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CN1482916A - 含有转化生长因子α的疫苗组合物 - Google Patents

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CN1482916A
CN1482916A CNA018214347A CN01821434A CN1482916A CN 1482916 A CN1482916 A CN 1482916A CN A018214347 A CNA018214347 A CN A018214347A CN 01821434 A CN01821434 A CN 01821434A CN 1482916 A CN1482916 A CN 1482916A
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R·佩雷斯罗德里格斯
G·M·冈萨雷斯马里内罗
A·奥瓦雷斯阿科斯塔
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T·梅南德斯麦迪纳
G·E·吉伦涅托
B·桑切斯拉米雷斯
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Centro de Immunologia Molecular
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Abstract

本发明涉及能够产生针对自身TGFα的特异性免疫应答的疫苗组合物，其包含TGFα及其任何衍生物作为活性成分，以及适宜的佐剂。所述疫苗制剂还可包括TGFα和其它生长因子如表皮生长因子(EGF)的组合，从而抑制其进展依赖于所述因子的肿瘤的增殖。使用所述组合物可控制表皮样癌的生长和增殖。

Description

含有转化生长因子α的疫苗组合物
技术领域
本发明涉及免疫学和人类医学领域，特别是一种能够引起对抗自身TGFα的免疫去势反应的疫苗制剂。该疫苗可以用于某些癌症和其它TGFα相关疾病的治疗。
现有技术
转化生长因子(TGFα)是一种50个氨基酸的多肽，最初分离自逆转录病毒转化细胞的条件培养基。开始它被认为是一种能够与表皮生长因子(EGF)竞争结合EGF-R的分子。然而，抗EGF抗体不能识别TGFα(Todaro等(1976)，Nature 264，26-31)。所以，这两种生长因子是两种免疫学不同的实体。
TGFα属于EGF家族。结构和功能相关的蛋白组成了这个家族。该家族的其他成员有EGF、双调蛋白(AR)、criptol(CR1)、肝素结合EGF、β动物纤维素、表皮调节素。另一方面痘病毒科包括了EGF相关蛋白。其中最具代表性的是牛痘病毒生长因子(VGF)。
所有这些分子结合并活化EGF-R，那就是为什么它们被视为这一受体的配体。这个系统在正常和肿瘤细胞的生长中发挥作用。EGF-R是一种170kD的糖蛋白，其基因已经被克隆并测序。该受体的胞内域伴有酪氨酸激酶蛋白活性。这些蛋白与v-erb-B癌基因产物具有结构同源性，这成为其与肿瘤转化过程关联的证据(Heldin C.H.(1984)，Cell 37，9-20.)
TGFα合成为160个氨基酸的跨膜前体形式(前TGFα)。成熟TGFα，50个氨基酸的可溶形式，是通过蛋白水解断裂释放的。人TGFα(hTGFα)显示出与人EGF(hEGF)具有43％的氨基酸序列同一性，与小鼠或大鼠TGFα有93％同一性。此外，它们的生物学效应不具有种特异性。
许多实验室的工作已证实了TGFα调节培养细胞增殖、迁移和分化的能力(Carpenter和Wahl.(1990)，Springer-Verlag，柏林，69-171页)。
TGFα是最广泛存在的EGF-R配体。它在胚胎发生时的正常组织和成年人的正常及肿瘤组织中表达。然而，在敲除TGFα的小鼠中并未观察到大的病理缺陷，并且这些小鼠可以生存并繁衍(Bruce Mann和同事(1993)，Cell，73，249-261)。
在肿瘤发生过程中，EGF-R活化的旁分泌和自分泌过程的失调节是由生长因子表达的上调或其受体高合成或突变造成的。
在上皮性肿瘤中测到了高水平的EGF-R。在许多情况下，该受体的过度表达预示着不良预后。
TGFα的诱导常见于肿瘤转化。事实上，许许多多的研究表明不同部位的上皮性肿瘤中该分子有过度表达，包括乳腺、肺、脑、肝、前列腺、膀胱、胃肠道、结肠、生殖(卵巢)和内分泌组织等。
尽管TGFα诱导肿瘤发生的机制尚未明确，已有一些报道将该生长因子的过度表达与肿瘤的分级、患者的生存和其它肿瘤标记物联系起来。此外，一些研究人员已经证实了它们与其它癌基因的关系，如肝癌中的c-myc。TGFα也是von Hippel-Lindau肿瘤抑制基因(VHL)的标靶(总结在Lee等，(1996)，Growth Factors and Cytokines inHealth and Disease，卷1B，277-318)。
尽管TGFα和EGF以相似的亲和力与同一受体结合，TGFα通常比EGF效力更强，并且在一些情况下，据述它的效应更强和/或更持久(Barrandon和Green(1987)，Cell，50，1131-1137)。据报道对于内化的TGFα/EGF-R复合物，TGFα和EGF-R优先重新循环回到细胞表面，而当EGF/EGF-R复合物内化至同一类型细胞中时，两种成分都被有效降解(Ebner和Derynck(1991)，Cell Regul.2，599-612)。这些结果表明每种生长因子生物活性的差异可能是由于细胞内运输机制不同造成的。
另一方面，TGFα是一种比EGF更强的血管生成因子(Schreiber等，(1986)，Science 232，1250-1253)。
至于在肿瘤中的表达，有证据表明某些上皮性肿瘤的细胞膜中存在EGF前体，但TGFα在上皮性肿瘤中有着最多的表达，并且与EGF相反，它是通过与EGF-R的自分泌环起作用的。另一方面，我们中心的结果显示在某些上皮性肿瘤的活检组织中有TGFα表达而没有EGF(乳腺异管癌、喉癌)，但其它肿瘤呈现的EGF多于TGFα(非小细胞肺癌(NSCLC))。这些结果表明生长因子在不同肿瘤细胞的肿瘤生物学中具有不同的影响。
这些年所累积的关于EGF-R/EGF-R配体系统和癌症之间关系的所有证据，使该系统成为癌症免疫治疗中极富吸引力的目标。
我们小组先前的结果证实了可发展一种基于EGF的疫苗用于癌症主动免疫治疗。事实上，已经获得了有关用偶联至载体蛋白的hEGF进行疫苗接种所产生的免疫原性和低毒性的临床前期和临床证据(González等(1996)，Vaccine Research 5(4)，233-243)。
临床前期研究显示用在佐剂中的hEGF免疫小鼠可以增加移植了Ehrlich腹水瘤(EAT)的小鼠的存活(González等(1996)，VaccineResearch 5(4)，233-243)。
制备了hEGF与P64K的融合蛋白。该蛋白含有在P64K的45/46氨基酸间插入的hEGF序列。该融合蛋白被用于免疫小鼠，引起抗hEGF的特异性体液免疫应答。所激发的免疫应答使负荷EAT的小鼠寿命延长(González和同事(1997)，Vaccine Research 6(2)，91-100)。
在两项针对NSCLC患者的临床试验中观察到，与历史对照组相比较，接种疫苗的患者的生存有增加趋势。具有抗hEGF高水平抗体反应的患者存活显著增加(González等(1998)，Annals of oncology9，1-5)。
通常接种EGF不会产生抗TGFα的特异性抗体应答。然而已经获得的证据是小鼠模型接种含TGFα的免疫原性制剂后，仅一些小鼠产生了低水平的抗EGF抗体。该抗体应答在一些情况下能够阻断EGF在体外与其受体的结合。然而所获得的抗EGF抗体的水平并不足以产生有效的EGF免疫去势反应并在抗肿瘤作用中发挥影响。
由于这些生长因子中的每一种在各肿瘤和/或原发瘤及其转移灶之间作用不同，一种联合EGF-R的两种主要配体TGFα和EGF的疫苗通常对上皮性肿瘤具有更好的抗肿瘤效应。
在本发明之前，尚未有任何治疗将含有hTGFα或任何衍生物，或其与EGF-R的其它配体EGF的组合的疫苗制剂用于癌症主动免疫治疗。
发明内容
本发明提供了一种疫苗组合物，它含有TGFα或其任何来源的任何衍生物，与载体蛋白遗传连接(融合蛋白)或通过化学方法偶联，它能够抑制上皮性肿瘤的生长而无不良副作用。这一作用是通过生长因子免疫去势机制实现的。本发明还要求保护一种含有hTGFα与hEGF或任何衍生物的组合以及载体蛋白的疫苗组合物。
该疫苗组合物可用于治疗依赖TGFα或TGFα/EGF的上皮性肿瘤，或与TGFα相关的任何其它疾病，如银屑病(Kapp等(1993)JDermatol Sci，Jun；5(3)：133-42)。
在TGFα的详细说明中，具有与原分子相同的免疫学特性和/或相似作用的任何TGFα衍生片段都包括在内。那些衍生物，包括但并不排除其它：氨基酸的原始置换、改变特定氨基酸以增加稳定性和/或活性、化学修饰等。
更为具体地说，本发明提供了一种能够引起自身TGFα免疫去势反应的疫苗组合物，它可以用于某些癌症和其它与TGFα相关的疾病的治疗。
另一方面本发明包括了由TGFα和EGF的组合构成的疫苗制剂的用途。该疫苗可用于治疗在其发病过程中依赖于这两种生长因子的肿瘤。
1-免疫原性制剂：
本发明使用的疫苗制剂所包含的hTGFα或者通过基因工程的方法与载体蛋白偶联(融合蛋白)，或者通过化学方法与之结合。这些免疫原性制剂的任何一种中所使用的hTGFα可以是重组的、合成的或来自天然来源。不同的蛋白可以用作载体。可用作载体蛋白的例子有：破伤风类毒素、KLH、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白及其它。疫苗制剂中hTGFα的最佳量波动在每剂5μg至1000μg之间。
另一方面使用了含有hTGFα与hEGF的组合的疫苗制剂(国家药品注册办公室，Office of National Registration of Medication，HEBERMIN Not 1266)。
在TGFα或EGF的详细说明中，具有与原分子相同的免疫学特性和/或相似作用的任何TGFα或EGF衍生片段都包括在内。那些衍生物包括但并不排除其它：氨基酸的原始置换、改变特定氨基酸以增加稳定性和/或活性、化学修饰，及其它。
A)通过基因工程方法获得融合蛋白TGFα-载体蛋白：
使用特定引物通过聚合酶链式反应(PCR)扩增编码hTGFα的基因(500bp)。将获得的DNA片段进行消化并在特定的位点克隆至含有编码载体蛋白的基因的表达载体中。获得的蛋白含有两种分子的一个或多个拷贝。可以使用哺乳动物细胞、细菌或酵母菌作为表达载体。该载体还可以在载体蛋白的N末端包括6个组氨酸。通过在琼脂糖凝胶上进行限制酶切分析、使用Sequenase2.0(Amersham-USB)进行DNA测序，以及最后使用抗hTGFα的特异性单克隆抗体(R&DSystem)通过蛋白质印迹技术对任意大肠杆菌表达株表达融合蛋白进行分析来证实所获得的质粒。为获得蛋白，使用强破坏法破坏细菌细胞壁，然后使用硫酸铵差异沉淀法和色谱法相结合纯化蛋白。最后，在无菌条件下过滤蛋白并保存于-20℃或冻干并保存于4℃直至随后使用。
B)获得含hTGFα的化学结合物：
获得含有与不同载体蛋白(如P64K)结合的hTGFα的不同制剂。可以使用任何化学结合法。优先使用的化学法是北美专利U.S.Pat，Not.4,302,386；Lee等，1981中所述的使用EMCS物质的方法。
或者，可以使用戊二醛结合方法。简而言之，将这两或三种在最终溶液中浓度为1mg/ml的分子与0.05％戊二醛(在总溶液中)混合。混合物于室温下温育1小时，然后用PBS 1×/10mM MgCl2溶液透析。最后，在4℃用PBS 1×透析过夜。在无菌条件下过滤该免疫原性制剂并保存于4℃直至使用。
C)获得将hTGFα和hEGF相结合的疫苗。
获得将EGF-R的两种主要配体相结合的疫苗可以通过不同方式进行：
1-在注射时按1∶1关系混合两种分别含有与载体蛋白相连的hTGFα或hEGF的疫苗。为此目的可以使用每种生长因子与载体蛋白的融合蛋白或化学结合物。疫苗制剂中hTGFα和hEGF的最佳量波动在每剂5μg至1000μg之间。
2-根据A部分所述获得一种相似的基因构建体，它含有两种生长因子hTGFα和hEGF，或它们任何衍生物的组合。
3-应用B部分所述的方法通过化学方法获得含hTGFα和hEGF或它们任何衍生物的组合与载体蛋白的化学结合物。
D)获得免疫原性制剂：
为获得该疫苗组合物理想的免疫原效应，可便利地使用合适的佐剂并选择给药途径以使疫苗制剂表现出高免疫原性。
本发明所述疫苗组合物是通过两种特定方式制备的：
1)使用Al(OH)3作为佐剂以获得水溶液，疫苗制剂吸附在该化合物上。为此目的在不同制剂中用相当于5μg到1000μg的TGFα结合到2到5mg的Al(OH)3上。振荡该制制1小时，最终的溶液置于4℃保存直至随后使用。
2)使用不完全弗氏佐剂，形成水/油或油/水乳状液。融合蛋白或化学结合物与佐剂在最终制剂中的量在40/60到60/40(体积/体积)的范围内。所用体积取决于期望获得的最终乳状液。在免疫接种前加入佐剂并将制剂于室温下振荡10到30分钟。
每种免疫原性制剂的最终体积覆盖了相应给药途径的适宜范围。
对于如C部分所述在注射时即刻制备联合疫苗的情况，如前所述将与适宜佐剂混合的两种疫苗通过振荡混合并注射或者分别注射。
可以通过多种途径施用疫苗组合物：肌肉内、皮下、鼻内和皮内。
实施例
实施例1：通过聚合酶链式反应(PCR)获得编码成熟TGFα的DNA片段。
使用PSK/TGFα载体(CIGB，古巴)作为模板通过PCR扩增编码hTGFα的基因。该质粒含有克隆至商品载体pBluescript KS-(Stragene)的EcoR V位点的hTGFα互补DNA(cDNA)。使用所述特异性引物扩增编码成熟TGFα(50个氨基酸长(图1))的序列：
N末端：5’-GC TCTAGAAGTGGTGTCCCATTTTAATGAC-3’
(下划线，XbaI限制酶切位点)
C末端：5’-CG GAATTCGCCAGGAGGTCCGCATGCTCAC-3’
(下划线，EcoRI限制酶切位点)
简而言之，在75μL的混合物中使用200ng的PSKTGFα，混合物含有：每种特异性引物各500ng，各200mM浓度的脱氧三磷酸核苷酸的混合物，25mM MgCl2和100单位溶于Promega提供的缓冲溶液中的Taq-聚合酶(Promega)，。执行30个循环的变性(94℃ 1分钟)、退火(60℃ 1分钟)和延伸(72℃ 30秒)。在第一个循环之前，将DNA变性4分钟；最后一个循环之后，再最后延伸2分钟。
PCR产物在低熔点(LGT)琼脂糖凝胶上电泳分离，并按照常规步骤用苯酚提取来纯化扩增的基因并用XbaI和EcoRI酶(NEB，USES)消化。按该方案制备的是编码成熟TGFα的基因片段。
实施例2：获得融合蛋白TGFα-P64K的表达载体。
使用表达载体pM 92(CIGB，古巴)。该质粒含有编码脑膜炎奈瑟氏球菌(B385株)的P64K蛋白的lpdA基因，其受大肠杆菌色氨酸操纵子启动子(ptrp)和噬菌体T4转录终止子(tT4)的控制。pM 92编码氨苄西林和卡那霉素抗生素耐药性。用pM 92转化Dam-大肠杆菌菌株(GC-366)并使用商品试剂盒(Quiagen)根据生产商的方案纯化该质粒。消化PM92载体并从LGT琼脂糖凝胶纯化。而后用T4连接酶(Gibco BRL)将PM92载体与之前制备的成熟hTGFα的cDNA相连接。所获质粒pMTGFα编码含有在P64K的45/46氨基酸间插入的hTGFα的融合蛋白。通过琼脂糖凝胶限制酶切分析、使用Sequenase2.0(Amersham-USB)进行DNA测序，以及最后使用hTGFα的特异性单克隆抗体(R&D System)通过蛋白质印迹技术分析大肠杆菌MM299株中融合蛋白表达，来证实该重组质粒。图2显示了表达载体pMTGFα获得过程的图解。该载体编码融合蛋白TGFα-P64K。
实施例3：获得N末端有6个组氨酸的融合蛋白TGFα-P64K的表达载体(pMHisTGFα)。
依照之前实施例所述的相同方案获得表达载体pMHisTGFα，起始载体为pM224，它包括了一个编码P64K N末端6个组氨酸的片段。由于与带有Cu2+或其它金属的螯合Sepharose结合增加，该6个组氨酸的标记在蛋白纯化过程中显现了优势。
实施例4：融合蛋白(TGFα-P64K)纯化。
表达融合蛋白TGFα-P64K的大肠杆菌(MM299株)在LBA培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨苄西林)中于37℃生长10小时。收集细胞后，所有的步骤在0-4℃下进行。在弗氏压碎器中于1500kg/cm2破裂细菌，并于11,000×g下高速离心30分钟以除去不溶部分。第一步纯化使用40％的硫酸铵沉淀以去除部分大肠杆菌蛋白。在4℃11,000×g下进一步离心30分钟以去除得到的沉淀。上清通过疏水作用层析法(TSK-butil，Pharmacia，瑞典)分部分离，使用在pH＝7.2、含0.15M NaCl的Tris-Cl缓冲液中从40％到0％递减的硫酸铵梯度。然后将所得样品通过经PBS 1×平衡的G200柱(Pharmacia)凝胶过滤而分离，使最终纯度大于95％。按照Lowry等(1951)J.Biol.Chem.191，495-498描述的比色法测定蛋白浓度。使用抗P64K和TGFα的特异性抗体，通过蛋白质印迹技术对融合蛋白进行表征。
实施例5：融合蛋白(HisTGFα-P64K)纯化。
表达融合蛋白TGFα-P64K的大肠杆菌(MM299株)在LBA培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和50mg/L氨苄西林)中于37℃生长10小时。收集细胞后，所有的步骤在0-4℃下进行。在弗氏压碎器中于1500kg/cm2下破裂细菌，并于11,000×g下高速离心30分钟以除去不溶部分。第一步纯化使用40％的硫酸铵沉淀以去除部分大肠杆菌蛋白。在4℃11,000×g进一步离心30分钟以去除得到的沉淀。由于蛋白中存在6个组氨酸，上清通过螯合亲和层析法(Chelating Sepharose Fast Flow，Pharmacia，瑞典)分部分离，使用在pH＝5.5、含0.5M NaCl的Tris-Cl缓冲液中从25mM到500mM递增的咪唑梯度。然后所得样品通过经PBS 1×平衡的凝胶过滤G25柱(Pharmacia)去除盐分，达到95％纯度水平。按照Lowry等(1951)J.Biol.Chem.191，495-498描述的比色法测定蛋白浓度。使用抗P64K和TGFα的特异性抗体，通过蛋白质印迹技术对融合蛋白进行表征。
实施例6：用hTGFα特异性单克隆抗体(Mab)识别重组蛋白TGFα-P64K。
使用蛋白质印迹技术确定在融合蛋白中的TGFα是否可以被抗hTGFαMab(Calbiochem)所识别。按传统步骤将25μg的EGF-P64K、TGFα-P64K或P64K在两个聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，然后转移到0.45μm硝酸纤维素膜上。转移后，将膜与含5％脱脂奶的TBS 1×封闭液一起于4℃温育过夜。使用TBS 1×-Tween 20(0.05％)简单冲洗后，将一张膜与抗P64K抗体(1/500)(图3A)，另一张膜与抗TGFαMab(1/100)(图3B)一起在室温下温育2小时。然后用同样的溶液洗3次，并将膜在同样条件下与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(1/1000)一起温育1小时。最后加入0.004g Fast Net酶底物(Sigma)，该底物在含0.1M Tris-Cl(pH＝8.2)、0.004g萘酚ACE-MX磷酸(Sigma)及400μL NN’二甲基甲酰胺的20mL缓冲液中。用相似的冲洗终止反应。观察到了抗hTGFαMab对TGFα-P64K的特异性识别(图3)。这一结果证明融合蛋白中的TGFα保持了能够被特异性抗体识别的结构。
实施例7：获得化学结合物hTGFα-P64K。
将1毫升在PBS/10mM MgCl2中浓度为2mg/mL的TGFα与1毫升在同样溶剂中浓度为2mg/mL的P64K相混合。然后加入0.2mL0.5％的戊二醛溶液使最终百分比为0.05％。混合物于室温温育1小时，然后用PBS 1×/10mM MgCl2溶液透析。最后，于4℃用PBS 1×透析过夜。在无菌条件下过滤该免疫原性制剂并在4℃保存直至使用。
实施例8：获得hTGFα、hEGF与P64K的融合蛋白。
使用质粒pBEF 10作为模板PCR扩增编码hEGF(150bp)的基因。该质粒含有克隆至商品载体pBluescript SKII(Stragene)的EcoR V位点的完整hEGF。用实施例2所述方法将获得的DNA连接到pMHisTGFα质粒位于P64K C末端的Bam HI位点。这样就获得了编码融合蛋白TE-P64K的pMTGFα-EGF载体。
实施例9：获得化学结合物hTGFα-hEGF-P64K。
将1毫升在PBS/10mM MgCl2中浓度为3mg/mL的TGFα与1毫升在同样溶剂中浓度为3mg/mL的hEGF和3mg/mL的P64K相混合。然后加入0.6mL 0.5％的戊二醛溶液使最终百分比为0.05％。混合物于室温温育1小时，然后用PBS 1×/10mM MgCl2溶液透析。最后，于4℃用PBS 1×透析过夜。在无菌条件下过滤该免疫原性制剂并在4℃保存直至使用。
实施例10：制备含hTGFα的制剂。
如本发明中详述的那样将实施例2、3、7、8和9中所述的不同免疫原性制剂与Al(OH)3或Montanide ISA 51相混合。所有制剂中hTGFα的用量等于50μg，在实施例8和9所述的联合疫苗中，hTGFα和hEGF的用量为50μg。每种融合蛋白或化学结合物制剂使用2毫克Al(OH)3，制剂分别含有50μg hTGFα或hEGF的相当物。
实施例11：制备含TGFα-P64K蛋白和EGF-P64K蛋白的联合疫苗。
在注射之前，将总体积为0.5mL在0.6mg重组体中的50μg每种生长因子与相同体积的Montanide ISA 51混合并在室温下振荡10分钟。
当使用Al(OH)3作为佐剂时，注射之前将在2mg Al(OH)3中含0.6mg每种蛋白的两种制剂相混合。
实施例12：制备含化学结合物TGFα/P64K和EGF/P64K的联合疫苗。
于室温下使用注射器将0.25mL含50μg如实施例7所述连接到P64K的hTGFα的免疫原性制剂与0.25mL含hEGF的相应免疫原性制剂相混合，并如实施例10所述与0.5mL的Montanide ISA 51混合10分钟。
当使用Al(OH)3作为佐剂时，将吸附于2mg Al(OH)3、分别含有50μg hTGFα或hEGF的前述化学结合物各0.5mL相混合。
实施例13：小鼠模型中TGFα-P64K/不完全弗氏佐剂(MontanideISA 51)的免疫原性。
为了证实疫苗的免疫原性，对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠皮下注射与Montanide ISA 51按1∶1混合的58mg(相当于5μgTGFα)、116mg(10μg)或0，6mg(50μg)TGFα-P64K。如本发明的详细描述制备免疫原并在免疫前振荡10分钟。每只动物接种4剂。在免疫前、一周后及此后每两周进行抽血。从所抽取的动物血中分离血清并采用间接ELISA技术测定抗hTGFα的特异性抗体滴度。
简而言之，用含2.5μg/mL hTGFα的pH＝7.2碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液按50μL/孔包被微滴ELISA板(COSTAR)，并在4℃温育过夜。用PBS 1×-Tween 20(0.05％)冲洗三次后，用PBS 1×-Tween20(0.05％)-SFT(5％)溶液在37℃封闭1小时。立刻加入被免疫小鼠的血清并于37℃温育2小时。冲洗后，将于PBS 1×-Tween20(0.05％)-SFT(5％)中1/1000稀释的碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Sigma)加入板中在相同温度下温育板1小时(50μL/pozo)。最后，在冲洗后，加入在pH＝9.8二乙醇胺缓冲液中终浓度为1mg/mL的酶底物(对硝基苯磷酸(Sigma))(50μL/孔)。在ELISA读板机中测量所形成的酶-底物复合物在405nm的吸光度。
图4显示了在用TGFα-P64K免疫的小鼠中获得的多价抗hTGFα抗体应答的动力学。
由于hTGFα与大鼠或小鼠相应因子之间的高度同源性(93％)，可以将此抗hTGFα的免疫应答视为抗自身TGFα(小鼠)的应答。
实施例14：小鼠模型中TGFα-P64K/Al(OH)3的免疫原性。
使用2mg Al(OH)3作为佐剂，按之前实施例所述实施免疫方案。按本发明的详细描述制备免疫原性制剂。对于TGFα获得的抗体滴度达1/10000。用于测定抗体滴度的技术是实施例13中所述的间接ELISA。
实施例15：小鼠模型中用TGFα-P64K蛋白/不完全弗氏佐剂(Montanide ISA 51)免疫的小鼠中的IgG亚群分布。
通过实施例13中所述的间接ELISA技术，使用1/1000稀释的与生物素(Jackson)偶联的抗不同IgG亚群的特异性抗血清，然后用链霉抗生物素蛋白-磷酸酶复合物(1/1000)，来测定IgG亚群分布。
测定每种IgG亚群相对于被免疫动物血清中的总IgG的比例。按照实施例13中所述的免疫程序通过皮下(组1)或肌内(组2)途径用含50μg TGFα的融合蛋白免疫动物。图5是所获得的亚群分布。研究所用的两组小鼠均获得更大比例的IgG1。
实施例16：通过放射受体测定技术(RRA)测定用TGFα-P64K蛋白/不完全弗氏佐剂(Montanide ISA 51)免疫的动物血清抑制I125-TGFα结合的能力。
为测定之前所述的免疫程序中所产生的抗体是否能够抑制TGFα与其受体结合，使用了一种称为RRA的体外技术。在合成中，如实施例13中所述获得的被免疫小鼠的血清与包含100mL人胎盘膜和20mLI125-TGFα(100000cpm)以及330mL缓冲液(pH＝7.4，10mM Tris-Cl，10mM MgCl2和1％BSA)的混合物一起温育。使用氯胺T方法(Hunter和Greenwood(1962)，Nature，358：495-498)将TGFα偶联至放射性同位素I125。混合物于室温下温育1小时并用1mL之前提到的缓冲液终止反应。最后将试管于1000rpm离心30分钟。洗涤沉淀并晾干。用γ发射计数器(Wallac，芬兰)检测放射性。放射性测量值的减少表明由于被测血清的作用，TGFα与其受体的结合被抑制。在所有被测血清中抑制百分比为50％-80％。
实施例17：测定通过用TGFα-P64K蛋白免疫而产生的抗人EGF(hEGF)体液应答。
使用所述的间接ELISA技术在显示高抗TGFα抗体滴度的小鼠血清中检测抗EGF抗体的存在。向包被有hEGF(CIGB)的板内加入1/100、1/1000和1/10000稀释的血清。图6显示了用TGFα-P64K蛋白免疫的小鼠血清中获得的抗EGF抗体滴度。仅在一组被免疫小鼠中获得了阳性抗EGF抗体应答。
然而用一种化学结合物EGF-P64K免疫的小鼠未显示任何水平的抗TGFα抗体。
实施例18：通过用TGFα-P64K蛋白/不完全弗氏佐剂(MontanideISA 51)免疫而获得的多克隆抗血清抗hTGFα在体外对人类肿瘤的识别。
将使用TGFα-P64K蛋白与Montanide ISA 51免疫小鼠获得的多克隆抗血清抗hTGFα用于检测包埋在石蜡中的肿瘤活检组织中的TGFα表达。这些活检组织获自接种了基于EGF的疫苗的患者。在一名有高抗hEGF抗体反应的患者身上，观察到了NSCLC肿瘤的消退。然而，后来检测到了喉部的第二肿瘤。分析这两个肿瘤的活检组织并观察到每一个肿瘤中EGF和TGFα的差异性表达。图7中显示的是不同抗体的反应性值。这些结果证实了用含TGFα-P64K的疫苗制剂进行免疫会产生能识别人体肿瘤中hTGFα的抗hTGFα特异性抗体这一事实。
实施例19：乳腺癌活检组织中EGF、TGFα和EGF-R的mRNA表达。
使用TRIZOL试剂(Life technologies)从乳腺癌肿瘤活检组织中分离信使核糖核酸(mRNA)并通过逆转录酶转换为cDNA。使用对于这些分子中每一种的特异性引物对总cDNA进行30个PCR循环。用一个管家基因(GAPDH)作为内对照。获得的PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳分离并用溴化乙锭来观察。
图8显示了在22个乳腺癌中使用对EGF、TGFα、EGF-R和GAPDH(内对照)的特异性引物获得的结果。只在1/22的活检组织中观察到了EGF mRNA，而在大多数样品中观察到TGFα和EGF-RmRNA的高表达。这两个分子表达之间的高度相关性提示TGFα/EGF-R自分泌环在这类肿瘤生长中的重要性(图9)。
附图简要说明
图1：成熟hTGFα的基因和氨基酸序列(黑体下划线字母)。
图2：表达载体pMTGFα获得过程图解。
图3：通过蛋白质印迹技术，抗P64K Mab(A)和抗hTGFαMab(B)对TGFα-P64K融合蛋白的识别。对P64K(1)、EGF-P64K(2)和TGFα-P64K(3)进行10％SDS-PAGE。然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜并与抗P64K(A)或TGFα(B)的特异性抗体一起温育，以表征TGFα与P64K的融合蛋白。
图4：抗hTGFα抗体反应动力学：通过间接ELISA技术测定抗hTGFα特异性抗体滴度。用与Montanide ISA 51混合的相当于5μg(A)、10μg(B)和50μg(C)hTGFα的TGFα-P64K蛋白免疫小鼠。x轴代表从每只小鼠收集样本的天数，y轴代表所达到的抗体滴度的倒数。免疫的天数在图A中用箭头指出(0、14、28和42天)。
图5：用相当于50μg TGFα的融合蛋白进行免疫诱导产生的IgG亚群分布。使用TGFα-P64K蛋白经皮下(1)或肌内(2)免疫所诱导的抗体反应中IgG亚群比例的比较。对每组5只免疫动物，图中显示标准偏差值。
图6：用TGFα-P64K融合蛋白免疫的小鼠中的抗EGF特异性抗体反应。图表中显示的是在用TGFα-P64K免疫的小鼠中达到的抗hTGFα和抗EGF抗体的滴度。
图7：通过对EGF疫苗II期临床试验中接受疫苗接种的患者肿瘤活检组织的免疫组化分析来测定EGF-R、EGF和TGFα的表达。这三种分子在肺原发肿瘤和后出现的喉部第二原发瘤中的差别活性，在图中用加号显示。
图8：EGF、hTGFα和EGF-R mRNA在22个乳腺癌中的表达。该图显示了用对每种分子特异性的引物获得并在1.5％的琼脂糖凝胶上分离后用溴化乙锭观察到的30个PCR循环的产物。GAPDH mRNA表达作为内对照，也可以看到。
图9：乳腺癌活检组织中hTGFα和EGF-R mRNA水平之间的关系：通过一个计算程序(ImagQuant，Amersham)分析用溴化乙锭获得的条带强度。x轴显示对于每个样品用对EGF-R特异性的引物获得的PCR产物的强度值与用GAPDH获得的强度值之间的关系(相对强度)，y轴是对hTGFα相同的相对强度值。在这两种分子的表达之间观察到了确实的相关性(R2＝0.657，P＝0.00121)。

Claims (14)

1.引发抗自身TGFα的特异性免疫应答的疫苗组合物，其中所述组合物包含自身TGFα或其任何衍生物作为活性成分以及合适的佐剂。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其包含人重组TGFα。
3.根据权利要求1和2的疫苗组合物，其包含单独的或与其它EGF-R配体相组合的自身TGFα作为活性成分。
4.根据权利要求1-3的疫苗组合物，其中作为活性成分的自身TGFα和EGF-R配体可任选通过化学结合或通过遗传方式偶联至载体蛋白。
5.根据权利要求4的疫苗组合物，其包含来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白作为载体蛋白。
6.根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFα和来自脑膜炎奈瑟菌的P64K蛋白之间的化学结合物作为活性成分。
7.根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFα和来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白之间的化学结合物作为活性成分，还包含EGF。
8.根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFα和来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白之间的重组融合蛋白作为活性成分。
9.根据权利要求5的疫苗组合物，其包含TGFα和来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白之间的重组融合蛋白作为活性成分，其中所述P64K蛋白的N末端有一个六个组氨酸的尾。
10.根据权利要求9的疫苗组合物，其包含TGFα、来自脑膜炎奈瑟氏球菌的P64K蛋白和EGF之间的重组融合蛋白作为活性成分。
11.根据权利要求1-10的疫苗组合物，其包含不完全弗氏佐剂作为佐剂。
12.根据权利要求1-10的疫苗组合物，其包含Al(OH)3作为佐剂。
13.治疗表达TGFα或任何EGF-R配体的上皮性来源肿瘤恶性疾病的方法，其中使用权利要求1-12中任何一项所述的疫苗组合物。
14.根据权利要求13的方法，用于治疗肿瘤，如肺、乳腺、前列腺、胃和卵巢的表皮样癌，其中使用权利要求1-12中任何一项所述的疫苗组合物。
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