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CN1592786A - 在酵母菌中高效生产异源性蛋白质的方法和组合物 - Google Patents

在酵母菌中高效生产异源性蛋白质的方法和组合物 Download PDF

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CN1592786A
CN1592786A CNA018224377A CN01822437A CN1592786A CN 1592786 A CN1592786 A CN 1592786A CN A018224377 A CNA018224377 A CN A018224377A CN 01822437 A CN01822437 A CN 01822437A CN 1592786 A CN1592786 A CN 1592786A
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CN
China
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yeast
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khn
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CNA018224377A
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戴维斯·T·W·吴
希尔帕·瓦什斯特
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Penn State Research Foundation
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Abstract

本发明提供的方法和组合物克服了以前这些蛋白质不能恰当折叠的问题，因而能在酵母菌和其他真菌中高效生产异源性蛋白质。按照本发明，真菌所使用的质量控制机制将错误折叠的蛋白质送回胞质，操纵其降解从而分泌这些蛋白质。

Description

在酵母菌中高效生产异源性 蛋白质的方法和组合物
交叉参考有关的专利申请
本申请享有2000年12月5日提交的美国临时专利申请60/251374的35U.S.C.§119(e)的权益。
基金
本发明的工作在资金上部分得到美国国立卫生研究院(NIHA)蛋白质项目No：428-1280AA的支持。美国政府对本发明拥有一定的所有权。
技术领域
本发明总体上涉及分子生物学领域。更具体说，本发明涉及在酵母菌和其他真菌中通过操纵内质网的蛋白质加工，来高效生产异源性蛋白质的新方法。本发明的方法可用于大规模生产异源性蛋白质并且包括这种生产所需的方法和新式载体。
发明背景
基因操纵技术的发展使得用微生物大量生产有用的蛋白质成为可能。原核细胞如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌因它们的遗传学特征已熟知而被广泛用作宿主。然而，具有药物价值的大多数生物分子是真核细胞分泌的蛋白质，当它们在原核细胞中产生时常常失去功能。以产业化规模生产需要的真核细胞蛋白质，如激素、抗体、凝血因子、蛋白酶、各种酶、生长因子和抑制剂以及疫苗用的病原分子，一直是一个难题。理论上可采用发酵使微生物无限制繁殖来生产这些分子，然而细菌等的表达系统缺乏真核细胞使用的分泌装置，故不能完完全全地合成这类蛋白质。
作为单细胞真核生物，酵母菌似乎对解决此难题有相当前景，因为酵母菌具有所有真核生物共同的正规分泌通路。但酵母生产方法只获得有限的成功，因为大多数异源性蛋白质产生在错误的部位或不能恰当地折叠。有助于分泌性蛋白质适当定位的一种方法，是融合一段内源性信号序列以指导异源蛋白质运输到内质网中，这是分泌通路的第一步。这有助于解决定位问题，但发现大多数异源蛋白质即使在内源信号序列帮助下被恰当地转运到内质网腔室(compartment)中仍不能折叠。在这种情况下，采用哺乳动物组织培养来合成蛋白质成为唯一实用选择。不幸的是，需要的生长培养基和设备使此方法费用高昂、选择复杂。
酵母菌是高度安全的，因为已长期使用酿酒酵母菌生产发酵产品，如酒制品或面包。酵母菌通常以高于细菌的细胞密度被培养并且可连续培养。在分泌的蛋白输出到培养基中时，酵母菌还可提供其糖基化，从而保存了其活性需要这种修饰的蛋白质的活性。然而，仍然需要解决的是，其他生物的许多分泌性蛋白在酵母菌中生产时为何不能产生活性蛋白？以及为什么酵母菌对这些类型的蛋白质仍然是一种不稳定的表达系统？
从以上所述可以明白，本领域仍然需要开发有效、方便和高效率的转化系统，以获取在酵母菌中生产的优点但没有蛋白质错误折叠问题。
本发明的一个目的是提供能完成上述需要的酵母菌转化方法。
本发明的另一目的是提供将用于细菌的转基因技术应用于生产商品化异源蛋白质的机制。
本发明还有一个目的是提供用于此种转基因方法的聚核苷酸构建物(constructs)、载体、转化的细胞。
本发明的其他目的通过以下对本发明的描述将变得清晰。
发明内容
本发明的方法能够对酵母菌进行基因修饰，促进其作为生物发酵器的用途，以大规模生产重要的商品化蛋白质产品，如人生长激素。本发明促进了异源性分泌蛋白在酵母菌中的恰当合成，克服了先前酵母表达系统不能折叠许多异源性蛋白质的问题。此外，本发明提高了已获得的某些成功的酵母表达蛋白质的产量和活性。简言之，本发明使得酵母产生的异源性蛋白质更类似于(如果不是相同于)原先宿主生物所合成的蛋白质。
可以采用本发明的转化方法与本领域已知的常规应用于细菌、植物和动物的遗传工程技术，一起来从遗传上操纵酵母菌生产，收获重组蛋白质。
根据本发明，操纵酵母菌的质量控制机制，使错误折叠的蛋白质返回胞质溶胶，操纵其降解从而分泌这些蛋白质。本发明一优选实施例包括利用受到操纵的受体酵母细胞，以抑制与O-糖基化相关的酶或Bypass of Sec Thirteen家族。作为质量控制的一部分，要消除对蛋白质的酵母菌的特异性修饰。抑制O-糖基化可防止不适当的酵母菌特异性修饰从而避开了酵母菌的质量控制机制。可用本发明的任何方法来产生本发明的受体宿主细胞，包括缺失突变、反义序列或者甚至给予参与这些酶家族调节通路的酶的外源性激动剂或拮抗剂。
本发明还包括含有分离自这种转基因酵母菌的蛋白产物的新颖组合物。还包括用于该程序和转化细胞、载体和掺入了它们的转基因酵母细胞。在一优选实施例中，设计了一种新的载体，可帮助提高转基因蛋白质在酵母菌中的产量。
定义
以上所用的以及整个说明书和权利要求书所用的与本发明组合物和方法有关的各种术语，除另有说明，都具有这里所说明的含义。
各种单位、前缀和符号可以它们的SI形式表示。除非另有说明，分别为核酸序列书写从左到右为5’-3’方向，氨基酸序列书写从左到右为氨基末端——羧基末端方向。数字范围包括确定范围的编号和确定范围中的各个整数。氨基酸可用其通常知道的三字码表示或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字码表示。同样核苷酸可用它们通常接受的单字码表示。除非另有说明，本文所用的软件、电气或电子学术语如“新的IEEE电气和电子学术语标准词典”所定义的那样(1993第5版)。以下的术语参见本说明书后对整个含义的理解会更加完全。
“反义寡核苷酸”是一种至少6个连续核苷酸的、最好与DNA互补(反基因)或RNA互补(反义)的分子，能干扰内源蛋白质的转录或翻译过程，以抑制基因产物的产生。
“克隆载体”是一种DNA分子，例如质粒、粘粒或细菌噬菌体，能在宿主细胞中自主复制。克隆载体一般含有一个或多个限制性内切酶识别位点，外源性DNA序列可以限定方式插入此位点而不会丧失载体的基本生物学功能，此位点也可插入适当的标志基因，用于鉴定和选择受此克隆载体转化的细胞。标志基因一般包括提供对抗菌素如潮霉素、四环素或氨苄青霉素等的抗性的基因。
“编码序列”或“编码区”指一种核酸分子，其含有必须的序列信息，当此序列表达时可产生一基因产物。
术语“保守性修饰变异体”用于氨基酸和核酸序列两者。对于具体的核酸序列，保守性修饰变异体指编码相同氨基酸序列的或编码氨基酸序列保守性修饰变异体的那些核酸。由于遗传密码子的简并性，许多功能相同的核酸可能编码任一给定的蛋白质。例如密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此在一密码子编码的丙氨酸的每一位点，该密码子可以改变为上述相应密码子之一，而不会改变所编码的多肽。这类核苷酸变异是“沉默变异”，代表一种保守性修饰变异。本文中编码一条多肽的每条核酸序列也称为遗传密码，描述了该核酸的每一个可能的沉默变异。普通技术人员懂得，可对核酸中的每个密码子(除AUG和UGG外，AUG是甲硫氨酸的唯一密码子，UGG是色氨酸的唯一密码子)进行修饰以产生功能相同的分子。因此编码本发明多肽的核酸的每个沉默变异都包含在各个描述的多肽序列中并在本发明范围内。
对于氨基酸序列，技术人员懂得对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的各种取代、缺失或添加、改变、以增加或缺失了该编码序列中的一个氨基酸或一小部分氨基酸，是一种“保守性修饰变异”，其中这种改变导致一个氨基酸被一个化学性质上类似的氨基酸所取代。如此，可改变选自包括1至15之间整数的氨基酸残基的任何数目。例如，可进行1、2、3、4、5、7或10个残基改变。保守性修饰变异体通常提供类似于衍生该变异序列的未修饰多肽序列的生物活性。例如，对其天然底物来说，底物特异性、酶活性或配体/受体结合一般至少为天然蛋白质的30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的活性。本领域熟知能提供功能相似氨基酸的保守性取代的名单。以下6组各含有互相可保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
也可参见Creighton(1984)Proteins W.H.Freeman and Company.
术语“共抑制”是一种在生物体中抑制基因表达的方法，其中该生物体被导入了一种构建物。该构建物具有一个或多个拷贝的序列，其与一驻留基因(resident gene)相同或享有核苷酸同源性。
关于一具体核酸所“编码”或“编码的”指其含有翻译成为具体蛋白质的信息。编码一蛋白质的核酸可能在核酸翻译区中含有非翻译序列(如内含子)或可能缺乏这种间插性非翻译序列(如在cDNA中)。编码一蛋白质的信息是在使用密码子时特有的。通常核酸使用“通用性”遗传密码编码氨基酸序列。然而，存在于某些植物、动物和真菌线粒体，Capricolum支原体或纤毛虫滋养核(ciliate Macronucleus)中的通用密码变异体，当核酸在这些生物中表达时可予以利用。
当用合成方法制备或改变核酸时，可利用该核酸将要在其体内表达的预定宿主的已知密码子偏爱性(preferences)。例如，虽然本发明的核酸序列可在植物和真菌中表达，但可能要按照该生物的特异性密码子偏爱性和GC成分偏爱性来修改序列，因为如本文引用的参考文献所描述这些偏爱性显示有所不同。
术语“表达”指基因产物的生物合成。结构基因的表达涉及该结构基因转录为mRNA，然后该mRNA翻译为一个或多个多肽。
“表达载体”是一种含有可在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常基因表达处在某些调节元件包括启动子、组织特异性调节元件和增强子的调控下。这样可以说该基因“操作性连接于”这些调控元件。
如本文所用，“异源性”核酸是来源于异种生物的核酸，或者如果来源于同种生物，则是经过人类精心干预在组成和/或基因组基因座上与其天然核酸有实质性修饰的核酸。例如：一操作性连接于一异源性结构基因的启动子，是来源于不同於衍生该结构基因的生物的启动子，或者如果来源于同种生物，则该启动子有一处或两处实质上的被修饰而不同于其来源形式。异源性蛋白可来源于异种生物，或者如果来源于同种生物则是已经过人类精心干预有实质性修饰而不同于其来源形式。
如本文所用，术语“高严谨性”将意味着按以下条件或相等的条件杂交：在含50％甲酰胺，5×SSPE、2％SDS、10×Denhardt’s溶液和100微克/毫升鲑精子DNA的缓冲液中，42℃杂交12小时，用0.1×SSC、0.1％SDS 55℃洗涤，-70℃曝光柯达X-Omat AR底片4天。
“宿主细胞”指含有载体并能支持该载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是诸如大肠杆菌等原核细胞，或诸如真菌、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞等真核细胞。宿主细胞优选真菌细胞。
术语“导入的”即本文中将一核酸插入一细胞中，指“转染”或“转化”或“转导”，包括指一核酸掺入一真核或原核细胞中，即该核酸可被插入该细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA中)转变成自主复制子，或短暂(transiently)表达(如转染的mRNA)。
术语“聚核苷酸构建物”或  “DNA构建物”有时用于指表达构建物，然而也包括设计用于共抑制天然宿主细胞序列，或相应于(例如)病毒中发现的那些外源性序列的反义寡核苷酸或核苷酸。
术语“操作性连接”，指将表达编码序列所必须的调控序列置于核酸分子中该表达序列相关的适当位置上，以能表达此编码序列。此同一定义有时用于指表达载体中其他转录调控元件(如增强子)的排列。
转录和翻译调控序列是一种DNA调控序列，例如：启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，它们保证了编码序列在宿主细胞中的表达。
如本文所用，“聚核苷酸”，包括指脱氧核糖聚核苷酸、核糖聚核苷酸或它们的同类物，其具有天然核糖核苷酸的基本性质，能在严谨杂交条件下与天然核苷酸基本上相同的核苷酸序列杂交，或/和能翻译成与天然核苷酸相同的氨基酸序列。聚核苷酸可以是天然基因或异源性结构基因或调控基因的全长序列或亚序列(subsequence)。除非另有说明，该术语包括具体的序列及其互补序列，故为了稳定性或其他理由(如本文中聚核苷酸术语所指)需采用骨架(backbone)修饰的DNA或RNA。然而本文所用的聚核苷酸这个术语中，DNA或RNA也包括稀有碱基如次黄嘌呤核苷，或修饰的碱基如三苯甲基化碱基这两个例子。本领域技术人员将会明白对DNA或RNA已作了很多不同的修饰使其服务于许多有用的目的。本文所用的聚核苷酸包括化学上、酶学性能上或代谢上改变的聚核苷酸类型，以及病毒和细胞，包括其他生物的细胞、单细胞和复杂细胞中，特征性的DNA和RNA化学类型。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。此术语可用于其中有一个或多个氨基酸残基是相应的天然氨基酸的人工化学同类物的氨基酸聚合物，或用于天然存在的氨基酸聚合物。这类天然存在的氨基酸同类物的基本性质是，当其加入一蛋白质中时，该蛋白可与含有全部天然氨基酸的相同蛋白质所诱导的抗体起特异性反应。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括各种修饰，包括但不限于磷酸化、糖基化、脂质结合(lipid attachment)、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧基化、羟基化和ADP-核糖基化。如众所周知和上述的那样，可以明白多肽不都是线性的。例如，多肽可因遍在蛋白化作用而可能是分枝状的，它们由于翻译后加工可能是有或没有分枝的环状，包括天然加工产生的或不是天然加工而是人为操作产生的。环状、分枝状或分枝性环状多肽，可经非翻译性天然加工或完全是人工合成方法来合成。另外，本发明考虑采用本发明的含甲硫氨酸和无甲硫氨酸、氨基末端变异的蛋白质。关于蛋白质“N末端区域”，包括毗邻蛋白质氨基末端端部的大约50个氨基酸。
术语“启动子”、“启动子区”或“启动子序列”通常指基因的转录调控区，见于该编码区的5’或3’侧或编码区内，或内含子内。通常启动子是能在细胞中结合RNA聚合酶和启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。通常5”启动子序列在其3’端接邻转录起始位点，并向上游(5’方向)延伸包括启动转录超过上述背景的可检测水平所必须的最低数目的碱基或元件。启动子序列中有转录起始位点(可用核酸酶S1作图来方便地确定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域(共有序列)。启动子术语包括所述序列的必须的调节特性，以及可任选地包括翻译起始位点前面的长末端重复区。
“重组宿主”，可以是含有克隆载体或表达载体之一的原核或真核细胞。此术语也包括那些经基因工程改造在宿主细胞染色体或基因组中含有克隆基因的原核或真核细胞。
术语“报告基因”，指编码一种易为标准方法直接或间接检测到的产物的基因。
术语“选择性标志基因”，指编码一种表达时能赋予转化细胞可选择表型(例如抗生素抗性)的产物的基因。
对于寡核苷酸或其它单链核酸分子，术语“特异性杂交”指两个充分互补序列的两个单链核酸分子之间的结合，使得在预先确定的条件下(本发明通常采用的严谨条件下，有时称为“基本上互补的”条件下)发生杂交。具体说，该术语指寡核苷酸与单链DNA或RNA分子中的基本上互补序列的杂交，并指该寡核苷酸与非互补序列的单链核酸基本上不发生杂交。
“结构基因”是一种DNA序列，其可转录成信使RNA(mRNA)后者再翻译成具体多肽的特征性氨基酸序列。
“载体”是一种复制子，例如质粒、噬菌体、粘粒或病毒，可将其它核酸节段操作性插入它们中间导致该节段的复制或表达。
附图说明
图1表明KHN在酵母菌中的表达。KHN在野生型细胞和ER相关降解突变体cue1细胞得到表达。用35S-氨基酸脉冲标记细胞并按显示的时间追踪检测。然后从去污剂溶胞产物(detergentlysates)免疫沉淀，洗涤剂裂解得到KHN，作SDS-PAGE分离然后放射自显影观察。
图2表明用内切糖苷酶H除去KHN的N-连接糖基。显示用35S-氨基酸脉冲标记的cue1细胞中KHN的表达和追踪检测的时间。KHN经免疫沉淀并用内切糖苷酶H处理或模拟处理。然后KHN作SDS-PAGE分离和放射自显影观察。
图3表明通过O-连接糖基化修饰KHN。KHN在cue1、pmt2和pmt1突变株细胞中得到表达。脉冲标记细胞并如上述追踪检测，如图1中所述免疫沉淀KHN并进行分析。
图4A、4B、4C的曲线表明BST1基因和PMT2基因突变的细胞与野生型细胞相比KGFP活性显著提高，平均荧光强度在Δbst1细胞升高5倍，在Δpmt2细胞升高9倍。
图5所示为表达KGFP的细胞的荧光显微镜图。用装有Spot II数码相机的Zeiss Axioplan上置荧光显微镜拍照显示野生型和pmt2突变细胞所表达的KGFP。曝光时间见所示。
图6A、6B、6C，KHN是一种转运到高尔基体时快速降解的蛋白质，图6A显示用[35S]甲硫氨酸/半胱氨酸30℃代谢性脉冲标记10分钟，然后按所示的时间冷追踪检测表达KHN的野生型细胞和Δcue1细胞。用抗HN多克隆抗血清免疫沉淀洗涤剂裂解物得到KHN，并经10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。将免疫沉淀的蛋白质与500单位内切糖苷酶H(Endo H)培育3小时除去N-连接糖基。星号表示非特异性免疫沉淀的蛋白质位置。图6B如图6A所述对表达KHN的野生型、Δpmt1和Δpmt2细胞作了分析。图6C为22℃培养表达KHN的野生型、sec12-4和sec18-1细胞至对数生长期，移至37℃，30分钟后脉冲标记细胞并如所示定时追踪测定。免疫沉淀得到KHN并如图6A所述进行分析。KHN p1和p2形式的位置如图6A所示，箭头标出p1形式的位置(图6B和图6C)。
图7A、7B、7C、7D，KHNt是ERAD通路的降解底物。图7A用[35S]甲硫氨酸/半胶氨酸脉冲标记表达KHNt的野生型和突变株细胞10分钟，随后进行冷追踪检测。用抗HA单克隆抗体(HA.11；BabCo)进行KHNt的免疫沉淀，并用总TCA沉淀计数标准化，SDS-PAGE分析蛋白质并放射自显影观察。图7B使用图7A所示产生放射自显影的同一块凝胶作摄影分析(phosphorlmageranalysis)，定量测定图7A的实验结果。图7C免疫印染法分析了野生型和ERAD突变株中KHNt的相对稳态水平。将等量细胞裂解物(0.2 OD600当量细胞)加入各泳道，电泳分离，转移到硝酸纤维膜上，用HA.11单抗探查，用化学发光法(Pierce Chemical Co.)显示蛋白质。图7D用载玻片上固定和渗透的细胞进行野生型和ERAD突变细胞中KHNt的免疫定位。分别用抗α-HA单抗和抗α-Kar2p多克隆抗血清检测KHNt和BiP。荧光第二抗体结合后，红色泳道(a、b和c)显示KHNt，绿色泳道(d、e和f)显示BiP，各泳道曝光时间相同。显影。标尺2微米。
图8A、8B、8C、8D，可溶性而非膜结合的ERAD底物的降解要求内质网向高尔基体转运。图8A、8B、8C、8D所示为22℃培养野生型细胞和表达HA标记的ERAD底物的内质网转运突变株Sec12-4和Sec18-1至对数生长期，移到37℃的限制性温度30分钟，如图7所述进行时间过程(time courses)和分析。数据作图比较各细胞株背景上每一底物降解的速度，Δcue1株包括Ste6-166p和Sec61-2p的阳性对照。
图9A、9B、9C，包含在COPII小泡(vesicles)中的可溶性ERAD底物，在自表达KHNt(图9A)、CPY* HA(图9B)和Ste6-166P(图9C)的野生型细胞株分离获得的内质网膜上，进行重建的COPII出芽反应。标记T的泳道代表用于出芽反应总膜量的十分之一。减号(-)泳道表示缺乏纯化COPII成分时形成的小泡量。加号(+)泳道表示加入COPII蛋白时产生的小泡。离心收集总膜和出芽的小泡，在聚丙酰胺凝胶上分离，免疫印染显示蛋白质。用荧光自显影检测糖基化前α因子(gpαf)的量。
图10A、10B、10C、10D、10E、10F，KHNt和CPY* HA而非Ste6-166p的降解需要高尔基体向内质网转运。如图2所述对表达KHNt(图10A)、CPY* HA(图10B)和Ste6-166p(图10C)的野生型和sec21-1细胞株进行了脉冲追踪检测分析。22℃培养细胞株至对数生长期，移至33℃后立即脉冲标记。33℃继续培养作冷追踪检测(时间如所示)放射自显影观察凝胶(左)并摄影分析定量测定(右)，图10C中为摄影扫描的凝胶图象。
图11A、11B、11C、11D、11E、11F，per17-1是对阻断错误折叠蛋白转运，但不阻断正确折叠蛋白转运的挽回(retrieval)通路有特异性的突变株。图11A通过图7所述代谢性脉冲-追踪分析，测定了野生型和per17-1细胞中的KHNt、CPY* HA、Ste6-166p和Sec61-2p的转化。实验在30℃下进行，表达Sec61-2p的细胞株除外。30℃培养表达Sec61-2p的细胞株至对数生长期，移至37℃30分钟，继续培养作脉冲追踪检测。图11B上图显示在A部分所示时间进程中，KHNt凝胶产生的放射自显影图，标出了p1(内质网)和p2(高尔基体-已改变的)中形成的位置。从KHNt时间进程制备的等分裂解物平行免疫沉淀得到内源性CPY和Gas1p。凝胶电泳分离这些蛋白质，放射自显影观察(p1，内质网前CPY；p2高尔基体前CPY；mCPY；成熟CPY；内质网Gaslp，Gaslp的内质网形式；mGas1，成熟的高尔基体改变的Gaslp)。图11C所示为脉冲标记野生型和per17-1细胞10分钟并在所示时间追踪检测，免疫沉淀CPS和ALP并作凝胶电泳，然后放射自显影分析。标明了各蛋白质的前体形式(proCPS和proALP)和成熟形式(mCPS和mALP)。
图12A、12B，per17-1细胞中错误折叠蛋白质的免疫定位。图12A所示为固定和渗透化处理对数生长培养的表达KHNt(a-c)和CPY* HA细胞(d-f)的per17-1细胞和表达CPY* HA(g-I)的Δder1细胞。该细胞用抗HA和抗α-、Kar2p抗体，然后用Alexa荧光546羊抗小鼠(a、d和g)和Alexa荧光488羊抗兔(b、e和h)第二抗体染色。用DAPI(c、f和I)染色表明核的位置。箭头指出特异性着色点(colocalization)。图12B所示为图12A中显示经加工并结合第一抗体的、表达HA表位标记SRβ的野生型和Per17-1细胞。采用Alexa荧光546羊抗兔和Alexa荧光488羊抗小鼠抗体，故Bip呈现红色泳道(a和d)而SRβ呈现绿色泳道(b和e)。标尺：2微米。
图13所示为假设的出芽酵母菌内质网质量控制模型，检索蛋白质易位后，错误折叠蛋白分为保留通路(白色箭头)或挽回通路(黑色箭头)。挽回通路中蛋白质包装在COPII小泡中转运入高尔基体，通过逆向转运通路得以挽回。在内质网中两通路的底物会聚为ERAD，这些蛋白质通过易位子复合物穿越内质网膜，受到遍在蛋白化作用标记和胞质26S蛋白酶体的降解。
图14所示为pDN477，一种允许异源性蛋白质在酵母菌中高水平表达的酵母表达载体，的质粒图。强力TDH3启动子(已标示)驱动了信息RNA的合成。包含了酵母BiP(KAR2)基因的信号序列(SS)，通过将其cDNA插入Cla1(5’)和Xba1(3’)位点，它指导蛋白质转位入共翻译(更多是哺乳动物的)SRP分泌通路。为了避免分泌或利用内源性信号序列，将编码序列插入BamH1(5’)和Xba1(3’)位点，ACT1终止子终止了转录。该载体还含有供酵母菌中选择的URA3基因和酵母的复制起点(ARS1)以及着丝粒(CEN4)。可得到具有其它标志或整合入基因组的pDN477版本。
具体实施方式
通过诸多研究建立了本发明以了解酵母菌中分泌性蛋白质的折叠和成熟过程。研究过程中，在酵母分泌通路中表达了许多异源性蛋白质，第一种是水母(jellyfish)的绿荧光蛋白(GFP)。为了将其导入分泌通路，将Kar2p蛋白的内源性酵母信号序列与GFP的氨基端融合，该信号序列引导蛋白质进入特异的转位通路，Kar2p利用了酵母菌中较多的“哺乳动物”的SRP通路。优选的此信号序列与常用的α因子信号序列(其利用酵母菌特有的翻译后通路)相反。此外，将内质网(ER)保留基序HDEL与其羧基末端融合以将该蛋白质定位于ER。GFP是监测蛋白质折叠的理想分子，因为其荧光活性依赖于蛋白质的正确构型并易于检测。当该称为KGFP嵌合性蛋白质表达时能恰当定位，但荧光活性很低，提示其在ER中并未恰当折叠。这种低活性对其在分泌通路中表达是特有的，因为其在胞质中的表达采用ER转位突变株sec63显示为明亮的胞质荧光。不清楚KGFP为何在酵母菌分泌通路中不能有效折叠。
突破来自于表达猿猴病毒5的、称为HN的哺乳动物病毒糖蛋白，选HN是因为它的折叠容易监测。为了在酵母中表达HN，将该病毒的信号/锚着结构域(在酵母菌中不被识别)用Kar2p信号序列取代。产生的蛋白质称为KHN，能恰当地靶向分泌通路而有效地被糖基化(图1)。
此蛋白质被迅速降解(图1)，这对ER中错误折叠的蛋白质来说是常见的。当我们发现KHN在遍在蛋白化突变cue1细胞(其为ER相关蛋白降解缺陷性细胞)中是稳定的证实了这一点(图1)，观察了迁移率中的时间依赖性转移，表明存在糖修饰(KHN是一种糖蛋白)。故检验了该转移是否是由于其受到内切糖苷酶H的消化KHN而发生N-连接糖基化修饰。如图2所示其转移并非由于其N-连接糖基修饰。其它可能性是KHN受到O-连接糖基化修饰，这是令人惊奇的，因为HN通常在正常哺乳动物宿主中只受到N-连接糖基化修饰。通过在O-连接糖基化缺陷性酵母菌株中表达KHN检验了这种可能性。酵母菌ER中的O-连接糖基化，通过称为蛋白质甘露糖基转移酶(PMT)的基因家族的作用而开始。令人惊奇的是本发明人发现在显示KHN受到O-连接糖基化不恰当修饰的两种突变体pmt1和pmt2中，HN的修饰受到阻碍(图3)。
高等真核细胞中，高尔基体中发生O-连接糖基化是一种罕见的修饰。所有的多肽都在加入任何O-连接糖基前折叠完毕。相反酵母细胞ER中第一步为O-连接糖基化。不知道什么物质传导了O-连接糖基化信号？是否有可能大多数异源性蛋白质可被O-连接糖基化？因为以前不知道这一点，本发明人假设，新生的多肽在ER中受到O-连接糖基化的不恰当修饰可能改变该链的化学性质并可能导致错误折叠。充其量即使该蛋白质可因此种修饰而折叠但其活性和稳定性可能受损伤，因为化学性质上不同于其天然形式。为了检验这个假设我们采用我们的报告构建物KGFP，检测了抑制O-连接糖基化对折叠的影响(对于此目的KHN不够理想，因为它是天然HN的可溶形式在哺乳动物细胞中折叠会部分受损)。
酵母菌TDH3启动子在野生型和pmt突变细胞中能驱动KGFP表达。因为KGFP是一种荧光标志物，可通过发射光强度变化监测其折叠，采用上置荧光显微镜观察表达细胞中的KGFP。在所有情况下，KHN都适当地靶向到ER，令人感兴趣的是pmt2突变体具有最强的效果，显示ER着染模式比对照明亮得多；而其它pmt突变体4和3显示较差的效果。为了定量测定和特征鉴定荧光活性的明显增强，对表达KGFP的野生型和pmt2突变株细胞进行了流式细胞计数。如图4所示，pmt2细胞中的荧光活性显示较野生型细胞有均匀一致的增强，平均荧光活性pmt2突变细胞高近8.5倍(109.5单位对12.9单位)，bst1细胞高5.5倍(71.4单位对12.9单位)这种差别可归因于比活性的差别，因为定量脉冲追踪分析显示表达水平和稳定性两细胞株相类似。此外，直接荧光显微镜观察显示活性显著增加，但这种增加不是由于KGFP的错误定位(图5)。
这些资料显示酵母菌中表达的异源性蛋白受到O-连接糖基化的不适当修饰。此种修饰进而可能对该蛋白质的成熟和活性具有不良后果。本发明人认定，若采用内源信号序列与O-连接糖基化缺陷的特定突变株偶联表达，酵母表达的异源蛋白质的活性可以显著提高。由于酵母中有6个不丰裕的PMT基因并且底物特异性表现有差异，这6个基因任何一个缺失的细胞株可能提供所需的对O-糖基化异常的抑制。此外，可联合诸突变进一步促进适当折叠。因此，本发明人发展了一种新的办法来克服市场上重要分子在酵母菌中低成本表达潜力受到限制的问题。
近年来，已有了以制备规模合成蛋白质的各种表达系统。最常用的微生物体大肠杆菌一般不用于真核分泌性蛋白的合成，因为细菌的分泌是根本不同的。而酵母系统应用有限，因为许多蛋白质不能正确合成，以前对此原因未明。本发明观察到病毒糖蛋白SV5HN的可溶形式在酵母细胞中受到不恰当修饰，导致其错误折叠，这一现象已有可能被利用来克服这个问题。本发明人证明抑制O-连接糖基化(实施例显示的是特定的突变株，但任何抑制方法预计会有同样效果)可显著增强活性异源性蛋白质的合成。此外，采用“更像哺乳动物的”内源性共翻译特异性信号序列也是优选的，可指导蛋白质正确导向酵母菌的内质网。虽然是在酿酒酵母菌中发展了此方法，但此方法也可用于所有其他酵母菌，包括pombe和巴斯德酵母菌以及其它真菌，因为它们内质网都具有O-糖基化蛋白质的机构。
此系统具有广泛的应用价值，因为实际上任何异源性蛋白质(分泌性或非分泌性)都可以合成，包括但不限于抗体、激素、生长因子和抑制剂、毒素、凝血因子、酶和免疫接种用蛋白质。除了用于大规模蛋白合成外，本发明将使得酵母菌可用作强有力的研究工具来研究和筛选用于人类疾病相关蛋白质的药物。这包括但不限于束性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、朊蛋白、细胞受体表达筛选激动剂和拮抗剂，和早老性痴呆病的β淀粉样蛋白前体的加工。
本发明的酵母转化是在其质量控制机制受到抑制或操纵，蛋白质不能经由高尔基体和内质网中的传统通路降解的环境中进行。在一优选实施形式中，受体细胞环境是O-糖基化受到抑制的环境，这可通过使用本领域已知的反义物质或共抑制方法，或通过工程改造宿主酵母菌株使之与O-连接糖基化有关的基因突变而丧失功能而实现。在一优选实施方式中，通过操纵PMT家族的基因来抑制O-连接糖基化。
另一实施例中，通过突变或抑制Bypass of Sec Thirteen基因，或者其他功能类似基因来操纵质量控制机制。
反义物质和共抑制机制是本领域众所周知和采用的，Ausubel等(同上)作了举例说明。此外，本领域也知晓在受体酵母细胞系中构建突变的技术和标准，见Sambrook等1989描述。包括整合性破坏技术：Shortle，1982，Science 217：373“整合性DNA转化的酵母肌动蛋白基因的致死性破坏”；一步基因破坏Rothstein 1983，Methods Enzymol.101：202-210“酵母的一步基因破坏”；PCR介导的一步基因破坏，Baudin等1993酿酒酵母，Nucl.Acids Res.21：3329-3330，“导致酿酒酵母菌基因缺失的一种简单有效的方法”；或置换Scherer和Davis1979 PNAS76：4951-4955“用体外构建的改变的DNA序列置换染色体区段”。在优选实施例中通过基因工程改造正常质量控制必须基因缺陷的酵母菌缺失突变株或受体真菌菌株，来创造内质网质量控制受到操纵的受体菌环境。
在一优选实施方式中采用的基因是Bypass基因或SecThirteen基因(Elrod-Erickson和Kaiser，1996，Molecular biology ofthe Cell，7：1043)。预计一些具有类似功能可用于本发明的BST家族的其他这类基因将在酵母菌中得到鉴定。按照本领域熟知的本文和Ausubel(Protocols in Molecular Biology 1997，Wiley and Sons出版社)所公开的技术，可用其他生物的已知序列产生探针，与文库杂交来鉴定酵母菌的其他BST基因。
在另一优选实施方式中，操纵受体酵母细胞使其O-甘露糖基化受到抑制，这可通过抑制O-连接糖基化通路中的任何酶而实现。蛋白质O-甘露糖基化最初见于真菌始于内质网，从分泌性蛋白质的丝氨酰或苏氨酰残基的多萜醇活化甘露糖转变为甘露糖，蛋白质O-甘露糖转化酶(PMT)家族催化此反应。见Strahl-Bolsinger等，蛋白质的O-甘露糖基化，Biochimicaet Biophysica Acta 1999，1426：297-307。
在一优选实施方式中，受抑制的酶是PMT基因家族的酶。近年已知至少有6个或更多的蛋白质O-糖基化基因PMT1-7，见Gentzsch等PMT基因家族：“酿酒酵母中的蛋白质O-糖基化是生命所必须的”EMBO J 1996 15(21)，5752-5759。
蛋白质O-甘露糖基化是O-连接糖基化的第一步，抑制此通路的其他几步预计会产生本发明的类似结果。见Hersgovics等，“酵母中的糖蛋白生物合成”FASEB J 1993，7：540-550。例如可抑制催化第3个甘露糖残基连接的MNT/KRE2基因家族(KTR1/YUR1)。可采用本文鉴定其他突变的方法不难筛选其他O-连接糖基化突变株，按本发明做工作量不会比常规筛选法大。
在酵母菌中产生重组蛋白质联合了目前公开的本领域已知的各种技术手段。本发明还包括采用需要在真菌宿主细胞中表达的编码结构性基因的聚核苷酸，这些聚核苷酸常常是以表达构建物形式掺入与结构基因操作性相连并常常是末端序列的启动子区域中，此构建物也可包含信号序列以指导转基因蛋白的分泌。此种构建物常包含在一载体通常为质粒载体中。这种载体应具有在细菌中该载体复制和保留的性能(克隆载体)，和显示在宿主中整合和/或发挥功能(表达载体)的可选择性标志基因和/或序列。
本发明方法中所用的这些组分每一个都属于本发明范围之中。大多数情况下，也可对整个过程的各个阶段进行开发。选择开发目标依赖于对其进行的变化，例如对所选的用于克隆和导入重组DNA分子的质粒载体系统、待修饰的酵母菌种类、具体的结构基因、所用的启动子元件和上游元件的变化。本领域技术人员能够选择和利用适当的替代物来实现其功能。表达所需的结构基因和培养细胞的培养条件是本领域知道的。本领域还知道可得到许多种类的可转化和可发酵的酵母菌，它们含有并能表达在本发明启动子分子调控下的所需要的基因。
以下是可用于实施本发明方法的分子生物学技术的非限制性综述。
本发明的聚核苷酸构建物具有分子生物学领域熟知的类似元件。例如在每个构建物中感兴趣的DNA序列宜操作性连接(位于能确保其起作用的部位)于在酵母细胞中有功能的启动子，从而使该DNA能被转录(成RNA转录物)并包含一含有复制系统的载体。在一优选实施例中，为了防止内源性基因发生共抑制，感兴趣的DNA序列应是外源性的，除非共抑制方案是需要的。
酵母菌的克隆载体和基因
根据酵母菌的复制方式，常用的酵母载体可分为5类：Yip，Yrp，Ycp，YTEp和Ylp质粒。除Ylp质粒(线性酵母质粒)外，其它均可在大肠杆菌中保持，Plasmid Vector Development。
Struhl等人开发了三种嵌合型质粒载体(Struhl，K.“酵母菌的高频率转化：杂交DNA分子的自主复制”Proc Natl Acad Sci USA1979，76：1035-1039)：(i)YIp(酵母整合性质粒)不能通过整合进入受体菌株基因组而复制和转化；(ii)YEp(酵母游离型质粒)携带有酵母菌2微米环形复制起点。它是一种酵母内源性质粒可在受体细胞中复制；和(iii)YRp(酵母复制性质粒)可利用酵母菌自主复制序列(ARS)复制。整合性载体以低效率(1-10个转化体/微克)转化。质粒在转化的酵母细胞中能以高得多的效率复制。YEp载体一般以0.5-2.0×104转化体/每微克输入质粒DNA的效率转化，而YRp-7质粒产生0.5-2.0×103转化体/每微克输入质粒DNA。Struhl等(Struhl，K“酵母菌的高频率转化：杂交DNA分子的自主复制”，Proc Natl Acad Sci USA 1979，76：1035-1039))：(i)YIp(酵母整合性质粒)显示要求整合入基因组的该质粒转化效率低于能在酵母细胞中自主复制的那些酵母质粒载体。因此已开发了其它两种酵母质粒载体，携带有ARS和酵母着丝粒的酵母着丝粒质粒(YCp)(Clarke，L.等“酵母着丝粒的分离和功能性环状小染色体的构建”Nature，1980 287：504-509；Parent，S.A.等“在酿酒酵母菌中表达、分析和克隆DNA序列的载体系统”Yeast J 1985，83-138)比YRp质粒更稳定，但每个细胞只存在一个拷贝。将人造酵母染色体(YACs)培养增殖成为含着丝粒、ARS和两个选择标志、两端粒和一克隆位点的环状质粒(Burke等“通过人造染色体载体将外源性DNA的大片段克隆入酵母菌中”Science，1987，236：806-812；Murray，A.W.等“在酵母中构建人造染色体”Nature1983，305：189-193)。通过去除端粒之间的序列线性化此载体并将外源性DNA插入克隆位点，结果获得一线性人造染色体，长100-1000Kb，可通过有丝分裂和减数分裂增殖。
启动子
用于本发明方法的表达构建物、启动子或控制系统可包括可诱导启动子或组成性启动子。可得到许多适合的启动子系统。可诱导的酵母启动子的例子包括GAL(半乳糖激酶)和PHO5(碱性磷酸酶)，见Schneider和Guarente，1991。半乳糖可激活GAL启动子，而缺乏磷酸盐的培养基可诱导PHO5启动子。
也可使用组成性启动子，例子包括最常用的ADH1(醇脱氢酶I)、TPI(丙糖磷酸异构酶)和PGK(3磷酸甘油酸激酶)。见Ausubel，分子生物学短方案，1999 John Wiley and Sons出版社。
这些和其他的这类启动子是已知的并可通过Genebank来源进入查询，在一优选实施方式中，启动子是受体宿主细胞种类的同源性启动子。例如，在酿酒酵母菌转化方案中，可在聚核苷酸构建物中采用酿酒酵母菌的启动子。
在启动子构建物中包含某些内含子序列也许是理想的，因为编码区包含内含子序列可能导致表达和特异性提高。
另外，可将一个启动子区域与不同启动子的区域相连接以在产生的嵌合启动子中获得所需的启动子活性，也可采用能调节基因表达的合成性启动子。
通过增加诸如转录终止子和/或增强子元件等补充元件可进一步优化表达系统。
其他调控元件
除启动子序列外，表达盒或聚核苷酸构建物也应含有位于结构基因下游的转录终止区以提供有效终止。此终止区域或聚腺苷酸化信号可得自启动子序列的同一基因，或可得自不同基因，聚腺苷酸化序列包括但不限于Octopine土壤杆菌的合酶信号(Gielen等EMBO J.1984，3：835-846)或胭脂氨酸(nopaline)合酶信号(Depicker等Mol and Appl Genet.19821：561-573)。
转基因产生的蛋白质转运入亚细胞腔室如液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁或线粒体，或分泌进入质外体或生长培养基，是通过将编码信号序列的核苷酸序列操作性连接于编码感兴趣蛋白质的基因的5’和/或3’区而实现的。蛋白质合成和加工过程中结构基因5’和/或3’端的靶向序列可能决定了该编码蛋白质最终定位在那里。存在的信号序列引导多肽进入胞内细胞器或亚细胞腔室或分泌入质外体或分泌到胞外环境。本领域知道许多这种信号序列，特别是酵母菌的，如BiP序列。一序列与蛋白质编码序列操作性相连使产生的蛋白质成为分泌性蛋白质。本发明对分泌性蛋白优选采用信号序列，但除了信号肽引导的分泌性蛋白质外，本发明也包括传统加工的蛋白质。
标志基因
含本文所述任何DNA序列和启动子的重组DNA分子还可含选择性标志基因，该基因编码的选择性基因产物可赋予受该重组DNA分子转化的细胞对一种化学试剂或生理性应激的抗性，或赋予该细胞一种特征性的可鉴别表型，可采用选择性试剂容易地挑选出该细胞。酵母菌转化中所用的选择标志性基因包括URA3、LEU2、HIS3和TRP1，这些基因弥补了酵母宿主的特定代谢性缺陷(营养性缺陷型)。也可采用赋予抵抗杀真菌剂，如苯菌灵(benomyl)或真核细胞毒素抗性的标志。
复制基团(replicators)
酵母表达载体也可含有衍生自酵母2微米环的复制子，其具有保证产生适当拷贝数目和适当分离进入子代细胞的DNA位点和基因。
蛋白质
采用本发明的转基因酵母，可以商品化数量生产外源性蛋白质。选择和培养增殖转化酵母菌的技术是本领域熟知的。以常规方法收获产生的大量转基因酵母菌，外源性蛋白质可从感兴趣的组织或从总生物量中提取，或分泌入生长培养基(液体或固体状态)再回收。可用所讨论的已知方法提取植物和真菌生物量中的蛋白质，例如见Heney and Orr.Anal.Biochem.1981，114：92-6和本文所引用的参考文献。
转化
酵母转化有许多标准方法，可用于本发明，其描述见下文。
原生质球转化
有许多方法转化酵母细胞，包括原生质球方法。此法在用PEG和质粒DNA(优选自身复制型)处理前优选用酶催化(蜗牛酶，glusulase)方法去除酵母细胞壁。
原生质球转化方法举例
1、在50ml YPAD中培养细胞到3×107细胞/毫升密度。
2、离心400-600g 5分钟收获细胞，用20毫升灭菌水洗二次，20毫升山梨醇洗一次。将细胞重悬于20毫升SPEM(1M山梨醇，10mM磷酸钠，PH7.5，10mM EDTA加40微升β-巯基乙醇，用前加入)中。
3、加入45微升酶解酶(zymolyase)20T(10微克/毫升)，30℃轻摇培育20-30分钟，使细胞转变成原生质球。此时，应有90％细胞变成原生质球。
4、离心250g 4分钟收获原生质球，小心去除上清液。以20毫升STC(1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2)洗粒状沉淀一次，重悬于2毫升STC中。
5、取150微升STC悬液与5微克运载体DNA和5微克质粒DNA(体积少于10微升)轻轻混合转化原生质球。室温培育该混合物10分钟，加入1毫升PEG试剂(10mM Tris-HCl，pH7.5，10mMCaCl2，20％(w/v)PEG8000；过滤除菌)，轻轻混合再培育10分钟。
6、离心250g 4分钟收获原生质球，重悬于150微升SOS(1.0M山梨醇，6.5mM CaCl2，0.25％酵母提取物，0.5％细菌蛋白胨(bactopeptone))中。将原生质球稀释液与8毫升TOP(含1.0M山梨糖醇和2.5％琼脂的选择培育基，保持于45℃)和含0.9M山梨糖醇和3％葡萄糖的合适选择培养基混合。30℃培养3-4天后可回收转化体。
Li + 转化
此法涉及用特定的单价碱性阳离子(Na+，K+，Rb+，Cs+和Li+)联合PEG处理酵母菌细胞，刺激完整酵母细胞摄取质粒DNA。Ito等“用碱性阳离子处理转化完整的酵母细胞”J.Bacteriology 1983，353：163-168。经5分钟热休克后将细胞接种在选择培养基上。用乙酸锂(LiAc)结果最好。加入超声处理的运载体DNA可增加效率，反应中加入单链化DNA或RNA以优化反应。在一次转化反应中可用携带不同被选的标志基因的两种载体来敲除两种不同的基因，或以可选择质粒共转染来寻找非选择性基因破坏。以下是用大多数实验室菌株已证明可工作并且适合用作酵母双杂交系统高效转化质粒文库的LiAc/ssDNA/PEG方案的标准方法。
LiAc/ssDNA/PEA方法举例
1、在2×YPAD中培养细胞过夜。重悬于温热2×YPAD中，密度为5×106细胞/毫升。再培养使细胞两次分裂增殖至2×107细胞/毫升。
2、离心3000g 5分钟收获细胞，以灭菌蒸馏水洗二次，重悬在灭菌蒸馏水中，密度109细胞/毫升。
3、取样108个细胞，转移到1.5毫升小离心管中，沉淀细胞，丢弃上清液。
4、沉淀重悬于360微升转化混合液中(240微升，50％(w/v)PEG3500，36微升1.0M LiAc，  50微升2.0mg/ml单链运载体DNA，0.1-10微克质粒DNA，加水到34微升)。
5、42℃培育转化混合液中的细胞40分钟，微量离心机离心沉淀细胞，去除转化混合液。
6、轻轻重悬细胞沉淀于1毫升灭菌水中，取样，接种于选择培养基上。
电穿孔
电穿孔，即用电脉冲在细胞膜上形成瞬时冲击，已广泛用于植物和动物细胞的转化。也用于酵母原生质球和完整的酵母细胞。Karube，FEBS lett，1985，182：90-94；Hashimoto Appl Microbiol.Biotechnol 1985，21：336-339。已将电穿孔与PEG以及LiAc/ssDNA/PEG法联用。可重复的标准电穿孔方法见以下：
表3，电穿孔举例：
1、在YPD中培养细胞到密度1×107细胞/毫升。
2、离心1500g 5分钟收获细胞，重悬于25mM DTT(用YPD培养液配制，20mM HEPES，PH8.0)中密度1×109细胞/毫升。30℃培育10分钟。
3、用EB(10mM，Tris-HCl，pH7.5，270mM蔗糖，1mM MgCl2)洗细胞二次，重悬于EB中，密度1×109细胞/毫升。
4、取样48微升与2微升质粒DNA混合，递送到方形脉冲发生器CNRS细胞电脉冲仪的两电极之间。
5、以1.74KV/cm电场强度和15ms每次脉冲时间，脉冲细胞。
6、立即加入1毫升预热至30℃的YPD，30℃培育悬液1小时。然后在微量离心机中离心沉淀细胞重悬于SD培养液中，接种适当的培养基上并培养。
酵母转化也可用玻璃珠进行，见Costanzo等Genetics1988，120：667-670和用biolisitics，见Klein等Nature 1987，327：70-73。
原生质球，锂阳离子和电穿孔已应用于大多数种类的酵母菌，包括pompe酵母、白色念珠酵母、毕赤酵母、汉森酵母、克鲁维酵母、Yamadazyma ohmeri、Yarrowia lipolytica和Schwanniomycesoccidentalis。
关于酵母转化的其他信息可在以下文献中找到：Gietz等“酵母菌的基因转化”BioTechniques 30：816-831((2001年4月)和Wang等“非酵母菌转化系统”Crit.Rev.Biotechnol.2001；21(3)：177-218。
经常需要用到纯合期的DNA序列，其可能要求一次以上的转化以产生细胞系，要求用二者均编码同一基因产物的第一和第二重组DNA分子进行转化。在本发明方法的某些实施方式中，还考虑用含有至少两种DNA序列的重组DNA分子，或用一种以上的重组DNA分子转化酵母细胞。在这类实施方式中DNA序列或重组DNA分子物理性连接在同一载体中，或物理性分开在不同的载体中。只要各载体具有其独特的选择标志基因，就可用一个以上载体同时转化一个细胞。或者，可用一个以上载体依次转化一个细胞允许在用第一种载体转化后有一个中间再生步骤。也可能在含不同DNA序列或重组DNA分子(优选连锁于或位于同一染色体上的DNA序列或重组分子)的各酵母细胞或酵母细胞系之间进行有性交配，然后从交配的子代中选出含有DNA序列或重组DNA分子二者的酵母菌。
可用本领域技术人员已知的Northern印染技术和/或Southern印染技术监测上述转化酵母细胞中含有DNA序列和启动子的重组DNA分子的表达。
将再生的酵母菌转移到标准生长培养基上(如固体或液体营养培养基、谷物、矿石、混合肥料，泥炭、木材、木屑、稻草等)，并培养或以本领域实施人员知道的方法培养。
在聚核苷酸稳定地掺入了再生转基因酵母菌后，该核苷酸可能通过有性交配转移到其他酵母菌，可采用许多标准技术之一种，这取决于要繁殖的菌种。
上述方法也可用来产生许多受重组构建物单个转化的酵母菌，以挽回没有任何位置效应(positional effects)的酵母菌。也可能较好的是挑选出含有一个以上拷贝的导入的重组DNA分子的酵母菌，这样可获得该重组分子的高水平表达。
如以上所表明的那样，如果在具体酵母菌种中可能的话，理想的是产生某具体基因的纯合型酵母细胞品系，在某些类型酵母菌中这可通过采用单孢子(monosporous)培养来实现。采用这些技术，有可能产生携带着插入基因的单倍体品系，然后自发性或用秋水仙素使染色体数目增倍，这样产生了插入基因的纯合型酵母菌株，如果插入的基因含有适当的选择标志基因则不难通过试验检测出带有该基因的酵母菌。
以下实施例目的是进一步阐明本发明而不是以任何方式限制本发明的范围。本文的实施例和讨论具体指酿酒酵母菌，然而本文所讲的同样可应用于任何其他类型的酵母菌。本文引用的所有参考文献均纳入其整体内容作为参考。
实施例
实施例1
被选定要进入分泌通路的蛋白质，首先须通过内质网(ER)膜，须横穿称为“易位子”的蛋白质的孔进入(ER)腔(Johnson and VanWaes 1999)。新生的可溶性蛋白质进入ER腔，而膜蛋白质整合入ER膜，因为这些蛋白质以非折叠状态易位，后一步骤是在ER中装配成其天然构型。为此，该细胞器(ER)保留了为蛋白质恰当折叠和修饰所需的原始材料，酶和伴侣分子的目录清单。由于这些功能活动的局部定位性质、一种称为“ER质量控制”的机制防止了新合成多肽转运到发挥其功能的部位直到它们获得其天然构型(Ellgaard等1999)。
当蛋白质不能折叠时该质量控制机制也发挥了重要作用。错误折叠的蛋白质被引向称为ER相关蛋白降解(ERAD)的降解通路(Sommer and Wolf 1997；Brodsky and McCracken，1999)。此通路在ER腔中不会发生降解，而是蛋白质通过输入所用的同样的易位子复合物被转运回到胞质中(Wiertz等1996；Pilon等1997；Plemper等1997；Zhou and Schekman 1999)。称为逆的易位或脱位的该过程常常与遍在蛋白化作用(一种底物降解必须的共价修饰)相连系(Biederer等1997)。遍在蛋白化作用发生在ER的胞质表面，因为E2和E3分别酶解位于那儿的Ubc7p和Hrdlp/Der3p，遍在蛋白化作用的位置可能毗邻易位子(Hiller等1996；Bordallo等1998；Bays等2001)。一旦受到标记，这些蛋白即被胞质26S蛋白酶体迅速降解(Hiller等1996)。
虽然对降解部位附近的ERAD底物的结局知道得挺多，但关于它们如何识别、保留和引导向易位/遍在蛋白化机制却知之甚少。一个模式浮现在脑中即新生多肽输出后一部分仍留在易位子中，多肽只能以折叠形式释放，而错误折叠的蛋白质经同一个孔逆易位回到胞质。这个假设有吸引力，因为它为保留和降解提供了一种简单的机理。当已明确的酵母可溶性ERAD底物(称为CPY*的羧肽酶Y的突变体形式)完全穿过膜易位时，此模式产生了问题。(Plemper等1999)。
在哺乳动物细胞中观察到一种已明确特性的水泡性口炎病毒G(VSV-G)蛋白突变体ts045，当移到可引起它错误折叠的39.5℃后定位于细胞的ER中(Kreis and Lodish 1986)。一项采用融合于绿荧光蛋白的VSV-G ts 045的精彩研究是对ER保留机制的直接证据。采用活细胞光漂白实验，显示整合的膜蛋白在膜平面中自由移动但不离开ER(Nehles等2000)。通过在该限制性温度下延长培养时间，细胞过度表达了VSV-G ts 045，此蛋白中一个组分逃出ER转运到高尔基体被收回(Hammond and Helenius 1994)。虽然这些早期实验是在比较极端的条件下进行，但它们开辟了阐明错误折叠蛋白质再循环机制的可能性。酵母菌中此机制不大清楚，但Ste6P和Yorlp膜整合蛋白的突变型缺乏ER向高尔基体转运而有效降解似乎支持哺乳动物中的这个看法(Loayza等1998；Katzmann等1999)。
错误折叠的可溶性蛋白和膜蛋白二者的共同质量控制机制提出了一个空间问题，因为这两种类型蛋白质可能占据ER的不同区域(即腔和膜)。因此，似乎有理由认为存在着不同的识别和引导机制将这些蛋白引入降解通路。按此看法，可能会考虑错误折叠的可溶性蛋白和膜蛋白质二者利用的遍在蛋白/蛋白酶体通路要么是ER保留机制的终点，或是不同机制的会聚点。
在此项研究中，申请人检验了出芽酿酒酵母菌中易遭ERAD特异性降解的几种质量控制底物的结局。已证明保留和回收机制共同存在，它们具有不同类型的质量控制底物。这两条通路的分拣步骤发生在ER中，借此回收通路的底物被包裹在COPII转运水泡中，而待保留的底物受到排斥。另外，申请人采用遗传学方法分离了能剖析两条通路的突变体。一种突变体丧失了称为per17-1的BSTI基因的等位基因功能(任何丧失功能的突变体都有类似作用)，它可阻止错误折叠蛋白质的ER向高尔基体转运，而保存了大多数正常蛋白质的转运。在per17-1细胞中挽回通路早期步骤的质量控制受到破坏，如观察到在ER相关亚区室中有错误折叠的蛋白质积累和稳定化现象。
KHN是一种从高尔基体挽回的ERAD错误折叠蛋白质。
病毒膜蛋白是研究蛋白质折叠和ER质量控制的极佳模型(Gething等1986；Machamer等1990；Hammomd and Helenius，1994)。为了更好了解质量控制机制，申请人探索将它们(病毒膜蛋白)的优点与出芽性酿酒酵母菌的易得到的遗传学特征结合起来，虽然所说的这些技术同样可用于任何类型的真菌。选择了猿猴病毒5的凝血性神经氨酸酶(HN)，因为它的折叠状态可用现有方法监测(Ng等1989)。为了表达HN，用酵母Kar2蛋白的可切割信号序列置换了HN的信号/锚着结构域，将该融合构建物置于温和(moderate)酵母菌PRO(CPY)启动子下游。这样就绕过了酵母内源性信号/锚着结构域的不佳利用。产生的蛋白质命名为KHN，类似于哺乳动物细胞已鉴定的可溶性HN形式(Parks and Lamb 1990)。
申请人采用代谢性脉冲追踪分析监测了KHN的表达，取得了出乎预料的发现，如图6A所示，在30分钟追踪分析后KHN迅速消失，60分钟后几乎检测不到。因为免疫沉淀的蛋白质是细胞和培养液二者的蛋白，解释KHN的消失可不考虑是由于其分泌。另一种可选择的解释是外源性蛋白质KHN可能不能恰当折叠，而受到质量控制机制的作用导致其降解。此与以下看法相一致，即KHN不能形成二硫键相连的二聚体，不与构型依赖性抗HN单抗起反应。CUD是一个注定要经受ERAD的蛋白质遍在蛋白化作用所需的基因，在缺失了这样一个CUD基因的一株酵母菌中(Biederer等1997)，KHN看来在同样的时间过程中达到了稳定(图6A中)。申请人证实KHN是真正的ERAD底物，因为它通过多种ERAD特异性突变体而得到了稳定(见下)。令人感兴趣的是KHN的稳定化提高了对ERAD底物的出乎预料的特性，即凝胶迁移率的时间依赖性减低(图6A P1和P2)。申请人接着研究了此改变形式的性质。
在酵母分泌通路的许多蛋白质成熟过程中均常观察到分子量的逐步增加。这种增加是由于最初在内质网中结合的糖增加而致(Herscovics and Orlean 1993)。延迟反映了新生多肽转运至高尔基体(在那儿受到酶修饰)所需的时间(Gemmill and Trimble，1999；Strahl Bolsinger等1999)。记住此点，所观察到的修饰提出了令人兴趣的一种可能性，即KHN转运到高尔基体并被回收到ER避免了降解。申请人通过先检定这种改变是否确实是由于糖修饰来说明此可能性。采用内切糖苷酶H消化去除KHN的N-连接糖基团。如果凝胶迁移率的改变只是由于N-连接糖的修饰。那么内切糖苷酶H处理后所有类型的KHN应作同样迁移。但如图6A(右)所示，去除N-连接糖没有消除迁移率差异。申请人接着利用O-甘露糖基化第一步特异性缺陷的变异株，测试了O-连接糖。ER中O-甘露糖基化始于一个甘露残基从Man-P-多萜醇转移到该多肽。甘露糖转移酶(PMT)蛋白质家族的酶催化此反应。缺失各个PMT基因的菌株显示糖基化时缺乏底物特异性，反映了这些基因不丰裕性质(Gentzsch and Tanner1996)。申请人在每一种PMT家族成员(PMT1-PMT6)单一缺失的菌株中表达KHN。如图6B所示，缺失PMT1和PMT2的菌株防止了KHN迁移率的改变，结果p1保留了最终被降解的主要形式。这些资料表明KHN的O-糖基化依赖于PMT1和PMT2，它们的产物前已证明是作为复合物一起起作用的(Gentzsch等1995)。在PMT3至PMT6单一缺失的菌株中蛋白质的KHN特异性加工不受影响可能是由于此蛋白质的底物特异性之故。其他PMT可能与其他蛋白质一起工作。
ER中的蛋白质O-甘露糖基化修饰通常在高尔基体中延长糖链(Lussier等1997)。为了检验KHN的凝胶迁移率改变是否是由于ER后加工所致，申请人在特性明确的ER向高尔基体转运突变株sce12-4和sec18-1中，表达了KHN(Eakle等1988；Nakano等1988；Barlowe and Schekman 1993)。当这些菌株中的转运受阻时，KHN在一段延长的时间过程中保留了p1形式(图6C)，这与高尔基体中(有修饰性酶)形成的p2形式相一致。对这些资料我们命名ER形式为p1，命名高尔基体形式为p2。令人感兴趣的是，KHN的转向看来是因为在这些突变株中受到损伤，提示转运离开ER可能需要降解步骤。不幸的是，蛋白质的非特异性免疫沉淀使p1和p2形式重叠，使得难以测定KHN转向的动力学。因此，从这些实验得到的稳定化程序无说服力。
为了精确测定KHN转向的动力学，构建了其带有COOH末端三联HA表位标记(KHNt)的修饰形式。当采用抗HA单抗时，KHNt的免疫沉淀物可与背景(沉淀物)分开，其产量与用抗NH多克隆抗血清做的实验难以区别(图7A)。KHNt的修饰和降解类似于KHN，除了转向速度似乎略低外(图7A上，与图6A左，相比较)。虽然初步试验结果提示KHN也许是ERAD通路的底物，但其转运到高尔基体提出了一种组分也许继续向前输送到液泡(酵母菌的溶酶体等价物)中降解的可能性。然而缺乏功能性液泡蛋白酶的突变株中KHNt降解与野生型中的降解相类似排除了这种可能性(图7，A和B，Δpep4)。为了确定KHN是ERAD的底物，申请人测定了几株该通路特异性缺陷的突变株中KHNt的稳定性。如图7所示，当在缺失CUE1(其在遍在蛋白化中的作用是使Ubc7p锚着于ER膜)、DER1(编码一种ERAD需要的ER膜蛋白质)或HRD1/DER3(编码一种位于ER的E3遍在蛋白连接酶)基因的菌株中表达KHNt时，其降解受损的程度类似于其它已知的ERAD底物(Hampton等1996；Knop等1996；Biederer等1997；Bordallo等1998)。免疫印染分析显示在各突变株中有较高分子量形式的KHNt的稳态积累，证实了在野生型细胞中优先降解的物质正是KHNt。
错误折叠的蛋白质积累在ERAD功能缺陷细胞的ER中(Knop等1996；Loayza等1998)。因为KHNt降解前转运到高尔基体，故提出的问题是当ERAD受到破坏时KHNt积累在什么地方？通过间接免疫荧光试验申请人发现，如它与ER标志BiP共同定位所显示的那样，在ERAD突变株细胞的ER中也有KHN的积累(图7D)。这些资料表明KHNt的行为类似于某些已知的ERAD底物，提出了它的降解存在着一条回收通路的可能性。
注定要经历ERAD的蛋白质的质量控制的两种不同机制
KHN在ER的高尔基体突变株中的表达得到一出乎预料的发现：转运可能是其降解的专有步骤。这令人惊奇，因为其他ERAD底物，包括在突变株Ste6P和Yorlp中观察到通常在相同条件下发生降解(Loayza等1998；Katzmann等1999)。如果存在着不同机制将异常蛋白质引向降解：即Ste6P和Yorlp(二者均为膜整合蛋白)类蛋白的静止性(非再循环)ER保留机制和KHN类其他蛋白的转运和挽回机制，这种明显的矛盾可以得到解决。为了检验此可能性，申请人采用了补充的体内体外方法来评估这些底物降解前的结局。
首先，检验了阻断ER向高尔基体转运的影响，据报道在sec18突变株中ERAD底物Ste6-166P受到降解，提示即使此转运受阻ERAD功能还是正常的(Loayza等1998)。申请人发现Ste6-166P的稳定性与野生型相同(图8A)，证实了sec12和sec18细胞中的发现。作为对照，申请人证明在相同条件下ERAD缺陷性突变株使Ste6-166P稳定(图8A)。申请人还分析了要经历ERAD的另一膜蛋白Sec61-2p(Sommer and Jentsch1993；Biederer等1996)。因为Sec61p本身在ERAD中起作用，故异位表达了Sec61-2p并与带有HA表位标记的野生型相区别。与Ste6-166p一样，每一菌株中Sec61-2p均在限制性条件下正常降解(图8B)。相反KHNt的降解受到严重损伤(图8C)。因为这些菌株中核心ERAD的功能正常，缺陷可能是扰乱了降解前KHNt运送方式的结果。提出的问题是这种需求是否对KHNt是独有的？或反映了ER质量控制的较普遍特征？为此，申请人检验了另一已明确的可溶性底物CPY*的HA表位标记形式(Finger等1993)。虽然已清楚知道CPY* HA利用核心ERAD机制，但不清楚它是否保留或经历回收循环。如图8D所示，在sec12和sec18两个突变株中CPY* HA很稳定，提示它也依赖液泡转运通路。然而，这是令人惊奇的，因为先前报道CPY*在sec18突变株中降解(Finger等1996)。经3小时长时追踪分析这种降解最为明显。申请人还发现这些转运突变株中有一些降解，因此我们设想，如果我们采用类似的延长追踪分析可能发现该底物组分被降解。
上述资料提示有二类ERAD底物，一类底物的质量控制利用液泡运送机制，另一类依赖静止性ER保留。这种差别预示在ER中发生分拣，将待转运的错误折叠蛋白质与待保留的蛋白质分开。sec12和sec18突变株中降解速度的差异只提供了提示性证据，不排除间接作用的可能性。为了检验此观点进行了体外试验来再现COPII包被的小泡出芽和从ER膜选择运送货物(Barlowe等1994)。为了这些实验，制备了表达KHNt、CPY* HA和Ste6-166p野生型菌株的微粒体。分离了这些微粒体的COPII出芽小泡，用免疫印染监测了各个蛋白质包装入小泡的水平(图9)。通过密度测量计算了各蛋白质掺入率，表示为总量的百分比。申请人发现KHNt和CPY* HA两种蛋白有1-2％包裹入COPII小泡，而阴性对照Sec61p不被包裹。虽然包裹入COPII小泡的错误折叠蛋白质的量比其它分泌性蛋白低，但这与KHNt比其他货物蛋白转运较慢相符(图11B)。为了用此法分析KHNt和CPY* HA，用胰蛋白酶处理膜以保证测定(内质网)腔中受保护的蛋白酶。这些资料独立证实了，注定要经历ERAD的亚组蛋白质，首先通过标准的膜运送机制运离ER。
接着申请人检查了Ste6-166p。已有证据表明Ste6-166p是用ER保留机制被靶向降解。然而保留的性质不清楚。将ER小泡出芽试验应用于Ste6-166p，它仍然独自排斥地位于ER膜内，即使其他膜整合蛋白有效地掺入了COPII包被的小泡中(图9C)。这些资料显示胞浆膜蛋白Ste6p当错误折叠时保留在ER内而排斥在转运运小泡外。综合这些结果揭示了ER质量控制的一个新方面，作为其监督机制的一部分，细胞对错误折叠的蛋白作ER保留或者转运进行分拣。
KHNt和CPY* HA转运到高尔基体后，ERAD对它们的降解要求逆向转运到ER。膜和蛋白质从高尔基体逆向流动受到COPI类包被小泡形成的驱动。为了检验错误折叠的蛋白质转运是否利用COPI包被的小泡，申请人在r-COP突变株sec21-1中表达了KHN和CPY* HA，并测定了它们的转变。在30℃允许温度时正向转运不受影响，逆向转运受影响极小(Letourneur等1994)，观察到KHNt和CPY* HA降解有一小的但可重现的延迟。然而在半允许温度33℃时(部分破坏逆向转运而仅极微小延迟正向转运)(Letourneur等1994)两蛋白质的降解受到抑制(图10A和B)。通过分析内源性CPY(数据未公布)和KHNp2高尔基体形式的形成(图10A)，证实了正向转运的精确性。排除了对ERAD功能的间接作用，因为sec21-1细胞中Ste6-166p的降解是正常的(图10C)。这些资料综合起来表明对错误折叠的蛋白质进行了ER保留或转运和从高尔基体回收的分拣，最后这两条通路会聚在ER中受ERAD通路的降解。
回收通路早期ER质量控制所需要的基因
近年研究已证明某些货物蛋白质离开ER时受到主动分拣进入转运小泡(Mouiz等2001)。虽然这些分拣活动的分子机制不大了解，但转运涉及的具体基因是一个蛋白亚组的基因(Belden andBarlowe 1996；Muniz等2000)。由于KHNt和CPY* HA可能代表新的一类货物蛋白质，故提出了是否存在分拣和包裹错误折叠蛋白质进入转运小泡的因子这个问题。为了说明此问题申请人采用了遗传学方法。如果存在这类因子我们有理由认为它们功能的丧失会导致正常时转运出ER的错误折叠的蛋白质保留和稳定化。申请人曾报道过一种根据非折叠蛋白质反应通路的合成致死率的基因筛选方法，可作为鉴定ER质量控制相关基因的强有力工具(Ng等2000)。由于最初的筛选余地远没有用完，故扩大了其范围，目的是解析质量控制的ER保留和再循环机制。申请人因此而发现了挽回通路中错误折叠蛋白质顺行转运所需的一个基因。
从ER(per)突变株中152个隐性蛋白加工池开始，这些表现为正常蛋白整体加工缺陷，包括糖基化和转运被排斥(Ng等2000)。通过按图8说明中所述的方法测定CPY* HA和Sec61-2p的稳定性，分析了其余107个蛋白质的ERAD活性。申请人分析了KHNt的稳定性和加工。对一个突变株per17-1(功能丧失)，对KHNt和CPY* HA降解是缺陷的(图11A)，然而与其他ERAD突变株不同(图7)，per17-1细胞中KHNt保留着ERp1形式，这与向高尔基体转运受阻相符(图11B上)。Gas1p(图11B下)和几丁质酶(壳多糖酶)糖基加工在per17-1细胞中是正常的，其作用是控制per17-1细胞中的功能性O-甘露糖基化和修饰(Nuoffer等1991；Gentzsch andTanner 1996)。这表明KHNtp1形式的普遍性反映出是转运缺陷而不是对糖基化的间接作用。令人感兴趣的是折叠的货物蛋白质的转运显示出差别性结果，CPY转运类似于野生型而Gas lp较正常蛋白为慢(图11B)。因Gas lp固定在膜中，申请人检测了其他两种膜整合货物蛋白质，羧肽酶S(CPS)和碱性磷酸酶(ALP)(Cowles等1997：Spormann等1992)。如图11C所示，这二种蛋白对野生型菌转运没有不同，证实per17-1突变不会导致ER向高尔基体转运的整体缺陷。
以上资料提示，per17-1突变由于不能促进错误折叠蛋白质转运到挽回通路而抑制降解。为了强化此观点，我们分析了分拣到ER保留通路的ERAD底物的命运。如果PER17在ER质量控制中起着独特作用，设想保留通路是起作用的，这些底物在per17-1细胞中将正常转变。如图11A(下)所示，per17-1细胞中Ste6-166p和Sec61-2p以野生型细胞动力学方式降解。这些资料表明per17-1等位基因对再循环通路是特异的，验证了我们遗传的策略。虽然这些资料与采用sce12和sce18突变株获得的资料相似但它们扩大了证据，表明转运是降解的重要步骤，因为per17-1转运受阻影响了错误折叠的可溶性蛋白，而几种正常的货物蛋白质的转运保持完好。
为了更好了解per17-1转运受阻的性质，申请人进行了间接免疫荧光分析以确定per17-1细胞中KHNt和CPY* HA被稳定的位置。如图12所示，KHNt和CPY*HA二者都浓积在整个细胞的点状结构中，这与转运有活性ERAD突变株不同，因为它们通过ER弥漫地累积这些底物(Knop等1996；图7D)。令人感兴趣的是，这种点状分布使人联想到sec12突变株细胞中所见的货物蛋白转运受阻模式(Nishikawa等1994)。在这此细胞中，ER伴侣蛋白BiP与货物蛋白共同位于ER中的分开的部位。因为错误折叠蛋白质转运受到类似阻断，我们还检查了per17-1细胞中BiP的分布。如图12所示在与KHNt和CPYHA同一点状结构中找到了BiP(图12A、B和E)。虽然BiP广泛用作ER形态学标志，申请人要问，这种模式是否反映了ER的亚结构域(如sec12细胞)或ER膜的全面改组？为说明这一点选择了另一种ER标志：信号识别颗粒受体β亚基(SRβ)。SRβ是一种膜整合蛋白质分布在整个ER中(Ogg等1998)。如图12B所示per17-1细胞SRβ染色与野生型相似，表明ER形态没有大的改变(图12B，e)这与用同一菌株作的超微结构分析很相符。在双标记实验中经SRβ确定该点状结构总是与ER重合(图12B)，以上资料表明错误折叠蛋白质与BiP积累在per17-1细胞的不同ER部位。
接着鉴定了PER17基因。将基于着丝粒YCP50载体的酵母菌基因组文库转化为per17-1突变株，通过恢复扇形表型获得一互补克隆(Ng等2000)。检索整个缺失图谱鉴定到一个编码BST1(Bypassof sec thirteen)的ORF为PER17基因。BST1编码一种通过与SEC13(COPII小泡包膜的一种成分)的遗传性相互影响第一次克隆的ER膜整合蛋白质(Elrod-Erickson和Kaiser1996)。因此据信BST1在ER向高尔基体转运中起作用。然而其精确作用在本领域中还不知道，因为BST1基因缺失似乎不影响两原型货物蛋白质，CPY和转化酶的转运。以上资料提示了BST1在ER质量控制中的新功能。因为per17-1和Δbst1细胞防止错误折叠蛋白质的转运而不防止大多数适当折叠蛋白质的转运，所以此资料也提示了其在货物蛋白质分拣中起作用(图11B；资料未公布)。
讨论
几乎25年前就首先发现了监视内质网中新生蛋白折叠状态的细胞监视系统。这些领先研究表明病毒膜蛋白错误折叠时不能转运至胞质膜而留在合成部位(Gething等1986；Kreis andLodish1986)。后来该现象被恰当地称为“ER质量控制”。根据突变蛋白质保留和降解的分子基础导致对几种人类疾病(包括膀胱纤维增生病)的认识(Carrell and Gooptu1998；Kim and Arvan，1998；Kopito and Ron2000)。最近的重要的进展提高了我们对ER质量控制的认识，最值得注意的是现认识到降解步骤或ERAD涉及底物通过ER易位子孔逆向易位至胞质(Wiertz等1996；Pilon等1997；Plemper等1997；Zhou and Schekmann1999)。逆向易位过程中或之后，底物受到遍在蛋白化及26S蛋白酶体的降解(Ward等1995；Hiller等1996)。除了这些进展外，上游至ERAD的活动仍不清楚。
申请人发现两种不同机制的合作保证了酵母分泌通路中蛋白质生物合成的质量控制。通过生化和遗传方法联用，再次证实了此保留机制，同时提示了另一种利用已知的ER向高尔基体小泡转运和挽回通路机制(图13)。申请人公开了错误折叠蛋白质的体内外ER向高尔基体转运的直接证据和逆向转运所需成分。
该方法的关键是作为新ERAD底物的KHN特征鉴定。与通常研究的其他错误折叠蛋白质不同，KHN使得我们可利用O-连接糖修饰监测其转运(图6)。哺乳动物细胞中天然HN蛋白没有O-糖基化，因此似乎有可能这种修饰是由于酵母菌中蛋白质错误折叠时发生了混乱的O-甘露糖基化(Harty等2001)。这些糖的加工表明大多数(如果不是全部)蛋白质在ERAD之前利用了一种挽回机制。而且申请人发现正向或逆向转运的破坏损伤了KHN的降解。转运所需成分没有特殊性，因为已熟知的底物CPY*在所有情况下受到的影响相似。由于在这些突变株中被保留的底物正常降解，故我们的研究资料强烈提示转运和挽回是KHN和CPY*有效降解的专门步骤。
采用纯化成分进行的体外小泡出芽试验提供了KHN和CPY*包装入COPII包裹的小泡中，而Ste6-166p则被是排斥的直接证据。这些实验很重要，因为以前已建立的试验反映了ER向高尔基体转运的早期活动，虽然该资料的作用是证实和扩展体内实验，但它们也揭示对于错误折叠蛋白质在其形成COPII小泡时或之前存在一种新的ER分拣机制。挽回通路主要利用标准的小泡转运机制，但我们不知道错误折叠蛋白质是否占用与正确折叠货物蛋白质相同的小泡。最近已证明不同类型折叠的货物蛋白质占用不同的小泡群(Shimoni等2000；Muniz等2001)。因此似乎有可能错误折叠的蛋白质为了转运至高尔基体被分拣到特定的小泡中。
材料和方法
本研究所用的质粒
采用标准的克隆方法(Sambrook等1989)构建质粒。如前所述(Ng等2000)pDN431和pDN436为HA表位标记的CPY*表达载体。pSM1083和pSM1346为HA表位标记的Ste6-66p表达载体，是S.Michaelis Johns Hopkins University，Baltimore，MD赠送(Loayza等1998)。
构建HA表位标记的Sec61-2p表达载体pDN1002
用Vent聚合酶(New England Biolabs，Inc.)按制造商的方法通过扩增基因组DNA从菌株RSY533(MATα，sec61-2，leu2，ade2，ura3，pep4-3)克隆了启动子和see61-2的编码序列。采用引物N782(5’-CGAATCCGTCGTTCGTCACC-3’)和N183(5’-TTCCCATGGAATCAGAAAATCCTGG-3’)扩增2016-bp片段。用HindIII和NcoI消化，纯化1931-bp片段。将此纯化片段连接于用同样的酶消化的pDN333。将pDN280(Ng等1996)的HA标记插入物插入pRS315(Sikorski and Hieter1989)中产生pDN333。N183的NcoI位点安置Sec61-2p编码序列于框内带上编码一个HA标记的载体序列后又随ACTT终止子序列。
构建KHN表达载体pSM31、pSM56、pSM70和pSM72。
通过连接Kar2p前45个氨基酸(信号序列和信号肽酶切割位点)的编码序列与SV5HN基因的COOH末端528个氨基酸，构建了KHN融合基因。用Vent聚合酶通过PCR扩增二片段，将其插入pDN251中产生pSM31。pDN251与酵母表达载体pDN201相同(Ng等1996)，除了它含有温和的PRC7启动子以代替TDH3启动子外。pSM70与pSM31相同，除了增加一框内插入到KHN的COOH末端的三联HA表位标记外。从pCS124(C.Shamu，HarvardUniversity赠，Cambridge，MA)切下三联HA表位标记的编码序列。pSM56和pSM72分别类似于pSM31和pSM70，除了KHN基因序列亚克隆入pRS315。
通过将含有pS0459(Ogg等1998)的HA表位标记SRβ基因的NotI/KpnI片段插入pRS426(Sikorski and Hieter 1989)构建pES69。
菌株和抗体
本研究所用酵母菌株见表1，抗HA单克隆抗体(HA.11)购自BabCo。Peter Walter(University of California，San Francisco，CA)提供了抗Kar2p抗体。抗CPY抗血清由Reid Gilmore提供(University of Massachusetts，Worcester，MA)，抗Gaslp为HowardRiezman(University of Basel，Basel，Switzerland)赠送。抗ALP和抗CPS抗血清为Chris Burd and Scott Emr(University ofCalifornia，San Diego，CA)赠送。抗HN抗血清如前所述制备(Ng等1990)。标记Alexa Fluor 488或546的第二抗体购自MolecularProbes，Inc.。
细胞标记和免疫沉淀
通常沉淀对数生长期的(酵母)细胞2单位A600OD，重悬于1毫升不含甲硫氨酸和半胱氨酸的合成性完全培养液中。在适当温度培育30分钟后用480微居里的Tran35S标记物(1CN Biomedicals)标记细胞。加入冷的甲硫氨酸/半胱氨酸至最终浓度2mM启动追踪。在脉冲结束前30秒开始追踪以耗尽未能掺入的标记的细胞内池。加入三氯醋酸至10％终止标记/追踪。如前所述(Ng等2000)制备细胞裂解液，进行免疫沉淀，凝胶电泳和免疫沉淀蛋白的定量测定。
体外出芽试验
如(Bariowe等1994)所述，将微粒体(Wuestehube andSchekmann，1992)与纯化的COPII蛋白(Sarlp，Sec23p复合物和Sec13p复合物)一起培育体外再现了ER的小泡出芽。从表达错误折叠的KHNt、CPY’HA和Ste6-166p(SMY248、WKY114和SMY225)细胞制备微粒体。为了测定蛋白掺入COPII小泡，用TLA100.3转头(Beck.Man，Coulter)100,000g离心15微升等份的总出芽反应物和150微升含出芽小泡的上清液，收集膜。将得到的膜沉淀物溶于30微升SDS-PAGE标本缓冲液，取10-15微升在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离。为了测定COPII小泡中含有的KHNt和CPY’，冰上用胰酶(100微克/毫升)处理膜10分钟，然后加入胰酶抑制剂(100微克/毫升)以保证检测到不受蛋白酶影响的成份。通过免疫印染的密度仪扫描，确定总反应物中包裹入小泡的各蛋白质(KHNt、CPY、Ste6-166p、Boslp、Erv25p和Sec61p)的百分比。[35S]-prepro-α-F翻译后易位入微粒体后通过伴刀豆球蛋白A-Sepharose沉淀，测定了包裹入出芽小泡的未受蛋白酶影响的[35S]glycol-proα因子(Wuestehube and Schekman，1992)。转移到硝纤膜和曝光于磷光屏后作摄影分析(Molecular Dynamics)观察[35S]glycol-pro-α因子。
间接免疫荧光显微镜观察
以合成性完全培养液培养细胞至0.5～0.9OD600。培养液中直接加入甲醛(EM级Polyscience Inc)到3.7％，30℃培育1小时。固定后离心收集细胞，用5毫升0.1M磷酸钾缓冲液pH7.5洗涤。将细胞在原生质球缓冲液(1.0毫克/毫升zymolyase20T，(ICNBiomedicals)0.1M磷酸钾pH7.5，0.1％2巯基乙醇)30℃培育30分钟消化细胞壁。以PBS洗细胞一次终止消化。取30微升细胞悬液加到聚L赖氨酸包被的载玻片各孔中1分钟，用PBS洗三次。将载玻片浸入-20℃丙酮中5分钟，空气干燥。在室温下进行以后的步骤，各孔加入30微升PBS封闭液(PBS中含3％BSA)培育30分钟。分别加入用PBS封闭液1∶1000或1∶5000稀释的第一抗体α-HA或α-Kar2p，反应1小时。用PBS封闭液洗孔3-5次。各孔加入30微升第二抗体(Alexa Flour488羊抗小鼠或抗兔，及AlexaFlour546羊抗小鼠或抗免Molecular Probes，Inc.)暗处培育45分钟。用PBS封闭液洗涤各孔5-7次，用PBS洗二次。各孔用5微升固定液(mounting medium)(PBS 90°甘油0.025微克/毫升DAPI)和盖玻片密封。在ZEISS Axioplan上置荧光显微镜上观察标本。用Spot 2冷却式数码相机(Diagnostic Instruments)收集影象，用Adobe Photoshopm4.0存档。在用KHNt的实验中将两个拷贝的基因导入各菌株以提高检测。单拷贝表达水平低可能是由于酵母细胞利用这种哺乳动物病毒基因密码子为亚适程度。通过增加基因剂量，表达水平类似于单拷贝时的CPY* HA，对例如ERAD底物的加工无影响(资料未公布)。
参考文献
以下为纳入本文的参考文献，除了本文引用的其他所有文献外。
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实施例2
表达真核性分泌蛋白的酵母载体系统。我们设计和构建了通用的载体系统(见图14)，在酵母中表达异源性(如哺乳动物的)分泌性或膜蛋白。该载体含有能在大肠杆菌中增殖和操纵的细菌性复制子，还含有酵母来源的着丝粒，提供了复制和有丝分裂的稳定性，另外，可得到基因组整合产生稳定的菌株所需要的描述文本(version)。表达模式根据用户需要不难操纵。酿酒酵母菌中的已知最强的组成型启动子是TDH3启动子，它驱动表达。战略安置限制性位点的方法使得可采用受试者自己的信号序列(如果在酵母菌中确定能起作用)或采用此模型中含有的酵母BiP信号序列。已证明酵母菌BiP信号序列比其他序列效率高，因为它能引导重组蛋白进入SRP通路，这是一种共同翻译的易位机制，是哺乳动物细胞中分泌蛋白和膜蛋白所使用的主要通路。通常用的α因子信号序列已证明有问题，因为它利用高等真核细胞不常用的翻译后通路。相反BiP信号序列对表达异源蛋白的功效中显示了100％成功率。此模型也含有6个组氨酸的尾，有利于重组蛋白的纯化。在目的cDNA插入时如果不需要可去除此尾。以酵母ACT1终止子终止转录。
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ttcccatgga atcagaaaat cctgg                                             25
<210>3
<211>483
<212>PRT
<213>yeast
<400>3
Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Ile Ser Ala Ile Asp Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
            20                  25                  30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
        35                  40                  45
Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
                85                  90                  95
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
            100                 105                 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Lys Ser Ser Ser Ser Trp Ser Tyr
        115                 120                 125
Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Tyr Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
    130                 135                 140
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser
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<213>Saccharomyces cerevisiae
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cgaatccgtc gttcgtcacc                              270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
        275                 280                 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
290                 295                 300
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305                 310                 315                 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
            325                 330                 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
        340                 345                 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
    355                 360                 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370                 375                 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
385                 390                 395                 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
            405                 410                 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
        420                 425                 430
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
    435                 440                 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450                 455                 460
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465                 470                 475                 480
Pro Gly Lys
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Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys
1               5                  10                   15
Ile Ser Ala Ile Asp Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr
            20                  25                  30
Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly
        35                  40                  45
Pro Val Thr Thr Gly His Phe Ser Tyr Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly
    50                  55                  60
Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Thr Asn Lys His Ser Trp
65                  70                  75                  80
Thr Pro Ala Arg Phe Ser Ala Ser Leu Leu Gly Gly Lys Cys Ala Leu
                85                  90                  95
Thr Leu Ser Gly Ala Arg Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu
            100                 105                 110
Leu Ser Tyr Gly Asp Gly Val Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr
        115                 120                 125
Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro
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Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile
145                 150                 155                 160
Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser
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Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser
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Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln
        195                 200                 205
Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser
    210                 215                 220
Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225                 230                 235

Claims (42)

1.一种在真菌中生产异源性蛋白质的方法，其特征在于，此方法包括提供一种受体真菌细胞，和向所述受体真菌细胞导入一聚核苷酸表达构建物；所述细胞中的质量控制机制经修饰以致折叠不完全的异源性蛋白质在内质网中不会被降解。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌细胞是一种酵母菌细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述导入通过选自以下的一种转化方法来进行：PEG、电穿孔、粒子轰击和乙酸锂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述转化方法是乙酸锂介导的转化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚核苷酸构建物在一酵母菌质粒中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述受体细胞经修饰后致使O-糖基化受抑制。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述受体细胞包括蛋白质甘露糖转移酶基因的抑制。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述甘露糖转移酶基因包括选自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6组的一个基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述PMT基因是PMT1。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述PMT基因是PMT2。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述受体基因提供了对Bypass of Sec Thirteen基因的抑制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Bypass of SecThirteen基因是BST1。
13.一种根据权利要求1所述的方法转化的酵母菌细胞。
14.一种根据权利要求1所述的方法生产的蛋白质。
15.一种在真菌中生产异源性蛋白质的方法，其特征在于，此方法包括提供一种受体真菌细胞，和向所述受体真菌细胞导入一聚核苷酸表达构建物；所述受体真菌细胞中的糖基化受到抑制以致错误折叠的异源性蛋白质不会被降解；所述构建物含有在所述细胞中表达的结构基因，所述基因操作性连接于在所述受体真菌细胞中表达所需的调控序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述真菌细胞是一种酵母细胞。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述导入通过选自以下的一种转化方法来进行：PEG、电穿孔、粒子轰击和乙酸锂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述转化方法是乙酸锂介导的转化。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述聚核苷酸构建物在一酵母菌质粒中。
20.根据权利要求15所述的方法，其中所述受体细胞含有的蛋白质甘露糖转移酶基因其表达受到抑制。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述甘露糖转移酶基因包括选自PMT1、PMT2、PMT3、PMT4、PMT5和PMT6组中的一个基因。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述PMT基因是PMT1。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述PMT基因是PMT2。
24.一种根据权利要求15所述的方法转化的酵母菌细胞。
25.一种根据权利要求15所述的方法生产的蛋白质。
26.一种在真菌中生产异源性蛋白质的方法，其特征在于，此方法包括提供一种受体真菌细胞，和向所述受体真菌细胞导入一聚核苷酸表达构建物；所述受体真菌细胞中的Bypass of SecThirteen表达受到抑制以致错误折叠的异源性蛋白质不会被降解；所述构建物含有在所述细胞中表达的结构基因，所述基因操作性连接于在所述受体真菌细胞中真菌细胞表达所需的调控序列。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述真菌细胞是一种酵母细胞。
28.根据权利要求1所述的方法，其中所述导入通过选自以下的一种转化方法来进行：PEG、电穿孔、粒子轰击和乙酸锂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述转化方法是乙酸锂介导的转化。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述聚核苷酸构建物在一酵母菌质粒中。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述Bypass of SecThirteen基因是BST1。
32.一种根据权利要求28所述的方法转化的酵母菌细胞。
33.一种根据权利要求28所述的方法生产的蛋白质。
34.一种用于转化酵母菌细胞的聚核苷酸，其特征在于，此聚核苷酸含有能驱动酵母细胞表达的启动子、大肠杆菌中增殖所需的细菌复制子、转录终止信号、酵母BiP信号序列、复制和有丝分裂稳定性所需的酵母起点和着丝粒；其中所述聚核苷酸引导重组蛋白质的表达进SRP通路。
35.根据权利要求34所述的聚核苷酸还含有一6个组氨酸的尾，以利于蛋白质纯化。
36.根据权利要求34所述的聚核苷酸，其中载体如图14所示。
37.一种用于生产异源性蛋白质的酵母细胞，其特征在于，所述细胞的修饰为所述细胞中质量控制机制的修饰，以致错误折叠的异源性蛋白质在内质网中不受到降解。
38.根据权利要求37所述的酵母细胞，其中所述修饰包括抑制O-连接糖基化的修饰。
39.根据权利要求38所述的酵母细胞，其中所述修饰是PMT功能丧失修饰。
40.根据权利要求39所述的酵母细胞，其中所述PMT修饰是针对PMT1的。
41.根据权利要求41所述的酵母细胞，其中所述PMT修饰是针对PMT2的。
42.根据权利要求37所述的酵母细胞，其中所述修饰包括抑制Bypass of Sec Thirteen产生的修饰。
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