CN1528781A - 二色桌片参中新的抗肿瘤化合物Intercedenside D～H - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，具体为从二色桌片参中分离的5种抗癌化合物Intercedenside D～H，分子式分别为：C55H83O27SNa；C54H81O26SNa；C55H85O27SNa；C54H81O25SNa；C55H83O26SNa。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二维核磁共振波谱的解析，确定了这些化合物的化学结构和立体构型。体外抗肿瘤实验表明，这些化合物对IA－9卵巢癌和A－549人肺癌等10种人肿瘤细胞株有明显的抑制作用。因此可用于制备抗肿瘤药物。本发明为研制新的抗肿瘤药物提供先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是从海洋动物二色桌片参中分离到的5种新的抗肿瘤化合物Intercedenside D、E、F、G、H。
背景技术
二色桌片参(Mensamaria intercedens Lampert)是一种大量生长于福建沿海的海参纲动物，属瓜参科桌片参属。体形较小，体长不足10cm，直径不足3cm，体壁薄。含有丰富的蛋白质、维生素A和维生素E，有较高的营养价值。文献报道该动物还含有丰富的蛋白多糖、多糖和皂苷类物质(吴萍茹等，二色桌片参化学成分研究，中国海洋药物，2000，19(1)：17)。有关所含的皂苷类成分的化学结构及抗肿瘤活性迄今尚未见有过报道。
发明内容
本发明是从生长于中国福建海域的二色桌片参中提取分离到的一种新的皂苷类化合物，分别命名为Intercedenside D，Intercedenside E，Intercedenside F，Intercedenside G，Intercedenside H，它们的化学结构式通式如下：
本发明化合物的制备方法如下：
(1)提取：将新鲜二色桌片参洗净、切碎，用5倍量(重量)95％乙醇浸泡提取7天，滤出提取液，再用85％的乙醇浸泡提取2次，每次7天。合并3次提取液，减压回收乙醇，得到流浸膏。将流浸膏溶于水中过滤，将滤液通过大孔树脂柱，依次用水和50％乙醇洗脱。收集50％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到总皂苷提取物。
(2)分离：上述总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(8～5∶1～4∶1)混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇∶水(5～10∶5～0)梯度洗脱，收集不同滤液，薄层层析检测，得到Intercedenside D～H纯品。经多种现代光谱分析，特别是综合应用多种先进的二维核磁共振波谱的解析，确定了这些化合物的化学结构和立体构型。
1.Intercedenside D为无色结晶性粉末，熔点214-216℃，分子式C55H83O27SNa；Liebermann-Burchard反应和α-萘酚反应阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS+m/z：1253[M+Na]+；电喷雾阴离子质谱ESI-MS-m/z：1207[M-Na]-。IR(KBr)cm-1：3436(羟基)，1745(羰基)，1653(双键)，1235，1068(硫酸酯基)。13C NMR与1H NMR数据见表1和表2。以15％HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定Intercedenside D的糖链由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖组成，比例为2∶1∶1。
2.Intercedenside E为无色结晶性粉末，熔点242-244℃，分子式C54H81O26SNa；Liebermann-Burchard反应和α-萘酚反应阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS+m/z：1223[M+Na]+；电喷雾阴离子质谱ESI-MS-m/z：1177[M-Na]-。IR(KBr)cm-1：3442(羟基)，1734(羰基)，1659(双键)，1237，1071(硫酸酯基)。13C NMR与1H NMR数据见表3和表4。以15％HCl水解皂营后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定Intercedenside E的糖链由木糖、3-O-甲基葡萄糖组成，比例为3∶1。
3.Intercedenside F为无色结晶性粉末，熔点226-228℃，分子式C55H85O27SNa；Liebermann-Burchard反应和α-萘酚反应阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS+m/z：1255[M+Na]+；电喷雾阴离子质谱ESI-MS-m/z：1209[M-Na]-。IR(KBr)cm-1：3437(羟基)，1731(羰基)，1660(双键)，1241，1069(硫酸酯基)。13C NMR与1H NMR数据见表5和表6。以15％HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定Intercedenside F的糖链由木糖、葡萄糖、3-O-甲基葡萄糖组成，比例为2∶1∶1。
4.Intercedenside G为无色结晶性粉末，熔点241.5-243.2℃，分子式C54H81O25SNa；Liebermann-Burchard反应和α-萘酚反应阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS+m/z：1207[M+Na]+；电喷雾阴离子质谱ESI-MS-m/z：1161[M-Na]-。IR(KBr)cm-1：3443(羟基)，1729(羰基)，1665(双键)，1242，1071(硫酸酯基)。13C NMR与1H NMR数据见表7和表8。以15％HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定Intercedenside G的糖链由木糖、3-O-甲基葡萄糖组成，比例为3∶1。
5.Intercedenside H为无色结晶性粉末，熔点188-190℃，分子式C55H83O26SNa；Liebermann-Burchard反应和α-萘酚反应阳性。电喷雾阳离子质谱ESI-MS+ m/z：1237[M+Na]+；电喷雾阴离子质谱ESI-MS-m/z：1191[M-Na]-。IR(KBr)cm-1：3437(羟基)，1732(羰基)，1671(双键)，1245，1069(硫酸酯基)。13C NMR与1H NMR数据见表9和表10。以15％HCl水解皂苷后得到组成皂苷糖链的单糖，将其制备成糖腈乙酸酯衍生物，进行气相色谱-质谱联用分析，经与标准糖的糖腈乙酸酯衍生物对照，确定Intercedenside H的糖链由木糖、奎诺糖、3-O-甲基葡萄糖组成，比例为2∶1∶1。
表1.Intercedenside D苷元部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBC1 35.2 1.25(1H，m，α)，1.33(1H，m，β)2 26.7 1.82(1H，m，β)，1.97(1H，m，α)3 88.9 3.15(1H，dd，3.6，12) C：1xyl14 39.15 47.8 0.84(1H，m) C：4，30，316 22.8 1.86(2H，m)7 119.6 5.59(1H，bs)8 147.59 47.5 3.34(1H，d，9.6)10 35.711 22.3 1.49(1H，m)，1.77(1H，m)12 25.4 1.98(1H，m)，2.64(1H，m)13 58.014 48.415 43.3 1.69(1H，m)，2.53(1H，dd，α，4.8，8.4)16 82.8 6.07(1H，m) C：17，CH3COO17 87.418 178.419 23.8 1.07(3H，s) C：9，1020 86.021 26.5 1.74(3H，s) C：17，20，2222 128.3 5.80(1H，d，12) C：20，2423 121.0 6.08(1H，t，12) C：20，2524 122.0 6.73(1H，d，12) C：26，27，25 135.426 26.0 1.58(3H，s) C：23，24，25，2727 17.2 1.57(3H，s) C：23，24，25，2630 17.0 0.98(3H，s) C：3，4，5，3131 28.4 1.10(3H，s) C：3，4，5，3032 30.9 1.44(3H，s) C：13，14CH3COO 170.6CH3COO 21.0 1.93(3H，s)
表2.Intercedenside D糖链部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1 104.7 4.66(1H，d，7.2) C：C-32 81.1 4.12(1H，m) C：1glc3 74.9 4.25(1H，m) C：2xyl14 75.9 5.01(1H，m)5 63.8 3.72(1H，m)，4.75(1H，m)glc(1→2xyl1)1 104.3 5.13(1H，d，7.2) C：2xyl12 75.6 3.88(1H，m)3 80.0 4.08(1H，m) C：1xyl24 71.8 4.04(1H，m)5 76.0 3.69(1H，m)6 60.7 4.26(1H，m)，4.31(1H，m)xyl2(1→3glc)1 104.1 4.91(1H，d，7.8) C：3glc2 73.2 3.86(1H，m)3 86.4 4.06(1H，m) C：1Meglu4 68.6 3.93(1H，m)5 65.8 3.53(1H，t，10.8)，4.05(1H，m)Meglu(1→3xyl2)1 104.4 5.15(1H，d，7.2) C：3xyl22 74.4 3.84(1H，m) C：3 Meglu3 86.9 3.64(1H，m) C：2，4 Meglu，OMe4 70.2 3.87(1H，m) C：OMe5 77.4 3.91(1H，m) C：4 Meglu6 61.6 4.02(1H，m)，4.36(1H，m)OMe 60.4 3.78(3H，s) C：3 Meglu
表3. Intercedenside E苷元部分13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBC1 35.4 1.28(1H，m，α)，1.37(1H，m，β)2 26.6 1.83(1H，m，β)，1.97(1H，m，α)3 88.8 3.18(1H，dd，4.2，12) C：1xyl14 39.25 47.9 0.90(1H，m) C：4，30，316 22.9 1.89(2H，m)7 119.7 5.61(1H，bs)8 147.69 47.7 3.38(1H，d，14.4)10 35.911 22.4 1.45(1H，m)，1.79(1H，m)12 25.5 1.99(1H，m)，2.65(1H，m)13 58.214 48.615 43.4 1.70(1H，m)，2.55(1H，dd，α，4.8，8.4)16 82.8 6.09(1H，m) C：17，CH3COO17 87.518 178.519 24.0 1.10(3H，s) C：9，1020 86.221 26.8 1.75(3H，s) C：17，20，2222 128.5 5.83(1H，d，12) C：20，2423 121.1 6.10(1H，t，12) C：20，2524 122.1 6.77(1H，d，12) C：26，27，25 136.126 26.1 1.59(3H，s) C：23，24，25，2727 17.3 1.58(3H，s) C：23，24，25，2630 16.8 1.0(3H，s) C：3，4，5，3131 28.3 1.15(3H，s) C：3，4，5，3032 31.0 1.48(3H，s) C：13，14CH3COO 170.5CH3COO 21.1 1.94(3H，s)
表4. Intercedenside E糖链部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1 104.8 4.60(1H，d，7.2) C：C-32 82.3 4.00(1H，m) C：1xyl23 75.4 4.26(1H，m) C：2xyl14 75.9 5.06(1H，m)5 64.1 3.71(1H，m)，4.79(1H，m)xyl2(1→2xyl1)1 105.7 5.02(1H，d，7.2) C：2xyl12 74.7 3.88(1H，m)3 74.9 4.03(1H，m)4 77.0 4.11(1H，m) C：1xyl35 64.2 3.50(1H，m)，4.34(1H，m)Xyl3(1→4xyl2)1 102.8 4.76(1H，d，7.2) C：4xyl22 72.6 3.90(1H，m)3 86.4 4.09(1H，m) C：1 Meglu4 68.8 3.97(1H，m)5 68.0 3.53(1H，m)，
4.14(1H，m)Meglu(1→3xyl3)1 104.5 5.22(1H，d，7.8) C：3xyl32 75.6 3.95(1H，m) C：3 Meglu3 87.2 3.66(1H，m) C：2，4 Meglu，OMe4 70.4 3.94(1H，m) C：OMe5 77.7 3.87(1H，m) C：4 Meglu6 61.8 4.06(1H，m)，4.40(1H，m)OMe 60.6 3.79(3H，s) C：3 Meglu
表5. Intercedenside F苷元部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBC1 35.7 1.25(1H，m，α)，1.35(1H，m，β)2 26.8 1.80(1H，m，β)，1.94(1H，m，α)3 88.8 3.16(1H，m) C：1xyl14 39.25 47.3 0.86(1H，m) C：4，30，316 22.9 1.85(2H，m)7 119.4 5.64(1H，bs)8 147.89 47.1 3.37(1H，d，14.4)10 35.311 22.3 1.45(1H，m)，
1.75(1H，m)12 25.8 1.92(1H，m)，2.60(1H，m)13 59.614 48.715 43.4 1.71(1H，m)，2.63(1H，dd，α，4.8，8.4)16 85.2 6.16(1H，m) C：17，CH3COO17 87.218 178.419 23.9 1.04(3H，s) C：9，1020 87.021 25.4 1.68(3H，s) C：17，20，2222 37.4 2.03(1H，m)，2.50(1H，m) C：20，2423 23.6 2.20(1H，m)，2.28(1H，m) C：20，2524 124.5 5.04(1H，m) C：26，27，25 131.626 25.3 1.55(3H，s) C：23，24，25，2727 17.4 1.43(3H，s) C：23，24，25，2630 17.1 0.98(3H，s) C：3，4，5，3131 28.5 1.07(3H，s) C：3，4，5，3032 30.4 1.45(3H，s) C：13，14CH3COO 169.9CH3COO 20.8 1.95(3H，s)
表6. Intercedenside F糖链部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1 104.8 4.65(1H，d，7.2) C：C-32 81.4 4.13(1H，m) C：1glc3 75.1 4.26(1H，m) C：2xyl14 75.9 5.05(1H，m)5 63.9 3.72(1H，m)，4.76(1H，m)glc(1→2xyl1)1 104.5 5.14(1H，d，7.2) C：2xyl12 75.8 3.95(1H，m)3 80.1 4.12(1H，m) C：1xyl24 71.4 4.04(1H，m)5 76.1 3.69(1H，m)6 60.8 4.28(1H，m)，4.37(1H，m)xyl2(1→3glc)1 104.2 4.95(1H，d，7.8) C：3glc2 73.3 3.90(1H，m)3 86.4 4.07(1H，m) C：1Meglu4 68.6 3.93(1H，m)5 66.0 3.53(1H，m)，4.08(1H，m)Meglu(1→3xyl2)1 104.6 5.18(1H，d，7.2) C：3xyl22 74.5 3.86(1H，m) C：3 Meglu3 86.6 3.65(1H，m) C：2，4Meglu，OMe4 70.3 3.92(1H，m) C：OMe5 77.6 3.88(1H，m) C：4Meglu6 61.7 4.05(1H，m)，4.40(1H，m)OMe 60.5 3.78(3H，s) C：3Meglu
表7. Intercedenside G苷元部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBC1 35.9 1.33(2H，m)2 26.7 1.80(1H，m，β)，1.99(1H，m，α)3 88.8 3.19(1H，m) C：1xyl14 39.25 47.6 0.91(1H，dd，4.2，10.2) C：4，30，316 23.0 1.95(2H，m)7 120.2 5.57(1H，bs)8 145.69 47.2 3.33(1H，bd，13.8)10 35.311 22.3 1.44(1H，m，α)，1.76(1H，m，β)12 30.6 2.09(1H，m)13 58.314 47.915 43.8 1.59(1H，dd，β，7.2，11.4)，2.42(1H，dd，α，7.8，12)16 72.7 5.91(1H，m) C：17，CH3COO17 57.2 3.12(1H，d，8.4) C：13，2118 179.519 23.7 1.09(3H，s) C：9，1020 84.021 28.9 1.60(3H，s) C：17，20，2222 131.7 5.69(1H，d，12) C：20，2423 120.3 6.03(1H，t，12) C：20，2524 121.0 6.42(1H，d，12) C：26，2725 137.026 26.0 1.66(3H，s) C：23，24，25，2727 17.5 1.61(3H，s) C：23，24，25，2630 16.8 1.00(3H，s) C：3，4，5，3131 28.2 1.16(3H，s) C：3，4，5，3032 32.4 1.08(3H，s) C：13，14CH3COO 170.2CH3COO 21.2 1.92(3H，s)
表8. Intercedenside G糖链部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz) HMBCxyl1(1→C-3)1 104.7 4.66(1H，d，7.2) C：C-32 82.4 4.01(1H，m) C：1xyl23 75.3 4.24(1H，m) C：2xyl14 75.8 5.07(1H，m)5 64.1 3.73(1H，m)，4.79(1H，m)xyl2(1→2xyl1)1 105.8 5.01(1H，d，7.2) C：2xyl12 74.7 3.89(1H，m)3 74.9 4.05(1H，m)4 77.0 4.13(1H，m) C：1Xyl35 64.2 3.49(1H，m)，4.31(1H，m)xyl3(1→4xyl2)1 102.8 4.76(1H，d，7.8) C：4xyl22 72.6 3.90(1H，m)3 86.2 4.09(1H，m) C：1 Meglu4 68.8 3.97(1H，m)5 66.0 3.54(1H，m)，4.12(1H，m)Meglu(1→3xyl3)1 104.6 5.22(1H，d，7.8) C：3xyl32 75.6 3.95(1H，m) C：3 Meglu3 87.2 3.68(1H，m) C：2，4 Meglu，OMe4 70.4 3.94(1H，m) C：OMe5 77.7 3.86(1H，m) C：4 Meglu6 61.8 4.06(1H，m)，4.40(1H，m)OMe 60.5 3.78(3H，s) C：3 Meglu
表9. Intercedenside H苷元部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz)1 35.3 1.26(1H，m，β)，1.34(1H，m，α)2 26.5 1.80(1H，m，β)，1.98(1H，m，α)3 88.3 3.20(1H，dd，4.2，12)4 39.55 47.9 0.93(1H，m)6 23.0 1.91(2H，m)7 120.1 5.62(1H，bs)8 147.99 47.5 3.37(1H，d，13.8)10 35.611 22.5 1.44(1H，m)，1.72(1H，m)12 25.7 1.98(1H，m)，2.65(1H，m)13 58.514 48.315 43.6 1.72(1H，β)，2.53(1H，dd，α，8.4，4.8)16 82.8 6.10(1H，m)17 87.618 179.019 24.1 1.12(3H，s)20 85.921 27.0 1.79(3H，s)22 128.6 5.77(1H，d，12)23 121.3 6.20(1H，t，12)24 122.5 6.69(1H，d，12)25 136.426 26.2 1.60(3H，s)27 17.7 1.57(3H，s)30 17.0 1.08(3H，s)31 28.3 1.15(3H，s)32 31.5 1.49(3H，s)CH3COO 170.1CH3COO 21.2 1.94(3H，s)
表10. Intercedenside H糖链部分的13C NMR与1H NMR数据Position δC δH(m，Jin Hz)xyl1(1→C-3)1 105.3 4.70(1H，d，7.2)2 83.2 3.97(1H，m)3 75.2 4.26(1H，m)4 75.8 5.10(1H，m)5 64.0 3.70(1H，m)，4.74(1H，m)qui(1→2xyl1)1 105.2 4.71(1H，d，6.6)2 76.1 3.91(1H，m)3 75.3 4.12(1H，m)4 86.0 3.59(1H，m)5 71.8 4.12(1H，m)6 18.0 1.64(3H，d，6.2)xyl2(1→4qui)1 105.0 4.84(1H，d，7.8)2 73.6 4.01(1H，m)3 87.2 4.18(1H，m)4 68.8 4.12(1H，m)5 66.6 3.56(1H，m)，4.27(1H，m)Meglu(1→3xyl2)1 105.6 5.32(1H，d，7.2)2 74.7 3.98(1H，m)3 88.0 3.63(1H，m)4 70.5 4.07(1H，m)5 78.1 3.94(1H，m)6 62.0 4.23(1H，m)，4.41(1H，m)OMe 60.8 3.84(3H，s)Xyl：木糖；Glc：葡萄糖；Qui：奎诺糖；J：偶合常数
本发明化合物intercedenside D～H经体外抗肿瘤活性实验，表明这些化合物有明显的抑制肿瘤细胞生长的效果。实验所用的细胞株为国际通用的肿瘤细胞株，即：
A-549(肺癌)
MCF-7(乳腺癌)
IA-9(卵巢癌)
CAKI-1(肾癌)
U-87-MG(神经母细胞癌)
PC-3(前列腺癌)
KB(鼻咽癌)
KB-VIN(鼻咽癌)
SK-MEL-2(黑色素瘤)
HCT-8(肠癌)
实验方法为国际通用的SRB法：根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞以90μl/孔接种于96孔培养板，贴壁生长24小时再加药10μl孔。每个浓度设3复孔。并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞调零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO2的条件下培养72小时，然后倾去培养液，用10％冷TCA固定细胞，4℃放置1小时后，用蒸馏水洗涤5次，空气干燥。最后加入150μl/孔的Tris溶液，酶标仪520nm波长下测定OD值。实验结果见表11。
表11. Intercedenside D～H对肿瘤细胞株的抑制作用(ED50，μg/ml)
样品 A549 MCF-7 IA9 CAKI-1 U-87-MG PC-3 KB KB-VIN SK-MEL-2 HCT-8
Int.D 1.8 2.4 2.4 ＞5 4.1 3.3 3.7 4.3 4.2 2.9
Int.E 1.4 1.4 1.7 1.6 2.1 1.7 1.9 2.0 1.6 1.1
Int.F 1.7 2.1 1.7 1.7 3.3 2.3 3.2 3.2 2.1 1.9
Int.G 1.6 2.0 1.9 3.8 3.3 2.0 3.3 3.9 2.4 1.8
Int.H 1.4 1.8 0.96 1.0 3.3 2.2 3.0 3.7 2.2 1.9
ED50：半数有效抑制浓度
从表11可见，这五种化合物对10种肿瘤细胞株的半数有效抑制浓度(ED50)均小于4.3μg/ml，通常ED50＜10μg/ml浓度为有效。上述实验结果表明，Intercedenside D～H对10种不同的肿瘤细胞株均显示明显的抑制作用。因而可用于制备抗肿瘤药物。
本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的先导化合物，对开发利用中国的海洋药用生物资源具有重要意义。
具体实施方式：
实施例1：Intercedenside D～H的分离制备
选择生长于中国福建海域的新鲜二色桌片参1000克，洗涤切碎后分别用5倍量(重量)95％、85％、85％的乙醇依次浸泡提取，每次浸泡7天。合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得流浸膏。将流浸膏溶于3倍量的水中，过滤，滤液通过D101大孔树脂柱，依次用水和50％乙醇各5000ml洗脱。收集50％乙醇洗脱液，减压回收溶剂至干，得到总皂苷4.6克。将总皂苷进行硅胶柱层析，以配比为7∶3∶1的二氯甲烷∶甲醇∶水混合溶剂(下层)约1500ml洗脱，收集含有皂苷的部分，再进行ODS反相柱层析，以甲醇∶水(9～7∶1～3)进行梯度洗脱，薄层层析检测，得到intercedenside D～H纯品，其得量分别为：0.13克、0.15克、0.09克、0.23克、0.21克。
Claims (3)
1.抗肿瘤化合物Intercedenside D～H，其特征在于化学结构式如下：
2.权利要求1所述抗肿瘤化合物Intercednside D～H的制备方法，其具体步骤如下：
(1)提取：将新鲜二色桌片参洗净、切碎，用5倍量(重量)95％乙醇浸泡提取7天，滤出提取液，再用85％的乙醇浸泡提取2次，每次7天，合并3次提取液，减压回收乙醇，得到流浸膏，将流浸膏溶于水中，通过大孔树脂柱，依次用水和50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液，减压回收乙醇，得到总皂苷提取物；
(2)分离：将上述总皂苷提取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇∶水(8～5∶1～4∶1)混合溶剂洗脱，薄层层析检测，收集含有皂苷的流分，再经过ODS反相柱层析，以甲醇∶水(5～10∶5～0)梯度洗脱，薄层层析检测，分别得到Intercedenside D～H纯品。
3.权利要求1所述抗肿瘤化合物Intercedenside D～H在制备抗肿瘤药物中的应用。
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