CN1450857A - 精子的低温保存 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种低温保存精子的方法。该方法包括提供一种精子样品；将精子冷却到第一个温度；将精子样品保持在第一个温度下；将精子冷却到第二个温度；将精子样品保持在第二个温度下；和在第三个温度下贮存所述精子。这些方法可被用来低温保存哺乳动物，例如转基因哺乳动物的精子，以及被用来保存后来被用于人工授精或体外授精的精子。
Description
背景技术
通过转基因技术修饰动物基因组的技能已经为医学应用开创了新途径。目前通过农畜的乳腺来表达生物医药蛋白，使得以低成本生产大量的贵重治疗性蛋白成为可能(Houdebine(1995)Reprod.Nutr.Dev.35：609-617；Maga等(1995)生物技术(Bio/Technology)，13：1452-1457；Echelard(1996)Curr.Op.(Biotechnol.7：536-540；Young等(1997)生物药学(BioPharm)10：34-38)。尽管15种最好的生物药品在1996年的总销售额已经达到75亿美元，然而预计将来这一数值还要继续升高(医学进展报导(Med AdNews)16：30)。无论是由于对高单位剂量的需求，给药次数还是由于存在大量患者群体，都导致了对蛋白的大量需要，转基因技术对所述蛋白的生产是适用和有利的，对于利用传统细胞培养方法很难以商用量生产的复杂蛋白来说，转基因技术也是非常适用和有利的。另外，通过在转基因农畜的乳汁中生产人用药物解决了与微生物的生物反应器或动物细胞生物反应器有关的大量问题，与微生物的生物反应器有关的问题例如是缺少翻译后的修饰、错误折叠、纯化成本高，与动物细胞生物反应器有关的问题例如是资金成本高、培养基昂贵、产率低。
然而，起始转基因动物的造价非常高。具有遗传学价值的雄性动物经常意外死亡。这些意外死亡给物主造成巨大的经济损失，而且更重要的是，如果没有生产后代或没有进行精子的低温保存，而失去了动物的遗传基础。在一个转基因生产项目中，起始雄性动物的死亡对经济具有巨大的影响以至于可以破坏整个项目的进程。
通过人工授精和体外授精技术已经对许多物种的遗传物质进行了保存和传代。冷冻精子的过程由于对细胞的热休克、渗透压休克、和/或机械性休克、以及形成结晶可能会很苛刻，其中，所述休克和结晶的形成会破坏细胞的结构，特别是破坏质膜。另外，冷冻和解冻过程能够引起细胞脱水从而导致细胞的损伤。能够克服这些障碍的方法可用于多种目的的精子保存，例如用于医学、商业和农业目的的保存。
发明内容
本发明部分基于以下发现：通过以足以降低新陈代谢速率的低速度将精子样品冷却到第一个温度，然后在例如液氮中对所述样品进行保存前将精子样品在第二个温度下冷冻能够保存具有活力的精子。对这种配子进行低温保存以备以后使用。还发现将精子冷却到第一个温度后再加入甘油，能够使精子免受甘油的毒性作用。本发明在农业、医药、自然资源保护以及兽医和人类医学领域中具有广阔的应用前景。尤其是，所述方法有利于个体遗传组成的保存。
因此，一方面，本发明提供了一种提供精子的方法。该方法包括以足以降低精子新陈代谢速率的低速度将含有精子的样品冷却到第一个温度从而提供一种被冷却的精子样品，所述第一个温度足以使得精子免受所加甘油的毒性作用。该方法还包括加入一种含有甘油的溶液，然后将所述被冷却的精子样品冷冻到第二个温度并维持足以使甘油和精子达到平衡的一段时间从而提供一种被冷冻的精子样品，由此对精子进行保存。
在一个实施方案中，所述方法包括提供一种精液样品，例如得自于活体动物的精液。在另一个实施方案中，所述精子样品是例如在尸体剖检时，从附睾中获取的。所述方法还可以包括例如通过离心从所提供的样品中分离精子。在一个实施方案中，冷却前将精子样品保持在约27℃至约38℃之间，优选地保持在约37℃下。精子样品可以得自于哺乳动物，例如山羊、母牛、绵羊、兔、猪或小鼠，优选地是山羊或兔。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是转基因哺乳动物，例如一种含有编码多肽的转基因的哺乳动物。所述多肽可以是需要在转基因哺乳动物体内表达的任何蛋白质，这些蛋白质包括：α-1蛋白酶抑制剂、碱性磷酸酶、血管生成素、抗体、胞外过氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酸脱羧酶、人血清白蛋白、髓磷脂碱性蛋白、胰岛素原、可溶性CD4、乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、乳白蛋白、红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂、人生长因子、抗凝血酶III、胰岛素、催乳激素和α1-抗胰蛋白酶。所述转基因还可以包括启动子，例如乳特异性启动子。该乳特异性启动子可以是酪蛋白、乳清酸性蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白或乳铁蛋白启动子。
在一个实施方案中，所述方法包括在一种防冻剂缓冲液中冷却所述样品。在一个优选实施方案中，所述防冻剂缓冲液不含甘油。所述防冻剂缓冲液可以含有蛋黄，例如约10％至约30％的蛋黄，例如约15％至约25％的蛋黄，优选地20％的蛋黄。所述防冻剂缓冲液还可以含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素(lincospectin)和/或壮观霉素。
在一个实施方案中，第一个温度可以在约1℃至约10℃之间，优选地在约1℃至约8℃之间，更优选地在约5℃。在一个优选的实施方案中，以每分钟约0.2℃至约0.5℃的速率，优选地以每分钟约0.5℃的速率，将精子样品冷却到第一个温度。在另一个实施方案中，所述精子样品被冷却约1.5小时至约4小时，优选地冷却约1.5小时。在另一个实施方案中，精子样品在第一个温度下维持一段时间，例如维持约4小时至约21小时，优选地约4小时。
在另一个实施方案中，在所述含有甘油的溶液中，甘油浓度约为5％至10％，优选地为7％。所述溶液可以是在冷却步骤之前使用的还含有甘油的防冻剂缓冲液。防冻剂缓冲液可以含有蛋黄，例如约10％至约30％的蛋黄，例如约15％至约25％的蛋黄，优选地是约20％的蛋黄。所述防冻剂缓冲液还可含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素(lincospectin)和/或壮观霉素。
在一个优选的实施方案中，所述第二个温度可以是约-40℃至约-100℃，约-60℃至约-90℃，优选地约为-80℃。在另一个实施方案中，在第二个温度下将被冷冻的精子样品维持约7分钟至20分钟，优选地维持约10分钟至约18分钟，更优选地维持约15分钟。
在一个实施方案中，所述方法还包括将冷冻精子样品置于约-180℃至约-200℃，例如，约-196℃的第三个温度下，例如放置在液氨中。在进一步使用之前可以一直将精子样品保持在第三个温度下。在另一个实施方案中，从第三个温度开始升温以使被冷冻的精子样品解冻。优选地，所述样品在约27℃至约38℃下维持约1分钟至约5分钟，优选地维持约1.5分钟而被解冻。在一个实施方案中，解冻后的存活精子的百分率约为20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％。
本发明的另一方面提供了一种保存精子的方法。该方法包括：以足以降低精子新陈代谢速率的低速度将精子样品冷却到约2℃至约10℃的第一个温度来制备被冷却的精子；在约-60℃至约-90℃的第二个温度下冷冻所述被冷却的精子；以及在约-180℃至约-220℃，优选地在-196℃的温度下贮存所述被冷冻的精子。
在一个实施方案中，所述方法包括提供一种精液样品，例如获自于活体动物的精液。在另一个实施方案中，所述精子样品是例如在尸体剖检时，从附睾中获取的。所述方法还包括例如通过离心从所提供的样品中分离精子。在一个实施方案中，冷却前将精子样品保持在约27℃至约38℃之间，优选地保持在约37℃。精子样品可以获自于哺乳动物，例如山羊、母牛、绵羊、兔、猪或小鼠，优选地是山羊或兔。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物可以是转基因哺乳动物，例如一种含有编码多肽的转基因的哺乳动物。所述多肽可以是需要在转基因哺乳动物体内表达的任何蛋白质，这些蛋白质包括：α-1蛋白酶抑制剂、碱性磷酸酶、血管生成素、抗体、胞外过氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酸脱羧酶、人血清白蛋白、髓磷脂碱性蛋白、胰岛素原、可溶性CD4、乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、乳白蛋白、红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂、人生长因子、抗凝血酶III、胰岛素、催乳激素和α1-抗胰蛋白酶。所述转基因还可以包括启动子，例如乳特异性启动子。该乳特异性启动子可以是酪蛋白、乳清酸性蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白或乳铁蛋白启动子。
所述方法包括在一种防冻剂缓冲液中冷却所述样品。在一个优选实施方案中，所述防冻剂缓冲液含有甘油，例如含有约5％至10％的甘油，优选地含有约7％的甘油。在另一个实施方案中，所述防冻剂缓冲液不含甘油。所述防冻剂缓冲液可以含有蛋黄，例如约10％至约30％的蛋黄，例如约15％至约25％的蛋黄，优选地20％的蛋黄。所述防冻剂缓冲液还含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素和/或壮观霉素。
在一个实施方案中，将精子样品冷却到约1℃至约8℃，更优选地约5℃的第一个温度。在一个优选的实施方案中，以每分钟约0.2℃至约0.5℃的速率，优选地以每分钟约0.5℃的速率，将精子样品冷却到第一个温度。在另一个优选的实施方案中，所述精子样品被冷却约1.5小时至约4小时，优选地冷却约1.5小时。精子样品可以在第一个温度下维持一段时间，例如维持约4小时至约21小时，优选地约4小时。
在一个优选的实施方案中，如果在冷却前加入不含甘油的防冻剂缓冲液，可以向处于第一个温度下的冷却精子样品中加入第二种防冻剂缓冲液。所述第二种防冻剂缓冲液含有甘油，其中甘油浓度使得加入样品后，样品中的甘油浓度约为5％至10％，优选地约为7％。所述第二种防冻剂缓冲液可以含有蛋黄，例如含有约10％至约30％的蛋黄，例如含有约15％至25％的蛋黄，优选地含有20％的蛋黄。所述第二种防冻剂缓冲液还可以含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素和/或壮观霉素。
在一个实施方案中，在约-80℃的第二个温度下冷冻所述被冷却的精子样品。在另一个实施方案中，在第二个温度下将被冷冻的精子样品维持约7分钟至20分钟，优选地维持约10分钟至约18分钟，更优选地维持约15分钟。
在一个实施方案中，于约-180℃至约-200℃，例如，约-196℃的第三个温度下，例如，在液氮中贮存被冷冻的精子样品。在进一步使用之前可以一直将精子样品保持在第三个温度下。在另一个实施方案中，从第三个温度开始升温以使冷冻精子样品解冻。优选地，所述样品在约27℃至约38℃下维持约1分钟至约5分钟，优选地维持约1.5分钟而被解冻。在一个实施方案中，解冻后的存活精子的百分率约为20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％。
本发明的另一方面提供了一种提供精子的方法。所述方法包括：提供一种含有精子的样品；从该样品中分离精子；将分离的精子与第一种防冻剂缓冲液混合；以每分钟约0.2℃至0.5℃的速度，优选地以每分钟约0.5℃的速度将精子冷却到约2℃至约8℃，例如约5℃的第一个温度来制备冷却的精子；加入第二种防冻剂缓冲液；将被冷却的精子在第一个温度下保持约4小时至约21小时，优选地约4小时；在约-60℃至约-90℃的第二个温度下将所述被冷却的精子冷冻约10分钟至约15分钟，例如，约15分钟；并于约-180℃至约-220℃，优选地-196℃的第三个温度下，例如在液氮中贮存被冷冻的精子。在进一步使用之前可以一直将精子样品保持在第三个温度下。
在一个实施方案中，所述方法包括提供一种精液样品，例如获自于活体动物的精液。在另一个实施方案中，所述精子样品是例如在尸体剖检时，从附睾中获取的。所述方法还包括例如通过离心从所提供的样品中分离精子。在一个实施方案中，冷却前将精子样品保持在约27℃至约38℃之间，优选地保持在约37℃。精子样品可以得自于哺乳动物，例如山羊、母牛、绵羊、兔、猪或小鼠，优选地是山羊或兔。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物可以是转基因哺乳动物，例如一种含有编码多肽的转基因的哺乳动物。所述多肽可以是需要在转基因哺乳动物体内表达的任何蛋白质，这些蛋白质包括：α-1蛋白酶抑制剂、碱性磷酸酶、血管生成素、胞外过氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酸脱羧酶、人血清白蛋白、髓磷脂碱性蛋白、胰岛素原、可溶性CD4、乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、乳白蛋白、红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂、人生长因子、抗凝血酶III、胰岛素、催乳激素和α1-抗胰蛋白酶。所述转基因还可以包括启动子，例如乳特异性启动子。该乳特异性启动子可以是酪蛋白、乳清酸性蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白或乳铁蛋白启动子。
在一个优选的实施方案中，第一种防冻剂缓冲液中不含甘油。在一个优选的实施方案中，将待冷却的精子与一种含有蛋黄，例如约10％至约30％的蛋黄，例如约15％至25％的蛋黄，优选地20％的蛋黄的防冻剂缓冲液混合。所述防冻剂缓冲液还可以含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素和/或壮观霉素。
在一个优选的实施方案中，所述第二种防冻剂缓冲液含有甘油，例如含有约5％至10％的甘油，优选地含有7％的甘油。优选地，所述防冻剂缓冲液还含有蛋黄，例如含有约10％至约30％的蛋黄，例如含有约15％至25％的蛋黄，优选地含有20％的蛋黄。所述防冻剂缓冲液还可以含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素和/或壮观霉素。
在一个实施方案中，经过约1.5小时至约4小时，优选地经过1.5小时，所述精子样品被冷却到第一个温度。
在一个优选的实施方案中，所述被冷冻的精子样品在例如约27℃至约38℃下维持约1分钟至约5分钟，优选地维持约1.5分钟而被解冻。在一个实施方案中，解冻后的存活精子的百分率约为20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或100％。
本发明的另一方面提供了一种生产动物，例如哺乳动物的方法。该方法包括利用通过本文记载的任何方法提供的精子使卵母细胞受精。在一个实施方案中，在体内使卵母细胞受精。例如，将被解冻的精子植入子宫颈内或子宫内。在另一个实施方案中，在体外使卵母细胞受精。在一个优选的实施方案中，用于体外受精的卵母细胞可以在体外或体内进行发育。
在一个实施方案中，所述方法包括利用获自于哺乳动物的精子使卵母细胞受精。所述哺乳动物可以是山羊、母牛、绵羊、兔子、猪或鼠。优选地，所述哺乳动物是山羊或兔。在一个优选地实施方案中，所述哺乳动物是一种转基因哺乳动物，例如一种含有编码多肽的转基因的哺乳动物。所述多肽可以是需要在转基因哺乳动物体内表达的任何蛋白质，这些蛋白质包括：α-1蛋白酶抑制剂、碱性磷酸酶、血管生成素、胞外过氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酸脱羧酶、人血清白蛋白、髓磷脂碱性蛋白、胰岛素原、可溶性CD4、乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、乳白蛋白、红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂、人生长因子、抗凝血酶III、胰岛素、催乳激素和α1-抗胰蛋白酶。所述转基因还包括启动子，例如乳特异性启动子。该乳特异性启动子可以是酪蛋白、乳清酸性蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白或乳铁蛋白启动子。
本发明的另一方面提供了一种动物，例如一种由卵母细胞发育而成的动物，该卵母细胞通过利用本文记载的任何方法制备的精子进行了受精。
本发明的另一方面提供了一种经过本发明的任何方法处理过的被保存精子的样品。
本发明的另一方面提供了一种低温保存精子的试剂盒，该试剂盒包括一种防冻剂缓冲液。该试剂盒还包括保存精子的说明书。
在一个优选的实施方案中，所述防冻剂缓冲液可含有甘油，例如约5％至10％的甘油，优选地7％的甘油。在另一个实施方案中，所述防冻剂缓冲液可不含甘油。所述防冻剂缓冲液可含有蛋黄，例如约10％至约30％的蛋黄，例如约15％至25％的蛋黄，优选地20％的蛋黄。所述防冻剂缓冲液还可以含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素和/或壮观霉素。
在一个优选的实施方案中，所述说明书包括对本文记载的任何方法进行的详细说明。在另一个实施方案中，所述试剂盒还可包括无菌塑料吸管；一个放置吸管的架子。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包括用于测定精子存活力的染色剂，优选地带有该染色剂的使用说明书。
本发明的另一方面提供了一种用于生产动物，例如哺乳动物的试剂盒。所述试剂盒包括一种防冻剂缓冲液、通过本文记载的任何方法保存精子的说明书和利用保存的精子使卵母细胞受精的说明书。
在一个优选的实施方案中，所述防冻剂缓冲液可含有甘油，例如约5％至10％的甘油，优选地7％的甘油。在另一个优选的实施方案中，所述防冻剂缓冲液可不含甘油。所述防冻剂缓冲液可含有蛋黄，例如约10％至约30％的蛋黄，例如约15％至25％的蛋黄，优选地20％的蛋黄。所述防冻剂缓冲液还可以含有一种或多种下列物质：果糖，例如重量体积比浓度至少为约1％的果糖；柠檬酸，例如重量体积比浓度至少为约1.5％的柠檬酸；Tris缓冲液；抗生素化合物，例如泰乐菌素、庆大霉素、林肯壮观素和/或壮观霉素。
本明的另一方面提供了一种用于生产动物的试剂盒。所述试剂盒包括通过本文记载的方法保存的精子和利用保存的精子使卵母细胞受精的说明书。
在一个实施方案中，所述方法包括利用获自于哺乳动物的精子使卵母细胞受精。该哺乳动物可以是山羊、母牛、绵羊、兔、猪或鼠。优选地，该哺乳动物是山羊或兔。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是转基因哺乳动物，例如一种含有编码多肽的转基因的哺乳动物。所述多肽可以是需要在转基因哺乳动物体内表达的任何蛋白质，这些蛋白质包括：α-1蛋白酶抑制剂、碱性磷酸酶、血管生成素、胞外过氧化物歧化酶、纤维蛋白原、葡糖脑苷脂酶、谷氨酸脱羧酶、人血清白蛋白、髓磷脂碱性蛋白、胰岛素原、可溶性CD4、乳铁蛋白、乳球蛋白、溶菌酶、乳白蛋白、红细胞生成素、组织纤溶酶原激活剂、人生长因子、抗凝血酶III、胰岛素、催乳激素和α1-抗胰蛋白酶。所述转基因还可以包括启动子，例如乳特异性启动子。该乳特异性启动子可以是酪蛋白、乳清酸性蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白或乳铁蛋白启动子。
本文使用的术语“转基因序列”指的是一种通过一定手段插入到细胞中的核酸序列(例如，编码一种或多种人蛋白质)。所述转基因序列(在本文中也被称为转基因)成为动物基因组的一部分，该动物由这种细胞的整体或一部分发育而成。在本发明的一个实施方案中，所述转基因序列被整合到染色体基因组中。如果转基因序列被整合到基因组中，仅仅由于它的插入就能导致它所插入的基因组的核酸序列发生变化。转基因序列可以是部分或全部种异源性的，即，所述转基因序列或其部分可以来自与其中引入它的细胞不同的物种。转基因序列可以是部分或全部种同源性的，即，所述转基因序列或其部分可以来自与其中引入它的细胞相同的物种。如果转基因序列与其中引入它的细胞的内源基因是同源的(序列同源意义上的或种同源意义上的)，那么该转基因序列优选地具备下列一种或多种特征：它是为插入目的而设计的，或者它是以这样的方式被插入到细胞的基因组中的以致于改变了它所插入细胞的基因组的序列(例如，它所插入的位点不同于内源基因的位点或者它的插入导致内源基因的序列发生变化)；它包括突变，例如一种导致转基因序列发生错表达的突变；由于它的插入，会导致它所插入的基因的错表达，例如所述插入可导致它所插入的基因的剔除。转基因序列可含有一种或多种转录调节序列以及可能是所选核酸的表达达到所希望水平或模式所必需的任何其它的核酸序列，如内含子，所述序列均与所选核酸可操作性地连接在一起。所述转基因序列可含有一个增强子序列和/或引导分泌的序列。
本文所使用的“转基因细胞”指的是含有转基因的细胞。
本文所使用的“转基因动物”是一种非人动物，其中一个或多个，优选地基本上全部动物细胞异源性核酸，该异源性核酸是通过人工干预的方式引入的，所述人工干预方式例如是本技术领域中已知的转基因技术。可以通过引入细胞前体中通过成熟的遗传学操作方法，如微注射或通过利用重组病毒进行的感染，将所述转基因直接或间接地引入细胞中。
本文中所定义的哺乳动物是指除人以外的所有具有乳腺并能产乳的动物。
本文使用的“精液”是指含有精子的雄性动物的一次射出的精液。
本文使用的“附睾精子”是指通过手术切开睾丸的附睾而获取的精子。
本文使用的“防冻剂”是指一种能够降低在低于结冰温度的温度下进行的冷冻、解冻和/或贮存所产生的影响程度的试剂。防冻剂的实例包括例如甘油和乙二醇。
本文使用的“补充缓冲液”是指含有一种试剂的溶液，该试剂能够在温育、冷冻、贮存和/或解冻过程中使精子的存活力、游动性和/或致育性比没有补充缓冲液存在时精子的存活力、游动性和/或致育性有所提高。
“人工授精”被定义为通过手工注射或施用精子使雌性动物受精的过程。在该过程中，授精时不需要雄性动物在场，因为预先已经得到了精子。
活精子的百分率可以通过在同一样品中观测到的活精子数目与所观测到的总精子数目的比值来确定。所述百分率在本文中也被称为存活/死亡比率。
本发明提供了几点益处，包括保持和保存能育的雄性配子，该配子可获自于稀有和珍贵的遗传资源如濒危物种、转基因动物及个体。例如，本发明提供了例如来源于意外死亡或需要安乐死的雄性动物的精子的保存方法。该方法在保护还不能评定其对生物多样性的贡献作用的濒危物种方面具有价值。对于所讨论的物种的繁殖周期是有限的或者是季节性的情况，也需要对精子进行保存。本发明通常有利于随着时间的流逝具有恒定的遗传组成的动物能够延续和保留下来。
本发明还提供了几点与转基因动物有关的益处。转基因动物是一项巨大的商业投资，在某些情况下，创造一种转基因动物的难度非常大而且成本非常高。例如，由于转基因向基因组中的插入具有固有的随机性以及插入频率低，所以个别起始的转基因动物只能在部分细胞中含有转基因，例如它们是嵌合体。另外，它们能够在乳汁中以可变浓度表达转基因蛋白。因此，从高表达个体中选择精子并进行起始的保存为生产转基因动物而进行的初期投资提供了长期的保证，同时由于不需要进行子代的筛选和淘汰而节省了成本。
本发明的其它特征和优势可以通过下面的详细描述和权利要求而得到体现。本发明的详细描述
下文以及“实施例”部分对精子的低温保存方法进行详细的描述。
本发明提供了保存精子的方法，所述精子例如是来源于转基因动物的精子，该精子可被以后用来生产一种动物，例如一种转基因哺乳动物。所公开的方法可以包括以下几个步骤：获得含有精子的样品，测定精子的存活力，分离精子，低温冷冻所述精子样品，对受体动物进行人工授精或通过体外操作提供胚胎，包括对体内或体外成熟的卵母细胞进行体外受精。
还可以通过实施例对本发明进行进一步说明，所述实施例无论如何不应被理解为是对本发明的限制。因此本申请中所引用的全部参考文献的全部内容(包括参考文献、授权专利、专利申请公开文献和共同悬而未决专利申请)只是作为参考性质的。精子样品的获取
含有待保存的精子的样品可以通过几种方法来获得。本文所使用的术语“精子”是指成熟的雄性配子。本文交替使用术语“精子(sperm)”和“精子(spermatozoa)”。获得精子样品的方法可以包括获取雄性动物的精液或从附睾中提取精子。
可以通过利用一种人造阴道进行刺激来从动物中获得精液。例如可以按照以下方式使用人造阴道。
收集样品之前，将水浴温度平衡到37℃，并且将补充溶液也平衡到该温度，该补充溶液(Continental Plastics Corp.，Delavan，WI)含有7％的甘油、2.42％的Tris缓冲液、1.38％的柠檬酸、1％的果糖、抗生素(每100ml含5.5mg的泰乐菌素，27.5mg的庆大霉素、16.5mg林肯壮观素和33.0mg的壮观菌素)和20％(v/v)的蛋黄(不含特定的病原体，SPAFAS，Norwich CT)。将带有温度计的保温瓶装入35-39℃的水以便保存和转运新收集的样品。准备好人造阴道。优选地，在使用前将人造阴道的组成部件拆卸开并用热水和10％的Nolvasan溶液彻底清洗干净。然后将所有部件用RO/DI水冲洗并进行干燥。可以使用的人造阴道由一个硬橡胶外环结构和一个充气橡胶内衬组成，所述外环结构长约6-10英寸。该内衬中充入温水后再充入空气以使压力适当。将另一个一端带有渐缩的圆锥形开口的内衬放到人造阴道器械中。将适量的无菌妇科润滑剂涂到一端并将15ml的无菌圆锥形试管插入另一端。
对雄性动物进行体检以确保其健康状况良好。选择一个合适的试情对象。该试情对象可以是一个大约提前24小时灌注了外源性雌激素的切除了卵巢的雌性动物，一个在收集当天正在发情的试情对象或能够提供足够刺激的任何动物(即另一个雄性动物)。利用人造阴道和用于刺激雄性动物的雌性试情对象收集精液。立即将样品与被平衡的补充溶液(Continental Plastics Corp.，Delavan，WI)混合起来，该补充溶液含有7％的甘油、2.42％的Tris缓冲液、1.38％的柠檬酸、1％的果糖、抗生素(每100ml含5.5mg的泰乐菌素，27.5mg的庆大霉素、16.5mg林肯壮观素和33.0mg的壮观菌素)和20％(v/v)的蛋黄(不含特定的病原体，SPAFAS，Norwich CT)。将所述样品立即拿到实验室去进行分析和保存。
可以从动物的附睾中直接获得精子，例如附睾精子。该方法可以被用来从存活和死亡动物体中获得精子。用于从附睾中取出精子的方法在本技术领域中是已知，例如参见Sharma等(1997)FertilSteril. 68：626-631，而且也通过下面的实施例得到更详细的说明。精子存活率的测定
然后可以通过进行例如波浪运动分析、游动率测定和存活率计数来对所获得的精子样品进行分析从而确定精子的状况。
例如，通过在放大倍数低(10x)的镜头下观察波浪运动并将波浪运动划分为0-5个等级来对精液总体进行显微镜分析，0表示没有波浪运动而5表示导致漩涡形成的快速波浪运动。其次，在放大倍数高(40x)的镜头下，对游动的精子进行计数并以与精子总数的百分比来确定等级。再将该百分比乘以浓度/数目从而确定强活力的精子数目。优选地，所述样品的质量高到足以能够进行低温保存。例如，可以使用游动率至少约为40％的精子。精子的浓度可以由以下多种方法来测定：利用精子敏感性(Spermacue)光度计对装有精液的微量管进行测定，所述精液用0.9％盐水以1∶10的稀释度进行了稀释；或者制备一系列稀释度(1∶1000)的精子稀释液，然后利用血细胞计数器对其进行计数。
在滴加了15μl活体/死体染色剂(Morphology Stain，LaneManufacturing，Inc.，Denver CO)的显微镜载玻片上滴加15μl被稀释的精子样品。将这两滴混合后制得薄的涂片。所述样品风干后，活体染色剂染色在带有放大倍数为100的油浸镜头的显微镜下对200个精子进行计数。
最后，可以通过利用Spermac染色剂观察精子的顶体帽和精子尾部形态来分析精子的完整性。通过滴加15μl的精子来制备另一块显微镜载玻片，风干后按照厂商提供的使用说明书进行Spermac染色。通过将200个精子的顶体帽划分为完整的或非完整的以及对其正常尾部进行计数来确定样品的整体质量和形态。分离精子
可以从所提供的样品中选择性地分离精子。例如，通过向样品中加入补充缓冲液使体积达到10ml，然后以大约1500rpm(500-600xg)将样品离心15分钟或者直到使精子得到充分分离为止。倒掉上清液。然后用补充溶液稀释高质量的样品达到每只细管中所需精子的适当量。尽管通常使用0.5ml的细管，但是需要时也可以使用0.25ml的细管。所加补充溶液的量可以根据样品的不同而发生变化。可以对补充溶液的加入量进行调节从而确保每只细管中的具有活力的精子数达到1亿-1.5亿，优选地达到1.5亿。
可以使用两种类型的补充溶液。如果使用一步补充溶液，那么可以在该步骤中加入全部量的补充溶液。一步补充溶液含有甘油。如果使用两步补充溶液，可以在这时加入一部分补充溶液，例如约一半的补充溶液。两部分补充液中的第一部分，A部分不含甘油。第二部分，B部分含有甘油并且，优选地是在将精子冷却到第一个温度后才加入。A部分补充液可以含有：蛋黄、A部分缓冲液浓缩液和/或抗生素浓缩液。B部分补充液可以含有：蛋黄、B部分缓冲液浓缩液和/或抗生素浓缩液。
A部分补充溶液和B部分补充液可以，例如按照以下方式进行制备。使用之前，将抗生素和蛋黄都添加到A部分补充溶液和B部分补充溶液中。通过用氯己定溶液清洗鸡蛋并用纸巾将鸡蛋擦干来准备大量的鸡蛋。小心地敲开每只鸡蛋而不能碰破蛋黄囊。将蛋黄与带有蛋壳的蛋清分开从而从蛋黄中除去清蛋白。将蛋黄囊倒在平放在烧杯上的金属网上。蛋黄囊被刺破后，蛋黄通过金属网流入烧杯中。在每种补充溶液，A部分和B部分中将足量的蛋黄加工配制成20％(v/v)的蛋黄溶液。可以分别制备每一部分。对于A部分和B部分每一部分来说，将补充浓缩液倒入刻度量筒中，将蛋黄和抗生素加到补充溶液中，用无菌水使溶液达到500ml。优选地，以下列量加入浓缩液、蛋黄和抗生素。配制一升的A部分补充溶液需要加200ml的蛋黄、340ml的A部分浓缩液、20ml的重建抗生素溶液，然后加入无菌水使终体积达到1升。配制一升的B部分补充溶液需要加200ml的蛋黄、340ml的B部分浓缩液、2ml的重建抗生素溶液，然后加入无菌水使终体积大到1升。然后分别将45ml的等分补充溶液倒入50ml的无菌离心管中，可以将离心管做好标记，注明日期并冷冻贮存在-20℃下。低温保存精子
一旦用补充溶液将精液稀释到适当的稀释度，就做好了低温保存的准备。优选地，在进行低温保存之前一直将样品保存在约37℃的温度下。低温保存的过程如下所述：最初将一支含有被稀释精液的离心管放进一个装有约37℃水的烧杯中。将这套配置放进冰箱中。这种最初的冷却优选地是在不少于1.5小时内将样品冷却到5℃(+/-2℃)。在冷却过程中可以对样品进行混合，对温度进行监控以及对冷却速度进行测定。
如果使用两步补充溶液，B部分补充溶液可以在样品温度达到约5℃时加入。
冷冻前可以将样品在约0-5℃(+/-2℃)下保持至少约4小时且不超过约21小时。优选地，将所述样品在维持在5℃(+/-2℃)下的冰箱中贮存约4小时。
在这段平衡期之后，可以将样品转移到预冷却到约5℃(+/-2℃)的塑料管中。用塑料塞子将塑料管密封好或者进行热密封，然后将塑料管插到塑料管架上并置于冰床上，一直保持到完成所有操作。然后可以将塑料管架放置到-80℃的冷冻器中。优选地，所述塑料管在-80℃的冷冻器中保持约15-20分钟。即将被放进液氮之际，将塑料管放进预冷到-80℃的小桶和高脚杯中。
一旦被放进液氮中，就可以将塑料管贮存在氮气罐中。在低温保存3天至几天的时间段内，可以取出装有每种精子样品的一支塑料管进行分析。在37℃的水中对冷冻塑料管进行90秒钟的解冻。然后按照上文中所述的方法测定具有活力精子的百分率、顶体帽的完整性和尾部形态。对受体动物进行人工授精
在本发明的一个实施方案中，可以采用低温保存的精子对雌性受体动物进行受精。可以通过在耳朵中埋植6mg的诺孕美特(氟羟孕酮-B，Rhone-Meriuex，Athens GA)来诱导受体动物同步发情。埋植后的第13天，对所述动物单次非超排卵注射(400 I.U.)妊娠母马(mare)血清促性腺激素(PMSG，Calbiochem-Novabiochem Corp.，LaJolla CA)。受体雌性动物与切除输精管的雄性动物进行交配从而确保同步发情(Selgrath等，Theriogenology，1990.1195-1205页)。然后可以按照上述方法解冻精子并用被解冻的精子按照本技术领域的技术人员通用的方法使受体雌性动物受精。提供胚胎
在另一个实施方案中，可以从雌性动物体内收集卵母细胞用于与低温保存的精子进行体外受精。如上所述，可以采用耳朵埋植诺孕美特的方法来达到同步发情。在第7天单次注射前列腺素(PGF2α)(Upjohn，US)。在第12天开始连续4天每日两次给雌性动物施用FSH(促卵泡激素-V，Vetrepharm，Canada)。第14天取出诺孕美特耳朵埋植物。取出诺孕美特耳朵埋植物后的24小时，在48小时内使雌性动物与切除了输精管的雄性动物交配数次。在最后注射FSH后，给雌性动物单次注射GnRH(Rhone-Meriuex，Athens GA)。在最后一次交配后的约18至24小时内通过对腹中部进行的剖腹手术利用外科手段从雌性供体体内回收卵母细胞。利用预热到37℃的不含Ca++/Mg++的PBS(磷酸盐缓冲盐水)将卵母细胞从输卵管中冲洗出来。将回收到的卵母细胞在利用10％的FBS平衡的M199培养基中进行培养，该培养基中还添加了2mM L-谷氨酰胺、100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素。
然后可以按照本技术领域中通用的方法使回收的卵母细胞与已经解冻的精子进行结合。将精子解冻后利用90％-45％的Percoll梯度溶液进行纯化，然后在油镜下通过利用50μl添加了20％FBS、7.7mM乳酸钙、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的B-O培养基在5％CO2和38℃的环境中培养18小时来进行受精。体外培养是在添加了10％FBS的M199中进行的，该M199中含有初级山羊输卵管上皮细胞共培养物。可以在至少首次卵裂(2-细胞期)至胚泡期之前一直将胚胎保持在培养基中。优选地，在2或4-细胞期将所述胚胎转移。用于胚胎发育的各种培养基是本技术领域中已知的，同样用于将胚胎转移到受体中的方法也是本技术领域中已知的，例如参见Ebert等(1994)生物技术(Bio/Technology)12：699。
本发明通过下列实施例得到进一步的说明，但是所述实施例无论如何不应被理解为是对本发明的限制。实施例1
使用了三十二只由三个品种(Alpine，Saanen和Toggenburg)组成的年龄在13天至7年的公山羊。按照公共动物饲养和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)批准的方案以及按照动物福利法案(Animal Welfare Act)(AWA)中所规定的条款来对待这些动物。通过静脉注射过量的巴比土酸盐来对动物实施安乐死。在约5至约10分钟内从阴囊中取出睾丸，然后将这些睾丸放进38℃的保温箱中。睾丸是经过处理的个体。利用无菌解剖刀剥去被膜以使附睾的尾部露出来。沿着附睾尾部做一个小侧切口以便打开卷曲的小管。轻轻压迫尾部，从而产生几小滴精液。用吸管将这几滴精液转移到被平衡的补充溶液(Continental Plastic Corp.，Delavan WI)中，每100ml的该补充溶液由20％v/v的蛋黄(标准的-不含病原体，SPAFAS，Norwich，CT)、7％的甘油、2.42％的Tris缓冲液、1％的果糖、1.38％的柠檬酸、5.5mg的泰乐菌素、27.5mg的庆大霉素、16.5mg的林肯壮观素和33mg的壮观霉素组成。重复该过程一直到附睾尾部中的精子被全部取出。从两个睾丸中收集精子。从25只具有附睾精子的公山羊体内成功地收集到了附睾精子而且进行了低温保存。在年龄范围为4个月至7岁的公山羊中，产生精子的平均年龄是2.1岁。7只没有精子的公山羊的年龄全部在4个月。
15μl的样品被用来进行精子游动性和波浪运动的分析。根据精子的运动情况将每个样品划分为0-5等级(0＝没有运动，以及5＝快速线性运动)。通过将15μl的样品和15μl的形态学染色剂TM(动物生殖学协会(Society for Theriogenology，Hastings，NE)滴加到载玻片上并进行混合从而制备成薄层涂片来测定存活/死亡精子的百分比。在100倍的油浸镜头下对每个样品中的200个精子进行随机计数。以类似的方式利用Spermac染色剂(Minitube of America。Verona，WI)来测定顶体的完整性。在1.1×109至12.3×109的范围内，提取到的精子的平均数目为3.8×109±2.0×109。在63％至97％的范围内，附睾精子的平均存活/死亡比率为92％。在32％至93％的范围内，解冻后的平均存活/死亡比率为83％。另外，84％的样品在解冻后具有完整的顶体。参见表1中的数据。
表1.对从附睾中收集到的精子进行的游动性、存活/死亡比率和
精子数目分析山羊年龄 N＝ 精子游动性 ％存活率 解冻后的％ 精子总数
(月) 存活率 109/ml
4-6 1 5 92.0± 80.0± 1.3±
6-18 11 5 94.0± 87.0± 4.3±
18- 13 5 90.0± 79.0± 2.4±
4-84 25 5 92.0± 83.0± 3.7±
数据值被表示为平均值±标准偏差。
将合并的精液样品离心后用新鲜的平衡补充溶液再悬浮成每毫升溶液中的精子数达到300×106。将样品放进37℃的水浴中，冷藏，并以每分钟0.5℃的速度在1.5小时内将样品冷却到5℃。在该温度下将样品保持4至21小时。然后将精子样品装入0.5ml的细管中并将该细管在-80℃的冷冻器中放置约10至约15分钟，然后投入液氮中。低温贮存至少3天后，将一支细管在37℃下解冻2分钟，然后按照上文所述方法测定解冻后的存活/死亡百分比和顶体的完整性。通过尸体解剖从雌山羊(对于北半球来说已过发情期)的卵巢中抽吸出卵母细胞，在M199(GibeoBRL)中使所述卵母细胞在体外成熟18-24小时，所述M199中添加了10％的胎牛血清、5.0U/ml的FSH、5.0U/ml的LH、1μg/ml的β-雌二醇和青霉素-链霉素。将精子解冻后利用90％-45％的Percoll梯度溶液进行纯化，然后在油镜下通过利用50μl添加了20％FBS、7.7mM乳酸钙、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的B-O培养基在5％CO2和38℃的环境中培养18小时来进行受精。体外培养是在添加了10％FBS的M199中进行的，该M199中含有初级山羊输卵管上皮细胞共培养物。
将低温保存的附睾精子解冻后进行体外受精，结果有40％的卵母细胞发生了卵裂以及6％的卵母细胞发育到胚泡期(表2)。相比之下，利用一次射出的精液中的精子进行的体外受精导致37％的卵母细胞发生卵裂以及4％的卵母细胞发育到胚泡。
通过在第0天埋植孕酮(氟羟孕酮-B，Rhone Meriux，Athens GA)使用于人工授精的动物同步。在第7天，施用5mg的PGF2(Pharmacia & Upjohn)，然后在第14天施用300-400 IU IM的PMSG(Calbiochem-Novabiochem)。在第14天取出孕酮埋植物，在第15-16天与切除了输精管的公山羊进行育种。用切除了输精管的公山羊来检查雌山羊发情的迹象。发情持续约12小时后，采用一细管解冻的精子对雌山羊进行一次授精。所采用的技术可以是子宫颈内的植入也可以是子宫内的植入。对21只雌山羊进行人工授精。该过程每12小时重复一次，一直到雌山羊不再处于发情期。在第32天至第36天对雌山羊进行超声波检查，在第55天至第60天再次进行超声波检查。从第145天起对雌山羊进行监控。产出小山羊羔后，雌山羊正常产奶。对21只雌山羊进行人工授精，结果其中一只雌山羊受孕(4％)而产出一只健康的小山羊羔。
表2.利用解冻的精子对山羊卵母细胞进行体外受精的结果
| 精子样品 | N＝ | 卵母细胞数 | 卵裂的(％) | 桑葚胚(％) | 胚泡期(％) |
| 附睾中的 | 3 | 168 | 67/168(40％) | 32/168(19％) | 10/168(6％) |
| 一次射出的精液中的 | 3 | 169 | 63/169(37％) | 29/169(17％) | 6/169(4％) |
对来源于珍贵动物的附睾精子进行的成功低温保存使得动物发生意外死亡或需要实施安乐死时，其遗传物质仍能进行传递。这一过程甚至可能在死亡数小时后进行。在本研究过程中，取出了附睾精液的25只动物全部导致了低温保存的精子。这与有关提取其它动物物种的附睾精子的公开文献一致(Foote和Igboeli(1968)日志科学杂志(J Diary Sci)10：1703-5；Pauffle等(1968)生殖受精杂志(JReproduction Fertil)17：125-137)。
将附睾精子植入受控山羊体外胚胎生成系统中结果导致卵裂从而发育成胚泡。未将发育中的胚胎转移到受体中。用于人工授精的精子导致怀孕，这在其它物种也已有报道(Foote和Igboeli，见上文；Sharma等见上文)。
可能影响附睾精子数量和质量的若干因素可包括动物的年龄和季节。山羊属于季节性繁殖动物；因此处于非繁殖季节时，从附睾中取出的精子数量可能要比处于繁殖季节时取出的少。处于繁殖季节时能够收集到精子的最小年龄是4个月龄。一种降低能够提取到精子的年龄的可能途径是在繁殖季节使公山羊与发情期的雌山羊相处。这有助于刺激生殖系统并且通过环境因素的影响尽早地开始产生精子。
总之可以保质保量地对来源于尸体剖检山羊的附睾精子进行低温保存。这种精子可以被用于体外发育或人工授精从而进行有价值的遗传繁殖。诸如最佳繁殖季节和产生精子低龄化的因素可以产生有益的影响。通过提高从睾丸中获取精液的量，可以获得较高产率的精子。在优化利用附睾精子进行人工授精的同时还需要进一步对其理论展开研究工作。实施例2
利用人造阴道收集转基因公兔的精子。采用不含甘油的A部分补充溶液对样品进行稀释，然后将样品放进实验室中的温度约为37℃的保温瓶中。除了以下几点例外，按照实施例1中的方法来处理样品。每支细管中装入两千万个精子。将样品冷却到4℃后，加入含有甘油的B部分补充溶液。然后具体按照实施例1中所述的方式将样品冷冻到-80℃，将样品在液氮中贮存1个月。对四只荷兰兔施用激素促卵泡激素和人绒毛促性腺素使之同步。通过将精子样品放置在37℃的水浴中保持90秒钟来使其解冻。然后将样品用于对同步发情的雌性兔进行人工授精。经所述样品授精的两只母兔总共生出十一只子兔。
本文引用的所有专利和参考文献被全文引入作为参考。
其它实施方案被包含在所附的权利要求书中。
Claims (26)
1.一种提供精子的方法，该方法包括：
(a)以足以降低精子新陈代谢速率的低速度将含有精子的样品冷却到第一个温度从而提供一种被冷却的精子样品，所述第一个温度足以使得精子免受甘油的毒性作用；
(b)向被冷却的精子样品中加入一种含有甘油的溶液；和
(c)将所述被冷却的精子样品冷冻到第二个温度并维持足以使甘油和精子达到平衡的一段时间从而提供一种被冷冻的精子样品，由此对精子进行保存。
2.如权利要求1所述的方法，还包括：提供一种将要在不含甘油的防冻剂缓冲液中进行冷却的精子样品。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述防冻剂缓冲液含有约10％至约30％的蛋黄。
4.如权利要求1所述的方法，其中加入甘油溶液后的样品中的甘油浓度为约5％至约10％。
5.如权利要求1所述的方法，其中精子样品获自于哺乳动物。
6.如权利要求1所述的方法，其中第一个温度为约0℃至约10℃。
7.如权利要求1所述的方法，其中精子样品在第一个温度下保持约4小时至约21小时。
8.如权利要求1所述的方法，其中精子以每分钟约0.2℃至约0.5℃的速度被冷却到第一个温度。
9.如权利要求1所述的方法，其中精子经过约1.5至约4小时被冷却到第一个温度。
10.如权利要求1所述的方法，其中第二个温度为约-40℃至约-100℃。
11.如权利要求1所述的方法，其中精子样品在第二个温度下保持约7分钟至约20分钟。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括将被冷冻的精子样品贮存在约-190℃至约-200℃下。
13.一种保存精子的方法，该方法包括：
a)将精子与第一种防冻剂缓冲液进行混合；
b)以足以降低精子新陈代谢速率的低速度将所述精子冷却到约2℃至约10℃的第一个温度由此制备被冷却的精子；
c)在约-60℃至约-90℃的第二个温度下冷冻所述被冷却的精子；和
d)将被冷冻的精子贮存在液氮中。
14.如权利要求13所述的方法，其中第一种防冻剂缓冲液含有约5％至约10％的甘油。
15.如权利要求13所述的方法，其中第一种防冻剂缓冲液不含甘油。
16.如权利要求13所述的方法，其中精子样品获自于哺乳动物。
17.如权利要求13所述的方法，其中精子样品在第一个温度下保持约4小时至约21小时。
18.如权利要求13所述的方法，其中精子以每分钟约0.2℃至约0.5℃的速度被冷却到第一个温度。
19.如权利要求13所述的方法，其中精子经过约1.5至约4小时被冷却到第一个温度。
20.如权利要求15所述的方法，其中在精子被冷却到第一个温度之后而且被进一步冷却到第二个温度之前将第二种防冻剂缓冲液加到样品中。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第二种防冻剂缓冲液含有约5％至约10％的甘油。
22.如权利要求13所述的方法，其中第二个温度约为-80℃。
23.如权利要求13所述的方法，其中样品在第二个温度下保持约7分钟至约20分钟。
24.一种提供精子的方法，该方法包括：
a)提供一种含有精子的样品；
b)从样品中分离精子；
c)将所述被分离的精子与不含甘油的第一种防冻剂缓冲液进行混合；
d)以每分钟约0.2℃至约0.5℃的速度将所述精子冷却到约2℃至约8℃的第一个温度来制备被冷却的精子；
e)加入含有甘油的第二种防冻剂缓冲液；
f)将被冷却的精子在第一个温度下保持约4小时至约21小时
g)在约-60℃至约-90℃的第二个温度下将被冷却的精子冷冻约10分钟至约15分钟；
h)将被冷冻的精子在约-180℃至约-220℃的温度下贮存一段所需的时间；和
i)解冻所述精子由此提供精子。
25.如权利要求24所述的方法，其中精子在约37℃的水浴中解冻约90秒钟。
26.一种生产动物的方法，包括采用由权利要求1、13或24所述的方法保存的精子使卵母细胞受精。
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