CN1431321A

CN1431321A - 组装式化合物阵列芯片及制备方法

Info

Publication number: CN1431321A
Application number: CN 03112772
Authority: CN
Inventors: 肖鹏峰; 刘全俊; 王红; 陆祖宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-01-28
Filing date: 2003-01-28
Publication date: 2003-07-23

Abstract

本发明组装式化合物阵列芯片及其制备方法，涉及的是一种组装式化合物分子检测芯片及其制备工艺方法。组装式化合物阵列芯片结构包括支撑物、载体和多聚物化合物分子。支撑物上组装有若干载体，各自载体上合成有对应的多聚物化合物分子。载体及其对应的多聚物化合物分子在支撑物上的位置是已知的，其中的多聚物化合物分子与特定流体相互作用后，其性质的改变可以通过光学等方法进行检测。编码载体上不同多聚物化合物分子采用组合化学法合成，将不同多聚物化合物分子相同位置具有相同单体分子的合并进行相同的化学反应。这里的多聚物化合物分子是指由数目不多的小分子为单体构成的化合物分子，主要包括寡核苷酸、多肽、多糖、以及肽核酸等生物大分子。

Description

组装式化合物阵列芯片及其制备方法

技术领域

本发明组装式化合物阵列芯片及其制备方法涉及的是一种组装式化合物分子检测芯片及其制备工艺方法。

背景技术

组合化学是获得大量不同化合物的一种快速方法。对于象寡核苷酸、多肽类由数目不多的小分子单体构成的大分子化合物，通过组合化学方法可以在较短时间内获得大量的同类不同化合物。通过组装方式可以将这些不同化合物构建成阵列生物芯片。生物芯片主要指在固相载体表面组装的生物活性物质(包括核酸、蛋白质、细胞及微小组织等)构成的微阵列，以实现对化合物(包括药物)、蛋白质、核酸、细胞以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的筛选或检测。

生物芯片在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义。生物芯片的制备方法有在片(原位)合成和离片(点样)合成两种。原位合成高密度芯片是利用组合化学方法通过掩膜板(或虚拟掩膜板)将合成位点分次激活然后将碱基A、G、C、T分次偶联在相应的位点。原位合成的主要缺点是合成过程中偶联试剂的污染造成合成产物的错误、同时偶联过程中也很难保证所有位点合成时的反应条件完全一致，从而导致合成位点上化合物分子的质与量间产生差异，最终得出的信息错误率高(假如合成相同的寡核苷酸序列，则通过杂交给出的结果会不一样)。另外，原位合成虽然批量化生产成本低，但现有的原位合成方法均存在灵活性差的不足，制备任何一种芯片均需要花费很大的人力和财力进行一套掩膜板(掩膜板数一般为合成寡核苷酸中碱基数的四倍)的设计和生产；点样法制备低密度芯片是先将寡核苷酸序列合成、纯化，然后通过合成在寡核苷酸序列上的活性基团与基片相应位置上的活性基团连接。其主要缺点为购买探针的费用高，探针上合成一个固定其于基片上的活性基团(如氨基等)的价格目前相当于合成50个碱基的寡核苷酸序列的价格。其次，点样过程中样品量的不同、反应条件的不同也会导致各位置上目的化合物分子数目的不一致。

发明内容

本发明针对目前常规生物芯片在研究和开发中存在的不足之处，提出了一种组装式化合物阵列芯片及其制备方法，结合在片合成中直接合成(固定)探针的优点和离片合成中的灵活性，用少量的试剂，通过组合化学方法在编码的相同固相载体上按一批或者多批次合成大量不同的化合物，然后随意将不同编码的固相载体(表面通过组合合成了对应的化合物)构建化合物阵列。提供一种芯片信息准确率高且制作成本低的化合物阵列芯片的组装式制备方法。

组装式化合物阵列芯片及其制备方法是采取以下方案实现的：组装式化合物阵列芯片其特征在于结构包括支撑物、载体和多聚物化合物分子；支撑物上组装有若干载体，各自载体上合成有对应的多聚物化合物分子，组装式化合物阵列芯片上载体所对应的多聚物化合物分子与该多聚物化合物在阵列芯片上的位置是一一对应的。组装式化合物阵列芯片其特征在于支撑物采用基片、玻璃管、塑料管、塑料盘管等。

组装式化合物阵列芯片的制备方法中：(1)根据待制备的化合物阵列芯片上欲合成的多聚物化合物分子的要求，按下述操作分别在各自编码的载体上合成对应的多聚物化合物分子：先将成堆载体与多聚物化合物分子的第一位置对应的单体分子溶液进行第一次反应，再将已合成第一个单体的成堆载体与多聚物化合物分子的第二位置相对应的单体分子溶液进行第二次反应，以后仍然按照欲合成的多聚物化合物序列的要求，逐次将当次载体上的反应物与下一位置相对应的单体分子溶液进行反应，直至在载体上合成了所需的完整多聚物化合物分子。(2)在第一步操作获得了待制备的化合物阵列芯片上所需的多聚物分子后，将载体连同对应的多聚物分子一同组装于一支撑物上。这里的多聚物化合物分子是指(单体不局限于)由数目不多的小分子为单体构成的化合物分子；主要包括寡核苷酸、多肽、多糖、以及肽核酸等生物大分子；载体材料由无机材料：玻璃、石英、陶瓷、晶体、金属；有机材料：橡胶、塑料、凝胶、尼龙、生物大分子、导电聚合物等高分子材料，或者是由上述无机材料和有机材料的复合物；载体的编码是在固相载体上的直接标记，或者是固相载体上的间接或虚拟标记，固相载体的编码的目的为方便固相载体上不同化合物分子的组合合成以及识别固相载体表面上合成后所携带的化合物分子。

组装式化合物阵列芯片中的化合物分子与流体相互作用后，其性质的改变可以通过光学、电学、磁学、声学、或者热学等方法进行检测；载体表面合成的不同多聚物分子在流体作用下不会发生迁移。

有益效果(1)由于本发明是将可以集中的载体集中在一起，形成成堆载体，这既可以使欲合成相同多聚物分子的载体集中合成多聚物分子，也可以在用于合成不同多聚物分子的过程中的某个位置的多聚物单体分子相同的时候，将这些载体或前一次反应所得物集中成堆，置于反应液中同时反应，因此，本发明的合成多聚物分子的成本低，其芯片的制造成本也低；而本发明将多聚物分子分别合成在各自编码的载体上，然后再将这些合成有多聚物分子的载体排列在基片上，从而使本发明制造的芯片具有芯片信息准确率高的优点。(2)本发明采取的根据当前位置欲合成的多聚物单体分子是否相同的原则进行集中分类成堆，将用于当前位置欲合成的相同多聚物单体分子的载体或者前一次反应所得物集中形成成堆载体，并将载体进行集中反应，从而避免了合成过程中的相互污染，进一步提高了芯片制作准确率，降低了成本。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述：

图1是本发明提出的组装式化合物阵列芯片结构示意图。

图2本发明提出的组合化学合成不同化合物的示意图。

图3本发明提出的具有编码的不同化合物构建化合物阵列芯片示意图。

图4本发明提出的固态载体阵列与特定的流体相互作用后给出的分析检测结果示意图。

具体实施方式

参照附图1，组装式化合物阵列芯片结构包括多聚物化合物分子1(放大示意)、载体2、支撑物3玻璃管或者支撑物4基片。支撑物采用基片、玻璃管、塑料管、塑料盘管。

图2为本发明提出的组合化学合成不同化合物的示意图：将大面积固相载体编码，每个编码的固相载体数可以是1也可以很大。编码固相载体按要求分类成堆，然后同堆固相载体进行相同的化学反应。这种分类可以只进行一次，使同堆编码的固相载体表面具有相同的化合物；也可以反复进行许多次，最后使不同编码的固相载体具有不同的化合物。固相载体表面相应的化合物合成后，将固相载体进行切割成数目众多的更少固相载体，此时更少的固相载体至少有一个识别面上含有合成的化合物分子。

图3本发明提出的具有编码的不同化合物构建化合物阵列芯片示意图。从每个编码的具有相应化合物的固相载体中取出一粒或者多粒填充于微小直线空心管中便构成化合物的一维阵列；从每个编码的具有相应化合物的固相载体中取出一粒或者多粒分布于一平面载体上便构成化合物的平面二维阵列。

图4本发明提出的固态载体阵列与特定的流体相互作用后给出的分析检测结果示意图。含有待检测物质的流体在一定条件下通过固态载体阵列中的某些化合物发生相互作用，在特定的检测仪下得到发生相互作用的结果。通过分析检测作用的结果确定那些化合物(坐标位置对应其编码)与流体中的物质发生了作用。

以下结合具体实施例进一步说明本发明：

实施例一：寡核苷酸化合物的组合合成及其化合物阵列芯片的制备。将玻璃片表面清洗、干燥后，分别放入APTS(氨基丙基三乙氧基硅烷)的苯溶液中反应2小时，在苯中漂洗后再放入琥珀酸的苯溶液中反应1小时，从而在玻璃表面形成羟基。然后将这些表面具有羟基的玻璃片进行编码。将所有编码的玻璃片按一定方式分成四堆，第一堆玻璃片在含有5’-OH已用二对甲氧三笨甲基(DMT)保护的dAdp和四唑(催化剂)的无水乙腈溶液的第一个反应池中进行偶反应，玻璃片表面的羟基便偶联上碱基A，第二堆玻璃片在含有5’-OH已用二对甲氧三笨甲基(DMT)保护的dGdp和四唑(催化剂)的无水乙腈溶液的第二个反应池中进行偶反应，玻璃管片表面的羟基便偶联上碱基G，第三堆玻璃片在含有5’-OH已用二对甲氧三笨甲基(DMT)保护的dCdp和四唑(催化剂)的无水乙腈溶液的第三个反应池中进行偶反应，玻璃管片表面的羟基便偶联上碱基C，第四堆玻璃片在含有5’-OH已用二对甲氧三笨甲基(DMT)保护的dTdp和四唑(催化剂)的无水乙腈溶液的第四个反应池中进行偶反应，玻璃片表面的羟基便偶联上碱基T。偶联反应完成后，将粘附在玻璃片表面的未参加反应物用乙腈溶剂洗净。然后将上述四堆玻璃片并成一堆，并在第五个反应池中分别用乙酸/乙酸酐溶液进行封闭反应、碘试剂进行氧化反应和三氯乙酸/二氯甲烷溶液进行脱保护反应。使玻璃片表面未进行反应的羟基被封闭，核苷酸上的磷变成稳定的五价磷并使5’-OH上的保护基团DMT被脱出得到活化。进行上述操作后，所有玻璃片表面上合成了第一个碱基，这个碱基是A，G，C，T中其中的一个。然后将上述编码玻璃片表面已合成一个碱基的玻璃片按照合成的要求重新分成四堆。两次分类中每堆玻璃片的数量不尽相同。两片不同的玻璃片在二次分类中可以属于同一堆，也可以不属于同一堆。然后，按同样的方法，第一堆在第一个反应池中进行偶反应，使玻璃片上在已经合成的第一个碱基上偶联A，第二堆在第二个反应池中进行偶反应，使玻璃片上在已经合成的第一个碱基上偶联G，第三堆在第三个反应池中进行偶反应，使玻璃片上在已经合成的第一个碱基上偶联C，第四堆在第三个反应池中进行偶反应，使玻璃片上在已经合成的第一个碱基上偶联T。偶联反应完成后，将粘附在固相材质表面的未参加反应物用溶剂洗净。然后将上述四堆并成一堆，在第五个反应池中进行封闭反应、氧化反应和脱保护反应。进行上述操作后，所有编码的玻璃片表面上均合成了含2个碱基的寡核苷酸，寡核苷酸的形式为十六中形式中的一种。十六中形式包括AA，AG，AC，AT，GA，GG，GC，GT，CA，CG，CT，CA，TA，TG，TC，TT。按照上述同样的方法，每次根据合成的要求将所有玻璃片分成四堆，相同堆进行相同的偶联反应，同时完成相应的封闭、氧化和脱保护反应，则所有编码玻璃片表面上的寡核苷酸便增加了一个碱基。所以欲合成20个碱基的寡核苷酸便进行20次分类并进行相应次数化学反应。不同寡核苷酸序列的多少与分类的次数无关，但与分类的工作量相关。寡核苷酸序列的越多，分类的工作量越大。

所有编码的玻璃片完成寡核苷酸序列合成后进行后处理，使寡核苷酸上碱基和磷的保护基团被脱出，这样便具有了生物活性。

将合成具有生物活性的寡核苷酸的玻璃片切割成少的玻璃块，切割后的玻璃小块至少有一个识别面合成有对应的寡核苷酸。相同编码的玻璃片切割成的很多玻璃小块均具有相同的编码和相同序列的寡核苷酸。

从每个编码的玻璃小块(具有相应序列的寡核苷酸)中取出一块或者多块排布并固定于一平面基片上，由于玻璃小块已经合成了对应的寡核苷酸且固定在平面基片上的位置是已知的，因而这些固定在基片上的玻璃小块便构成了寡核苷酸序列的阵列芯片。寡核苷酸阵列芯片与特定的反应物相互作用(杂交)后在特定的检测仪下给出的检测结果。

Claims

1、一种组装式化合物阵列芯片其特征在于结构包括支撑物、载体和多聚物化合物分子；支撑物上组装有若干载体，各自载体上合成有对应的多聚物化合物分子。

2、根据权利要求1所述的组装式化合物阵列芯片其特征在于支撑物采用基片、玻璃管、塑料管、塑料盘管。

3、根据权利要求1所述的组装式化合物阵列芯片的制备方法其特征在于：(1)根据待制备的化合物阵列芯片上欲合成的多聚物化合物分子的要求，按下述操作分别在各自的载体上合成对应的多聚物化合物分子：先将成堆载体与多聚物化合物分子的第一位置对应的单体分子溶液进行第一次反应，再将已合成第一个单体的成堆载体与多聚物化合物分子的第二位置相对应的单体分子溶液进行第二次反应，以后仍然按照欲合成的多聚物化合物序列的要求，逐次将当次载体上的反应物与下一位置相对应的单体分子溶液进行反应，直至在载体上合成了所需的完整多聚物化合物分子；(2)在第一步操作获得了待制备的化合物阵列芯片上所需的多聚物分子后，将载体连同对应的多聚物分子一同组装于一支撑物上。

4、根据权利要求3所述的组装式化合物阵列芯片制备方法，其特征在于根据载体上的多聚物化合物分子在待制备的化合物阵列芯片上位置的要求，将载体连同对应的多聚物化合物分子一同组装于一支撑物上。

5、根据权利要求3所述的组装式化合物阵列芯片制备方法，其特征在于将用于合成不相同的多聚物化合物分子的载体进行编码，再将欲合成的不相同的多聚物化合物分子分别与不同编码的载体相对应，然后将欲合成的第一位置单体相同的多聚物化合物分子所对应的载体集中在一起形成相应的成堆载体，再将成堆载体置于多聚物化合物分子的第一位置相对应的单体分子溶液中进行反应；以后，将下一位置单体相同的多聚物化合物分子所对应的载体重新集中在一起形成相应的成堆载体，并将成堆载体与所对应的单体分子溶液进行反应；以此类推，逐位置成堆反应，直至在载体上合成了所需的完整多聚物化合物分子。

6、根据权利要求3所述的组装式化合物阵列芯片制备方法，其特征在于多聚物化合物分子是指由数目不多的小分子为单体构成的化合物分子；主要包括寡核苷酸、多肽、多糖、以及肽核酸等生物大分子。

7、根据权利要求3所述的组装式化合物阵列芯片制备方法，其特征在于载体材料由无机材料：玻璃、石英、陶瓷、晶体、金属；有机材料：橡胶、塑料、凝胶、尼龙、生物大分子、导电聚合物等高分子材料，或者是由上述无机材料和有机材料的复合物。

8、根据权利要求5所述的组装式化合物阵列芯片制备方法，其特征在于载体的编码是在固相载体上的直接标记，或者是固相载体上的间接或虚拟标记，固相载体的编码的目的为方便固相载体上不同化合物分子的组合合成以及识别固相载体表面上合成后所携带的化合物分子。

9、根据权利要求1所述的组装式化合物阵列芯片，其特征在于其中的化合物分子与流体相互作用后，其性质的改变可以通过光学、电学、磁学、声学、或者热学等方法进行检测。

10、根据权利要求1所述的组装式化合物阵列芯片，其特征在于载体表面合成的不同多聚物分子在流体作用下不会发生迁移。