CN1431514A - 检测弓形虫抗体IgG免疫胶体金试剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
检测弓形虫抗体IgG免疫胶体金试剂及制备方法，检测风疹病毒抗体IgG的免疫胶体金试剂及制备方法，该试剂包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。结合垫上包被了蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物。硝酸纤维素膜上包被了弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A(或羊抗兔IgG)。该试剂是一种特异性强、敏感性高、简易快速、费用低廉、能现场检测，全过程只需30分钟，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测抗体的免疫胶体金试剂，还涉及该试剂的制备方法。
背景技术
现有检测弓形虫抗体IgG的方法主要是通过酶联免疫吸附(EIA)和免疫胶体金渗滤法来检测，这两种方法均有缺陷或不足。酶联免疫吸附(EIA)方法的缺陷是：需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用；试剂需要低温保存；检测操作人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长；检测所需费用较高，不能实现单人份检测；不利于在基层单位进行推广使用。免疫胶体金渗滤法的缺陷是：操作过程相对比较复杂，不能实现一步操作；试剂需要低温保存；检测所需时间较长、检测所需费用较高。
发明内容
本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种不需要特定仪器设备辅助的检测试剂，并且能有效地降低检测成本，减轻需检测人员的负担。同时提供该试剂的制备方法。
检测弓形虫抗体IgG免疫胶体金试剂及制备方法，该试剂包括结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。结合垫上包被了蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被了弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A(或羊抗兔IgG)。如果用蛋白A来标记胶体金，则用鸡抗蛋白A来作为控制线；如果用兔抗人IgG来标记胶体金，则用羊抗兔IgG来作为控制线。
该试剂的制备方法包括以下步骤：(1)蛋白A或兔抗人IgG的制备：如果使用蛋白A，一般就直接购买；兔抗人IgG的制备可通过以下方法：提取人抗血清免疫家兔，纯化后得兔抗人IgG；(2)制备多克隆抗体：用弓形虫特异性表面膜抗原多次免疫家兔，提取抗血清免疫山羊，纯化后得羊抗兔IgG；(3)制备胶体金：用柠檬酸三钠等还原剂将氯金酸还原成20nm～40nm的胶体金颗粒；(4)制备单克隆抗体胶体金标记物：将胶体金与蛋白A(或兔抗人IgG)按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混匀，使胶体金与蛋白A(或兔抗人IgG)形成稳定的胶体颗粒，通过纯化浓缩形成蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物；(4)将蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A(或羊抗兔IgG)包被在硝酸纤维素膜的检测区和控制区，充分干燥。
本发明的积极效果在于：价格低廉，生产流程简单，成本低，检测的费用比使用其它方法要便宜得多；检测速度快，全过程只需30分钟，可以实现自我检测；可以现场检测；特异性好、灵敏度高、重复性好；操作简便，快速定性，结果准确、快速，操作简便，无需冲洗过程和标准对照，可分批或单个样品及时检测；易于推广使用，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作。
具体实施方式
将PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。结合垫上包被了蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物。硝酸纤维素膜上包被了弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A(或羊抗兔IgG)，具体由标记用的是蛋白A还是兔抗人IgG来决定。如果用蛋白A来标记胶体金，则用鸡抗蛋白A来作为控制线；如果用兔抗人IgG来标记胶体金，则用羊抗兔IgG来作为控制线。
按以下步骤制备：(1)兔抗人IgG的制备：提取人抗血清免疫家兔，纯化后得兔抗人IgG；(2)制备多克隆抗体：用弓形虫特异性表面膜抗原多次免疫家兔，提取抗血清免疫山羊，纯化后得羊抗兔IgG；(3)制备胶体金：将100ml 0.01％氯化金用0.9ml 1％柠檬酸三钠还原成40nm大小的颗粒；(4)制备蛋白A—胶体金标记物：用0.1mol/LK2CO3将胶体金溶液的pH值调至6.5左右，将胶体金溶液与单克隆抗体按100ml胶体金溶液中加入0.8mg蛋白A的比例混合均匀，使胶体金与抗体形成稳定的胶体金复合物，再通过多次离心、弃上清、清洗，通过纯化浓缩形成兔抗人IgG—胶体金标记物，冷藏备用；(5)将蛋白A—胶体金标记物喷涂在胶体金结合垫上，将弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A喷涂在硝酸纤维素膜上，充分干燥；(6)将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫等依次粘在PVC背衬上；(7)将粘好的PVC材料切成一定宽度的试剂条，即制成检测弓形虫抗体IgG免疫胶体金试剂。
在检测前先将样本和试剂条(板)放在室温条件下放置一段时间(10分钟)，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试剂条，按MARK线下箭头所示的方向将试剂条浸入样本溶液中，液面不得超过MARK线，5秒～8秒后取出，平放在操作台上；如果是试剂板：从铝箔袋中取出检测试剂板，平放在操作台上，往加样孔中滴加3滴(约120ul)样品溶液(血清)；3分钟～15分钟内即可判断结果，30分钟后判断的结果为无效。结果判断：如果样品中有要检测的“弓形虫抗体IgG”存在，则检测线处出现红色条带，同时质控线上也出现红色条带，此时结果为阳性；如果样品中没有要检测的“弓形虫抗体IgG”存在，则检测线处无条带出现，但质控线上出现红色条带，此时结果为阴性。如果质控线上没有红色条带出现，则产品无效。
Claims (2)
1、检测弓形虫抗体IgG免疫胶体金试剂及制备方法，该试剂包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫上包被了蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被了弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A(或羊抗兔IgG)。
2、根据权利要求1所述的检测弓形虫抗体IgG免疫胶体金试剂及制备方法，其特征在于该试剂的制备方法包括以下步骤：(1)蛋白A或兔抗人IgG的制备：如果使用蛋白A，一般就直接购买；兔抗人IgG的制备可通过以下方法：提取人抗血清免疫家兔，纯化后得兔抗人IgG；(2)制备多克隆抗体：用弓形虫特异性表面膜抗原多次免疫家兔，提取抗血清免疫山羊，纯化后得羊抗兔IgG；(3)制备胶体金：用柠檬酸三钠等还原剂将氯金酸还原成20nm～40nm的胶体金颗粒；(4)制备单克隆抗体胶体金标记物：将胶体金与蛋白A(或兔抗人IgG)按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混匀，使胶体金与蛋白A(或兔抗人IgG)形成稳定的胶体颗粒，通过纯化浓缩形成蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物；(5)将蛋白A(或兔抗人IgG)—胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将弓形虫特异性表面膜抗原和鸡抗蛋白A(或羊抗兔IgG)包被在硝酸纤维素膜的检测区和控制区，充分干燥。
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|---|---|---|---|---|
| CN103901194A (zh) * | 2012-12-26 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 山羊弓形虫病检测免疫试纸及其制备方法 |
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2003
- 2003-01-24 CN CN 03115145 patent/CN1431514A/zh active Pending
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| CN103901194A (zh) * | 2012-12-26 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 山羊弓形虫病检测免疫试纸及其制备方法 |
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