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CN1418251A - 人干扰素α的表达和分泌载体及通过使用这种载体产生人干扰素α的方法 - Google Patents

人干扰素α的表达和分泌载体及通过使用这种载体产生人干扰素α的方法 Download PDF

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CN1418251A CN01803860A CN01803860A CN1418251A CN 1418251 A CN1418251 A CN 1418251A CN 01803860 A CN01803860 A CN 01803860A CN 01803860 A CN01803860 A CN 01803860A CN 1418251 A CN1418251 A CN 1418251A
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Abstract

本发明公开了一种分泌性产生人干扰素α(hIFNα)的表达载体，包含一种编码修饰的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸，和一种连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸；用所述表达载体转化的微生物；以及通过培养所述微生物分泌性产生人干扰素的方法，所述方法能将可溶形式的活性hIFNα分泌进大肠杆菌细胞周质中，所述可溶形式的活性hIFNα在其N末端没有附加的甲硫氨酸残基。

Description

人干扰素α的表达和分泌载体及通过使用 这种载体产生人干扰素α的方法
发明领域
本发明涉及一种分泌性产生人干扰素α(hIFNα)的表达载体，其包含一种编码修饰的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸和一种连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸；本发明还涉及一种用这种表达载体转化的微生物；和一种在大肠杆菌细胞周质中分泌性产生hIFNα的方法，所述hIFNα在其N末端没有添加甲硫氨酸。
发明背景
Isaacs and Lindenmann在1957年报道了当将小鸡用流感病毒A感染时，产生一种称为干扰素的病毒复制抑制因子(Isaacs，K和Lindenmann，J.Proc.R.Soc.Lond.，B 147：258-267，1957)。
人干扰素是细胞因子蛋白，其抑制体内免疫应答或病毒复制，而且根据产生它们的细胞类型将干扰素分为干扰素α(IFNα)，干扰素β(IFNβ)和干扰素γ(IFNγ)(Kirchner，H.等，Tex.Rep.Biol.Med.，41：8993，1981；Stanton，G.J.等，Tex.Rep.Biol.Med.，41：84-88，1981)。
已经熟知这些干扰素在抗病毒，抗癌，NK(天然杀伤)细胞活化和骨髓细胞抑制活动中一起发挥协同作用(Klimpel等，免疫学杂志129：76-78，1982；Fleischmann，W.R.等，国际癌症研究杂志65：863-966，1980；Weigent，等，感染免疫学，40：35-38，1980))。另外，干扰素可以作为基因在细胞中表达，结构和功能的调节因子，并示出直接抗增殖作用。
IFNα是在白细胞受到B细胞促分裂原、病毒或癌细胞刺激时产生的。到目前为止，已经报道了编码20种以上干扰素的基因，每种基因均含有165或166个氨基酸。
用于早期临床试验的IFNα是从用Sendai病毒刺激棕黄层白细胞时获得的，而且其纯度仅在1％以下(Cantell，K.和Hirvonen，Tex.Rep.Biol.Med.，35：138-144，1977)。
在20世纪80年代已经可以通过基因重组方法产生大量具有生物物理学活性的IFNα(Goedell，D.V等，自然287：411-416，1980)。使用重组IFNα的临床试验已经示出其在治疗各种固体癌症，尤其膀胱癌，肾癌，HIV相关的Kapos′s肉瘤等疾病中是有效的(Torti，F.M.，J.Clin.Oncol.，6：476-483，1988；Vugrin，D.等，Cancer Treat.Rep.，69：817-820，1985；Rios，A.，等，J.Clin.Oncol.，3：506-512，1985)。其在治疗丙型肝炎病毒中也是有效的(Davis，G.G等，N.Engl.J.Med.，321：1501-1506，1989)，而且其作为治疗剂的可应用范围一天天扩大。
从白细胞中克隆IFNα基因的结果示出IFNα是由一组至少10种不同的基因编码的。这表明基因的DNA序列不是产生一种蛋白质，IFNα是具有相似结构的亚型蛋白的混合物。这种亚型蛋白称为IFNα-1，2，3，依此类推(自然，290：20-26，1981)。
在一些类型的干扰素中，纯化自人白细胞的hIFNα的分子量为17,500-21,000，并具有非常高的大约2×108IU/mg蛋白质的天然活性。在体外，IFNα是一种由165个氨基酸组成的蛋白质。当第23位氨基酸是赖氨酸时，其被称为IFNα-2a(SEQ ID NO：1)，当第23位氨基酸是精氨酸时，其被称为IFNα-2b(SEQ ID NO：2)。在开始阶段，hIFNα是使用细胞培养的方法产生的。然而，这种方法不适于商业化，因为其产量较低，大约为250ug/L。
为解决这个问题，通过使用基因重组方法从微生物中回收大量干扰素的方法已经研制并使用。
最广泛应用的是一种使用大肠杆菌的方法，其根据大肠杆菌细胞的特性，产生由166或167个氨基酸组成的IFNα。这些产物具有额外的甲硫氨酸残基，这些残基是通过存在于起始密码子位点的ATG密码子的作用添加在N末端。然而，已经有报道在人生长激素的情况中，添加的甲硫氨酸残基能引发有害的免疫应答(EP专利出版物No.256,843)。
另外，大多数表达的hIFNα以不溶的包含体形式累积在细胞质中，而且在纯化期间必须通过重折叠转变为活性形式。由于这种重折叠方法不是有效的，因此hIFNα部分以还原形式存在，或形成分子内二硫键偶联体或缺陷的二硫键偶联体。这些副产物很难除去，由此导致非常低的产量。尤其地，非常难以除去非所需的干扰素副产物如错误折叠的干扰素。
近年来为解决与在微生物细胞内产生外源蛋白相关的上述问题，进行了各种努力以研制一种基于有效分泌可溶形式的不携带添加在N末端的额外甲硫氨酸的靶蛋白的方法。
在这种方法中，所需的蛋白是以融合蛋白的形式表达的，其携带一个附着于其N末端的信号肽。当融合蛋白穿经细胞膜时，通过大肠杆菌中的酶除去信号肽，而且所需蛋白是以天然形式分泌的。
分泌性生产方法比微生物生产方法更有优势，其中产生的蛋白质的氨基酸序列和较高级的结构通常与野生型的相同。然而，分泌性生产方法的产量通常非常低，因为其在细胞膜转运和随后的纯化过程中不是很有效。因为在原核细胞生物中以分泌的形式产生的哺乳动物蛋白的产量比在原核细胞中以相同方式产生的原核细胞性蛋白产量更低。因此，已经尝试研制一种更有效的分泌性生产方法。例如，韩国专利出版物No.93-1387揭示了一种使用大肠杆菌碱性磷酸酶大量生产IFNα的方法，但这种方法的产量是非常低的，为109IU/L培养基(10ug/L培养基)。因此，热切希望研制出一种方法，这种方法可以使用微生物大量生产可溶性IFNα，而且不具有添加在N末端的额外的甲硫氨酸残基。
本发明人预先产生了大肠杆菌耐热肠毒素II的一种新的信号肽(韩国专利申请No.98-38061和99-27418)，并发现这种新的分泌性信号肽可以用于大量生产天然形式的IFNα。即本发明人已经构建了一种表达载体，其含有一种通过将IFNα编码基因而不是肠毒素II编码基因连接于修饰的大肠杆菌分泌性信号肽而获得的基因，并研制了一种分泌性生产具有天然生物学活性的IFNα的方法，通过培养用所述表达载体转化的微生物经微生物分泌系统产生。
发明概述
因此，本发明的一方面是提供了一种表达载体，其能分泌性产生人干扰素α(IFNα)。
本发明的另一方面是提供了一种用所述表达载体转化的微生物。
本发明的再一方面是提供了一种使用所述微生物产生可溶形式的hIFNα的方法，所述hIFNα在氨基末端没有额外的甲硫氨酸残基附着。
附图简述
本发明的上述及其它方面和特点通过以下论述及结合以下附图将是显而易见的。
图1：构建载体pT-IFNα-2a的步骤；
图2：构建载体pT14SIα-2a的步骤；
图3：构建载体pT14SSIα-2a的步骤；
图4：构建载体pT140SSIα-2a-4T22Q的步骤；
图5a和5b：分别是在重组的细胞系中检测IFNα-2a的表达和表达的IFNα-2a的纯度的SDS-PAGE结果，和检测表达的IFNα-2b的分子量的Western印迹分析结果。
发明详述
根据本发明的一方面，提供了一种分泌性产生hIFNα的表达载体，其包含一种编码修饰的耐热肠毒素II信号肽序列(也称为STII突变体)的多核苷酸，和一种连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸。
用于构建本发明的表达载体的编码hIFNα的多核苷酸，可以是任一种编码随机hIFNα亚型的多核苷酸，如天然IFNα-2a(SEQ IDNO：1)，IFNα-2b(SEQ ID NO：2)，IFNα-1和IFNα-3，而且还可以是重组的多核苷酸，其具有修饰的编码上述IFNα亚型的碱基序列。
本发明编码修饰的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸，其连接于编码hIFNα的多核苷酸5’末端的前面，并可以用于分泌性产生hIFNα，这种多核苷酸可以是一种编码突变体的多核苷酸，突变体是通过置换SEQ ID NO：3所述大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列一或多个氨基酸产生的，尤其是用其它氨基酸置换第4，20和22位氨基酸而产生的。编码突变体的这种多核苷酸例如是通过以下置换获得的：在SEQ ID NO：3所述的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列(STII)中，用苏氨酸置换第4位氨基酸([Thr4]STII)；分别用苏氨酸置换第4位氨基酸和用谷氨酰胺置换第22位的氨基酸([Thr4，Gln22]STII)；分别用苏氨酸置换第4位氨基酸，用缬氨酸置换第20位氨基酸和用谷胺酰胺置换第22位氨基酸([Thr4，Val20，Gln22]STII)；和分别用苏氨酸置换第4位氨基酸，用缬氨酸置换第20位氨基酸([Thr4，Val20]STII)，优选的多核苷酸序列是SEQ ID NO：4，5，6和7所述的序列。然而已知可以存在一些不同的编码本发明突变体的多核苷酸，这是由于密码子的简并性所致，而且特异地通过导入大肠杆菌优选的密码子而不改变氨基酸序列所修饰的多核苷酸可以用于促进IFNα的表达率。
另外，本发明的表达载体还可以包含大肠杆菌耐热肠毒素IIShine-Dalgarno序列(SD序列，SEQ ID NO：8)或其连接于编码修饰的耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸5’末端前面的突变体。野生型在SEQ ID NO：8所述的大肠杆菌耐热肠毒素II SD序列5’末端具有7个碱基(TGATTTT)，后接GAGG，与其相比，SD序列的突变体的序列是6或5个碱基的较短的序列。使用这种突变体可以提高IFNα的分泌性表达率。然而，当所述碱基序列少于4个碱基时，表达率明显降低。可用于本发明的一个优选的突变体例如是大肠杆菌耐热肠毒素II SD序列突变体，其具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。
用于制备本发明的表达载体的启动子，可以是能在微生物宿主中表达异源蛋白的任何启动子。当异源蛋白是在大肠杆菌中表达时，优选lac，Tac，和阿拉伯糖启动子。
本发明还提供了转化的微生物，其可以是通过例如用所述表达载体转化大肠杆菌菌株如大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，美国)或大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)获得的。本发明例如提供了以下转化的微生物：大肠杆菌BL21(DE3)/pT140SSIα-2a-4T(″HM10603″)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT140SSIα-2a-4T22Q(″HM 10611″)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT140SSIα-2b-4T(″HM 10703″)和大肠杆菌BL21(DE3)/pT140SSIα-2b-4T22Q(″HM10711″)。根据关于用于专利程序的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约，上述转化的微生物在1999年12月23日保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)(地址：韩国汉城120-091，Yurim Bldg.，361-221，Hongje 1-dong，Seodaemun-gu)，保藏号分别为KCCM-10175，KCCM-10176，KCCM-10177和KCCM-10178。
根据本发明的另一方面，还提供了一种在大肠杆菌周质中分泌性产生没有额外的甲硫氨酸残基添加在N末端的hIFNα的方法，所述方法是通过将转化的微生物在适当的培养条件下培养，所述培养条件可以与用于转化的微生物的常规培养条件相同。
通过本发明的方法分泌性产生的hIFNα包含随机的IFNα亚型如IFNα-1，IFNα-3等，以及由165个氨基酸组成的天然的hIFNα-2a(SEQ ID NO：1)和hIFNα-2b(SEQ ID NO：2)。另外，本发明的方法可以用于产生任何其它干扰素如hIFNβ和hIFNγ。
根据本发明，80％或更多的通过本发明的大肠杆菌转化体产生的IFNα是以1g/L以上的高产量分泌入周质中的。产生的IFNα具有与天然的IFNα相同的氨基酸序列，其没有额外的氨基酸附着在N末端，而且示出与天然IFNα相同的生物活性。
以下实施例进一步例证了本发明而无限制之意。参考实施例：IFNα-2a基因及含有其的载体的构建
编码hIFNα-2a的基因是用人基因组DNA作模板，将SEQ IDNO：10和11作为引物，通过PCR制备的。将SEQ ID NO：10引物设计为提供一个Ndel限制位点(5′-CATATG-3′)，该位点位于天然hIFNα的第一个氨基酸(半胱氨酸)密码子的上游，SEQ ID NO：11引物设计为提供一个BamHI限制位点(5′-GGATCC-3′)，该位点位于终止密码子的下游。
将扩增的PCR产物用NdeI和BamHI切割，以获得编码hIFNα-2a的DNA片段。将此DNA片段插入载体pET-14b(Novagen，美国)的NdeI/BamHI位点以获得载体pT-IFNα-2a。
图1示出上述构建载体pT-IFNα-2a的步骤。对比实施例1：构建含有肠毒素信号序列和IFNα-2a基因的载体
为制备大肠杆菌肠毒素II信号序列基因，基于已知的大肠杆菌肠毒素II信号肽的核苷酸序列，设计一对互补的寡核苷酸SEQ ID NO：12和13，并用DNA合成仪(Model 380B，美国应用生物系统公司)合成。将上述寡核苷酸设计为在大肠杆菌肠毒素II的起始密码子上游提供一个BspHI限制位点(与NdeI限制位点互补的位点)，及在另一末端通过沉默改变导入一个MluI限制位点。将这两个寡核苷酸在95℃退火，以获得平端的DNA片段，其具有编码大肠杆菌肠毒素II信号序列的核苷酸序列。将上述DNA片段插入载体pUC19(BioLabs，美国)的SmaI位点以获得载体pUC19ST。
另外，将在参考实施例中获得的含有IFNα-2a基因的载体pT-IFNα-2a，使用SEQ ID NO：14和15引物进行PCR，以将肠毒素信号肽与IFNα-2a基因连接。将SEQ ID NO：14引物设计为相当于IFNα-2a基因的5’末端，并将SEQ ID NO：15引物设计为提供一个BamHI限制位点(5′-GGATCC-3′)，该位点位于终止密码子的下游。将含有编码天然IFNα-2a的多核苷酸的DNA片段使用上述多核苷酸引物通过PCR扩增。将扩增的DNA片段用MluI和BamHI切割，以获得具有MluI/BamHI末端的IFNα-2a DNA片段。
同时，将含有肠毒素信号肽的载体pUC19用MluI切割，然后用BamHI消化以获得具有MluI/BamHI末端的载体片段。将此载体片段与IFNα-2a DNA片段连接，以构建载体pUC19SIFNα-2a。
将载体pUC19SIFNα-2a用BspHI和BamHI切割以获得一个DNA片段(564bp)。将此DNA片段插入在载体pET-14b(Novagen，美国)的NcoI/BamHI节段，以获得载体pT14SIα-2a。图2示出构建载体pT14SIα-2a的步骤。
随后，将大肠杆菌BL21(DE3)菌株用70mM氯化钙溶液处理，以制备感受态的大肠杆菌，然后加入在10mM Tris缓冲液(pH7.5)中的载体pT14Iα-2a。表达IFNα-2a的大肠杆菌转化体是利用转化的载体对抗生素的敏感性通过常规方法选择的，并将其称为大肠杆菌HM 10600。
另外，将载体pT14SIα-2a使用SEQ ID NO：16和17引物，进行PCR以扩增DNA片段，所述DNA片段是通过将肠毒素的Shine-Dalgarno序列，肠毒素信号肽，和IFNα-2a基因依次连接获得的，然后将此DNA片段用XbaI和BamHI切割获得一个插入体。
将插入体连接于载体pET14b(Novagen，美国)的XbaI/BamHI节段中以构建载体pT14SSIα-2a。图3示出了上述构建载体pT14SSIα-2a的步骤。将大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)用载体pT14SSIα-2a转化获得称为大肠杆菌HM 10601的转化体。对比实施例2：构建含有肠毒素信号序列和IFNα-2b基因的载体
将载体pT14SSIα中IFNα-2a基因的第23个赖氨酸密码子，通过定点诱变用精氨酸密码子置换(Papworth，C.等，Stratagies，9，3，1996)，以构建一种含有IFNα-2b基因的表达载体。将载体pT14SSIα-2a与含有置换的密码子的SEQ ID NO：19和20的合成寡核苷酸杂交，形成杂合分子，并用pfu(Stratagene，美国)和4种三磷酸核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)进行DNA扩增，使所述寡核苷酸从5’-3’方向延伸。干扰素α-2b的序列17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys(SEQ ID NO：18)CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC(SEQ ID NO：19)GCA GGA AGG AAG AGA GAT TCT CCT CAT CTG TGC CAG GAG(SEQ ID NO：20)
回收扩增的DNA片段并在其中加入限制酶DpnI以彻底除去未转变的质粒。
将大肠杆菌XL-I blue(Novagen，美国)用修饰的质粒转化。测定回收自转化的菌落的DNA的碱基序列，由此获得的是质粒pTI4SSIα-2b，其含有其中IFNα-2a的第23位赖氨酸用精氨酸代替的基因。
随后将大肠杆菌BL21(DE3)用修饰的载体pTI4SSIα-2b转化以获得称为大肠杆菌HM10701的转化体，使用与对比实施例1中相同的方法。对通过培养转化体产生的蛋白质的N末端氨基酸序列进行分析，证实具有天然氨基酸序列的IFNα-2b从中表达。实施例1：构建含有肠毒素信号肽突变体的载体(1)构建含有[Thr4]STII的载体
为修饰肠毒素信号肽的一个特异性氨基酸残基，通过如下的位定点诱变制备一种载体，该载体含有编码肠毒素突变体信号序列的多核苷酸。
首先，将在对比实施例1中获得的载体pTI4SSIα-2a使用SEQ IDNO：22和23的寡核苷酸进行PCR，以获得一种修饰的质粒，其中肠毒素信号序列的第4位氨基酸用苏氨酸(Thr)置换，通过对比实施例2中所述的定点诱变方法。
          Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu (SEQ ID NO：21)5′-GGTGATTTT ATG AAA AAG ACA ATC GCA TTT CTT C-3′(SEQ ID NO：22)3′-CCACTAAAA TAC TTT TTC TGT TAG CGT AAA GAA G-5′(SEQ ID NO：23)
然后，将大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)用修饰的质粒转化。确定回收自转化的菌落的DNA的碱基序列，由此获得一种质粒，这种质粒含有一种编码肠毒素信号序列的基因，序列中第4位氨基酸是Thr。将由此获得的质粒用XbaI和MiuI切割，然后插入载体pT14SSIα-2a的XbaI/MluI节段中，获得载体pT14SSIα-2a-4T。
随后，将大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)用载体pT14SSIα-2a-4T转化，获得称为大肠杆菌HM10602大肠杆菌转化体。
用pT14SSIα-2b构建载体pT14SSIα-2a-4T，然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagene，美国)中，获得称为大肠杆菌HM10702的大肠杆菌转化体。(2)构建含有[Thr4，Gln22]STII的载体
将在(1)步骤中获得的载体pT14SSIα-2a-4T进行PCR，使用SEQ ID NOS：25和26的寡核苷酸，根据(1)步骤中的定点诱变方法，将其设计为第4位氨基酸为Thr的肠毒素信号肽的第22位氨基酸取代为Gln密码子，以获得一种修饰的质粒。
       Asp Ala Gln Ala Cys Asp Leu Pro(SEQ ID NO：24)
5′-CA ATT GCC CAA GCG TGT GAT CTG CCT-3′(SEQ ID NO：25)
3′-GT TTA CGG GTT CGC ACA CTA GAC GGA-5′(SEQ ID NO：26)
然后将大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)用修饰的质粒转化。确定回收自转化的菌落的DNA的碱基序列，由此获得质粒pT14SSIα-2a-4T22Q，其含有一个肠毒素信号序列的第4和22位分别是Thr和Gln的基因。随后将大肠杆菌BL21(DE3)(Stratagen，美国)用载体pT14SSIα-2a-4T22Q使用与(1)步骤中相同方法进行转化，获得称为大肠杆菌HM 10604的转化体。
为将修饰的肠毒素信号序列的Shine-Dalgarno序列修饰为SEQID NO：9，将载体pT14SSIα-2a-4T和pT14SSIα-2a-4T22Q使用寡核苷酸SEQ ID NO：27和28进行(2)步骤中所述的定点诱变，以获得所需修饰的质粒。
将大肠杆菌XL-1 blue(Novagen，美国)用修饰的质粒转化。确定回收自转化的菌落的DNA的碱基序列，由此获得肠毒素信号序列的Shine-Dalgarno序列经修饰的质粒pT14OSSIα-2a-4T和pT14OSSIα-2a-4T22Q。图4示出构建载体pT14OSSIα-2a-4T22Q的上述步骤。
分别用载体pT14OSSIα-2a-4T和pT14OSSIα-2a-4T22Q转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得称为大肠杆菌HM 10603和HM 10611的转化体，其于1999年12月23日保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)，保藏号分别为KCCM-10175和KCCM-10176。
另外，载体pT14OSSIα-2b-4T和pT14OSSIα-2b-4T通过如上述相同方法用载体pT14SSIα-2b制备，其用于转化大肠杆菌BL21(DE3)，以获得分别称为大肠杆菌HM 10703和HM 10711的转化体。大肠杆菌转化体HM 10703和HM 10711于1999年12月23日保藏在KCCM中，保藏号分别为KCCM-10177和KCCM10178。(3)构建含有[Thr4，Val20，Gln22]STII的载体
为进一步将第4和22位分别为Thr和Gln的肠毒素信号肽序列的第20位氨基酸取代为Val密码子，将(2)步骤中制备的载体pT14OSSIα-2a-4T22Q和pT14OSSIα-2b-4T22Q，使用寡核苷酸SEQID NO：29和30通过(2)步骤中所述的定点诱变方法进行PCR，获得称为pT14OSSIα-2a-4T20V22Q和pT14OSSIα-2b-4T20V22Q的所需修饰的质粒。
将大肠杆菌XL-1 blue用修饰的质粒转化。确定回收自转化的菌落的DNA的碱基序列，由此获得质粒pT14OSSIα-2a-4T20V22Q和pT14OSSIα-2b-4T20V22Q，其含有一种第4位Asp，第20位Asp和第22位Tyr分别用Thr，Val和Gln密码子置换的基因。将大肠杆菌BL21(DE3)用质粒转化，获得分别称为大肠杆菌HM 10612和HM10712的转化体。实施例2：制备耐热肠毒素II Shine-Dalgarno序列突变体
为降低上述制备的表达载体的耐热肠毒素II Shine-Dalgarno序列内修饰的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的核糖体结合位点和起始密码子ATG之间的碱基数目，通过对比实施例2所述的定点诱变方法构建一种修饰的质粒。
为将核糖体结合位点GAGG和起始密码子ATG之间碱基数从7降低到5个，将实施例1(2)中制备的载体pT14OSSIα-2a-4T22Q使用寡核苷酸SEQ ID NO：31和32进行对比实施例2所述的定点诱变，以获得称为pT14NSSIα-2a-4T22Q的一种修饰的质粒。另外，为将核糖体结合位点GAGG和起始密码子ATG之间的碱基数降至4个，将载体pT14NSSIα-2a-4T22Q使用寡核苷酸SEQ ID NO：33和34进行对比实施例2所述的定点诱变，以获得称为pT14MSSIα-2a-4T22Q的一种修饰的质粒。
将大肠杆菌XL-1 blue用修饰的质粒转化。确定回收自转化的菌落的DNA的碱基序列，由此获得IFNα表达质粒pT14NSSIα-2a-4T22Q和pT14MSSIα-2a-4T22Q，它们在核糖体结合位点GAGG和起始密码子ATG之间分别含有5个和4个碱基。将大肠杆菌BL21(DE3)用表达质粒转化，获得分别称为HM 10613和HM 10614的转化体。实施例3：对比IFNα-2的表达量
将在上述对比实施例和实施例中制备的转化体在LB培养基中培养，然后在存在IPTG的情况下温育3小时。将每种培养物在6000rpm离心10分钟，以沉淀细菌细胞，并将沉淀物用如下渗透压休克方法处理(Nossal，G.N.，生物化学杂志241：3055，1966)。
将沉淀物悬浮于1/10体积的等渗溶液中(20％蔗糖，含有1mMEDTA的10mM Tris-CI缓冲液，pH7.0)。将悬浮液在室温下放置30分钟，然后离心以收集细菌细胞。将细胞在4℃重悬浮于D.W.中，以提取细胞周质中存在的蛋白质，并离心以获得周质溶液的上清。周质溶液中IFNα-2水平通过使用抗IFNα-2的抗体(R&D，美国)，根据ELISA方法进行分析(Kato，K.等，免疫学杂志116，1554，1976)，计算为每1L培养物中产生的IFNα-2a的数量。结果示于表1。表1.对比IFNα-2的表达数量
  转化体    实施例        表达载体       STII中修饰的氨基酸残基 周质中水平*
 HM10600 对比实施例1  pT14SIα-2a 82±40
 HM10601 对比实施例1  pT14SSIα-2a 325±75
 HM10701 对比实施例2  pT14SSIα-2b 288±90
 HM10602 实施例1(1)  pT14SSIα-2a-4T  Thr4 550±120
 HM10603 实施例1(2)  pT14OSSIα-2a-4T  Thr4 1020±135
 HM10604 实施例1(2)  pT14SSIα-2a-4T22Q  Thr4，Gln22 680±105
 HM10611 实施例1(2)  pT14OSSIα-2a-4T22Q  Thr4，Gln22 1220±120
 HM10612 实施例1(3)  pT14OSSIα-2a-4T20V22Q  Thr4，Val20，Gln22 1130±180
 HM10613 实施例2  pT14NSSIα-2a-4T22Q  Thr4，Gln22 750±144
 HM10614 实施例2  pT14MSSIα-2a-4T22Q  Thr4，Gln22 420±100
 HM10702 实施例1(1)  pT14SSIα-2b-4T  Thr4 370±90
 HM10703 实施例1(2)  pT14OSSIα-2b-4T  Thr4 735±117
 HM10711 实施例1(2)  pT14OSSIα-2b-4T22Q  Thr4，Gln22 1070±150
 HM10712 实施例1(3)  pT14OSSIα-2b-4T20V22Q  Thr4，Val20，Gln22 820±160
*IFNα-2mg/100 O.D600nm/L培养溶液
实施例4：后处理和纯化
根据实施例3的方法，将在实施例1(2)中制备的转化体大肠杆菌HM10611在LB培养基中培养，并将培养物在6000rpm离心20分钟以收获细胞。通过渗透压休克方法从细胞中制备周质溶液。
将周质溶液调节为pH5.0-5.5，吸附在预平衡为pH5.3的S-Sepharose(瑞典Pharmacia公司)层析柱上，然后将此层析柱用25mMNaCl洗。通过相继加入分别含有50mM，100mM，200mM，和1M NaCl的酸性缓冲液洗脱IFNα-2，并收集及组合含有IFNα-2的级分。
将组合的级分在Blue Sepharose(瑞典Pharmacia公司)层析柱中层析，并通过加入含有2M以上NaCl的层析缓冲溶液洗脱，以获得一种活性级分。
将活性级分用缓冲液透析，并最后用DEAE阴离子交换树脂层析柱，在pH5.8进行树脂层析分离，以获得纯度大于99％的IFNα-2a。另外，通过重复上述步骤从转化体大肠杆菌HM10711中纯化IFNα-2b。
将每种纯化的IFNα-2a和IFNα-2b级分进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以确定IFNα的纯度和大致浓度，然后进行如实施例3中所述的常规ELISA方法，以确定周质溶液中精确的IFNα浓度。另外，通过N末端氨基酸序列分析证实IFNα-2a和IFNα-2b是没有额外甲硫氨酸的天然类型。实施例5：确定从重组的细胞系中产生的IFNα-2a的分子量
从重组的细胞系中产生的IFNα-2a和IFNα-2b的表达和分子量，是通过使用SDS-PAGE和Western印迹分析确定的。
首先，将实施例4中制备的转化体大肠杆菌HM10611的周质级分和从中获得的纯化的IFNα-2a，根据常规方法进行SDS-PAGE，使用商购的IFNα-2a制品(3×106IU/ml)作对照。图5a示出了SDS-PAGE结果，其中泳道1示出IFNα-2a对照物；泳道2示出大肠杆菌转化体HM10611的周质级分；泳道3示出纯化的IFNα-2a。从图5a中可以看出，纯化的IFNα-2a与天然的IFNα-2a具有相同的分子量，并以高水平存在于转化体大肠杆菌HM10611的周质级分中。
另外，将转化体大肠杆菌HM10711的周质级分，一种通过将周质溶液进行S-Sepharose层析柱层析获得的纯化的级分，和最后纯化的IFNα-2b，根据常规方法进行SDS-PAGE。
将一种硝基纤维素滤膜(Bio-Rad Lab，美国)用缓冲溶液湿润以进行印迹(170mM glicine，25mM Tris.HCl[pH8]，20％甲醇)，并使用印迹试剂盒将在凝胶上分离的蛋白质移至硝基纤维素滤膜上3个小时以上。将滤膜在1％酪蛋白溶液中保持1小时，并用含有0.05％Tween 20的PBS洗3次。将滤膜置于用PBS稀释的兔抗IFNα抗体(Chemicon，#AB1434，美国)溶液中，并在室温反应2小时。在反应后，将滤膜用PBST溶液洗3次以除去未反应的抗体。将用PBS稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(Bio-Rad Lab.，美国)加入其中，并在室温反应2小时。将滤膜用PBST洗，加入过氧化物酶底物试剂盒(Bio-Rad Lab.，美国)溶液，以产生生色反应。得自上述Weatern印迹的结果示于图5b，其中泳道1示出转化体大肠杆菌HM10711的周质级分；泳道2示出用S-Sepharose层析柱层析纯化的级分；泳道3示出最后纯化的IFNα-2b。
实施例的结果证实大量可溶的IFNα从本发明重组的大肠杆菌中表达。
                    序列表<110>韩美药品工业株式会社<120>人干扰素α的表达和分泌载体及通过使用这种载体产生人干扰素α的方法<130>PCA10105/HMY<150>KR 2000-2434<151>2000-01-19<160>34<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>165<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1              5                   10                     15Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
        20                  25                      30Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
    35                   40                  45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50                      55                  60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65                  70                 75                  80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
             85                  90                  95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
        100               105                 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
    115                120                 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130                135                 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145                 150               155                 160Leu Arg Ser Lys Glu
            165<210>2<211>165<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Cys Asp Leu Pro Glu Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp
        20                  25                  30Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln
     35                 40                  45Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe
50                  55                  60Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu65                  70                 75                 80Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu
             85                  90                 95Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys
        100               105                 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu
    115                120                 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg
130                135                140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser145                 150                155                160Leu Arg Ser Lys Glu
            165<210>3<211>23<212>PRT<213>Escherichia coli<400>3Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser1             5                   10                 15Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala
        20<210>4<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码修饰的E.Coli热稳定肠毒素II
 ([Thr4]ST II)的DNA<400>4atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat    60gcctacgcg                                                            69<210>5<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码修饰的E.Coli热稳定肠毒素II
 ([Thr4，Gln22]ST II)的DNA<400>5atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaat    60gcccaagcg                                                            69<210>6<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA encoding a modified E.coli thermostable enterotoxin II
 ([Thr4，Val20，Gln22]ST II)<400>6atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacagtt    60gcccaagcg                                                            69<210>7<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>编码修饰的E.Coli热稳定肠毒素II
 ([Thr4，Val20]ST II)的DNA<400>7atgaaaaaga caatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacagtt    60gcctacgcg                                                            69<210>8<211>11<212>DNA<213>Escherichia coli<400>8gaggtgattt t                                                         11<210>9<211>10<212>DNA<213>人工序列<220><223>修饰的E.Coli热稳定肠毒素II的Shine-Dalgarno序列<400>9gaggtgtttt                                                           10<210>10<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备干扰素α-2a的N-末端的引物<400>10cgccgccata tgtgtgatct gcctcaaacc cacag                              35<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备干扰素α-2a的C-末端的引物<400>11accgaattcg gatcctcatt ccttacttct taaact                              36<210>12<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备E.Coli热稳定肠毒素II的分泌序列的引物<400>12tcatgaaaaa gaatatcgca tttcttcttg catctatgtt cgttttttct attgctacaa    60atgcctacgc gt                                                        72<210>13<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备E.Coli热稳定肠毒素II的分泌序列的引物<400>13acgcgtaggc atttgtagca atagaaaaaa cgaacataga tgcaagaaga aatgcgatat    60tctttttcat ga                                                        72<210>14<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备干扰素α-2a的N-末端的引物<400>14acaaatgcct acgcgtgtga tctgcctcaa acccacag                           38<210>15<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备干扰素α-2a的C-末端的引物<400>15accgaattcg gatcctcatt ccttacttct taaact                             36<210>16<211>65<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于导入E.coli ST II的Shine-Dalgarno序列的引物<400>16cggtttccct ctagaggttg aggtgtttta tgaaaaagaa tatcgcattt cttcttgcat   60ctatg                                                               65<210>17<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于导入E.coli ST II的Shine-Dalgarno序列的引物<400>17accgaattcg gatcctcatt ccttacttct taaact                              36<210>18<211>13<212>PRT<213>Escherichia coli<400>18Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys1               5                  10<210>19<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备干扰素α-2b的寡核苷酸<400>19ctcctggcac agatgaggag aatctctctt ttctcctgc                           39<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：19的反义序列<400>20gaggaccgtg tctactcctc ttagagagaa aagaggacg                           39<210>21<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>[Thr4]ST II的第1-8个氨基酸<400>21Met Lys Lys Thr Ile Ala Phe Leu1             5<210>22<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备[Thr4]ST II的寡核苷酸<400>22ggtgatttta tgaaaaagac aatcgcattt cttc                                34<210>23<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：22的反义序列<400>23gaagaaatgc gattgtcttt ttcataaaat cacc                                34<210>24<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>[Gln22]ST II的第20-27个氨基酸<400>24Asn Ala Gln Ala Cys Asp Leu Pro Gln Thr His1               5                  10<210>25<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备[Gln22]ST II的寡核苷酸<400>25caaatgccca agcgtgtgat ctgcctcaaa cccacag                             37<210>26<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：25的反义序列<400>26ctgtgggttt gaggcagatc acacgcttgg gcatttg                             37<210>27<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备修饰的SEQ ID NO：9的Shine-Dalgarno序列的引物<400>27tctagaggtt gaggtgtttt atga                                           24<210>28<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：27的反义序列<400>28tcataaaaca cctcaacctc taga                                           24<210>29<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备[Val20]ST II的寡核苷酸<400>29gttttttcta ttgctacagt tgcccaagcg tgtgatctgc ct                       42<210>30<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：29的反义序列<400>30aggcagatca cacgcttggg caactgtagc aatagaaaaa ac                       42<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备修饰的Shine-Dalgarno序列的引物<400>31tctagaggtt gaggttttta tgaaa                                          25<210>32<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：31的反义序列<400>32tttcataaaa acctcaacct ctaga                                          25<210>33<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于制备修饰的Shine-Dalgarno序列的引物<400>33tctagaggtt gaggttttat gaaa                                          24<210>34<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ ID NO：33的反义序列<400>34ttcataaaa cctcaacctc taga                                            24

Claims (18)

1.一种分泌性产生人干扰素α(hIFNα)的表达载体，包含一种编码修饰的耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸，和一种连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸，所述修饰的耐热肠毒素II信号序列是通过用其它氨基酸置换具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的第4，20和22位中的一或多个氨基酸而获得的。
2.权利要求1的表达载体，其中修饰的耐热肠毒素II信号序列选自以下一组：
—用苏氨酸置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位天冬酰胺获得的多肽；
—用苏氨酸和谷氨酰胺分别置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位天冬酰胺和第22位酪氨酸获得的多肽；
—用苏氨酸和谷氨酰胺分别置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位和第20位天冬酰胺获得的多肽；
—用苏氨酸，缬氨酸和谷氨酰胺分别置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位天冬酰胺，第20位天冬酰胺和第22位酪氨酸获得的多肽。
3.权利要求1的表达载体，其中编码hIFNα的多核苷酸编码SEQID NO：1的IFNα-2a或SEQ ID NO：2的IFNα-2b。
4.权利要求1的表达载体，其还包含连接于编码修饰的耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸的5’末端前面的大肠杆菌耐热肠毒素II的Shine-Dalgarno序列(SD序列，SEQ ID NO：8)，或其突变体。
5.权利要求4的表达载体，其中突变体具有一种序列，该序列是通过在SEQ ID NO：8所示序列5，末端的GAGG之后的部分中缺失1或2个核苷酸而获得的。
6.权利要求4的表达载体，其中SD序列的突变体具有SEQ IDNO：9所示核苷酸序列。
7.权利要求1的表达载体，其选自由以下质粒组成的一组：质粒pT14SSIα-2a-4T，pT14OSSIα-2a-4T，pT14SSIα-2a-4T22Q，pT14OSSIα-2a-4T22Q，pT14OSSIα-2a-4T20V22Q，pT14NSSIα-2a-4T22Q，pT14MSSIα-2a-4T22Q，pT14SSIα-2b-4T，pT14OSSIα-2b-4T，pT14OSSIα-2b-4T22Q和pT14OSSIα-2b-4T20V22Q。
8.用权利要求1-7的任一种表达载体转化的微生物。
9.权利要求8的微生物，其是大肠杆菌。
10.权利要求9的微生物，其选自以下一组：大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T(HM 10602)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(HM 10603；保藏号KCCM-10175)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q(HM 10604)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q(HM 10611；保藏号：KCCM10176)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q(HM 10612)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q(HM 10613)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q(HM 10614)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T(HM 10702)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703；保藏号：KCCM-10177)，大肠杆BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q(HM 10711；保藏号：KCCM 10178)和大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q(HM 10712)。
11.一种选择性产生在N末端没有额外的甲硫氨酸残基附着的hIFNα的方法，包括用一种分泌性产生hIFNα的表达载体转化微生物，并培养转化的微生物，其中所述载体包含一种编码修饰的耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸以及连接于其3’末端的编码hIFNα的多核苷酸，所述修饰的耐热肠毒素II信号序列是用其它氨基酸置换具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的大肠杆菌耐热肠毒素II信号序列的第4，20和22位的氨基酸中的一或多个而获得。
12.权利要求11的方法，其中修饰的耐热肠毒素II信号序列选自以下一组：
—用苏氨酸置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位天冬酰胺获得的多肽；
—用苏氨酸和谷氨酰胺分别置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位天冬酰胺和第22位酪氨酸获得的多肽；
—用苏氨酸和谷氨酰胺分别置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位和第20位天冬酰胺获得的多肽；
—用苏氨酸，缬氨酸和谷氨酰胺分别置换SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的第4位天冬酰胺，第20位天冬酰胺和第22位酪氨酸获得的多肽。
13.权利要求11的方法，其中编码hIFNα的多核苷酸编码SEQ IDNO：1的IFNα-2a或SEQ ID NO：2的IFNα-2b。
14.权利要求11的方法，进一步包括连接于编码修饰的耐热肠毒素II信号序列的多核苷酸的5’末端前面的大肠杆菌耐热肠毒素II的SD序列(SEQ ID NO：8)，或其突变体。
15.权利要求14的方法，其中突变体具有一种序列，该序列是通过在SEQ ID NO：8所示序列5’末端的GAGG之后的部分中缺失1或2个核苷酸而获得的。
16.权利要求14的方法，其中SD序列的突变体具有SEQ IDNO：9所示核苷酸序列。
17.权利要求11的方法，其中表达载体选自由以下质粒组成的一组：pT14SSIα-2a-4T，pT14OSSIα-2a-4T，pT14SSIα-2a-4T22Q，pT14OSSIα-2a-4T22Q，pT14OSSIα-2a-4T20V22Q，pT14NSSIα-2a-4T22Q，pT14MSSIα-2a-4T22Q，pT14SSIα-2b-4T，pT14OSSIα-2b-4T，pT14OSSIα-2b-4T22Q和pT14OSSIα-2b-4T20V22Q。
18.权利要求11的方法，其中转化的微生物选自以下一组：大肠杆菌  BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T(HM 10602)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T(HM 10603；保藏号KCCM-10175)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2a-4T22Q(HM 10604)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T22Q(HM 10611；保藏号：KCCM10176)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2a-4T20V22Q(HM 10612)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14NSSIα-2a-4T22Q(HM 10613)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14MSSIα-2a-4T22Q(HM 10614)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14SSIα-2b-4T(HM 10702)，大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T(HM 10703；保藏号：KCCM-10177)，大肠杆BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T22Q(HM 10711；保藏号：KCCM 10178)和大肠杆菌BL21(DE3)/pT14OSSIα-2b-4T20V22Q(HM 10712)。
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