CN1582956A - 一种分枝杆菌多糖复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗多种疾病有效的免疫治疗药。本发明涉及用生物化学方法从一种非致病性分枝杆菌菌体中提取的纯多糖制剂，单糖构成有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。它可广泛刺激动物和人的免疫系统，通过使多种免疫细胞的活化及细胞因子的产生，发挥免疫治疗效应。该制剂生产安全、生产周期短、人体应用无任何毒副作用，可用于化疗肿瘤患者的白细胞减少，HBeAg阳性的慢性乙型肝炎以及其他伴有免疫功能降低或因免疫功能低下而引起的多种疾病的治疗。

Description

一种分枝杆菌多糖复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种对治疗多种疾病有效的免疫治疗药。具体而言，本发明涉及一种从非致病性分枝杆菌全菌体中提取的纯多糖复合物以及制备方法。

背景技术

目前的研究表明，某些真菌、细菌及中药来源的多糖有明显的增强机体免疫功能的作用。其中研究较多的是有关分枝杆菌的免疫作用和应用。有关分枝杆菌免疫作用的研究可大致概括为两个方面。一方面是作为免疫佐剂，例如由牛型结核杆菌制备的卡介苗(BCG)和从分枝杆菌细胞壁中提取制备的胞壁酰二肽(MDP)。这类物质使用已久，它们属于非特异性免疫增强剂，除用于实验研究外，也可用于提高肿瘤患者和慢性感染性疾病患者的免疫功能。

另一方面是作为免疫治疗剂，其中研究较多的是应用分枝杆菌的提取物，已经有使用细胞壁提取物的报道，如CN94191293.0描述了一种免疫治疗组合物，它是一种不含油的改性分枝杆菌细胞壁提取物的制剂，但其中含有一些对发明目的无效甚至作用相反的其它物质，在使用后会对人体有一定的副作用，如过敏反应。

另一个例子是日本的S.S.M(SpecialSubstance，Maruyama)，以前称为丸山疫苗。它是人型结核杆菌青山株的提取物，其主要成分为阿拉伯甘露聚糖，早期是在日本作为肿瘤治疗的试验性用药，具有延长晚期肿瘤患者生命、消除肿瘤所致疼痛的作用。进一步研究发现其抗肿瘤的机制是能在肿瘤组织周围形成胶原的包裹，阻止肿瘤的扩散，并发现它能促进造血因子的产生，升高白细胞水平。1992年日本厚生省批准该药作为治疗后肿瘤患者的白细胞减少的药物(药品名Ancer-20)。

然而，S.S.M是由人型结核杆菌提取的多糖物质，因人型结核杆菌对人有严重的传染性，致使其生产过程具有一定的危险性；并且由于该菌的培养周期长，使其生产周期长。另外，据报道S.S.M使用后有4.7％患者注射局部出现过敏反应，说明该制剂有一定的毒副作用，使其应用受到一定程度的限制。

因此，有必要研究能缩短生产周期、价格经济并且能使临床使用的副作用降至最低甚至没有副作用的分枝杆菌提取物。

发明内容

根据上述需要，本发明申请人提供了一种分枝杆菌多糖复合物，从而解决了上述难题。

本发明一方面涉及一种分枝杆菌的多糖复合物，它主要含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

在一种优选实施方案中，上述分枝杆菌多糖复合物的分子量在2,000～20,000之间。

所述分枝杆菌优选是草分枝杆菌。

本发明还涉及一种制备分枝杆菌多糖复合物的制备方法，包括以下步骤：

(一)将含有分枝杆菌的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养至生长成黄色至橙色菌膜；

(二)多糖粗提：将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，酸碱处理，用极性有机溶剂在低温下沉淀多糖，获得粗制多糖；

(三)多糖精制：上述粗糖经离子交换柱及超滤处理后冷冻干燥得精制多糖；

在本发明的制备方法的优选实施方案中，上述极性有机溶剂为乙醇。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物或含有该复合物的药学组合物的使用形式可以是注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、乳剂。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物或含有该复合物的药学组合物的给药途径包括口服、经皮、静脉或肌肉注射。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物或含有该复合物的药学组合物可以单独使用，也可以与其它药物结合使用。结合使用的药物包括抗肿瘤药。所述抗肿瘤药包括环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、氟铁龙、安曲希、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、正定霉素、长春新碱、喜树碱、顺铂、乐沙定、辛乐尔或紫杉醇等。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物的剂量使用范围为(0.02-5μg)/kg体重/天。

本发明进一步涉及含有本发明分枝杆菌多糖复合物的药学组合物。该复合物含有活性成份为分枝杆菌多糖复合物以及药学上可接受的赋型剂，载体或稀释剂，以常规方法将其制成药物。

经研究证实，本发明分枝杆菌多糖复合物与现有技术相比具有生产更安全、生产周期更短、使用无任何毒副作用以及应用范围更广泛的优点，而且成品价格低廉。

具体实施方式

本发明是以非致病性的分枝杆菌——-草分枝杆菌为原料，用生物化学方法提取多糖成分。

本发明通过以下工艺过程制备：

(一)菌种保存与鉴定

菌种用罗氏鸡蛋斜面培养基上培养保存。增菌接种前，先经苏通培养基传代培养。传代培养后，对细菌生长情况进行检定，并经耐酸染色和革兰染色进行形态学检定。

可以使用多种分枝杆菌，优选使用草分枝杆菌。

(二)将检定合格的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养2周。由于本菌为表面生长，在苏通液体基表面生长成黄色至橙色菌膜。

(三)多糖粗提

将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，酸碱处理，用乙醇在低温下沉淀多糖获得粗制多糖。

(四)多糖精制

粗制多糖经阴离子交换柱及超滤处理后冷冻干燥得精制多糖，其分子量为2,000～20,000。

经分析表明本发明分枝杆菌多糖的主要组分为阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等单糖。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物或含有该复合物的药学组合物可以以注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、乳剂的形式使用。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物或含有该复合物的药学组合物的给药途径包括口服、经皮、静脉或肌肉注射。

在本发明中，所述分枝杆菌多糖复合物或含有该复合物的药学组合物可以单独使用，也可以与其它药物结合使用，例如与抗肿瘤药结合使用，所述抗肿瘤药如环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、氟铁龙、安曲希、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、正定霉素、长春新碱、喜树碱、顺铂、乐沙定、辛乐尔或紫杉醇等。

本发明分枝杆菌多糖的优选使用方法是单剂量皮下注射。将用本发明的方法获得分枝杆菌多糖复合物溶于注射用生理盐水中，制成分枝杆菌多糖注射液(MPS)，供皮下注射使用。每次15μg(1ml溶液中含15μg)，隔日注射一次。应用时间则根据疾病种类及病情严重程度而定，一个疗程为一个月，一般使用1-3个疗程。也可以静脉注射、局部给药或口服给药。

以下将以实施例的方式进一步阐述本发明。

实施例

实施例1

本草分枝杆菌采用罗氏鸡蛋斜面培养基培养保持。采用苏通培养基进行扩增培养，每瓶110-120ml，在35℃-37℃温室培养2周后，培养瓶表明生长出黄色至橙色菌膜。培养瓶中菌膜下的液体应澄清透明，不应有灰绿色或灰黑色污染物生长，也不应有臭味或异味。培养物需经逐瓶检查，确保其未污染、无异常方可用于多糖的提取。

将上述培养物集中于大玻璃烧杯内，置沸水中加热煮沸2个小时，冷却后4000转/分离心20分钟，使菌体沉淀碴完全沉淀，上清液为清澈透明。收集上清液，加入冰醋酸，冰醋酸量约为占总液体量的1％，同样方法离心，收集上清液。此上清液再加1％量的氢氧化钠，100℃水浴中加热2小时，同样方法离心，收集上清液，3倍乙醇沉淀，沉淀物用乙醇、丙酮洗涤，烘干即为多糖粗提物。

上述多糖粗提物用水溶解。上离子交换柱，自动部分收集器及紫外监视仪收集。样品加入量为20-30ml。对收集的各部分多糖组分用苯酚-硫酸法检测，弃去无糖及含色素的部分。

将收集的多糖部分，膜超滤，放入冷冻真空干燥机中干燥，分装于小瓶密封，置干冷处保存。

用注射生理盐水，按处方使用含量配制成15μg/ml、45μg/ml分枝杆菌多糖溶液，分装按瓿，经高压灭菌处理。经此处理的分枝杆菌多糖注射液其保质期至少为2年。

实施例2

为检测经实施例1制备的经大量的实验研究表明本发明具有广泛提高机体免疫功能，升高白细胞等作用。人体应用无任何毒副作用。

为检验本发明复合物在增强小鼠巨噬细胞吞噬杀伤活性中的作用，进行了本发明复合物对小鼠巨噬细胞吞噬杀伤活性影响的实验。使用20-25g的小鼠进行实验。将动物随机分为两组每组10只。于实验组小鼠腹腔内注射本发明复合物0.5ml(50μg/ml)，对照组腹腔内注射0.5ml生理盐水，16h后，用RPMI1640液(请标明来源)(pH7.4)3ml冲洗小鼠腹腔，将腹腔冲洗液置于组织培养瓶内，37℃孵育30分钟后，弃去瓶内液体，以0.5mlRPMI1640液冲洗瓶壁获得的粘附细胞即为本实验用巨噬细胞的来源。记数细胞后制成5×105/ml的细胞悬液。经台盼蓝排斥试验检查细胞存活率＞95％。

使用本实验室保存的临床分离金黄色葡萄球菌菌株，将细菌接种于肉汤培养基培养18h后，制备成2×10⁸/ml悬液备用。

将小鼠S180腹水癌细胞(北京肿瘤研究所提供)接种到小鼠皮下生长后取出肿瘤，剪碎并用细胞研磨器研磨，加入RPMI1640液制细胞悬液.细胞悬液洗涤3次后，计数细胞并制成：2×107/ml细胞悬液.经台盼蓝排斥试验检查细胞存活率＞95％。

参照文献(RobisonP等，Infect.Immun1984；43：744-752)方法，将0.2ml巨噬细胞(5×105/ml)悬液加入发光测定管中，置37℃水浴20min后，加入20μlluminol，经37℃水浴保温10min后，用发光光度计(LumiphotometerTD4000，Labosciene)测定发光本底。然后加入金黄色葡萄球菌悬液(2×108/mi)或小鼠S180腹水癌细胞悬液(2×107/mi)0.1ml，混匀后连续测定30min，观察30min内(自动减除本底)的积分值。测定时分别测定两组每只小鼠样品的积分值，取其均值计算。

本发明制剂对小鼠巨噬细胞受金黄色葡萄球菌刺激后活性的影响见表1。

表1 本发明制剂对小鼠巨噬细胞受金黄色葡萄球菌刺激后活性的影响

              小鼠数          积分值(cpm)    两组比较

组别

              (只)            X±S           (t检验)

实验组        10              37.92±32.11

                                             P＜0.01

对照组        10              5.34±5.38

结果表明，经注射本发明制剂诱导的小鼠巨噬细胞在与金黄色葡萄球菌作用过程中，其发光强度(积分值)比对照组明显增强(P＜0.01)。

应用化学发光方法测定巨噬细胞对小鼠S180腹水癌细胞的作用，亦观察到本发明制剂增强了巨噬细胞的活性，实验结果如表2所示。

表2 本发明制剂对小鼠巨噬细胞受肿瘤细胞刺激后活性的影响

           小鼠数    积分值(cpm)    两组比较

组别

           (只)      X±S           (t检验)

实验组     10        29.07±27.22

                                    P＜0.01

对照组     10        5.48±5.29

为了了解经本发明制剂增强了活性的巨噬细胞能否杀伤肿瘤细胞，又应用染料排斥实验方法，观察了肿瘤细胞在经和未经本发明制剂注射的小鼠巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的情况(实验组及对照组每组各3只小鼠)。结果显示经本发明制剂作用后(实验组)杀伤25.5％的瘤细胞(对照组杀伤13.3％)，提示本发明制剂可能具有增强小鼠巨噬细胞杀伤小鼠S180肿瘤细胞的作用。

实施例3

消除免疫抑制剂(环磷酰胺)所致的小鼠白细胞减少及促进其回升

动物：LACA小鼠，雄性，18～22g，购自北京医科大学动物中心。

药物：MPS为安瓿分装的水针剂，分为60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml和120μg/ml4种规格。惠尔血(GRAN)为75 P8的安瓿针剂，日本麒麟啤酒株式会社产品，批号：483A。环磷酰胺(Cydophosphamide，CP)为每瓶20mg粉剂，上海第十二制药厂产品，批号：920317。

实验分组与给药：每批实验分7组，每组10只小鼠。正常对照组为健康LACA小鼠，以注射生理盐水代替给药；环磷酰胺组按120mg/kg给予CP，于第6、7天，每天1次腹腔注射给药；阳性药物对照组以惠尔血按50μg/m²(体表面积)计算给药，即每只3.9μg，于第1、4和7天皮下注射1次；以及MPS1组～MPS4组，分别依次为0.6、0.8、1.0和1.2mg/(kg·d)，皮下注射1次，第1～7天连续给药。上述阳性药物对照组和各MPS组，均在第6、7天腹腔注射环磷酰胺120mg/kg，每天1次。

骨髓造血祖细胞培养与定量测定

采用双层软琼脂培养法。即无菌取小鼠股骨，冲洗骨髓制备细胞悬液，过4.5针头，计数有核细胞数，将细胞悬液稀释成5.7×10⁶ml^-1备用。小鼠肺条件培养基(CM)的制备为：预先用健康小鼠肺做液体培养7d，取上清液，微孔滤膜过滤除菌，分装备用，以健康小鼠骨髓细胞作靶细胞测定CM活性。培养体系为底层RPMI 1640 5.0ml，马血清2.5ml，3％琼脂糖1.0ml；上层RPMl 1640 3.0ml，马血清1.4ml，CM0.6ml，骨髓细胞悬液0.2ml，3％琼脂糖0.5ml。先做底层，底层培养体系充分混合后，向每个直径30mm平皿注入1.0ml，待凝后，做上层培养体系，即在底层之上加注1.0ml上层，待凝后，将小平皿置于100～200mm直径的大平皿中，于37℃5％CO2中培养5d。在40倍显微镜下计数造血细胞集落(每个集落应含≥50个细胞)。最后计算各组的平均值及标准差，并做统计学分析。

经重复3批实验的结果表明，正常小鼠骨髓每2×10⁵个有核细胞可形成100～120个GM-CFU。而环磷酰胺组使GM-CFU受到一定程度的限制，其抑制率为47.0％～55.0％(与正常组比较，P＜0.01)。在这种情况下惠尔血对GM-CFU有升高作用(与环磷酰胺组比较，P＜0.001)。MPS在不同剂量下促进GM-CFU的作用不同，在0.6mg/kg剂量下作用相对较弱；0.8mg/kg剂量下提高GM-CFU作用近似于惠尔血；而1.0mg/kg时，MPS对GM-CFU的刺激作用最强，几乎相当于0.6mg/kg组2倍的水平；1.2mg/kg组不再增高GM-CFU，但仍远高于环磷酰胺对照组(P＜0.001)。

经反复实验证明，MPS具有较明显的刺激骨髓造血祖细胞的作用，而且有较好的量效关系，其作用(0.6-1.0mg/kg剂量)大致与惠尔血(0.19mg/kg)的活性水平相当。

实施例4

本发明分枝杆菌复合物对慢性乙型肝炎的治疗作用的临床观察

对象：共40例均为临床或病理确诊为HBV感染的慢性乙肝及携带者，HBsAg.HBeAg抗-HBc三项均阳性者，病程在6个月以上。

方法：分三组进行观察

第一组MPS+乙肝疫苗联合治疗组20例，MPS(A)20μg/l支。MPS(B)2μg/l支，隔日交替皮下注射1支，再每月肌注乙肝疫苗30μg/l支共四次，疗程四个月。

第二、三组为双盲配对组(即单纯MPS组与安慰剂组)两组共20例，药品统一编号，由专人负责发放，治疗结束后揭底，注射剂量方法及疗程均同第一组。

观察项目：治疗前、治疗后每月及停药后3个月均检测肝功及HBV/m，部分病人检HBV-DNA，DNA-P及OKT4/8比值。各组治疗期间均不使用其他免疫调节剂及抗病毒药。

为避免检测技术的误差，治疗前及治疗后的血清标本保留，并进行统检。本组选用肝炎所自备和盒进行统检(RPHA法)并同进口荷兰梅准试剂盒对照，两者HBeAg阴转符合率一致。

观察结果表明，MPS+乙肝疫苗联合组eAg阴转率为45％，单纯MPS组eAg阴转率为40％，安慰剂组为20％。三组经统计学处理，各组间比较无显著性差异(P＞0.05)。但在HBV-DNA阴转方面，联合乙肝疫苗组为66.6％，单纯MPS组为40％，而安慰剂组为0％，在细胞免疫OKT4/8比值改善方面，联合乙肝疫苗治疗组及单纯MPS组，治疗后上升者为7/9，占77.8％，安慰剂组无上升，从而提示MPS对提高细胞免疫功能有可靠的疗效。

实施例5

本发明分枝杆菌复合物对类风湿性关节炎的治疗作用

病例选择和分组

所有病人均符合美国风湿病学会(ARA)1987年的诊断标准：①晨僵至少1h，＞6周，②3个或3个以上关节痛，＞6周，③腕、掌指、近端指间关节肿，＞6周，④对称性关节肿，＞6周，⑤皮下结节，⑥手X线像改变(至少有骨质稀疏及关节隙狭窄)，⑦类风湿因子阳性(所用方法正常人群中的阳性率不超过5％)。上述7条中具备4条。

主要选择单用一种NSAID治疗2个月病情无改善的活动期类风湿关节炎病人，具备以下5条中的3条：①晨僵时间＞30min，②双手平均握力，男性病人＜20kPa(150mmHg)，女性病人＜17.3kPa(130mmHg)，③关节痛或压痛数＞6个关节，④关节肿数＞3个关节，⑤血沉(ESR，魏氏法)＞25mm/h。X线分期为I～III期。受试者无药物过敏史。孕妇和哺乳期妇女不纳入本试验。受试者在试验前3个月内未使用过SAARD类药物，包括MTX、青霉胺、金制剂、激素和雷公藤。治疗不足1个月而中断治疗者不参加疗效评定。

用药方法

A组病例先接受为期6个月的分枝杆菌多糖和非甾体抗炎药治疗，然后停用分枝杆菌多糖，继用原来非甾体抗炎药1个月后换用甲氨喋呤和非甾体抗炎药治疗6个月。B组病例先接受为期6个月的甲氨喋呤和非甾体抗炎药治疗，然后停用甲氨喋呤，继续用原来的非甾体抗炎药1个月后换用分枝杆菌多糖和非甾体抗炎药治疗6个月。整个12个月的治疗中每个病人所用的非甾体抗炎药固定不变，剂量上也基本保持不变。分枝杆菌多糖用法：每周肌肉注射2次，每次1支(每支15μg)。甲氨喋呤用法：每周口服1次(10mg)或每周肌肉注射1次(10mg)。

疗效评定

疗效评定：①显效：晨僵、关节肿、关节压痛、握力、血沉、C反应蛋白、类风湿因子，7项中至少有4项进步＞50％。②有效：上述7项中有3项进步＞50％。③无效：上述7项中不足3项进步者或病情加重者。

结果

所得的结果见表3和表4。

表3 MPS与MTX分别治疗6个月疗效对比

组别	显效	有效	无效	总有效率/％
					A组	1	11	13	48
B组	3	12	10	60

2组均n＝25，经秩和检验u＝0.931 3，P＞0.05

表4 A组与B组治疗总疗效对比

组别	显效	有效	无效	总有效率/％
					A组	6	11	8	68
B组	12	9	14	44

2组均n＝25，经秩和检验u＝3.317 9，P＞0.05

同时证明，使用分枝杆菌多糖治疗6个月后对T淋巴细胞亚群有双向调节作用。而其毒副作用较甲氨喋呤更少，见表5。

药物	样本数	恶心	皮疹	WBC减少	PIT减少	ALT升高	总副作用率％
								MPS	26	0	1	0	0	0	3.8
MTX	28	3	0	3	1	2	32.0

尽管为了清楚理解的目的，已经通过例证和实施例的方式对前述发明进行了相当详细的描述，显而易见的是可以在所附权利要求的范围内进行一些改变和修改。这些改变和修改也在本发明的范围之中。

Claims (8)

1.一种分枝杆菌多糖复合物，其特征在于该多糖复合物含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。所述多糖复合物的分子量范围为2,000～20,000。

2.根据权利要求1所述分枝杆菌多糖复合物，其特征在于所述分枝杆菌是草分枝杆菌。

3.根据权利要求1所述分枝杆菌多糖复合物，其特征在于所述分枝杆菌多糖复合物的使用形式选自注射剂、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、和乳剂。

4.根据权利要求1所述分枝杆菌多糖复合物，其特征在于其给药途径选自口服、经皮、静脉和肌肉注射。

5.一种制备分枝杆菌多糖复合物的制备方法，包括以下步骤：

(一)将含有分枝杆菌的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养至生长成黄色至橙色菌膜；

(二)多糖粗提：将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，酸碱处理，用极性有机溶剂在低温下沉淀多糖，获得粗制多糖；

(三)多糖精制：上述粗糖经离子交换柱及超滤处理后得精制多糖。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于所述菌种为非致病菌。

7.根据权利要求5所述方法，其特征在于所述菌种为草分枝杆菌。

8.一种药学组合物，其特征在于含有有效量的权利要求1的分枝杆菌复合物和药学上可接受的赋型剂、载体或稀释剂。