CN1403478A - 具有抑制癌细胞生长功能的新的人蛋白及其编码序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类新的具有抑癌功能的人蛋白,编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生该多肽的方法。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病如癌症等的方法。本发明还公开了抗此多肽的拮抗剂及其治疗作用。本发明还公开了编码这类新的具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地说,本发明涉及新的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸和此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备。
背景技术
人基因组学研究目前是国际上的热点,除人染色体DNA大规模测序,表达序列测序(EST)的方法外,还缺少从功能开始的筛选具有功能基因的高通量的方法。
癌症是危害人类健康的主要疾病之一。为了有效地治疗和预防肿瘤,目前人们已越来越关注肿瘤的基因治疗。因此,本领域迫切需要开发研究具有抑癌功能的人蛋白及其激动剂/抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一类新的具有抑癌功能的人蛋白多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面,提供新颖的分离出的具有抑癌功能的蛋白多肽,它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35;或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地,该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。
在本发明的第二方面,提供了一种分离的多核苷酸,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:(a)编码上述的具有抑癌功能的蛋白多肽的多核苷酸;(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地,该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。更佳地,该多核苷酸的序列选自下组:SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36的编码区序列或全长序列。
在本发明的第三方面,提供了含有上述多核苷酸的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面,提供了制备具有抑癌功能的蛋白活性的多肽的制备方法,该方法包含:(a)在适合表达具有抑癌功能的蛋白的条件下,培养上述被转化或转导的宿主细胞;(b)从培养物中分离出具有抑癌功能的蛋白活性的多肽。
在本发明的第五方面,提供了与上述的具有抑癌功能的蛋白多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子,它含有上述的多核苷酸中连续10个核苷酸至全长核苷酸,较佳地它含有连续的约10-800个核苷酸。
在本发明的第六方面,提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明的具有抑癌功能的蛋白多肽以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗癌症以及细胞异常增殖等病症。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
本发明采用大规模cDNA克隆转染癌细胞,在获得具有抑癌作用的基础上,经测序证明为新的基因,进一步得到全长cDNA克隆。DNA转染试验证明,本发明的具有抑癌功能的蛋白对癌细胞(肝癌细胞)具有抑制克隆形成的作用,其抑制率在50%或50%以上。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的具有抑癌功能的蛋白或多肽”是指具有抑癌功能的蛋白多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化具有抑癌功能的蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽,优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从原核或真核宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主,本发明的多肽可以是糖基化的,或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括具有抑癌功能的人蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然具有抑癌功能的人蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。以FP977蛋白(在本申请中,蛋白质的命名采用其克隆编号)为例,编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质,但与SEQ IDNO:3所示的编码区序列有差别的核酸序列。再以FP1147蛋白(在本申请中,蛋白质的命名采用其克隆编号)为例,编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:6所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:5的蛋白质,但与SEQ ID NO:6所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于本发明的其他具有抑癌功能的蛋白,可依此类推。
编码成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95%以上,更好是97%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能(以FP977蛋白为例)和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供,更佳地被纯化至均质。
本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如,用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于:1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列,和2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的DNA片段。
编码具有抑癌功能的蛋白的特异DNA片段序列产生也能用下列方法获得:1)从基因组DNA分离双链DNA序列;2)化学合成DNA序列以获得所需多肽的双链DNA。
上述提到的方法中,分离基因组DNA最不常用。当需要的多肽产物的整个氨基酸序列已知时,DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。如果所需的氨基酸的整个序列不清楚时,DNA序列的直接化学合成是不可能的,选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录,形成质粒或噬菌体cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术,试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory.New York,1989)。还可得到商业供应的cDNA文库,如Clontech公司的不同cDNA文库。当结合使用聚合酶反应技术时,即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于):(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(2)标志基因的功能出现或丧失;(3)测定具有抑癌功能的蛋白的转录本的水平;(4)通过免疫学技术或测定生物学活性,来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用,也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中,杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源,其长度至少15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸。此外,探针的长度通常在2kb之内,较佳地为1kb之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因DNA序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素,荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中,检测具有抑癌功能的蛋白基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法,放射免疫沉淀法,酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki,et al.Science 1985;230:1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时,可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法),用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因,或者各种DNA片段等的核苷酸序列的测定可用常规方法如双脱氧链终止法(Sanger et al. PNAS,1977,74:5463-5467)。这类核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列,测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列,才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或具有抑癌功能的蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science,1984;224:1431),可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的具有抑癌功能的蛋白多肽。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码具有抑癌功能的人蛋白的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,具有抑癌功能的人蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg,et al.Gene,1987,56:125);在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J Bio Chem.263:3521,1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含具有抑癌功能的人蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook,et a1.)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有:大肠杆菌的lac或trp启动子;λ噬菌体PL启动子;真核启动子包括CMV立即早期启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时,如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子,通常大约有10到300个碱基对,作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可包被于细胞内、细胞外或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的具有抑癌功能的人蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于):直接做为药物治疗具有抑癌功能的蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如癌症),和用于筛选促进或对抗具有抑癌功能的蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。例如,抗体可用于激活或抑制具有抑癌功能的人蛋白的功能。用表达的重组具有抑癌功能的人蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激具有抑癌功能的人蛋白功能的多肽分子。
本发明也提供了筛选药物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)具有抑癌功能的人蛋白的药剂的方法。激动剂提高具有抑癌功能的人蛋白刺激细胞增殖等生物功能,而拮抗剂阻止和治疗与细胞过度增殖有关的紊乱如各种癌症。例如,能在药物的存在下,将哺乳动物细胞或表达具有抑癌功能的人蛋白的膜制剂与标记的具有抑癌功能的人蛋白一起培养。然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。所述的拮抗剂可以与具有抑癌功能的人蛋白结合并消除其功能,或是抑制具有抑癌功能的人蛋白的产生,或是与多肽的活性位点结合使多肽不能发挥生物学功能。具有抑癌功能的人蛋白的拮抗剂可用于治疗用途。
在筛选作为拮抗剂的化合物时,可以将本发明蛋白加入生物分析测定中,通过测定化合物影响具有抑癌功能的蛋白和其受体之间的相互作用来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法,可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。
本发明的多肽可直接用于疾病治疗,例如,各种恶性肿瘤、和细胞异常增殖等。
本发明的多肽,及其片段、衍生物、类似物或它们的细胞可以用来作为抗原以生产抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将此多肽直接注射动物的方法得到。制备单克隆抗体的技术包括杂交瘤技术,三瘤技术,人B-细胞杂交瘤技术,EBV-杂交瘤技术等。
可以将本发明的多肽和拮抗剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒,容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起,可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示,该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外,本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药,如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。具有抑癌功能的蛋白以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的具有抑癌功能的蛋白的量和剂量范围将取决于许多因素,如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
具有抑癌功能的人蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于具有抑癌功能的蛋白的无表达或异常/无活性的具有抑癌功能的蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体可用于治疗具有抑癌功能的蛋白表达或活性异常所致的疾病。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将具有抑癌功能的蛋白基因转移至细胞内。构建携带具有抑癌功能的蛋白基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook,etal.)。另外重组具有抑癌功能的人蛋白基因可包装到脂质体中转移至细胞内。
抑制具有抑癌功能的人蛋白mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子,其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得,如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性,可用多种方法对其进行修饰,如增加两侧的序列长度,核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括:将多聚核苷酸直接注入到体内组织中;或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中,再将细胞移植到体内等。
本发明的多肽还可用作肽谱分析,例如,多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割,并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析。
本发明还提供了针对具有抑癌功能的人蛋白抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于):多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。这些抗体可用常规方法制备。抗具有抑癌功能的人蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中,检测活检标本中的具有抑癌功能的人蛋白。
与具有抑癌功能的人蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记,注入体内可跟踪其位置和分布。本发明中的抗体可用于治疗或预防与具有抑癌功能的人蛋白相关的疾病。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断具有抑癌功能的人蛋白的产生或活性。
抗体也可用于设计针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如具有抑癌功能的人蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素,蓖麻蛋白,红豆碱等)共价结合。
多克隆抗体的生产可用具有抑癌功能的人蛋白或多肽免疫动物,如家兔,小鼠,大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应,包括但不限于弗氏佐剂等。
具有抑癌功能的人蛋白单克隆抗体可用杂交瘤技术生产(Kohler and Milstein.Nature,1975,256:495-497)。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al,PNAS,1985,81:6851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗具有抑癌功能的人蛋白的单链抗体。
能与本发明蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时,必须对具有抑癌功能的人蛋白分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测具有抑癌功能的人蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的,且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的具有抑癌功能的人蛋白水平,可以用作解释具有抑癌功能的人蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断具有抑癌功能的蛋白起作用的疾病。
具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于具有抑癌功能的蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面,具有抑癌功能的蛋白的多聚核苷酸可用于检测具有抑癌功能的蛋白的表达与否或在疾病状态下具有抑癌功能的蛋白的异常表达。如具有抑癌功能的蛋白DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断具有抑癌功能的蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法,Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术,相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上,用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用具有抑癌功能的蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测具有抑癌功能的蛋白的转录产物。
检测具有抑癌功能的蛋白基因的突变也可用于诊断具有抑癌功能的蛋白相关的疾病。具有抑癌功能的蛋白突变的形式包括与正常野生型具有抑癌功能的蛋白DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外,突变有可能影响蛋白的表达,因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。这些序列会特异性地针对某条人染色体具体位置且并可以与其杂交。目前,需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。然而现在只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。为了将这些序列与疾病相关基因相关联。第一步就是将本发明DNA序列定位于染色体上。
简而言之,根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp),可以将序列定位于染色体上。然后,将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法,是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的的寡核苷酸引物,通过类似方法,可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选,从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH),可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述,参见Verma等,Human Chromosomes:a Manual of BasicTechniques,Pergamon Press,New York(1988)。
一旦序列被定位到准确的染色体位置,此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如,V.Mckusick,Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析,确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。
接着,需要测定患病和未患病个体间的cDNA或基因组序列差异。如果在一些或所有的患病个体中观察到某突变,而该突变在任何正常个体中未观察到,则该突变可能是疾病的病因。比较患病和未患病个体,通常涉及首先寻找染色体中结构的变化,如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。
本发明的具有抑癌功能的蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中的各种DNA分子(如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
此外,由于本发明的具有抑癌功能的蛋白具有源自人的天然氨基酸序列,因此,与来源于其他物种的同族蛋白相比,预计在施用于人时将具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人体内的免疫原性更低或没有)。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:cDNA基因的获得及对癌细胞克隆形成的抑制作用
FP977、FP1147、FP1188、FP1193、FP1477、FP1572、FP2568、FP2653、FP2823、FP2860、FP2926和FP3235来自于自建的人胎儿cDNA文库。取3、6、9月龄的胎儿组织,用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL),反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞,获得了1×106cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆,其后以高丰度cDNA克隆和已证明有抑癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针,杂交筛选cDNA文库,挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒,按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后,加6μl H2O溶解,待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液,混匀后,室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液,均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中,37℃放置2小时,每孔再加50μl无血清培液,37℃24小时。每孔换100μl全培液,37℃24小时,换含G418的全培液100μl,37℃24-48小时,边观察,边换G418浓度不等的培液。约2-3次后,直到镜检细胞有克隆形成,计数。发现上述克隆有抑制癌细胞克隆形成作用,结果如下表所示。
cDNA克隆转染细胞(7721)克隆形成情况
cDNA克隆名称 | cDNA克隆数(三个重复) | 空载体克隆数(三个重复) | ||||
FP977 | 0 | 0 | 0 | 15 | 18 | 13 |
FP1147 | 12 | 10 | 11 | 15 | 18 | 13 |
FP1188 | 2 | 1 | 4 | 15 | 18 | 13 |
FP1193 | 4 | 4 | 4 | 15 | 18 | 13 |
FP1477 | 2 | 2 | 3 | 15 | 18 | 13 |
FP1572 | 7 | 5 | 9 | 15 | 18 | 13 |
FP2568 | 0 | 0 | 0 | 15 | 18 | 13 |
FP2653 | 8 | 11 | 10 | 15 | 18 | 13 |
FP2823 | 5 | 4 | 8 | 15 | 18 | 13 |
FP2860 | 13 | 10 | 4 | 15 | 18 | 13 |
FP2926 | 7 | 4 | 10 | 15 | 18 | 13 |
FP3235 | 2 | 5 | 7 | 15 | 18 | 13 |
对cDNA克隆采用双脱氧终止法,在ABI377 DNA自动测序仪上测定其一端近500bp的核苷酸序列。分析后,确定为新基因克隆,进行另一端测序,仍未获得全长cDNA序列,设计引物,再次进行测序,直到获得全长序列(SEQ ID NO:1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34)。
实施例2:PCR法获得全长基因及重组蛋白的获得
取胎儿组织,用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA,用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL),反转录酶在42℃进行反转录反应,获得胎儿cDNA。利用各个基因的特异引物(如下表所示),按97℃ 3′1个循环。94℃30″60℃30″72℃ 1′共35个循环,72℃ 10′,1个循环进行PCR扩增,获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证,与实施例1测得的序列相符,随后用常规技术将扩增产物转入宿主细胞,获得重组蛋白(SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35)。
基因特异引物
克隆名称 | 特异引物1(5′→3′) | 特异引物2(5′→3′) |
FP977 | (338)CACAGTACCCAAACAACGC | GACGATAGGGAACCGATT(2549) |
FP1147 | (212)GAGCTAGAATGGAATCCCTGAA | GTCATCGAAGTGTTTCACGGTT(1326) |
FP1188 | (101)CTCCCGACTCCCCAGTTT | CTAGACGCACTTGCGGTT(1872) |
FP1193 | (107)GCCCCACTGACCCAAGTC | CGAAGACGGCATAGGGAT(2181) |
FP1477 | (252)CCCACATCTTCCATCACTTT | CTTCCCTCGGTTATGCTCA(3222) |
FP1572 | (107)CCAATCCCAGACATCCTCA | ACTTTCTGAGGCAACCCT(2403) |
FP2568 | (163)AGGAGGAAGATGGTCCAGG | GTTGCCCTACATACGCCT(1647) |
FP2653 | (228)TGAGGGACAGAGCAAAGAC | GACGAGGGCATCAGGAGT(2244) |
FP2823 | (60)GATTTGTTTGCCTTTTACCA | TTACCTCTTTTACTTTGCTT(2627) |
FP2860 | (48)TGTTTAGGTTGTTTCCAGT | TTGTATCACTCTGGAGGGT(1822) |
FP2926 | (231)AGCTGATGTGGCGCTGAG | GGTTCTAGTGCGGTAACG(1867) |
FP3235 | (3)GGCGAGGCTACCCAGGCT | CCGACTGGACCGTAACCC(1426) |
实施例3:cDNA克隆序列分析1.FP977A:核苷酸序列(SEQ ID NO:1)长度:2657个碱基
1 GGTAATTTGT CAAACTGATG TCTCAGGTAA GGTGCCACTC TACGCATTGC AGAGTTGTGG61 CAGATACCCC AGACCTGTTC TCTGTTTCAT TTTCAAAAAT GCTTTCCAAC ATTGAACTTC121 TCTCTCCTGC TAGCCCTAAA AGAAGATCCC CCTAGAAATC TCCTGGAAGA GAGGAAATCA181 GATCAACTGG GGCTGCCTCA GACCTTGCAG CAGGAATTCT CCCTGATCAA TGTGCAAATC241 CGGAATGTCA ATGTGGAGAT GGATGCGGCA GACAGGAGCT GCACAGTGTC TGTGCACTGC301 AGCAACCATC GTGTCAAGAT GCTGGTGAAG TTCCCTGCAC AGTACCCAAA CAACGCCGCC361 CCTTCCTTCC AGTTTATTAA CCCCACAACC ATCACATCCA CCATGAAAGC TAAGCTGCTG421 AAGATCCTGA AGGACACAGC CCTGCAGAAA GTGAAGCGTG GCCAGAGCTG CCTGGAGCCC481 TGCCTGCGCC AGCTCGTCTC CTGCCTTGAG TCCTTTGTGA ACCAGGAAGA CAGCGCTTCC541 AGCAACCCGT TTGCACTCCC CAACTCTGTC ACTCCCCCCT TACCGACGTT TGCGCGGGTG601 ACCACGGCTT ACGGGTCGTA CCAGGACGCC AACATTCCCT TTCCTAGGAC TTCTGGGGCC661 AGGTTCTGCG GAGCAGGTTA CCTGGTATAT TTCACAAGGC CCATGACAAT GCATCGGGCG721 GTGTCTCCCA CAGAGCCTAC TCCGAGATCT CTCTCAGCCT TGTCTGCTTA TCACACTGGC781 TTGATCGCGC CCATGAAGAT CCGCACAGAG GCCCCTGGGA ACCTTCGTTT ATACAGTGGG841 AGCCCCACTC GCAGCGAGAA AGAGCAGGTC TCCATCAGCT CCTTCTACTA CAAGGAGCGG901 AAATCAAGAC GATGGAAAAG TAAGCGTGAG GGATCAGACT CTGGCAATCG ACAGATCAAG951 GCTGCTGGGA AAGTCATCAT CCAGGATATT GCTTGCCTCC TGCCTGTTCA CAAATCGCTG1021 GGAGAGCTGT ACATATTGAA TGTGAATGAT ATTCAGGAAA CATGTCAGAA GAATGCCGCC1081 TCTGCCTTGC TCGTTGGAAG AAAGGATCTT GTCCAGGTTT GGTCGCTGGC TACGGTAGCT1141 ACAGATCTTT GCCTTGGTCC GAAATCTGAC CCAGATTTGG AAACACCCTG GGCTCGACAT1201 CCATTTGGGC GGCAGCTGCT GGAGTCCCTG TTGGCTCACT ATTGCCGGCT CCGGGATGTT1251 CAGACACTGG CGATGCTCTG TAGCGTGTTT GAAGCCCAGT CTCGGCCTCA GGGGCTACCA1321 AACCCCTTTG GGCCTTTTCC TAACCGTTCT TCTAATCTTG TGGTGTCCCA TAGTCGATAT1381 CCTAGCTTTA CCTCTTCTGG TTCCTGCTCC AGTATGTCAG ACCCAGGGCT CAACACTGGC1441 GGCTGGAACA TAGCGGGAAG AGAGGCAGAG CACTTGTCCT CCCCTTGGGG AGAATCCTCA1501 CCAGAAGAGC TCCGCTTTGG GAGTCTGACC TACAGTGATC CCCGTGAGCG AGAACGCGAC1561 CAGCATGATA AAAATAAAAG GCTCCTGGAC CCCGCCAATA CCCAGCAATT TGATGACTTT1621 AAGAAATGCT ATGGGGAAAT CCTCTACCGT TGGGGTCTGA GAGAGAAGCG AGCTGAAGTG1681 TTGAAGTTTG TCTCCTGTCC TCCTGACCCT CACAAAGGGA TCGAGTTCGG CGTGTACTGC1741 AGCCACTGCC GGAGTGAGGT CCGTGGCACG CAGTGTGCCA TCTGCAAAGG CTTCACGTTC1801 CAGTGTGCCA TCTGTCACGT GGCTGTGCGG GGATCGTCCA ATTTCTGCCT GACCTGTGGG1861 CACGGTGGCC ACACCAGCCA CATGATGGAG TGGTTTCGGA CCCAGGAGGT GTGTCCCACC1921 GGGTGTGGGT GCCACTGCCT GCTTGAAAGC ACTTTCTGAA CCTACAGAAG TTGGGTATTG1981 TCTGAAATCC CAGAGGACCC ATAAGTGCCG GTGACAAGCT GTCTGTCAGG GGAGAGGCTC2041 CAGAACCTGG GTTCGTCCCC AGTGAGACCG GAGGATGATC CCCCAAGGAC TGCGCAGCAT2101 CAGCTCTTGG TGGGCCTCTG CCTTCTCTTC TGTTTGGCCA CCTGGTGTGG ATGTCACTGT2161 GTGAAGATAA GGACAGAAGT GCAGAGCTGC GCTTTGTGTG TTGTCTATGT CGGCTGAGCT2221 ACCAAGGTGG AAGTTTTCAT GGAGAAAAGC ACCTGGCTCC AGGGCCAGTG TTACAGTGTT2281 ACCCTGTAAG GTGTTAGCCT TAAACCACCG AGCAGCGTTC TCTTGATGCC AGTGCAGAGA2341 CCAGAGTCAG ATGCCCGAGG ACAGTGGGTA GGAATTTCAT CAACAAATGG ACCTATGGCA 2401 TCATGGCTTT AGAAGCTGGT ACATTTACTG AGCTGATGGA CAGTGGCCTT CTAAAATATG2461 ACACTTAAAT TGTAAATATG CACTGTACTT AAGGATTCTT AAGATGTATT TTTTTGTTAT2521 TTCTCCTCCA GCTGCTATCC CTTGGCTAAT AAAATTCTAG TAATTTGAAA AAAAAAAAAA2581 AGAGAGAAAG TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA2641 AAAAAAAAAA AAAAAAAB:核苷酸序列 (SEQ ID NO:2) 长度:566个氨基酸
1 MDAADRSCTV SVHCSNHRVK MLVKFPAQYP NNAAPSFQFI NPTTITSTMK AKLLKILKDT61 ALQKVKRGQS CLEPCLRQLV SCLESFVNQE DSASSNPFAL PNSVTPPLPT FARVTTAYGS121 YQDANIPFPR TSGARFCGAG YLVYFTRPMT MHRAVSPTEP TPRSLSALSA YHTGLIAPMK181 IRTEAPGNLR LYSGSPTRSE KEQVSISSFY YKERKSRRWK SKREGSDSGN RQIKAAGKVI241 IQDIACLLPV HKSLGELYIL NVNDIQETCQ KNAASALLVG RKDLVQVWSL ATVATDLCLG301 PKSDPDLETP WARHPFGRQL LESLLAHYCR LRDVQTLAML CSVFEAQSRP QGLPNPFGPF361 PNRSSNLVVS HSRYPSFTSS GSCSSMSDPG LNTGGWNIAG REAEHLSSPW GESSPEELRF421 GSLTYSDPRE RERDQHDKNK RLLDPANTQQ FDDFKKCYGE ILYRWGLREK RAEVLKFVSC481 PPDPHKGIEF GVYCSHCRSE VRGTQCAICK GFTFQCAICH VAVRGSSNFC LTCGHGGHTS541 HMMEWFRTQE VCPTGCGCHC LLESTFC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:3)克隆号:FP977起始编码子: 259 ATG 终止编码子:1957 TGA 蛋白质分子量:62904.43(注:(1)给出的是起始和终止编码子第一个核苷酸的位置,(2)分子量单位是道尔顿)1 GGT AAT TTG TCA AAC TGA TGT CTC AGG TAA GGT GCC ACT CTA CGC ATT 4849 GCA GAG TTG TGG CAG ATA CCC CAG ACC TGT TCT CTG TTT CAT TTT CAA 9697 AAA TGC TTT CCA ACA TTG AAC TTC TCT CTC CTG CTA GCC CTA AAA GAA 144145 GAT CCC CCT AGA AAT CTC CTG GAA GAG AGG AAA TCA GAT CAA CTG GGG 192193 CTG CCT CAG ACC TTG CAG CAG GAA TTC TCC CTG ATC AAT GTG CAA ATC 240241 CGG AAT GTC AAT GTG GAG ATG GAT GCG GCA GAC AGG AGC TGC ACA GTG 2881 Met Asp Ala Ala Asp Arg Ser Cys Thr Val 1089 TCT GTG CAC TGC AGC AAC CAT CGT GTC AAG ATG CTG GTG AAG TTC CCT 33611 Ser Val His Cys Ser Asn His Arg Val Lys Met Leu Val Lys Phe Pro 26337 GCA CAG TAC CCA AAC AAC GCC GCC CCT TCC TTC CAG TTT ATT AAC CCC 38427 Ala Gln Tyr Pro Asn Asn Ala Ala Pro Ser Phe Gln Phe Ile Asn Pro 42385 ACA ACC ATC ACA TCC ACC ATG AAA GCT AAG CTG CTG AAG ATC CTG AAG 43243 Thr Thr Ile Thr Ser Thr Met Lys Ala Lys Leu Leu Lys Ile Leu Lys 58433 GAC ACA GCC CTG CAG AAA GTG AAG CGT GGC CAG AGC TGC CTG GAG CCC 48059 Asp Thr Ala Leu Gln Lys Val Lys Arg Gly Gln Ser Cys Leu Glu Pro 74481 TGC CTG CGC CAG CTC GTC TCC TGC CTT GAG TCC TTT GTG AAC CAG GAA 52875 Cys Leu Arg Gln Leu Val Ser Cys Leu Glu Ser Phe Val Asn Gln Glu 90529 GAC AGC GCT TCC AGC AAC CCG TTT GCA CTC CCC AAC TCT GTC ACT CCC 57691 Asp Ser Ala Ser Ser Asn Pro Phe Ala Leu Pro Asn Ser Val Thr Pro 106577 CCC TTA CCG ACG TTT GCG CGG GTG ACC ACG GCT TAC GGG TCG TAC CAG 624107 Pro Leu Pro Thr Phe Ala Arg Val Thr Thr Ala Tyr Gly Ser Tyr Gln 122625 GAC GCC AAC ATT CCC TTT CCT AGG ACT TCT GGG GCC AGG TTC TGC GGA 672123 Asp Ala Asn Ile Pro Phe Pro Arg Thr Ser Gly Ala Arg Phe Cys Gly 138673 GCA GGT TAC CTG GTA TAT TTC ACA AGG CCC ATG ACA ATG CAT CGG GCG 720139 Ala Gly Tyr Leu Val Tyr Phe Thr Arg Pro Met Thr Met His Arg Ala 154721 GTG TCT CCC ACA GAG CCT ACT CCG AGA TCT CTC TCA GCC TTG TCT GCT 768155 Val Ser Pro Thr Glu Pro Thr Pro Arg Ser Leu Ser Ala Leu Ser Ala 170769 TAT CAC ACT GGC TTG ATC GCG CCC ATG AAG ATC CGC ACA GAG GCC CCT 816171 Tyr His Thr Gly Leu Ile Ala Pro Met Lys Ile Arg Thr Glu Ala Pro 186817 GGG AAC CTT CGT TTA TAC AGT GGG AGC CCC ACT CGC AGC GAG AAA GAG 864187 Gly Asn Leu Arg Leu Tyr Ser Gly Ser Pro Thr Arg Ser Glu Lys Glu 202865 CAG GTC TCC ATC AGC TCC TTC TAC TAC AAG GAG CGG AAA TCA AGA CGA 912203 Gln Val Ser Ile Ser Ser Phe Tyr Tyr Lys Glu Arg Lys Ser Arg Arg 218913 TGG AAA AGT AAG CGT GAG GGA TCA GAC TCT GGC AAT CGA CAG ATC AAG 960219 Trp Lys Ser Lys Arg Glu Gly Ser Asp Ser Gly Asn Arg Gln Ile Lys 234961 GCT GCT GGG AAA GTC ATC ATC CAG GAT ATT GCT TGC CTC CTG CCT GTT 1008235 Ala Ala Gly Lys Val Ile Ile Gln Asp Ile Ala Cys Leu Leu Pro Val 2501009 CAC AAA TCG CTG GGA GAG CTG TAC ATA TTG AAT GTG AAT GAT ATT CAG 1056251 His Lys Ser Leu Gly Glu Leu Tyr Ile Leu Asn Val Asn Asp Ile Gln 2661057 GAA ACA TGT CAG AAG AAT GCC GCC TCT GCC TTG CTC GTT GGA AGA AAG 1104267 Glu Thr Cys Gln Lys Asn Ala Ala Ser Ala Leu Leu Val Gly Arg Lys 2821105 GAT CTT GTC CAG GTT TGG TCG CTG GCT ACG GTA GCT ACA GAT CTT TGC 1152283 Asp Leu Val Gln Val Trp Ser Leu Ala Thr Val Ala Thr Asp Leu Cys 2981153 CTT GGT CCG AAA TCT GAC CCA GAT TTG GAA ACA CCC TGG GCT CGA CAT 1200299 Leu Gly Pro Lys Ser Asp Pro Asp Leu Glu Thr Pro Trp Ala Arg His 3141201 CCA TTT GGG CGG CAG CTG CTG GAG TCC CTG TTG GCT CAC TAT TGC CGG 1248315 Pro Phe Gly Arg Gln Leu Leu Glu Ser Leu Leu Ala His Tyr Cys Arg 3301249 CTC CGG GAT GTT CAG ACA CTG GCG ATG CTC TGT AGC GTG TTT GAA GCC 1296331 Leu Arg Asp Val Gln Thr Leu Ala Met Leu Cys Ser Val Phe Glu Ala 3461297 CAG TCT CGG CCT CAG GGG CTA CCA AAC CCC TTT GGG CCT TTT CCT AAC 1344347 Gln Ser Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Pro Phe Gly Pro Phe Pro Asn 3621345 CGT TCT TCT AAT CTT GTG GTG TCC CAT AGT CGA TAT CCT AGC TTT ACC 1392363 Arg Ser Ser Asn Leu Val Val Ser His Ser Arg Tyr Pro Ser Phe Thr 3781393 TCT TCT GGT TCC TGC TCC AGT ATG TCA GAC CCA GGG CTC AAC ACT GGC 1440379 Ser Ser Gly Ser Cys Ser Ser Met Ser Asp Pro Gly Leu Asn Thr Gly 3941441 GGC TGG AAC ATA GCG GGA AGA GAG GCA GAG CAC TTG TCC TCC CCT TGG 1488395 Gly Trp Asn Ile Ala Gly Arg Glu Ala Glu His Leu Ser Ser Pro Trp 4101489 GGA GAA TCC TCA CCA GAA GAG CTC CGC TTT GGG AGT CTG ACC TAC AGT 1536411 Gly Glu Ser Ser Pro Glu Glu Leu Arg Phe Gly Ser Leu Thr Tyr Ser 4261537 GAT CCC CGT GAG CGA GAA CGC GAC CAG CAT GAT AAA AAT AAA AGG CTC 1584427 Asp Pro Arg Glu Arg Glu Arg Asp Gln His Asp Lys Asn Lys Arg Leu 4421585 CTG GAC CCC GCC AAT ACC CAG CAA TTT GAT GAC TTT AAG AAA TGC TAT 1632443 Leu Asp Pro Ala Asn Thr Gln Gln Phe Asp Asp Phe Lys Lys Cys Tyr 4581633 GGG GAA ATC CTC TAC CGT TGG GGT CTG AGA GAG AAG CGA GCT GAA GTG 1680459 Gly Glu Ile Leu Tyr Arg Trp Gly Leu Arg Glu Lys Arg Ala Glu Val 4741681 TTG AAG TTT GTC TCC TGT CCT CCT GAC CCT CAC AAA GGG ATC GAG TTC 1728475 Leu Lys Phe Val Ser Cys Pro Pro Asp Pro His Lys Gly Ile Glu Phe 4901729 GGC GTG TAC TGC AGC CAC TGC CGG AGT GAG GTC CGT GGC ACG CAG TGT 1776491 Gly Val Tyr Cys Ser His Cys Arg Ser Glu Val Arg Gly Thr Gln Cys 5061777 GCC ATC TGC AAA GGC TTC ACG TTC CAG TGT GCC ATC TGT CAC GTG GCT 1824507 Ala Ile Cys Lys Gly Phe Thr Phe Gln Cys Ala Ile Cys His Val Ala 5221825 GTG CGG GGA TCG TCC AAT TTC TGC CTG ACC TGT GGG CAC GGT GGC CAC 1872523 Val Arg Gly Ser Ser Asn Phe Cys Leu Thr Cys Gly His Gly Gly His 5381873 ACC AGC CAC ATG ATG GAG TGG TTT CGG ACC CAG GAG GTG TGT CCC ACC 1920539 Thr Ser His Met Met Glu Trp Phe Arg Thr Gln Glu Val Cys Pro Thr 5541921 GGG TGT GGG TGC CAC TGC CTG CTT GAA AGC ACT TTC TGA ACC TAC AGA 1968555 Gly Cys Gly Cys His Cys Leu Leu Glu Ser Thr Phe *** 5671969 AGT TGG GTA TTG TCT GAA ATC CCA GAG GAC CCA TAA GTG CCG GTG ACA 20162017 AGC TGT CTG TCA GGG GAG AGG CTC CAG AAC CTG GGT TCG TCC CCA GTG 20642065 AGA CCG GAG GAT GAT CCC CCA AGG ACT GCG GAG CAT CAG CTC TTG GTG 21122113 GGC CTC TGC CTT CTC TTC TGT TTG GCC ACC TGG TGT GGA TGT CAC TGT 21602161 GTG AAG ATA AGG ACA GAA GTG CAG AGC TGC GCT TTG TGT GTT GTC TAT 22082209 GTC GGC TGA GCT ACC AAG GTG GAA GTT TTC ATG GAG AAA AGC ACC TGG 22562257 CTC CAG GGC CAG TGT TAC AGT GTT ACC CTG TAA GGT GTT AGC CTT AAA 23042305 CCA CCG AGC AGC GTT CTC TTG ATG CCA GTG CAG AGA CCA GAG TCA GAT 23522353 GCC CGA GGA CAG TGG GTA GGA ATT TCA TCA ACA AAT GGA CCT ATG GCA 24002401 TCA TGG CTT TAG AAG CTG GTA CAT TTA CTG AGC TGA TGG ACA GTG GCC 24482449 TTC TAA AAT ATG ACA CTT AAA TTG TAA ATA TGC ACT GTA CTT AAG GAT 24962497 TCT TAA GAT GTA TTT TTT TGT TAT TTC TCC TCC AGC TGC TAT CCC TTG 25442545 GCT AAT AAA ATT CTA GTA ATT TGA AAA AAA AAA AAA AGA GAG AAA GTT 25922593 AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA 26402641 AAA AAA AAA AAA AAA AA 26572.FP1147A:核苷酸序列(SEQ ID NO:4)长度:2450个碱基1 GGGTATATAT AACTTTTAAA TTATGTCAAC TTTTCTGTTT GCCAACTAGT ATGTAAGTTC61 CACAAGGGCA ATGATTTTTT ATCTGTTCTC TAGTTATCCT AAGTAATTAG AATAGCGCCC121 AGCCCATAGC TGGAACTTAT GAGGAAATGA GGAAACGAGC TTCAGATAAT TTAAATAACT181 TCCCAAGACT AAGTTTTATA GTTAGTTGGT GGAGCTAGAA TGGAATCCCT GAAGAGTGGC241 TCAAAGGCCT TTCTCTTTAC CATGGCCTGT GCTGCCTTGC TATACTGATG CCATGAAGTT301 AGTCCATCCT GAGGTCTAAC CCCTTTTGAT GGTGTGGAAC TCACATGGGG AAGGCGGACA361 TTTGCCCACC TGGGCCTTCA ACTCCTTCAC TTGGAGCTGG CCTCTCCCCA TCATGCCAGC421 TTCCCTGTGT GTGAATGGGT GTGTGTGTGT GTGTGAATGG GGTGTGTGAA GTGTGTATGT481 GAATGGGGGT GTGTGTGAAT GGGGTGTGTG TGTGTGAATG ATGTGTGTGT GAATGAGGTG541 TGTGTGAATG GGGTGTGTGT GTGTGAATGA GGTGTGTGTG TGAATGGGGT GTGTGTGTGA601 ATGGGGTGTG TGTGTGCGGT TGATGACTAT CCGTGTGAGA ACACGGGAGT TGGGGCTGCT661 CCTTCTCTTT GCCTCCTTGC CCAGGCACCT GAGGTCTTGG ACTCCTGTCC TAACTCTCAG721 CCCATTAGAG GCTGCTGCCT CTGGACTAGA CTCAGGCTCT GACCTCACAC TCCATGCCTA781 GGATTTCAGT CTGGGGTCCC AGTTCCCATC TGCCATTCCG GGCTTGGTCA TCAGCCTCTT841 CCCAGAGGCC CAGGATGGGT GGATTTGGCA GGAGTATGGG GAAGGAAGGA AGAGCTTAGC901 TTCCTTCCCT GTGGGGACCC TGTGAGGCAC AGCAGACTGG GCTGGGCCTG GTCCTGGGCT961 CCAGCCTCCA GCCTCCACTC ACACCCTCCT CTTCCTCAGG ATCATCTTCT CCACGCCCCT1021 GGCCGTCATT GCCTACTTCC TCATCTGGTT CGTGCCCGAC TTCCCACACG GCCAGACCTA1081 TTGGTACCTG CTTTTCTATT GCCTCTTTGA AACAATGGTC ACGTGTTTCC ATGTTCCCTA1141 CTCGGCTCTC ACCATGTTCA TCAGCACCGA GCAGACTGAG CGGGATTCTG CCACCGCCTA1201 TCGGATGACT GTGGAAGTGC TGGGCACAGT GCTGGGCACG GCGATCCAGG GACAAATCGT1261 GGGCCAAGCA GACACGCCTT GTTTCCAGGA CCTCAATAGC TCTACAGTAG CTTCACAAAG1321 TGCCAACCAT ACACATGGCA CCACCTCACA CAGGGAAACG CAAAAGGCAT ACCTGCTGGC1381 AGCGGGGGTC ATTGTCTGTA TCTATATAAT CTGTGCTGTC ATCCTGATCC TGGGGCGTGC1441 GGGAGCAGAG AGCTCTCGGC CACTTTAACC ATTCCCATCT GGCAGTGGTT CTTGACCCGG1501 TTTGGCAAGA AGACAGCTGT ATATGTTGGG ATCTCATCAG CAGTGCCATT TCTCATCTTG1561 GTGGCCCTCA TGGAGAGTAA CCTCATCATT ACATATGCGG TAGCTGTGGC AGCTGGCATC1621 AGTGTGGCAG CTGCCTTCTT ACTACCCTGG TCCATGCTGC CTGATGTCAT TGACGACTTC1681 CATCTGAAGC AGCCCCACTT CCATGGAACC GAGCCCATCT TCTTCTCCTT CTATGTCTTC1741 TTCACCAAGT TTGCCTCTGG AGTGTCACTG GGCATTTCTA CCCTCAGTCT GGACTTTGCA1801 GGGTACCAGA CCCGTGGCTG CTCGCAGCCG GAACGTGTCA AGTTTACACT GAACATGCTC1861 GTGACCATGG CTCCCATAGT TCTCATCCTG CTGGGCCTGC TGCTCTTCAA AATGTACCCC1921 ATTGATGAGG AGAGGCGGCG GCAGAATAAG AAGGCCCTGC AGGCACTGAG GGACGAGGCC1981 AGCAGCTCTG GCTGCTCAGA AACAGACTCC ACAGAGCTGG CTAGCATCCT CTAGGGCCCG2041 CCACGTTGCC CGAAGCCACC ATGCAGAAGG CCACAGAAGG GATCAGGACC TGTCTGCCGG2101 CTTGCTGAGC AGCTGGACTG CAGGTGCTAG GAAGGGAACT GAAGACTCAA GGAGGTGGCC2161 CAGGACACTT GCTGTGCTCA CTGTGGGGCC GGCTGCTCTG TGGCCTCCTG CCTCCCCTCT2221 GCCTGCCTGT GGGGCCAAGC CCTGGGGCTG CCACTGTGAA TATGCCAAGG ACTGATCGGG2281 CCTAGCCCGG AACACTAATG TAGAAACCTT TTTTTACAGA GCCTAATTAA TAACTTAATG2341 ACTGTGTACA TAGCAATGTG TGTGTATGTA TATGTCTGTG AGCTATTAAT GTTATTAATT2401 TTCATAAAAG CTGGAAAGCA GCTGCCTGTT TCAAAAAAAA AAAAAAAAAAB:核苷酸序列(SEQ ID NO:5)长度:154个氨基酸1 MESNLIITYA VAVAAGISVA AAFLLPWSML PDVIDDFHLK QPHFHGTEPI FFSFYVFFTK61 FASGVSLGIS TLSLDFAGYQ TRGCSQPERV KFTLNMLVTM APIVLILLGL LLFKMYPIDE121 ERRRQNKKAL QALRDEASSS GCSETDSTEL ASILC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:6) 克隆号:FP1147起始编码子: 1570 ATG 终止编码子:2032 TAG 蛋白质分子量: 17057.851 GGG TAT ATA TAA CTT TTA AAT TAT GTC AAC TTT TCT GTT TGC CAA CTA 4849 GTA TGT AAG TTC CAC AAG GGC AAT GAT TTT TTA TCT GTT CTC TAG TTA 9697 TCC TAA GTA ATT AGA ATA GCG CCC AGC CCA TAG CTG GAA CTT ATG AGG 144145 AAA TGA GGA AAC GAG CTT CAG ATA ATT TAA ATA ACT TCC CAA GAC TAA 192193 GTT TTA TAG TTA GTT GGT GGA GCT AGA ATG GAA TCC CTG AAG AGT GGC 240241 TCA AAG GCC TTT CTC TTT ACC ATG GCC TGT GCT GCC TTG CTA TAC TGA 288289 TGC CAT GAA GTT AGT CCA TCC TGA GGT CTA ACC CCT TTT GAT GGT GTG 336337 GAA CTC ACA TGG GGA AGG CGG ACA TTT GCC CAC 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Ile Val Ser Ala Gly Asp Thr Ser Val Leu His Leu Gly His 63817 GTG GAG CAC CTG GTG GCA GGC CAA GGC AAC CCC GAG CCA ACT GAA CTC 86464 Val Asp His Leu Val Ala Gly Gln Gly Asn Pro Glu Pro Thr Glu Leu 79865 CCC CAT CCA TCA GAG GGT AAT GAT GAG AAG GCT GAA GAG GCG GGT GAA 91280 Pro His Pro Ser Glu Gly Asn Asp Glu Lys Ala Glu Glu Ala Gly Glu 95913 GGT CGG GGA GAC TCC ACT GGG GAG GCT GGA GCT GGG GGT GGT GTT GAG 96096 Gly Arg Gly Asp Ser Thr Gly Glu Ala Gly Ala Gly Gly Gly Val Glu 111961 CCC AGC CTT GAG CAT CTC CTT GAC ATC CAA GGC CTG CCC AAA AGA CAA 1008112 Pro Ser Leu Glu His Leu Leu Asp Ile Gln Gly Leu Pro Lys Arg Gln 1271009 GCA GGT GCA GGC AGC AGC AGT CCA GAG GCC CCC CTG AGA TCT GAG GAT 1056128 Ala Gly Ala Gly Ser Ser Ser Pro Glu Ala Pro Leu Arg Ser Glu Asp 1431057 AGC ACC TGC CTC CCT CCC AGC CCT GGC CTC ATC ACT GTG CGG CTC AAA 1104144 Ser Thr Cys Leu Pro Pro Ser Pro Gly Leu Ile Thr Val Arg Leu Lys 1591105 TTC CTC AAT GAT ACC GAG GAG CTG GCT GTG GCT AGG CCA GAG GAT ACC 1152160 Phe Leu Asn 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Arg Gln Phe Phe Thr Ala Pro Ala Thr Val Ser Leu Val Gly Val 2871489 ACC GTC TTC TTC AGC TTC CTA GTA TTT GGG ATG TAT GGA CGA TAA GGA 1535288 Thr Val Phe Phe Ser Phe Leu Val Phe Gly Met Tyr Gly Arg *** 3021537 CAT AGG AAG AAA ATG AAA GGC ATG GTC TTT CTC CTT TAT GGC CTC CCC 15841585 ACT TTT CCT GGC CAG AGC TGG GCC CAA GGG CCG GGG AGG GAG GGG TGG 16321633 AAA AGG ATG TGA TGG AAA TCT CCT CCA TAG GAC ACA GGA GGC AAG TAT 16801681 GCG GCC TCC CCT TCT CAT CCA CAG GAG TAC AGA TGT CCC TCC CGT GCG 17281729 AGC ACA ACT CAG GTA GAA ATG AGG ATG TCA TCT TCC TTC ACT TTT AGG 17761777 GTC CTC TGA AGG AGT TCA AAG CTG CTG GCC AAG CTC AGT GGG GAG CCT 18241825 GGG CTC TGA GAT TCC CTC CCA CCT GTG GTT CTG ACT CTT CCC AGT GTC 18721873 CTG CAT GTC TGC CCC CAG CAC CCA GGG CTG CCT GCA AGG GCA GCT CAG 19201921 CAT GGC CCC AGC ACA ACT CCG TAG GGA GCC TGG AGT ATC CTT CCA TTT 19681969 CTC AGC CAA ATA CTC ATC TTT TGA GAC TGA AAT CAC ACT GGC GGG AAT 20162017 GAA GAT TGT GCC AGC CTT CTC TTA TGG GCA CCT AGC CGC CTT CAC 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1 MKYRSCADCV LARDPYCAWS VNTSRCVAVG GHSGSLLIQH VMTSDTSGIC NLRGSKKGEL61 FHSRRIGLSP GPELEFLFSS SPALLSCTNM HSVFSATTVR PTPKNITVVA GTDLVLPCHL121 SSNLAHARWT FGGRDLPAEQ PGSFLYDARL QALVVMAAQP RHAGAYHCFS EEQGARLAAE181 GYLVAVVAGP SVTLEARAPL ENLGLVWLAV VALGAVCLVL LLLVLSLRRR LREELEKGAK241 ATERTLVYPL ELPKEPTSPP FRPCPEPDEK LWDPVGYYYS DGSLKIVPGH ARCQPGGGPP301 SPPPGIPGQP LPSPTRLHLG GGRNSNANGY VRLQLGGEDR GGLGHPLPEL ADELRRKLQQ361 RQPLPDSNPE ESSVC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:27) 克隆号:FP2823起始编码子: 612 ATG 终止编码子:1734 TGA 蛋白质分子量: 40201.861 GG TTC CTA GTT GCC TTG TGC AAT ACT CTT GTG GCA TGT TTG CTA CAC 4748 CTC CTG AAC TTT GAT TTG TTT GCC TTT TAC CAG CTA TTA TGA CTC AAA 9596 ATT GTC CCC TAG AAC ATG GAA TAA TGG CAG AAA GAA AGT GTG TGG TTG 143144 AAT AAA CAC ACA GAT TGG CAT CCA CCG TTG AAA CAG GAA AAC ATC TTA 191192 TGT TAT GCT GCT GCT GTT GTG AGG GCT GAT GGG CCT TGA AAT GTA TTT 239240 CCT GCA CTA TGT GTG TGT GAG TGT GTG TGA TTA TAC TTT TTG GCC TCA 287288 CAG CCC CAT CAT CCC TTT CTA ATA ACG TCA CGT CGA TAA GGG GCT TAG 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Leu 68816 AGC CCT GGA CCA GAG CTG GAG TTT CTG TTC TCC TCT TCC CCA GCC CTG 86369 Ser Pro Gly Pro Glu Leu Glu Phe Leu Phe Ser Ser Ser Pro Ala Leu 84864 CTT TCC TGC ACT AAC ATG CAC TCT GTT TTC TCT GCC ACT ACA GTC AGG 91185 Leu Ser Cys Thr Asn Met His Ser Val Phe Ser Ala Thr Thr Val Arg 100912 CCC ACT CCC AAA AAC ATC ACG GTG GTG GCG GGC ACA GAC CTG GTG CTG 959101 Pro Thr Pro Lys Asn Ile Thr Val Val Ala Gly Thr Asp Leu Val Leu 116960 CCC TGC CAC CTC TCC TCC AAC TTG GCC CAT GCC CGC TGG ACC TTT GGG 1007117 Pro Cys His Leu Ser Ser Asn Leu Ala His Ala Arg Trp Thr Phe Gly 1321008 GGC CGG GAC CTG CCT GCG GAA CAG CCC GGG TCC TTC CTC TAC GAT GCC 1055133 Gly Arg Asp Leu Pro Ala Glu Gln Pro Gly Ser Phe Leu Tyr Asp Ala 1481056 CGG CTC CAG GCC CTG GTT GTG ATG GCT GCC CAG CCC CGC CAT GCC GGG 1103149 Arg Leu Gln Ala Leu Val Val Met Ala Ala Gln Pro Arg His Ala Gly 1641104 GCC TAC CAC TGC TTT TCA GAG GAG CAG GGG GCG CGG CTG GCT GCT GAA 1151165 Ala Tyr His Cys Phe Ser Glu Glu Gln Gly Ala Arg Leu Ala Ala Glu 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Ala Arg 2921488 TGC CAG CCC GGT GGG GGG CCC CCT TCG CCA CCT CCA GGC ATC CCA GGC 1535293 Cys Gln Pro Gly Gly Gly Pro Pro Ser Pro Pro Pro Gly Ile Pro Gly 3081536 CAG CCT CTG CCT TCT CCA ACT CGG CTT CAC CTG GGG GGT GGG CGG AAC 1583309 Gln Pro Leu Pro Ser Pro Thr Arg Leu His Leu Gly Gly Gly Arg Asn 3241584 TCA AAT GCC AAT GGT TAC GTG CGC TTA CAA CTA GGA GGG GAG GAC CGG 1631325 Ser Asn Ala Asn Gly Tyr Val Arg Leu Gln Leu Gly Gly Glu Asp Arg 3401632 GGA GGG CTC GGG CAC CCC CTG CCT GAG CTC GCG GAT GAA CTG AGA CGC 1679341 Gly Gly Leu Gly His Pro Leu Pro Glu Leu Ala Asp Glu Leu Arg Arg 3561680 AAA CTG CAG CAA CGC CAG CCA CTG CCC GAC TCC AAC CCC GAG GAG TCA 1727357 Lys Leu Gln Gln Arg Gln Pro Leu Pro Asp Ser Asn Pro Glu Glu Ser 3721728 TCA GTA TGA GGG GAA CCC CCA CCG CGT CGG CGG GAA GCG TGG GAG GTG 1775373 Ser Val *** 3751776 TAG CTC CTA CTT TTG CAC AGG CAC CAG CTA CCT CAG GGA CAT GGC ACG 18231824 GGC ACC TGC TCT GTC TGG GAC AGA TAC TGC CCA GCA CCC ACC CGG CCA 18711872 TGA GGA CCT GCT CTG CTC 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Asp Ser Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ala Ser Pro Thr Ala 281583 GGC TCT GCG ACG GGG ACA ATG ACT GTG GGA ACA GTG AAG ATG AGT CCA 163029 Gly Ser Ala Thr Gly Thr Met Thr Val Gly Thr Val Lys Met Ser Pro 441631 ATG CCA CTT GTT CAG GTG TGG AGC GGG GCT CAG ATC ACA CGA GGC ACC 167845 Met Pro Leu Val Gln Val Trp Ser Gly Ala Gln Ile Thr Arg Gly Thr 601679 CCT CAG TCA AGG AGG CAG GGG AGA CGA GGG GGC CAG GTT CAG TGG CTC 172661 Pro Gln Ser Arg Arg Gln Gly Arg Arg Gly Gly Gln Val Gln Trp Leu 761727 ATG CCT ATA ATC TCA GCA CTT TGG GAG GCC AAG GTG AGA GGA TCA CTT 177477 Met Pro Ile Ile Ser Ala Leu Trp Glu Ala Lys Val Arg Gly Ser Leu 921775 GAG CCC AGG AGC TCA AGA CCA GCC TGG CCA ACA TAG TGA GAC CTC CCA 182293 Glu Pro Arg Ser Ser Arg Pro Ala Trp Pro Thr *** 1041823 CTC TTT ACA AAA AAA AAA AAA AAA AA 184811.FP2926A:核苷酸序列(SEQ ID NO:31)长度:1921个碱基1 GCACGGTGAA ACCCCGTCTC TACTAAAAAT ACAAAAAATT AGCCGGGCAC GGTGGCGGGC61 ACCTGTAGTC CCAGCTACTC GGGAGGCTGA GGCAGGAGAA TGGCATGAAC CTGGGAGGCG121 GAGCTTGCAG TGAGCCGAGA 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CACTGCAGCG1021 TGGTGGAGGT GACAGAGGAG GAGGTTAAGA ACTCAGTCAG GCTCATCCCC AGCTGGACCA1081 CGGTGGTAAG AGAGCCGGGG TAGATGCTCC CTTGTCCTGG AGGGCCTGGG GGACCTGAGC1141 CTTGCTCTGT GCCTGGCTCC TTGGGGGGAC AGAGGCCTGC CTGGCCAGCC AGCTGTGATC1201 CTGGGCCACT GGAGCCAGCC ATTCTGATGG AGGCCCATGG AGAGGGAGGT CTTGTGGTCG1261 GGAGACCAGG AGGCTTGGTG AGGAGAGTGA CTGATTTAAA GAAATAGCGG GCGTGGGGCC1321 GGGCGCGGTG GCTCACGCCT GTAATCCCAG CACTTTGGGA GGCCAAGGCG GGCAGATCAC1381 GAGGTCAGGA GATCGAGACC ATCCTTGAAA CCCCGTCTCT ACTAAAAATA TAGAAAATTA1441 GCCGGGCGTG GTGGCGGGCG CGTGTAGTCC CAGCTACTCG GGAGGCTGAG GCAGGAGAAT1501 GGTGTGAACC CGGGAGGTGG AGTTTGCCGT GAGCCGAGAT CGCGCCACTG CACTCCAGCC1561 TGGGCCACAG AGCGAGACTG CGTCTCAAAA AAAAAAAAAG AAGAAAAGAA AAGAAAGAAA1621 TACCAGGCGC GGTGGCTCAC GCCTGGAATC CCAGCACTTT GGGAGGCCGA GGCGGGTGGA1681 TCACGAGGTC AGGAGATCGA GACCATCCTG GCTAATACGG CGAAACCCCA CCTCTACTAA1741 AAATACAAAA AAATTAGCCG GGCGCAGTGG TGGGCACCTG TAGTCCCAGC TACTGGGGAG1801 GCCGAGGCAG GAGAATCGCT TGAACCTGGG AGGTGGAGGT TGTAGTGAGC CAAGATCACG1861 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Val Leu Gly Trp Ala Gly Thr Gln Lys Thr 113817 GGA GTC ACT TTC CCT TTC TGG AGG GAT CAA CAC CAG GAT GCA TGT GTG 864114 Gly Val Thr Phe Pro Phe Trp Arg Asp Gln His Gln Asp Ala Cys Val 129865 TTG GGT TTG AGT CTG TGG ACT TTG GAC CCC TCC AGG TGA TTC TGG TAA 912130 Leu Gly Leu Ser Leu Trp Thr Leu Asp Pro Ser Arg *** 142913 TGG CCT GAC CTC TCC CCC TCT CCC TGC CCT CCC GGC CCC GAC AGT TGC 960961 ACC CTT GGG TGA CCA AGA ACG GGG AGG AGC CCC TTC CTT CGG AGG AGG 10081009 AGC ACT GCA GCG TGG TGG AGG TGA CAG AGG AGG AGG TTA AGA ACT CAG 10561057 TCA GGC TCA TCC CCA GCT GGA CCA CGG TGG TAA GAG AGC CGG GGT AGA 11041105 TGC TCC CTT GTC CTG GAG GGC CTG GGG GAC CTG AGC CTT GCT CTG TGC 11521153 CTG GCT CCT TGG GGG GAC AGA GGC CTG CCT GGC CAG CCA GCT GTG ATC 12001201 CTG GGC CAC TGG AGC CAG CCA TTC TGA TGG AGG CCC ATG GAG AGG GAG 12481249 GTC TTG TGG TCG GGA GAC CAG GAG GCT TGG TGA GGA GAG TGA CTG ATT 12961297 TAA AGA AAT AGC GGG CGT GGG GCC GGG CGC GGT GGC TCA CGC CTG TAA 13441345 TCC CAG CAC TTT GGG AGG 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AGCTGTGGCT GCCGCATGGG ACAGTGGCCA121 CTCCTGTGTT CATGCCAGTG GGCACGCAGG CCACCATGAA GGGCATCACG ACCGAACAGC181 TGGACGCTCT GGGGACCCGA GCTGATCCAG AAAGCCAACG GTCTCCACGG CTTCATGAAT241 TGGCCTCATA ATCTGCTAAC GGACAGCGGC GGTTTCCAGA TGGTGTCGCT GGTGTCTCTG301 TCCGAGGTGA CGGAGGAGGG CGTCCGCTTC CGCTCCCCCT ACGACGGCAA TGAGACCCTG361 CTGAGCCCGG AGAAATCCGT GCAGATCCAG AATGCGCTGG GCTCGGACAT CATCATGCAG421 CTGGACGACG TGGTTAGCAG TACTGTGACT GGGCCACGTG TGGAGGAGGC CATGTACAGG481 TCAATCCGCT GGCTGGACCG GTGCATTGCA GCCCATCAGC GGCCGGACAA GCAGAACCTC541 TTCGCCATTA TCCAGGGTGG GCTGGACGCA GATCTCCGGG CCACCTGCCT TGAAGAGATG601 ACCAAGCGAG ACGTGCCTGG CTTCGCCATC GGGGGCCTGA GCGGGGGTGA GAGCAAGTCG661 CAGTTCTGGC GGATGGTGGC GCTGAGCACC TCTCGGCTGC CGAAGGACAA GCCCCGATAT721 CTGATGGGGG TTGGGTATGT TGTGGATAGG GAAGCCAGAG CCCTACCTGT GGGAAGTGGA781 TTCCTGGGGA CCCCCTACCC TGCTTGGGGA GGTGGCATTT GGGGGAAACG GACACAGGTC841 TGATCTGAGG AGACTAGGAA GACATGGCTG TCCCTTGGGG GCCATTCTGA GGGAATATGG901 CCCAGTCTGG GGCAGTGTGA GGGTTGGAAG GGGCCCTGGG AAGCCCCTGA GGTTCTCTGC961 CCCCTCCCGT CATGGCTGCA ACCCCAGCTA TGCCACTGAT CTGGTAGTCT GCGTGGCTCT1021 TGGATGTGAC ATGTTCGACT GCGTCTTCCC CACACGGACA GCGCGCTTTG GCTCTGCCCT1081 GGTGCCCACT GGGAACCTGC AGTTGAGGAA GAAGGTGTTT GAGAAGGACT TCGGCCCCAT1141 AGACCCGGAG TGCACCTGCC CCACGTGCCA AAAGCACAGC CGCGCCTTCC TGCACGCACT1201 GCTGCACAGT GACAACACGG CCGCGCTGCA CCACCTCACG GTCCACAACA TCGCCTACCA1261 GCTGCAGCTC ATGAGCGCCG TCCGCACCAG CATCGTGGAG AAGCGCTTCC CGGACTTCGT1321 GCGGGACTTC ATGGGCGCCA TGTACGGGGA TCCCACCCTC TGTCCCACCT GGGCCACTGA1381 CGCTCTGGCC TCTGTGGGAA TCACACTGGG CTGACCTGGC ATTGGGAGAG GGAGGGAGGA1441 AGGAAGGGAG GGAGGGGCTG GAAGATACTG AAGGATTCCT TTTTGAAAGG TTTTTTTTAT1501 TGTAACTTAC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAB:核苷酸序列(SEQ ID NO:35)长度:225个氨基酸1 MLWIGKPEPY LWEVDSWGPP TLLGEVAFGG NGHRSDLRRL GRHGCPLGAI LREYGPVWGS61 VRVGRGPGKP LRFSAPSRHG CNPSYATDLV VCVALGCDMF DCVFPTRTAR FGSALVPTGN121 LQLRKKVFEK DFGPIDPECT CPTCQKHSRA FLHALLHSDN TAALHHLTVH NIAYQLQLMS181 AVRTSIVEKR FPDFVRDFMG AMYGDPTLCP TWATDALASV GITLGC.核苷酸及氨基酸组合序列(SEQ ID NO:36) 克隆号:FP3235起始编码子: 737 ATG 终止编码子:1412 TGA 蛋白质分子量: 24675.171 G CGG CGA GGC TAC CCA GGC TTC CCT GGA GTC GGC CCC ACG GAT CAT 4647 GCG GCT GGT GGC CGA ATG CAG CCG CTC CAG GGC CCG GGC AGG CGA GCT 9495 GTG GCT GCC GCA TGG GAC AGT GGC CAC TCC TGT GTT CAT GCC AGT GGG 142143 CAC GCA GGC CAC CAT GAA GGG CAT CAC GAC CGA ACA GCT GGA CGC TCT 190191 GGG GAC CCG AGC TGA TCC AGA AAG CCA ACG GTC TCC ACG GCT TCA TGA 238239 ATT GGC CTC ATA ATC TGC TAA CGG ACA GCG GCG GTT TCC AGA TGG TGT 286287 CGC TGG TGT CTC TGT CCG AGG TGA CGG AGG AGG GCG TCC GCT TCC GCT 334335 CCC CCT ACG ACG GCA ATG AGA CCC TGC TGA GCC CGG AGA AAT CCG TGC 382383 AGA TCC AGA ATG CGC TGG GCT CGG ACA TCA TCA TGC AGC TGG ACG ACG 430431 TGG TTA GCA GTA CTG TGA CTG GGC CAC GTG TGG AGG AGG CCA TGT ACA 478479 GGT CAA TCC GCT GGC TGG ACC GGT GCA TTG CAG CCC ATC AGC GGC CGG 526527 ACA AGC AGA ACC TCT TCG CCA TTA TCC AGG GTG GGC TGG ACG CAG ATC 574575 TCC GGG CCA CCT GCC TTG AAG AGA TGA CCA AGC GAG ACG TGC CTG GCT 622623 TCG CCA TCG GGG GCC TGA GCG GGG GTG AGA GCA AGT CGC AGT TCT GGC 670671 GGA TGG TGG CGC TGA GCA CCT CTC GGC TGC CGA AGG ACA AGC CCC GAT 718719 ATC TGA TGG GGG TTG GGT ATG TTG TGG ATA GGG AAG CCA GAG CCC TAC 7661 Met Leu Trp Ile Gly Lys Pro Glu Pro Tyr 10767 CTG TGG GAA GTG GAT TCC TGG GGA CCC CCT ACC CTG CTT GGG GAG GTG 81411 Leu Trp Glu Val Asp Ser Trp Gly Pro Pro Thr Leu Leu Gly Glu Val 26815 GCA TTT GGG GGA AAC GGA CAC AGG TCT GAT CTG AGG AGA CTA GGA AGA 86227 Ala Phe Gly Gly Asn Gly His Arg Ser Asp Leu Arg Arg Leu Gly Arg 42863 CAT GGC TGT CCC TTG GGG GCC ATT CTG AGG GAA TAT GGC CCA GTC TGG 91043 His Gly Cys Pro Leu Gly Ala Ile Leu Arg Glu Tyr Gly Pro Val Trp 58911 GGC AGT GTG AGG GTT GGA AGG GGC CCT GGG AAG CCC CTG AGG TTC TCT 95859 Gly Ser Val Arg Val Gly Arg Gly Pro Gly Lys Pro Leu Arg Phe Ser 74959 GCC CCC TCC CGT CAT GGC TGC AAC CCC AGC TAT GCC ACT GAT CTG GTA 100675 Ala Pro Ser Arg His Gly Cys Asn Pro Ser Tyr Ala Thr Asp Leu Val 901007 GTC TGC GTG GCT CTT GGA TGT GAC ATG TTC GAC TGC GTC TTC CCC ACA 105491 Val Cys Val Ala Leu Gly Cys Asp Met Phe Asp Cys Val Phe Pro Thr 1061055 CGG ACA GCG CGC TTT GGC TCT GCC CTG GTG CCC ACT GGG AAC CTG CAG 1102107 Arg Thr Ala Arg Phe Gly Ser Ala Leu Val Pro Thr Gly Asn Leu Gln 1221103 TTG AGG AAG AAG GTG TTT GAG AAG GAC TTC GGC CCC ATA GAC CCG GAG 1150123 Leu Arg Lys Lys Val Phe Glu Lys Asp Phe Gly Pro Ile Asp Pro Glu 1381151 TGC ACC TGC CCC ACG TGC CAA AAG CAC AGC CGC GCC TTC CTG CAC GCA 1198139 Cys Thr Cys Pro Thr Cys Gln Lys His Ser Arg Ala Phe Leu His Ala 1541199 CTG CTG CAC AGT GAC AAC ACG GCC GCG CTG CAC CAC CTC ACG GTC CAC 1246155 Leu Leu His Ser Asp Asn Thr Ala Ala Leu His His Leu Thr Val His 1701247 AAC ATC GCC TAC CAG CTG CAG CTC ATG AGC GCC GTC CGC ACC AGC ATC 1294171 Asn Ile Ala Tyr Gln Leu Gln Leu Met Ser Ala Val Arg Thr Ser Ile 1861295 GTG GAG AAG CGC TTC CCG GAC TTC GTG CGG GAC TTC ATG GGC GCC ATG 1342187 Val Glu Lys Arg Phe Pro Asp Phe Val Arg Asp Phe Met Gly Ala Met 2021343 TAC GGG GAT CCC ACC CTC TGT CCC ACC TGG GCC ACT GAC GCT CTG GCC 1390203 Tyr Gly Asp Pro Thr Leu Cys Pro Thr Trp Ala Thr Asp Ala Leu Ala 2181391 TCT GTG GGA ATC ACA CTG GGC TGACCT GGC ATT GGG AGA GGG AGG GAG 1438219 Ser Val Gly Ile Thr Leu Gly *** 2261439 GAA GGA AGG GAG GGA GGG GCT GGA AGA TAC TGA AGG ATT CCT TTT TGA 14861487 AAG GTT TTT TTT ATT GTA ACT TAC AAA AAA AAA AAA AAA AAA A 1529
Claims (10)
1.一种分离的具有抑癌功能的人蛋白,其特征在于,它包含具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35;
或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的多肽,其特征在于,该多肽是具有选自下组的氨基酸序列的多肽:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。
3.一种分离的多核苷酸,其特征在于,它包含一核苷酸序列,该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85%相同性:
(a)编码如权利要求1和2所述多肽的多核苷酸;
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸编码的多肽具有选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、35。
5.如权利要求3所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸的序列选自下组:
SEQ ID NO:3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36的编码区序列或全长序列。
6.一种载体,其特征在于,它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它是选自下组的一种宿主细胞:
(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞;
(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。
8.一种具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a)在适合表达具有抑癌功能的人蛋白的条件下,培养权利要求7所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出具有抑癌功能的人蛋白活性的多肽。
9.一种能与权利要求1所述的具有抑癌功能的人蛋白特异性结合的抗体。
10.一种药物组合物,其特征在于,它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白以及药学上可接受的载体。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN104878103A (zh) * | 2015-06-01 | 2015-09-02 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | Fam57b基因及其表达产物作为胆管癌诊治的靶标 |
EP3886889A4 (en) * | 2018-11-29 | 2022-03-02 | Technion Research & Development Foundation Limited | PEPTIDE, COMPLEX AND METHODS OF TREATMENT OF CANCER |
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2001
- 2001-09-12 CN CNB011267267A patent/CN1177048C/zh not_active Expired - Fee Related
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CN1177048C (zh) | 2004-11-24 |
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