CN1408726A - 非促有丝分裂重组酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）突变体的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增haFGF的全编码序列，并对其cDNA全序列进行改造，去掉5’端57－150个碱基，克隆到大肠杆菌表达系统中高效表达，经分离纯化后，获得的重组蛋白除不具有促有丝分裂功能外，保留了aFGF的其他生物学活性，可用于心脑血管疾病、神经系统疾病的预防和治疗。
Description
本发明涉及重组人aFGF基因克隆、改造、基因工程菌的构建和使用该菌制备重组人aFGF的方法。
一.成纤维细胞生长因子研究现状
成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor，FGFs)主要包括酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)两种，是一类对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子。aFGF在临床上具有广泛的应用前景，可用于创伤修复、心脑血管疾病治疗(如心肌缺血、脑中风等)、神经系统疾病(如帕金森氏症、阿尔茨海默病等)治疗等。自1974年首先分离bFGF以来，国内外对FGFs结构与功能，作用机理等进行了深入研究，我国也投入巨资对FGFs的临床应用进行了研究，取得了大量研究成果。但迄今为止，除我国批准用于创伤治疗的外用bFGF进入临床外，对用于其他治疗适应症的FGFs新药的研究进展困难。阻碍FGFs进入临床应用的瓶颈问题是其临床安全性问题。由于FGFs具有促有丝分裂活性，在对正常细胞具有促分裂效应的同时，对肿瘤细胞也具有同样作用，因此，长期以来，对其临床安全性的认识一直存在分歧。
对aFGF结构与功能研究结果表明，aFGF序列中存在多个功能性结构域，其主要功能区包括：肝素区、受体结合区和核转位区。Imamura等人研究证实，对154氨基酸残基的aFGF，其核转位区位于N端第20至27位氨基酸残基之间，切除aFGF的N端27个氨基酸残基后，可显著降低aFGF的促分裂活性。Rosa M.Lozano等对全长127个氨基酸残基的aFGF28-154的研究表明，此改构体不致使细胞发生分裂，但保持了野生型aFGF所有的神经调节、血管活性、心脏和神经保护的特性。
研究表明，aFGF的非促有丝分裂效应包括：(1)aFGF参与血管张力与血压调节
给动物注射天然纯化FGF或给予人工修饰后的FGF(在N末端缺乏核转位序列)，均可显示出扩张血管和降压效应，但剂量有所不同。FGF的降压效应有3个特点：(1)有或无肝素作为载体均表现出降压作用，但血中一定浓度的肝素盐能增加其降压效果；(2)FGF诱导的降压反应包括快相与慢相两个阶段，ATP敏感的K+通道可能在早期(快相)血压下降中起一定作用；(3)从中枢(脑室内)给予FGF无降压作用，亦不影响从外周静脉血给予FGF的降压效应。FGF诱导的降压效应可能是它能诱导升高细胞内钙离子浓度，诱导内皮细胞释放松驰因子(EDRF)，进而产生血管扩张效应有关。因此有人认为FGF的这一药理作用有可能给高血压的治疗带来突破。(2)aFGF治疗缺血性损伤
FGF能显著减少脑缺血导致的海马神经元死亡率；可防止再灌注损伤中心肌细胞外和线粒体内钙的沉积，减轻组织水肿，降低毛细血管损伤率以及肌酸磷酸激酶(CK)的释放；对急性肢体缺血性损伤，FGF除能显著减轻组织水肿外，还能部分恢复组织活力，减少细胞内钙依赖性ATP酶以及脱氢酶类的损失。其抗缺血损伤效应机制可能包括：A.FGF降低血管阻力，有助于开放小动脉与毛细血管而减少组织缺血后的“无再灌流(no reflow)”现象；B.FGF有助于开放K+-ATP通道，促进内皮细胞分泌释放血浆纤维蛋白溶酶原激活物(PA)，进而有助于清除心血管系统的栓塞；C.FGF能调节细胞Ca2+浓度，有助于维持Ca2+依赖性ATP酶的活性，减少自由基的产生。(3)对神经系统的作用
实验表明，许多神经元受慢性神经退化变性疾病的影响，如：肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)，影响运动神经元；帕金森疾病，影响黑质中的神经元；早老性痴呆，影响基底前脑副交感神经元。这些神经元中都有大量的aFGF分布，aFGF可作为自分泌神经营养因子，感受细胞质膜哪怕是瞬间的渗漏，并立即启动修复，促进神经细胞的迁移和纤溶酶活剂的释放，增加髓磷脂相关蛋白和类脂的含量，改变神经细胞的典型的细胞进程和细胞膜结构，使神经元免受神经退化变性疾病的影响。
aFGF能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活，使神经元成活时间增加和其轴突延长。Koshinaga等研究了脊髓损伤后aFGF的表达情况后，发现前角运动神经元的aFGF含量增加，表明机体自身产生大量aFGF，在脊髓损伤的自我修复和再生中起作用，这是机体的一种自我保护机制。
此外，FGF还具有调节摄食过程，调节激素分泌、诱导促甲状腺激素的释放，同时也增加靶细胞对这种激素的敏感性等非促分裂效应。
二.本发明的实现
将非促有丝分裂酸性成纤维细胞生长因子基因克隆到大肠杆菌高效表达载体中，转入大肠杆菌。从转化子中筛选出含有非促有丝分裂酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)基因的菌株。进行发酵表达，制备方法及工艺优化后非促有丝分裂酸性成纤维细胞生长因子的表达量为20-120mg/L。
实施例一 在胞内高效表达非促有丝分裂重组aFGF突变体的大肠杆菌工程菌的构建1.目的基因的获得
设计合成两条含不同限制性酶酶切位点的PCR引物(PI，PII)，
用PCR方法，从人胎脑的Quick Clone cDNA中扩增haFGF的全编码序列，所得的PCR产物长485 bp，在5’端有一EcoR I酶切位点，3’端有一HindIII切点。将扩增所得的haFGF的全长cDNA用EcoRI和HindIII酶切，将酶切片段与经EcoRI和HindIII双酶切的克隆载体pUC18连接，经DNA序列分析，得到含正确haFGF全长cDNA序列的重组子pUC-haFGF。
以所得的重组质粒pUC-haFGF为模板，设计合成两条含不同限制性酶酶切位点的PCR引物(PIII，PIV)，使扩增所得的haFGF cDNA片段的5’端有一NdeI酶切位点，3’端有一BglII切点。所得的haFGF cDNA片段较全长cDNA在5’端少57-150个个碱基。2.重组表达质粒的构建
将扩增所得haFGF的cDNA片段用NdeI和BglII酶切，表达空载体pET3c用NdeI和BamI酶切，其中BglII与BamI酶切后的粘性末端一致，两种酶切片段用T4DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，选择含重组子的阳性克隆，并进行DNA序列分析，以确保所得haFGF的cDNA序列是正确的。将所得的重组质粒命名为pET3c-haFGF(m)。将重组质粒pET3c-haFGF(m)转化DE3噬菌体溶源的宿主菌BL21(DE3)。在抗性(100ug/ml的氨苄青霉素)平板上筛选转化子。
对重组子pUC-haFGF中haFGF cDNA的核苷酸序列测定结果，和文献报道的序列一致；重组子pET3c-haFGF(m)中haFGF cDNA的核苷酸序列测定结果，与预计的序列完全一致。
实施例二 非促有丝分裂重组aFGF突变体的制备方法及工艺1.发酵培养1.1培养基
由胰蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、糖蜜组成，流加用葡萄糖。1.2培养程序
将发酵培养基适量置发酵罐中(发酵罐预先进行空消)，然后进行消毒，再将适量上述培养种子液接种于该培养基中，采用连续流加葡萄糖的高密度发酵培养工艺，通过控制葡萄糖的流加速率将培养液pH值控制在7.0-7.5，当菌体OD600达到25-35左右，加入IPTG进行诱导表达。1.3收菌
发酵结束后，立即用离心机将培养液进行连续离心分离，控制温度4℃，转速为10000转/分，流速为10升/小时，离心结束后收取菌体，称量湿重。2.菌体的裂解与粗制haFGF的制备
将收获的菌体悬浮于含0.05-0.2M氯化钠的20mM磷酸盐缓冲液中，用超声粉碎机冰浴下超声破碎细胞，将所得的细胞裂解液以20000转/分的转速进行离心分离，取上清即得粗制haFGF。3.纯化3.1纯化基本程序
将上述所得上清液首先过CM-Sepharose FF离子交换柱，以含0.01-1M氯化钠的10-50mM磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰蛋白质溶液，过亲和层析柱，用含0.06-3.0氯化钠的10-50mM的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰蛋白质溶液，即获得haFGF纯品。3.2纯化各步技术指标1)离子交换填料：CM-Sepharose FF
流动相：A液为含0.01-0.6M氯化钠的10-50mM磷酸盐缓冲液
B液为含0.6-1M氯化钠的10-50mM磷酸盐缓冲液
洗脱：等度洗脱，B液收峰
流速：20-50ml/min
收集峰：活性最高峰(第二洗脱峰)2)亲和层析：
填料：Heparin-Sepharose
流动相：A液为含0.06-1.0M氯化钠的10-50mM磷酸盐缓冲液
B液为含1.0-1.5M氯化钠的10-50mM磷酸盐缓冲液
C液为含1.5-3.0M氯化钠的10-50mM磷酸盐缓冲液
洗脱：等度洗脱，C液收峰
流速：20-50ml/min
收集峰：活性最高峰(第三洗脱峰)
所收蛋白峰即为haFGF原液，加入稳定剂人血白蛋白称为“加白蛋白haFGF原液”，过滤除菌后保存。4.半成品配制4.1稀释液配制
10mMPB pH7.0 121℃高压灭菌30分钟4.2半成品配制与除菌
白蛋白：注射用人血白蛋白
除菌滤膜：0.22μm滤膜
配制白蛋白终浓度：1％-2％(g/ml)
将加白蛋白haFGF原液和人血白蛋白用4.1项稀释液稀释至所需浓度，用0.22μm滤膜过滤除菌，即为半成品，保存于2～8℃。5.分装及冻干
容器：2ml西林瓶 分装量：1.0ml
预冻温度和时间：-45℃ 3小时
真空度：2.7Pa 1小时6.保存条件
4～8℃
Claims (6)
1.本发明所说的aFGF突变体为包括N端缺失19到50个氨基酸残基的重组aFGF；
2.能在胞内表达N端缺失19-50个氨基酸残基的重组aFGF突变体的基因工程菌；
3.权利要求2中所说的基因工程宿主菌为大肠杆菌；
4.权利要求2中所说的基因工程菌表达N端缺失19到50个氨基酸残基的重组aFGF突变体的制备方法及工艺。
5.权利要求1中所说的重组aFGF突变体用于防治心脑血管疾病；
6.权利要求1中所说的重组aFGF突变体用于防治神经系统疾病。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 01127892 CN1408726A (zh) | 2001-09-27 | 2001-09-27 | 非促有丝分裂重组酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）突变体的制备 |
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| CN1408726A true CN1408726A (zh) | 2003-04-09 |
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| WO2015051596A1 (en) * | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Eu Sol Biotech Co., Ltd. | Modified acidic fibroblast growth factors and composition thereof |
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| CN105793281A (zh) * | 2013-10-07 | 2016-07-20 | 雅祥生技医药股份有限公司 | 经修饰的人类酸性纤维母细胞生长因子及其组合物 |
| CN105793281B (zh) * | 2013-10-07 | 2020-03-27 | 雅祥生技医药股份有限公司 | 经修饰的人类酸性纤维母细胞生长因子及其组合物 |
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