CN1434725A - 两亲聚合物以及包含两亲聚合物的多肽结合物 - Google Patents

Abstract

将蛋白和/或肽例如肠腔缩胆囊肽释放因子(LCRF)与两亲低聚物和聚合物肽结合。这样的结合物可调节蛋白和/或肽的药动学性质，并由此改善其临床用途。这样的结合物还能够稳定蛋白和/或肽例如LCRF，和将其递送到肠中的受体而不吸收到血流内。

Description

两亲聚合物以及包含两亲聚合物的多肽结合物

1.发明背景

本发明一般涉及将两亲低聚物和聚合物与肽结合以调节其药动学性质并由此改善其临床用途的新技术。本发明结合物能够稳定肠腔缩胆囊肽释放因子(LCRF)和将其递送到肠中的受体而不吸收到血流内。

1.1发明背景

内源性LCRF在肠上皮细胞的肠腔表面上的受体上起作用，引起它们将缩胆囊肽(CCK)—一种引起饱食感并减少食物摄取的多肽激素释放到血流内。被稳定且递送到肠中的外源性LCRF将模拟正常生理活动。调节进食行为的化学改性的肽具有治疗肥胖的可能性，在所有发达国家、尤其是美国，肥胖是严重的且不断增多的公众健康问题。

在发达国家，肥胖接近流行比例，并且其流行性正在不断增加。肥胖的发病机理很复杂，涉及生活方式、食谱、行为和遗传因素的相互作用。本发明的目的是提供引起饱食感并因此减轻体重的药物。

神经肽和胃肽在调控进食中的作用已经成为肥胖研究的主要焦点。有令人信服的证据表明CCK抑制进食。调控CCK表达在很大程度上是通过调控LCRF来实现的，LCRF在大鼠十二指肠组成性地表达。在人体中，据假定需要通过营养素的刺激来刺激公认的CCK-释放因子的分泌。食用蛋白食物后，食物中的蛋白使可利用的胰蛋白酶饱和，留下大量未水解的LCRF，然后与CCK细胞结合。这引起它们释放CCK，导致饱食感。

一方面，可使用本发明结合物来将LCRF、其天然激动剂靶向递送到LCRF受体上以引起CCK释放。

本发明的目的是提供将LCRF递送到其靶向受体上的手段。通过将用烷基修饰的PEG低聚物或聚合物与蛋白和肽结合来改善其药理性质，实现了该目的。本发明使用两亲低聚物和聚合物结合来改变药物分子的疏水性和亲水性。这减轻了免疫原性，防止了酶降解，并促进了口服递送和分配到不同组织中。

本发明的另一目的是提供能减少CCK释放细胞释放CCK，导致饱食感和减少食物摄取的结合的LCRK。我们提出使用我们专有的两亲聚合物结合技术来递送LCRF，该技术保护LCRF不被蛋白酶分解，并将其在较长时间内限制在肠腔中，产生饱食感。我们提出，这样的结合LCRF可用于有效且安全地长期治疗肥胖。

本发明还提供了将两亲聚合物连接到LCRF的N-末端残基—表现出全长LCRF所有生物活性的35氨基酸片断上的合成方法。

所述两亲结合物包含聚乙二醇(PEG)部分和烷基链。烷基链可整合到肠上皮上的膜内，使结合物紧密地接近位于CCK释放细胞表面上的LCRF受体。肽的稳定性可以被延长以保持生物活性。此外，当需要更强的稳定性和降低穿透肠上皮的趋势时，可用结合物在N-末端、在K19和C-末端提供肽。

LCRF结合物分子的可操作性可在使用由大鼠肠新制备的CCK释放细胞的基于细胞的测定中证实。可使用放射免疫测定(RIA)来检测CCK释放。

LCRF是在十二指肠中释放的，并且可通过蛋白酶解、特别是通过胰蛋白酶来在生理上调控。通过保护LCRF不发生蛋白酶解消化，其将保持活性，结合并激活CCK细胞上的LCRF受体。

可将两亲聚合物共价连接在与LCRF(1-41)中唯一的胰蛋白酶裂解位点相邻的K19i(在本申请中使用单字母氨基酸代码)的ε氨基上，由此通过空间位阻保护LCRF不被胰蛋白酶分解。优选地，对LCRF的修饰必须不阻碍涉及受体结合的关键残基。因为已知K19位于受体结合的关键区域内，所以优选用在十二指肠中的条件下缓慢地水解的连接基团来连接K19结合物。这样在K19结合物释放时，肽恢复了全部活性。缓慢的水解还延长了递送的LCRF的作用时间，以将给药次数减到最少。

约55％的美国人超重或肥胖，这带来了严重的公众健康问题。肥胖的3个最严重的后果是心脏病、高血压、和糖尿病。对大多数超重的人来说，饮食和锻炼是不成功的长期策略；因此需要抑制食欲的药物。抑制食欲的一种方法是引起CCK—产生饱食感和减少进食的肽激素释放。

CCK是紧紧调节饥饿和饱食感、消化、和营养处理的激素系统的一种组分。CCK具有几种活性：其诱导饱食感和减少食物摄取；刺激胆囊收缩；增加胰腺酶分泌；和延迟胃排空。当食物、尤其是脂肪和蛋白进入小肠中时，CCK释放到血液中，在血液中其与外周神经、胰腺、胆囊、和胃中的受体结合。

到肠中的CCK释放处于负反馈调控之下。LCRF是组成性产生的对胰蛋白酶敏感的肠CCK释放肽，其是这种负反馈现象的部分原因。附图1ⁱⁱ(由Miyasaka K & Funakoshi A(1998)Pancreas 16：279修改的)总结了通过LCRF调控CCK释放。在基本或禁食状态下，所有LCRF都被胰蛋白酶迅速裂解。在摄入蛋白或胰蛋白酶抑制剂后，一些LCRF保持完整，并结合到CCK释放细胞上，引起CCK释放和饱食感。当把LCRF和胰蛋白酶抑制剂一起输入到大鼠的十二指肠内时，其引起食物摄取减少。

LCRF是有效的CCK释放因子。LCRF是引起CCK释放细胞将CCK释放到血流内的至少3种肽中的一种。LCRF是这些肽当中最有效的。还发现分泌到肠中的两种其它肽能刺激CCK释放：地西泮结合抑制剂和和监视肽。后者控制通过正反馈调节来控制CCK释放。然而，这两种肽刺激CCK释放的效力低于LCRF(分别小100-1000倍和6倍)。

受体-LCRF相互作用的性质尚未确立，因为没有确定出受体。然而，有很有力的证据表明细胞表面上存在受体。我们的合作者Duke大学的Dr.Rodge已经证实了LCRF经由钙流入途径刺激CCK从肠内分泌细胞的释放。细胞内钙的增加是受体信号传导的典型信号机制，并有力地表明了受体位于细胞表面上。

在大鼠和人中，食入胰蛋白酶抑制剂或胆汁-胰液转变刺激胰腺外分泌和CCK释放。对胰蛋白酶消化敏感的CCK刺激肽首先是从肠洗液中纯化的。称为肠腔缩胆囊肽释放因子(LCRF)的该肽刺激隔离大鼠、小鼠、和人肠细胞以及源自肠内分泌肿瘤的细胞系(STC-1细胞)释放CCK。LCRF的35残基N-末端片段具有长度为60-65个残基(8136Da)的天然肽的所有生物活性。使用合成肽，已经发现残基11-25引起LCRF的CCK释放特性，产生约60％的1-41片段的活性。然而，尚未鉴定出LCRF的基因，并且到1999年12月为止，在公众可获得的蛋白或DNA序列数据库中没有任何同系物存在。

本发明提供了LCRF结合物，所述结合物保留了与CCK细胞上的LCRF受体结合的能力tp；被保护不发生蛋白酶解裂解；并且通过其分子量限制在肠腔中。LCRF受体结合将引起CCK细胞将CCK释放到血液中，导致饱食感和减少食物摄取。因此，本发明提供了口服有效的可治疗肥胖的LCRF结合物。

肽类药物的使用存在着实际限制。在肠和血流中的蛋白酶解是使用肽作为治疗药物的主要障碍。实际上，包括LCRF在内的多种内源性肽的短暂性质是其调节功能的特征。对于非内源性肽所遇到的另一困难是免疫原性。这些问题使得制药工业去使用药物化学技术来开发小的非肽分子。虽然药物化学已经取得了成功，但是其花费的时间非常长。此外，化学药物可能具有意想不到的毒性或致畸性。

虽然良好地确定了“PEG化”蛋白的应用，但是迄今为止它们局限在注射应用上。本发明提供了口服有效的多肽例如胰岛素、亮氨酸-脑啡肽、和降钙素的结合物。具体来说，本发明提供了包含连接在烷基链上的PEG单元的结合物。通过调节PEG单体的数目、烷基链的类型和长度、以及PEG-肽连接键的确切性质，可使其具有适合特定应用的所需亲脂性。此外，PEG-肽连接键的确切性质可以改变，这样其在生理pH是稳定的或者对水解敏感。可水解的连接基团使得完整、未结合的肽延时释放，起到前药的作用。

可使用基于细胞的测定来证实两亲低聚物-LCRF结合物在动物中口服递送的能力。然后可使用动物实验来证实所述结合物抑制食欲的能力。例如，可将大鼠进行行为实验以评价所述LCRF结合物的食欲抑制性质。如果结合物表现出抑制大鼠食欲的所需能力，则在大鼠中进行化合物的详细药动、和药效实验，以及测试毒性。

人们正在非常努力地开发治疗肥胖的药物。一种最近批准用于肥胖的药物是脂肪酶抑制剂orlistat，其阻止脂肪摄取，但是不影响食欲。Orlistat(Xenical)可导致脂溶性维生素摄取量下降，并且可具有非常不适的副作用。市售食欲抑制剂包括西布茶明(Meridia)，这是一种混合的神经递质再摄取抑制剂和拟交感神经剂。然而，CNS作用限制了这些药物的使用。在1997年，发现食欲抑制联合用药物芬氟拉明和右旋芬氟拉明(Fen-Phen)引起心脏心瓣病，因此从市场上收回了。神经肽Y拮抗剂κ阿片样物质受体拮抗剂，melanocortin-4激动剂和β-3肾上腺素能受体拮抗剂都处于用于食欲抑制的临床前开发中。Leptin和神经肽Y—两种内源性肽参与控制食物消耗和能量消耗的长期调控。虽然对这两种肽正在进行广泛的研究，但是在临床试验中没有一种被证实是成功的。

CCK路径涉及进食方式的调节，而不是长期的体重维持。发现和开发治疗肥胖的药物的3种途径直接以CCK路径作为靶目标，包括CCK-A激动剂、CCK蛋白酶解抑制剂、和LCRF受体激动剂。

几种苯并二氮杂卓类似物和肽模拟物正作为CCK-A激动剂处于临床前开发中。Abbott Laboratories and Glaxo Welcome已表明这些化合物能减少大鼠食物摄取量，并且正进行治疗肥胖的临床前开发。该途径的其它证实是使用CCK-A拮抗剂治疗神经性食欲缺乏。

Butabindide是缩胆囊肽失活性肽抑制剂，INSERM，France正对其进行治疗肥胖的临床前评价。然而，对于临床应用而言，butabindide的作用持续时间太短了，其它类似物的评价也正在进行。

可使用作为LCRF受体激动剂的合成小分子来刺激CCK释放。然而，目前基于结构的药物设计不是有效手段，这是因为缺乏关于LCRF或其受体的结构数据。

预计到2005年，出于健康原因通过饮食来减轻体重的人数将达到五百八十万。在美国，出于健康或美容原因而使用的减肥产品和服务，包括食物的总销售额为约30亿美元。尽管缺少安全有效的产品，但是在1998年美国人仍在肥胖药物上花费了两亿四千三百万美元。很明显，安全、有效且长期的肥胖治疗的市场非常巨大。

2.发明概述

本发明提供了包含与一个或多个非天然聚合物分子偶联的蛋白或肽例如LCRF的组合物，所述聚合物包含亲脂性部分和亲水性聚合物部分，因此给组合物带来了平衡的亲脂性和亲水性特征，这样组合物可溶于可药用溶剂中，并能够与生物膜相互作用。

本发明提供了包含与一个或多个非天然聚合物分子偶联的蛋白或肽例如LCRF的组合物，所述聚合物包含：(i)亲脂性部分；和(ii)亲水性聚合物部分，因此给结合物带来了平衡的亲脂性和亲水性特征，这样结合物可溶于可药用溶剂中，并能够与生物膜相互作用。

本发明提供了包含与一个或多个非天然聚合物分子偶联的蛋白或肽例如LCRF的组合物，所述聚合物包含亲脂性部分和亲水性部分，其中所述组合物溶于含水溶剂中，并且LCRF能有效地预防或治疗肥胖。

本发明提供了包含与一个或多个聚合物分子共价偶联的蛋白或肽例如LCRF的组合物，所述聚合物包含：(i)直链聚亚烷基二醇部分和(ii)亲脂性部分，其中所述生理活性肽、直链聚亚烷基二醇部分和亲脂性部分彼此相关地构象排列，以使得与单独的LCRF相比，LCRF组合物中的LCRF具有增强的抗酶降解的体内抗性。

本发明提供了包含甘油三酯主链部分的组合物，所述组合物含有：经由键合在甘油三酯主链部分的碳原子上的聚亚烷基二醇间隔基团与甘油三酯主链部分共价偶联的LCRF；和直接与甘油三酯主链部分的碳原子共价连接或者经由聚亚烷基二醇间隔基团共价连接的至少一个脂肪酸部分。

本发明提供了包含聚山梨醇酯部分的聚山梨醇酯复合物，所述聚山梨醇酯部分包括甘油三酯主链，其中甘油三酯主链具有与其一个α、α′和β碳原子共价偶联的脂肪酸，具有与其一个α、α′和β碳原子共价偶联的聚亚烷基二醇基团。

本发明提供了稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与聚乙二醇修饰的糖脂部分稳定且结合偶联的LCRF。

本发明提供了包含聚山梨醇酯部分的聚山梨醇酯复合物，所述聚山梨醇酯包括甘油三酯主链，其中甘油三酯主链具有与独立地选自其α、α′和β碳原子的碳原子共价偶联的官能团，所述官能团包括：脂肪酸基团；具有与其共价键合的生理活性基团的聚乙二醇基。

本发明还提供了治疗肥胖的口服剂型，所述剂型包含可药用载体和稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂部分偶联的LCRF。

本发明还提供了在表现出肥胖的人或非人哺乳动物个体中治疗肥胖的方法，包括给所述个体口服施用有效量的结合的LCRF组合物，所述组合物包含稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂部分共价偶联的LCRF。

本发明提供了在人或非人哺乳动物个体中预防或干预性地治疗可能或已发展成的肥胖的方法，包括给所述个体口服施用有效量的结合的LCRF组合物，所述组合物包含稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂部分共价偶联的LCRF。

本发明提供了在体内或体外系统中延长LCRF活性的方法，包括将LCRF与包含亲脂性部分和亲水性聚合物部分的一个或多个非天然聚合物分子结合性地偶联，以形成结合偶联的聚合物-LCRF组合物，并将该结合偶联的聚合物-LCRF组合物引入到体内或体外系统中。

本发明还在优选的实施方案中提供了下式化合物：其中n为3-230，且m为0-20。

本发明还在优选的实施方案中提供了下式化合物：其中n为3-230，m为0-20，且X选自N、O或S。

本发明还在优选的实施方案中提供了下式化合物：

其中n为3-230，且m为0-20，其中蛋白优选为治疗蛋白。

本发明还在优选的实施方案中提供了下式化合物：其中n为3-230，m为0-20，且X选自N、O或S，其中蛋白优选为治疗蛋白。

3.附图概述

附图1总结了通过LCRF调控CCK释放。

附图2表示的是用于LCRF结合技术的三种基本设计。

附图3表示的是用于制备本发明聚合物的基本合成方案。

4.发明详述

虽然下文的描述主要并且示例性地涉及LCRF作为肽组分在各种本发明组合物和制剂中的应用，但是应当理解，本发明的应用并不因此受限制，而是扩展到能够以本发明方法共价或缔合性地结合的任何肽，这些肽包括但不限于下列肽：降钙素、ACTH、胰高血糖素、促生长素抑制素、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促甲状腺激素、内啡肽、抗体、血红蛋白、可溶性CD-4、凝血因子、组织纤溶酶原激活质、脑啡肽、后叶加压素、非天然阿片样物质、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶核糖核酸酶、胰蛋白酶、chemotrypsin、和木瓜蛋白酶、碱性磷酸酶、和其它合适的酶、激素、蛋白、多肽、酶-蛋白结合物、抗体-半抗原结合物、病毒表位等。

本发明的一个目的是提供用于与肽结合以获得上述所需特征的合适的聚合物。另一目的是使用这样修饰的肽以在体内持续递送该肽。还有一个目的是使用这样的技术来口服递送其活性形式的肽。

另一目的是使用缔合性地结合的肽来用于免疫分析、诊断、和其它非治疗(例如体外)应用。本发明另一目的是提供稳定地结合的肽组合物，包括适于体内和非体内应用的共价键合的组合物，以及提供适于体内和非体内应用的非共价、缔合性地结合的肽组合物。

在本发明宽范围内，可使用一种聚合物分子来与多种肽结合，并且在本发明的宽范围实施中还可能有利的是使用多种聚合物作为给定肽的结合剂；也可以使用这样的方法的组合。此外，稳定结合的肽组合物可在体内以及非体内应用中找到用途。此外，应当认识到，根据最终的应用，结合聚合物可使用任何其它基团、部分、或其它结合物质。例如，在某些应用中，可将给聚合物赋予UV-降解抗性、或抗氧化性、或其它性质或特征的官能团与聚合物共价键合。再例如，在某些应用中，将聚合物官能化以带来相同的反应性或交联性特征来增强整个结合材料的不同性质或特征可能是有利的。因此，聚合物可含有不消除结合组合物在其预期应用方面的效力的任何官能团、重复基团、连接键、或其它构成结构。通过后面的公开内容和权利要求书，本发明的其它目的和优点将更显而易见。

可使用以获得这些理想特征的聚合物的实例描述于下文的示例性反应方案中。在共价键合的肽应用中，可将聚合物官能化，然后偶联到肽的游离氨基酸上，以形成不稳定的键，其使得活性得以保留，并且该不稳定的键保持完整。之后通过化学水解和蛋白酶解除去该键，增强肽活性。

在本发明中使用的聚合物可适于将组分例如可食用脂肪酸(亲脂性末端)、聚乙二醇(水溶性末端)、可接受的糖部分(受体相互作用末端)、和用于连接肽的间隔基团掺入到其分子内。在所选的聚合物当中，聚山梨醇酯是特别优选的，并且在下文的描述中选择它来举例说明不同的本发明实施方案。当然本发明的范围不限于聚山梨醇酯，并且在本发明的宽范围实施中可使用多种其它上述掺入聚合物的部分。有时可能需要在聚合物结构中除去一个这样的部分，并保留其它部分，同时不失去目的应用。当需要这样做时，可在不失去目的应用和本发明优点的情况下除去的优选部分是糖和/或间隔基团部分。

优选使用分子量为100-10,000道尔顿的聚合物。

在本发明实施中，有利起见，将C₂-C₄烷基聚亚烷基二醇的聚亚烷基二醇残基、优选聚乙二醇(PEG)掺入到聚合物系统中。

存在这些PEG残基将给聚合物以及相应的聚合物-肽结合物带来亲水性质。已知一些糖脂能稳定蛋白和肽。该稳定作用的机制可能涉及糖脂脂肪酸部分与肽或蛋白的疏水域缔合；由此防止了蛋白或肽的聚集。还已知，与天然肽相比，聚集的肽在小肠中的吸收不佳。因此本发明涉及聚合物-肽产品，其中肽例如LCRF与聚合物的亲水或疏水残基结合。提供聚合物的脂肪酸部分以与肽的疏水域缔合，并因此防止在溶液中聚集。因此，所得聚合物-肽结合物是：稳定的(对化学和酶水解稳定)；由于存在PEG残基而是水溶性的；和由于脂肪酸-疏水域相互作用而不易于聚集。

在本发明的实施中，聚亚烷基二醇衍生化对于聚合物-肽结合物的制剂有很多优点，因为聚亚烷基二醇衍生物带来了下列特征：改善水溶性，同时不引起抗原或免疫原性反应；高度生物相容性；没有聚亚烷基二醇衍生物的体内生物降解；和易于被活的有机体排泄。

因此，在本发明实施中使用的聚合物包含亲脂性和亲水性部分，使得所得聚合物-肽结合物在口服和非胃肠道以及其它生理给药方式中高度有效(生物活性)，并且在非生理应用中高度有效。

下面列出共价键合结合物的结构式作为本发明聚合物-肽结合物的实例，为了便于随后的提及，将这些结构式称为结合物1、结合物2、和结合物3，并且在后文中描述m、n、w、x、和y的具体值。结合物1：

其中：w+x+y+z＝20；且结合物2：

结合物3：

结合物1的特征是在聚合系统的中心具有市售聚山梨醇酯一油酸酯—许多药物应用中使用的糖衍生物。油酸链赋予了亲脂性和吸收提高性质，而聚乙二醇(PEG)残基提供了亲水(氢键接受)环境。胰岛素是经由与聚合物的PEG区相邻的氨基甲酸酯键连接的。

在结合物2中，不存在糖残基，但是LCRF还是经由与聚合物的PEG区相邻的氨基甲酸酯键连接在聚合物上的。因此，聚合物的亲脂性脂肪酸区距离LCRF连接点有一定距离。

上述结合物2的排列与结合物3相反。也不存在糖残基，但是在该结构中，亲脂性脂肪酸残基与LCRF的连接点最近，并且亲水性PEG区远离连接点，并且也是经由氨基甲酸酯键连接的。

在本发明的一般实施中，可使用将聚合物与肽偶联的多种不同方法，并且在下文中更全面地描述。在加工肽和多肽时，应当认识到，肽中的一些残基对于其整个生物整体性很重要。选择不过分干扰这样的残基的合适的偶联剂很重要。在某些情况下，可能难以避免偶联并由此掩蔽这些重要残基的活性，但是可通过牺牲某些活性来提高稳定性，同时保持所赋予的有益性质。例如，在体内应用中，可由此减小给药频率，降低成本，和提高患者顺应性。

依据本发明在蛋白/肽结合中使用的聚合物设计为具有能使得它们实现所需目的的良好物理特征。虽然吸收增强剂能使得肽穿越细胞膜，但是没有改善肽的稳定性，并且体内应用可因此在不含穿透增强剂的制剂中使用本发明聚合物-肽结合物。因此一个本发明方面涉及将脂肪酸衍生物掺入到聚合物内以模拟穿透增强剂。

在本发明共价结合的聚合物-肽结合物中，可通过不稳定的化学键将肽与水溶性聚合物共价连接。肽与聚合物之间的共价键可通过化学或酶反应来裂解。聚合物-肽产物保留了可接受量的活性；当聚合物完全从肽上裂解下来时，实现了组分肽的全部活性。同时，结合用聚合物中存在聚乙二醇部分，以赋予聚合物-肽高水溶性和延长的血液循环能力。糖脂可以与聚合物以下述方式有用地缔合，即其脂肪酸部分占据肽的疏水域，并由此防止聚集。肽的聚集导致其在小肠中的吸收不好。未聚集的肽更易于被小肠吸收。将糖脂掺入到结合用聚合物中所起的作用是提高结合后的稳定性和防止肽聚集。上述修饰提高了肽的溶解性、稳定性、和膜亲和性。作为这些改善的特征的结果，本发明涉及非胃肠道和口服递送活性聚合物-肽，和水解裂解后，肽自身在体内应用中的生物利用度。

在下述实施方案中使用的聚合物可分类为聚乙二醇修饰的糖脂和聚乙二醇修饰的脂肪酸。在优选的结合用聚合物当中，可提及聚山梨醇酯，包括一棕榈酸酯、二棕榈酸酯、三棕榈酸酯、一牛磺酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、一油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、一硬脂酸酯、二硬脂酸酯、和三硬脂酸酯。各种组合所得的聚合物的数均分子量优选为约500-约10,000道尔顿。对于该实施方案，另一优选的聚合物是聚乙二醇醚或脂肪酸酯，这样的脂肪酸是月桂酸、棕榈酸、油酸、和硬脂酸，并且聚合物的数均分子量为500-10,000道尔顿。在聚合物中优选具有可衍生化的基团，其中这样的基团可在用聚乙二醇终止的末端或者在用脂肪酸终止的末端。可衍生化的基团还可以位于聚合物内，并由此起着肽与聚合物之间的间隔基团的作用。

用结构实例进一步详细地描述修饰脂肪酸脱水山梨醇以获得所需聚合物的几种方法。聚山梨醇酯是山梨醇及其酐的酯，每摩尔山梨醇和山梨醇酐与大约20摩尔环氧乙烷共聚。下面给出代表性聚合物的结构。

(式1)w、x、y、z的和是20，且R₁、R₂和R₃分别独立地选自月桂酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸基团，或者R₁和R₂分别是羟基，而R₃是月桂酸、棕榈酸、油酸或硬脂酸基团。这些聚合物是商购获得的，并且可用于药物制剂。当需要高分子量的聚合物时，其可以由糖脂例如脱水山梨醇一月桂酸酯、脱水山梨醇一油酸酯、脱水山梨醇一棕榈酸酯或脱水山梨醇一硬脂酸酯和适当的聚乙二醇合成。可用作原料的糖脂的结构如下所示。

m＝10-16                          (式2)

在被聚乙二醇在3个位置取代的糖脂聚合物的合成中，用1摩尔三苯甲基氯将在末端具有2个游离羟基的所需聚乙二醇在一个末端保护。将聚乙二醇的其余游离羟基转化成甲苯磺酸酯或溴化物。将所需糖脂溶解在合适的惰性溶剂中，并用氢化钠处理。将保护的聚乙二醇的甲苯磺酸酯或溴化物溶解在惰性溶剂中，并加入过量糖脂溶液。在室温用对甲苯磺酸在无水惰性溶剂中的溶液处理产物，并通过柱色谱法纯化。结构的转化如下所示。

              m＝10-16

              x、y、z的和＝8-240(式3)通过调节反应物的摩尔当量和使用具有适当分子量范围的聚乙二醇，可通过上述方法获得具有所需分子量范围的单取代或二取代的糖脂。(式4)其中每个n和m可独立地改变，并且具有对于所稳定的特定肽来说是合适的任何值，例如为1-16。

上述糖脂的糖部分可被甘油或氨基甘油取代，甘油和氨基甘油的结构式如下所示。

                                         (式5)

在该修饰中，首先将伯醇醚化或者用脂肪酸部分例如月桂酸、油酸、棕榈酸或硬脂酸酯化；用脂肪酸将氨基衍生化以形成如下所示的酰胺或仲氨基。

                                  (式6)其中m可具有任意合适的值，例如为10-16。

用三苯甲基将其余伯醇基保护，而用聚乙二醇将仲醇基转化成所需的聚合物。聚乙二醇通常在一个末端携带离去基团，在另一个末端携带甲氧基。将聚乙二醇溶解在惰性溶剂中，并加到含有糖脂和氢化钠的溶液中。如下所示，在对甲苯磺酸中于室温将产物脱保护，以获得所需聚合物。p-TsA＝对甲苯磺酸

                                    (式7)

有时需要将脂肪酸衍生物掺入到聚乙二醇链的不同部位中，以获得一些类似于已经用2个/3个脂肪酸分子取代的聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯三油酸酯的物化性质。

下述反应方案显示了作为开链聚山梨醇酯的代表聚合物的结构。

Pr＝肽、蛋白、蛋白药物；R＝C₅-C₁₈烷基；n＝5-120；可以是 Pr＝肽、蛋白、蛋白药物；R＝C₅-C₁₈烷基；n＝5-120；m＝2-15；可以是

Pr＝肽、蛋白、蛋白药物；R＝C₅-C₁₈烷基；m＝5-18；n＝2-15；y＝5-120；并且其中m、n、和y可彼此独立地在上述范围内变化。

                                             (式8)

在聚合物A的合成中，需要将在二醇的第一个和第二个碳上的羟基保护，例如酮缩醇。在惰性溶剂中将其余羟基转化成钠盐，并与其中聚乙二醇的一个末端已作为酯保护起来的卤代或甲苯磺酸化的聚乙二醇反应。除去二醇保护基，将所得两个游离羟基转化成相应的钠盐。在惰性溶剂中将这些盐与已经用脂肪酸部分衍生化的聚乙二醇反应。反应在将游离羟基转化成甲苯磺酸酯或溴化物之后进行。

聚合物G是按照相同方法合成的，除了首先将保护的二醇与已经在酸的末端碳上卤代的脂肪酸酯反应。

在聚合物C的合成中，优选用1，3-二卤代-2-丙醇开始合成。将该二卤代化合物溶解在惰性溶剂中，并用2摩尔已经预先用1摩尔脂肪酸衍生化的聚乙二醇的钠盐处理。通过色谱法或透析纯化产物。将所得干燥产物在惰性溶剂中用氢化钠处理。将由此形成的钠盐与部分保护的聚乙二醇的卤代衍生物反应。

有时需要除掉聚合物的糖部分。所得聚合物仍然含有聚乙二醇片断。脂肪酸部分的膜亲和特性可通过用亲脂性长链烷烃适当地代替脂肪酸来保持；由此保留了生物相容性。在该实施方案的一个实例中，将具有两个末端游离羟基的聚乙二醇与氢化钠在惰性溶剂中反应。将一当量脂肪酸样部分的伯溴化物衍生物加到聚乙二醇溶剂混合物中。将所需产物萃取到惰性溶剂中，并按照需要通过柱色谱法纯化。

                                        (式9)

当需要在脂肪酸与聚乙二醇之间形成酯键时，在合适的惰性溶剂中用过量所需聚乙二醇处理脂肪酸的酰氯。将聚合物萃取到惰性溶剂中，并按照需要通过色谱法纯化。

(式10)

在一些肽修饰中，需要将脂肪酸直接结合到肽上。在这种情况下，用置于脂肪酸部分上的可衍生化官能团合成聚合物。在惰性溶剂中用氢化钠处理具有适当分子量的一甲氧基聚乙二醇，然后加入含有在酸的末端碳上携带离去基团的脂肪酸乙酯的溶液。溶剂萃取后纯化产物，并按照需要通过柱色谱法纯化产物。

                                   (式11)通过用稀酸或碱处理来除去酯保护。

                                   (式12)

当需要与多肽形成氨基甲酸酯键时，通过本领域已知的化学还原方法将羧基或酯转化成羟基。

         HO-(CH₂)_m-(OC₂H₄)_nXR      (式13)

用于多肽结合的官能团通常在聚合物的末端，但是在某些情况下，官能团优选位于聚合物内。在这种情况下，衍生化基团起间隔基团的作用。在该实施方案的一个实例中，可将脂肪酸部分在羧基的α碳上溴化，并将酸部分酯化。用于这类化合物的实验方法类似于上述方法，生成如下所示的产物。

(式14)当需要延长的间隔基团时，可将聚乙二醇单醚转化成氨基，并用已经用脂肪酸部分衍生化的琥珀酸酐处理。将所需的携带伯胺的聚乙二醇溶解在pH8.8的磷酸钠缓冲液中，并用如在下面的反应方案中所示的取代的琥珀酸酐脂肪酸部分处理。通过溶剂萃取分离出产物，并按照需要通过柱色谱法纯化。

(式15)

应当理解，提供上述反应方案仅是为了举例说明，并不是对反应和结构的限制，这些反应可在本发明宽范围的实施中有益地用于肽的修饰以例如获得用于非胃肠道和口服给药的溶解性、稳定性、和细胞膜亲和性。

本发明提供了生物相容性聚合物与作为生物活性大分子的诊断试剂等的结合物，所述生物活性大分子可由例如肽、蛋白、酶、生长激素、生长因子等构成。这样的大分子化合物可用以酰胺键连接的α-氨基酸构建以形成肽低聚物和聚合物。根据这些物质的功能，肽组分可以是蛋白、酶、生长激素等。为了简便起见，这些物质统称为肽，并称作Pr。在所有情况下，生物活性肽含有游离氨基或羧基。聚合物与肽之间的键一般是经由游离氨基或羧基形成的。

为了本发明目的所选的肽特别适用于医药、农业、科学、家庭和、以及工业应用领域。它们可以是用于替代治疗的酶；用于促进动物生长或细胞培养物中的细胞生长的激素；或用于不同领域例如生物技术和生物以及医疗诊断的活性蛋白物质。可提及的酶有超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、谷氨酸酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨基酶、腺苷脱氨基酶核糖核酸酶、胰蛋白酶、chromotrypsin、和木瓜蛋白酶。可提及的肽类激素有胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、somatosin、生长激素、促生长因子、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、促乳素、促甲状腺激素、内啡肽、脑啡肽、和后叶加压素。

获得共价结合产物的聚合物与肽的反应易于进行。为了在描述中简便起见，将聚合物称为(P)。当聚合物含有羟基时，首先将其转化成活性碳酸酯衍生物例如对硝基苯基碳酸酯。然后将活化的衍生物与肽在产生具有保留的生物活性的氨基甲酸酯衍生物的温和条件下短时间反应。

                      (式16)

提供上述反应和反应物只是为了举例说明，并不是排他的；可使用导致形成尿烷或其它键的活化反应物。可使用本领域众所周知的试剂将羟基转化成氨基。然后与肽经由其羧基偶联，形成酰胺。

当聚合物含有羧基时，可将其转化成混合酸酐，并与肽的氨基反应以产生含有酰胺键的结合物。在另一方法中，可用水溶性碳二亚胺处理羧基，并与肽反应以生成含有酰胺键的结合物。

可通过几种方法改变肽结合物的活性和稳定性，例如改变聚合物与肽的分子比例，和使用具有不同分子大小的聚合物。可通过改变掺入到聚合物组合物中的聚乙二醇片段的比例和大小来改变结合物的溶解性。亲水和疏水特征可通过谨慎地组合脂肪酸和聚乙二醇部分来平衡。

下面列出用于本发明聚合物-肽结合物的一些示例性修饰反应。

在涉及I、J和K的上述反应方案中，证实了修饰结合聚合物的亲水性/亲脂性平衡的途径。结合用聚合物中的酯基易于被酯酶水解；因此可修饰含有酯基的结合用聚合物，以将酯基转化成抗水解性更强的醚基。涉及L和M的反应方案举例说明了将羟基转化成羧酸酯基。在这方面，羧基将提供羧酸根阴离子，其是比羟基好的稳定的官能团(形成离子配位复合物)，而羟基不形成这样的复合物。用于形成涉及本发明聚合物的配位离子复合物的其它合适的阴离子源官能团包括硫酸酯和磷酸酯基。

一般可有利地采用多种不同技术来改善本发明聚合物-肽结合物的稳定性特征，包括：用具有良好的水解抗性的基团将聚合物官能化，例如如上所述的将酯基转化成醚基；根据被聚合物稳定的肽，修饰结合用聚合物的亲脂性/亲水性平衡；和将聚合物的分子量修剪至与被聚合物稳定的肽的分子量适合的水平。

对于本发明治疗应用，聚亚烷基二醇衍生的聚合物的独特的性质是一般的生物相容性。这样的聚合物具有不同的水溶性，并且没有毒性。它们是非抗原性的、非免疫原性的，并且不干扰酶的生物活性。它们在血液中具有长时间的循环，并且易于从活的生物体中排泄。

已经发现本发明产品可用于支持肽的生物活性，并且为了治疗给药，可例如通过溶解在可接受的液体介质中来配制。给药可通过非胃肠道或口服途径来进行。对于非胃肠道给药，可制成细小的胶态悬浮液以产生贮药库效应，或者可通过口服途径施用。

在干燥、冷冻状态，本发明肽-聚合物结合物具有良好的贮存稳定性；本发明结合物的溶液制剂同样具有良好的贮存稳定性。

本发明的治疗性聚合物-肽结合物可用于预防或治疗其中肽组分是有效的任何病症或疾病。

此外，本发明聚合物-肽结合物可用于在生物系统或样本中诊断组分、病症、或疾病，以及在非生理系统中用于诊断。

此外，本发明聚合物-肽结合物可用于预防或治疗植物系统中的病症或疾病。例如，结合物的肽组分可具有适用于不同植物系统的杀昆虫、除草、杀真菌、和/或杀虫效力。

此外，本发明结合物的肽组分可以是用于诊断、免疫学、和/或测定的抗体或抗原。

在治疗应用中，本发明涉及治疗患有或易患有病症或疾病并需要这种治疗的动物个体的方法，包括给这样的动物施用有效量的对于所述病症或疾病有效的本发明聚合物-肽结合物。

可用本发明聚合物-肽结合物治疗的个体包括人和非人动物(例如鸟、狗、猫、牛、马)个体，并优选是哺乳动物个体，最优选是人个体。

根据欲治疗的特定病症或疾病，可以以任意合适的治疗有效安全剂量将本发明聚合物-肽结合物施用给动物个体，这样的剂量可易于由本领域技术人员确定，并且不用进行不适当的实验。

一般情况下，为了实现治疗益处，式(I)化合物的合适剂量为1微克(μg)-100毫克(mg)/千克接受者体重/天，优选为10μg-50mg/千克体重/天、最优选10μg-50mg/千克体重/天。在一天内，所需剂量优选分成2、3、4、5、6、或更多个亚剂量以适当时间间隔施用。这些亚剂量可以在单位剂型中施用，例如每个单位剂型含有10μg-1000mg、优选50μg-500mg、最优选50μg-250mg活性组分。或者，如果接受者的病症需要这样的话，剂量可以作为连续输注来施用。

对于给定的治疗应用，给药方式和剂型当然将影响所需且有效的化合物的治疗量。

例如，对于相同活性组分，口服剂量一般是在非胃肠道给药方法中使用的剂量水平的至少2倍，例如2-10倍。

本发明聚合物-肽结合物可以以自身的形式或者其可药用酯、盐、和其它生理官能衍生物的形式施用。

本发明还涉及兽医和人医疗用药物制剂，其中含有一种或多种本发明聚合物-肽结合物作为活性剂。

在这样的药物和制剂中，活性剂优选与一种或多种可药用载体一起使用，并任选包含其它治疗组分。从与制剂的其它组分相容，并且对接受者没有不适当的损害的意义上来讲，载体必须是可药用的。如上所述，活性剂以实现所需药理作用的量、以及适于给出所需日剂量的量提供。

制剂包括适于非胃肠道给药和不是非胃肠道给药的制剂，并且具体给药程式包括口服、制成、颊、局部、经鼻、经眼、皮下、肌内、静脉内、透皮、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管、淋巴管、阴道、和子宫内给药。适于口服和非胃肠道给药的制剂是优选的。

当活性剂在包含液体溶液的制剂中使用时，制剂可有利地口服或非胃肠道施用。当活性剂在液体悬浮制剂中使用或者作为粉末在生物相容性载体制剂中使用时，制剂可有利地口服、直肠、或支气管施用。

当活性剂直接以粉末固体的形式使用时，活性剂可有利地口服施用。或者，其可支气管施用，支气管施用是经由在气体载体中的粉末的喷雾，以形成气态粉末分散体，患者从包含合适的喷雾装置的呼吸回路中吸入气态分散体。

方便起见，包含本发明活性剂的制剂可制成单位剂型，并且可通过药物领域众所周知的方法制得。这样的方法一般包括将活性化合物与组成一种或多种辅助组分的载体混合的步骤。制剂一般可这样制得：将活性化合物与液体载体或细分散的固体载体或者二者均匀且充分地混合，然后如果需要的话，将产品制成所需制剂的剂型。

适于口服施用的本发明制剂可作为分别含有预定量的粉末或颗粒形式的活性组分的不连续单位例如胶囊、扁囊剂、片剂、或锭剂提供；或在水液体或非水液体中的悬浮液例如糖浆剂、酏剂、乳剂、或顿服剂。

片剂可通过任选与一种或多种辅助组分压制或模制来制得。压制片可通过在合适的机器中将可自由流动形式例如粉末或颗粒形式的活性化合物压缩来制得，活性化合物任选与粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂、或拔染剂混合。由活性化合物粉末与合适的载体组成的模制片可通过在合适的机器中模制来制得。

糖浆剂可通过将活性化合物加到糖例如蔗糖的浓水溶液中而制得，还可以向其中加入任何辅助组分。这样的辅助组分可包括矫味剂、合适的防腐剂、阻止糖结晶的物质、和提高任何其它组分溶解度的物质例如多羟基醇如甘油或山梨醇。

方便起见，适于非胃肠道给药的制剂包含活性化合物的无菌水制剂，所述水制剂优选与接受者的血液等渗(例如生理盐水溶液)。这样的制剂可包含悬浮剂和增稠剂或设计用来将化合物靶向递送到血液或一个或多个器官中的其它微颗粒系统。制剂可以以单位剂型或多剂型的形式提供。

鼻用喷雾剂包含具有防腐剂和等渗剂的活性化合物的纯化水溶液。优选将这样的制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

直肠给药制剂可作为包含合适的载体例如椰子油、氢化脂肪、或氢化脂肪羧酸的栓剂提供。

眼用制剂可通过类似于鼻用喷雾剂的方法制得，除了优选将pH和等渗因素调节至与眼睛适合。

局部施用制剂包含溶解或悬浮在一种或多种介质例如矿物油、石油、多羟基醇、或用于局部给药制剂的其它基质中的活性化合物。

除了上述组分以外，本发明制剂还可以包含一种或多种选自下列的辅助组分：稀释剂、缓冲剂、矫味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。

在本发明的非治疗应用中，聚合物-多肽结合物可在肽与聚合物组分之间利用共价键或非共价键结合。此外，在治疗性肽的给药中，通过合适的给药方法例如上文在举例说明本发明共价键合的聚合物-肽结合物时所举例说明的方法，可以使用缔合性地结合的肽和聚合物组分。

在这样的非治疗性、缔合性地结合的肽-聚合物组合物中，可首先将肽与聚合物组分配制在一起以提高稳定性和降解抗性；或者，这些组分可例如是多部分组合物的分隔的部分，它们在使用时混合，并且在所得混合物中由于聚合物和肽之间没有相关键合而易于迅速降解或发生其它降解性改变。无论缔合性地结合的肽和聚合物组合物是什么形式，本发明涉及提高肽的某些特征或方面，或提高肽的实用性(相对于没有这些缔合聚合物的肽)的相关缔合。

因此，本发明涉及提供合适的聚合物以在体外稳定溶液中的肽，这是非治疗应用的一个优选的应用实例。可使用聚合物例如提高肽的热稳定性和酶分解抗性。通过以本发明方式结合来提高肽的热稳定性提供了改善储藏期限、室温稳定性、和诊断以及研究试剂和试剂盒例如免疫测定试剂盒的稳定性的手段。作为特定实例，可依据本发明将碱性磷酸酶共价或缔合性地偶联到合适的聚合物上，以当用作试剂盒中的试剂来比色检测生物液体中的抗体或抗原时给这样的磷酸酶带来稳定性。

提供下列实施例来举例说明本发明，但不应当理解为对本发明的限制。5.实施例

可合成并测定LCRF-两亲聚合物结合物的CCK-释放活性。然后可评价LCRF结合物对蛋白酶解的抗性。可通过体内动物实验来证实生理和行为作用。5.1合成LCRF两亲聚合物结合物

通过使用具有不同大小和化学组成的两亲低聚物或聚合物，可改变肽结合物吸收和参与性质。与LCRF肽偶联的聚合物优选不干扰受体结合。LCRF与其受体之间的相互作用的精确性质是未知的，但是已经作出了关于该相互作用的两个观察：11-25残基对于该相互作用是决定性的，19和20残基之间的裂解破坏结合活性。因此，我们使用可在K19水解的连接物来保护肽不被胰蛋白酶分解。

本发明结合物具有两个成分(PEG和烷基链)，其赋予LCRF两个有用的性质。首先，在N-末端使用大的支化低聚物来防止从肠中摄取到血流内。为了实现该目的，我们将一个5-10kDa低聚物加到N-末端上，因为分子量大于4kDa的分子不能越过肠壁进入血流中，而是保留在肠腔中。其次，疏水性烷基链能够整合到肠上皮的细胞膜内，使肽紧密靠近上皮细胞表面上的其靶受体。优选在远离参与受体结合的残基的N-末端上连接PEG/烷基结合物。

LCRF(LCRF的氨基酸序列为STFWAYQPDGDNDPTDYQKYEHTSSPSQLLAPGDYPCVIEV)的前35个残基可通过固相法合成，并且得自商业供应商。LCRF结合技术将按照在附图2中总结的3个基本设计。

LCRF含有两个可用于连接结合物的反应性氨基-氨基末端和赖氨酸侧链。第一种结合物(结合物1)可使用通过不可水解的连接物连接在LCRF的N-末端上的总平均分子量为4-10kDa的支化低聚物。该结合物有3个关键特征。首先，在N-末端的低聚物远离LCRF的已知的受体结合域，由此不可能削弱其生物效力。其次，在N-末端上的支化低聚物提供了对氨基肽酶(该酶会消化肽)的空间位阻。第三，支化低聚物提供了非常高的水溶性，并显著增大了LCRF结合物的尺寸，结合物尺寸的增大防止了肽越过小肠的上皮壁。

结合物2可使用对于结合物1所述的N-末端结合物，和第二个连接在K19的ε氨基上的直链结合物。该直链结合物可通过可水解的键连接，这样随着时间的延长，该低聚物将被水解掉以使得LCRF能够与其受体结合。K19是公认的受体结合序列的近似中心。除了具有上述结合物1的关键特征以外，结合物2的关键特征还有在K19上加了一个可水解的低聚物，这保护了其不被胰蛋白酶水解。其次，低聚物的可水解连接应当允许适当受体结合。第三，在K19的低聚物的缓慢水解(预计T_1/2为30-60分钟)可延长LCRF作用时间。设计3将生成在C-末端、N-末端、和K19加上聚合物的结合物。C-末端残基(酪氨酸)被改变成赖氨酸，由此提供了第3个结合位点。预计该突变不会改变受体结合，因为结合域距离残基35至少10个残基。两亲平衡是通过使用三个直链聚合物以代替一个支化低聚物来实现的。在C-末端加上可水解的低聚物提供了抗被羧肽酶降解的抗性。通过水解除去所有3个低聚物将再生出具有全部生物活性的活性LCRF。低聚物的水解(预计T1/2为30-60分钟)可延长LCRF作用时间。

LCRF结合物的合成化学如附图3所示。用溴将低聚的羧基链烷醇活化，并酯化。然后将低聚PEG与活化的烷烃低聚物偶联。PEG/烷烃羧酸与肽的游离氨基的偶联是用N-羟基琥珀酰胺在水溶液中实现的，水溶液的pH是其中氨基具有亲核作用的pH。将预先合成和纯化的低聚物活化，并在容许在一些位点(N-末端、C-末端或K19)连接低聚物的可变反应条件下与LCRF偶联。还可以使用结合反应和产物纯化程序来实现特定结合方式。N-末端氨基对赖氨酸侧链的选择性可通过选择反应介质的pH来获得。在N-末端的偶联(pKa～8)是在pH～9进行的，其中ε氨基(pKa～10.6)仍然被质子化。

通过改变烷烃(疏水性)和PEG(亲水性)成分的相对长度，可获得结合物的最佳两亲性和溶液结构。

在制备HPLC柱(C-18)上纯化该反应混合物，用由异丙醇/水(0.1％三氟乙酸)组成的溶剂梯度系统进行纯化。将溶剂在20℃以下温度减压蒸发，获得了干燥的产物。通过反相HPLC和质谱分析产物的纯度。

基于细胞的测定提供了证实LCRF结合物的生物活性(例如结合物引起CCK-释放细胞释放CCK的能力)的快速手段。

可使用基于细胞的测定来比较用本发明结合物处理和用载体处理的效果。天然LCRF引起CCK分泌增加约300％。我们的目的是用本发明结合物将CCK分泌增加至少200％。预计每次实验使用6个测定可提供有统计学显著意义的结果。

可如下所述制备天然CCK细胞：由200-225g的雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠制备肠粘膜细胞。处死后，迅速取出从距离幽门2cm处开始的邻近的10cm小肠，立即置于盐水中，并洗涤。将小肠切成短长度，外翻，并置于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。用PBS将粘膜表面洗涤2次，放置在37℃的不含胰蛋白酶的离解介质中，并轻微搅拌2分钟。除去溶液，用新鲜的离解介质替换，并在轻微搅拌下再培养10分钟。将所得悬浮液过滤(450□m)，并将流出液离心(1000rpm，3分钟)。将离心团重悬在含有HEPES(10mM；pH7.4)的Hank′s平衡盐溶液(HHBSS)中，并如上所述进行离心。将离心团重悬在5ml HHBSS中，并分成用于测试的等分试样。

可如下所述证实结合物的活性：将CCK细胞与测试化合物(或载体)培养5-40分钟。通过将细胞置于冰上来停止培养，将细胞离心，并除去上清液。对于含有可水解的连接物的结合物，在第5、10、15、20、30和40分钟停止培养。对于不含有可水解的连接物的结合物，仅需要使用一个时间点(15分钟)。使用上清液来进行如下所述的CCK的RIA测定。通过HPLC和MALDI-TOF质谱测定50□l上清液以测定保留的LCRF结合物的量。

可使用放射免疫测定(RIA)来测定CCK分泌。测定从铺在24-孔微量滴定板中的CCK-释放细胞中的分泌。将细胞在37℃培养，并用含有HEPES(10mM，pH7.4)的HHBSS洗涤。在5-40分钟的时间点向细胞中加入含有或不含有测试物的0.5ml缓冲液。取出350□l，离心并放置在冰上或冷冻。对于RIA使用300□l样本。RIA是在含有HEPES(10mM，pH7.5)、0.1％γ-球蛋白、和0.01％NaN₃的PBS中进行的。将50□l样本加到200□l RIA缓冲液和100□l 1∶80,000稀释的兔子CCK抗体(OAL-656)中。然后向管中加入100□l ¹²⁵I-CCK-8(3,000-4,000cpm)，在4℃培养12小时。在轻微搅拌下用山羊抗-兔子IgG琼脂糖CL4B珠子将样本处理1小时。然后将琼脂糖珠子短暂离心，并抽吸出离心团。将离心团重悬在0.5ml HEPES缓冲盐水中，将珠子再一次离心。然后取出珠子并洗涤，在γ计数器上将离心团计数5分钟。未结合的LCRF引起从CCK和STC-1细胞的CCK分泌增加了约300％，并用作细胞测定的阳性对照。

对于具有可水解结合物的测试化合物，CCK释放(RIA)可与结合物水解(HPLC-MS)相关联。

可将结合物的精确性质优化以提供所需性质。可测试N-末端和C-末端结合方法以确定N-末端或C-末端结合或者二者是否提供最佳保护和生物活性。

当把LCRF输入到大鼠的十二指肠内时，观察到了胰腺蛋白输出量的二相性剂量-反应曲线，其中较高剂量的LCRF导致胰腺蛋白输出量下降。本领域技术人员可根据本申请的公开内容确定合适的结合物浓度，并且合适的浓度可以为1-1000nM。

据信CCK分泌是由负反馈抑制调控的。LCRF在大鼠十二指肠中组成性地生成，并且对人体中的营养素起反应。当缺乏食物时，LCRF被十二指肠中的蛋白酶降解。因为给十二指肠输入胰蛋白酶抑制剂足以引起大鼠中CCK释放增加，所以我们提出，保护不被胰蛋白酶裂解将足以保护LCRF结合物不发生蛋白酶解消化9。我们已经成功地使用了我们的结合技术来保护降钙素和胰岛素不被蛋白酶解。

结合的LCRF在肠内环境中的稳定性可通过测定在40分钟内(典型的肠经过时间)肽对蛋白酶解酶胰蛋白酶、胰腺弹性蛋白酶、和胰凝乳蛋白酶的稳定性来测定。将结合的LCRF溶液在37℃培养(0.1％吐温20[w/v]，10mM NaHPO₄，pH7.4)，并加入蛋白酶。如果需要的话加入吐温(0.1％)来稳定肽。通过将pH调节至2-3来停止蛋白酶解。通过使用5□m，C-18柱的HPLC分离所得样本；并用90％H₂O/0.1％三氟乙酸和10％2-丙醇-60％2-丙醇的线性梯度以0.5ml/分钟的速度洗脱25分钟。

结合的LCRF在胃中的稳定性可通过测定肽对胃蛋白酶的稳定性来测定。在模拟胃液(33mM NaCl，pH1.2)中测定结合的LCRF的胃蛋白酶降解。将肽溶液在37℃培养，并加入胃蛋白酶。通过将pH增加至7.0-7.5来停止蛋白酶解。

可使用HPLC来监测蛋白酶解。积分吸收峰下的面积(280nm)以确定不同时间的蛋白酶解速度。使用得自未裂解的LCRF结合物的峰积分面积的下降来监测水解速度。如上所述在用于结合LCRF纯化的Specific Aim 1中进行HPLC分离。

胰凝乳蛋白酶裂解位点存在于残基Y17和Y20。如果胰凝乳蛋白酶将肽迅速裂解，我们给具有在pH7.4缓慢水解的键的胰蛋白酶羟基加上保护性PEG基。弹性蛋白酶裂解位点存在于残基5、10、29、30和31。这些残基在对受体结合很关键的区域(11-25)的外面。如果需要的话，可通过肠溶衣包衣—药物工业中的成熟技术来保护不受胃液的影响。

在本发明的一个优选方面，如通过RIA测定的那样，用结合的LCRF治疗时，结合物将CCK释放的基础分泌提高了至少200％。天然LCRF使得从CCK细胞分泌的CCK增加了约300％，并且可用作这些实验的阳性对照。

此外，暴露于丝氨酸蛋白酶(pH7.4)40分钟时，LCRF结合物优选有不到70％被蛋白酶解。还优选的是，暴露于模拟胃液40分钟后，肠溶衣包衣的LCRF结合物有不到10％被蛋白酶解。

借助于本发明公开内容，本领域技术人员可在动物模型和人个体中证实与进食和肥胖有关的生理和行为后果。使用大鼠肠作为纯化粘膜CCK细胞的组织源。将大鼠处死，以采集肠组织。处死后，手术除去肠，洗涤，并通过胶原酶和EDTA分散来制备肠细胞。2.5-3个月大小、体重250-300g的雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠可作为CCK细胞的来源。为了让提出的实验产生有意义的结果，需要大约48只大鼠。对于大鼠中CCK分泌的调控已经作了很多研究。对于一个实验，每只大鼠应当提供足够的CCK细胞。将大鼠处死以采集肠组织。安乐死方法优选为CO₂麻醉，对于此，将大鼠置于含有CO₂的气密笼子中。该方法与美国兽医协会的安乐死小组(the Panel on Euthanasia ofthe American Veterinary Medical Association)的推荐一致。

Claims (32)

1.包含与一个或多个非天然聚合物分子偶联的LCRF的LCRF组合物，所述聚合物包含亲脂性部分和亲水性聚合物部分，因此给组合物带来了平衡的亲脂性和亲水性特征，使得组合物可溶于可药用溶剂中，并能够与生物膜相互作用。

2.包含与一个或多个非天然聚合物分子偶联的LCRF的LCRF组合物，所述聚合物包含：(i)亲脂性部分；和(ii)亲水性聚合物部分，因此给结合物带来了平衡的亲脂性和亲水性特征，使得结合物可溶于可药用溶剂中，并能够与生物膜相互作用。

3.包含与一个或多个非天然聚合物分子偶联的LCRF的肽组合物，所述聚合物包含亲脂性部分和亲水性部分，其中所述组合物溶于含水溶剂中，并且LCRF能有效地预防或治疗肥胖。

4.权利要求1的肽组合物，其中所述非天然聚合物包含(i)直链聚亚烷基二醇部分和(ii)亲脂性部分。

5.权利要求1的肽组合物，其中：

(a)非天然聚合物包含：

(i)直链聚亚烷基二醇部分；和

(ii)亲脂性部分；和

(b)LCRF，其中直链聚亚烷基二醇部分和亲脂性部分彼此相关构象排列，使得与天然LCRF相比，所述组合物中的LCRF具有增强的抗酶降解的体内抗性。

6.包含与一个或多个聚合物分子偶联的LCRF的LCRF组合物，所述聚合物包含：(i)直链聚亚烷基二醇部分和(ii)亲脂性部分，其中所述生理活性肽、直链聚亚烷基二醇部分和亲脂性部分彼此相关构象排列，使得与单独的LCRF相比，所述LCRF组合物中的LCRF具有增强的抗酶降解的体内抗性。

7.包含甘油三酯主链部分的多配体结合的LCRF复合物，所述复合物具有：

(a)经由键合在甘油三酯主链部分的碳原子上的聚亚烷基二醇间隔基团与甘油三酯主链部分共价偶联的LCRF；和

(b)直接与甘油三酯主链部分的碳原子共价连接或者经由聚亚烷基二醇间隔基团共价连接的至少一个脂肪酸部分。

8.权利要求7的多配体结合的LCRF复合物，其中甘油三酯主链部分的α′和β碳原子上具有脂肪酸部分，所述脂肪酸部分通过与其直接共价键合连接，或者经由聚亚烷基二醇间隔基团与其间接共价键合连接。

9.权利要求8的多配体结合的LCRF复合物，其中脂肪酸部分通过直接共价键合或者经由聚亚烷基二醇间隔基团连接在甘油三酯主链部分的α和α′碳上，LCRF通过与其直接共价键合或者经由聚亚烷基间隔基团与其间接键合而与甘油三酯主链部分的β-碳偶联。

10.包含聚山梨醇酯部分的聚山梨醇酯复合物，所述聚山梨醇酯部分包括甘油三酯主链，其中甘油三酯主链具有与其一个α、α′和β碳原子共价偶联的脂肪酸基团，具有与其一个α、α′和β碳原子共价偶联的聚亚烷基二醇基团。

11.权利要求10的聚山梨醇酯复合物，其中聚山梨醇酯部分具有与其共价键合的生理活性部分。

12.权利要求11的聚山梨醇酯复合物，其中所述生理活性部分共价键合到聚乙二醇基团上。

13.稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与聚乙二醇修饰的糖脂部分稳定且结合偶联的LCRF。

14.权利要求13的LCRF复合物，其中LCRF通过在聚LCRF的游离氨基酸基团上的不稳定共价键与聚乙二醇修饰的糖脂共价偶联，其中，所述不稳定的共价键在体内可通过生化水解和/或蛋白酶解裂解掉。

15.权利要求13的LCRF复合物，其中所述聚乙二醇修饰的糖脂部分包含聚山梨醇酯聚合物。

16.权利要求15的LCRF复合物，其中所述聚山梨醇酯聚合物包含选自下列的脂肪酸酯基团：一棕榈酸酯、二棕榈酸酯、一月桂酸酯、二月桂酸酯、三月桂酸酯、一油酸酯、二油酸酯、三油酸酯、一硬脂酸酯、二硬脂酸酯、和三硬脂酸酯。

17.权利要求16的LCRF复合物，其中所述聚乙二醇修饰的糖脂部分包含选自脂肪酸的聚乙二醇醚、和脂肪酸的聚乙二醇酯的聚合物，其中所述脂肪酸包括选自月桂酸、棕榈酸、油酸、和硬脂酸的脂肪酸。

18.权利要求16的LCRF复合物，其中所述复合物包含聚山梨醇酯部分，所述聚山梨醇酯部分包括甘油三酯主链，其中甘油三酯主链具有与其一个α、α′和β碳原子共价偶联的脂肪酸，具有与其一个α、α′和β碳原子共价偶联的聚亚烷基二醇基团。

19.权利要求18的LCRF复合物，其中LCRF与甘油三酯主链在其β碳原子上共价偶联。

20.权利要求19的LCRF复合物，其中所述甘油三酯主链包含在甘油三酯主链的β碳原子与一个α、α′碳原子之间的生物相容性二价间隔基团。

21.包含聚山梨醇酯部分的聚山梨醇酯复合物，所述聚山梨醇酯部分包括甘油三酯主链，其中甘油三酯主链具有与独立地选自其α、α′和β碳原子的碳原子共价偶联的官能团，所述官能团包括：

(a)脂肪酸基团；和

(b)具有与其共价键合的生理活性部分的聚乙二醇基团。

22.权利要求21的聚山梨醇酯复合物，其中所述生理活性部分共价键合到聚乙二醇基团的末端官能团上。

23.权利要求1的LCRF组合物，其中所述非天然聚合物的分子量为约500-约10,000道尔顿。

24.治疗肥胖的口服剂型，其中包含可药用载体和稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂部分偶联的LCRF。

25.在表现出肥胖的人或非人哺乳动物个体中治疗肥胖的方法，包括给所述个体口服施用有效量的结合的LCRF组合物，所述组合物包含稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂部分共价偶联的LCRF。

26.在人或非人哺乳动物个体中预防或干预性地治疗可能或已发展成的肥胖的方法，包括给所述个体口服施用有效量的结合的LCRF组合物，所述组合物包含稳定的、水溶性的结合的LCRF复合物，所述复合物包含与生理相容性聚乙二醇修饰的糖脂部分共价偶联的LCRF。

27.在体内或体外系统中延长LCRF活性的方法，包括将LCRF与包含亲脂性部分和亲水性聚合物部分的一个或多个非天然聚合物分子结合性地偶联，以形成结合偶联的聚合物-LCRF组合物，并将该结合偶联的聚合物-LCRF组合物引入到体内或体外系统中。

28.权利要求27的聚合物-LCRF结合物，其中所述LCRF是LCRF。

29.下式化合物：

其中n为3-230，且m为0-20。

30.下式化合物：其中n为3-230，m为0-20，且X选自N、O或S。

31.下式化合物：其中n为3-230，且m为0-20。

32.下式化合物：

其中n为3-230，m为0-20，且X选自N、O或S。

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