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CN1563387A - 一种蚯蚓纤溶酶基因和基因工程菌株及其构建和应用 - Google Patents

一种蚯蚓纤溶酶基因和基因工程菌株及其构建和应用 Download PDF

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CN1563387A
CN1563387A CN 200410034475 CN200410034475A CN1563387A CN 1563387 A CN1563387 A CN 1563387A CN 200410034475 CN200410034475 CN 200410034475 CN 200410034475 A CN200410034475 A CN 200410034475A CN 1563387 A CN1563387 A CN 1563387A
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CN
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Pending
Application number
CN 200410034475
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English (en)
Inventor
孟小林
徐进平
胡燕
张俊杰
鲁伟
王健
孟海洋
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Green Life Laboratory Ltd
Original Assignee
Green Life Laboratory Ltd
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Abstract

本发明公开了一种蚯蚓纤溶酶基因和基因工程菌株及其构建和应用，纤溶酶基因由747核苷酸组成，编码246个氨基酸，该基因在毕赤酵母中表达出有活性的基因工程纤溶酶蛋白，发酵液活性单位超过3,390,000U/L，该基因工程纤溶酶蛋白在医疗、卫生、保健类药物的研发领域中具有广泛的用途。

Description

一种蚯蚓纤溶酶基因和基因工程菌株及其构建和应用
                       技术领域
本发明涉及一种正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因的核苷酸序列，同时还涉及该基因的制备方法，本发明还涉及一种表达该基因的毕赤酵母基因工程菌株的构建以及基因工程纤溶酶在药物研究开发中的应用。
                       背景技术
急性心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、外周动脉血栓和深部静脉血栓等心脑血管疾病是危害人类生命和健康的主要疾病之一。据世界卫生组织统计，全世界每年大约有1200万人死于心脏病和脑卒中。在我国，随着经济的高速发展，人民群众物质生活水平的提高，心脑血管疾病的发病率及其病死率亦正逐年提高。因此，研制和发展高效、特异、安全、不良反应小的溶血栓药物，一直是近年来世界范围的热门课题。
蚯蚓，俗称地龙，在我国已有数千年的应用历史，可清热、平肝、止喘、通络，主治高热狂躁、惊风抽搐等病症。1983年日本H.Mihara首次发现正蚓科(Lumbrici dae)蚯蚓水提物有直接溶解纤维蛋白及纤溶酶原激活作用，其活性成分称为纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme，EFE)，又称蚓激酶。纤溶酶溶栓的药理机制主要有：1)与纤维蛋白具有特殊亲和力，不仅水解富含纤溶酶原的纤维蛋白，还可以水解不含纤溶酶原的纤维蛋白，使纤维蛋白迅速降解，还可以水解纤维蛋白原。2)类似tPA，激活纤溶酶原而发挥间接作用，体外实验表明纤溶酶对牛血管内皮细胞tPA的释放有刺激作用。3)水解凝血因子I，抑制了血小板在其表面的粘附。
研究结果表明：蚯蚓体内的纤溶酶具有多种组分，仅在粉正蚓(Lumbricus rubellus)中已经分离到至少6种不同的组分。现今国外已经从蚯蚓中分离了6个编码纤溶酶基因的cDNA序列。国内也已从赤子爱胜蚓、双胸蚓等蚯蚓中克隆到了蚯蚓纤溶酶基因，但未见有从粉正蚓中分离纤溶酶基因并进行克隆表达的报道。
目前已有多种蚯蚓纤溶酶制剂应用于临床，主要为各种胶囊制剂，都是从蚯蚓肠腔和体液中提取的，如普恩复、百奥、博洛克，溶栓胶囊等，多用在心脑血管疾病方面。此外由于纤溶酶可改善血液流变学，降低血小板聚集率，所以可以用在与血液流变学相关的一些疾病中，如美尼尔病、突发性耳聋、肺心病等。
传统的蚯蚓纤溶酶胶囊制剂应用于临床有一定的疗效，但也存在明显的缺陷，首先是成分复杂，不能静脉注射，而口服给药作用缓慢，因而不能应用于治疗急性心、脑血管栓塞疾病；其次胶囊制作工艺复杂，生产受蚯蚓养殖季节、周期的限制，产品产量、质量不稳定；从虫体中分离纯化纤溶酶工艺烦琐，产品中可能含有各种小分子多肽或其它化学物质，可能引起机体的过敏反应。而运用基因工程的方法则可以通过简单的发酵大量获得纤溶酶，分离纯化工艺简单，产品纯度高，成本底。因此，基因工程纤溶酶在医疗、卫生、保健类药物的研发领域中具有广泛的用途，可用于制备用于治疗栓塞性心血管疾病的注射水剂、口服药剂等，还可用于生产具有预防血栓疾病、有益心血管健康的保健品。
在基因工程药物开发方面，目前应用最广泛、技术比较成熟的表达系统有：大肠杆菌系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统。
大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛、最成熟的表达系统，适合于表达非糖基化蛋白质及二级结构较简单的蛋白质，表达产物一般是在细胞质内形成包涵体，产物需要经过复性才具有活性，也有的载体可分泌目的蛋白于细胞间质，或在细胞质内可溶性表达。其最大的缺点是不能进行表达后的加工和修饰(比如糖基化)，而这种加工过程是很多蛋白质获得功能所必需的。
CHO细胞表达系统：这是目前构建及表达难度相对较大的表达系统，适合表达糖基化蛋白和空间结构较复杂的蛋白质，表达产物一般存在于细胞质中，如果在基因构建时在目的蛋白前加一段信号肽，表达产物会分泌到胞外，通过细胞翻译后包装成为有活性的蛋白，但表达量低、成本高、纯化困难使其难以在工业化生产中应用。
                       发明内容
本发明的目的在于提供一种正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因，该基因编码的蛋白质具有溶栓作用。
本发明的另一个目的在于提供一种制备正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因的方法，该方法简单，操作方便易行。
本发明进一步目的在于提供一种基因工程菌株，该菌株能表达蚯蚓纤溶酶。同时还涉及该菌株的制备方法，用于制备基因工程纤溶酶蛋白。
本发明的目的进一步提供一种制备基因工程毕赤酵母菌株的方法，该基因工程菌株可以用来表达蚯蚓纤溶酶基因，获得基因工程纤溶酶蛋白。
本发明还涉及基因工程纤溶酶蛋白在治疗心血管疾病药物中的应用，该类药物具有溶栓作用和对脑缺血的保护作用。
本发明的技术要点之一为正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因的核苷酸序列及其制备方法，
在本发明的一个实施例中提供了一种正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因的核苷酸序列及其制备方法，该方法是以正蚓科粉正蚓属蚯蚓总RNA为模板，用特异性寡核苷酸引物，经反转录PCR方法得到纤溶酶基因cDNA。粉正蚓购于华中农业大学，基因测序结果表明cDNA由747核苷酸组成，5′端至3′端序列为：
正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因的核苷酸序列  (SEQ ID NO：1)acatggaacttcctcccggaacaaaaattgtcggaggaattgaagctagaccatacgagttcccatggcaggtgtccgtccgaaggaaatcttccgattcccatttctgcggaggtagcatcatcaacgatcgttgggttgtctgcgctgctcactgcatgcagggagaggcccccgctctggtttcattggtcgtgggtgagcacgacaggagtgcagcgagtacagtacgtcagactcatgacgttgatagcatcttcgttcacgaggactacaacacaaataccctagagaacgacgtttctgtcatcaagacatctgttgccatcactttcgacatcaacgttggtccaatctgcgccccagatccggctaacgactacgtctaccgtaagagccagtgttccggatggggaactatcaattcaggtggaatctgctgtcccaacgttctgcgatacgtgacgctgaatgacacaaccaaccaatactgcgaagatgtatacccactaaattcaatctacgacgatatgatttgcgcgtcggacaacactgggggtaacgacagagactcctgccagggtgactccggcggccctctgagcgtcaaggatggtagtggaatcttcagcctgattggtattgtgtcttggggaattggttgcgcttctggctatccaggagtctactcccgcgtcggattccatgctgcatggatcaccgacatcatcaccaacaactaaaccg
其中3-740位核苷酸是基因编码的成熟肽序列，即纤溶酶蛋白序列，741-743位是终止密码子TAA。该基因编码的蛋白质氨基酸序列为：
正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶的氨基酸序列  (SEQ ID NO：2)MELPPGTKIVGGIEARPYEFPWQVSVRRKSSDSHFCGGSIINDRWVVCAAHCMQGEAPALVSLVVGEHDRSAASTVRQTHDVDSIFVHEDYNTNTLENDVSVIKTSVAITFDINVGPICAPDPANDYVYRKSQCSGWGTINSGGICCPNVLRYVTLNDTTNQYCEDVYPLNSIYDDMICASDNTGGNDRDSCQGDSGGPLSVKDGSGIFSLIGIVSWGIGCASGYPGVYSRVGFHAAWITDIITNN
本发明涉及的纤溶酶蛋白分子量为26.4kD，等电点为4.5，富含甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸和天冬氨酸。其生物化学特性还有：①热稳定性：纤溶酶60℃加热30分钟后，酶活性没有明显降低，65℃以上，酶活性开始下降，85℃加热30分钟酶活性完全丧失；②酸稳定性：纤溶酶在pH1～11间酶活性没有明显变化，pH低于1或高于11时，酶活性明显下降，最佳纤溶反应的pH值范围较宽，在7～10之间。
本发明涉及的纤溶酶基因还可以通过以下方法获得：(1)亚克隆：以本发明所涉及的基因片段为模板，或者以含有本发明所涉及的基因片段的重组质粒为模板，或者以含有本发明所涉及的基因片段的基因工程菌株DNA为模板，通过常规分子生物学操作方法(如PCR)，亚克隆得到相应基因片段，这些片段可以包括全部的或者部分的本发明所涉及基因序列，这些片段可在细菌、酵母、动植物细胞或其它真核、原核生物中表达，得到蛋白质或多肽片段，这些蛋白质或多肽片段与本发明所涉及的蛋白质有相同的生物学功能；(2)人工合成：根据本发明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，可以通过化学合成的方法合成DNA片段，这些片段可以包括全部的或者部分的本发明所涉及基因序列，可以克隆到相应的载体中进行表达，表达的蛋白质或多肽与本发明所涉及的蛋白质有相同的生物学功能。
本发明所涉及的基因片段可以进行修饰，比如突变基因的某些核苷酸序列，但并不影响其编码的蛋白质氨基酸序列；可以增加、缺失本发明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，这些修饰不会影响蛋白质的生物化学特性、高级结构和蛋白质的生物学功能，比如：可以在蛋白质或多肽N-端或C-端加上分泌信号肽，还可以加上适当的接头(如6个组氨酸)便于蛋白质提取、纯化。
本发明所涉及的基因与载体连接后可以克隆到相应的宿主中，以便于基因的保存、扩增和表达。应用于本发明的克隆载体包括但不仅限于下列载体：pBR322、pBR325、pACYC177、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV 40、pBluescript II SK+/-、pQE、pGEM-T、pET系列载体。载体特征及克隆方法可参见冷泉港实验室编写的《分子克隆实验手册》。应用于本发明的宿主——载体系统包括但不仅限于下列系统：细菌——噬菌体系统，细菌——质粒载体系统，酵母——酵母载体系统，哺乳动物——病毒系统(牛痘病毒、腺病毒等)，昆虫细胞——杆状病毒系统。
在本发明的一个实施例中提供了一种正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因的制备及克隆到大肠杆菌(E.coli)的方法，该方法包括：扩增引物合成，蚯蚓总RNA提取，mRNA的反转录，目的基因的PCR扩增、目的基因片段的回收、目的基因片段克隆入载体、蚯蚓纤溶酶cDNA序列测定。
(1)扩增引物合成：根据GeneBank中已经发表的蚯蚓纤溶酶cDNA序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物(P1)长18个核苷酸：ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物(P2)长19个核苷酸：ATCACCAACAACTAAACCG，引物经PACE纯化。
(2)蚯蚓总RNA提取：取3～5条蚯蚓成体，用DEPC处理过的灭菌水漂洗后，放在铺有湿滤纸的平皿中饥饿过夜，使其尽可能的吐尽体内的泥沙。再次用DEPC水清洗干净后，在液氮中研磨成粉末状，按照QIAGEN公司RNeasyR Mini Kit的产品说明书提取总RNA。将提取到的RNA溶液贮存于-80℃以备用。
(3)反转录合成cDNA第一条链：按照Promega公司的ReverseTranscription Reaction试剂盒说明书进行，以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一链。反应条件为：42℃1小时；95℃5分钟；3℃5分钟。
(4)目的基因的PCR扩增：按照Reverse Transcription Reaction试剂盒中给出的PCR反应体系参数进行PCR反应。以cDNA第一条链为模板进行PCR扩增，其反应参数为：95℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，20个循环；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，10个循环；72℃再延伸10分钟。
(5)目的基因片段的回收：按照上海华舜生物工程公司PCR产物回收试剂盒说明书回收目的基因片段。
(6)目的基因片段克隆入载体：回收的PCR产物与T载体连接，连接产物转化感受态细胞大肠杆菌(E.coli)JM109，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包含本发明涉及基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。
(7)蚯蚓纤溶酶cDNA序列测定
提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为M13启动子引物。正蚓科粉正蚓属蚯蚓纤溶酶基因核苷酸的序列测定结果：蚯蚓纤溶酶cDNA序列长747个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌噙核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为：A-185、C-197、G-189；T-176。基因成熟肽序列为第3-740位核苷酸，编码246个氨基酸，其余核苷序列为非编码区。该蛋白质cDNA成熟肽终止密码子位于基因第741-743位，终止密码为TAA。
本发明的技术要点之二是表达纤溶酶基因的毕赤酵母基因工程菌株的构建及表达，该菌株可以表达纤溶酶基因，得到基因工程纤溶酶蛋白用于制备治疗心血管疾病的药物。
本发明所涉及的纤溶酶基因可以在包括但不仅限于下列载体-宿主系统中进行表达，获得基因工程蛋白：大肠杆菌系统、酵母表达系统、CHO细胞表达系统、杆状病毒表达系统、丝状真菌表达系统、芽孢杆菌表达系统。
毕赤(Pichia)酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效的真核表达系统，与其它表达系统相比，它具有以下优点：(1)表达量高，因为毕赤酵母生长速度快，而且表达载体使用的是强启动子——乙醇氧化酶启动子，外源蛋白表达量很高。(2)稳定性好，由于该系统的表达载体在酵母中不是以自主复制的质粒存在，而是通过同源重组稳定的整合在酵母染色体上，所以构建的工程菌株十分稳定。(3)纯化容易，操作简便。表达产物一般分泌到胞外，可以直接从培养液中检测目的蛋白，不需要复性，而且可以直接从上清中提取蛋白。(4)活性高。外源蛋白在毕赤酵母中分泌表达的最大好处就是能够进行蛋白质翻译后加工，包括二硫键的成形成、蛋白质折叠及糖基化等。与啤酒酵母等其他一些真核表达系统相比，毕赤酵母对外源蛋白糖基化更接近于哺乳动物的糖基化，因此毕赤酵母表达的糖蛋白被认为更适宜用于人体。(5)便于工业化生产。毕赤酵母有现成的、成熟的发酵技术进行扩大培养，而且毕赤酵母表达系统可以利用甲醇作为唯一碳源生长，大规模发酵生产方便，成本低，易于实现产业化。
本发明涉及的蚯蚓纤溶酶cDNA来源于粉正蚓(Lumbricusrubellus)，该片段共有741bp，编码246个氨基酸。本发明在酵母系统中表达该基因，通过发酵的方法生产得到基因工程纤溶酶，并通过纤维蛋白平板法检测了该蛋白的生物活性。目前国内已有蚯蚓纤溶酶在大肠杆菌中表达方面的研究，但其在酵母中的表达未见报道。
毕赤酵母表达载体包括但不仅限于下列载体：pPIC6、pPIC6α、pPICZ、pPICαZ、pPIC9k、pPIC3.5k、pPAO815、pGAPZ、pGAPαZ；毕赤酵母表达菌株包括但不仅限于下列菌株：GS115、KM71、KM71H、X-33、SMD1168、SMD1168H。
在本发明的一个实施例中提供了一种构建基因工程菌株、在毕赤酵母中表达蚯蚓纤溶酶基因的方法，该方法是用pPIC6αA载体(Invitrogen公司)在毕赤酵母X-33中表达蚯蚓纤溶酶基因，毕赤酵母Pichiapastoris X-33(pPIC6αA-EFE)，该菌株在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，编号为：M204005，该菌株的制备方法为(1)蚯蚓纤溶酶基因的PCR扩增；(2)PCR产物克隆至T载体；(3)穿梭表达质粒的构建；(4)表达纤溶酶基因的酵母基因工程菌株的构建。
(1)蚯蚓纤溶酶基因的PCR扩增：以含有纤溶酶基因的T载体质粒为模板，根据EFE成熟肽和表达载体pPIC6αA上的克隆位点设计引物，并在上游引物中加入6个连续的组氨酸编码序列，之后加入肠激酶切割位点序列，并设计了一对蚯蚓纤溶酶PCR扩增引物。因此，该工程菌株的表达产物为融合蛋白，在纤溶酶蛋白的N端有6个连续的组氨酸，用于表达产物的分离纯化，纯化产物经过肠激酶切割后可切去融合蛋白N端的非天然存在氨基酸，得到与天然纤溶酶组成完全相同的基因工程蛋白。在本发明的一个实施例中提供了一对引物序列，上游引物P1：C GAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGGTAGCAGCGACGACAAG ATGGAACTTCCTCCCGGAACA  (下划线处为内切酶EcoRI位点)。下游引物P2：G TCTAGATTAGTTGTTGGTGATGATGTCGGTGATCCATGCAGCAT(下划线处为内切酶XbaI位点)。
(2)PCR产物克隆至T载体：回收PCR产物中的基因片段，并克隆于pGEM-T载体，将该重组载体(pGEM-T-EFE2)转入大肠杆菌JM109中。
(3)穿梭表达质粒的构建：提取重组载体pGEM-T-EFE2，用EcoRI和XbaI双酶切以得到目的片段EFE；同样酶切pPIC6αA空载体并在CIAP作用下使之去磷酸化。将去磷酸化后的线性化的pPIC6αA空载体与双酶切后得到的EFE在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC6αA-EFE，将该重组载体转入大肠杆菌JM109中进行扩增。
(4)表达纤溶酶基因的酵母基因工程菌株的构建；
a.穿梭表达质粒的线形化：提取重组质粒pPIC6αA-EFE，用SacI酶切成线性，同样酶切空质粒pPIC6αA作为对照。
b.转化：方法参考Invitrogen公司表达载体说明书：利用生化方法将线性化的重组质粒pPIC6αA-EFE和空质粒pPIC6αA转化X-33酵母菌株，在含有杀稻瘟素(Blasticidin)300mg/ml的YPD(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)固体培养基上培养2-3天，直到有单菌落出现。
c筛选阳性转化子：挑取10-20个单菌落于YPD液体培养基中30℃，250rpm摇床培养直至对数生长晚期，提取基因组进行重组子的PCR鉴定。引物为Invitrogen公司表达载体提供的通用引物，其序列为上游：GACTGGTTCCAATTGACAAGC，下游：GCAAATGGCATTCTGACATCC，鉴定的阳性克隆毕赤酵母工程菌株命名为Pichia pastorisX-33(pPIC6αA-EFE)，该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC M204005。
在毕赤酵母中有两个编码乙醇氧化酶的基因AOX1和AOX2，可以利用甲醇作为唯一碳源快速生长，而当培养基中存在其它碳源时，AOX基因不表达。在毕赤酵母工程菌株中，外源基因被克隆至AOX1启动子控制下，因此必须以甲醇作为诱导剂，同时也是唯一碳源来实现外源蛋白的高效表达，在诱导表达时，应补充甲醇以维持其0.5％的含量。
在本发明的一个实施例中提供了一种毕赤酵母工程菌株诱导表达的方法，可用于毕赤酵母工程菌株诱导表达的培养基包括但不仅限于下列培养基：MGY、MM、BMM、BMMY，各种培养基的配置方法为本技术领域人员非常熟悉的方法，可以通过参考相关文献获得详情。
蛋白质的分离和纯化有多种方法，其原理是根据目的蛋白的物理和化学性质将其与其他蛋白质分离。如根据蛋白质分子量的大小和蛋白形状可选择离心法、超滤法、凝胶过滤层析法，根据蛋白质溶解度的不同可选择硫酸铵沉淀法或丙酮沉淀法，根据等电点的不同选择等电聚焦电泳法或等电沉淀法，根据疏水性不同可选择疏水作用层析法、反向HPLC法，根据蛋白质与金属离子的结合能力选择固定化金属亲和层析法。
在本发明的一个实施例中提供了一种在毕赤酵母X-33中表达、分离、纯化蚯蚓纤溶酶基因，获得基因工程蛋白的方法，该方法包括：(1)毕赤酵母工程菌株的诱导表达；(2)基因工程纤溶酶的分离、纯化；(3)基因工程纤溶酶蛋白的功能研究及活性测定。
(1)毕赤酵母工程菌株的诱导表达
毕赤酵母工程菌株诱导表达方法如下：挑取重组菌的单菌落到20mlYPD液体培养基，30℃、250rpm培养进行活化；16个小时后取10ml活化后的菌液转接500ml MGY液体培养基30℃、250rpm培养增浓；增浓24小时后的菌液经离心收集菌体(1500g、10分钟、4℃)；将收集到的菌体用重悬于1000ml MM液体培养基进行诱导表达，每24h添加甲醇至终浓度为0.5％；诱导96h后离心收集发酵液上清(30000g、20分钟、4℃)；
(2)基因工程纤溶酶的分离、纯化
可用于基因工程纤溶酶分离、纯化的方法包括但不仅限于下列方法：Ni2+柱层析法、离子交换层析法、亲和层析法、凝胶过滤层析法、电泳回收法、超滤法、硫酸铵沉淀法等。
在本发明的实施例中提供一种分离、纯化基因工程纤溶酶的方法，分为3个步骤，首先是Ni2+柱层析纯化，基因工程纤溶酶蛋白有6个连续的组氨酸残基，它们能与Ni2+结合使基因工程蛋白结合在固定的金属离子柱上，而其它杂蛋白不能与金属离子柱结合被直接洗脱下来，最后用适当的洗脱液将目的蛋白质洗脱下来从而达到蛋白纯化的目的。Ni2+柱层析纯化产物加入高度纯化的牛内肠激酶或重组的内肠激酶，进行降解反应，可切去融合蛋白中的非天然氨基酸残基，得到与天然蛋白氨基酸组成完全相同的基因工程蛋白。最后将肠激酶降解的样品直接加入QAE-Tyoypearl 550C层析柱中，由于不同蛋白质等电点的不同将基因工程纤溶酶分离纯化，纯化产物经SDS-PAGE电泳分析验证。
(3)基因工程纤溶酶蛋白的功能研究及活性测定
当前尚无蚯蚓纤溶酶活性测定的国家标准，然而作为一种新的药品，需要建立一套活性和效价测定的方法。同时这种测定方法应该既准确可靠，又简便易行。当前的测定方法只能参考其它溶栓药物的活性测定方法。比如尿激酶活性的气泡上升法和测定蝮蛇抗栓酶的精氨酸脂酶法(TAME)法，但这两种方法均不适用测定蚯蚓纤溶酶，因为纤溶酶具有纤维蛋白溶酶原激活剂和蛋白水解酶的作用，在溶解血栓时能发挥这两种功能，而且该酶的溶酶活性显著大于激酶活性。
纤维蛋白平板法能够客观地表示出纤溶酶溶栓的能力。血纤维蛋白平板中含有纤维蛋白溶酶原，在纤溶酶的激酶作用下转变为纤维蛋白溶酶。加之应纤溶酶的溶酶作用，使血纤维蛋白发生水解作用，变成可溶性的小分子肽和氨基酸，从而使加样处平板形成半透明溶圈，并根据圈的大小确定酶的活性单位。在一定范围内，平板溶圈大小与浓度程线形关系，因此测定纤维蛋白平板的活性可看成纤溶酶和激活酶的双重作用。该方法具有操作简单，溶解圈清晰、易于观察，重复性好等优点。
应用与本发明所涉及基因的基因工程纤溶酶蛋白的功能研究及活性测定的方法包括但不仅限于下列方法：纤维蛋白平板法、气泡上升法、精氨酸脂酶法。
在本发明的一个实施例中提供一种纤维蛋白平板法测定基因工程纤溶酶的生物学活性的方法，通过活性测定，本发明的基因工程菌株发酵液的活性单位超过3,390,000U/L。
本发明的技术要点之三为基因工程纤溶酶蛋白在治疗心脑血管疾病中的应用。
本发明所涉及的基因工程蛋白在医疗、卫生、保健类药物的研发领域中具有广泛的用途，可用于制备治疗栓塞性心血管疾病的冻干剂、水针剂、片剂、栓剂、喷雾剂等，还可用于生产具有预防血栓疾病、有益心血管健康的保健品。
与传统的蚯蚓纤溶酶胶囊制剂相比，本发明所涉及的基因工程药物有如下优点：(1)蚯蚓纤溶酶胶囊制剂口服给药作用缓慢，不能静脉注射，不能应用于治疗急性心、脑血管栓塞疾病；(2)胶囊制作工艺复杂，需要人工大量养殖蚯蚓，从虫体中分离纯化纤溶酶工艺烦琐，产品中可能含有各种小分子多肽或其它化学物质，可能引起机体的过敏反应。而运用基因工程的方法则可以通过简单的发酵大量获得纤溶酶，分离纯化工艺简单，产品纯度高，成本底。
与其它溶栓类药物(包括生物提取的和基因工程药物)相比，本发明所涉及基因工程药物有如下优点：
(1)链激酶(streptokinase SK)和尿激酶(urokinase UK)：SK和UK属于第一代溶栓药物，它们可以直接或者间接的激活纤溶酶原使之转变成具有溶纤活性的纤溶酶。SK是从β型溶血性链球菌培养液中提取的一种外源性纤溶酶原激活物，是间接的纤溶酶原激活剂。UK是从人的尿液中分离出来的丝氨酸蛋白酶，也可由人胚胎肾细胞培养液中获得。这两种酶在实际使用过程存在两个不可避免的问题：首先，他们作用的专一性差，在溶解血栓时常导致纤溶蛋白酶原的系统性激活，而造成对凝固蛋白的无差别性的消化，增加了治疗过程中内出血的危险；其次，和底物结合的亲和力小，直接溶栓效果弱。在治疗时使用剂量大，导致治疗成本昂贵。SK是一种非酶蛋白，在使用中最大的问题是它的抗原性。几乎所有人的血液中或多或少都含有抗SK抗体。抗体的存在一方面“中和”药物，使药效降低，另一方面可能引起过敏反应。
(2)组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator，tPA)：tPA是一种主要由血管内皮细胞产生的丝氨酸蛋白酶，能催化无活性的纤溶酶原变成有活性的纤溶酶，使血栓溶解。正常人tPA的血浆浓度约为5ng/ml，半衰期5分钟。tPA对存在于血栓部分的纤溶酶原的特异性使用其做为第二代溶栓药物受到重视，在欧美发达国家，用基因工程方法生产的tPA已经开始用于临床，显示了一定的优越性。但是由于半衰期短，需要反复大量用药才能奏效，由此增加了系统性溶纤而导致内出血的可能性，且由于造价高而限制了它的广泛使用。
(3)其它的溶栓剂：除了UK，SK和tPA之外，目前研究的还有蛇毒抗栓酶，单链尿激酶型纤溶酶原激活物(pro-UK)，乙酰化纤溶酶原链激酶激活性复合物(APSAC)等。但这些制剂有的应用存在较大的副作用，会发生过敏反应；有的作用机理不明，使用万分复杂，对制品品质要求极高，有的价格昂贵。
生物提取的溶栓类药物在生产过程中，需活性炭吸附，主要是用来脱色、吸附热源、除杂质和助滤。本发明所涉及的基因工程蛋白纯度高，品质纯粹、无热原，避免脱炭过程和活性炭对环境的污染，生产成本低，可直接用于生产注射用水剂、粉剂。
本发明生产的基因工程纤溶酶可以与药学上可以接受的载体(如赋形剂、填充剂、吸收促进剂等)混合，或者与其它药物混合使用，可以按照药学领域的常规方法将其制成所需的剂型，可通过口服、注射等方式给药。这些剂型包括但不仅限于冻干剂、水针剂、片剂、栓剂、喷雾剂。
本发明所涉及的基因工程药物可应用于心脑血管疾病的治疗或辅助治疗中，这些疾病包括但不仅限于：缺血性脑病，急性心肌梗死合并高纤维蛋白原血症，冠心病、冠心病引起的高粘滞血症、冠心病心绞痛、不稳定性心绞痛、纤维蛋白原和血小板聚集增高症，本发明所涉及的基因工程药物还可应用于血液流变学相关的一些疾病的治疗及辅助治疗中，这些疾病包括但不仅限于美尼尔病、突发性耳聋、肺心病、糖尿病、视网膜静脉阻塞、肾病综合症。
本发明所涉及的基因工程蛋白可以作为主要活性成分应用于保健品的生产，用于预防血栓疾病、增进心脑血管健康。
上述以基因工程纤溶酶为主要活性成分的药物或其它生物制品，其制作过程或方法为该技术领域人员所熟悉，生产过程应依照国家相关的法律、法规进行，包括《中华人民共和国药典》(国家药典委员会，2000)和《中国生物制品规程》(中国生物制品标准化委员会，2000)。
在本发明的实施例中，提供了一种制备基因工程纤溶酶溶栓药物制剂的方法，并且在动物模型中进行了溶栓和对脑缺血保护作用的试验，结果表明本发明所涉及的基因工程纤溶酶有良好的溶栓作用，并对试验动物的脑缺血有保护作用，这些都可以作为例证说明本发明说涉及的基因工程纤溶酶在心脑血管疾病药物研发领域中的用途。
全世界有心脑血管疾病人约1500万，所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元，可用纤溶酶进行治疗的各类病人约5000万人，潜在市场约35亿美元，因此，基因工程纤溶酶具有广阔的市场前景。
一种基因工程菌株，毕赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC6αA-EFE)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2004年1月12日，保藏编号：CCTCC No：M204005。
                      附图说明
附图1纤溶酶基因的PCR扩增结果
泳道1为DNA分子量标准(λDNA/HindIII)；泳道2为反转录合成的cDNA第一条链；泳道3为纤溶酶基因的PCR扩增产物
附图2重组质粒pUCm-T-EFE的酶切鉴定结果
泳道1为DNA分子量标准(λDNA/HindIII)；泳道2、3纤溶酶基因的PCR扩增产物，泳道4为DNA分子量标准(λDNA/EcoRI+HindIII)；泳道5为重组质粒pUCm-T-EFE用NotI和SalI双酶切的结果；泳道6为重组质粒pUCm-T-EFE用SalI单酶切的结果；泳道7为重组质粒pUCm-T-EFE用SphI单酶切的结果。
附图3重组表达载体pPIC6αA-EFE的酶切鉴定结果
泳道1为PCR分子量标准；泳道2为重组表达载体的PCR鉴定结果；泳道3为重组表达载体用EcoRI+XbaI双酶切的结果；泳道4为重组表达载体用SacI单酶切的结果；泳道5为DNA分子量标准(λDNA/EcoRI+HindIII)
附图4基因工程纤溶酶纯化后的SDS-PAGE电泳检测结果
泳道1为小分子量蛋白标准；泳道2为纯化后的基因工程菌Pichiapastoris X-33(pPIC6αA-EFE)上清，即基因工程纤溶酶蛋白。
附图5纤维蛋白平板法测定纤溶酶的生物学活性
a为纯化后的基因工程纤溶酶蛋白；b为10ul纤溶酶标准品(10000U/ml)；c为10ul对照菌Pichia pastoris X-33(pPIC6αA)上清纯化后产物。
                      具体实施方式
下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，但并不作为对本发明权利范围的限制。
所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆“(实验室手册，冷泉港，1989)及“精编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版社，1998)。
实施例1.蚯蚓纤溶酶的基因PCR扩增及克隆
(1)扩增引物合成
根据GeneBank中已经发表的蚯蚓纤溶酶cDNA序列设计PCR寡核苷酸扩增引物。上游引物长18个核苷酸ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物长19个核苷酸ATCACCAACAACTAAACCG。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。
(2)蚯蚓总RNA提取
取3～5条蚯蚓成体，用DEPC处理过的灭菌水漂洗后，放在铺有湿滤纸的平皿中饥饿过夜，使其尽可能的吐尽体内的泥沙。再次用DEPC水清洗干净后，在液氮中研磨成粉末状，按照QIAGEN公司RNeasyRMini Kit的产品说明书提取总RNA。将提取到的RNA溶液贮存于-80℃，以备用。
(3)反转录合成cDNA第一条链
按照Promega公司的Reverse Transcription Reaction试剂盒说明书进行，以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一链。具体操作步骤如下：将以下试剂加入一个经DEPC浸泡并灭菌处理过的PCR反应管中：25mMMgCl2 12μl；缓冲液6μl；10mM dNTP 6μl；Recombinant RNasinRibonuclease Inhibitor 2μl；AVM反转录酶4μl；Oligo(dT)206μl；蚯蚓总RNA 15μl；灭菌双蒸水9μl。反应条件为：42℃1小时；95℃5分钟；3℃5分钟。
(4)目的基因的PCR扩增
取8μL反转录反应产物，按照Reverse Transcription Reaction试剂盒中给出的PCR反应体系参数进行PCR反应。反应组分为：缓冲液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；mRNA反转录产物15μl；RT-PCR酶混合物2μl；灭菌双蒸水5μl。其反应参数为：95℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，20个循环；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，10个循环；72℃再延伸10分钟。1％琼脂糖检测PCR结果，电泳结果如附图1所示。
(5)目的基因片段的回收
按照上海华舜生物工程公司PCR产物回收试剂盒说明书回收目的基因片段，其过程如下：取30μlPCR反应产物加入1.4mlPB液(试剂盒提供)，混合物移入吸附柱中离心15秒，弃废液；在吸附柱中加入400μlPB液，静置1分钟后，离心15秒，弃废液；再加入500μlW1液(试剂盒提供)，离心15秒，弃废液，重复一次；在吸附柱中加入300μl T1液(试剂盒提供)，静置1分钟后，离心30秒，收集离心液，贮存于-20℃。
(6)目的基因片段克隆入载体
目的基因片段克隆入pUCm-T载体，该载体购自上海生工生物工程公司。反应组分如下：PCR产物5μl；pUCm-T载体1μl；10×T4DNA连接酶缓冲液1μl；T4DNA连接酶1μl；去离子水2μl；总体积为10μl，4℃连接过夜。
感受态细胞的制备：挑取单个JM109菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1∶100再接种于50mlLB培养液中，37℃振荡3小时，待菌液OD值为0.6时，4℃5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀用0.1M CaCl2悬浮，再5000rpm离心8分钟，弃上清，沉淀以适量0.1M CaCl2重悬，分装后置冰浴内6小时备用。
连接产物的转化：取上述连接产物5μl加入100μl感受态细胞冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入无氨苄青霉素的LB培养基0.9ml，37℃培养1小时，取200μl菌液加入40μl 20mg/ml 5-溴-4氯-3吲哚(D-半乳糖苷(X-gal))及4μl 0.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)混匀后涂含氨苄青霉素LB平皿，37℃培养16小时，挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物经1％琼脂糖检测。结果如图2所示，其阳性克隆命名为pUCm-T-EFE。
质粒DNA的快速小量制备：挑取单菌落接种于4ml含氨苄青霉素的LB培养基，37℃振荡培养过夜。菌液加入1.5ml离心管中，5000rpm离心8分钟，弃上清、沉淀悬浮于15μl悬浮液(50mM葡萄糖，25mMTris-HCl，10mMEDTA，PH8.0)，加200μl裂解液(0.2MNaOH，1％SDS)，置冰浴5分钟后，加150μl中和液(3.0MKAc，pH4.8)，冰浴10分钟，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清加等体积酚/氯仿抽提一次，上清加2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10分钟，沉淀物用70％乙醇洗1次，真空抽干加入20μl TE(10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0和1μl RNaseA 10mg/ml)，-20℃冻存备用。
(7)蚯蚓纤溶酶cDNA序列测定
提取质粒DNA双脱氧法测定核苷酸序列，序列测定由上海生工生物工程有限公司完成，测序引物为M13启动子引物。
测定结果：蚯蚓纤溶酶cDNA序列长747个核苷酸，腺嘌呤核苷(A)、胞嘧啶核苷(C)、鸟嘌呤核苷(G)及胸腺嘧啶核苷(T)的含量分别为：A-185、C-197、G-189；T-176(sequence No.1)，编码246个氨基酸(见sequence No.2)。基因成熟肽序列为第3-740位核苷酸，其余核苷序列为非编码区。该蛋白质cDNA成熟肽终止密码子位于基因第741-743位，终止密码为TAA。
(8)蚯蚓纤溶酶基因的修饰和改造
本发明所涉及的基因片段可以进行修饰，比如突变基因的某些核苷酸序列，但并不影响其编码的蛋白质氨基酸序列；可以增加、缺失本发明所涉及的氨基酸或者核苷酸序列，这些修饰不会影响蛋白质的生物化学特性、高级结构和蛋白质的生物学功能，比如：可以在蛋白质或多肽N-端或C-端加上分泌信号肽，还可以加上适当的接头(如6个组氨酸)便于蛋白质提取、纯化。可以人工合成全部或部分的核苷酸序列，合成的核苷酸序列序列可以与本发明提供的序列有差异，但其编码的蛋白质与本发明所涉及的蛋白质序列相同，这些可能的人工合成序列如下：atggarytnccnccnggnacnaarathgtnggnggnathgargcnmgnccntaygarttyccntggcargtnwsngtnmgnmgnaarwsnwsngaywsncayttytgyggnggnwsnathathaaygaymgntgggtngtntgygcngcncaytgyatgcarggngargcnccngcnytngtnwsnytngtngtnggngarcaygaymgnwsngcngcnwsnacngtnmgncaracncaygaygtngaywsnathttygtncaygargaytayaayacnaayacnytngaraaygaygtnwsngtnathaaracnwsngtngcnathacnttygayathaaygtnggnccnathtgygcnccngayccngcnaaygaytaygtntaymgnaarwsncartgywsnggntggggnacnathaaywsnggnggnathtgytgyccnaaygtnytnmgntaygtnacnytnaaygayacnacnaaycartaytgygargaygtntayccnytnaaywsnathtaygaygayatgathtgygcnwsngayaayacnggnggnaaygaymgngaywsntgycarggngaywsnggnggnccnytnwsngtnaargayggnwsnggnathttywsnytnathggnathgtnwsntggggnathggntgygcnwsnggntayccnggngtntaywsnmgngtnggnttycaygcngcntggathacngayathathacnaayaay
其中m代表a或c；r代表a或g；w代表a或t；s代表c或g；y代表c或t；k代表g或t；v代表a或c或g；h代表a或c或t；d代表a或g或t；b代表c或g或t；n代表g或a或t或c。
实施例2.表达纤溶酶基因的毕赤酵母基因工程菌株的构建
(1)蚯蚓纤溶酶基因的PCR扩增
以pUCm-T-EFE质粒为模板，根据EFE成熟肽和表达载体pPIC6αA上的克隆位点设计引物，上游引物P1：C GAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGGTGACGACGACGACAAGATGGAACTTCCTCCCGGAACA(下划线处为内切酶EcoRI位点)。下游引物P2：G TCTAGATTAGTTGTTGGTGATGATGTCGGTGATCCATGCAGCAT(下划线处为内切酶XbaI位点)。引物由上海Sangon生物工程公司合成，合成产物经PAGE纯化。反应组分为：缓冲液2.5μl；25mM MgCl2 1.5μl；10mM dNTP 2μl；上游引物1μl；下游引物1μl；pUCm-T-EFE质粒1μl；LA Taq DNA聚合酶2μl；灭菌双蒸水19μl。其反应参数为：95℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃再延伸10分钟。
(2)PCR产物克隆至T载体
按照上海华舜生物工程公司PCR产物回收试剂盒说明书回收目的基因片段，扩增产物克隆于pGEM-T载体(Promega公司)得到重组载体pGEM-T-EFE2，将该重组载体转入大肠杆菌JM109中。
(3)穿梭表达质粒的构建
提取重组载体pGEM-T-EFE2，用EcoRI和XbaI双酶切以得到目的片段EFE；同样酶切pPIC6αA空载体并在CIAP作用下使之去磷酸化。将去磷酸化后的线性化的pPIC6αA空载体与双酶切后得到的EFE在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC6αA-EFE，将该重组载体转入大肠杆菌JM109中进行扩增。挑取白色菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物经1％琼脂糖检测结果如图3所示。
(4)转化毕赤酵母X-33
方法参考Invitrogen 公司表达载体说明书(Pichia expressionvectors for selection on blasticidin and purification of recombinant proteinsmanual)。
挑取毕赤酵母X-33单菌落于接种5毫升YPD培养基，30℃250rpm摇床培养过夜，按1％接种量接种200mlYPD液体培养基，30℃250rpm摇床培养3-5小时，菌体浓度达到0.8-1.0，1500g离心10分钟，沉淀用10ml灭菌双蒸水重悬，1500g离心10分钟，沉淀重悬于0.4ml 100mM的LiCl中并转移至灭菌的1.5ml离心管中，12000g离心15秒，弃上清，加入0.1 6ml 0.1M的LiCl重悬，备用。
提取重组质粒pPIC6αA-EFE，用SacI酶切成线性，同样酶切空质粒pPIC6αA作为对照。
取50μl上述感受态细胞，12000g离心15秒，用移液器小心吸取上清，按顺序依次加入下列组分：240μl 50％PEG；36μl 1M LiCl；25μl 2mg/ml鲑鱼精DNA；50μl(5-10μg)线形化重组质粒pPIC6aA-EFE。以线形化空质粒pPIC6αA作为对照。剧烈震荡一分钟使完全混匀，30℃静置30分钟，42℃热激20-25分钟，6000-8000rpm离心15分钟，沉淀用1mlYPD培养基重悬，30℃培养1-4小时，取25-100μl图布于含有300μg/ml杀稻瘟素(Blasticidin)的YPD固体培养基，30℃培养2-3天，直到有单菌落出现。
(5)筛选阳性转化子
挑取10-20个单菌落于YPD液体培养基中30℃，250rpm摇床培养直至对数生长晚期，提取基因组进行重组子的PCR鉴定。
酵母基因组DNA制备方法：取1.5ml培养液4000r/分钟离心10分钟。菌体用液氮碾磨破壁。加7mL DNA缓冲液(100mmol/LTris--HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，1％SDS)混匀，65℃保温1h。10000r/分钟离心15分钟。上清用苯酚抽提2次，每次5000r/分钟离心7分钟。再用氯仿抽提1次，5000r/分钟离心7分钟。用2.5倍乙醇沉淀(加0.3mol/L醋酸钠，pH5.2)，10000r/分钟离心10分钟。70％乙醇洗涤，电吹风吹干，加TE或水悬浮。
PCR鉴定方法：引物为Invitrogen 公司表达载体提供的通用引物，其序列为上游：GACTGGTTCCAATTGACAAGC；下游：GCAAATGGCATTC TGACATCC。PCR按常规方法进行，扩增条件为：94℃45秒，54℃1分钟，72℃1分钟，40个循环。扩增产物用用0.8％琼脂糖检测其大小是否正确，结果如附图3所示。
所获得的阳性克隆命名为Pichia pastoris X-33(pPIC6αA-EFE)，该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC M204005。
实施例3.基因工程纤溶酶蛋白的表达、分离、纯化；
(1)毕赤酵母工程菌株X-33(pPIC6αA-EFE)的发酵过程：
a.挑取重组菌的单菌落入20mlYPD液体培养基(1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)，30℃、250rpm培养进行活化；
b.16个小时后取10ml活化后的菌液转接500ml MGY液体培养基液体培养基30℃、250rpm培养增浓；
c.增浓24小时后的菌液经离心收集菌体(1500g、10分钟、4℃)；
d.将收集到的菌体用重悬于1000ml MM液体培养基进行诱导表达，每24h添加甲醇至终浓度为0.5％；
e.诱导96h后离心收集发酵液上清(30000g、20分钟、4℃)；
(2)样品处理及Ni2+柱层析过程：
发酵液上清灌装透析袋，经以下步骤得柱层析样品；
a.PEG20000(聚乙二醇20000)掩埋透析袋浓缩，浓缩约10倍；
b.双蒸水洗净透析袋外表面，将装有浓缩发酵液的透析袋浸没在与原发酵液体积相等的1×BINDING BUFFER(5mMimidazole+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl PH＝7.9)内过夜，以平衡发酵液PH、离子浓度；
c.同步骤a，浓缩至体积约为原发酵液的1/10；
d.向透析袋中加入1×BINDING BUFFER，将浓缩过的样品稀释4倍；
e.同步骤c；
f.从透析袋中取出浓缩发酵液，并用少量1×BINDING BUFFER将透析袋中的剩余样品洗净，收集；
g.将浓缩发酵液高速离心(15000RPM，15分钟)，离心后的上清用0.45um微孔滤膜(MILLIPORE公司)过滤得到待柱层析的样品。
注：以上步骤均在4℃进行。
Ni2+柱层析：
a.Ni2+柱用10床1×BINDING BUFFER、10床无菌水清洗柱床，用10床1×CHARGE BUFFER(5Mm NiSO4)补充Ni2+，再用10床1×BINDING BUFFER清洗柱床，准备开始吸附层析(1床即是柱内介质的体积)；
b.浓缩过的样品用蠕动泵以循环方式经过Ni2+柱，使带有6×HIS样品充分与Ni2+结合，过夜后从Ni2+柱出口收集与Ni2+反应后的样品(穿漏液)；
c.使20床1×BINDING BUFFER流过Ni2+柱，以冲洗留在柱内的少量样品；
d.用5mM-100mM的咪唑溶液洗脱Ni2+柱上非目的蛋白(洗脱床数和洗脱溶液浓度视总蛋白含量和非目的蛋白与Ni2+结合能力灵活变化)注：如果按上面配方，则洗脱杂蛋白溶液为60mM咪唑。
e.用1×ELUTE BUFFER洗脱目的蛋白，分步收集，每1床(实际小于柱床体积)体积为一管，SDS-PAGE检验目的蛋白在洗脱液中的分布。Ni2+柱用1×ELUTE BUFFER(1M imidazole+0.5M NaCl+20mMTris·HCl PH＝7.9)继续洗脱，洗掉柱床中全部蛋白，再用1×STRIPBUFFER(100Mm EDTA+0.5M NaCl+20mM Tris·HCl PH＝7.9)洗去柱子上的Ni2+离子。
(3)牛内肠激酶降解(Enterokinase Cleavage)
将Ni2+柱纯化的纤溶酶用1000倍体积缓冲液A(25mMHepes/pH8.0，5mM EDTA)透析6-8小时后，加入高度纯化的牛内肠激酶(Sigma公司)，进行降解反应，反应条件如下：
1份酶：2000份底物(重量比)
37℃反应15-20小时后加入P-Aminobenzawidine终止反应
(4)QAE-Toyopearl 550C阴离子交换树脂柱层析
柱子的制备：将树脂混合均一后，取出大约50毫升的树脂加入缓冲液A(25mM Hepes/pH8.0，5mM EDTA)；树脂沉淀后，去掉上清液，再加上等体积缓冲液A，于树脂混合均一后，自然沉淀，这样重复3次。固定好一支层析柱(1.5×30cm)后，堵住柱出口，随后将缓冲液A处理的树脂装入柱内。然后打开柱子下面出口后，使树脂中缓冲液慢慢流出柱子，然后用200毫升缓冲液A，在4℃以下条件下，继续平衡层析柱。
样品的制备：将10毫升Ni2+亲和层析纯化的样品液，装入半透膜透析袋中，用2000毫升的缓冲液A，在4℃以下条件，进行过夜透析。
纯化过程：(4℃以下温度操作)：将透析后的样品加入层析柱，收集流出液；用3×柱床体积(150毫升)的缓冲液A洗柱子；用缓冲液A和缓冲液B(25mM Hepes/pH8.0，300mM NaCl，5mM EDTA)，通过一个线性梯度形成器，制备的NaCl浓度梯度缓冲液洗脱层析柱。(缓冲液A 200毫升；缓冲液B 200毫升)；洗脱样品用自动样品收集器以每部分1毫升体积分步收集。用OD280nm紫外光监测蛋白洗脱峰。用SDS-PAGE确认主蛋白峰样品管含纤溶酶后，将这些样混合。
(5)纯化产物的SDS-PAGE电泳分析
a.凝胶的灌制：参照参见Sambrook等“分子克隆“(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀开灌胶，封一层0.1％SDS(二烷基硫酸钠)覆盖液面，37℃下聚合30分钟。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
b.上样及电泳：在酵母诱导发酵液中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5分钟变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚兰进分离胶，提高电压至150V，当溴酚兰到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
c.凝胶染色：参见《蛋白质纯化与鉴定实验指南》(美国D.R.马歇克等著，朱厚础等译，科学出版社，2002)。室温下，凝胶在旋转平台上缓慢摇动，并进行下列步骤。
将凝胶在50％的甲醛溶液中浸泡2次，每次15分钟；在5％的甲醛中浸泡10分钟；用双蒸水迅速洗3次；在10μmol/L二硫苏糖醇(DTT)溶液中浸泡20分钟；在0.1％AgNO3(0.1％，w/v)中进浸泡20分钟；先用双蒸水快速洗1次，然后用显影液(15g碳酸钠溶于500ml水中，用前加入250μl 37％(w/v)甲醛溶液)快速洗2次，每次不超过15秒；在显影液中浸泡数分钟，直至显出蛋白质带；加入固体柠檬酸(每200ml显影液加入约10g柠檬酸)，停止显影；用铝箔盖住凝胶继续浸泡10分钟，然后用双蒸水彻底清洗。
d.电泳结果：如附图4所示。
实施例4.基因工程纤溶酶蛋白的功能研究及活性测定
采用纤维蛋白平板法测定纤溶酶的生物学活性，通过活性测定，发酵液的活性单位超过3E+06U/L。图5为测定时的纤溶圈，检测方法可参考郝苏丽等的方法[郝苏丽，沈佳，蚓激酶生物活性检测方法的研究，中国药事1996年第10卷第6期]，具体操作方法如下。
(1)铺板：取纤维蛋白原液(称取纤维蛋白原适量。用Tris-HCl缓冲液配成每毫升中含4.2mg可凝蛋白的溶液)12.7ml，纤维蛋白溶酶原液(取纤维蛋白溶酶原用Tris-HCl缓冲液配成每毫升中含lu的溶液)0.67ml，琼脂液(称取琼脂0.8g加Tris-HCl缓冲液100ml，加热溶解)13.4ml.凝血酶液(取凝血酶用Tris-HCl缓冲液配成含70B.PU的溶液)0.67ml。混匀.倒人直径9cm的有机玻璃盘内。室温放置半小时。凝好的板均匀无气泡，呈乳白色。
(2)点样：称取纤溶酶标准品适量。用Tris-HCI缓冲液配成每毫升中含2200，1100，550，270四个浓度。用微量注射器吸取10μl标准液点于板上。点与点间应留有一定间距，然后盖上玻扳。置37℃恒温培育18小时，去盖，用游标卡尺测量其溶圈的垂直直径，以两直径乘积为纵座标。标准品单位为横座标，在双对数座标纸上作图绘制标准曲线或求回归方程。供试品的单位取在标准曲线范围内。以供试品溶圈垂直两直径乘积，在纤溶酶标推曲线上查活力单位。
(3)检测结果：两直径乘积为纵座标，标准品单位为横座标，回归方程为lgY＝-1.573+0.544 lgX，Y为溶圈的垂直直径乘积，单位为cm2，X为活性单位。结果表明，发酵液的活性单位为3.39E+06U/L。
实施例5.基因工程纤溶酶制备溶栓类药物
将纯化的纤溶酶在缓冲液(23克甘氨酸/升，1.6克磷酸氢二钠/升，0.55克磷酸二氢钠/升，pH7.0)透析后，用超滤浓缩到每毫升含1毫克浓度，用0.22μm孔径的膜过滤灭菌。然后，大约1毫升样品液(约300000活力单位)装瓶，冷冻干燥，制成成品。使用时，样品首选用1毫升医用水溶解，用作生物测活和注射病人。
基因工程纤溶酶样品规格为：300000U基因工程纤溶酶；23mg甘氨酸；1.6mg磷酸氢二钠；0.55mg磷酸二氢钠。另外配备5毫升医用级水。
实施例6.基因工程纤溶酶蛋白制剂的应用——小鼠抗凝实验
方法参考陈健康等的文献进行[陈健康，王雷，李珂，郭峰，杨军，银杏黄酮与基因工程纤溶酶的抗凝溶栓作用，心脏杂志2001，13(4)：308-309]。
挑选昆明种雄性小鼠30只，随机分为3组，体重20±2g。连续给药3天，各组分别注射5000U/kg基因工程纤溶酶，0.2mg阿司匹林，对照组注射生理盐水0.5mL。第3天用药后2小时开始实验。将小鼠尾尖部剪断1cm，间隔10s用滤纸吸去血清，不得挤压，记录小鼠出血时间。
实验结果(见表1)表明，基因工程纤溶酶组和阿司匹林组出血时间均延长，基因工程纤溶酶用药组和对照组比较有显著性意义，说明基因工程纤溶酶有很好的抗凝血作用。
             表1  实验小鼠尾部出血时间对照表
    组    别    例    数   平均出血时间(秒)
    对照组       10      89±27
  基因工程纤溶酶组       10      237±46
    阿司匹林组       10      198±32
(与对照组相比，ρ＜0.05)
实施例7.基因工程纤溶酶蛋白制剂的应用——对大鼠实验性脑缺血的保护作用
(1)大鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)的制备
方法参照文献进行[Tamura A，Graham DI，McCulloch J，Teasdale GM.，Focal cerebral ischaemia in the rat：l.Description of technique and earlyneuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.J CerebBlood Flow Metab.1981；1(1)：53-60.][冯亦璞，闰韶华，小鼠短暂性MCAO模型，张均田，现代药理实验方法，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998]。
用10％水合氯醛(300mg/kg)ip麻醉大鼠，仰位固定，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，由分叉处向头端依次游离，结扎并剪断枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎并切断，游离备用。分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉，用细线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进20毫米左右。扎紧颈外动脉根部松扣。一小时后，小心拔出细线，扎紧动脉残端，用外科无损伤缝合线缝合皮肤，完成大脑中动脉栓塞。术中术后室温控制在22±1℃。
雄性Wister大鼠(50±50g)，随机分成4个组，即假手术组、模型组、基因工程纤溶酶(2500U/kg)组，基因工程纤溶酶(5000U/kg)组。其中假手术组暴露左大脑中动脉和左颈总动脉，不结扎。各给药组于结扎前10分钟分别静脉注射基因工程纤溶酶，模型组则给予生理盐水0.5ml。
(2)基因工程纤溶酶对脑缺血大鼠存活时间的影响
实验结果见表2
        表2  基因工程纤溶酶对脑缺血大鼠存活时间的影响
Tahle 2 Effect of Lumbroinase on survival time in ischemic mice(x±S)
分    组             例数(n)           存活时间(min)
对照组                 15                 9.5±4.1
假手术组               15                 8.2±5.4
基因工程纤溶酶
                       15                 11±8
(2500U/kg)
基因工程纤溶酶
                       15                 68±282
(5000U/kg)
与对照组相比，ρ＜0.001
(3)基因工程纤溶酶对脑缺血大鼠大脑动脉24h后梗死面积和脑组织含水量的影响，实验结果见表3
表3  基因工程纤溶酶对小鼠大脑中动脉闭塞24h后梗死面积及组织的含水量
Table 3 Inhibitory effect of lumbrokinase on infarction area and water content
                in brain ofter 24h MCAO in rats  (x±S)
分  组           例数(n)      梗死面积(1/2)      含水量(mL/g)
假手术组            8           1.22±0.05        3.74±0.09
模型组              8           7.17±0.37c      4.99±0.45c
基因工程纤溶        8           5.77±0.22bd     4.77±0.34
酶(2500U/kg)
基因工程纤溶        8           4.07±0.65b      4.41±0.56a
酶(2500U/kg)
与模型组比较，a：ρ＜0.05，b：ρ＜0.01；与假手术组比较，c：ρ＜0.001；与模型+基因工程纤溶酶2500U/kg和5000U/kg组比较，d：ρ＜0.05。
(4)基因工程纤溶酶对大鼠大脑中动脉闭塞24小时后神经功能障碍的影响
上述3组动物在大脑中动脉结扎术后24小时观察其神经功能障碍的情况，将神经功能障碍分为5级：I级为无神经系统功能损害，记1分；II级仅有轻度功能障碍，表现为行走时虽不用扶持，但步态欠稳，提尾时脑损伤对侧前肢屈曲，记2分；III级有中度功能障碍，表现为在扶持下方可站立，不持久，提尾时脑损伤对侧前肢屈曲，向手术侧转圈，记3分；IV级为重度功能障碍，表现为有意识变化，嗜睡，反应迟钝，不能站立，记4分；V级为死亡，记5分。该方法为溶栓类药物常用的测定方法，可参考[Lawner PM，Laurent JP，Simeone FA，Fink EA，Effect ofextracranial-intracranial bypass and pentobarbital on acute stroke in dogs.JNeurosurg.1982 Jan；56(1)：92-96.][Diaz FG，Mastri AR，Ausman JI，Chou SN.，JNeurosurg.Acute cerebral revascularization after regional cerebral ischemia in thedog.，1979 Nov；51(5)：644-653.]。
实验结果见表4。
表4  基因工程纤溶酶对小鼠大脑中动脉闭塞24h后神经功能障碍的影响
Table 4  Influence of lumbrokinase on neurologic deficits(ND)scores
           produced by 24h MCAO in rats(x±S)
分  组            例数(n)        神经功能障碍评分
模型组               8              4.21±0.3d
假手术组             8              1.45±0.5
基因工程纤溶         8              2.16±0.5b
酶(2500U/kg)
基因工程纤溶         8              1.67±0.3b
酶(5000U/kg)
与模型组比较，b：ρ＜0.01；与假手术组比较，d：ρ＜.001。
(5)基因工程纤溶酶对小鼠大脑中动脉闭塞24小时后脑组织总抗氧化能力、NO含量及NOS活性的影响
实验结果见表5。
表5  基因工程纤溶酶对小鼠大脑中动脉闭塞24h后脑组织总抗氧化能力，一氧
                 化氮含量和一氧化氮合酶活性的影响
Table 5 Effect of Lumbrokinase on T-AOC.NO content and NOS activity after
                       24h MCAO(n＝6，x±S))
                 总抗氧化能力       NO           NOS
分  组
                    (kU/g)       (μmol/g)      (kU/g)
正常对照          3.17±0.56     1.11±0.20    0.39±0.06
模型组            1.20±0.15d   3.20±0.54d  0.84±0.79d
假手术组          3.16±0.58     1.09±0.20    0.41±0.04
基因工程纤溶酶
                  1.71±0.24af  3.20±0.38    0.75±0.15
(2500U/kg)
基因工程纤溶酶
                  2.20±0.18be  2.80±0.35a  0.74±0.09a
(5000U/kg)
与假手术组比较，d：ρ＜0.001；与模型组比较，a：ρ＜0.05，b：ρ＜0.01；与模型+基因工程纤溶酶5000U/kg组比较，e：ρ＜0.05，，f：ρ＜0.01。
上述实验结果表明基因工程纤溶酶可缩小梗死面积、减轻脑水肿和缺血后脑组织总抗氧化能力的降低，减低NO含量、降低NOS活性，故对脑缺血起到保护作用。
实施例8.基因工程纤溶酶蛋白制剂的应用——溶栓作用
家兔颈外静脉血栓法操作简便，不需特殊仪器，在国内外均有研究室采用，是研究药物溶血栓作用的可行方法。该方法可参考[赵炜明，许超千，何树庄，王玲，基因工程纤溶酶溶栓作用的实验研究：哈尔滨医科大学学报，2002(36)3：183-185][徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982.][朱燕，何执中，孙可迪，王少飞，基因工程纤溶酶对实验性血栓的影响，中国药科大学学报，2000，31(1)：50～52。]
(1)制造颈动-静脉旁路实验模型
将实验兔用20％乌拉坦5ml/kg耳缘静脉注射麻醉，背位固定，剥离气管，插入一塑料套管(气管分泌物多时可通过此套管吸出)，分离左侧颈外静脉和右侧颈总动脉。在三段聚乙烯管中段放入一段长6cm的4号手术丝线，聚乙烯管内充满肝素生理盐水溶液(50U/ml)：用聚乙烯管的一端插入左颈外静脉后，由聚乙烯管准确注入肝素生理盐水溶液(50U/ml)抗凝，然后再将聚乙烯管的另一端插入右颈总动脉，打开动脉夹，血液从右颈总动脉流至聚乙烯管内，返回左颈外静脉，形成颈动-静脉旁路，维持3h后，取血，中断血流，迅速取出丝线称重。
(2)实验分组及给药途径
家兔36只，体重2.5士0.2kg，随机分成6组，分别为模型组、生理盐水对照组、基因工程纤溶酶小剂量组、基因工程纤溶酶中剂量组、基因工程纤溶酶大剂量组、尿激酶阳性对照组。
各组具体给药途径如下：模型组：所制造的颈动-静脉旁路模型；生理盐水对照组：耳缘静脉等体积注射生理盐水；基因工程纤溶酶小剂量组：耳缘静脉注射基因工程纤溶酶1250U/kg；基因工程纤溶酶中剂量组：耳缘静脉注射基因工程纤溶酶2500U/kg；基因工程纤溶酶大剂量组：耳缘静脉注射基因工程纤溶酶5000U/kg；尿激酶阳性对照组：耳缘静脉注射尿激酶2×104U/kg。
给药方法：颈动-静脉旁路模型建立后，生理盐水对照组、基因工程纤溶酶小剂量组、中剂量组、大剂量组及尿激酶阳性对照组分别于旁路建立后15min给药，观察3h。
(3)溶栓作用
采用兔动-静脉旁路血栓形成模型，测定蚯蚓纤溶酶的溶栓作用(血栓湿重、干重)；心脏取血，测定蚯蚓纤溶酶对血浆纤维蛋白酶(FIB)、血浆优球蛋白溶解时间(ELT)、纤维蛋白裂解产物(FDP)等生化指标的影响。
实验结果见表6和表7。本实验中基因工程纤溶酶中剂量组与大剂量组可使ELT显著缩短，说明基因工程纤溶酶激活了纤溶系统。本实验中基因工程纤溶酶小剂量组、中剂量组和大剂量组与模型组相比可明显增加FDP含量，说明基因工程纤溶酶可使血液系统的纤溶活性增强。在本实验中，FIB没有明显的变化，表明基因工程纤溶酶不易产生出血的副反应。
            表6基因工程纤溶酶对ETL FDP数值及FIB含量的影响
                  ELT(min)    FDP(ng·L-1)
组    别                                                    FIB(g·L-1)
                  ＜120    ≥130    ＜5    5-20    ≥20
模型组               0     7.9      8.1     0        0      4.60±2.89
生理盐水组           0     7.9      8.1     0        0      5.90±2.98
基因工程纤溶酶小     0     7.8      4.9     0        2.5    5.34±2.80☆
剂量组(1250U/kg)
基因工程纤溶酶中
                     4.1· 4.1·    1.1·    4·          3·       3.75±1.84☆
剂量组(2500U/kg)
基因工程纤溶酶大
                     5·   3·          1·        1·          6·       3.00±1.93☆
剂量组(5000U/kg)
尿激酶组             5·   3·          0·        1·          7·       2.60±1.02☆
ELT，FDP均以例数计，经秩和检验，·与生理盐水组比较，均为ρ＜0.01；FIB含量经q检验，☆与生理盐水组比较ρ＜0.05。
        表7基因工程纤溶酶对家兔体内血栓形成的影响(x±S)
组  别         例      剂量      湿重(ng)            干重(ng)           抑制率
               数                                                        (％)
模型组         8                 70.25±2.04         22.01±1.83
重理盐水组     8                 85.31±3.61         28.25±1.02
基因工程纤溶   8      1250U/kg   63.58±9.60△△         19.55±3.67△△         24.5
酶小剂量组
基因工程纤溶   8      2500U/kg   39.00±5.9··△△☆    14.26±1.05··△△    53.6
酶中剂量组                                                ☆
基因工程纤溶   8      5000U/kg   29.49±4.58··△△    12.21±2.01··△△    65.3
酶大剂量组
尿激酶组       8      2×104U/kg21.11±5.48··△△    8.91±2.07··△△      75.1
··与模型组比较，ρ＜0.01；△△与生理盐水组比较ρ＜0.01；☆大、中、小剂量组比较；ρ＜0.05。
                          SEQUENCE LISTING
                               NO：1
<110>  绿色生命实验室有限公司
<120>  一种蚯蚓纤溶酶基因和基因工程菌株及其构建和应用
<130>  正蚓科粉正蚓属蚯蚓(Lumbricus rubellus)纤溶酶基因核苷酸
序列
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  747
<212>  DNA
<213>  Lumbricus rubellus
<220>
<221>  cDNA
<222>  (3)..(740)<223>
<400>  1
acatggaact tcctcccgga acaaaaattg tcggaggaat tgaagctaga ccatacgagt     60
tcccatggca ggtgtccgtc cgaaggaaat cttccgattc ccatttctgc ggaggtagca    120
tcatcaacga tcgttgggtt gtctgcgctg ctcactgcat gcagggagag gcccccgctc    180
tggtttcatt ggtcgtgggt gagcacgaca ggagtgcagc gagtacagta cgtcagactc    240
atgacgttga tagcatcttc gttcacgagg actacaacac aaatacccta gagaacgacg    300
tttctgtcat caagacatct gttgccatca ctttcgacat caacgttggt ccaatctgcg    360
ccccagatcc ggctaacgac tacgtctacc gtaagagcca gtgttccgga tggggaacta    420
tcaattcagg tggaatctgc tgtcccaacg ttctgcgata cgtgacgctg aatgacacaa    480
ccaaccaata ctgcgaagat gtatacccac taaattcaat ctacgacgat atgatttgcg    540
cgtcggacaa cactgggggt aacgacagag actcctgcca gggtgactcc ggcggccctc    600
tgagcgtcaa ggatggtagt ggaatcttca gcctgattgg tattgtgtct tggggaattg    660
gttgcgcttc tggctatcca ggagtctact cccgcgtcgg attccatgct gcatggatca    720
ccgacatcat caccaacaac taaaccg                                        747
                       SEQUENCE LISTING
                             NO：2
<110>  绿色生命实验室有限公司
<120>  一种蚯蚓纤溶酶基因和基因工程菌株及其构建和应用<130>
正蚓科粉正蚓属蚯蚓(Lumbricus rubellus)纤溶酶基因氨基酸序列
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  246
<212>  PRT<213>  Lumbricus rubellus
<220><221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(246)
<223>
<400>  1
Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg
1                5                  10                  15
Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp
                20              25                  30
Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys
        35                  40                  45
Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val
    50                  55                  60
Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gln Thr His
65                  70                  75                  80
Asp Val Asp Ser Ile Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Thr Asn Thr Leu
                85                  90                  95
Glu Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Ser Val Ala Ile Thr Phe Asp
            100                 105                 110
Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val
        115                 120                 125
Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly
    130                 135                 140
Ile Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Asp Thr Thr
145                 150                 155                 160
Asn Gln Tyr Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn Ser Ile Tyr Asp Asp
                165                 170                 175
Met Ile Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp Ser Cys
            180                 185                 190
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile
        195                 200                 205
Phe Ser Leu Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly
    210                 215                 220
Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Ala Trp Ile Thr
225                 230                 235                 240
Asp Ile Ile Thr Asn Asn
                    245

Claims (7)

1、一种蚯蚓纤溶酶基因，其包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
2、一种编码权利要求1的蚯蚓纤溶酶蛋白，其包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3、一种实现权利要求1所述的蚯蚓纤溶酶基因的方法，包括下列步骤：
A、扩增引物合成：根据GeneBank中已经发表的蚯蚓纤溶酶cDNA序列设计引物，上游引物P1长18个核苷酸：ACATGGAACTTCCTCCCG，下游引物P2长19个核苷酸：ATCACCAACAACTAAACCG.，引物经PAGE纯化；
B、蚯蚓总RNA提取：取3～5条蚯蚓成体，用DEPC处理过的灭菌水漂洗后，放在铺有湿滤纸的平皿中饥饿过夜，再次用DEPC水清洗干净后，在液氮中研磨成粉末状，提取总RNA贮存于-80℃；
C、反转录合成cDNA第一条链：以Oligo(dT)20为引物合成cDNA第一链，反应条件为：42℃ 1小时；95℃ 5分钟；3℃ 5分钟；
D、目的基因的PCR扩增：以cDNA第一条链为模板进行PCR扩增，其反应参数为：95℃预变性4分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，20个循环；94℃变性1分钟，55℃退火1.5分钟，72℃延伸2分钟，10个循环；72℃再延伸10分钟；
E、目的基因片段的回收，按照PCR产物回收试剂盒说明书回收目的基因片段；
F、目的基因片段克隆入载体：回收目的基因片段并与T载体连接，连接产物转化感受态细胞大肠杆菌JM109，挑取菌落快速提取质粒进行酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是包含本发明涉及基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏。
4、一种基因工程菌株，其特征是：毕赤酵母Pichia pastoris X-33(pPIC6αA-EFE)CCTCC No：M204005。
5、一种实现权利要求4的基因工程菌株的制备方法，其特征是：
A、蚯蚓纤溶酶基因的PCR扩增：以含有纤溶酶基因的T载体质粒为模板，根据EFE成熟肽和表达载体pPIC6αA上的克隆位点设计引物，并在上游引物中加入6个连续的组氨酸编码序列，之后加入肠激酶切割位点序列，并设计了一对蚯蚓纤溶酶PCR扩增引物；
B、PCR产物克隆至T载体：回收PCR产物中的基因片段，并克隆于pGEM-T载体，将该重组载体pGEM-T-EFE2转入大肠杆菌JM109中；
C、穿梭表达质粒的构建：提取重组载体pGEM-T-EFE2，用EcoR I和Xba I双酶切以得到目的片段EFE；同样酶切pPIC6αA空载体并在CIAP作用下使之去磷酸化，将去磷酸化后的线性化的pPIC6αA空载体与双酶切后得到的EFE在T4DNA连接酶的作用下4℃过夜，以得到重组表达载体pPIC6αA-EFE，将该重组载体转入大肠杆菌JM109中进行扩增；
D、表达纤溶酶基因的酵母基因工程菌株的构建，首先是穿梭表达质粒的线形化，提取重组质粒pPIC6αA-EFE，用SacI酶切成线性，同样酶切空质粒pPIC6αA作为对照；其次是转化，利用生化方法将线性化的重组质粒pPIC6αA-EFE和空质粒pPIC6αA转化X-33酵母菌株，在含有杀稻瘟素300mg/ml的YPD固体培养基上培养2-3天，直到有单菌落出现；第三是筛选阳性转化子，挑取10-20个单菌落于YPD液体培养基中30℃，250rpm摇床培养直至对数生长晚期，提取基因组进行重组子的PCR鉴定。
6、根据权利要求5所述的基因工程菌株的制备方法，其特征是：蚯蚓纤溶酶PCR扩增所用的PCR引物为：上游引物：CGAATTCCACCACCACCACCACCACGGTGGTGGTGACGACGACGACAAGATGGAACTTCCTCCCGGAACA；下游引物：GTCTAGATTAGTTGTTGGTGATGATGTCGGTGATCCATGCAGCAT。
7、一种基因工程纤溶酶蛋白在治疗心血管类疾病药物中的应用。
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