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CN1445236A - 促进毛发生长的寡肽 - Google Patents

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CN1445236A
CN1445236A CN02150639A CN02150639A CN1445236A CN 1445236 A CN1445236 A CN 1445236A CN 02150639 A CN02150639 A CN 02150639A CN 02150639 A CN02150639 A CN 02150639A CN 1445236 A CN1445236 A CN 1445236A
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Abstract

本发明提供具有表皮形态发生促进活性，特别是毛发促进活性的寡肽。所述寡肽可以是单体形式、具有反应性物质束缚形式的单体或者聚合物形式如二聚物，包括同型二聚物、异型二聚物、同型三聚物或异型三聚物。本发明还提供特异性地识别上皮新毛囊的220kDa抗原、产生这样的抗体的杂交瘤细胞、以及用于在哺乳动物患者中评价毛发生长的方法和试剂盒。

Description

促进毛发生长的寡肽
相关申请的交叉参考
本申请要求2001年11月13日提交的日本申请2001-347340、2001年11月13日提交的日本申请2001-347338、2001年12月5日提交的日本申请2001-371175和2001年12月5日提交的日本申请2001-371366的优先权，所有这些申请在本文中全文引入作为参考。
技术领域
本发明涉及具有形态发生活性的寡肽。特别地，本发明提供包含具有毛发生长促进活性的寡肽的组合物，和用于促进人的毛发生长的方法。本发明还涉及对上皮新毛囊的抗原特异性的单克隆抗体，以及使用这样的单克隆抗体评价毛发生长促进活性的方法。
背景技术
已经提出，上皮组织的正常形态发生受起源于上皮组织周围存在的间叶细胞的因素控制。由于上皮组织的异常形态发生所产生的疾病主要由间叶细胞的异常性引起。所以，在理解间叶细胞控制上皮细胞的形态发生机理方面产生了兴趣。
在日本专利公报No.25295/94中公开的表皮形态发生素有277-289个氨基酸作为核心蛋白质，其通过其对上皮细胞的作用而具有促进上皮细胞形态发生的作用。已经发现当表皮形态发生素不起作用时，正常的组织形成不再进行。
表皮形态发生素已经在Hirai等人(1992，细胞(Cell)，69：471-481)、Hirai(1994，Eur.J.Biochem，225卷，1133-1139)、Hirai等人(1998，J.Cell Biol.，140：159-169)和Hirai等人(2001，J.Cell.Biol.，153：785-794)中描述。
EP 0698666 A2把全长的表皮形态发生素的结构描述为大致分四段，从N-端开始，卷曲螺旋域(1)、功能域(2)、卷绕螺旋域(3)和在C-端的疏水区。EP0698666A公开了功能域(在人表皮形态发生素中由第104-187个氨基酸指定的域)参与细胞粘结并且与表皮形态发生素的生理活性的表达相关。
1998年3月10日授权的美国专利No.5,726,298公开了人和鼠的表皮形态发生素核苷酸和氨基酸序列。WO98/22505和EP1008603A1描述了由人表皮形态发生素的第1-第103个氨基酸的N-端序列和由鼠表皮形态发生素的第1-第104个氨基酸的N-端序列指定的多肽。
天然哺乳动物表皮形态发生素在水性介质如盐水中几乎是不溶解的，这导致在用于人的治疗的组合物中使用表皮形态发生素是困难的。日本专利公报No.25295/1994公开了通过去掉C-端的疏水区获得的表皮形态发生素的修饰形式。
尽管在表皮形态发生素和上皮组织的形态发生的理解方面的进展，仍然需要修饰上皮组织形态发生的措施，特别是当其涉及与异常形态发生相关的疾病或失调时。
发明内容
本发明涉及用于治疗和改善与异常形态发生相关的疾病或失调的症状的寡肽。本发明的寡肽可以用于诱发形态发生、诱发再血管化效应、诱发再生效应、诱发心血管再生、和诱导内皮细胞生长。本发明的寡肽例如可以用于治疗和/或改善烧伤或创伤的症状，或者促进毛发生长，或者防止毛发减少。特别地，本发明涉及具有毛发促进活性的寡肽并涉及促进毛发生长的方法。本发明还涉及使用对上皮新毛囊的220kDa抗原特异性的单克隆抗体检测毛发生长的方法和包含本发明的单克隆抗体的试剂盒。
本发明提供具有毛发生长促进活性的长度在约5-约104个氨基酸残基的分离的寡肽，包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2不同，并且与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还提供具有毛发生长促进活性的长度在约5-约104个氨基酸残基之间的分离的寡肽，其包含以下氨基酸残基：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽不是SEQ ID NO：2，并且与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还涉及具有毛发生长促进活性的长度为约7-约100个氨基酸残基之间的分离的寡肽，其包含下列氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还涉及具有毛发生长促进活性的长度为约7-约100个氨基酸残基的分离的寡肽，其包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
在某些实例中，具有毛发生长促进活性的寡肽包含T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(SEQ ID NO：3)。
在某些实例中，本发明提供具有毛发生长促进活性的寡肽，其包含至少一个氨基酸序列，其中，在鼠的pep7区的氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的残基不是Cys，或者被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys。在其它实例中，本发明提供其中在由Glu-Gln-Ser-Cys-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的寡肽；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代的寡肽。
在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第五的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第五的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代的寡肽。本发明还提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第四的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第五的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys以外的1-3个氨基酸残基被取代的寡肽，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
在一些实例中，本发明提供具有毛发生长促进活性的寡肽，其包括至少一个氨基酸序列，其中在氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp(鼠的pep7区的突变种，其中，Cys在该区域的第五个氨基酸位置上)中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser。在其它实例中，本发明提供其中在由Glu-Gln-Cys-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的寡肽；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代的寡肽。本发明还提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代的寡肽。在一些实例中，本发明还提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第四的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代的寡肽，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
在其它实例中，本发明提供包含至少一个氨基酸序列的寡肽，其中在氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp(鼠的pep7区的突变种，其中，Cys在该区域的第四个氨基酸位置上)中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者其中被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser。在其它实例中，本发明提供其中在由Glu-Cys-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的寡肽；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者其中被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代的寡肽。本发明还提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代的寡肽。在另一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代的寡肽。
在另一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第五的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代的寡肽，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
在一些实例中，本发明提供其中在由Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp(鼠的pep7区的突变种，其中，Cys在该区的第三个氨基酸位置上)表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的寡肽，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者不是第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser。在其它实例中，本发明提供其中在由Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的寡肽；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代的寡肽。在另外的实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代的寡肽。在另一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代的寡肽。在另一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代的寡肽。在另一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第四的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第五的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第四的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代的寡肽。本发明还提供其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代的寡肽，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
在某些实例中，本发明提供其中在由Glu-Gln-Ser-Cys-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在由Glu-Gln-Cys-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的寡肽。在一些实例中，本发明提供其中在由Glu-Cys-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的寡肽。在其它实例中，本发明提供其中在由Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的寡肽。
本发明还提供包含约8-约20个氨基酸残基并且包含选自以下的氨基酸序列的寡肽：
Ser-Ile-Glu-Gln-Xaa-Ser-Asp-Gln；
Ser-Ile-Glu-Xaa-Gln-Ser-Asp-Gln；和
Ser-Ile-Xaa-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln，其中，Xaa是Cys，或活性物质束缚的Cys。
本发明还提供包含选自下列的氨基酸序列的寡肽：
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln；
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln；和
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln。
本发明还提供包含SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：124的任一个的氨基酸序列的寡肽。本发明还提供包含以下氨基酸序列的寡肽：Tyr AsnGlu Gln Ser Cys Asp Arg Glu Glu；Thr Ser Asp Gln Cys Cys AspPro Asp Lys；Pro Ser Glu Gln Ser Cys Ala Glu Glu Glu；Ser AsnGlu Gln Ser Cys Ala Val Ala Glu；Thr Thr Glu Gln Ser Cys AlaVal Asp Glu；Ser Ile Glu Gln Ser Cys Gly Gln His Glu；Ser SerAla Gln Ser Cys Leu Gln Asp Thr；Tyr Ile Glu Gln Tyr Cys AspGln Asp Glu；或Thr Ile Trp Gln Ser Cys Asp Gln Glu Glu。
本发明的寡肽包括包含天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基、或二者的混合物的寡肽。本发明的寡肽包括用交联剂修饰的寡肽。本发明还包括包含交联的至少两种本发明寡肽的寡肽聚合物，条件是该聚合物不是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的均聚物，并且条件是该聚合物不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。在一些实例中，所述聚合物是二聚物，包括同型二聚物以及异型二聚物。在其它实例中，所述聚合物是三聚物。本发明包括通过使至少两种本发明的寡肽交联制备的寡肽聚合物，条件是该聚合物不是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的均聚物，并且不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
本发明包括包含本发明的寡肽的组合物。在一些实例中，该组合物还包括药物上可接受的赋型剂。在其它实例中，该组合物包含提高经皮肤渗透或给药的试剂。
本发明还提供促进哺乳动物中毛发生长的方法，包括以促进所述哺乳动物中的毛发生长的有效量根据毛发生长的需要向哺乳动物施用包含本发明的寡肽的组合物。
本发明还提供单克隆抗体，或其片断，其特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原。在一些实例中，在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原是在成虫的生长期或者在胎儿的发育期过程中特异性地表达。在其它实例中，本发明提供用the Patent and Bio-Resource Center of National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology并且登记号为FERM P-18578沉积的杂交瘤细胞和由所述杂交瘤细胞制备的单克隆抗体。在其它实例中，本发明提供一种抗原或其片断，由用the Patent and Bio-Resource Centerof National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology并且登记号为FERM P-18578沉积的杂交瘤细胞制造的单克隆抗体识别。
本发明还提供一种由以下方法生产的杂交瘤细胞：即融合哺乳动物的免疫细胞和哺乳动物的骨髓瘤细胞，所述免疫细胞用含有从生长期的哺乳动物皮肤上收集的毛发和/或生长期的哺乳动物的须的毛囊中提取的蛋白质的免疫原免疫。本发明还提供一种生产对在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原特异性的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：培养用the Patent and Bio-Resource Center of NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology并且登记号为FERM P-18578沉积的杂交瘤细胞，收集由所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
本发明还提供评价毛发生长促进活性的方法，包括以下步骤：(1)在合适条件下存在被测物质时培养得自哺乳动物的皮肤组织，培养时间可以有效地促进毛发生长；(2)回收得自步骤(1)的皮肤组织；(3)使所述皮肤组织与用the Patent and Bio-Resource Center ofNational Institute of Advanced I ndustrial Science andTechnology并且登记号为FERM P-18578沉积的杂交瘤细胞制得的单克隆抗体或其片断反应；(4)检测与所述皮肤组织反应的所述单克隆抗体或其片断。
本发明还提供包含用tho Patent and Bio-Resource Center ofNational Institute of Advanced Industrial Science andTechnology并且登记号为FERM P-18578沉积的杂交瘤细胞制得的单克隆抗体的试剂盒。
附图简述
图1表示表皮形态发生素(EPM)pep7基基因文库的分析结果。突变率表示为取包含pep7区的鼠的表皮形态发生素的天然产生区域为100％的百分比。
图2表示表皮形态发生素(EPM)pep7基基因文库含量的分析结果。
图3表示在表皮形态发生素(EPM)pep7基基因文库中存在的理论值。
图4表示使用如实施例9-10所述的同型二聚物寡肽的毛发生长促进活性的分析结果。
图5表示使用如实施例9-10所述的异型二聚物寡肽和同型二聚物寡肽的毛发生长促进活性的分析结果。
图6A-6B表示本发明寡肽(由氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu代表)的毛发生长促进活性。图6(A)表示由生物素化的寡肽获得的结果。大方决表示由寡肽b7(b7是SIEQSCDQDB)获得的结果，小方块表示由对比试验(对比试验为空白试验)获得的结果。图6(B)表示由S-S桥接且生物素化的寡肽获得的结果。大固表示由寡肽ssb7(交联的b7)获得的结果，小圆表示由对比试验获得的结果。纵轴表示毛发生长得分，横轴表示施用开始的天数。
图7表示本发明的寡肽的毛发生长促进活性(S-S桥接且生物素化的寡肽：ss7)。在图中，■表示S-S桥接且生物素化的寡肽，□表示由第一对比试验(与图6中的对比试验相同)获得的结果， 表示第二对比试验(随机7-mer寡肽)的结果。纵轴表示毛发生长得分，横轴表示施用开始的天数。
图8表示b7ΔC1、b7ΔC2、b7ΔC3、b7ΔC4、b7ΔC5、b7ΔN1、b7ΔN2和b7ΔN3对IL-8诱导活性的评价结果。b7ΔC1是指寡肽序列(SIEQSCDQD)；b7ΔC2是指寡肽序列(SIEQSCDQ)；b7ΔC3是指寡肽序列(SIEQSCD)；b7ΔC4是指寡肽序列(SIEQSC)；b7ΔC5是指寡肽序列(SIEQS)；b7ΔN1是指寡肽序列(IEQSCDQDE)；b7ΔN2是指寡肽序列(EQSCDQDE)；b7ΔN3是指寡肽序列(QSCDQDE)。在图中，Scont表示阻断试剂的结果，PBS表示磷酸盐缓冲盐水的结果，纵轴表示IL-8分泌量的相对值。
图9表示通过把生物素结合到由氨基酸序列Lys-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu表示的寡肽的N端获得的寡肽bk7和寡肽b7(SIEQSCDQDE)对IL-8诱导活性的评价结果，如图17和18中所述。在图中，PBS表示磷酸盐缓冲盐水的结果，纵轴表示IL-8分泌量的相对值。
图10A-10C表示通过用如实施例12中所公开的凝胶渗析柱分析寡肽和交联剂的反应产物获得的结果。
图11表示如实施例13所公开的修饰和未修饰的寡肽的毛发生长促进活性的评价结果。用单字母编码的寡肽为SIEQSXDQDE，其中X是所表明的未修饰或修饰下的Cys或Lys。
图12A-12C表示使用在本发明中获得的单克隆抗体mAb27的免疫分析的结果。图12(A)表示用蛋白质印迹检测mAb27的抗原的结果。从左到右的每个电泳泳道表示分析结果，其中，从须的生长期和生长终止期阶段以及从背部皮肤的生长期和生长终止期提取的每种蛋白质经过电泳和蛋白质印迹，然后，使用单克隆抗体mAb27检测抗原。图12B表示使用成人毛发的组织染色的结果，图12C表示第14天的小鼠坯胎的上颌骨。
图13表示使用单克隆抗体mAb27评价寡肽的毛发生长促进活性的结果。
图14表示从氨基酸残基1到氨基酸残基103的人的表皮形态发生素卷绕螺旋域的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，如EP06986A2中所公开的。“pep7”区下面画了线。
图15表示从氨基酸残基1到氨基酸残基104的鼠的表皮形态发生素卷绕螺旋域的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，如EP0698666A2中所公开的。“pep7”区下面画了线。
具体实施方式
本发明涉及用于治疗或改善与异常形态发生相关的疾病或失调的症状。本发明的寡肽可以用来诱导形态发生、诱导再血管化效应、诱导再生效应、诱导心血管再生、和诱导内皮细胞生长。本发明的寡肽可以用于治疗和/或改善例如烧伤或创伤的症状，或者促进毛发生长或防止毛发减少。特别地，本发明涉及具有毛发生长促进活性的寡肽以及促进毛发生长的方法。本发明还提供抗体，包括多克隆抗体、单克隆抗体和其片断，其特异性地结合本发明的寡肽，用于检测、定量、分离或提纯所述寡肽。
本发明还提供对上皮新毛囊的220kDa抗原特异性的单克隆抗体，以及使用这样的单克隆抗体测试毛发生长的方法。本发明包括对上皮新毛囊的220kDa抗原特异性的单克隆抗体，其由the Patent andBio-Resource Center of National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology并且登记号为FERM P-18578(Ferm BP-8121)沉积的杂交瘤细胞产生。
本发明部分基于以下观察结果：本发明的寡肽以单体，即单一的寡肽形式，特别是以能够在适合于二聚的条件下二聚的单体形式，以具有反应性物质束缚的单体形式，和以聚合物如二聚物，包括同型二聚物和异型二聚物，以及三聚物的形式，具有毛发生长促进活性。通过本文在实施例7中公开的测试并借助本领域技术人员已知的知识可以测定毛发生长促进活性。
除非另外说明，本发明的实施可以采用分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，这是在本领域技术人员知识范围内。在文献中充分解释了这样的技术，例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)、Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)、Animal CellCulture(R.I.Freshney编，1987)、Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)、Handbook of Experimental Immunology(D.M.Wei&C.C.Blackwell编)、Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos编，1987)、CurrentProtocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等编，1987和年度更新)、PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等编，1994)、Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991和年度更新)。表皮形态发生素序列
人和鼠的表皮形态发生素氨基酸序列公开于美国专利5,726,298中。美国专利5,726,298还公开了人和鼠的表皮形态发生素的同种型。人的表皮形态发生素pep7氨基酸区域在美国专利5,726,298的SEQ ID NOS：3-5的氨基酸位点94处开始，并具有以下序列：Ala-Ile-Glu-Gln-Ser-Phe-Asp(SEQ ID NO：137)并在本文中表示在图14中。鼠的表皮形态发生素pep7氨基酸区始于美国专利5,726,298的SEQ ID NOS：9-11的氨基酸位点9 5并具有以下序列：Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp(SEQ ID NO：138)并在本文中表示在图15中。在鼠的pep7区中，人的pep7的第一的Ala被Ser取代，人的pep7区第六的Phe被Cys取代。
在人和鼠的表皮形态发生素的蛋白质中，pep7区位于各自的表皮形态发生素的卷绕螺旋域中，即使在人的表皮形态发生素pep7区域内没有Cys，多肽链也通过所述卷绕螺旋域通向用于形成二聚物的其它多肽链。本发明部分基于以下观察结果：包括用Cys取代一些氨基酸残基的人的表皮形态发生素pep7区Ala-Ile-Glu-Gln-Ser-Phe-Asp的突变证明了在本文实施例7中公开的小鼠模型中诱发新毛发毛囊的形态发生的能力。本发明还基于以下观察结果：包含在位点6的Cys的pep7区突变株在小鼠模型中有活性，其中该突变株在允许二聚的条件下具有与包含Cys的其它pep7区二聚的能力，而用Phe取代Cys(即没有Cys)的pep7区突变株在本文的实施例中公开的小鼠模型中没有活性。
基于以下事实：即人和鼠的pep7氨基酸区是高度保守的并且包含Cys的人的pep7区的突变在本文实施例7公开的小鼠模型中证明了活性，可以预测，本文公开的寡肽将在人体中诱发毛发生长和/或防止毛发减少。单体形式的寡肽和具有反应性物质束缚的单体表现出毛发促进活性。根据在本文实施例7中公开的测试测定，二聚体形式的寡肽表现出最高的活性。寡肽
包括在本发明范围内的寡肽基于在EP0698666A2(又见本文图14和15)和美国专利5,726,298中公开的人或鼠的表皮形态发生素pep7氨基酸区。基因编码的人的表皮形态发生素及其同种型在美国专利5,726,298中公开为SEQ ID NO：6、7和8。基因编码的鼠的表皮形态发生素及其同种型在美国专利5,726298中公开为SEQ ID NO：12、13和14。
在一些实例中，寡肽包括在人或鼠的pep7区中或其周围的突变，即突变发生在该7个氨基酸pep7区内并且还可以发生在相对于人或鼠的表皮形态发生素的pep7区的N-端方向和/或C-端方向上的1-4个氨基酸内。本文所用的“突变”包括但不限于氨基酸取代和/或缺失和/或插入和/或加成。本发明的寡肽包括长度为约5-约104个的氨基酸残基，并且在一些实例中具有如本文以SEQ ID NO：3-124公开的氨基酸序列，条件是所述寡肽不同于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2且不同于寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys，并且保持至少一种生物活性。在一些实例中，只要寡肽保持至少一种生物活性，该寡肽由pep7区突变组成。在其它实例中，只要寡肽保持至少一种生物活性，该寡肽包含pep7区突变，特别是如本文以SEQ ID NO：3-124公开的。本发明包括包含如本文所公开的，特别是如本文以SEQ ID NO：3-124所公开的pep7区的寡肽，并且在一些实例中，在寡肽中的pep7区突变的N-端方向和/或C-端方向上的氨基酸残基是在人或鼠的表皮形态发生素pep7区的N-端方向和/或C-端方向上的天然产生的氨基酸序列并且可以具有最高达人和鼠的表皮形态发生素或其任何同种型的全长的长度并包含人和鼠的表皮形态发生素或其任何同种型的全长，只要该寡肽保持至少一种生物活性，条件是该寡肽不同于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2且不同于寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys。
本发明包括包含如本文所公开的，特别是如本文以SEQ IDNO：3-124公开的pep7区突变的寡肽，并且在一些实例中，在寡肽中的pep7区突变的N-端方向和/或C-端方向上的氨基酸残基包含对人或鼠的表皮形态发生素pep7区或其任何同种型的N端和/或C端方向上的天然产生的氨基酸序列的取代，特别是保守取代和/或缺失和/或加成和/或插入，并且可以具有最高达全长的人和鼠的表皮形态发生素并包括全长的人和鼠的表皮形态发生素，只要该寡肽保持至少一种生物活性，条件是该寡肽不同于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2且不同于寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys。在其它实例中，在寡肽中的pep7区突变的N-端方向和/或C-端方向上的氨基酸残基是哺乳动物的表皮形态发生素pep7区的N-端方向和/或C-端方向上的天然产生的氨基酸序列，或者包含对哺乳动物的表皮形态发生素pep7区的N-端方向和/或C-端方向上的天然产生的氨基酸序列的取代，特别是保守取代和/或缺失和/或加成和/或插入，只要该寡肽保持至少一种生物活性。在一些实例中，寡肽可溶于水性介质中如盐水或水。在其它实例中，寡肽能够在合适的条件下二聚。
本发明包括长度为约5-约104个氨基酸残基的分离的寡肽，其表现出毛发生长促进活性，包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X 3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2不同，并且与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还包括具有毛发生长促进活性的长度在约5-约104个氨基酸残基之间的分离的寡肽，其包括以下氨基酸残基：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽不是SEQ ID NO：2，并且与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还包括具有毛发生长促进活性的长度为约7-约100个氨基酸残基之间的分离的寡肽，其包含下列氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还包括具有毛发生长促进活性的长度为约7-约100个氨基酸残基的分离的寡肽，其包括以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
本发明还包括表现出毛发生长促进活性的包含以下氨基酸序列的分离的寡肽：T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(SEQ ID NO：3)。
包含如本文公开的SEQ ID NO：3-124的任一个中所示的氨基酸序列的分离的寡肽包括在本发明中。在一些实施方案中，寡肽将由如SEQID NO：3-124的任一个中所示的氨基酸序列组成，并且在其它实施方案中，寡肽将包含如SEQ ID NO：3-124的任一个中所示的氨基酸序列。本文所用的“分离的”寡肽是指从与其天然伴生的至少一种组分中取出的寡肽。
本发明还包括表现出毛发促进活性的以下寡肽：
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其包括一种其中在氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp中1-3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包括一种其中在由Glu-Gln-Ser-Cys-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的氨基酸序列，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第五的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第五的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-6ln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第四的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第五的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其包括至少一种在氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp中1-3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包括由Glu-Gln-Cys-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代氨基酸序列；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-IIe-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的As p用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第四的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其包含至少一个在氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp中1-3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者其中被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包含在由Glu-Cys-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的氨基酸序列；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者其中被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第五的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其包含至少一种在由Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的氨基酸序列，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包含在由Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代的氨基酸序列，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第四的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第五的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第四的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含7-100个氨基酸残基的寡肽，其中在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的5er用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包含在由Glu-Gln-Ser-Cys-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的至少一个氨基酸序列；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包含在由Glu-Gln-Cys-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的至少一个氨基酸序列；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包含在由Glu-Cys-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的至少一个氨基酸序列；
长度包含5-100个氨基酸残基的寡肽，其包含在由Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代的至少一个氨基酸序列。
不想限于理论，可以推理，为了用未被取代的寡肽获得具有类似形态发生活性(如毛发生长促进活性)的有氨基酸取代的寡肽，优选的是在表皮形态发生素的pep7区中新加入的氨基酸残基具有与缺失的氨基酸残基类似的性质。具体地，在来自鼠的表皮形态发生素的pep7区的氨基酸序列中，5种类型(总共7个位置，即 S I E Q SC D QDE的7个下面划线的位点)的氨基酸残基Ser(在2个位点)、Ile、Glu、Gln(在2个位点)和Asp可以被取代。其中，Ser(丝氨酸)可以用属于羟基氨基酸的Thr(苏氨酸)取代；Ile(异亮氨酸)可以用属于脂肪族氨基酸的Gly(甘氨酸)、Ala(丙氨酸)、Val(缬氨酸)或Leu(亮氨酸)取代；Glu(谷氨酸)可以用属于酸性氨基酸的Asp(天冬氨酸)取代；Gln(谷氨酰胺)可以用属于酰胺的Asn(天冬酰胺)取代；Asp(天冬氨酸)可以用属于酸性氨基酸的Glu(谷氨酸)取代。这些是取代的优选实例，只要保持至少一种生物活性，所述氨基酸可以用任何其它氨基酸取代。
包含以下氨基酸序列的寡肽，根据在本文实施例7中所述的测试来测定，显示了毛发生长促进活性，其在生物体外测量了mAb27抗原的量。Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp(SEQ ID NO：4)；Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp(SEQ ID NO：5)；Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp(SEQ ID NO：6)；Tyr-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp(SEQ ID NO：7)；Thr-Ser-Asp-Gln-Cys-Cys-Asp(SEQ ID NO：8)；Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Gly(SEQ ID NO：9)；Ser-Ser-Ala-Gln-Ser-Cys-Leu(SEQ ID NO：10)；Tyr-Ile-Glu-Gln-Tyr-Cys-Asp(SEQ ID NO：11)；Thr-Ile-Trp-Gln-Ser-Cys-Asp(SEQ ID NO：12)；Thr-Thr-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：13)；Pro-Ser-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：14)；和Ser-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：15).
显示了毛发生长促进活性的包含氨基酸序列的其它寡肽用单字母氨基酸编码表示在下表I中(其中标记？表示未知的氨基酸，*表示终止密码子)。
表IYIKQSCEQDE    (SEQ ID NO：16)YNEQSCDREE    (SEQ ID NO：17)SVEQSCHRGE    (SEQ ID NO：18)SSEQTCDQHG    (SEQ ID NO：19)STGQSCDQPG    (SEQ ID NO：20)TTEQSCDQQE    (SEQ ID NO：21)SIRQFCDQDV    (SEQ ID NO：22)TTEQSCDQQE    (SEQ ID NO：23)SNEPCSDQGG    (SEQ ID NO：24)FIEQSCDQNE    (SEQ ID NO：25)S？E？SCDQDQ  (SEQ ID NO：26)TSQQSCDLDE    (SEQ ID NO：27)VNEQSCDQDE    (SEQ ID NO：28)SNEQSCAVAE    (SEQ ID NO：29)SIEQSCDQDW    (SEQ ID NO：30)SLEQSCDQDV    (SEQ ID NO：31)TIWQSCDQEE    (SEQ ID NO：32)SSAQSCL       (SEQ ID NO：10)PSEQSCA       (SEQ ID NO：14)TIEQSCDEVA    (SEQ ID NO：33)STEQSCHKVE    (SEQ ID NO：34)SSEQWCSQDQ    (SEQ ID NO：35)SFEQSCDQHE    (SEQ ID NO：36)SNEESCDLDE    (SEQ ID NO：37)SIKQSCDPHQ    (SEQ ID NO：38)GLEQSCDQDW    (SEQ ID NO：39)TGEQSCDQHE    (SEQ ID NO：40)SIEQSCAPAF    (SEQ ID NO：41)PIKTSCDQEE    (SEQ ID NO：42)SIERSCDQDE    (SEQ ID NO：43)SSERSCDPDE    (SEQ ID NO：44)VIEQACDQNE    (SEQ ID NO：45)AIEQSCDQVE    (SEQ ID NO：46)SIEQSCNQDE    (SEQ ID NO：47)SSAQSCLQDT    (SEQ ID NO：48)YNEQSCD       (SEQ ID NO：7)YIEQYCD       (SEQ ID NO：11)SNEQSCA       (SEQ ID NO：15)YGEQSCDQGQ    (SEQ ID NO：49)SVEQSCDPND    (SEQ ID NO：50)SIEQFCEQGW    (SEQ ID NO：51)SLEQSCDQDK    (SEQ ID NO：52)SIEQSCDAHQ    (SEQ ID NO：53)SIEQFCNPDE    (SEQ ID NO：54)PIGPSCDKPV    (SEQ ID NO：55)SIVQSCGEAE    (SEQ ID NO：56)TGEQSCDQHE    (SEQ ID NO：57)FIEQSCDQHV    (SEQ ID NO：58)PIEQSCYQHG    (SEQ ID NO：59)STEQPCDQGL    (SEQ ID NO：60)PSEQSCAEEE    (SEQ ID NO：61)SIEQPCHQRV    (SEQ ID NO：62)TTEQSCAVDE    (SEQ ID NO：63)YIEQYCDQDE    (SEQ ID NO：64)TSDQCCD       (SEQ ID NO：65)TIWQSCD       (SEQ ID NO：66)YGEQSCDQGQ    (SEQ ID NO：67)SIEQSCDLHE    (SEQ ID NO：68)SIEQSCSQ？？  (SEQ ID NO：69)SIEQSCDQDE    (SEQ ID NO：70)SNEPSC？EDG   (SEQ ID NO：71)SSEHSCDHDE    (SEQ ID NO：72)PIKTSCDQFE    (SEQ ID NO：73)YNEQSCDQDE    (SEQ ID NO：74)TSDQCCDPDK    (SEQ ID NO：75)SIESSCDTAE    (SEQ ID NO：76)SFQQSCEQNE    (SEQ ID NO：77)SSEQFCDQGK    (SEQ ID NO：78)SIEQACGQGE    (SEQ ID NO：79)SIEQSCGQHE    (SEQ ID NO：80)SVEKPCDLVV    (SEQ ID NO：81)SIEQSCG       (SEQ ID NO：9)TTEQSCA       (SEQ ID NO：13)
显示出毛发生长促进活性的包含以下氨基酸序列的其它寡肽包括在本发明中。Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：82)；Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：83)；Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：84)；Thr-Ser-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：85)；Thr-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：86)；Tyr-Ser-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：87)；Tyr-Asn-Glu-Gln-Ser-Cys-Ala(SEQ ID NO：88)；Thr-Ser-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala(SEQ ID NO：89)；Thr-Asn-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala(SEQ ID NO：90)；Tyr-Ser-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala(SEQ ID NO：91)；Tyr-Asn-Glu-Gln-Cys-Ser-Ala(SEQ ID NO：92)；Thr-Ser-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：93)；Thr-Asn-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：94)；Tyr-Ser-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：95)；Tyr-Asn-Glu-Cys-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：96)；Thr-Ser-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：97)；Thr-Asn-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：98)；Tyr-Ser-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：99)；TYr-Asn-Cys-Glu-Gln-Ser-Ala(SEQ ID NO：100)；Glu-Gln-Ser-Cys-Asp(SEQ ID NO：101)；Glu Gln-Cys-Ser-Asp(SEQ ID NO：102)；Glu-Cys-Gln-Ser-Asp(SEQ ID NO：103)；和Cys Glu Gln Ser Asp(SEQ ID NO：104).
显示出毛发生长促进活性的包含以下氨基酸序列的其它寡肽包括在本发明中。
Ser-Ile-Glu-Gln-Xaa-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：105)；
Ser-Ile-Glu-Xaa-Gln-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：106)；和
Ser-Ile-Xaa-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：107)；其中，Xaa表示反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys。
下表II提供了具有毛发生长促进活性的寡肽的结构表征。氨基酸序列SIEQSCD是鼠的表皮形态发生素的pep7区。表II
为了在大肠杆菌(E.coli)中产生寡肽，制备寡肽文库。表III提供了关于所制备的寡肽文库的信息。在表III中，所述文库的设计值由下面的“理论值”表示。最终制备的寡肽由上面的“表观”值表示。
表III
Figure A0215063900442
在一些实例中，本发明的寡肽长度为约5-约104个氨基酸残基，在其它实例中，长度为约5-约100个氨基酸残基，在另外的实例中，寡肽长度为约7-约100个氨基酸残基。在进一步的实例中，寡肽长度为约7-约104个氨基酸残基。在另外的实例中，寡肽长度为约5-约40个氨基酸残基，长度为约6-约30个氨基酸残基，长度为约7-约20个氨基酸残基，长度为约7-约15个氨基酸残基，长度为约7-约15个氨基酸残基，长度为约7-约10个氨基酸残基，长度为约8-约20个氨基酸残基，长度为约8-约15个氨基酸残基，长度为约8-约12个氨基酸残基，长度为约8-约10个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的寡肽长度为至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25，至少26，至少27，至少28，至少29，至少30，至少31，至少32，至少33，至少34，至少35，至少36，至少37，至少38，至少39，至少40，至少41，至少42，至少43，至少44，至少45，至少46，至少47，至少48，至少49或至少约50个氨基酸残基。在其它实施方案中，本发明的寡肽长度为直到至少50，直到至少55，直到至少60，直到至少65，直到至少70，直到至少75，直到至少80，直到至少85，直到至少90，直到至少95，直到至少100，直到至少101，直到至少102，直到至少103或直到至少104个氨基酸残基。在使用更大的寡肽时，希望的是包括增强或促进寡肽经皮肤吸收的试剂。这样的试剂包括例如增强皮肤渗透和/或给药的试剂。这样的试剂是本领域熟知的并描述于本文中。
在一些实例中，本发明的寡肽的长度下限至少为5，至少为6，至少为7，至少为8，至少为9，至少为10，至少为11，至少为12，至少为13，至少为14或至少为15个氨基酸残基，其上限为直到至少15，直到至少20，直到至少25，直到至少30，直到至少35，直到至少40，直到至少45或直到至少50个氨基酸残基，其中，上限和下限独立地选择。
本发明的寡肽中的氨基酸残基种类不特别限制，可以是任何天然型氨基酸残基、非天然型氨基酸残基或它们的衍生物。所述氨基酸可以是L-氨基酸、D-氨基酸或其混合物。所述氨基酸的种类可以是α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸或δ-氨基酸。α-氨基酸是一种天然型氨基酸，其是优选的。
本文所用的非天然氨基酸覆盖除了20种构成天然蛋白质(Gly、L-Ala、L-Val、L-Leu、L-Ile、L-Ser、L-Thr、L-Asp、L-Glu、L-Asn、L-Lys、L-Arg、L-Cys、L-Met、L-Phe、L-Tyr、L-Trp、L-His、L-Pro)的天然型氨基酸以外的所有氨基酸。具体实例包括(1)在天然型氨基酸中的原子被其它物质取代的非天然型氨基酸残基，(2)一种关于天然型氨基酸的侧链的光学异构体，(3)通过向天然型氨基酸的侧链中引入取代基所获得的非天然型氨基酸，和(4)通过取代天然型氨基酸的侧链以改变疏水性、反应活性、电荷、分子尺寸、氢键合能力等所获得的非天然型氨基酸。
寡肽可以是游离形式的，也可以以酸加成盐或碱加成盐的形式提供。
寡肽氨基酸残基可以包括天然产生的氨基酸残基、非天然产生的氨基酸残基，或天然产生的和非天然产生的氨基酸残基的混合物。在一些实施方案中，寡肽可以被修饰，例如通过添加反应性物质如交联剂，使得寡肽能够二聚或与寡肽聚合。本发明包括寡肽单体、具有反应性物质束缚的寡肽单体和寡肽聚合物如二聚物，包括同型二聚物(与相同的寡肽二聚的寡肽)和异型二聚物(与不同的寡肽二聚的寡肽)。在一些实施方案中，反应性物质被束缚到在该寡肽内的Cys或Lys上，在另一些实施方案中，反应性物质被束缚到寡肽的pep7区内的Cys或Lys上。
可以例如通过测试对得自肾的MDCKII细胞的形态发生促进活性来测定寡肽的生物活性，如EP1008603A1所述。简而言之，把MDCKII细胞加到含有测试的寡肽、胶原和产生胶原胶的合适的培养条件的混合物中，并使细胞可以在合适的条件下培养。通过在胶原胶中以三维方式形成管状结构而表明阳性的结果。
日本申请公开平-6-25,295也描述了一种测定上皮组织的形态发生活性的测试。美国专利5,726,298描述了测定上皮生长的测试。简而言之，从胎儿小鼠中分离出的肺部表皮形态发生素组织经过核孔膜上的三维培养，并在测试分子(例如本发明的寡肽)的存在下测定了肺部的表皮形态发生素的管形继续生长。
还可以通过以下过程测试寡肽的生物活性：即例如测试寡肽促进毛发生长的能力或通过刺激毛发产生而表现出毛发生长促进活性；诱导更大量发束形成和/或增大发束的直径和/或延长发束和/或防止、阻碍或阻止毛发损失过程，和/或通过诱导新毛囊的数量或尺寸或同时诱导二者；在本文实施例7和8中公开的测试和/或按照美国专利5,616,471中公开的体外测试测量的诱导毛发毛囊细胞增殖。
更具体地，可以通过检测或测定对与皮肤组织反应的上皮新毛囊的220kDa抗原特异性的单克隆抗体或其抗体片断，从而测定对施用本发明的寡肽响应而在上皮新毛囊中表达的220kDa抗原的量，来评价毛发生长促进活性。
本领域普通技术人员之一通过试验方法可以容易地确定本发明的寡肽具有毛发生长促进活性，所述试验方法例如在本说明书的实施例中详细描述的方法或对所述试验方法的变化或改进。其它试验方法包括在美国专利5,616,471中公开的那些试验方法。
本文所公开的这些试验方法的实例包括但不限于以下方法。
(1)已知C3H和C57BL/6小鼠从出生后第45天到约95天，保持约50天的毛发生长终止期。基于其皮肤颜色变化，即从毛发生长终止期的粉红色到生长期的灰或黑色，可以容易地判断其毛发周期。“生长期”是指毛发毛囊的活化期，“毛发生长终止期”是指毛发毛囊的休止期。通过使用这种小鼠并评价试验物质的施用是否促进了毛发生长终止期到生长期的转变，可以评价毛发生长促进活性。
(2)通过使用特异性地识别上皮新毛囊中存在的抗原的单克隆抗体或其片断(例如，由登记号为FERM P-18578的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体)，可以评价毛发生长促进活性。具体地，在试验物质如包括本发明范围内的寡肽的存在下培养来自生物体的皮肤细胞，收集细胞组织，并使其与由登记号为FERM P-18578的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体或其片断反应。通过检测或测量与皮肤组织反应的单克隆抗体或其片断，从而测定在上皮新毛囊中表达的抗原的量，可以评价毛发生长促进活性。上皮新毛囊量的增加与人体中的毛发生长促进活性有关。
适合于本文所用的二聚的条件是指本发明的低聚物与另一个寡肽结合的条件。在一些实施方案中，一个寡肽与另一个寡肽共价结合。二聚条件在本领域中是已知的，并且包括在寡肽中的半胱氨酸残基的巯基与半胱氨酸残基的巯基或寡肽的赖氨酸残基的氨基形成共价键的条件。
反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys是指已经使其束缚到一种物质如交联剂上的Cys或Lys氨基酸残基，其能够与官能团如-SH基团或-NH2基团反应和键合。在一些实施方案中，反应性物质是交联剂。在另一些实施方案中，反应性物质是双官能交联剂。在本发明的一些实施方案中，表现出形态发生活性例如表现出毛发生长促进活性的寡肽是单体形式的，特别是能在合适条件下二聚的单体。在本发明的另一些实施方案中，寡肽是能在合适条件下二聚的反应性物质束缚的单体形式的。在本发明的另一些实施方案中，寡肽是聚合物形式的，例如二聚物如同型二聚物或异型二聚物，以及三聚物。
因此，本发明提供具有形态发生促进活性如毛发生长促进活性的寡肽聚合物，其包含交联的寡肽，其中，所述寡肽聚合物的至少一种寡肽包含长度约5-约104个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该聚合物不是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的均聚物，并且不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
在一些实施方案中，具有形态发生促进活性的寡肽聚合物包含至少一个含有具有以下氨基酸序列的长度约5-约104个氨基酸残基的寡肽：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽聚合物不是SEQ ID NO：2的均聚物，并且不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
本发明还提供具有形态发生促进活性如具有毛发生长促进活性的寡肽聚合物，其包含交联的寡肽，其中，所述寡肽聚合物的至少一种寡肽包含长度为约7-约100个氨基酸残基并且包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽聚合物不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
本发明还提供具有形态发生促进活性如毛发生长促进活性的寡肽聚合物，其包含交联的寡肽，其中，所述寡肽聚合物的至少一种寡肽包含长度为约7-约100个氨基酸残基并包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽聚合物不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
在另一些实施例中，所述寡肽聚合物包含本发明的寡肽，所述寡肽包含寡肽SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：124中单独的任一种，所述聚合物是单一寡肽的聚合物(即均聚物)或者是本发明的寡肽混合物的聚合物(杂聚物)。在本发明的一些实施例中，寡肽聚合物是同型二聚物、异型二聚物、同型三聚物或异型三聚物。
本发明包括修饰的寡肽。在本发明中，术语“修饰的”包括化学修饰和生物学修饰。修饰的实例包括官能团的引入如烷基化、酯化、卤化、和胺化；或者官能团的转化如氧化、还原、加成和消去；或者糖类化合物(单糖、二糖、低聚糖或多糖)或脂类化合物的引入；磷酸化；生物素化。但是，修饰不限于这些实例。因此，本发明提供修饰的寡肽和在哺乳动物体中促进毛发生长的方法，包括根据毛发生长的需要向哺乳动物体内施用一种包含修饰寡肽的组合物，其用量是在所述哺乳动物中促进毛发生长的有效量。
修饰寡肽的一个实例包括生物素化的寡肽，并且更优选的实例包括其N-端被生物素束缚的寡肽，可以有或没有隔离物。在上述修饰寡肽中，只要能保持希望的生理活性，可以向生物素上添加合适的化学修饰。一种生产生物素化的寡肽的方法具体表示在本说明书的实施例中。为了借助于具有合适长度的隔离物向N-端引入生物素，例如可以使用NHS-生物素或NHS-LC-生物素(得自Pierce)。
修饰的寡肽的另一个优选的实例包括由其中的半胱氨酸的巯基二聚的寡肽。该二聚反应在空气气氛下自发进行，形成二聚物。但是，不是所有的寡肽都形成二聚物。二聚的寡肽可以是通过交联相同的寡肽获得的同型二聚物寡肽，也可以是通过交联不同的2种寡肽获得的异型二聚物寡肽。用于提高形态发生活性如毛发生长的包含本发明寡肽的组合物可以是相同或不同单体的混合物，特别是能在合适条件下二聚的单体，已经束缚到反应性物质上的单体和聚合物如二聚物形式的。
本发明的聚合物，如同型二聚物或异型二聚物，可以通过使用交联剂交联上述本发明的任何寡肽获得，包括修饰的寡肽。
本发明中所用的交联剂优选的是包括双官能交联剂，其可以激活寡肽中的半胱氨酸残基的巯基并与另一个寡肽中的半胱氨酸残基的巯基形成共价键。
可以用于本发明中的双官能交联剂的实例包括双马来酰亚胺化合物，如其中马来酰亚胺基团的N-原子被束缚到低级烷基(例如C1-C10，优选的是C1-C8烷基)的两端的化合物，其中，所述低级烷基任选的是有取代基，如羟基。双马来酰亚胺化合物的实例包括1，4-双马来酰亚胺基-2，3-二羟基丁烷、1，6-双马来酰亚胺己烷、双马来酰亚胺乙烷和1，4-双马来酰亚胺丁烷。
此外，其中交联剂被束缚到上述寡肽(包括修饰的寡肽)的任一个中的半胱氨酸残基上的单体寡肽和使用这样的单体来促进哺乳动物患者中的毛发生长的方法也落在本发明的范围内。
另外，除了二聚物寡肽以外，聚合物寡肽如三聚物或更多的聚合物也落在本发明的范围内。例如，本发明包括聚合物寡肽，如通过使用可以交联3个或多个肽的交联剂获得的三聚物或更多的聚合物。
上述寡肽(包括修饰的寡肽)可以是游离形式的，也可以以酸加成盐或碱加成盐形式提供。酸加成盐的实例包括无机酸盐，如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐；有机酸盐如对甲苯磺酸盐、甲基磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、马来酸盐和酒石酸盐。碱加成盐的实例包括金属盐如钠盐、钾盐、钙盐和镁盐；铵盐；有机铵盐如甲基铵盐和三甲基铵盐。所述寡肽可以形成带有氨基酸如甘氨酸的盐，或者可以形成分子中的反离子。
另外，这些寡肽或其盐可以以水化物或溶剂化物的形式存在。上述寡肽具有多个不对称的碳原子。虽然每个不对称的碳原子的立体化学不受限制，但是优选的是所述氨基酸残基是L-氨基酸。基于非对称碳原子的立体异构体如光学异构体或非对映体、所述立体异构体的任何混合物和外消旋变体都落在本发明范围内。
本发明的寡肽可以通过传统的肽合成化学技术合成，例如固相法或液相法。在肽合成领域，关于氨基等的保护基团和用于缩合反应的缩合剂，有各种各样的参考文献，因此，关于所述合成，可以参见这些参考文献。在固相法中，可以利用市售的各种肽合成装置。通过根据需要进行官能团的保护和去保护，可以高效率地进行合成。关于引入和去除保护基团的方法，例如，可以参考Protective Groups inOrganic Synthesis，T.W.Greene，John Wiley&Sons，Inc.1981等。
通过应用本领域技术人员已知的生物方法，如基因表达过程，希望的寡肽可以通过构造含有编码上述寡肽的DNA序列的重组载体，制备由该载体转化的微生物(转化体)，并从该转化体的培养中任选地分离和提纯寡肽，可以获得希望的寡肽。生产寡肽的方法不限于这些化学和生物方法。包括化学修饰和生物修饰的生产修饰寡肽的方法对于本领域技术人员是熟知的，并且可以使用任何方法。
本发明还提供包含(即用其转化的)编码本文所述寡肽的核酸的宿主细胞。只要存在保持在该宿主中所必需的序列，如合适的复制起点，原核和真核宿主细胞都可以使用。为了方便起见，也可以提供选择性标记。宿主系统是本领域已知的。原核宿主细胞包括细菌细胞，例如大肠杆菌(E.Coil)、B.Subtilis和分支细菌。在真核宿主细胞中，包括酵母、昆虫、鸟类、植物、C.elegans(或线虫)和哺乳动物宿主。真菌(包括酵母)宿主细胞的实例是S.cerevisiae、Kluyveromyceslactis(K.Lactis)、包括C.albicans和C.glabrata的念珠菌属的物种、Aspergillus nidulans、Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)、Pichia pastoris和Yarrowia lipolytica。哺乳动物细胞的实例是培养的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和非洲绿猴细胞。还可以使用Xenopus laevis卵母细胞或两栖动物来源的其它细胞。本发明的寡肽的应用
本发明的寡肽可以用作治疗和/或改善异常形态发生的疾病或失调的症状所用的药剂或药物组合物的活性成分。本发明的寡肽可以用来诱导形态发生、诱导再血管化效应、诱导再生效应、诱导心血管再生和诱导内皮细胞生长。本发明的寡肽可以用来治疗和/或改善例如烧伤或创伤的症状，或者促进毛发生长或防止毛发减少。在一些实例中，所述组合物可以用于促进毛发生长或者防止毛发减少。因此，本发明提供一种包含本发明的寡肽和可药用赋形剂的组合物。在一些实例中，用于促进毛发生长的组合物还包含促进透过皮肤吸收的试剂，如经皮肤渗透增强剂和/或经皮肤释放剂。这样的试剂是本领域已知的并且是本文所述的。术语“药剂”或“药物组合物”在本文中可以互换使用。本文所用的“药物组合物”以广义使用并且包括包含形态发生促进剂的组合物，在一些实例中包含毛发生长促进剂。形态发生剂用来改善哺乳动物(包括人)的疾病或失调的症状以及治疗这些疾病或失调。毛发生长组合物有时归类为准药物或化妆品，以及药剂或药物组合物。以下具体说明本发明的药剂的施用患者和药物效果，以及由本发明的药剂治疗的疾病和/或失调。本文所用的“改善”意思是状态的防止、减小或减缓。本发明的寡肽和包含寡肽的组合物可以用来提供再血管化效应、再生促进效应、心血管再生效应、对血管内皮细胞的诱导作用等，并用于治疗和改善和防止慢性障碍性动脉硬化、Buerger疾病、sever angina心绞痛、动脉硬化等的症状(Exp.Cell.Res.，1996年1月10日，222(1)：189-98)。本发明的寡肽可以涉及胰腺内皮的形态发生，并且包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善糖尿病等的症状(J.Cell.Biol.，2001年3月5日；152(5)：911-22)。本发明的寡肽可以涉及肝脏的形成，并且包含寡肽的组合物可以用于治疗和改善肝脏代谢失调的症状(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1998年9月18日；250(2)：486-90)。本发明的寡肽可以涉及骨和牙的形成，所以，包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善牙周病、骨折、骨瘤、骨缺乏症和骨质疏松症的病症(Arch.Oral.Biol，1995年2月；40(2)：161-4)。本发明的寡肽可以涉及肺支气管(lungbranching)形态发生和肺纤维化，并且包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善肺病病症(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1997年5月19日；234(2)：522和Am.J.Res pir.Cell.Mol.Biol.，2000年8月；23(2)：168-74)。本发明的寡肽可以涉及小囊绒毛形态发生，并且包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善肠病病症(Am.J.Physiol.，1998年7月；275(1 Pt1)：G114-24)。本发明的寡肽可以涉及肌肉结构的保持，并且包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善肌肉萎缩等的症状(Histochem.J.，1998年12月；30(12)：903-8)。本发明的寡肽可以涉及胆囊上皮细胞的形态发生，并且包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善胆囊疾病的病症(Cell.Tissue.Res.，2000年5月；300(2)：331-44)。本发明的寡肽可以涉及乳房鲁米那形态发生，并且包含寡肽的组合物可以用来治疗和改善乳房疾病的病症(J.Cell.Biol.，2001年5月14日；153(4)：785-94)。其中最优选的是，本发明的寡肽可以用作毛发生长促进剂。
包含寡肽的本发明组合物以促进形态发生的有效量施用于患者。在一些实例中，包含寡肽的本发明组合物以促进毛发生长的有效量施用于患者。所述患者可能正在产生毛发减少和/或存在毛发减少的危险。
因此，本发明提供一种在产生毛发减少或存在毛发减少危险的哺乳动物患者中促进毛发生长的方法，包括在所述哺乳动物患者中以促进毛发生长的有效量施用包含本发明的寡肽的组合物。
作为本发明的药剂或药物组合物，可以使用选自本文公开的寡肽或其生理上可接受的盐的一种或多种寡肽。本发明的寡肽可以是单体形式的，特别是能够在适合于二聚的条件下二聚的单体，已经束缚了反应性物质的单体，以及聚合物形式的，如二聚物包括同型二聚物和异型二聚物，或三聚物包括同型三聚物或异型三聚物。但是，一般来说，优选的是通过使用一种或多种可药用药物添加剂制备和施用包含一种或多种上述寡肽作为活性成分的药物组合物。含有一种或多种上述寡肽作为活性成分的毛发生长促进剂可以以外用制剂如霜剂、喷雾剂、涂敷液和斑贴的形式施用。所述药剂也可以以注射的形式直接向靶位给药。可以提供任何适合于用作毛发生长促进剂的形式提供该药剂。
例如，作为活性成分的上述寡肽可以加入到香波或润丝中，或者上述寡肽可以包封在脂质体中来制造一种制剂。上述形式的组合物也在本发明的范围内。为了实现本发明的寡肽通过皮肤角蛋白层的有效经皮肤吸收，优选的是在霜剂中加入合适的洗涤剂、脂溶性物质等。
增强经皮肤渗透和经皮肤给药的试剂描述于例如美国专利公报2002 0048558A1、美国专利6,376,557、美国专利6,333,057、美国专利6,358,541和美国专利6299,900并包括例如laurocaprom和laurocapram衍生物如在美国专利5,196,410中说明的1-烷基氮杂环庚烷-2，油酸及其酯衍生物如单油酸甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、丁酯、乙烯酯和甘油酯，和在美国专利5,082,866中给出的那些，特别是(N，N-二甲基氨基)乙酸十二烷酯和(N，N-二甲基氨基)丙酸十二烷酯和在美国专利4,861,764中所述的，特别是2-正壬基-1-3-二氧戊环。其它已知的皮肤渗透增强剂包括adapalene、维甲酸、视黄醛(retinalaldehyde)、tazarotene、水杨酸、壬二酸和羟基乙酸。另外的皮肤渗透剂包括乙氧基二甘醇、乙醇、Tween.RTM.80和卵磷脂有机凝胶。
对于在哺乳动物，优选的是人的局部给药，本组合物以许多种产品种类提供，包括但不限于洗液、霜剂、凝胶、条剂、喷雾剂、软膏和膏剂。这些产品种类可以包含数种制剂，包括但不限于溶液、乳液、凝胶、固体和脂质体。
配制成溶液的用于本发明组合物的局部给药的组合物通常包括可药用的水性或有机溶剂。术语“可药用有机溶剂”是指能使本发明的寡肽分散或溶解在其中并且具有可接受的安全性(例如刺激和敏化特性)的溶剂。合适的有机溶剂的实例包括：丙二醇、聚乙二醇(200-600)、聚丙二醇(425-2025)、甘油、1，2，4-丁三醇、山梨糖醇酯、1，2，6-己三醇、乙醇、异丙醇、丁二醇和它们的混合物。
本发明的寡肽可以以约1mg/ml的量溶解在PBS中。用交联剂二聚的寡肽可以以约0.9mg/ml的量溶解。通过测量肽溶液的吸光率可以测定溶解度，在单体的情况下，由(A215-A225)×144(μg/ml)确定溶解度(Waddell，1956)。在二聚物的情况下，由该计算获得的值可以除以1.3。
如果在本发明中可用的局部组合物配制成气雾剂并通过喷雾施用到皮肤上，向溶液组合物中加入抛射剂。本文所用的抛射剂的实例包括但不限于氯化的、氟化的或氯-氟化的低分子量烃。
用于本发明中的局部组合物可以配制成包含润肤剂的溶液。本文所用的“润肤剂”是指用于防止或缓解干燥，以及用于保护皮肤。各种各样的合适润肤剂是已知的并且可以在本文中使用。
可以由包含寡肽的组合物配制的另一类产品是霜剂或洗液。洗液和霜剂可以配制成乳液以及溶液。
可以由本发明的组合物配制的另一类产品是软膏。软膏可以包含动物或植物油或半固体烃(油质的)的简单基料。软膏还可以包含吸水性软膏基料，其吸收水形成乳液。软膏载体也可以是水溶性的。
另一种类型的制剂是乳液。乳化剂可以是非离子、阴离子或阳离子的，并且乳化剂的实例描述在例如美国专利3,755,560和4,421,769中。
水包油型和油包水型的局部用制剂如洗液和霜剂的单一乳液是本领域熟知的。多相乳液组合物如水包油包水型也是熟知的，如美国专利4,254,105中所公开的。三元乳液也可以用于本发明的局部给药，并且包含硅酮包水包油型流体乳液，如美国专利4,960,764中所公开的。
用于局部给药组合物的另一种乳液是微乳液体系。例如，这样的体系包含约9％-约15％的角鲨烷、约25％-约40％硅油、约8％-约20％的脂肪醇、约15％-约30％聚氧化乙烯山梨糖醇酐单脂肪酸(以商品名TWEENS市售)或其它非离子型表面活性剂，以及约7％-约20％的水。
脂质体制剂也可用于包含本发明的寡肽的组合物。这样的组合物可以根据已知方法通过把包含本发明寡肽的组合物与磷脂(如二棕榈酰基磷脂酰基氯)、胆甾醇和水组合来制备。用于形成脂质体的合适组合物的外皮脂类可以代替所述磷脂。然后把脂质体制剂引入到上述局部给药制剂(例如凝胶或水包油乳液)中，以形成脂质体制剂。局部给药脂质体的其它组合物和药物用途例如描述在Mezei(1985)Topicsin Pharmaceutical Sciences，Breimer等人编，Elsevier Science，New York，N.Y.，第345-358页中。
包含本发明寡肽的组合物的剂量可以根据应用目的、药剂形式、活性成分的种类等合适地选择。例如，可以参考在本说明书的实施例中具体表示的剂量来确定剂量。例如，一种组合物的活性成分的剂量，即本发明的寡肽的剂量为每个成人每天一般在约1μg/kg/天-约10mg/kg/天范围内，在一些实例中，约10μg/kg/天-约1mg/kg/天，在其它实例中，约100μg/kg/天-约500μg/kg/天，在另一些实例中，约200μg/kg/天-约400μg/kg/天。在一些实例中，剂量的下限为至少1μg/kg/天，10μg/kg/天，20μg/kg/天，30μg/kg/天，40μg/kg/天，50μg/kg/天，60μg/kg/天，70μg/kg/天，80μg/kg/天，90μg/kg/天，100μg/kg/天，150μg/kg/天，200μg/kg/天，250μg/kg/天，300μg/kg/天，350μg/kg/天，400μg/kg/天，450μg/kg/天和500μg/kg/天。在另一些实例中，上限为最高600μg/kg/天，700μg/kg/天，800μg/kg/天，900μg/kg/天，1mg/kg/天，2mg/kg/天，3mg/kg/天，4mg/kg/天，5mg/kg/天，6mg/kg/天，7mg/kg/天，8mg/kg/天，9mg/kg/天和10mg/kg/天，并且下限和上限独立地选择。抗体
本发明包括特异性结合本发明的寡肽的抗体，其中，所述抗体用于通过本领域技术人员已知的方法检测、定量测定、分离或提纯寡肽。特异性地结合本发明的寡肽的多克隆抗体和单克隆抗体及其片断包括在本发明范围内并且可以用传统方法制造。
本发明还包括特异性地识别，即特异性地结合在成虫的生长期或胎儿的发育期过程中特异性表达的上皮新毛囊中存在的约220 kDa的抗原的单克隆抗体。这样的单克隆抗体可以用来检测本发明的寡肽的毛发生长促进活性，如本文在实施例中所述。
这样的单克隆抗体的实例是本文在实施例中描述的单克隆抗体mAb27。产生单克隆抗体mAb27的杂交瘤细胞用Patent and Bio-Resource Center of National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology(Chuo-6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)以FERM P-18578的沉积号在2001年11月22沉积。
在本说明书中所用的术语“抗体”包括多克隆抗体以及单克隆抗体，并且还包含抗体的片断。根据本发明，提供了特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的单克隆抗体的片断。该抗体的片断优选的是官能的片断，其实例是F(ab’)2和Fab’。
F(ab’)2和Fab’通过用蛋白酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白制备，并且是由其在铰链区中的两个H链之间存在的二硫键前后的位点上的消化产生的抗体片断。本说明书中所用的术语“抗体片断”还包括含有得自编码所述抗体的基因的抗原结合位点的蛋白质。
例如，当用木瓜蛋白酶处理IgG1时，在铰链区的两个H链之间存在的二硫键的上游发生分裂，以产生两个同源的抗体片断，其中包含VL(L链可变区)和CL(L链不变区)的L链和包含VH(H链可变区)和CHγ1(在H链不变区中的γ1区)的H链通过在C端区的二硫键结合。这两个同源抗体片断的每一个称为Fab’。另外，当用胃蛋白酶处理IgG时，在铰链区中的两个H链之间存在的二硫键的下游发生分裂，以产生比上述两个Fab’在铰链区中连接的略大的抗体片断。这种抗体片断称为F(ab’)2。
本发明的抗体可以用作固定的抗体，即固定在不溶性载体如固体载体上，或者可以用作用标记物质标记的标记抗体。所有这些固定的抗体和标记的抗体在本发明范围内。
固定的抗体是处于通过物理吸附、化学结合等承载在不溶性载体上的状态的抗体。这样的固定抗体可以用来检测、定量测定、分离或提纯在样品(如毛发、上皮新毛囊或其提取物)中含有的抗原(即本发明的寡肽或在上皮新毛囊中存在的约200kDa的抗原)。可以用于抗体固定的不溶性载体的实例包括(1)具有内容积的容器如平板、试管或管、或珠、球、过滤器、薄膜等，其每一个都是用水不溶性物质如塑料或玻璃制成，所述塑料包括聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、硅树脂或尼龙树脂；(2)用于亲合色谱法的不溶性载体，如纤维素基载体、琼脂糖基载体、聚丙烯酰胺基载体、右旋糖酐基载体、聚苯乙烯基载体、聚丙烯醇基载体、聚氨基酸基载体或多孔二氧化硅基载体。
标记的抗体是指用标记物质标记的抗体，并且这样的标记抗体可以用来检测或定量测定在样品(如毛发、毛囊或其提取物)中含有的抗原(即在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原)。对于本发明所用的标记物质没有特别限制，只要可以通过物理结合、化学结合等结合到抗体上检测其存在。标记物质的实例是酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素蛋白或放射性同位素。具体实例包括酶如过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、脱葡萄糖(apoglucose)氧化酶、尿素酶、荧光素酶或乙酰胆碱酯酶；荧光物质如荧光素异硫氰酸酯、藻胆素蛋白质、稀土金属螯合物、丹磺酰氯或四甲酰基若丹明异硫氰酸酯；放射性同位素如3H、14C、125I或131I；生物素；抗生物素蛋白；和化学发光物质。关于使标记物质结合到抗体上的方法，可以使用已知的方法如戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基硫醚法和高碘酸法。
这里，每种放射性同位素和荧光物质本身能够产生可检测的信号，而每种酶、化学发光物质、生物素和抗生物素蛋白本身不能产生可检测的信号，所以，可检测信号是由于与一种或多种其它物质反应而产生的。例如，在酶的情况下，至少一种物质是必需的，取决于测量酶活性的方法(比色法、荧光法、生物发光法或化学发光法)，可以使用各种底物。在生物素的情况下，通常至少抗生物素蛋白或酶束缚的抗生物素蛋白与其反应。如果需要，可以根据所述底物使用各种显色物质。产生单克隆抗体的杂交瘤细胞
本发明还提供产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述单克隆抗体特异性地识别在本文所述的上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原。本发明的单克隆抗体可以使用所述杂交瘤细胞产生。
下面描述本发明的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备方法，所述单克隆抗体特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原。
首先，使用免疫原如从生长期的皮肤和/或生长期的须的毛囊中收集的毛发中提取的蛋白质使哺乳动物免疫，从而在动物体内制备抗体产生细胞。虽然对于哺乳动物的种类没有特别限制，但是，实例一般包括小鼠、大鼠、牛、兔、山羊和绵羊，优选的是啮齿动物如小鼠、大鼠和兔，更优选的是小鼠和大鼠。小鼠的实例是具有A/J株、BALB/C株、DBA/2株、C57BL/6株、C3H/He株、SJL株、NZB株或CBA/JNCrj株的小鼠。BALB/C株的小鼠是优选的，因为得自该株的骨髓瘤的细胞株在制备杂交瘤细胞时形成。
在本发明中，从生长期的皮肤和/或生长期的须的毛囊中收集的毛发中提取的蛋白质可以用作免疫原。只要其含有由本发明的单克隆抗体识别的在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原，任何材料都可以用作免疫原。
在免疫前，把免疫原与增强免疫响应的佐剂混合。佐剂的实例包括油包水型乳液(如弗氏不完全佐剂)、水包油包水型乳液、水包油型乳液、脂质体、氢氧化铝凝胶，二氧化硅佐剂、粉末状膨润土和木薯淀粉佐剂，以及BCG的细胞体和细胞壁，Propionibacterium acnes等和体细胞成分如海藻糖二胆酸酯(TDM)；作为革兰氏阴性菌的内毒素的脂质多糖(LPS)和脂质体A部分；β-葡聚糖(多糖)；胞壁酰基二肽(MDP)；苯丁抑制素；合成化合物如左旋咪唑；得自生物成分如乳腺激素、乳腺激素的液体因子和taftsin的蛋白质或肽物质；及其混合物(如弗氏完全佐剂)。这样的佐剂对取决于给药方法、剂量、给药周期等的免疫响应的增强或抑制是有效的。此外，根据佐剂的种类，发现在血中对抗原产生抗体、细胞免疫性的诱导、免疫球蛋白的种类等的差异。所以，优选的是根据目标免疫响应合适地选择佐剂。用佐剂处理的方法在本领域中是已知的。
根据本领域技术人员已知的方法进行哺乳动物的免疫。例如，把抗原在皮下、皮内、静脉内或腹膜内注射到哺乳动物中。由于免疫响应随要免疫的哺乳动物的种类和株而变化，根据所用动物合适地设计免疫计划。在第一次免疫后，抗原的给药重复进行多次。例如，可以在第一次免疫后四周、6周和半年进行另外的免疫处理。
在免疫后，从哺乳动物中采集血液，测试所得血液的毛发毛囊结合活性的存在，以证实哺乳动物体内产生了对毛囊的抗体。测试方法包括已知的方法，例如酶联免疫吸收剂测试(ELISA)、放射性免疫测试(RIA)和荧光抗体法。
在证实毛囊结合抗体的产生后，可以进行强化(另外注射免疫原)，使得能产生特异性抗体的免疫细胞成为适合于细胞融合的状态。虽然对于在强化中免疫原的给药量没有特别的限制，但是优选的是约为初始免疫量的4-5倍。通常，可以使用免疫原和弗氏不完全佐剂的乳液进行强化。给药方法可以合适地选自皮下、皮内、静脉内、腹膜内给药等。
在最终免疫后，从免疫的哺乳动物中切除脾细胞，并使其经过与得自骨髓瘤的细胞株的细胞融合。在细胞融合中，优选的是使用具有高繁殖潜力的细胞株，并且优选的是得自骨髓瘤的细胞株具有与获得待融合脾细胞的哺乳动物的相容性。得自小鼠骨髓瘤的细胞株的实例包括P3U1、P3X63-Ag8.653、Sp2/O-Ag14、FO.1、S194/5、XX0BU.1、P3/NS1/1-Ag4-1等。
可以按本领域技术人员已知的方法进行细胞融合。细胞融合方法的实例包括聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法、和使用电流的方法。对于一般的方法，参见Antibodies，A Laboratory Manual by EdHarlow David Lane，1988，Cold Spring Harbor Laboratory。
按本领域已知的条件繁殖所得的融合细胞。希望的融合细胞根据所产生的抗体的结合能力选择。
从所融合的细胞产生的抗体与希望的抗原结合的能力根据本领域已知的方法测试。在本发明中，利用融合细胞产生具有高结合能力且对上皮新毛囊的抗原特异性的抗体的能力作为选择，克隆感兴趣的细胞株。抗体的结合能力可以用与证实抗体产生已经提及的那些方法同样的方法，用诸如ELISA、RIA和荧光抗体法的方法测试。由于其简单性和高敏感性，ELISA是优选的。
可以按本领域中已知的方法进行融合细胞的克隆。用于克隆的方法包括有限稀释法、软琼脂法等。由于容易操作和高再现性，有限稀释法是优选的。为了从细胞融合所获得的许多融合细胞中高效地选择有用的细胞，优选的是从克隆的初始阶段进行细胞的选择。用这种方式，可以最终选择出产生具有要求结合能力的抗体的融合细胞株。
通过大规模培养如上所述所选的单克隆抗体产生细胞株，对毛囊特异性的单克隆抗体可以大量生产。大规模培养单克隆抗体产生细胞株的方法包括体内和体外培养。大规模体内培养的实例是一种把融合细胞经腹膜内注射到哺乳动物中以便繁殖使得在腹水中产生抗体的方法。在体外培养中，融合细胞在介质中培养并且抗体在该介质中产生。
本发明的单克隆抗体可以按本领域已知的方法从大规模培养获得的腹水中提纯，或者从培养介质的上层液体中提纯。对于提纯，可以使用DEAE阴离子交换色谱法、亲合色谱法、硫酸铵分馏、PEG分馏、乙醇分馏等的适当组合。本发明的抗体可以提纯到优选约90％的纯度，更优选的是到约95％的纯度，仍然更优选的是到约98％的纯度。评价毛发生长促进活性的方法
本发明还涉及一种评价毛发生长促进活性的方法，其特征在于使用特异性地结合在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的单克隆抗体或该抗体的片断进行免疫测试。该方法优选的是包括至少以下步骤(a)-(c)。
(a)在待测物质如本发明的寡肽的存在下培养得自活生物体的皮肤组织；
(b)回收所述皮肤组织，并且使其与特异性地结合在该上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的单克隆抗体或其抗体片断反应；和
(c)检测或测量与所述皮肤组织碎片反应的所述单克隆抗体或其片断。
依赖于特异性地结合在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的单克隆抗体的评价毛发生长促进活性的方法可以是任何方法，只要其是使用抗体的检测，即免疫测试。即本发明包括使用特异性地结合在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的单克隆抗体或该抗体的片断在本领域技术人员已知的免疫测试中测定约220kDa的抗原在上皮新毛囊中的存在，其中，约220kDa的抗原在上皮新毛囊中的存在与毛发生长有关。这样的免疫测试的实例包括蛋白质印迹、酶联免疫吸收剂测试(ELISA)、荧光免疫测试、放射性免疫测试(RIA)、发光免疫测试、免疫酶测试、免疫荧光测试、免疫浊度测试法、乳胶凝集反应、乳胶浊度测定法、红血球凝集反应和颗粒凝集反应。
对于经过本发明的评价方法的测试物质种类没有特别限制，并且测试物质可以是寡肽，如本发明的寡肽，或者低分子量有机化合物。例如，可以使用具有表皮形态发生素的部分氨基酸序列的寡肽。
当使用标记的抗体如酶联免疫吸收测试(ELISA)、荧光免疫测试、放射性免疫测试(RIA)或发光免疫测试的免疫测试进行根据本发明的评价毛发生长促进活性的方法时，也可以通过三明治法或竞争法进行测试。在三明治法中，固相抗体和标记的抗体至少之一是本发明的单克隆抗体。
关于固相抗体载体，可以使用在本说明书中描述的上述载体作为与固定的抗体相关的不溶性载体的具体实例。关于标记物质，可以使用在本说明书中关于标记的抗体描述的上述物质。
可以用已知的方法(“Immunoassay for Clinical Tests-Technique and Application”，Special Issue No.53 of RinshoByori，the Japanese Society of Clinical Pathology编，RinshoRyori Kankokai出版，1983；“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”Eiji Ishikawa等编，Third Edition，Igaku Shoin出版，1987；和“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay”，Supplementary Issue No.31 of Tampakushitsu，Kakusan，Koso，Tsunehiro Kitagawa等编，Kyoritsu Shuppan出版，1987)作为进行测定的方法。
例如，使固相抗体同时与样品和标记的抗体反应，或者使固相抗体与样品反应，并在洗涤后，使其与标记的抗体反应，从而形成固相抗体-抗原-标记抗体的复合物。然后，把未束缚的标记抗体通过洗涤分离，在样品中的抗原量可以由所束缚的标记抗体量测定。具体地，在酶联免疫吸收剂测试(ELISA)的情况下，使标记的酶在最适宜的条件下与底物反应，并且通过例如光学方法测定反应产物量。在荧光免疫测试的情况下，测定由荧光物质标记产生的荧光强度，并且在放射性免疫测试的情况下，测定放射性物质标记的发射剂量。在发光免疫测试的情况下，测定在发光反应体系中的发光量。
在根据本发明的检测和/或定量测定方法中，当通过光学方法测定其发射光或散射光或者通过视觉测定来测定由免疫浊度测试法、乳胶凝集反应、乳胶浊度测试法、红血球凝集反应、颗粒凝集反应等产生的免疫复合聚集物时，可以使用磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、Good缓冲液等作为溶剂，并且其中可以含有反应促进剂如聚乙二醇或者非特异性反应抑制剂。
当通过使其对固相载体敏化来使用抗体时，可以使用由诸如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸盐聚合物、乳胶、明胶、脂质体、微胶囊、红血球、二氧化硅、氧化铝、碳黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性底料等材料制成的颗粒作为固相载体。
用于敏化的方法包括已知的方法如物理吸附、化学结合或其组合。可以用已知方法作为进行测定的方法。例如，在通过光学方法测定的情况下，使样品与抗体反应，或者使样品与用固相载体敏化的抗体反应。然后，通过终点法或速率法测定发射光或散射光。
当在视觉上进行测定时，使样品与用固相载体敏化的抗体在容器中反应，所述容器例如是平板或微滴定板，凝集的状态通过视觉判断。代替视觉测定，可以通过仪器如微量培养板读数装置的仪器进行测定。评价毛发生长促进活性的试剂盒
本发明用于评价测试物质的毛发生长促进活性的试剂盒包括一种单克隆抗体或其片断，其特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原或其片断。特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的单克隆抗体或其片断可以是固定的或标记的形式。
例如，当特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原的本发明的单克隆抗体用作原抗体时，本发明的试剂盒还可以包含用于检测由抗原-抗体反应形成的复合体的二次抗体。除了这些抗体以外，本发明的试剂盒还可以包含各种助剂，使得所述试剂盒可以高效容易地使用。助剂的实例包括在免疫学测定的试剂盒中常用的助剂，如用于溶解固体二次抗体的增溶剂、用于洗涤不溶性载体的洗涤剂、用于在使用酶作为抗体的标记物质时用来测定酶活性的底物、和反应终止剂。本发明的试剂盒还可以包含进行毛发生长促进活性评价的说明书。
通过以下实施例更具体地解释本发明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。
实施例实施例1：文库载体的制备
使用以带有表面蛋白质(侵袭素)(Nakajima等，Gene，260，121-131(2000))的融合形式在大肠杆菌(E.coli)表面上给出约10个氨基酸的肽的载体。使用mutanegenis试剂盒(Takara)除去所有BstXI位点，启动区用PL启动子取代，硫氧还蛋白cDNA的氨基酸2-36连接到侵袭素cDNA的C-端位点。另外，连接的部分硫氧还蛋白cDNA的第33个半胱氨酸到第36个半胱氨酸区用TCCGGTCCGCCATCACGTTGGCTCGAGCCAGGATATTGGGGTCCGTGA(SEQ IDNO：125)取代，以制备载体(指定为pALinvThio4)。
把双链接cDNA编码的HA表位以移码形式(in frame)插入该载体的BstXI位，并把所得的载体引入到E.coli GI724中。所得的菌株根据与以下实施例3中的第一和第二次筛选类似的方法检验。结果，发现该大肠杆菌(E.coli)菌株结合到anti-HA抗体上。这表明作为模型插入的HA表位的肽存在于细胞的表面上。实施例2：在大肠杆菌表面上存在的文库的制备
合成以下的寡核苷酸。1.5’CTG CAG AAC CAT CAC GTT GG  agT  atT  gaG  caG  agT  tgT  gaT  caG  gaTgaG C CAG GAT ATT GGA TGC AT3’(SEQ ID NO：126)2.5’CTGCAGAAC CATCAC GTT GG  atT  atT  gaG  caG  atT  tgT  gaT  caG  gaT gaG C CAG GAT ATT GGA TGC AT3’(SEQ ID NO：127)其中， T、 G、 a、 t、 g和 c表示以下意义：T∶T∶G＝17∶3G∶T∶G＝3∶17a∶A∶T∶G∶C＝7∶1∶1∶1t∶A∶T∶G∶C＝1∶7∶1∶1g∶A∶T∶G∶C＝1∶1∶7∶1c∶A∶T∶G∶C＝1∶1∶1∶7
把等量的以上寡核苷酸1和2混合，并退火到引物(5’ATG CAT CCAATA TCC TGG 3’)(SEQ ID NO：128)。该DNA用克列诺片断延长，并用限制酶BstXI切开，并且用聚丙烯酰胺凝胶收集希望的带。所收集的DNA编码一组在SIEQSCDQDE(SED ID NO：142)中有一部分氨基酸突变的肽。
载体pALinvThio4用BstX切割，并用BAP(细菌碱性磷酸酯酶)处理，然后连接到上面获得的文库片断上。
所得的载体被转变成E.coli GI724(150μl)的电感受态细胞，以制备被指定为EPM pep7类肽文库(3.8×106)的转变体。图3表示在该文库中存在的理论值百分数。
把EPM pep7类肽文库的等分试样涂敷在LB琼脂板上，并且随机挑选100个群体，并把质粒分别收集和分析。结果发现约30％的群体给出其中在氨基酸序列SIEQSCDQDE(其含有鼠的pep7区)中1-3个氨基酸被取代的肽。另外，作为上面制备的文库含量的分析结果，发现被取代的氨基酸的位置和种类是随机的(图2)。图2表示分析100个克隆的分析结果。实施例3：第一次和第二次筛选
通过加入100μg/ml色氨酸把EPM pep7类肽文库(文库大小为3.6×106)在30℃诱导表达6小时，并加入到预先涂敷10μg兔的抗表皮形态发生素抗体(中和表皮形态发生素的多克隆抗体；Hirai等人，1998J.Cell.Biol.，140：159-169)的35mm皿中，并用阻断溶液(1％脱脂乳、150mM NaCl、1％α-甲基甘露糖苷在IMC介质中)阻断，静置1小时。向其中加入洗涤液(1％α-甲基甘露糖苷在IMC介质中)，并以100转/分洗涤所述皿5分钟。重复洗涤5次。在洗涤后，收集束缚克隆。把束缚克隆的等分试样平皿接种(plated)，用于测定回收率，并把其余的在30℃在IMC介质(由Invitrogen获得；用于培养大肠杆菌的介质，其不含色氨酸)中培养一整夜。
通过用与上面相同的方法加入色氨酸诱导表达在培养一整夜后的第一次筛选的克隆。第二次筛选所用的皿涂敷10μg大鼠H12抗体，该抗体用EPM pep7亲合提纯，并且用含有每种25μg没有毛发促进生长活性(见下文)的重组体H1-72、H1-73Δ、H1-78、H1-79(共100μg)或每种4μg的其可变区的合成肽(共16μg)的阻断溶液阻断。用与第一次筛选相同的方法，把其表达被诱导的克隆加入到皿中，并洗涤，然后，收集束缚克隆。把束缚克隆的等分试样平皿接种(plated)，用于测定回收率，并把其余的在30℃在IMC介质中培养一整夜。
在第一次和第二次筛选中，其中引入了pALinvThio4(不含插入片断)的载体的细胞用作对照。由平皿接种法表明，与使用该文库的情况相比，在上述条件下淘选的收集率对于第一次筛选小于1/100，对于第二次筛选小于1/50，这样获得的文库的大小为2.5×105。
Figure A0215063900671
引物①含有H1的ORF的起始密码子和EcoR1引物②设计了6种来改变H1的pep7区，含有终止密码子和SmaIR73Δ  GGG CCC GGG TCA CTG ATC GCT CTG GTC ACA AAT AGA CTT CAG CTT GCC CCG GAT CCT GTT(SEQ ID NO：129)R75Δ  GGG CCC GGG TCA CTG ATC GCT ACA CTG GTC AAT AGA CTT CAG CTT GCC CCG GAT CCT GTT(SEQ ID NO：130)R72    GGG CCC GGG TCA CTC GTC CTG ATC GCT CTG GTC AAT ACA AGA CTT CAG CTT GCC CCG GAT CCT GTT(SEO ID NO：131)R74    GGG CCC GGG TCA CTC GTC CTG ATC GCT CTG ACA GTC AAT AGA CTT CAG CTT GCC CCG GAT CCT GTT(SEQ ID NO：132)R78    GGG CCC GGG TCA CTC GTC ACA CTG ATC GCT CTG GTC AAT AGA CTT CAG CTT GCC CCG GAT CCT GTT(SEQ ID NO：133)R79    GGG CCC GGG TCA CTC ACA GTC CTG ATC GCT CTG GTC AAT AGA CTT CAG CTT GCC CCG GAT CCT GTT(SEQ ID NO：134)PCR循环    94℃    30s        PCR→用限制酶处理(EcoRI，SmaI)
       70℃    30s
       72℃    2分钟      载体：pET-3被改变且His-tag被整合
               循环    5次      类似的限制酶处理
       94℃    30s                  →脱磷酸处理
       75℃    30s              PCR产物+载体的连接→转化
       72℃    2分钟                                 →到LB+Amp的板上
               循环    20次
       72℃    7分钟
       4℃     ∞实施例4：重组到大规模制备的载体中
①用HindIII切割高活性重组体表皮形态发生素的大规模制备的载体，SRαEPM(Hirai等人，(1994)Eur.J.Biochem.，225，1133-1139)，两端用T4聚合酶钝化。该载体经过自连接，以除去HindIII限制位点。
②使用突变引入试剂盒(TAKARA)用从GCTT(HindIII的限制位点)来取代直接位于编码表皮形态发生素的SIEQSCDQDE的序列上游的AAGCTG，所述表皮形态发生素被插入在以上①中获得的载体中。
③由具有HindIII限制位点的形式的PCR制备编码直接位于鼠表皮形态发生素的SIEQSCDQDE下游的“12个片断的NGN到C端(Eur.J.Biochem，225，1133-1139)”的cDNA，并且把该cDNA插入在上述②中制备的载体的HindIII位点中。插入载体中的表皮形态发生素由12个片断组成并且缺少肽7，并且其中添加了HindIII限制位点。
④通过化学合成每个链，然后在70-50℃使它们退火来制备AgCTTCCATCACgTTggTCTAgACCAggATATTggA(SEQ ID NO：135)
AggTAgTgCAACCAgATCTggTCCTATAACCTTCgA(SEQ ID NO：136)，并引入到在以上③中制备的HindIII位点中，以便把HindIII限制位点转换成HindIII-BstXI-XbaI-BstXI-HindIII。
⑤从第二次筛选获得的大肠杆菌组(在30℃培养一整夜)中收集一组质粒，并把通过在BstXI位点切割获得的cDNA编码的pep7类肽组插入到在以上④中制备的载体的BstXI XbaI BstX位点中。
⑥把所得的质粒组的等分样品克隆到E.coli HB101中，并且考查15种克隆。结果，发现所有的克隆具有编码表皮形态发生素12片断的序列，其中，在pep7区中的一个或多个氨基酸用另一个氨基酸取代。
⑦在以上⑤中获得的质粒组用NspV/PvuII处理，以获得一组含有突变的pep7的表皮形态发生素片断的基因。把这些片断插入到载体pet12(Hirai等，J.Cell.Biol.，2001，153，785-794)的NspV-SmaI位点中，用来大规模制备在N-端有6个His的表皮形态发生素12片断(称为大规模制备的文库)。
⑧把如此获得的质粒组的等分样品在E.coli BL21中克隆，并且考查每种克隆的蛋白质表达和内部序列。结果，所有的克隆呈现由IPTG诱导的蛋白质表达，并且证实了其中pep7区用不同的肽取代并且缺少从C端到H12的PvuII位点的区域的表皮形态发生素片断。构造了用于大规模表达的2.5×105的文库。实施例5：pep7-类肽的制备
①把用于大规模制备的文库引入到E.coli BL-21中，并且涂敷在LB-琼脂糖(含有腺苷一磷酸(Amp))平板上。次日，把该文库从所述平板上克隆到含有LB的96孔板的每个加样孔中，同时，制备主平板。把这些平板在32℃培养一整夜，然后用1mM(最终浓度)的IPTG处理2小时。然后，以根据Qiagen手册用Ni-NTA(Qiagen)束缚的形式收集每个加样孔中的His-tag蛋白质。下面公开细节。
把平板以2000转/分离心15分钟，把介质废弃。向每个加样孔中加入50μl的2mg/ml溶菌酶，把该平板培养1小时。用液氮冷冻并在室温下熔化的操作重复两次。用DNAse处理这些加样孔，并用150μl的8M尿素(pH为8.0)溶解所有的蛋白质。加入用8M尿素平衡的Ni-NTA凝胶(Qiagen)，并把这些加样孔培养30分钟。把所述平板在2000转/分离心1分钟，并废弃上层清液。把这些加样孔用PBS洗涤两次，用水洗一次。
②向每个加样孔中加入胰蛋白酶(序列级；Promega)，最终浓度为1μl/ml，并把该平板在37℃培养一夜。
③在把所述平板在95℃处理5分钟后，收集溶液，向其中加入等量的2×DH10(用10％FCS补充的DMEM和Ham12(Gibco)的混合介质)来制备样品。通过用液相色谱法分析，证实了在样品之间的区别是pep7区的突变。同样，使用主平板分析每个克隆的序列。实施例6：对新毛囊特异性的单克隆抗体的制备
从生长期(48-50天)的B57BL小鼠的皮肤上切下毛发，并在含有8M尿素、2％SDS和100mM DTT的PBS中在37℃培养一夜，从而提取蛋白质。另外，用立体显微镜收集B57BL小鼠的须毛囊(这里，毛球部分用颜料染色；生长期)，并在PBS中均化。混合以上2种样品(0.5mg的蛋白质重量)，并且与等量的完全佐剂混合来制备微团。
把上面获得的微团(0.2mg)皮下(3个位置)给药到用于免疫的大鼠(Wister)。在第一次免疫后，用与以上相同的方法进行强化。2周后，用与以上相同的方法进行第二次强化。在第二次强化后的第三天，从免疫的大鼠中取出脾，由筛孔收集血细胞。在这些血细胞中含有抗体产生细胞。使用聚乙二醇1500，把所有的以上收集的血细胞与小鼠骨髓瘤P3U1混合，并且悬浮在Dulbecco/HumF12混合介质中。在96孔板的每个加样孔中培养100μl的培养液。次日，向每个加样孔中加入等量(100μl)HAT介质(Sigma)。在2天后，在吸气条件下从每个加样孔中除去150μl介质，并向每个加样孔中加入150μl新介质。把96孔平板放在37℃的CO2培养箱中。
通过超声处理，把B57BL小鼠的生长须毛的毛囊溶解在8M尿素中。把硝化纤维素膜在该溶液中浸渍5分钟，并用PBS良好洗涤。装有上述薄膜的Biorad斑点印迹装置用来进行杂交瘤细胞上层清液的第一次筛选，所述上层清液从以上的96孔平板的每个加样孔中回收。首先，把以上制备的硝化纤维素膜用含有5％脱脂乳(TBST)的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液阻断，然后向每个加样孔中加入100μl杂交瘤细胞上层清液，这里，硝化纤维素膜构成底部。在培养1小时后，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤这些加样孔，并加入第二种抗体，辣根过氧化物酶标记的anti-rat IgG(1μg/ml TBST)。加入ECL剂(AmershamPharmacia)，这是一种显色底料，并且通过显色检测选择与生长须毛毛囊反应的共50种抗体(第一次筛选)。
在以上第一次筛选中所选择的50种抗体中，选择与生长须毛毛囊的冷冻部分(10μm)特异性反应的抗体(第二次筛选)。具体地，把生长须毛毛囊的冷冻部分放在载玻片上，向其中加入在第一次筛选中所选择的杂交瘤细胞上层清液，并用第二种抗体显色。更具体地，通过Cryosdat(Bright)制备的生长须毛毛囊的冷冻部分用甲醇在-20℃处理，并用TBST阻断1小时，然后与所述杂交瘤细胞上层清液反应1小时。该样品用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤，并与FITC标记的anti-rat IgG(100μg/ml在TBST)反应。用三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤该样品，并用盖玻片覆盖。在荧光显微镜下进行观察。
作为第二次筛分的结果，选择了8种抗体。这些抗体不与表皮反应，并且特异性地与毛囊反应。这8种抗体通过有限稀释法克隆。
使用生长须毛毛囊(生长期)或休止期(毛发生长终止期)须毛毛囊作为样品，并使用得自14天胎儿小鼠的有毛囊皮肤的玻片样品，用蛋白质印迹法考查这8种抗体的反应性。结果，以与生长须毛毛囊和塑性毛囊(plastic follicle)(新毛囊)特异性地反应并且不与休止期须毛毛囊反应的单克隆抗体形式获得mAb27。产生单克隆抗体mAb27的杂交瘤细胞用Patent and Bio-Resource Center of NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology(Chuo-6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)在2001年11月2日以FERM P-18578的沉积号沉积。
图12(A)表示用蛋白质印迹法检测mAb27抗原的结果。从左到右的每个电泳道表示分析结果，其中，从须毛的生长期和终止期和背部皮肤的生长期和终止期提取的每种蛋白质经过电泳和蛋白质印迹，然后使用本发明的单克隆抗体mAb27检测抗原。
具体地，通过在8M尿素中用超声处理研磨须毛毛囊获得的溶液用作没有稀释的抗原。在SDS-PAGE(丙烯酰胺4-20％)中在30mA的恒定电流条件下进行电泳。电泳缓冲液是14.4g/L甘氨酸、1g/L的Tris和1g/L的SDS。在电泳后，把样品转移到PVDF膜上，并在含有5％脱脂乳(TBST)的Tris缓冲液中培养1小时，然后，使该样品与mAb27(100μl杂交瘤细胞上层清液)反应1小时，用TBS良好地洗涤，并与作为第二种抗体的过氧化物酶标记的anti-ratIgG(Amersham)(以1mg/ml溶解在TBST中)反应。在良好洗涤后，使用ECL试剂盒(Amersham)测定mAb27的反应强度。
结果，发现本发明的单克隆抗体mAb27检测了在抗原样品中特异性地存在的约220kDa的抗原。
图12(B)表示使用成人毛发的历史染色结果，图12(C)表示第14天的小鼠胚胎的上颌骨。过程与在实施例1中抗体的第二次筛选过程相同。
结果，发现在使用本发明的单克隆抗体mAb27的情况下，在成人毛发中，表皮不染色，仅仅发球被染色，并且在第14天的小鼠胚胎中，表皮不染色并且仅仅毛囊被染色。
从图12(A)-(C)中所示的结果，证明了本发明的单克隆抗体mAb27特异性地识别在新毛囊中存在的约220kDa的抗原。实施例7：毛发生长促进活性的评价
用小镊子剥掉ICR小鼠(怀孕14天)的背部皮肤，并收集在HCMF中。把所收集的皮肤转移到平板上，并使用带夹子的2个刀切成碎片。把切碎的皮肤转移到15ml离心管中，并在1000转/分离心1秒钟。向沉淀物中加入50μl的DNase(2mg/ml)，并使该混合物均化。加入10ml的DH10介质并离心该混合物。向沉淀物中加入10ml的DH10介质，并使该混合物悬浮。在使用顶端(tip)使该混合物悬浮均化后，在每个96孔平板上涂敷100μl的该悬浮液。
向在96孔平板上的悬浮液上，分别加入50μl在以上的实施例5③中获得的每个样品，并使该平板在CO2培养箱中在37℃培养2天。在培养过程中，在加样孔之间的间隙中充满PBS以防干燥，并密封所述平板。在培养后，加入100μl的8M尿素。
把已经在TBS中浸渍的纸和硝化纤维素膜放在由BioRad生产的斑点印迹装置(96个加样孔)上。这样的设备准备了3套。把10μl涂敷到两个膜上，其中一个膜(试验对象A)用于单克隆抗体mAb27，另一个膜用于抗E钙粘着蛋白(anti-E-cadherin)(TAKARA)，其检测所有的上皮细胞。在通过吸收把该溶液印迹到膜中以后，取出所述膜并在室温干燥10分钟。把所述膜用TBS洗涤一次，并用脱脂乳在室温下阻断1小时。然后，把所述膜用原抗体，单克隆抗体mAb27(杂交瘤细胞的培养上层清液稀释到1/30)或抗E钙粘着蛋白(1/2000稀释的，TAKARA)，在室温培养1小时。把该膜用TBS洗涤两次，每次10分钟。然后使过氧化物酶标记的anti-rat IgG或过氧化物酶标记的抗兔IgG(anti-rabbi IgG)(Amersham)(1/1000稀释的)反应作为第二种抗体，并把所述膜用TBS洗涤两次，每次10分钟。使用ECL plus(Amersham)检测反应强度。实施例8：数据分析
使用Fuji Photo Film荧光图像分析仪(LAS-1000plus)摄取用ECL检测的那些的autora-film。由试验对象A测定单克隆抗体mAb27的抗原量，作为新毛囊诱导的指标，由试验对象B测定E-钙粘着蛋白的量用作表皮细胞总量的指标。
由试验对象A和试验对象B所获得的测定量的比例用计算机分析，并分析每个表皮细胞的毛发生长诱导程度。
作为总共960个样品的分析结果，获得了其中来自试验对象A的测定量高于来自试验对象B的测定量的样品(即具有更高诱导新毛囊能力的样品)。在这些样品中的65个样品的pep7类序列在本文中表示在表I中。这65种克隆的氨基酸序列的结构要求也表示在表II中。
来自试验对象A的测定量高于来自试验对象B的测定量的样品表示在表III中。这些样品的氨基酸序列为：Tyr Asn Glu Gln Ser Cys Asp Arg Glu Glu(SEQ ID NO：17)Thr Ser Asp Gln Cys Cys Asp Pro Asp Lys(SEQ ID NO：75)Pro Ser Glu Gln Ser Cys Ala Glu Glu Glu(SEQ ID NO：61)Ser Asn Glu Gln Ser Cys Ala Val Ala Glu(SEQ ID NO：29)Thr Thr Glu Gln Ser Cys Ala Val Asp Glu(SEQ ID NO：63)Ser Ile Glu Gln Ser Cys Gly Gln His Glu(SEQ ID NO：80)Ser Ser Ala Gln Ser Cys Leu Gln Asp Thr(SEQ ID NO：48)Tyr Ile Glu Gln Tyr Cys Asp Gln Asp Glu(SEQ ID NO：64)Thr Ile Trp Gln Ser Cys Asp Gln Glu Glu(SEQ ID NO：32)
这些肽的活性约比来自鼠的表皮形态发生素的pep7区的氨基酸序列Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp的肽高约3倍。
在这65种克隆中，存在具有氨基酸序列为Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的7个氨基酸残基的肽。所以，这7个氨基酸残基被认为是毛发生长促进活性所必需的区域。
在这65种克隆中，Cys不被另一种氨基酸取代，所以，Cys残基在本发明的寡肽中是重要的。包含Cys氨基酸残基的单体能够在合适条件下二聚。
在这65种克隆中，Glu-Gln-Ser-Cys-Asp(SEQ ID NO：108)的氨基酸序列被较高程度保留(即保留在2 3种克隆中)，并且Glu-Gln-Ser-Cys(SEQ ID NO：109)被进一步高度保留(即保留在30种克隆中)。
在实施例中，具有高诱导新毛囊能力的65种肽克隆从960个样品中获得。在如实施例3中所示的第二次筛选中获得2.5×105种肽克隆，并且可以认为其中包含具有相同能力的除了以上65种克隆以外的肽。在一些实例中，在7个氨基酸残基中的3个氨基酸残基可以被取代。如果对于各个氨基酸的候选氨基酸由8种组成，组合的总数估计为7C3×83＝17920。在2.5×105的文库中17920种克隆的比例为7.1％。另一方面，在960个样品的群中65种克隆的比例为6.8％。上述假定与本发明的实施例的结果良好地一致(在筛选中为阳性的肽的比例)。
预计基于表II(用单字母氨基酸码表示)中所提供序列的以下寡肽会表现出毛发生长促进活性。SIDQSCD(SEQ ID NO：110)SIEESCD(SEQ ID NO：111)SIEQACD(SEQ ID NO：112)SIEQSCR(SEQ ID NO：113)SIEQFCH(SEQ ID NO：114)SFDQSCD(SEQ ID NO：115)SFEESCD(SEQ ID NO：116)SFEQACD(SEQ ID NO：117)SFEQSCR(SEQ ID NO：118)SFEQFCH(SEQ ID NO：119)实施例9：改变的寡肽
使用Fmoc通过固相法合成由以下氨基酸序列代表的寡肽(A)、(B)、(C)和(D)。A.Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ ID NO：120)B.Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ ID NO：121)C.Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ ID NO：122)D.Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln(SEQ ID NO：83)
使用交联剂(双马来酰亚胺己烷，商品名BMH，由Pierce生产)二聚所合成的寡肽，来制备同型二聚物。具体地，根据该交联剂的说明进行合成。
所得的反应混合物不仅包含同型二聚物寡肽，而且包含其上束缚交联剂的单体寡肽。
用于以上相同的方法，等量使用寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp和Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp(SEQ ID NO：4)来制备异型二聚物寡肽。所得的反应混合物不仅包含异型二聚物寡肽，而且包含其上束缚交联剂的单体寡肽。
每种合成寡肽(A)、(B)和(C)由高性能液相色谱(HPLC)来提纯，并由HPLC和Mass证明纯度为90％或更高。
HPLC的条件描述如下。柱：ODS-UG3(Monomeric ODS，Normura Kagaku)，内径1.0mm，长100mm测定：室温(25℃)检测：UV 214nm，280nm冲洗溶剂：溶剂A和溶剂B梯度(溶剂A：0.1％三氟乙酸；溶剂B：90％乙腈/0.1％三氟乙酸，线性浓度梯度为5分钟以后(溶剂B：0％)到55分钟(溶剂B：55％)流量：75ml/ml寡肽的保留时间21.52分钟(二聚物)，20.59分钟(单体)实施例10：改变的寡肽的毛发生长促进活性的评价
通过立体显微镜收集ICR小鼠(怀孕12天)的上颌骨的皮肤组织，从5只小鼠分别收集左侧和右侧。把5块来自5只小鼠的每一块如此收集的左侧(用于对比)和右侧(用于测试寡肽)的皮肤分别放在1个核孔膜(孔径8微米；直径13mm)，并且固定使得在用立体显微镜观察样品时外面向上翻转。向24孔皿的2个加样孔中加入500μ含有1％BSA的Dulbecco’s MEM/Ham F12介质。在溶剂(PBS)中的测试寡肽在1个加样孔中的最终浓度为20μM，并且以相同的量向其它加样孔中加入溶剂(PBS)作为对照。在实施例9中合成的寡肽用作测试寡肽。
把其上有皮肤组织的每个膜投放在上述加样孔中的溶液上，并在37℃培养6天。从该膜回收5块组织到100μl的SDS样品缓冲液(SDS0.02g/ml、甘油0.2g/ml，pH为6.8)，并通过超声处理溶解。对照膜也类似地进行处理。由这样的处理获得的溶液经过在SDS-PAGE(丙烯酰胺4-20％)中的电泳(35mA，1.5小时)，并转移到PVDF膜上，在含有5％脱脂乳(TBST)的Tris缓冲液中培养1小时。所述膜与实施例2中获得的mAb27(10μg/ml在TBST中)反应1小时，并用TBS良好洗涤。然后，使过氧化物酶标记的ant-rat IgG(Amersham)(在TBST中1/1000稀释的)反应作为第二种抗体，并且所述膜用TBS良好洗涤。使用ECL试剂盒(Amersham)考查mAb27的反应强度。
所得的结果表示在图4和图5中。
在图4的每个电泳泳道中的测试寡肽如下。
左起第一个：Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(A)(SEQ ID NO：120)
左起第二个：对照
左起第三个：Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(B)(SEQ ID NO：121)
左起第四个：对照
左起第五个：Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(C)(SEQ ID NO：122)
左起第六个：对照
从图4的结果可以理解，在左起第一个、第三个和第五个电泳泳道中的带分别比在左起第二个、第四个和第六个电泳泳道中的带更强。这些结果表明，测试寡肽(A)、(B)和(C)具有毛发生长促进活性。
在图5的每个电泳泳道中的测试寡肽如下。
左起第一个：通过在其处理后混合寡肽(A)和寡肽(B)获得的混合物。
左起第二个：对照
左起第三个：通过在其混合后处理寡肽(A)和寡肽(B)获得的混合物。
左起第四个：对照
左起第五个：Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln(D)(SEQ IDNO：83)(在(b)的C端去除两个氨基酸)。
左起第六个：对照
从图5的结果可以理解，在通过其处理后混合寡肽(A)和寡肽(B)获得的混合物和在其混合后处理寡肽(A)和寡肽(B)获得的混合物中观察了类似的活性。所以，证明了异型二聚物也具有毛发生长促进活性。还发现在C端缺失2个氨基酸的寡肽(D)具有毛发生长促进活性。实施例11
在以下寡肽中的半胱氨酸残基向上游移动1、2或3个氨基酸的各种寡肽与实施例9中一样合成，并且用与以上相同的方法评价毛发生长促进活性：Ser Ile Asp Gln Ser Cys Asp(SEQ ID NO：110)Ser Ile Glu Glu Ser Cys Asp(SEQ ID NO：111)Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp(SEQ ID NO：112)Ser Ile Glu Gln Ser Cys Arg(SEQ ID NO：113)Ser Ile Glu Gln Phe Cys His(SEQ ID NO：114)Ser Phe Asp Gln Ser Cys Asp(SEQ ID NO：115)Ser Phe Glu Glu Ser Cys Asp(SEQ ID NO：116)Ser Phe Glu Gln Ala Cys Asp(SEQ ID NO：117)Ser Phe Glu Gln Ser Cys Arg(SEQ ID NO：118)Ser Phe Glu Gln Phe Cys His(SEQ ID NO：119)
结果，观察到了活性。即发现其中Cys位置改变的Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp(SEQ ID NO：4)、Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp(SEQ ID NO：5)或Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp(SEQ IDNO：6)氨基酸序列呈现出毛发生长促进活性。在这些肽中的每个氨基酸也可以象在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的情况下一样被取代。例如，氨基酸序列Ser Asn Glu Pro Cys Ser Asp Gln Gly Gly(SEQ IDNO：24)的肽可以通过在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp(SEQ ID NO：4)氨基酸序列的肽中分别用Asn和Pro取代Ile和Gln获得，并且可以认为，具有这种取代的肽将呈现毛发生长促进活性，与在本说明书中所表示的情况一样。实施例12：修饰寡肽的制备
通过使用Fmoc的固相法合成由以下氨基酸序列代表的寡肽。
Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu(包含鼠的pep7区)。然后，根据该交联剂的说明，使合成的寡肽与交联剂(双马来酰亚胺己烷，商品名BMH，由Pierce生产)反应。以各种寡肽与交联剂的比例进行反应。图10A-10C表示通过用凝胶渗透柱(AmershamPharmacia，SuperdexTM肽PC 3.2/30，250mM NaCl，20mN磷酸钠缓冲液(pH为7.2)用作显影液)分析寡肽和交联剂的反应产物获得的结果。
在图10中的上图(A)表示通过使寡肽与双马来酰亚胺以7∶3的比例反应并用液相色谱法(Amersham Pharmacia，Smart System)分离获得的结果。峰(a)表示肽二聚物，峰(b)表示有反应性马来酰亚胺的肽二聚物。峰(a)对应流出1.2ml的时间，峰(b)对应流出1.4ml的时间。
图10中的中间图(B)表示通过使寡肽与双马来酰亚胺以2∶5的比例反应获得的结果。峰(a)表示肽二聚物，峰(b)表示有反应性马来酰亚胺的肽二聚物。由于双马来酰亚胺己烷过量存在，有反应性马来酰亚胺的肽二聚物(b)以比肽二聚物(a)更大的量形成。
图10中的下图(C)表示通过对以上(B)(即使寡肽与双马来酰亚胺以2∶5的比例反应获得的样品)过量地加入未修饰的寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Glu获得的样品的结果。从其中峰(b)减小且峰(a)增大的结果可以理解，一部分所加入的(c)与(b)反应形成二聚物(a)。实施例13：各种寡肽的毛发生长促进活性的评价(1)各种寡肽的制备
通过使用Fmoc的固相法合成由以下氨基酸序列代表的寡肽(A)和(B)(下文中，这些被称为未修饰的寡肽)。(A)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ ID NO：142)(B)Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Lys-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ ID NO：123)
使所合成的寡肽(A)与交联剂(双马来酰亚胺己烷，商品名BMH，由Pierce生产)根据该交联剂的说明反应。同时，使合成寡肽(B)与交联剂DSG(戊二酸双琥珀酰亚胺酯)反应。使用馏分收集器，把其上束缚该交联剂的单体分馏并收集。(2)毛发生长促进活性的评价
通过立体显微镜收集ICR小鼠(怀孕12天)的上颌骨的皮肤组织，从5只小鼠分别回收左侧和右侧。把5块来自5只小鼠的每一块如此收集的左侧(用于对比)和右侧(用于测试寡肽)的皮肤分别放在1个核孔膜(孔径8微米；直径13mm)，并且固定使得在用立体显微镜观察样品时外面向上翻转。向24孔皿的2个加样孔中加入500μl含有1％BSA的Dulbecco’s MEM/Ham F12介质。加入在溶剂(PBS)中的测试寡肽，在1个加样孔中的最终浓度为20μM，并且以相同的量向其它加样孔中加入溶剂(PBS)作为对照。在以上(1)中合成的未修饰寡肽和修饰寡肽用作测试寡肽。
把其上有皮肤组织的每个膜投放在上述加样孔中的溶液上，并在37℃培养6天。从该膜回收5块组织到100μl的SDS样品缓冲液(SDS0.02g/ml、甘油0.2g/ml，pH为6.8)中，并通过超声处理溶解。对照膜也类似地进行处理。由这样的处理获得的溶液经过在SDS-PAGE(丙烯酰胺4-20％)中的电泳(35mA，1.5小时)，并转移到PVDF膜上，在含有5％脱脂乳(TBST)的Tris缓冲液中培养1小时。所述膜与实施例6中获得的mAb27(10μg/ml在TBST中)反应1小时，并用TBS良好洗涤。然后，使过氧化物酶标记的ant-rat IgG(Amersham)(在TBST中1/1000稀释的)作为第二种抗体反应，并且所述膜用TBS良好洗涤。使用ECL试剂盒(Amersham)考查mAb27的反应强度。
所得结果表示在图11中。
在图11的每个电泳泳道中的测试寡肽如下。
左起第一个：未修饰的寡肽(A)
左起第二个：BMH修饰的寡肽(A)
左起第三个：未修饰的寡肽(B)
左起第四个：DSG修饰的寡肽(B)
从图11的结果可以理解，在左起第二个和第四个电泳泳道中(修饰的寡肽)的带分别比左起第一个和左起第三个电泳泳道中(未修饰的寡肽)的带更强。这些结果表明，修饰的寡肽有毛发生长促进活性，尤其是比相应的未修饰寡肽的毛发生长促进活性更强。
而且，通过使用具有改变的氨基酸序列和各种交联剂的寡肽，用与以上相同的方法评价毛发生长促进活性。
结果表明，用双马来酰亚胺(BMH)、1，4-双马来酰亚胺丁烷(BMB)或双马来酰亚胺乙烷(BMOE)修饰Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu、Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ IDNO：122)或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln获得的所有修饰寡肽呈现出毛发生长促进活性。实施例14：寡肽制备
通过使用Fmoc的固相法合成有以下氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu(包含鼠的pep7区)。同时，制备在以上序列的N端由生物素修饰的修饰寡肽(本文称为“b7”)。
用高性能液相色谱法(HPLC)提纯合成的寡肽，并且通过HPLC和Mass证实，纯度为90％或更高。
HPLC的条件描述如下。柱：ODS-UG3(Monomeric ODS，Normura Kagaku)，内径1.0mm，长100mm测定：室温(25℃)检测：UV 214nm，280nm冲洗溶剂：溶剂A和溶剂B的梯度(溶剂A：0.1％三氟乙酸；溶剂B：90％乙腈/0.1％三氟乙酸，线性浓度梯度为5分钟以后(溶剂B：0％)到55分钟(溶剂B：55％)流量：75ml/ml寡肽的保留时间Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu：21.52分钟(二聚物)，20.59分钟(单体)b7；29.89分钟(单体)，32.85分钟(二聚物)
把以上制备的寡肽以0.3mg/ml溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，向该溶液中加入等量的100％乙醇，以制备50％乙醇/PBS溶液(0.15mg/ml)。该寡肽的交联进行如下。在搅拌条件下，向1mg/ml在PBS中的寡肽溶液(5ml)中缓慢加入溶解在二甲硫醚中的BMH(65μl)，最终浓度为33μg/μl，并使该混合物在4℃反应一夜。向该溶液中加入6.6ml的PBS和盐酸半胱氨酸以5 ml溶解在PBS中的最终浓度为5mg/ml的溶液并混合，以制备最终浓度为0.3mg/ml的S-S桥接的寡肽(称为“ss7”)溶液(含有其上束缚交联剂的单体，以及二聚物)。在上面公开的条件下进行的HPLC的保留时间为33.01分钟。通过加入反应物以相同的方式反应制备一种对比溶液，但是使用PBS代替寡肽溶液。交联寡肽的溶液还加入相同体积的乙醇，以制备最终浓度为0.15mg/ml的50％乙醇/PBS溶液。这种S-S桥接寡肽用来在实施例15和实施例16中评价毛发生长促进活性。实施例15：通过体内法评价毛发生长促进活性
已知C3H和C57BL/6小鼠在出生后的第45天到第95天维持毛发生长终止期约50天。基于皮肤颜色变化，即从毛发生长终止期的粉红色变成生长期中的灰色或黑色，容易判断其毛发周期。评价施用本发明的寡肽是否可以促进从毛发生长终止期到生长期的转变的试验使用小鼠进行。购买7周大(48-50天大，雌性)的C57BL/6小鼠并用动物电动剪毛机仔细剃掉背部(约3×2.5cm2)的毛发，以便不伤到皮肤，由皮肤颜色证实毛发周期是毛发生长终止期。把以上制备的寡肽溶液施用到每组5只小鼠，每天1次并且每周5天，用量为0.2ml，直至从试验开始到第38天。使用没有针的注射器进行施用。把其N端被生物素化的二肽(Ile-Lys)和三肽(Glu-Ile-Lys)混合，然后，用交联剂加成，以制备对比溶液。
多人(两人)用肉眼每周两次观察这些小鼠来进行评价，以剃除毛发的区域为基准，根据毛发恢复面积的比例，给出6级的分数。同时，拍摄照片。毛发生长分数评价如下。首先，根据在毛发剃除出区域中皮肤颜色变灰或黑的区域的比例，给出以下分数；0-20％：1，20-40％：2，40-60％：3，60-80％：4，80-100％：5。每组中的以上分数的总和确定为毛发生长分数。对于进行判断的每个人来说，每组的毛发生长分数的最大值为50，由于由两人进行判断，所以，毛发生长分数的最大值为100。在其中施用S-S桥接的寡肽(含有其上束缚交联剂的单体，以及二聚物)和生物素化的寡肽的组中，向生长期的转变比对比组早7天或更多，在直至毛发几乎完全生长和恢复之前的任何时候促进了毛发恢复。在其中使用生物素化寡肽的组中，直至从试验开始约30天，促进了毛发恢复，与对照组相比，类似于S-S桥接组。结果表示在图6和7中。如这些结果所示，由氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu代表的寡肽聚有毛发生长促进活性。实施例16：使用本发明的单克隆抗体评价毛发生长促进活性
通过立体显微镜收集ICR小鼠(怀孕12天)的上颌骨的皮肤组织，从5只小鼠分别回收左侧和右侧。把5块来自5只小鼠的每一块如此收集的左侧(用于对比)和右侧(用于测试寡肽)的皮肤分别放在1个核孔膜(孔径8微米；直径13mm)，并且固定使得在用立体显微镜观察样品时外面向上翻转。向24孔皿的2个加样孔中加入500μl含有1％BSA的Dulbecco’s MEM/Ham F12介质。在溶剂(PBS)中的测试寡肽加入到1个加样孔中，最终浓度为20μM，并且以相同的量向其它加样孔中加入溶剂(PBS)作为对照。在以上实施例中制备的S-S桥接寡肽用作测试寡肽。
把其上有皮肤组织的每个膜投放在上述加样孔中的溶液上，并在37℃培养6天。从该膜回收5块组织到100μl的SDS样品缓冲液(SDS0.02g/ml、甘油0.2g/ml，pH为6.8)中，并通过超声处理溶解。对照膜也类似地进行处理。由这样的处理获得的溶液经过在SDS-PAGE(丙烯酰胺4-20％)中的电泳(35mA，1.5小时)，并转移到PVDF膜上，在含有5％脱脂乳(TBST)的Tris缓冲液中培养1小时。所述膜与实施例6中获得的mAb27(10μg/ml在TBST中)反应1小时，并用TBS良好洗涤。然后，使过氧化物酶标记的ant-rat IgG(Amersham)(在TBST中1/1000稀释的)作为第二种抗体反应，并且所述膜用TBS良好洗涤。使用ECL试剂盒(Amersham)考查mAb27的反应强度。
所得的结果表示在图13中，
在图13中，左边的电泳泳道表示其中加入在实施例14中制备的S-S桥接寡肽(ss7)的样品的结果，右边的电泳泳道(对比)表示其中仅加入溶剂的样品。从图13中的结果可以理解，在其中加入S-S桥接寡肽(ss7)的样品中检测到比对照样中更强的带。这表明增大了由mAb27识别的抗原的表达量。
本实施例表明，ss7具有毛发生长促进活性。由本实施例可以理解，ss7增大了mAb27抗原的表达量。由这些实施例可以理解，mAb27抗原对毛囊的抗原是特异性的。所以，mAb27抗原的增加被认为是代表毛发生长促进活性的一种指标。即可以通过考查使用mAb27在新毛囊中存在的约220kDa的抗原的表达，可以评价毛发生长促进活性。
本发明的单克隆抗体可以特异性地识别在上皮新毛囊中存在的抗原，并且用于评价毛发生长促进活性。实施例17
通过分别从b7的C端去掉1、2、3、4、或5个氨基酸，然后阻断巯基来合成寡肽b7ΔC1、b7ΔC2、b7ΔC3、b7ΔC4和b7ΔC5。通过从b7的N端去掉1、2或3个氨基酸来合成寡肽b7ΔN1、b7ΔN2和b7ΔN3。b7ΔC1是指寡肽序列(SIEQSCDQD)；b7ΔC2是指寡肽序列(SIEQSCDQ)；b7ΔC3是指寡肽序列(SIEQSCD)；b7ΔC4是指寡肽序列(SIEQSC)；b7ΔC5是指寡肽序列(SIEQS)；b7ΔN1是指寡肽序列(IEQSCDQDE)；b7ΔN2是指寡肽序列(EQSCDQDE)；b7ΔN3是指寡肽序列(QSCDQDE)。合成由氨基酸序列Lys-Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu代表的寡肽bk7(没有巯基的阻断)，其N端用赖氨酸束缚。
把人的角质化细胞(NHEK细胞，Clonetics，得自SankoJyunyaku，Ltd.)在包含30μg/ml BPE、0.1ng/ml人的EGF、5μg/ml胰岛素、0.5μg/ml氢化可的松、50μg/ml庆大霉素和50ng/ml的amphoterin的用于繁殖的介质(Clontics)中培养。把这些细胞以1×104个细胞/ml的浓度重新悬浮在其中从以上的用于繁殖的介质中去除EFG、胰岛素和氢化可的松的介质中，然后把100μl的该悬浮液放在96孔平板的每个加样孔中。在平板培养细胞的同时，向所述悬浮液中加入5μl的1mg/ml寡肽，因此最终浓度为50μg/ml。在培养16-20小时后，用ELISA试剂盒(ENDOGEN)测定培养上层清液中IL-8的量。表IV表示NHEK细胞对IL-8分泌的诱导活性与毛发生长促进活性之间的关系。
表IV
寡肽 IL-8诱导活性 毛发生长活性
b7     ◎     O
交联的b7     ◎     ◎
ss7     ◎     ◎
对比     ×     ×
b7是指b7为SIEQSCDQDE。ssb7是指交联的b7。ss7是指S-S桥接且生物素化的寡肽。
由寡肽b7ΔC1、b7ΔC2、b7ΔC3、b7ΔC4、b7ΔC5、b7ΔN1、b7ΔN2和b7ΔN3对IL-8诱导活性的评价所得的结果表示在图8中。当一种或多种氨基酸从N端缺失后，IL-8的分泌量明显降低，当一种或多种氨基酸从C端缺失后，直至缺失4个氨基酸之前，仍然能保持IL-8的分泌量。当缺失5个氨基酸时，IL-8的分泌量明显减少。由这些结果表明，通过从b7区的C端缺失最多4个氨基酸，或者从N端缺失最多3个氨基酸，预计可以获得几乎与寡肽b7相同的毛发生长促进活性。如图9所示，11-mer寡肽bk7也具有几乎与寡肽b7相同的IL-8诱导活性.实施例18
根据所附手册的说明，使用NHS-生物素或NHC-生物素(Pierce)，使寡肽鼠pep7的N端生物素化。当使用NHS-生物素时，把-O-CO-(CH2)4-(13.5)引入到N端与生物素之间作为隔离物，当使用NHS-LC生物素时，把-O-CO-(CH2)5-NH-CO-(CH2)4-(22.4)引入到在N端与生物素之间作为隔离物。用与实施例17中相同的方法使用这些生物素化的寡肽测定IL-8的分泌量，这些寡肽具有几乎与寡肽b7相同的IL-8诱导活性。这些结果表明，其N端直接生物素化的寡肽具有几乎与其N端通过隔离物生物素化的寡肽相同的毛发生长促进活性，并且与N端没有生物素的b7区域相比，二者都是活性的。

Claims (116)

1.一种具有毛发生长促进活性的长度为约5-104个氨基酸残基的分离的寡肽，其包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2不同，并且与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
2.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸残基：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽不是SEQ ID NO：2，并且与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
3.一种具有毛发生长促进活性的长度为约7-约100个氨基酸残基的分离出的寡肽，其包含下列氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val、Gly、Leu、Ile或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe、Leu、Ala、Pro、Cys或Met的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Lys、Gln、Arg、Ala、Val、Trp、Cys或Asp的氨基酸残基；X4是Gln、Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His、Cys或Lys的氨基酸残基；X5是Ser、Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro、Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Met的氨基酸残基；X6是氨基酸残基Cys；反应性物质束缚的Cys或反应性物质束缚的Lys；和X7是Asp、Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr、Arg或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
4.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7；
X1-X2-X3-X4-X6-X5-X7；
X1-X2-X3-X6-X4-X5-X7；或
X1-X2-X6-X3-X4-X5-X7；其中，X1是Ser、Tyr、Thr或Pro的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X2是Ile、Asn、Thr或Ser的氨基酸残基，或者从所述寡肽中缺失；X3是Glu、Ala、Trp或Asp的氨基酸残基；X4是Gln的氨基酸残基；X5是Ser、Cys或Tyr的氨基酸残基；X6是Cys的氨基酸残基；和X7是Asp、Ala、Gly或Leu的氨基酸残基，或从所述寡肽中缺失，条件是该寡肽与寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys不同。
5.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：T/Y-S/N-E-Q-S-C-A(SEQ ID NO：3)。
6.权利要求3的寡肽，其包含以下氨基酸序列：T/Y-S/Y-E-Q-S-C-A(SEQ ID NO：3)。
7.权利要求1的寡肽，其中，在氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys。
8.权利要求1的寡肽，其中，在由Glu-Gln-Ser-Cys-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys。
9.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代。
10.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代。
11.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
12.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代。
13.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第五的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
14.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第五的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代。
15.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代。
16.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代。
17.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代。
18.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第四的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代。
19.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第五的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或leu取代。
20.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Ser-Cys以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
21.权利要求1的寡肽，其包含至少一个氨基酸序列，其中在由氨基酸序列Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys或者不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser。
22.权利要求1的寡肽，其中，在由Glu-Gln-Cys-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser。
23.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代。
24.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代。
25.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
26.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代。
27.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
28.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代。
29.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代。
30.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代。
31.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代。
32.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第四的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代。
33.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
34.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Gln-Cys-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
35.权利要求1的寡肽，其包含至少一个氨基酸序列，其中在由氨基酸序列代表的Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者其中被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser。
36.权利要求1的寡肽，其中，在由Glu-Cys-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代；其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者其中被取代的氨基酸残基不是第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser。
37.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代。
38.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代。
39.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
40.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代。
41.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
42.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代。
43.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代。
44.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代。
45.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第三的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代。
46.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第五的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代。
47.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第三的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
48.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Glu-Cys-Gln-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代的寡肽，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
49.权利要求1的寡肽，其中，在由Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser。
50.权利要求1的寡肽，其中，在由Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中0-2个氨基酸残基被取代，其中，被取代的氨基酸残基不是Cys，或者不是第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser。
51.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用疏水氨基酸残基或中性氨基酸残基取代。
52.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Ala、Tyr、Thr、Pro、Phe、Val或Gly取代。
53.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
54.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第二的Ile用Gly、Asn、Thr、Val、Ser、Phe或Leu取代。
55.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用中性氨基酸残基或疏水氨基酸残基取代。
56.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第六的Ser用Trp、Phe、Thr、Cys、Tyr、Pro或Ala取代。
57.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用亲水氨基酸残基、Gly、Ala或Leu取代。
58.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第七的Asp用Glu、His、Ser、Ala、Gly、Asn、Tyr或Leu取代。
59.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第四的Glu用Lys、Gly、Gln、Arg、Ala、Val、Asp或Trp取代。
60.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第五的Gln用Pro、Glu、Thr、Arg、Ser、His或Lys取代。
61.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，第四的Glu用Ala、Asp或Trp取代，第六的Ser用Cys或Tyr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
62.权利要求1的寡肽，其中，在Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp的氨基酸序列中除第三-第六的氨基酸残基Cys-Glu-Gln-Ser以外的1-3个氨基酸残基被取代，第一的Ser用Thr或Tyr取代，第二的Ile用Ser、Asn或Thr取代，和/或第七的Asp用Gly、Ala或Leu取代。
63.权利要求1的寡肽，其中，在由Glu-Gln-Ser-Cys-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代。
64.权利要求1的寡肽，其中，在由Glu-Gln-Cys-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代。
65.权利要求1的寡肽，其中，在由Glu-Cys-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代。
66.权利要求1的寡肽，其中，在由Cys-Glu-Gln-Ser-Asp表示的氨基酸序列中1-3个氨基酸残基被取代。
67.权利要求1的寡肽，包含约8-约20个氨基酸残基，其包含选自以下的氨基酸序列：
Ser-Ile-Glu-Gln-Xaa-Ser-Asp-Gln；
Ser-Ile-Glu-Xaa-Gln-Ser-Asp-Gln；和
Ser-Ile-Xaa-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln，其中，Xaa是Cys，或活性物质束缚的Cys。
68.权利要求67的寡肽，其包含选自下列的氨基酸序列：
Ser-Ile-Glu-Gln-Cys-Ser-Asp-Gln；
Ser-Ile-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Gln；和
Ser-Ile-Cys-Glu-Gln-Ser-Asp-Gln。
69.权利要求1的寡肽，其中，所述寡肽具有SEQ ID NO：3-SEQID NO：124的任一个的氨基酸序列。
70.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Tyr Asn Glu GlnSer Cys Asp Arg Glu Glu。
71.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Thr Ser Asp GlnCys Cys Asp Pro Asp Lys。
72.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Pro Ser Glu GlnSer Cys Ala Glu Glu Glu。
73.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Ser Asn Glu GlnSer Cys Ala Val Ala Glu。
74.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Thr Thr Glu GlnSer Cys Ala Val Asp Glu。
75.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Ser Ile Glu GlnSer Cys Gly Gln His Glu。
76.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Ser Ser Ala GlnSer Cys Leu Gln Asp Thr。
77.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Tyr Ile Glu GlnTyr Cys Asp Gln Asp Glu。
78.权利要求1的寡肽，其包含以下氨基酸序列：Thr Ile Trp GlnSer Cys Asp Gln Glu Glu。
79.权利要求1的寡肽，其中，所述氨基酸序列包含天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基、或二者的混合物。
80.权利要求3的寡肽，其中，所述氨基酸序列包含天然氨基酸残基、非天然氨基酸残基、或二者的混合物。
81.权利要求1的寡肽，其是用交联剂修饰的。
82.权利要求3的寡肽，其是用交联剂修饰的。
83.一种寡肽聚合物，其通过交联权利要求1的寡肽获得，条件是该聚合物不是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的均聚物，并且不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
84.一种寡肽聚合物，其通过交联权利要求3的寡肽获得，条件是该聚合物不是寡肽Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp或Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys的均聚物。
85.权利要求83的寡肽，其是一种二聚物。
86.权利要求84的寡肽，其是一种二聚物。
87.权利要求85的寡肽，其中，所述二聚物是同型二聚物。
88.权利要求85的寡肽，其中，所述二聚物是异型二聚物。
89.权利要求86的寡肽，其中，所述二聚物是同型二聚物。
90.权利要求86的寡肽，其中，所述二聚物是异型二聚物。
91.一种包含权利要求1的寡肽的组合物。
92.一种包含权利要求3的寡肽的组合物。
93.一种包含权利要求67的寡肽的组合物。
94.一种包含权利要求68的寡肽的组合物。
95.一种包含权利要求83的寡肽的组合物。
96.一种包含权利要求84的寡肽的组合物。
97.权利要求91的组合物，其还包含可药用赋形剂。
98.权利要求91的组合物，其还包含一种增强皮肤渗透的试剂。
99.一种促进哺乳动物中毛发生长的方法，其包括以在所述哺乳动物中促进毛发生长的有效量施用权利要求91的组合物。
100.一种促进哺乳动物中毛发生长的方法，其包括以在所述哺乳动物中促进毛发生长的有效量施用权利要求92的组合物。
101.一种促进哺乳动物中毛发生长的方法，其包括以在所述哺乳动物中促进毛发生长的有效量施用权利要求93的组合物。
102.一种促进哺乳动物中毛发生长的方法，其包括以在所述哺乳动物中促进毛发生长的有效量施用权利要求95的组合物。
103.一种促进哺乳动物中毛发生长的方法，其包括以在所述哺乳动物中促进毛发生长的有效量施用权利要求96的组合物。
104.一种单克隆抗体，或其片断，其特异性地识别在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原。
105.权利要求104的单克隆抗体，其中，在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原是一种在成虫的生长期或胎儿的发育期中特异性表达的抗原。
106.一种单克隆抗体，或其片断，其由用the Patent andBio-Resource Center of National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology沉积并且登记号为FERM P-18578(FERM BP-8121)的杂交瘤细胞产生。
107.一种抗原，或其片断，其可由权利要求106的单克隆抗体识别。
108.一种产生权利要求104的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
109.权利要求108的杂交瘤细胞，其用the Patent and Bio-Resource Center of National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology沉积，并且登记号为FERM P-18578(FERMBP-8121)。
110.权利要求108的杂交瘤细胞，其通过包括融合用含有从生长期的哺乳动物的皮肤中和/或生长期的哺乳动物的须毛的毛囊中收集的毛发提取的蛋白质的免疫原免疫的哺乳动物的免疫细胞和哺乳动物的骨髓瘤细胞的方法来生产。
111.一种生产对在上皮新毛囊中存在的约220kDa的抗原特异性的单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：培养权利要求108的杂交瘤细胞，并收集由所述杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。
112.一种评价毛发生长促进活性的方法，其包括以下步骤：
(1)在待测物质存在下，在合适的条件下以有效促进毛发生长的时间培养得自哺乳动物的皮肤组织；
(2)从步骤(1)中回收所述皮肤组织；
(3)使所述皮肤组织与权利要求106的单克隆抗体或其片断反应；和
(4)检测与所述皮肤组织反应的所述单克隆抗体或其片断。
113.权利要求112的方法，其中，所述单克隆抗体由权利要求109的杂交瘤细胞产生。
114.一种用于评价毛发生长促进活性的试剂盒，其包含权利要求104的单克隆抗体或其片断。
115.权利要求114的试剂盒，其包含权利要求105的单克隆抗体或其片断。
116.权利要求114的试剂盒，其包含权利要求106的单克隆抗体或其片断。
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