CN1513555A - 甲-乙型肝炎联合疫苗及其冻干制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及甲型和乙型肝炎联合疫苗以及其冷冻干燥制剂，特别是涉及含有活的适当减毒的甲型肝炎疫苗病毒和由重组CHO细胞和/或重组酵母表达并经纯化的乙型肝炎表面抗原的甲－乙型肝炎联合疫苗，以及其冷冻干燥制剂。在冷冻干燥制剂中，采用的保护剂含有海藻糖、谷氨酸、抗坏血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐。本发明的甲型和乙型肝炎联合疫苗，可同时预防甲型肝炎和乙型肝炎。
Description
技术领域
本发明涉及甲型和乙型肝炎联合疫苗以及其冷冻干燥制剂，特别是涉及含有活的适当减毒的甲型肝炎疫苗病毒和由重组CHO细胞和/或重组酵母表达并经纯化的乙型肝炎表面抗原的甲-乙型肝炎联合疫苗，以及其冷冻干燥制剂。本发明还涉及制备所说的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的方法，以及所说的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的保护剂。
发明背景
甲型肝炎是一种由自然界广泛存在的甲型肝炎病毒(HAV)引起的全球性急性传染病。由于甲型肝炎流行的普遍性而且传播迅速，所以甲肝的流行已成为一个严重的公共卫生问题。特别是在包括中国在内的发展中国家，由于人口众多，社会经济和公共卫生条件相对落后，所以甲型肝炎的大规模暴发及局部流行常有发生，即使在经济高度发达的美国，每年也约有数万例肝炎病人与甲型肝炎病毒感染有关。
乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒引起的传染性疾病。乙型肝炎在发展中国家有很高的发病率和致死率，而且一般预后较差。迄今为止，尚没有一种治疗乙型肝炎的有效方法。在中国，乙肝病毒携带者大约占人口总数的8-10％，并且其中慢性肝炎患者多达1000万人以上。
由于甲型肝炎和乙型肝炎的严重危害性和高流行性，这两种类型肝炎在世界许多国家的发病率始终占所有病毒性肝炎发病率的首位，为70％-80％左右。面对甲-乙型肝炎这种严重流行状况，中国已率先成功开发了基于活的减毒甲型肝炎疫苗。特别是，为了解决乙型肝炎疫苗生产原材料的来源和可能的其他致病因子感染问题，近年来又在开发血源性乙型肝炎疫苗的基础上，进一步开发了基于乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基因工程乙型肝炎疫苗。
自1991年由联合国儿童基金会和世界卫生组织等国际组织发起并推行“儿童疫苗计划”(CVI)以来，世界上许多从事疫苗研究与开发的实验室和公司都在致力于新疫苗的研制。这些新疫苗应该是多联多价的、耐热稳定的，并且是可以以口服或气雾形式接种的。从临床应用角度看，通过使用联合疫苗，经一次免疫接种即可有效地预防两种或多种疾病，以降低疫苗生产成本、提高疫苗接种效率、减少多次注射所带来的不良反应，是疫苗研究的主要发展方向。
近年来，研究人员在开发多联多价疫苗方面已进行了许多有益的尝试。仅就肝炎疫苗而言，例如欧洲专利0339 667号公开了一种含有灭活的甲型肝炎病毒抗原及乙型肝炎病毒表面抗原和佐剂，可同时预防甲型肝炎和乙型肝炎的甲-乙型肝炎联合疫苗。另外，美国专利6,451,320号提供了一种适用于青少年接种的联合疫苗组合物。该联合疫苗组合物包括乙型肝炎病毒表面抗原和单纯疱疹病毒抗原，以及选自甲型肝炎病毒抗原(HAV)、EB病毒(EBV)抗原等的一种或多种病毒抗原，并且其中HAV是失活的源自于HM-175病毒株。然而，现有的这些联合疫苗中所使用的甲型肝炎病毒抗原均为灭活的HAV病毒。
迄今尚未见使用活的减毒甲型肝炎疫苗病毒生产甲-乙型肝炎联合(佐剂)疫苗及其冻干制剂的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种甲-乙型肝炎联合疫苗组合物，包括活的减毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。
本发明的另一个目的是提供一种冷冻干燥形式的甲-乙型肝炎联合疫苗组合物，包括活的减毒甲型肝炎疫苗病毒、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和保护剂。
本发明的又一个目的是提供一种冷冻干燥形式的甲-乙型肝炎联合疫苗组合物的制备方法。
本发明的其他目的，见于本文对本发明的描述中。
本发明涉及甲型和乙型肝炎联合疫苗，特别是涉及含有活的甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白以及保护剂的冷冻干燥形式的甲-乙型肝炎联合疫苗组合物。本发明还进一步涉及生产所说的联合疫苗组合物的制备方法。
根据本发明，一种甲-乙型肝炎联合疫苗，含有活的减毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白。
用于本发明的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒，可以是已知的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒。例如，可以使用从自然感染的甲型肝炎病人的粪便中分离得到的并经过系列减毒传代终末稀释、“克隆”纯化或其他人工诱变方法而获得的减毒适宜的甲型肝炎疫苗株作为种子病毒，采用对甲型肝炎疫苗病毒敏感的细胞基质，例如已建立的人胚肺二倍体细胞作为细胞基质，按照中国专利92114998.0号中详细描述的方法，制备用于本发明的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒原液。
优选采用甲型肝炎减毒活疫苗L-A-1疫苗株所制备的疫苗原液。
用于本发明的乙型肝炎表面抗原蛋白，可以是已知的纯化乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。例如，可以利用构建和选择适当的表达系统，如在原核、真核或酵母宿主中表达乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。例如，可以从供血者的HBsAg阳性和乙型肝炎e抗原阴性血清中分离HBsAg基因，并将其克隆到适当的质粒载体如pBR322或其衍生物中，然后用所得到的重组载体转化适当的宿主细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和/或酵母，并在适于表达HBsAg蛋白的条件下培养重组CHO细胞和/或酵母菌，然后从重组细胞培养液和/或酵母菌中收获并纯化得到所需的HBsAg蛋白。
乙肝表面抗原的制备可以依据2000年版《中国生物制品规程》中《重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗制造及检定规程》制备。
或者，也可以使用密度梯度离心法或各种离子交换层析法，由HBsAg阳性病毒携带者的血清中，分离和纯化血源性乙型肝炎表面抗原蛋白。
根据本发明联合疫苗组合物的一个优选实施方案，其中所说的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒，是由自然感染的甲型肝炎病人粪便中分离得到的野毒型甲型肝炎病毒，经终末稀释“克隆”纯化并在适当的宿主细胞中传代减毒而得到的甲型肝炎L-A-1病毒株。
根据本发明疫苗组合物的一个优选实施方案，特征在于联合疫苗中所含的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒的病毒滴度不小于6.5LogCCID50/ml。
根据本发明疫苗组合物的一个优选实施方案，其中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是由重组CHO细胞和/或重组酵母表达并经纯化后而获得。
根据本发明疫苗组合物的一个优选实施方案，特征在于联合疫苗中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的蛋白含量不小于10μg/ml。
减毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白在联合疫苗中的优选比例范围为：6.5-7.0LogCCID50/ml比12-14μg/ml。
为了便于本发明联合疫苗制品的运输、储存和使用，减少这些过程中所谓“冷链”压力，保证疫苗接种效果，本发明人经过反复的实验摸索，成功地研制了一种冻干保护剂或稳定剂。这种冻干保护剂或稳定剂能够完全保证液态联合疫苗制品，在冷冻干燥过程中，以及冻干后的运输、储存和使用过程中，联合疫苗不会失活。
因此，根据本发明，一种冷冻干燥形式的甲-乙型肝炎联合疫苗，含有活的减毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白以及保护剂。
用于本发明联合疫苗的保护剂，包含海藻糖、谷氨酸、抗坏血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐。
右旋糖酐可以是高，中，低分子的右旋糖酐，如右旋糖酐70，40，20；优选低分子右旋糖酐，如右旋糖酐20。
冷冻干燥前，它们在联合疫苗组合物中的含量(W/V)分别是：海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗坏血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％，右旋糖酐1-6％。
根据本发明疫苗组合物的一个优选实施方案，其中保护剂基本上是由海藻糖、谷氨酸、抗坏血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐组成的。
本发明的甲-乙型肝炎联合疫苗以及其冷冻干燥制品中，还可以含有一种或多种用于提高其免疫原性但不引起任何副作用的佐剂。这些佐剂一般都是本领域技术人员所熟知的，其中包括但不只限于氢氧化铝或磷酸铝凝胶、3D-MPL(一种Th1细胞反应刺激剂)等(参见PharmaceuticalBiotechnology，Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvantapproch，Powell and Newman，Plenurn Press)。
本发明优选的免疫佐剂是氢氧化铝溶液。
根据本发明疫苗组合物的一个优选实施方案，其中还可含有适当量的免疫佐剂，例如，0.8-1.2mg/ml的氢氧化铝溶液。
根据本发明疫苗组合物的一个优选实施方案，其中该佐剂是由冻干甲乙型肝炎联合疫苗稀释液中所含有的0.8-1.2mg/ml的氢氧化铝溶液提供的。
根据本发明，一种冷冻干燥的甲-乙型肝炎联合疫苗的生产方法，该方法包括：
(1)分别提供并按适当的比例混合的含有减毒的甲型肝炎疫苗病毒原液和由重组CHO细胞和/或重组酵母表达，并经纯化的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的蛋白原液，得到甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒表面抗原的混合悬液；
(2)在步骤(1)中得到的混合悬液中加入适当量的保护剂并混匀之，得到所需的甲型肝炎和乙型肝炎联合疫苗组合物悬液；
(3)冷冻干燥步骤(2)中得到的含有保护剂的联合疫苗悬液。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中保护剂的成分及它们在联合疫苗组合物悬液中的浓度(W/V)是海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗坏血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％和右旋糖酐1-6％。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的方法进一步包括，冻干联合疫苗在使用前，用氢氧化铝溶液稀释步骤(3)得到的冻干联合疫苗组合物，使其中活的减毒甲型肝炎疫苗病毒的病毒滴度不低于6.5LogCCID50/ml，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的蛋白含量不低于10μg/ml，氢氧化铝的浓度含量为0.8-1.2mg/ml。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中佐剂是由冻干甲乙型肝炎联合疫苗稀释液中所含有的氢氧化铝溶液提供的。
本发明的联合疫苗组合物可有效地用于预防甲型肝炎和乙型肝炎。多种动物及猴体实验观察结果表明，本发明的联合疫苗组合物不仅具有与其单价疫苗同样良好的安全性，而且具有比其单价疫苗更佳的免疫原性。另一方面，由于本发明的联合疫苗组合物中含有可有效的保护甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表明抗原蛋白的生物活性的冻干保护剂，所以可将其制成冷冻干燥的联合疫苗制剂，并因此而免除了疫苗生产、运输、储存和使用过程中的“冷链”压力，从而可更有效的保证疫苗的接种效果。特别是，由于本发明的联合疫苗组合物中使用了已充分证明具有良好安全性及免疫原性的活的甲型肝炎疫苗病毒，所以大大降低了联合疫苗组合物的生产成本和市场价格，从而有利于其在包括中国在内的发展中国家的推广和普遍使用。
为了制备本发明联合疫苗冻干保护剂，例如，可以首先按所示浓度将下列成份溶解于37℃蒸馏水(1000ml)中：谷氨酸钠100.0g/L、抗坏血酸20.0g/L、尿素80.0g/L、山梨醇80.0g/L和肌醇80.0g/L，并用0.1NHCL调整PH值至7.0。经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组分A。然后称取海藻糖500.0g溶解于温度为37℃左右注射用水补至1000ml，经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组分B。最后再将低分子右旋糖苷300.0g溶解于温度约为37℃的注射用水补至1000ml，经116℃高压蒸汽灭菌40分钟后得到保护剂组分C。使用时可以在上述甲肝疫苗原液和乙肝疫苗原液的混合悬液中加入适当体积的保护剂组分A、B和C，使保护剂的各成份达到如上限定的浓度范围(参见实施例2)。
然而，本发明冻干联合疫苗组合物中，佐剂并不是在疫苗制备过程中加入的，而是作为冻干制品的溶解剂和稀释剂，于冻干联合疫苗临使用前加入的。对所加入的氢氧化铝佐剂的含量一般有所限制，其作为冻干制品的溶解剂和稀释剂加入后，能使联合疫苗中甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎表面抗原蛋白的免疫原性有所增强。一般说来，佐剂氢氧化铝在冻干甲-乙型肝炎联合疫苗中的含量范围约为0.8-1.2mg/ml。
可以通过简单的机械混合方法，制备本发明的甲型和乙型肝炎联合疫苗组合物。例如首先按照适当的体积比例(如大约20∶1(V/V))，将预制备的病毒滴度为大于7.0Log CCID50/ml的甲型肝炎疫苗原液与预制备的蛋白质浓度为大于100μg/ml的乙型肝炎病毒表面抗原原液混合，然后再加入适当量预制备的冻干保护剂并轻轻混合均匀。
然后，使用作为疫苗稀释液的199综合培养液稀释至联合疫苗中各组份所需含量或浓度，即得到悬液形式的联合疫苗组合物。
最后，可以使用常规冻干装置冷冻干燥分装好的上述混合悬液，其中所使用的冷冻干燥条件是：于-30℃至-55℃低温条件预冷冻3-7时，然后于-30℃至35℃条件下真空干燥8至16小时。冻干过程中，疫苗冻干混合物的共融温度低于-38℃。
与冻干前相比，冻干后甲型肝炎疫苗病毒滴度虽稍有下降，但下降幅度不大干约0.5LogCCID50/ml。如此得到的冻干疫苗制品可以在室温条件较长时间地保存至6个月，而几乎不影响其甲肝疫苗病毒的病毒滴度和乙肝病毒表面抗原的相对效力(使用重组CHO细胞表达的乙肝疫苗作为参比疫苗)。
在临床应用之前，可以使用含量为0.8-1.2mg/ml的氢氧化铝溶液，溶解并稀释如上得到的冻干联合疫苗，将本发明的联合疫苗制成悬液形式的制剂。氢氧化铝水溶液不仅可以作为冻干联合疫苗的溶解剂和稀释剂使用，而且还可为其提供具有免疫增强作用的佐剂。
大量的实验研究和包括恒河猴、红面猴在内的多种动物接种实验证实，本发明的联合疫苗作为一种新的药物组合物，可有效地用于预防甲型肝炎和乙型肝炎，既不会因两种病毒抗原的混合造成彼此干扰，亦不导致任何免疫反应抑制作用或其他的不良反应。安全性实验结果表明，接种本发明联合疫苗的所有灵长类动物(恒河猴或红面猴)于接种后0-12周均未出现血清转氨酶(ALT)升高.对动物的肝脏活体组织的病理学检查显示，所有被检动物均未见有肝组织的异常病理学改变(参见实施例3)。
实验数据还表明，与单独使用甲型肝炎减毒活疫苗和/或乙型肝炎疫苗相比，本发明的联合疫苗似乎提供了比其单价疫苗更好的免疫原性。另外，由于本发明的联合疫苗组合物中含有有效的保护剂或稳定剂成份，所以在疫苗的冻干过程中或冻干后的长时间储存、运输过程中，甲肝疫苗病毒滴度和乙肝疫苗相对效力均没有明显下降。
对预制备的联合疫苗两种疫苗中组份检定结果表明，其中甲型肝炎疫苗病毒滴度为不低于6.5LogCCID50/ml，而HBsAg抗原蛋白含量为不低于10μg/ml。
联合疫苗免疫原性实验结果显示，恒河猴或红面猴接种联合疫苗4周时，动物血清中抗HAV抗体的阳转率即达到80-100％。同时观察到，动物血清中抗HBsAg抗体的阳转率约为20％；8周时的抗HBsAg抗体的阳转率为40-80％；而接种12周后的抗HBsAg抗体的阳转率可达到80-100％，另外，进一步的比较实验显示，与接种单价疫苗相比，接种本发明的冻干甲-乙肝炎联合疫苗的灵长类动物(恒河猴或红脸猴)，具有与其接种单价疫苗同样良好的安全性和似乎更佳的免疫原性(参见实施例4-①)。
细胞免疫学实验证实，给BALB/C纯系小鼠接种本发明的联合疫苗组合物后，通过淋巴因子表面标记检测、自然杀伤(NK)细胞活性检测、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性检测、巨噬细胞吞噬功能检测疫及一些细胞因子(如：IFN-γ、IL-2、IL-18)检测的结果表明：动物产生了显著的细胞介导免疫反应，另外，进一步比较试验显示，与接种单价甲肝疫苗和乙肝疫苗比较，本发明的甲—乙型肝炎联合疫苗可产生更佳的细胞免疫介导反应(参见实施例4-②)。
进一步的联合疫苗储存稳定性实验结果表明，本发明的冻干联合疫苗于2-8℃和室温(25℃)下可分别储存18和5个月以上，甲型肝炎疫苗病毒滴度和乙型肝炎疫苗相对效力稳定(参见实施例5)。
下列实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的权利要求范围内。
实施例1：甲型肝炎疫苗病毒原液制备
首先使用加有10-15％小牛血清的基本培养基(MEM)(pH7.2-7.6)扩增培养人胚肺二倍体细胞。细胞形成致密的单层后弃去生长培养液，并以新鲜Earle氏液反复冲洗细胞后，接种按中国专利92114998.0号实施例1中所述方法制备的种子病毒液。34℃-36℃吸附3-4小时后，向培养物中补加细胞生长维持液(加有维生素C的乳白蛋白水解液)后于34℃-36℃下培养约4周，每周换液一次。培养后弃去维持液和残留的小牛血清，直接加入含低浓度盐(例如1-10mM NaCl)并且不含酚红的199综合培养液并继续培养(34℃-36℃)2至4天。然后收集细胞，经反复冻融和超声破碎细胞后离心收集上清即得到甲型肝炎疫苗病毒原液。
实施例2：冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的制备
将2.0L甲肝疫苗病毒的原液(L-A-1.毒株，病毒滴度为8.0LogCCID50/ml)与72ml由重组CHO细胞和/或重组酵母表达并经纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白原液(蛋白含量为1334μg/ml)混合，然后加入如下制备的保护剂原液：保护剂组分A550ml、保护剂组分B700ml和保护剂组分C450ml。
然后，再向如此得到的混合悬液中加入适当量作为病毒疫苗基质液的199综合培养液，使液态联合疫苗的总体积达到8000ml，使其中甲型肝炎疫苗病毒滴度不小于6.5Log CCID50/ml，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白含量不小于10μg/ml。如此稀释的结果也导致疫苗悬液中所加保护剂各组份的浓度(W/V)分别达到海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗坏血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％和右旋糖酐1-6％。
为了制备冻干保护剂原液，可以首先按所示浓度将下列成份溶解于蒸馏水(1000ml)中：谷氨酸钠100.0g/L、抗坏血酸20.0 g/L、尿素80.0g/L、山梨醇80.0g/L和肌醇80.0g/L，并用0.1N HCL调整PH值至7.0。经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组份A。然后称取海藻糖500.0g溶解于温度为37℃左右注射用水补至1000ml，经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组份B。最后再将300.0g右旋糖酐20溶解于温度约为37℃注射用水补至1000ml，经116℃高压蒸汽灭菌40分钟后得到保护剂组份C。
按照每安瓶(或西林瓶)1ml的体积分装上述联合疫苗悬液，然后将安瓶置于密闭的真空冷冻干燥器(FS150-SS20C型，Hull Co.，USA)内，按下述条件冷冻干燥：首先将疫苗悬液于大约-40℃下预冻4小时，然后逐渐升温至32℃真空干燥约15小时，从而得到所需的冷冻干燥的甲-乙型肝炎联合疫苗。
按照世界卫生组织(WHO)及国家药品监督管理局(SDA)有关联合疫苗及冻干制剂制检规程及质量标准要求，对本发明所提供的联合疫苗进行全面检定，其结果各项质量指标均达到或超过世界卫生组织(WHO)及国家药品监督管理局(SDA)所规定的制检规程要求。其中甲型肝炎疫苗病毒滴度为不低于6.5LogCCID50/ml，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白质含量为不低于10μg/ml。
实施例3：冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的安全性实验
选择抗-HAV抗体、抗-HBV抗体均阴性、ALT指标正常的健康红面猴或恒河猴35只(平均体重1.5-4.5Kg)，随机分为7组，每组5只动物。于实验开始之日，5个实验组的每只动物通过静脉途径注射不同批次的本发明冻干联合疫苗各1ml(甲肝病毒滴度为6.5-7.0LogCCID50/ml，乙型肝炎病毒表明抗原蛋白含量为10-12μg/ml，其相对效力为2.45-3.06)，两对照组的动物则分别接受同样剂量的减毒甲肝活病毒疫苗(冻干制剂)和重组CHO细胞表达的乙肝疫苗。
于疫苗接种后第0、4、8和12周采集被免疫动物的静脉血，分离血清并分别以常规生化检测法和酶联免疫吸附法检测动物的血清谷丙转氨酶(SGPT)或(ALT)水平，以及抗HAV和抗HBsAg抗体水平以及乙肝疫苗相对效力(被检疫苗的ED50与参比疫苗的ED50之比)。其中使用抗HAV检测试剂盒并以酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗HAV抗体；使用抗HSsAg试剂并以放射免疫法(RIA)检测抗HBsAg抗体。在采血的同时，通过肝穿刺采集被试动物的活体肝组织并进行肝组织病理学检查。结果如下列表1所示。
表1 甲-乙型肝炎联合疫苗接种猴体安全性试验
疫苗 甲肝病毒滴度 乙肝 血清SGPT异常(周) 肝组织病理异常(周)
批号 LogCCID50/ml 相对效力 0 2 4 8 12 0 4 8 12
980401 6.50 2.79 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
980402 6.67 2.58 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
980403 6.67 2.88 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
980501 6.67 3.06 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
980502 7.00 2.45 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
HA980501 6.67 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
HB980401 2.55 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
HA：冻干的甲肝减毒活病毒疫苗；HB：重组CHO细胞表达的乙肝疫苗
从表1所示结果可以看出，冻干甲-乙型肝炎联合疫苗及对照组疫苗接种猴体后，动物均未发生血清肝酶的异常升高。肝活体组织病理学检查也表明，所有试验动物均未见肝组织的异常病理学改变。表明冻干甲乙型肝炎联合疫苗具有与其单价疫苗同样良好的安全性。
实施例4：冻干甲-乙型肝炎联合疫苗免疫原性实验
①疫苗诱导的体液免疫反应
选择HAV抗体、HBV抗体均阴性、ALT指标正常的健康恒河猴35只(平均体重1.5-4.5Kg)，随机分为柒组，每组5只动物。于实验开始之日，5个实验组的每只动物通过静脉途径接受本发明的不同批次的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗各1ml(甲肝病毒滴度为6.5-7.0LogCCID50/ml，乙型肝炎病毒表明抗原蛋白含量为10-12μg/ml，其相对效力为2.45-3.06)，其余2个对照组的动物则分别接受同样剂量的减毒甲肝活病毒疫苗(冻干制剂)或重组CHO细胞表达的乙肝疫苗。
于疫苗接种后第0、4、8和12周采集被免疫动物的静脉血，分离血清并使用常规酶联免疫吸附法检测动物的血清抗HAV和抗HBsAg抗体水平，以及HAV-IgM抗体滴度(作为疫苗接种后的原发性感染指征)。结果如下列表2、3、4和5所示。
表2 冻干甲-乙型肝炎联合疫苗接种猴体免疫原性试验(一)
疫苗 甲肝病毒滴度 乙肝 试验 Anti-HAV阳性(W) HAV-IgM阳性(W)
批号 LogCCID50/ml 相对效力 动物数 0 2 4 8 0 2 4 8
980401 6.50 2.79 5 0/5 3/5 5/5 5/5 0/5 4/5 3/5 0/5
980402 6.67 2.58 5 0/5 5/5 5/5 5/5 0/5 5/5 3/5 0/5
980403 6.67 2.88 5 0/5 4/5 4/5 5/5 0/5 5/5 2/5 0/5
980501 6.67 3.06 5 0/5 2/5 5/5 5/5 0/5 4/5 3/5 1/5
980502 7.00 2.45 5 0/5 3/5 4/5 5/5 0/5 3/5 2/5 1/5
HA980501 6.67 5 0/5 3/5 5/5 5/5 0/5 4/5 2/5 0/5
HA：冻干的甲肝减毒活病毒疫苗
表3 冻干甲-乙型肝炎联合疫苗接种猴体免疫原性试验(二)
疫苗 甲肝病毒滴度 乙肝 试验 抗-HBS阳性(W)
批号 LogCCID50/ml 相对效力 动物数 0 4 8 12 16
980401 6.50 2.79 5 0/5 0/5 2/5 5/5 5/5
980402 6.67 2.58 5 0/5 1/5 3/5 4/5 4/5
980403 6.67 2.88 5 0/5 1/5 4/5 5/5 5/5
980501 6.67 3.06 5 0/5 1/5 3/5 5/5 5/5
980502 7.00 2.45 5 0/5 1/5 3/5 4/5 4/5
HB980401 2.55 5 0/5 1/5 3/5 4/5 4/5
HB：重组CHO细胞表达的乙肝疫苗
表4 冻干甲乙型肝炎联合疫苗接种猴体后甲肝抗体水平检测
- HAV滴度 乙肝 抗体水平(mIU/m1)
样品号 LogCCID50/ml 相对效力 动物号 (4W) (8W) (12W) (16W)
321 1409 11008 69136 12769
322 389 6422 80589 46978
980401 6.50 2.79 323 1215 4984 70055 74418
324 1586 6962 15958 10224
325 1451 6336 14725 44275
(X±SD) 1089.13±1.79 6891.30±1.34 39128.26±2.36 28913.57±2.40
436 1389 1447 71535 12438
437 472 1489 69572 41287
980402 6.67 2.58 438 1441 1375 80109 49078
439 1511 1491 15123 57325
440 1312 1583 12263 10115
(X±SD) 1133.71±1.64 1475.45±1.05 37477.78±2.53 27098.93±2.26
326 1309 1479 15416 11098
327 1538 1592 13817 12495
HA980501 6.67 328 415 1319 15958 49907
329 1375 1563 6751 58732
330 1319 1601 7059 43285
(X±SD) 1086.67±1.72 1506.96±1.08 11012.73±1.54 28123.6±2.23
HA980501为单价冻干甲肝减毒活疫苗
表5 冻干甲-乙型肝炎联合疫苗接种猴体后抗-HBs水平检测
HAV滴度 乙肝 乙肝抗-HBS滴度(mIU/ml)(周)
样品号 LogCCID50/ml 相对效力
动物号 8 12 16
321 0 652.45 286.68
322 341.73 3586.68 4931.91
980401 6.50 2.79 323 67.63 785.54 3346.65
324 158.45 2038.51 1307.63
325 0 1156.66 2037.75
(X±SD) 1340.23±2.02 1660.09±3.01
436 163.56 3143.86 2193.86
437 0 845.65 1198.73
980402 6.67 2.58 438 186.70 2104.45 3586.68
439 61.85 584.36 797.45
440 0 0 0
(X±SD) 1344.05±2.19 1656.08±1.94
331 98.75 3296.71 1758.70
332 65.56 585.75 1965.30
HB980401 2.55 333 152.41 2345.84 3346.15
334 0 714.58 652.68
335 0 0 0
(X±SD) 1340.44±2.36 1657.55±1.98
HB90401为重组CHO细胞表达的乙肝疫苗
由表2、3、4和5所示的结果可以看出，灵长类动物(恒河猴或红面猴)接种不同批次的本发明甲-乙型肝炎联合疫苗后，第4周时动物血清抗甲肝病毒抗体阳转率为80％-100％，并且于8周后均达到100％。接种联合疫苗4周后动物血清抗-HBs抗体的阳转率为20％；8周时为40-80％，并且于12周时达到80-100％。联合疫苗的抗体水平与其单价甲肝疫苗和乙肝疫苗相比，差异无显著意义(P＞0.05)。这些结果表明，本发明的联合疫苗与其单价甲肝、乙肝疫苗均具有同样良好的免疫原性。另外，动物在接种联合疫苗后，作为甲肝原发性感染指征的血清抗甲肝病毒IgM抗体也均于接种后的2-4周时转为阳性，并且于第8周后逐渐消失(表2)。
②疫苗诱导的细胞免疫反应
A试验动物选择
选自6-8周龄雌性BALB/C纯系小鼠40只(长春生研所动物中心提供)，随机分为四组，每组10只：设空白对照组、甲肝疫苗组、乙肝疫苗组、甲-乙型肝炎联合疫苗组。各实验组动物分别腹腔内注射0.5ml相应疫苗，空白对照组动物则以相同途径注射等体积的氢氧化铝(浓度为1.0mg/ml)的稀释液。
B淋巴细胞表面标记检测
接种后10天处死动物，无菌摘取各组动物的脾脏并分别制备单细胞悬液。然后将所得到的细胞悬液按每管1ml的体积分装于试管内。各管分别加入结合了异硫氰酸荧光素(FITC)的抗CD3、抗CD4和抗CD8单克隆抗体(各0.1ml)。然后使用流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)进行流式细胞光度检测。结果如下列表6所示，其中数值以各组动物的平均值±标准差表示。
表6 被免疫动物T淋巴细胞表面标记的检测
组别 CD 3+(％) CD4+(％) CD8+(％) CD4+/CD8+(％)
①对照组 35.44±6.47 16.19±3.62 8.90±0.03 1.81±0.04
②甲肝疫苗组 47.46±5.60 25.86±2.85 9.24±0.75 2.80±0.01
③乙肝疫苗组 47.23±4.25 26.91±0.41 9.56±0.21 2.81±0.03
④联合疫苗组 50.66±7.77 32.74±6.85 9.72±0.43 3.41±0.15
由表6所示的结果可以看出，各试验组动物的CD3+总体上均较对照组有明显增加(P＜0.05)。各试验组动物的CD4+也较对照组有明显升高，而且联合疫苗组动物的CD4+高于单价疫苗组(P＜0.05)。而且从中还可以看出，联合疫苗组动物CD4+/CD8+值显著高于单价疫苗组及空白对照组(P＜0.05)。这些结果表明，动物接种本发明的联合疫苗后，体内免疫细胞被活化的程度明显高于接种单价甲肝或乙肝疫苗的动物。
C天然杀伤(NK)细胞活性检测
接种后10天处死动物，无菌摘取各组动物的脾脏并分别制备单细胞悬液。然后将所得到的细胞悬液按每管1ml的体积分装于试管内。各管分别加入结合了PE(磷脂酰乙醇胺)的抗小鼠NK1.1单克隆抗体(各0.1ml)。然后使用流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)进行流式细胞光度检测。结果如下列表7中所示，其中数值以各组动物的平均值±标准差表示。
D淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞活性检测
向上述被免疫小鼠脾淋巴细胞悬液中加入终浓度为15μl/ml的白介素2(IL-2)，于37℃和5％CO2条件下保温72小时后即得到所需的淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。实验中以H3-TdR标记的K562细胞为靶细胞，并按照100∶1的效应细胞：靶细胞比例混合两种细胞。将混合的细胞悬液于37℃和5％CO2下保温8小时。然后，充分洗涤并离心收集细胞，使用γ计数器测定各组动物细胞的放射活性(cpm值)。结果如下列表7中所示，其中所有数值均以各组动物的平均值±标准差表示。
E腹腔巨噬细胞吞噬功能测定
实验前，对所有被免疫小鼠腹腔内注射2％糖原水溶液。24小时后腹腔注射5％鸡红细胞悬液各1ml。30分钟后处死动物，收集腹腔巨噬细胞并涂片。然后，将所得细胞涂片于37℃下孵育30分钟。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)充分洗细胞并风干后，对细胞进行姬姆萨染色，然后于光学显微镜下观察并计数已吞噬鸡红细胞的小鼠腹腔巨噬细胞数，计算吞噬百分率。结果如下列表7中所示，其中所有数值均以各组动物的平均值±标准差表示。
表7 被免疫动物的NK活性、LAK活性和Mφ吞噬细胞活性
组别 NK活性(％) LAK活性(％) Mφ吞噬细胞活性
①对照组 4.46±0.51 33.5±5.60 28.58±3.06
②甲肝疫苗组 11.80±0.71 64.10±6.38 50.62±2.67
③乙肝疫苗组 8.79±1.21 63.98±4.71 48.20±1.38
④联合疫苗组 12.20±1.69 66.60±7.42 56.64±19.13
由表7所示的结果可以看出，动物接种甲-乙型肝炎联合疫苗和其单价甲型肝炎及乙型肝炎疫苗免疫后其NK细胞、LAK细胞和Mφ吞噬细胞活性均有明显的改善，与对照组相比差异非常显著(p＜0.05)。其中相对于接种单价疫苗的动物，接种甲-乙型肝炎联合疫苗动物的腹腔巨噬细胞活性有显著提高(P＜0.05)。这些结果表明动物接种本发明的联合疫苗后，巨噬细胞的吞噬作用及其引起的抗原呈递明显高于接种单纯甲肝和乙肝疫苗的动物。
F细胞因子的定量检测。
使用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)方法定量检测编码细胞因子IFN-γ、IL-2及IL-18的DNA。同时从被免疫小鼠的脾细胞中提取RNA，然后用MMLV-RT(小鼠白血病病毒逆转录酶)将mRNA逆转录为cDNA，并使用适当的细胞因子引物以竞争性PCR方法扩增细胞因子特异性cDNA。最后用琼脂糖凝胶电泳法定量分析所得到的扩增产物。实验中分别使用β-acting作为对照样品。结果如下列表8-10所示。
表8 疫苗刺激机体产生IFN-γ的定量比较
| 对照组 甲肝疫苗组 乙肝疫苗组 联和疫苗组 |
| 对照样品 70.3 52.47 65.34 45.16实验样品 29.7 47.53 35.5 3 54.84 |
表8所示的结果表明，甲肝疫苗组与甲-乙肝联和疫苗组刺激机体产生IFN-γ的能力相近(P＞0.05)，但显著高于对照组和乙肝疫苗组(P＜0.05)。
表9 疫苗刺激机体产生IL-2的定量比较
| 对照组 甲肝疫苗组 乙肝疫苗组 联和疫苗组 |
| 对照样品 62.27 59.1 60.28 43.04实验样品 37.73 40.99 39.22 56.95 |
表9所示的结果表明，甲-乙型肝炎联和疫苗组刺激机体产生IL-2的能力明显优于甲肝疫苗组、乙肝疫苗组和对照组(P＜0.05)。由于IL-2主要作用是诱导T淋巴细胞增殖和分化，因此可以认为本发明的甲-乙型肝炎联和疫苗在诱导T淋巴细胞增殖和分化能力方面明显优于甲肝及乙肝单价疫苗(P＜0.05)。
表10 疫苗刺激机体产生IL-18的定量比较
| 对照组 甲肝疫苗组 乙肝疫苗组 联和疫苗组 |
| 对照样品 100 72.33 100 52.1实验样品 0 27.67 0 47.9 |
表10所示的结果表明，甲-乙型肝炎联和疫苗组刺激机体产生IL-18的能力明显优于甲肝疫苗组、乙肝疫苗组和对照组(P＜0.05)。由于IL-18的主要作用在于活化的巨噬细胞分泌产生并显著地增强NK细胞活性，因此可以认为本发明的甲-乙型肝炎联和疫苗在增强NK细胞活性方面明显优于单价的甲肝或乙肝疫苗(P＜0.05)。
实施例5：冻干的甲-乙型肝炎联合疫苗热稳定性实验
将联合疫苗于不同温度下保存不同时间，然后取样进行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力、残余水分含量等项检测，以评价本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的热稳定性。
将本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗于2-8℃的温度下避光保存，其间分别于9、12、15、21、24个月时取样进行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力、残余水分含量检测。其中使用重组CHO细胞表达的乙肝疫苗作为参比疫苗。结果如下列表11和12所示。
表11 甲-乙型肝炎联合疫苗2-8℃保存不同时间后的病毒滴度和乙肝相对效力测定
疫苗 甲肝病毒滴度(LogCCID50/ml)(月) 乙肝相对效力(月)
批号 0 9 12 15 18 21 24 0 9 12 15 18 24
980401 6.50 6.50 6.67 6.50 6.67 6.50 6.00 2.79 2.73 2.81 2.64 2.57 2.54
980402 6.67 6.50 6.67 6.50 6.50 6.67 6.33 2.58 2.49 2.51 2.41 2.34 2.32
980403 6.67 6.67 6.50 6.50 6.67 6.67 6.50 2.88 2.86 2.81 2.77 2.79 2.78
980501 6.67 6.67 6.67 6.67 6.50 6.50 6.33 3.06 3.08 2.98 2.87 2.81 2.82
980502 7.00 7.00 7.00 7.00 6.67 6.67 6.50 2.45 2.47 2.36 2.41 2.31 2.39
表12 甲-乙型肝炎联合疫苗2-8℃保存不同时间的残余水份含量测定
残余水份含量(％)(月)
疫苗批号 0 9 12 15 18 21 24
980401 2.23 2.30 2.29 2.37 2.41 2.44 2.90
980402 2.15 2.25 2.27 2.31 2.39 2.40 2.43
980403 2.30 2.30 2.29 2.33 2.32 2.89 2.39
980501 2.28 2.31 2.30 2.34 2.31 2.79 2.95
980502 2.26 2.28 2.28 2.31 2.29 2.42
将本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗于室温下避光保存6个月，分别于0、2、3、4、5和6月取样进行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力和残余水分含量检测。其中使用重组CHO细胞表达的乙肝疫苗作为参比疫苗。结果如下列表13和15中所示。
表13 甲-乙型肝炎联合疫苗室温保存的甲肝病毒滴度和乙肝相对效力测定
疫苗 甲肝病毒滴度(LogCCID50/ml)(月) 乙肝相对效力(月)
批号 0 2 3 4 5 6 0 2 3 4 5 6
980401 6.50 6.67 6.50 6.50 6.50 6.33 2.79 2.68 2.71 2.69 2.61 2.59
980402 6.67 6.50 6.67 6.50 6.50 6.00 2.58 2.60 2.54 2.50 2.41 2.38
980403 6.67 6.67 6.67 6.50 6.50 6.00 2.88 2.84 2.71 2.75 2.87 2.70
980501 6.67 6.67 6.67 6.50 6.50 6.33 3.06 3.08 3.10 2.98 2.89 2.78
980502 7.00 7.00 7.00 7.00 6.67 6.50 2.45 2.47 2.39 2.33 2.21 2.19
将本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗置于37℃保存，于第0、1、2、3、4和5周取样进行甲肝疫苗病毒滴度、乙肝疫苗效力及残余水分含量检测。其中使用重组CHO细胞表达的乙肝疫苗作为参比疫苗。结果如下列表14和15中所示。
表14 甲-乙型肝炎联合疫苗37℃保存的甲肝病毒滴度和乙肝相对效力测定
疫苗 甲肝病毒滴度(LogCCID50/ml)(周) 乙肝效力(ED50)(周)
批号 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
980401 6.50 6.50 6.33 6.50 6.00 6.00 2.79 2.76 2.71 2.60 2.68 2.59
980402 6.67 6.50 6.50 6.67 6.00 6.00 2.58 2.51 2.53 2.47 2.41 2.34
980403 6.67 6.67 6.50 6.50 6.33 5.67 2.88 2.84 2.77 2.69 2.58 2.50
980501 6.67 6.67 6.33 6.67 6.33 6.00 3.06 3.02 3.06 2.98 2.95 2.89
980502 7.00 7.00 6.50 6.67 6.50 6.00 2.45 2.48 2.41 2.39 2.30 2.21
表15 甲-乙型肝炎联合疫苗于室温和37℃保存不同时间后的残余水份含量测定
疫苗 初测 室温残余水份(％)(月) 37℃残余水份(％)(周)
批号 水份(％) 2 4 5 6 1 2 3 4
980401 2.23 2.25 2.30 2.34 2.89 2.24 2.26 2.30 2.37
980402 2.15 2.19 2.41 2.50 3.10 2.20 2.27 2.29 2.36
980403 2.30 2.29 2.34 2.41 2.78 2.30 2.31 2.35 2.39
980501 2.28 2.30 2.31 2.39 2.40 2.33 2.33 2.40 2.41
980502 2.26 2.27 2.29 2.38 2.39 2.29 2.30 2.38 2.40
由以上表6-15所示的数据可以看出，与甲肝或乙肝单价疫苗相比，本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗在室温、2℃-8℃、37℃条件下保存不同时间后，其甲肝疫苗病毒滴度和乙肝疫苗相对效力均没有明显下降，甚至其乙肝疫苗效力高于乙肝单价疫苗。另外。本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗在不同的温度下储存不同时间后，其残余水分含量虽有所升高，但并不影响本发明的冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的总体质量要求。
Claims (12)
1.一种甲型和乙型肝炎联合疫苗，包括活的减毒甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。
2.一种冻干甲型和乙型肝炎联合疫苗，包括活的减毒甲型肝炎疫苗病毒，乙型肝炎病毒表面抗原蛋白和保护剂。
3.根据权利要求1或2的甲-乙型肝炎联合疫苗，其中还含有适量免疫佐剂。
4.根据权利要求1或2的甲-乙型肝炎联合疫苗，其中所说的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒是甲型肝炎减毒活疫苗L-A-1疫苗株或其它减毒活疫苗株。
5.根据权利要求1或2的甲-乙型肝炎联合疫苗，其中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)蛋白系由重组CHO细胞和/或重组酵母表达并经纯化后获得的。
6.根据权利要求1或2的甲-乙型肝炎联合疫苗，特征在于所说的活的减毒甲型肝炎疫苗病毒滴度不低于6.5LogCCID50/ml。
7.根据权利要求1或2的甲-乙型肝炎联合疫苗，特征在于所说的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白的含量不低于10μg/ml。
8.根据权利要求2的甲-乙型肝炎联合疫苗，其中保护剂包含海藻糖、谷氨酸、抗坏血酸、尿素、山梨醇、肌醇和右旋糖酐。
9.根据权利要求2的甲-乙型肝炎联合疫苗，其中保护剂的成分及它们在联合疫苗组合物悬液中的浓度(W/V)是海藻糖3-10％、谷氨酸0.5-1.0％、抗坏血酸0.1-0.3％、尿素0.5-2.0％、山梨醇0.5-2.0％、肌醇0.5-1.0％和右旋糖酐1-6％。
10.根据权利要求2的甲-乙型肝炎联合疫苗，其中佐剂是由作为冻干甲-乙型肝炎联合疫苗之稀释液的含有0.8-1.2mg/ml氢氧化铝溶液提供的。
11.一种制备冻干甲-乙型肝炎联合疫苗的方法，该方法包括：
(1)分别提供并按适当的比例混合减毒的甲型肝炎疫苗病毒原液和由重组CHO细胞或重组酵母表达并经纯化的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白原液，得到甲型肝炎疫苗病毒和乙型肝炎病毒表面抗原的混合液。
(2)在步骤(1)中得到的混合液中加入适量的保护剂并混匀之，得到所需的甲型肝炎和乙型肝炎联合疫苗组合物悬液。
(3)冷冻干燥步骤(2)中得到的含有保护剂的联合疫苗悬液，得到冻干甲-乙型肝炎联合疫苗。
12.根据权利要求11的方法，其中步骤(3)所说的冷冻干燥步骤包括首先将所说的联合疫苗组合物于大约-30至-55℃低温条件下，预冷冻3-7小时，然后逐渐升温至35℃，真空干燥8至16小时。
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