CN1367831A

CN1367831A - Bnm3转录激活物控制植物胚胎发生和再生过程的用途

Info

Publication number: CN1367831A
Application number: CN00811196A
Authority: CN
Inventors: 基姆·布莱利耶; 泰蕾兹·韦莱; 扬·屈斯泰; 服部次郎; 布赖恩·米基; 米希尔·范卢克伦康帕涅
Original assignee: Her Majesty Power Of Canada Represented By Department Of Agriculture And Agriculture Of Canada; Plant Research International BV
Current assignee: Her Majesty Power Of Canada Represented By Department Of Agriculture And Agriculture Of Canada; Plant Research International BV
Priority date: 1999-06-02
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2002-09-04
Also published as: EP1185656B1; CA2375535C; AU4907700A; JP2003501093A; BR0011101A; WO2000075330A1; ATE290082T1; EP1057891A1; BRPI0011101B1; AU776411B2; CA2375535A1; DE60018416T2; DE60018416D1; US7151170B1; EP1185656A1

Abstract

本发明提供了在诱导小孢子胚胎发育过程中获得的基因,由此基因编码的蛋白质使植物细胞进行胚胎发生,并增加植物细胞的繁殖能力。本发明还公开了这一基因的调控区,及其用于指导感兴趣的基因在合适宿主细胞中表达的用途。

Description

BNM3转录激活物控制植物胚胎发生和再生过程的用途

发明背景

典型的被子植物种子由三个主要成分构成，胚、胚乳和母体种皮。种子发育起自一双受精事件，在该事件中一个精细胞核与一个卵细胞核融合形成胚，第二个精细胞核与两个中央细胞核融合形成胚乳。胚发育本身可分成三个发育阶段，胚发育第一个阶段是细胞分裂和形态发生阶段，其用于建立成熟植物的主要组织类型和器官系统。第二个阶段包括快速细胞扩增阶段，其特征在于合成贮藏储备，以在萌发和早期幼苗发育过程中维持胚。在胚发育的最后阶段，胚成粉状并进入发育停止期或称休眠期。所有上述事件通常在种子保持附着在母体植物中时发生。

许多植物物种能在不受精中产生胚，这一无性胚发育过程可天然发生，例如在Bryophyllum(Yarborough，1923)和Malaxis(Taylor，1967)的叶缘上，或在无融合生殖植物的胚珠内(Koltunow，1995)。无融合生殖是指在不存在卵细胞受精时从母体胚珠组织产生种子的现象。无性胚发育也可从配子体或体细胞组织经体外诱导(Mordhorst等，1997)，或者如最近所述，可通过基因表达的遗传修饰而诱导(Ogas等，1997；Lotan等，1998)。

已观察到无融合生殖的三种主要机制，即倍数孢子形成、无孢子生殖和不定胚生殖。每种机制根据产生胚的细胞的来源以及在胚珠发育过程中起始无融合生殖过程的时间而不同。倍数孢子形成和无孢子生殖被认为是无融合生殖的配子体形式，因为它们涉及二倍体胚囊的形成。不定胚生殖不涉及有丝分裂衍生的胚囊的产生。

在倍数孢子形成中，大孢子母细胞不进行正常减数分裂，而是有丝分裂产生二倍体胚囊，而非正常的单倍体胚囊。胚囊细胞之一作为卵细胞起作用并孤雌生殖分裂(不经受精)形成胚。在某些物种中，胚囊的未还原的极性核可融合形成种子的营养性组织胚乳(自动胚乳生成)，而另一些物种中需要传粉而进行胚乳生成(假受精)。

在无孢子生殖型无融合生殖中，孤雌胚从另外的细胞即无孢子生殖原始细胞中产生，该细胞是从珠心中分化而来。与倍数孢子形成物种的大配子母细胞一样，无孢子生殖原始细胞进行有丝分裂产生二倍体胚囊。无孢子生殖胚不是衍生自大配子母细胞，并因此可在一单个胚珠中与有性衍生的胚共存。在无孢子生殖物种中很少发生胚乳的自动产生，因此无孢子生殖型无融合生殖依赖于减数分裂衍生的胚囊的极性核的受精来产生胚乳。

对于不定胚生殖，胚直接从孢子体胚珠组织如珠被或珠心中经孤雌生殖而形成。来自显示不定胚生殖的物种的种子通常含有多个无性胚并也可含有单个有性胚。显示不定胚生殖的物种也依赖于在相同胚珠内存在减数分裂衍生的胚囊以形成胚乳。

在大多数植物物种中，无融合生殖性状似乎在一单显性基因座的控制下，这一基因座可编码一或多个发育调控物，如转录因子，其在有性生殖植物中能起始基因表达级联，导致胚囊和/或胚胎发生，但是其在无融合生殖植物中异时或异位表达(Peacock，1995；Koltunow，1993；Koltunow等，1995)。

无融合生殖对于作物改进是一有价值的性状，因为无融合生殖种子产生克隆子代并因此可用于遗传固定杂交品系。杂交种子的生产是一费力而昂贵的程序，因为它涉及遗传学纯种亲本品系的保持，不同的花粉共同和雄性不育品系的使用，以及品系分离。通过无融合生殖生产种子避免了这些问题，因为一旦产生杂种，其可克隆保持，因此无需保持和杂交不同的亲本品系。无融合生殖种子的应用也提供了繁殖营养生殖作物的更经济的方法，因为其不需使用扦插或组织培养技术繁殖品系，降低了易于通过营养生殖组织传递的疾病传播，并且在许多物种中降低了繁殖体的大小，使得降低运输和种植成本。

尽管无融合生殖在许多植物物种中发生，但是仅有很少的作物物种是无融合生殖的。通过从野生亲缘物种中渐渗杂交(Ozias-Akins等，1993；WO97/10704；WO97/11167)或通过相关但发育趋异的有性物种间的杂交(WO98/33374)而将无融合生殖性状引入作物物种的尝试未能得到有市场价值的产物。其它的途径集中在可用于鉴别或操作无融合生殖过程的基因序列的鉴别上(WO97/43427；WO98/36090)，但是这些途径没有导致产生常规生产无融合生殖植物的方法。

也已经尝试诱变途径将有性繁殖植物如拟南芥(拟南芥属)转变成无融合生殖植物(Peacock等，1995)。例如，已经鉴别了若干隐性“受精不依赖性种子”(fis)突变体，其在不发生受精作用的情况下可以低频率起始部分胚和/或胚乳(Chaudhury等，1997)。但是，需要修改一些参数以用fis)突变体获得真正的二倍体无融合生殖种子。

从许多配子体和体细胞植物组织培养物中可诱导形成无性衍生的胚(Yeung，1995)。通过用植物生长调节剂如植物生长素或植物生长素与细胞激动素联合处理体细胞组织培养物可从中获得体细胞胚。通过加入植物生长调节剂或通过简单的应力处理可以从胚珠(雌核发育)和花药(雄核发育，花粉或小孢子胚胎发生)的配子体组织培养物诱导形成胚。

已鉴别了几种可用于诱导有效体外胚生成的突变体，这些突变体包括具有改变的枝分生组织的隐性拟南芥属突变体，例如primordiatiming(pt)，clavata(clv)1和clv3，其示出幼苗在存在植物生长素而萌发时增强胚胎发生愈伤组织形成(Mordhorst等，1998)。已示出两种拟南芥属基因LEAFY COTYLEDON(LEC1；WO98/37184，Lotan等，1998)和pickle的改变的表达在不添加生长调节剂时也促进体细胞胚的生成。LEC1基因编码CCAAT盒结合转录因子(CBF)的HAP3亚基的同系物，LEC1基因控制合子胚发育的许多方面，包括干燥耐受性和子叶同一性。在lec1突变体背景中LEC1基因的异位过表达导致产生2种转基因品系，其偶尔在叶上形成胚样结构。这些胚样结构表达基因，如编码种子贮藏蛋白和油体蛋白的基因，这些基因正常情况下在发育胚中优先表达。含有隐性突变体PICKLE基因的植物产生增厚的初级根分生组织。当将根组织与植物其它部分分开并置于不含生长调节剂的基本培养基上时，突变的pickle根产生胚形成愈伤组织(Ogas等，1997)。突变的pickle根显示发育种子的形态学特征，如油体，并且与LEC1过表达植物一样，积累在发育种子中优先表达的基因。

无融合生殖种子的有效产生似乎仅可通过鉴别并随后修饰发育调控物如转录因子而实现，已知发育调控物激活基因表达级联导致有性繁殖和无融合生殖植物中的胚胎发生。本发明通过提供产生无融合生殖种子的方法而实现这一需求，本发明方法包括异位过表达含有胚表达AP2结构域的转录因子BNM3或其同系物。

本发明的一个目的是克服现有技术的不足。

上述目的通过主权利要求特征的组合而实现，从属权利要求进一步公开了本发明的优选实施方案。

发明概述

本发明涉及植物的无性胚形成和再生，更具体地，本发明涉及产生无性衍生的胚的方法以及增强植物再生能力的方法。

根据本发明，提供了一种分离的DNA分子，其包含的核苷酸序列：

·在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5或6，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域，杂交；

·在严格条件下与SEQ ID NO：1或3，不包括AP2重复1-接头一AP2重复2区域，杂交；

·包含SEQ ID NO：1，3，5或6的至少27个连续核苷酸；或者

·与SEQ ID NO：1，3，5或6的核苷酸序列具有至少70％的相似性。

本发明还涉及一种分离的DNA分子，其在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1，3，5或6，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，并包括编码一种蛋白质的核酸序列，其中该蛋白质当以足够水平存在于植物细胞时能使细胞胚胎发生，或者增加植物细胞的再生能力，或者同时使细胞胚胎发生并增加植物细胞的再生能力。本发明包括上述分离的DNA分子，其包含在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1的1-2014位核苷酸、SEQ ID NO：3的1-2011位核苷酸、SEQ ID NO：5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域，杂交的核苷酸序列。本发明还包括一种载体，其包含上述定义的分离的DNA分子，其中该分离的DNA分子在指导所述DNA在植物细胞中表达的调控元件的控制下。调控元件可以是组成型、诱导型、组织特异性或发育活性调控元件。

本发明还包括转化的植物细胞、转化的植物或得自转化的植物的种子，其均包含上述定义的载体。

本发明涉及一种由一种分离的DNA分子编码的分离的蛋白质，该分离的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1，3，5或6的核苷酸序列，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，其中该蛋白质当以足够水平存在于植物细胞时能使细胞胚胎发生，或者增加植物细胞的再生能力。本发明还包括由一种分离的DNA分子编码的蛋白质，该分离的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ IDNO：5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域，杂交，或者在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列杂交。本发明还包括编码SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7定义的蛋白质的分离的DNA分子。本发明还涉及与SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7的氨基酸序列有至少70％同源性的蛋白质，或者包括SEQ ID NO：2的序列的约30-541个氨基酸，或者包括SEQ ID NO：4的序列的约30-561个氨基酸。

本发明还涉及产生无性衍生的胚的方法，包括：

i)用包含一种分离的DNA分子的载体转化植物细胞，该分离

的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1，3，5

或6的核苷酸序列，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2

区域杂交，并且编码一种蛋白质，该蛋白质当以足够水平存

在于植物细胞时能使植物细胞胚胎发生，或者增加植物细胞

的再生能力，或者该分离的DNA分子包含-核苷酸序列，

该核苷酸序列在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5的1620

-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035位核苷酸，

不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域，杂交，或者在

中等或严格条件下与SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列杂交；

ii)培养所述植物细胞产生转化的组织；

iii) 确定转化的组织中存在所述分离的DNA分子；和

iv)分析转化的组织中的无性胚形成。

本发明还涉及上述方法，其中分析步骤(步骤iv)涉及分析体细胞胚、配子体衍生胚、不定胚生殖、倍数孢子形成，或者分析胚囊的单倍体孤雌生殖。

本发明还包括生产无融合生殖植物的方法，包括：

i)用包含一种分离的DNA分子的载体转化植物细胞，该分离

的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1的1-2014

位核苷酸、SEQ IDNO：3的1-2011位核苷酸、SEQ IDNO：

5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035

位核苷酸，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，

并且编码一种蛋白质，该蛋白质当以足够水平存在于植物细

胞时能使植物细胞胚胎发生，或者增加植物细胞的再生能力；

ii)确定转化的组织中存在所述分离的DNA分子；和

iii)分析转化的组织中的无性胚形成。

本发明还涉及上述方法，其中分析步骤(步骤iii)涉及分析无性衍生的胚、体细胞胚、配子体衍生胚、不定胚生殖、倍数孢子形成，或者分析胚囊的单倍体孤雌生殖。

本发明还涉及一种产生无性衍生的胚的方法，包括：

i)用包含一种分离的DNA分子的载体瞬时转化植物细胞，该分

离的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：1的1-

2014位核苷酸、SEQ ID NO：3的1-2011位核苷酸、SEQ ID

NO：5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035

位核苷酸，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，

并且编码一种蛋白质，该蛋白质当以足够水平存在于植物细

ii)培养瞬时转化的植物细胞以产生瞬时转化的组织；

iii)分析瞬时转化的组织中的无性胚形成。

本发明还涉及一种修饰植物的再生能力的方法，包括：

i)用包含一种分离的DNA分子的载体转化植物细胞，该分离

的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5或SEQ ID

NO：6杂交并且编码一种蛋白质，该蛋白质当以足够水平存

在于植物细胞时能使植物细胞胚胎发生，或者增加植物细胞

的再生能力，或者该分离的DNA分子包含一种核苷酸序列，

该核苷酸序列在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5的1620

-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035位核苷酸，

不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，或者在严

格条件下与SEQ ID NO：1的1-2014位核苷酸或SEQ ID

NO：3的1-2011位核苷酸定义的核苷酸序列杂交；

ii)培养转化的植物细胞产生转化的组织；和

iii)分析转化的组织与野生型组织相比增强的再生能力。

本发明还包括上述方法，其中步骤iii)包括在不存在生长调节剂时进行分析。

本发明还涉及修饰植物的再生能力的方法，包括：

i)用包含一种分离的DNA分子的载体瞬时转化植物细胞，该

分离的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5或SEQ

ID NO：6杂交并且编码一种蛋白质，该蛋白质当以足够水平

存在于植物细胞时能使植物细胞胚胎发生，或者增加植物细胞

的再生能力，或者该分离的DNA分子包含一种核苷酸序列，

该核苷酸序列在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5的1620

-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035位核苷酸，

不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，或者在严

格条件下与SEQ ID NO：1或3定义的核苷酸序列杂交；

ii)培养瞬时转化的植物细胞产生瞬时转化的组织；和

iii)分析转化的组织与野生型组织相比增强的再生能力。

本发明还涉及一种选择转化的植物的方法，包括：

i)用包含一种分离的DNA分子的载体转化正常非再生的植物，

该分离的DNA分子在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5

或SEQ ID NO：6杂交并且编码一种蛋白质，该蛋白质当以

足够水平存在于植物细胞时能使植物细胞胚胎发生，或者增

加植物细胞的再生能力，或者该分离的DNA分子包含一种

核苷酸序列，该核苷酸序列在中等或严格条件下与SEQ ID

NO：5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6的2026-5035

位核苷酸，不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区域杂交，

或者在严格条件下与SEQ ID NO：1或3定义的核苷酸序列

杂交；

ii)确定转化的植物是否能在该正常非再生植物不再生的条件下

再生。

本发明还涉及一种分离的DNA分子，其包含一种DNA序列，该DNA序列与SEQ ID NO：5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO：6的1-2025位核苷酸至少有约70％相似性，或者包含SEQ ID NO：5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO：6的1-2025位核苷酸内的至少22个连续核苷酸。本发明范围内还包括一种载体，其包含与一种感兴趣基因可操纵连接的上述定义的分离的DNA分子，其中该分离的DNA分子指导该感兴趣基因在植物细胞内的表达。感兴趣的基因可以异源于该分离的DNA分子。感兴趣的基因可选自药物活性蛋白、抗体、工业酶、蛋白添加剂、营养药、贮藏蛋白、动物饲料和动物饲料添加剂。本发明还包括包含上述定义的载体的转化的植物细胞、转化的植物或得自转化的植物的种子。

另外，本发明包括指导感兴趣的基因在植物的发育胚中表达的方法，包括用含有一分离的DNA分子的载体转化所述植物，该分离的DNA分子与SEQ ID NO：5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO：6的1-2025位核苷酸至少有约70％相似性，或者包含SEQ ID NO：5的1-1619位核苷酸或SEQ ID NO：6的1-2025位核苷酸内的至少22个连续核苷酸。

本发明还涉及一种生产感兴趣的蛋白质的方法，包括：

i)用至少一种载体转化植物以产生转化的植物，所述载体包含

一种分离的DNA分子，该分离的DNA分子在中等或严格条

件下与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6杂交并且编码一种蛋

白质，该蛋白质当以足够水平存在于植物细胞时能使植物细胞

胚胎发生，或者增加植物细胞的再生能力，或者该分离的DNA

分子包含一种核苷酸序列，该核苷酸序列在中等或严格条件下

与SEQ ID NO：5的1620-4873位核苷酸或SEQ ID NO：6

的2026-5035位核苷酸，不包括AP2重复1-接头-AP2重

复2区域杂交，或者在严格条件下与SEQ ID NO：1或3定义

的核苷酸序列杂交；

ii)确定转化的植物中存在所述分离的DNA分子；和

iii)培养转化的植物以生产感兴趣的蛋白质，其中感兴趣的蛋

白质的表达由所述分离的DNA的表达产物而诱导。

本方法还包括用第二个载体转化植物，该第二个载体包含在调控元件控制下的编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，其中该调控元件由所述分离的DNA的表达产物而诱导。另外，本方法还可用于生产感兴趣的蛋白质，其中该感兴趣的蛋白质是一种天然蛋白质。

本发明的概述不需描述本发明的所有特征，本发明还可体现在所述特征的亚结合中。

附图描述

本发明的这些及其它特征参照附图及以下描述将变得更清楚。

图1示出培养温度对欧洲油菜(Brassica napus)的分离的小孢子和花粉的发育结局的影响。在25℃或更低温度培养的晚期单核小孢子和早期双核花粉持续分裂并形成有功能的花粉粒(配子体)，而在32℃培养的相同小孢子和花粉经历无数孢子体分裂，导致形成单倍体胚(胚胎发生)。在25℃培养1天随后在32℃培养的晚期单核小孢子和早期双核花粉可经历配子体分裂，但是不形成胚或成熟花粉粒(非胚胎发生)。

图2示出SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的DNA序列的对比，用黑体字示出了ATG翻译起始密码子和TAG翻译终止密码子。相同氨基酸用符号(*)代表，缺口由符号(-)示出。

图3示出由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的DNA序列编码的预测蛋白质序列的对比。用黑体字示出了第一个AP2结构域重复(重复1)和第二个AP2结构域重复(重复2)的氨基酸序列。相同氨基酸用星号(*)代表，错配由在序列对比下面的点(.)示出。

图4示出欧洲油菜基因组中两个BNM3基因的存在。在高严格条件下将Topas基因组DNA与BNM3A cDNA片段杂交。在这些条件下BNM3A cDNA与两个DNA片段杂交，这些片段相应于BNM3A和BNM3B基因。分子量标记(λDNA HindIII限制片段)的位置在图的左侧标出。用于消化DNA的限制酶在印迹上面示出。

图5示出由SEQ ID NO：1的DNA编码的预测的蛋白质序列(BNM3A)与其它AP2结构域蛋白质的预测的蛋白质序列的对比。起自第208位并跨越第1个AP2结构域重复(AP2结构域重复1)、第2个AP2结构域重复(AP2结构域重复2)和两个重复之间的接头区(接头)的BNM3A的氨基酸序列与含有两个AP2结构域的其它蛋白质的氨基酸序列进行对比。这一区域的氨基酸相似性从APETALA2的53％至ZMMHCF1的80％。相同氨基酸用符号(*)代表，缺口由符号(-)示出。蛋白质名称在左边列出并缩写如下：ANT，AINTEGUMENTA(登录号U41339)；ZM，ZMMHCF1(登录号Z47554)；GL15，GLOSSY15(登录号U41466)；AP2，APETALA2(登录号U12546)。

图6示出用BNM3A cDNA片段在提取自所示组织的RNA上进行的凝胶印迹分析的结果。RNA凝胶印迹含有5微克(a)或20微克(b，c)总RNA。图6A示出在小孢子胚培养物中BNM3的表达模式。RNA是在收集时(花粉0d)、在32℃培养4天后(+胚)、在25℃培养4天后(花粉4d)、在25℃培养1天随后在32℃培养3天后(-胚)的晚期单核小孢子和早期双核花粉以及在发育的球形期、心期、鱼雷期的小孢子衍生胚、21天子叶(21d子叶)、28天子叶(28d子叶)和42天子叶(42d子叶)中提取出来。在胚胎发生的小孢子和发育的小孢子衍生胚中检测到BNM3表达，但是在组织培养之前收集的发育的小孢子和花粉中和非胚胎发生摇瓶中未检测到。曝光时间是7天。图6B示出BNM3基因表达在发育的种子中检测到。种子在不同的传粉后天数(DAP)收集，这些时间点在发育中大致相应于球形期(7d)，心期(14d)，鱼雷期(18d)，早期子叶(21d)，中期子叶(28d，35d)和晚期子叶(42d)。图6C示出在非种子组织中未检测到BNM3基因表达。根和叶是从14天温室生长的植物中收集，完整的花以及切割的花药和雌蕊从即将开花的开放花芽中收集。小芽和大芽示出分别指长度小于5mm或大于5mm的闭合花芽。长角果是在传粉后16天收集。曝光时间14天。

图7示出用含有在修饰的POLYUBIQUITIN启动子(B)和含有AMB翻译增强子的双倍增强的35S启动子(A，C-E)控制下的BNM3基因的构建体转化的欧洲油菜和拟南芥属植物的表型。图7A示出Brassica T1幼苗的叶缘上的胚结构。图7B示出在拟南芥属T2幼苗的叶柄上的胚结构。图7C示出在拟南芥属T1幼苗的子叶上的胚结构。图7D示出拟南芥属T1子叶的离轴侧扫描电镜图。观察到胚的双极性以及从初生胚表面出现的次生胚(星号)。图7E示出图7C所示T1幼苗的一个子叶的半薄切片。观察到存在胚的所有主要器官和组织元件，以及在苗端分生组织和子叶侧翼的新胚发育。

图8示出用含有在修饰的POLYUBIQUITIN启动子控制下的BNM3B基因的构建体转化的拟南芥属植物具有增加的再生能力。图8A示出在含有生长调节剂的培养基上的野生型和转基因叶和下胚轴外植体。图8B示出在含有生长调节剂的培养基上的野生型和转基因根。图8C示出在不含生长调节剂的培养基上的野生型和转基因叶和下胚轴外植体。图8D示出在不含生长调节剂的培养基上的野生型和转基因根外植体。

图9示出BNM3的拟南芥属直向同源物AtBBM基因的鉴定。图9A示出在约8kb的重叠拟南芥生态型C24基因组DNA上AtBBM序列的位置以及所选择的限制酶的位点。该单个拟南芥属BNM3同系物的预测蛋白质编码区位于基因组序列的3426-6435位。预测的编码区的外显子由限制图谱上的黑框示出。在7479位的垂直箭头示出IXR3(Irregular xylem3)序列的起点。水平尺单位为kb。图9B示出拟南芥属AtBBM基因组克隆和通过用欧洲油菜BNM3 cDNA探针经DNA凝胶印迹分析鉴别的拟南芥属同系物是相同的。用(A)所示限制酶消化来自拟南芥属生态型Landsberg erecta(L)和Columbia(C)的基因组DNA并与全长BNM3A cDNA探针(SEQ IDNO：1)杂交。(A)中所示限制图谱与杂交限制片段模式的比较表明在中等严格清洗条件(0.2×SSC，0.1％SDS，25℃)下，全长BrassicacDNA探针检测到一个拟南芥属同系物。分子量标记(kb)在印迹右侧示出。

优选实施方案的描述

本发明涉及植物的无性胚形成和再生。更具体地，本发明涉及产生无性衍生胚的方法，以及增强植物再生能力的方法。本发明还涉及植物中的异源蛋白生产系统及其应用。

以下描述的是举例示出的优选实施方案，其并非对实施本发明所需的特征组合的限制。

经减数筛选分离在欧洲油菜栽培品种Topas小孢子胚胎发生诱导期间优先表达的基因。发现有包含6个独特的DNA序列的7个独立cDNA克隆在制备自胚胎发生和非胚胎发生小孢子培养物的cDNA文库中差异表达。如本文所述鉴定了几个这种BNM(代表欧洲油菜小孢子胚，Brassica napus microspore embryo)克隆，即BNM3A(SEQID NO：1)和BNM3B(SEQ ID NO：3)。BNM3A和BNM3B分别编码SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。还获得了包括调控区(SEQ ID NO：5的核苷酸1-1619)的BNM3A基因组序列(SEQ ID NO：5)。也鉴别了称为AtBBM的BNM3基因的拟南芥属直向同源物。AtBBM的基因组序列如SEQ ID NO：6所示，而其预测的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

本文所用术语“再生”是指一种形态发生应答，其导致产生衍生自一个单细胞或一组细胞的新组织、器官、胚、整个植物或整个植物的片段。再生可通过愈伤组织时期间接进行，也可无需间插的愈伤组织时期之间进行。“再生能力”是指植物细胞进行再生的能力。

“胚胎发生细胞”是指已经完成了从体细胞或配子体细胞向无需进一步施加刺激物而产生胚的状态过渡的细胞。

“调控元件”包括发育调控的、组织特异性的、诱导型和组成型调控元件。发育调控的或控制其所控制的基因的差异表达的调控元件在某些器官或器官的组织的发育过程中的特异时间在该器官或组织内被激活。但是某些发育调控的调控元件可在特异的发育阶段在某些器官或组织内优先活化，它们也可以发育调控的方式或以基础水平在植物的其它器官或组织中活化，这种调控元件被认为是“组织特异性的”。调控元件可以见于基因编码区的上游、之中、下游或其组合。

诱导型调控元件是能应答诱导物而直接或间接激活一或多个DNA序列或基因的转录的调控元件。在不存在诱导物时，DNA序列或基因不转录。典型地，与激活转录的诱导型调控元件特异结合的蛋白质因子以非活性形式存在，其随后通过诱导物而直接或间接转变为活性形式。诱导物可以是化学制剂，如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚化合物，或者是通过热、冷、盐或毒性元素直接施加的生理学应力，或通过病原体或致病因子如病毒而间接施加的生理学应力。含有诱导型调控元件的植物细胞可通过外部施加诱导物至细胞或植物而暴露于诱导物，施加方式如喷雾、洒水、加热或类似方法。

组成型调控元件指导基因在植物的各个部分并在植物发育期间持续表达。已知的组成型调控元件的例子包括与CaMV 35S转录物相关的启动子(Odell等，1985，自然313：810-812)，与水稻肌动蛋白基因(Zhang等，1991，植物细胞3：1155-1165)以及丙糖磷酸异构酶1(Xu等，1994，植物生理学106：459-467)基因相关的启动子，与玉米遍在蛋白1基因相关的启动子(Cornejo等，1993，植物分子生物学29：637-646)，与拟南芥属遍在蛋白1和6基因相关的启动子(Holtorf等，1995，植物分子生物学29：637-646)，与烟草翻译起始因子4A基因相关的启动子(Mandel等，1995，植物分子生物学29：995-1004)。

“感兴趣的基因”是指欲在转化的植物中表达的任何基因。这种感兴趣的基因可包括但不限于编码药物活性蛋白如生长因子、生长调节物、抗体、抗原、用于免疫接种的其衍生物等的基因。这种蛋白包括但不限于白介素、胰岛素、G-CSF，GM-CSF，hPG-CSF，M-CSF或其组合、干扰素如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-τ、凝血因子如因子VIII、因子IX或tPA或其组合。感兴趣的基因也可编码工业酶、蛋白补剂、营养药或用作饲料、食品或饲料和食品的附加值产品。这种蛋白的例子包括但不限于蛋白酶、氧化酶、植酸酶几丁质酶、转化酶、脂酶、纤维素酶、木聚糖酶、参与油生物合成的酶等。其它蛋白补剂、营养药或附加值产品包括天然或修饰的种子贮藏蛋白等。

本发明还涉及含有与本发明的调控元件可操纵连接的感兴趣的DNA的嵌合基因构建体。任何外源基因或感兴趣的基因可根据本发明使用和操作以获得外源基因的表达。

感兴趣基因的表达的激活也可在一调控元件的控制下，该调控元件本身被BNM3蛋白激活。非限制性的例子如感兴趣的基因可与napin启动子融合，而napin启动子可被BNM3诱导。另外，感兴趣的基因可在一或多个由BNM3诱导的启动子的控制下在体细胞组织中表达，从而如以下将详细描述的，体细胞组织发育成包括胚胎发生细胞的类似种子的结构，这些类似种子的结构产生感兴趣基因的产物。

本发明的嵌合基因构建体还可包括3′非翻译区。3′非翻译区是指包含一DNA区段的基因的部分，该DNA区段含有多腺苷酸化信号和任何能实现mRNA加工或基因表达的调控信号。多腺苷酸化信号通常特征在于能将聚腺苷酸序列段添加到mRNA前体的3′末端。多腺苷酸化信号通常通过存在与规范形式的5′AATAAA-3′的同源性而鉴别，当然常有变化。合适的3′区的例子是3′转录非翻译区，其含有农杆菌根瘤诱导(Ti)质粒基因如胭脂氨酸合酶(Nos基因)和植物基因如大豆贮藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)基因的多腺苷酸化信号。因此来自本发明构建体的结构基因的3′非翻译区可用作构建在植物中表达的嵌合基因。

如果需要，本发明的嵌合基因构建体还可进一步包括增强子，即翻译或转录增强子。这些增强子区是本领域技术人员熟知的，并可包括ATG起始密码子和相邻序列。起始密码子可以与编码序列同一读框以保证完整序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以来自包括天然和合成的各种来源。翻译起始区可从转录起始区的来源提供，或者从结构基因提供。该序列还可衍生自选择用于表达基因的调控元件，并可以特异修饰以增加mRNA的翻译。

为了有助于鉴别转化的植物细胞，可进一步操作本发明的构建体以包括植物选择标记。有用的选择标记包括提供对抗生素如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等的抗性的酶。类似地，可产生由颜色变化如GUS(β-葡糖醛酸酶)、荧光或发光鉴别的化合物的酶如萤光素酶也是有用的。

本发明还包括含有本发明的基因或嵌合基因构建体的转基因植物，其包含BNM3基因，得自BNM3的调控元件，或与组成型、发育调控或诱导型调控元件可操纵相关的来自BNM3的编码区，或其组合。从植物细胞再生完整植物的方法是本领域已知的。通常，转化的植物细胞在合适的培养基中培养，当使用选择标记来促进转化的植物细胞的鉴别时，该培养基可含有选择剂如抗生素。当形成愈伤组织后，可根据已知方法采用合适植物激素促进枝形成，并将枝转移至生根培养基进行植物再生。随后可使用该植物从种子或用营养繁殖技术建立重复代。本发明的构建体可用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔、biolistics等导入植物细胞，这些技术综述例如参见Weissbach and Weissbach，《植物分子生物学方法》，纽约学术出版社，VIII，pp421-463(1988)；Geiersonand Corey，《植物分子生物学》，第2版(1988)；Miki and Iyer，植物基因转移基础知识，见《植物代谢》，第2版，DT.Dennis，DH Turpin，DD Lefebrve，DB Layzell编辑，Addison Wesly，Langmans Ltd.，伦敦，561-579页(1997)。本发明还包括包含基因或嵌合基因构建体的合适载体。

从欧洲油菜小孢子胚培养中已分离了一类基因，这些基因被发现是胚胎发生的重要调节物，因为当它们在植物营养组织中异位表达时能诱导形成无性衍生胚的形成。以下这些基因被称为BNM3基因(代表欧洲油菜小孢子胚，Brassica napus microspore embryo)，SEQID NO：1示出BNM3A的cDNA，SEQ ID NO：3示出BNM3B的cDNA，BNM3A基因组序列在SEQ ID NO：5中给出。BNM3A的调控区位于SEQ ID NO：5的核苷酸1-1619。SEQ ID NO：1和3的DNA编码的预测的蛋白质序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示。

在拟南芥属中已鉴别了BNM3基因的直向同源物，以下称为AtBBM。SEQ ID NO：6示出了AtBBM的基因组序列。AtBBM的调控区位于SEQ ID NO：6的1-2025位核苷酸。预测的氨基酸序列见SEQIDNO：7。

BNM3翻译产物含有两个拷贝的AP2结构域，它们由接头区分开(图3，SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：4的氨基酸208-378，SEQ IDNO：5的核苷酸2694-4252，SEQ ID NO：6的核苷酸2938-4416)，其在以下称为“AP2结构域”或“AP2结构域重复1-接头-AP2结构域重复2”。据认为AP2结构域介导蛋白质-蛋白质相互作用。许多含有AP2结构域的蛋白质结合DNA的能力与潜在的核定位信号及可作为转录激活物的酸性区的存在偶联，提示这些蛋白质是转录因子。BNM3的AP2结构域重复1-接头-AP2结构域重复2显示与AtBBM的AP2结构域有约99％的同源性(BNM3和AtBBM之间有95％核苷酸相似性)，与其它含AP2蛋白质有高程度相似性，例如与ANT大约85％相似性(76％核苷酸相似性)，与MOE17(染色体3)有约85％相似性(78％核苷酸相似性，如果对比中包括内含子，例如来自SEQ ID NO：5的AP2区，则在第2个AP2结构域内的285bp区域MOE17显示约63％核苷酸相似性)，ZMMHCF1有约88％相似性，与GLOSSY15有66％相似性。但是在两个AP2结构域之外，BNM3序列和这些其它含AP2蛋白质的相似性显著降低。

“BNM3”或“BNM3基因”是指SEQ ID NO：1，3，5或6所公开的寡核苷酸序列，或其片段、衍生物或突变体，或者显示至少如下同源性或相似性的寡核苷酸序列：

i)与不包括AP2结构域重复1-接头-AP2结构域重复2区域

的SEQ ID NO：1，3，5或6公开的序列的片段或衍生物至少有

70％同源性或相似性，该AP2结构域重复1-接头-AP2结构

域重复2区域由SEQ ID NO：1的核苷酸741-1257，SEQ ID NO：3

的核苷酸672-11 88，SEQ ID NO：5的核苷酸2694-4252或SEQ

ID NO：6的核苷酸2938-4416编码区内的相应序列限定(由SEQ

ID NO：5的核苷酸2694-4252或SEQ ID NO：6的核苷酸2938-

4416限定区域由7个内含子打断，见图9)；或者

ii)与包括AP2结构域重复1-接头-AP2结构域重复2的SEQID

NO：1，3，5或6公开的全长序列有至少70％同源性或相似性。

这种同源性的确定可用寡核苷酸序列对比算法计算，该算法例如但不限于BLAST(GenBank URL：www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/，使用缺省参数：程序：blastn；数据库：nr；Expect10；filter：缺省；对比：成对；查询遗传密码：标准(1))，或FASTA，同样使用缺省参数。使用序列相似性搜索，AtBBM显示与全长BNM3有约85％同源性，因此AtBBM是一种BNM3基因。另外，BNM3基因也可根据其与本发明公开的序列杂交的能力确定。因此，“BNM3”或“BNM3基因”也包括：

iii) 长度超过约15个核苷酸，优选20-25个核苷酸的寡核苷

酸，其在高严格条件下，例如但不限于在65℃、5×SSC用凝

胶印迹杂交(Southern杂交)，随后在0.1×SSC、65℃清洗条

件，与不包括编码上述定义的AP2结构域(AP2结构域重复

1-接头-AP2结构域重复2)的区域的任何SEQ ID NO：1，3，5

或6或者SEQ ID NO：1，3，5或6的序列的片段或衍生物结合；

或

iv) 基本上全长的核苷酸序列，或长度超过约1000个核苷酸

的核苷酸序列，其在中等或高严格条件下，例如但不限于分别

在25℃、0.2×SSC，0.1％SDS或在65℃、5×SSC用凝胶印

迹杂交(Southern杂交)，随后在0.2×SSC、0.1％SDS、65℃

清洗条件，与不包括编码上述定义的AP2结构域(AP2结构

域重复1-接头-AP2结构域重复2)的区域的SEQ ID NO：

1或3或者SEQ ID NO：1或3的序列的长度超过约1000个核

苷酸的片段或衍生物结合。

在中等严格条件下，全长BNM3 cDNA仅与AtBBM的片段杂交(见图9B)，因此，AtBBM是一种BNM3基因。AtBBM基因组克隆的序列分析表明IRREGULAR XYLEM3(IXR3)基因的5，末端位于潜在的ArBBM编码区的下游(位置7479，图9A)。IXR3以前已示出定位于染色体5的标记物nga 106(33.26cM)和mi438(33.34cM)之间的150kb区(Taylor等，1999)。这一数据表明Brassica BNM3基因的拟南芥属直向同源物由一定位于染色体5的单基因编码。与AtBBM高度相似的序列TAMU BAC克隆：T10B6(登录号AP002073；Nakamura，2000年5月18日)也已被定位于染色体5。

“BNM3基因”也包括这样DNA分子，其包含SEQ ID NO：1，3，5或6的至少27个连续核苷酸，或位于SEQ ID NO：5的核苷酸1-1619或SEQ ID NO：6的核苷酸1-2025的调控区内的至少22个连续核苷酸。所定义的BNM3的片段可用作探针以鉴别一生物体内与BNM3调控或编码区相关的核苷酸，或者用作引物以扩增这些核苷酸序列。另外，包含SEQ ID NO：1，3，5或6的序列的至少27个连续核苷酸、优选超过30个至35个核苷酸，并且编码如下的蛋白质或其活性片段的分子也被认为是BNM3基因，所述蛋白质当以足够水平存在于植物细胞时使细胞胚胎发生，或增加植物细胞的再生能力，或同时使细胞胚胎发生并增加植物细胞的再生能力。优选地，BNM3基因包含SEQ ID NO：1或3的约50-1981位核苷酸，SEQ ID NO：5的编码区(1620-4858)的约50-3538位核苷酸，或SEQ ID NO：6的编码区(2025-5035)的约50-3009位核苷酸。

得自欧洲油菜和拟南芥属的基因组BNM3序列的特征在于包括8个内含子，这些内含子在SEQ ID NO：5的核苷酸1846-2298、2720-2952、3036-3160、3170-3314、3404-3553、3628-3797、3849-3961和4039-4148，以及SEQ ID NO：6的核苷酸2249-2578、2994-3220、3304-3420、3429-3521、3611-3770、3845-3969、4020-4151和4229-4310。SEQ ID NO：5和6的起始密码子分别位于核苷酸1620和2026，而终止密码子分别在位置4856和5035发现。

“BNM3调控区”是指显示调控BNM3基因的表达(正向调控，例如增强子或启动子区，或负向调控，例如沉默子区)并与BNM3基因可操纵连接的寡核苷酸序列。典型地，BNM3调控区包括BNM3基因起始位点上游的核苷酸，但是位于基因的其它区域内的序列也可显示调控性质并被认为是BNM3调控区，例如但不限于位于内含子中的序列。BNM3调控区的非限制性例子包括：

·与BNM3基因可操纵连接的显示调控功能的序列，例如但不限于位于BNM3基因起始位点上游或位于内含子中的调控区，或其片段、衍生物或突变体；

·SEQ ID NO：5的约核苷酸1-1619，或其片段或衍生物；

·SEQ ID NO：6的约核苷酸1-2025，或其片段或衍生物；

·在高严格条件下，例如但不限于在约65℃、5×SSC与凝胶印迹杂交，随后在0.1×SSC、65℃清洗条件，与SEQ ID NO：5的约1000-1619位或SEQ ID NO：6的约1500-2025位核苷酸序列或其片段或衍生物结合的核苷酸序列；

·在中等或高严格条件下，例如但不限于分别在约25℃、0.2×SSC、0.1％SDS或65℃、5×SSC与凝胶印迹杂交，随后在0.1×SSC、65℃清洗条件，与SEQ ID NO：5的约1-1000位或SEQ ID NO：6的约1-1500位核苷酸序列或其片段或衍生物结合的核苷酸序列；

·如用寡核苷酸序列对比(例如但不限于BLAST或FASTA搜索，使用缺省参数，见上述)确定的显示与SEQ ID NO：5的约1000-1619或SEQ ID NO：6的约1500-2025位核苷酸序列或其至少约22个核苷酸的片段有至少70％相似性的核苷酸序列。

“BNM3蛋白”是指一种使植物细胞胚胎发生、或增加植物细胞的再生能力或同时使细胞胚胎发生并增加植物细胞再生能力，并且由如上所述BNM3基因编码的蛋白质或其生物活性片段。优选地，BNM3蛋白包括SEQ ID NO：2的序列的约30-579位氨基酸，或SEQID NO：4的序列的约30-579位氨基酸，或SEQ ID NO：7的约30-581位氨基酸。但是，BNM3蛋白也可定义为是一种与不包括AP2重复1-接头-AP2重复2区(SEQ ID NO：2和3的氨基酸208-378，SEQID NO：7的氨基酸205-375)的SEQ ID NO：2，4或7有至少70％同源性的蛋白质。

序列数据库的搜索表明BNM3翻译产物含有两个拷贝的AP2结构域(图3；BNM3A见SEQ ID NO：2，BNM3B见SEQ ID NO：4，AtBBM见SEQ ID NO：7)。AP2结构域首先在APETALA2中鉴别，但是随后在许多种不同功能的蛋白质中被鉴别，APETALA2是调节分生组织同一性、花器官特异性、种皮发育和花同源异型基因表达的拟南芥属蛋白(Jofuku等，1994)。

AP2结构域通常长度为58-68个氨基酸并含有18个氨基酸的保守中心核心，其特征是能够形成两亲性α螺旋，该结构被认为介导蛋白质-蛋白质相互作用。许多含有AP2结构域的蛋白质结合DNA的能力与存在潜在核定位信号和可作为转录激活物的酸性区相伴，提示这些蛋白质作为转录因子起作用。

已鉴别了两类系统发育不同的AP2结构域蛋白，即具有单个AP2结构域的蛋白质(类似EREBP)，和具有两个AP2结构域的蛋白质(类似AP2，(Zhou，1997))。由本发明的基因编码的蛋白质代表后一类蛋白质的独特成员。

因此，本发明的一个方面提供了分离的DNA分子，其包括一编码含有两个AP2结构域的蛋白质的序列。当所述蛋白质以足够水平存在于植物细胞时，使植物细胞胚胎发生、或增加植物细胞的再生能力或同时使细胞胚胎发生并增加植物细胞再生能力。

用Northem(图6)分析在小孢子衍生胚发育、种子发育或非种子组织发育过程中的BNM3表达表明BNM3基因在胚胎发生小孢子培养物、小孢子衍生胚和种子中优先表达。BNM3转录物在所测试的任何非种子组织中未检测到。

BNM3 mRNA在诱导经历胚胎发生的小孢子培养物以及随后的小孢子衍生胚发育的球形期、心期、鱼雷期和子叶期中检测到(例如图6A)。RNA还在传粉后14天(14 DAP)的相应于胚发育心期的发育种子中检测到。在胚发育早期(21 DAP)和子叶中期(28 DAP)BNM3表达增加，随后保持恒定(图6B)。

BNM3的组成型表达导致在植物的营养结构如子叶、叶柄、叶缘和苗端分生组织上形成体细胞胚(图7)。在这些实验中，将BNM3eDNA置于两个不同的组成型启动子构建体控制下，一个是修饰的向日葵POLYUBIQUITIN启动子构建体，一个是含有AMV翻译增强子的双倍增强的35S启动子构建体，但是应理解的是任何合适的组成型启动子可用于此目的。这种BNM3衍生的异位胚含有在发育的合子胚中发现的所有器官系统和组织层，即这些胚是双极性的(图7E)，由轴、下胚轴和胚根区、条根分生组织和子叶组成。另外，每个器官系统含有在合子胚中发现的三个特异组织层(表皮、基本薄壁组织和维管束原组织)的特征性放射排列。BNM3基因在发育的异位胚中的持续表达导致胚形成过程的重复，从而在预先存在的胚的表面持续形成新胚(图7E)。

BNM3的组成型表达导致植物在存在添加的生长调节剂时体外再生枝的能力增加。来自异位表达BNM3的转基因植物的根外植体与得自野生型植物的根外植体相比在存在激素时枝再生增加至少5倍(图8A，B)。与野生型相比转基因外植体中枝也发育的更快。野生型叶和下胚轴外植体的起始应答是在叶柄切口末端产生愈伤组织(图8B)，随后沿叶柄长度形成愈伤组织。相反，来自转基因品系的外植体立即从叶柄的切口末端产生新枝(图8B)或根。起始产生根的外植体最终也产生枝。

组成型表达BNM3的转基因外植体也能在不存在添加的生长调节剂时再生。这些外植体当置于不含生长调节剂的培养基上时，从叶和下胚轴外植体的切口末端或从根外植体的瘤状结构再生枝(图8C，D)。在所有情况下，再生枝发育、生根、开花并结种。相反，置于不含生长调节剂的培养基上的野生型叶和下胚轴外植体偶尔在叶柄的切口末端产生愈伤组织或根，但是从这些结构不形成枝(图8C，D)。

本发明范围还包括BNM3的表达可被用于在转化的植物或植物细胞中起始发育级联。这一级联可以是表达BNM3的DNA载体在转化的植物中的稳定整合的结果，但是这种级联也可以是BNM3的瞬时表达的结果，并且不需要BNM3载体稳定整合入植物细胞。这些瞬时途径可用于诱导体细胞胚胎发生，配子体衍生胚胎发生或增加植物或植物细胞的再生能力。

BNM3基因异位表达的植物展示出如下的有利品质：

·形成无性衍生胚；

·组织外植体再生能力增加；

·组织外植体在不存在添加的植物生长调节剂时能再生；和

·种子成分在异位表达BNM3的非种子器官中表达。

另外，异位表达至少一种BNM3基因的植物可用于利用种子特异性调控元件生产重组蛋白。

为了如下所述利用BNM3，有利的是获得高水平BNM3转录物和/或BNM3蛋白以获得表型高度外显的植物。这可以通过用遗传元件如内含子、转录增强子或翻译增强子而获得，其已知增强基因或蛋白质表达水平。

本发明的BNM3序列可有各种用途，包括但不限于胚过程控制，再生过程控制，调控序列用于定向基因表达的用途，BNM3序列用作转化植物或胚胎发生细胞的选择标记的用途。这些用途在以下更详细地描述。BNM3序列控制胚胎发生过程的用途

如本文所述，BNM3基因在胚发育的起始和保持中起重要作用。BNM3基因以在植物界许多不同成员中发现。从这些基因获得的调控区可用于利用本领域已知方法控制BNM3或其衍生物或片段或者任何感兴趣基因的转录。

BNM3基因的异位表达足以诱导在植物营养组织上回反(recurrent)形成无性衍生胚(见实施例4)。根据所用启动子，BNM3基因的异位过表达可用于产生体细胞或配子体胚。体细胞或配子体胚可通过在组成型调控元件控制下表达BNM3基因而获得，如实施例5所示；或者还可通过在组织特异性或发育调控的元件、来自植物或非植物基因的诱导型元件控制下或通过瞬时表达而表达BNM3基因来获得。在这一方面，还可采用化学诱导系统(例如见Gatz andLenk，1998，引入本文作参考)，或使用不产生BNM3基因的稳定整合的方法的瞬时表达，或直接使用BNM3蛋白如DNA或蛋白质微粒轰击。

当回反胚胎发生不是一希望性状时，优选的是用诱导型、组织特异性或发育调控的元件进行的BNM3表达的时间和/或空间限制。用于将BNM3限制于一特殊发育阶段或细胞类型的调控元件根据应用而选择。例如，可用于表达BNM3而产生小孢子衍生胚的调控元件包括但不限于下述基因的调控元件，这些基因为I类低分子量热休克诱导型基因GMHSP17.3B(Zarsky等，1995，该文献引入本文作参考)，或小孢子/花粉表达的基因如NTM19(Custers等，1997，EP790,311，该文献引入本文作参考)，BCP1(Xu等，1995，该文献引入本文作参考)，LAT52(Twell等，1989，该文献引入本文作参考)，BNM1(Treacy等，1997，该文献引入本文作参考)和APG(Roberts等，1993，该文献引入本文作参考)。

可用于表达BNM3以产生体细胞胚的调控元件的例子包括但不限于由通常用于诱导组织培养物体细胞胚胎发生的植物生长调节剂激活的基因的调控元件。非限制性具体例子包括细胞激动素诱导的IB6和CKI1基因(Brandstatter and Kieber，1998；Kakimoto，1996，该文献引入本文作参考)和植物生长素诱导的元件DR5(Ulmasov等，1997，该文献引入本文作参考)。但是应理解的是其它调控元件可用于在植物中表达BNM3。

另外，适合指导BNM3的表达而获得不定胚生殖的基因调控元件的例子包括但不限于得自如下基因的调控元件，如胚珠和胚表达的SERK基因(Schmidt等，1997，该文献引入本文作参考)，胚珠表达的AGL11基因(Roundsley等，1995，该文献引入本文作参考)，珠心表达的NUC1基因(Doan等，1996；WO98/08961，该文献引入本文作参考)，或内珠被表达的基因FBP7(Angenent等，1995，该文献引入本文作参考)和SC4(US申请09/059,909，1998年4月13日申请，该申请引入本文作参考)基因。

根据本发明的一个方面，提供了一种在植物中有效产生小孢子衍生胚的方法，该方法包括：

i)用由在合适的调控元件控制下的BNM3基因及任选地用于选

择转化子的标记基因组成的载体构建体或分离的DNA转化

感兴趣的植物如欧洲油菜(用本领域公知的转化技术，例如

DeBlock等，1989，Clough and Bent 1998，Vergunst等，1998，

Klein等，1987，该文献引入本文作参考)，所示合适的调控

元件可以是组成型、组织特异性、发育调控的或诱导型的；

ii)选择转化的植物；

iii) 产生异位表达BNM3基因或BNM3蛋白的品系；

iv)从转基因品系中分离小孢子和花粉，并培养小孢子和花粉以

诱导胚胎发生。

胚胎发生可用任何合适的方案诱导，例如但不限于在28℃-35℃、优选32℃培养小孢子和花粉约4天，然后将胚胎发生细胞或胚转移至约25℃。使用上述方法，异位过表达BNM3的欧洲油菜栽培品种比从不异位表达BNM3的野生型植物制备小孢子或花粉时观察到的胚胎发生细胞或胚的百分率增加。

用于表达BNM3产生小孢子衍生胚的调控元件的例子包括但不限于下述基因的调控元件，所述基因如I类低分子量热休克诱导型基因GMHSP17.3B(Zarsky等，1995，该文献引入本文作参考)，或小孢子/花粉表达的基因如NTM19(Custers等，1997，EP790,311，该文献引入本文作参考)，BCP1(Xu等，1995，该文献引入本文作参考)，LAT52(Twell等，1989，该文献引入本文作参考)，BNM1(Treacy等，1997，该文献引入本文作参考)和APG(Roberts等，1993，该文献引入本文作参考)。诱导型调控元件也是有用的，例如但不限于四环素诱导型启动子(Gatz 1997，该文献引入本文作参考)，类固醇诱导型启动子(Aoyama and Chua 1997，该文献引入本文作参考)和乙醇诱导型启动子(Slater等1998，Caddick等1998，该文献引入本文作参考)。

以类似的方式，通过将BNM3蛋白引入植物(例如通过biolistics；Klein等1987)并选择显示增加的小孢子胚胎发生的植物，也可在植物中产生小孢子衍生胚。

本发明还提供了有效体外产生体细胞胚的方法，该方法涉及：

i)用含有在合适的调控元件控制下的BNM3基因的载体构建体

采用本领域已知的转化技术(例如但不限于DeBlock等，1989，

Clough and Bent 1998，Vergunst等，1998，该文献引入本文作

参考)转化植物如拟南芥属，或者可用本领域已知方法(例如

biolistics；Klein等1987)用含有在合适的调控元件控制下的

BNM3基因的载体构建体瞬时转化植物细胞，以及任选地，将

用于选择转化子的标记基因转化至几种拟南芥属中；

ii)选择转化的植物，和

iii) 在含有或不含合适生长调节剂例如但不限于2，4-D(例如

Mordhorst等，1998)的培养基中，体外培养来自所选择的转

化的植物的所需外植体，例如但不限于根、叶或幼苗，以产生

直接胚胎发生或胚胎发生愈伤组织；和

iv)将胚、或非胚胎发生愈伤组织或者胚和非胚胎发生愈伤组

织转移至合适培养基以产生胚、或小植物或胚和小植物。

例如，当将上述方法的结果与用许多拟南芥属生态型体外产生的体细胞胚比较时，从异位过表达BNM3的转基因品系中起始的定向胚胎发生或胚胎发生愈伤组织的频率比野生型对照中高。

可用于表达BNM3以产生体细胞胚的调控元件的例子包括但不限于由通常用于诱导组织培养物体细胞胚胎发生的植物生长调节剂激活的基因的调控元件。非限制性具体例子包括细胞激动素诱导的IB6和CKI1基因(Brandstatter and Kieber，1998；Kakimoto，1 996，该文献引入本文作参考)，和植物生长素诱导的元件DR5(Ulmasov等，1997，该文献引入本文作参考)。诱导型调控元件也是有用的，例如但不限于四环素诱导型启动子(Gatz 1997，该文献引入本文作参考)，类固醇诱导型启动子(Aoyama and Chua 1997，该文献引入本文作参考)，和乙醇诱导型启动子(Slater等1998，Caddick等1998，该文献引入本文作参考)。

胚发育的异位起始是无融合生殖的关键步骤之一。如实施例4所示，BNM3基因的异位表达足以在非胚形成组织中起始胚形成。因此BNM3基因可通过在发育胚珠的孢子体或配子体组织中表达而用于起始还原或非还原胚囊细胞的不定胚生殖或孤雌生殖。

通过在孢子体胚珠组织如珠心、内珠被或位于发育的胚囊相邻或邻近的其它组织中表达BNM3而实现不定胚生殖，该方法包括：

i)用本领域已知方法用一载体构建体转化所需植物(见如上方

法)，该载体构建体由在合适调控元件控制下的BNM3基因和

任选地用于选择转化子的标记基因组成，该调控元件可以是组

成型、诱导型或发育调控的；

ii)选择转化的植物；

iii)将转化的植物去雄；

iv)用携带一或多个显性选择标记例如GUS或卡那霉素抗性

的花粉对转化的植物传粉；和

v)分析克隆子代的产生。

当将上述方法的结果与用携带显性选择标记的花粉对野生型拟南芥属植物的传粉作用相比时，得自这一杂交的所有F1胚均遗传了显性标记，而衍生自异位过表达BNM3基因或蛋白的植物胚是通过有性胚形成而克隆衍生，并且未遗传显性选择标记。

适合指导BNM3的表达以获得胚囊成分的不定胚生殖、倍数孢子形成或单倍体孤雌生殖的基因调控元件的具体例子包括胚珠表达的SERK基因(Schmidt等，1997，该文献引入本文作参考)，减数分裂表达的AtDMC1基因(Klimyuk and Jones，1997；WO98/28431，该文献引入本文作参考)，胚珠表达的AGL11基因(Roundsley等，1995，该文献引入本文作参考)，珠心表达的NUC1基因(Doan等，1996；WO98/08961，该文献引入本文作参考)，和内珠被表达的基因FBP7(Angenent等，1995，该文献引入本文作参考)和SC4(美国申请09/059,909，1998年4月13日申请，引入本文作参考)基因。另外，诱导型系统也是有用的，例如但不限于四环素诱导型启动子(Gatz 1997，该文献引入本文作参考)，类固醇诱导型启动子(Aoyamaand Chua 1997，该文献引入本文作参考)，和乙醇诱导型启动子(Slater等1998，Caddick等1998，该文献引入本文作参考)。胚囊相比的孤雌生殖需要在雌性配子体或其前体的一或多个细胞中有活性的调控元件。当种子发育依赖于胚乳的存在时，减数分裂衍生的极性核是希望的。BNM3序列控制再生过程的应用

异位过表达BNM3基因的植物显示出在不存在生长调节剂时具有增加的再生能力和再生完整植物的能力(见实施例5)。BNM3基因表达因此可体内或体外用于增强或诱导植物组织再生能力。用于表达BNM3的调控元件部分取决于用于再生的靶组织。为获得植物组织的再生，可通过表达在组成型调控元件例如但不限于35S控制下的BNM3基因，或者可通过表达在组织特异性或发育调控的元件、来自植物或非植物基因的诱导型元件(例如Gatz and Lenk，1998，引入本文作参考)控制下的BNM3基因，或者通过不产生BNM3基因的稳定整合或直接利用BNM3蛋白的瞬时表达方法(例如DNA或蛋白质的微粒轰击)而实现。可以使用化学诱导系统(见GatzandLenk，1998)或应答用于诱导再生的植物生长调节剂如细胞激动素(Brandstatter and Kieber，1998；Kakimoto，1996)或植物生长素(Ulmasov等，1997)的基因或在组织外植体的伤口部位表达的基因(Xu等，1993)的调控元件。

另外的应用是BNM3基因用作回收转基因植物的选择标记。这种应用的一个非限制性例子为将幼苗例如拟南芥属生态型C24幼苗的根与含有以下两个双向构建体的单个根瘤农杆菌菌株共栽培(参照Vergunst等，1998；只是所有步骤均在不存在添加的生长调节剂的情况下进行)：

·第一个双向载体携带报道基因融合体，例如但不限于35S：GUS；

·第二个双向载体含有在合适调控元件控制下的BNM3基因。

BNM3基因表达在上述构建体整合进拟南芥属基因组中时被激活，基于在野生型外植体不能再生的条件(例如但不限于缺乏生长调节剂)下再生的能力而选择转基因植物。在许多情况中，携带BNM3基因的T-DNA和携带感兴趣基因的T-DNA将整合在不连锁的基因座中。因此，含有导入的BNM3序列的T-DNA及其相关的再生能力增加表型将通过简单的分离而进入后代植物(Daley等，1998)。但是，如本领域技术人员了解的，其它方法如不产生BNM3基因稳定整合或直接利用BNM3蛋白的瞬时表达方法也可采用。BNM3序列定向基因表达至胚中的应用

由于BNM3基因在发育胚中优先表达(见实施例3)，所以本发明的另一应用是利用BNM3调控区将至少一种异源感兴趣基因的表达定向为在发育胚中，以用于任何目的，例如但不限于改变胚和种子性状如种子存活性或大小，种子组分的组成，抗病性或产生高价值产品如疫苗抗体、生物药物或其它特殊化学品。BNM3表达用作胚胎发生细胞的标记的应用

如实施例3和4所示，BNM3基因表达在植物胚胎发生的最早期被检测到，并且其本身即足以激活转导级联，导致胚发育。因此BNM3基因表达是植物细胞进入胚胎发生途径对于特异标记。

BNM3表达与体外和体内胚形成细胞分裂相关，因此可用于确定体外改变组织的胚形成能力的培养条件。在不存在形态学上类似胚的结构时，具有胚胎发生能力的细胞或仅经历有限次数胚形成分裂的细胞很难被鉴别。但是，这些细胞可基于BNM3表达而被鉴别。在这种应用中，用含有与报道基因例如但不限于GUS(Jefferson等，1987)，Luciferase(Ow等，1987)或GFP(Haselhoffand Amos，1995)融合的BNM3调控区的载体转化感兴趣的植物，在体外条件培养在胚中具有高水平报道基因表达的纯合转基因品系，基于报道基因在培养的组织中的表达鉴别胚胎发生细胞和促进或增强胚胎发生细胞形成的培养条件。

相关的应用是BNM3基因作为无融合生殖物种的标记，以鉴别正在形成无性衍生胚的个体细胞。在这一应用中，使用衍生自BNM3基因序列的RNA探针经mRNA原位杂交，使用抗BNM3蛋白的抗体经免疫细胞化学，经用含有BNM3调控区和报道基因的融合基因的DNA构建体转化植物，或经本领域技术人员已知的任何类似技术鉴别进入自发胚途径的细胞。信号转导成分的鉴别

激活BNM3基因表达或被BNM3基因表达激活的信号转导成分可通过鉴别与BNM3基因及其蛋白产物相互作用的蛋白质和DNA序列而阐明。这些信号转导成分可用本领域技术人员已知技术鉴别，这些技术包括但不限于：

·诱变以鉴别BNM3增加功能(gain-of-function)表型的基因内和/或基因外抑制因子或增强子；

·酵母单杂交体筛选(yeast one hybrid screens)以分离与BNM3调控区结合影响BNM3基因表达的蛋白质；

·在酵母中遗传选择以鉴别是BNM3结合的直接靶的基因；

·DNA阵列或蛋白质组以鉴别在BNM3信号转导级联中激活的基因；和

·酵母双杂交体筛选(yeast two hybrid screens)以鉴别与BNM3相互作用影响下游靶基因的表达的蛋白质。

分析信号转导成分和信号传导成分的技术是熟知的(参见例如Meijer等(1998)，Lipshutz等(1999)，和Anderson and Anderson(1998))。

过表达在强组成型调控元件如，例如但不限于花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下的BNM3基因的植物显示异位胚形成，经器官发生的增加的再生或其组合(实施例4和5)。。BNM3异位过表达诱导胚形成和增加再生过程的能力可用于鉴别胚形成或再生能力改变的突变体。在这一应用中，制备由在足以启动异位胚形成或增加的再生表型的调控元件控制下的BNM3蛋白编码区组成的载体构建体，并导入感兴趣的植物中，鉴别具有高外显性的异位胚形成、增加的再生表型或其组合的纯合转基因品系。这些品系通过本领域技术人员熟知的任何技术诱变，这些技术可包括EMS诱变，快中子诱变，转座子诱变或T-DNA诱变。随后筛选诱变的植物的异位胚形成或再生表型的改变。这些改变包括例如但不限于在不存在添加的生长调节剂时促进异位无性胚形成或再生能力的消除或增强。异源蛋白质表达系统

导致在转基因植物非种子器官中胚胎发生和器官发生的信号转导途径的遗传控制可通过异位表达BNM3基因而激活。与异源启动子结合的BNM3基因的表达可用于产生改变的种子成分包括例如蛋白质、油和其它代谢物。所需器官的生物转化作用也可包括改变例如饲料作物叶的营养价值，或者其可用于产生作物的替代用途。应用被BNM3表达起始的信号转导级联诱导的启动子可在非种子器官中表达高价值重组蛋白。这种启动子的一个例子是napin启动子，其得自2S种子贮藏蛋白napin。从BNM3诱导的级联起始的蛋白质的产生可在显示比种子高的生物量的器官中实现。因此，这一技术可用于产生替代植物作为作物。

因此，本发明进一步涉及一种二元(binary)系统，其中BNM3蛋白与胚表达调控序列(靶序列)直接或间接结合，并激活嵌合基因构建体在任何植物细胞、组织或器官中的转录。因此，BNM3可用于直接或间接激活嵌合基因构建体的转录。这一途径涉及BNM3直接与来自胚表达基因的至少一种靶序列相互作用，或通过起始胚胎发生信号级联间接相互作用，该信号级联激活转录因子，使之与至少一种靶序列结合并激活其转录。这一二元系统可用于在体细胞中表达具有在种子中表达的性质的蛋白质。

在这一应用中，产生含有在组成型调控元件例如但不限于35S启动子控制下的BNM3基因(35S：BNM3)的转基因植物，以产生BNM3激活品系。BNM3表达可通过RNA凝胶印迹分析在BNM3激活品系各种组织中证实。鉴别了具有高水平BNM3表达的稳定纯合激活品系。可检查过表达BNM3的体细胞组织对其它胚表达基因，如arabin(Guerche等，1990)，cruciferin(Pang等，1988)或oleosin的表达，或检查正常情况下为种子的特征的形态学性质，如脂或蛋白质体的存在。

也产生了与用于产生上述BNM3激活品系相同物种的转基因植物，其含有与感兴趣基因融合的胚表达启动子，以产生感兴趣品系的基因。为有助于描述这一实施方案，感兴趣品系的基因表达报道基因如GUS，这种品系的非限制性例子包括欧洲油菜2S albumin种子贮藏蛋白基因BngNAP1：GUS融合体(Baszczynski等，1994)或SERK：GUS融合体(Schmidt等，1997；非种子表达的报道基因构建体如BNM1：GUS(Treacy等，1997)可用作阴性对照)。证实每一构建体对感兴趣基因在感兴趣品系的这些基因的特异器官和组织中的表达的可靠性。创建具有高水平感兴趣基因表达的稳定纯合品系。

含有BNM3激活品系的转基因品系和感兴趣基因品系杂交并收集后代种子。检查BNM3基因表达，和本例中的GUS活性，其它胚表达基因的表达以及转化的组织的形态学特征。在非种子组织中BNM3表达通常激活胚发育和感兴趣基因(例如GUS)的表达，但是在不存在形态学可辨别的胚时感兴趣基因的表达的激活也可观察到。在不存在形态学可辨别的胚时感兴趣基因的表达提供了BNM3与靶序列的直接相互作用的原始证据。

BNM3与靶序列的直接相互作用也可用BNM3在植物原生质体中的瞬时表达以及与感兴趣基因融合的胚表达启动子(即感兴趣基因构建体)的瞬时共表达而证实。通过电穿孔将35S：BNM3 DNA和感兴趣基因构建体导入衍生自非种子细胞如叶肉细胞的原生质体中，几个小时后检查感兴趣基因的表达以证实靶序列的激活。BNM3与靶序列的直接相互作用可进一步通过单独共导入靶序列作为竞争DNA而证实。

为了确定来自不同植物物种的组织是否可以由BNM3反式激活，可以将35S：BNM3 DNA和报道基因(例如但不限于GUS)构建体经微粒轰击导入植物体细胞组织。如果BNM3与靶序列直接相互作用，则报道基因的表达应与BNM3在所有物种和组织中的瞬时表达平行。

BNM3-靶序列相互作用的直接证据也可通过分离在细菌、昆虫或酵母中表达的BNM3蛋白而获得。用市售表达系统使BNM3在细菌、昆虫或酵母中表达，并分离纯化。用BNM3-靶序列如胚表达靶序列进行凝胶迁移率变动分析(Gustavson等，1991)，以证实BNM3与BNM3-靶序列直接结合。也可进行足迹分析以定位BNM3结合区。与BNM3结合的靶序列的片段随后可被亚克隆并用作上述瞬时分析中BNM3结合的竞争剂。

下述描述举例示出本发明的优选实施方案，其不是限制实施本发明所需的特征的组合。

本发明将在下述实施例中进一步描述，但是应理解的是这些实施例仅是举例目的，而不应用作以任何方式限制本发明范围。

实施例一般方法：小孢子胚培养

欧洲油菜栽培品种Topas用作所有植物材料的来源以进行小孢子胚培养。用于小孢子培养的供体植物在生长箱中于20℃/15℃(昼/夜)、16小时光周期(400μE/m/s)下生长，该光周期由VHO冷白光荧光灯(165W，Sylvania)和白炽灯(40W，Duro-test)提供。萌发后4周将植物移至相同光条件但温度设定为10℃/5℃(昼/夜)的生长箱中。如Keller等(1987)所述分离并培养小孢子和花粉，只是在培养21天后，将子叶期胚转移至由1/2×NLN盐、1％蔗糖、0.35M甘露糖醇和5μM ABA组成的成熟培养基。从与用于起始胚胎发生培养物相同的起始材料培养未诱导的培养物(小孢子和花粉持续配子体发育)和热应力非胚胎发生培养物(用于构建扣除探针)。通过在25℃培养小孢子和花粉4天获得未诱导样品。通过在25℃培养小孢子和花粉1天，随后在32℃培养3天获得热应力非胚胎发生样品。

离心收集培养10天以下的小孢子和花粉样品。含有球形期、心期、鱼雷期和子叶期小孢子衍生胚的较长时间样品通过各种孔径的尼龙筛过滤收集，如Ouellet等(1992)所述。所有其它植物组织从温室培养材料中收集。种子材料通过在开花1天后手工传粉并在不同传粉后天数(DAP)收集发育的种子而获得。核酸分离和分析

用氯化铯/异硫氰酸胍程序(Ouellet，1992)或TRIZOL试剂(Gibco-BRL)分离总RNA。基本上如Sambrook等(1989)所述通过含有0.62M甲醛的1.5％琼脂糖凝胶每泳道分离5-20微克总RNA，随后毛细管转移至Hybond-N尼龙膜(Amersham)上而进行RNA凝胶印迹分析。聚(A)+RNA通过寡(dT)-纤维素层析(Sambrook，1989)从总RNA中分离出。

如Fobert等(1991)从叶组织中分离基因组DNA并用标准程序(Sambrook，1989)经特定的限制酶消化。提供将10微克DNA在0.8％琼脂糖凝胶上电泳随后毛细管转移至Hybond-N膜上进行DNA凝胶印迹分析。

部分1.2kb BNM3A cDNA插入片段用作DNA和RNA凝胶印迹的探针。根据Hybond-N方案在65℃进行与凝胶印迹的杂交。最终清洗条件是0.1×SSC，65℃。扣除探针构建和cDNA文库筛选

从在32℃培养4天以诱导胚胎发生的晚期单核小孢子和早期双核花粉(胚胎发生样品)中分离聚(A)mRNA，并用于合成第一链cDNA(Riboclone cDNA试剂盒，Promega)。随后将该cDNA与5倍过量(重量)的来自已在25℃培养1天随后在32℃培养3天以失活胚胎发生的晚期单核小孢子和早期双核花粉(非胚胎发生样品；Pechan等，1991)的聚(A)⁺RNA杂交。扣除杂交基本上如Sambrook等(1989)所述进行。扣除后回收的单链cDNA用随机引物试剂盒(BRL)用[α-³²P]dCTP标记并用作扣除探针筛选构建自上述相同胚胎发生样品的λ噬菌体cDNA文库(Boutilier，1994)。用随机引物标记的第一链非胚胎发生探针和随机引物标记的napin种子贮藏蛋白cDNA探针(pN2；Crouch，1994)，经扣除探针筛选来自约1.5×10⁵个噬斑形成单位的文库的3份尼龙滤膜影印物(Hybond-N)。napinmRNA在胚胎发生小孢子文库中是主要形式(Boutilier，1994)，因此从后续筛选步骤中除去与napin探针杂交的噬斑。选择与扣除探针杂交但不与非胚胎发生或napin探针杂交的噬斑，并用扣除探针和非胚胎发生cDNA探针进行两轮后续差异筛选。分离来自选择的λ克隆的DNA(Sambrook，1989)，用EcoRI和XbaI部分消化，并亚克隆进pGEM-4Z(Promega)。

鉴别了包含六个独特基因的7个cDNA，其中一个包含一截短的BNM3A cDNA。通过严格筛选构建自10日龄欧洲油菜栽培品种Topas的球形期至心期小孢子衍生胚的mRNA的cDNA文库(UniZAPII cDNA合成试剂盒，Stratagene)的约2.5×10⁵个噬斑形成单位，随后获得两个不同的全长BNM3 cDNA克隆。通过体内切除将这些BNM3 cDNA插入序列拯救进入Bluescript SK(-)(Stratagene)。欧洲油菜基因组DNA序列的分离

用Universal Genome Walker试剂盒(Clonetech)分离位于BNM3ATG起始密码子上游的基因组DNA片段。构建未克隆的衔接子连接的欧洲油菜栽培品种Topas基因组DNA片段的集合体，并用于经巢式PCR分离BNM3基因组序列。初始PCR利用由厂商供应的外部衔接子引物(AP1)和具有如下序列的BNM3特异引物：5’-GAGGCAGCGGTCGGATCGTAACAGTACTCT-3’ (SEQ IDNO：8)

巢式PCR利用厂商供应的巢式衔接子引物(AP2)和具有如下序列的BNM3特异引物：5’-CATAAGGAGAGAGAGAAAAGCCTAACCAGT-3’(SEQ ID NO：9).

随后将初始PCR混合物稀释1∶50并用作巢式PCR的模板。初始和巢式PCR均依照厂商推荐进行。将巢式PCR产物克隆进pGEMT-Easy载体(Promega)并测序。鉴别了相应于BNM3A和BNM3B cDNA的5’非翻译基因组区的PCR产物。

用Pfu聚合酶(Stratagene)和下述引物组合经PCR从欧洲油菜栽培品种Topas基因组DNA中分离跨越BNM3A ATG翻译起始和TAG翻译终止密码子的基因组DNA序列，所述引物组合为：

5’-ACCAAGAACTCGTTAGATC-3’ (SEQ ID NO：10)；和

5’-AACGCATATAACTAAAGATC-3’ (SEQ ID NO：11)。

在标准PCR条件下使用引物。将PCR产物克隆进pGEMT-Easy载体并测序。DNA凝胶印迹分析和在拟南芥属中的定位

用20种不同限制性内切酶消化500ng拟南芥属基因组DNA(生态型Columbia和Landsberg erecta)，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离并用标准方法印迹在Hybond N+尼龙膜(Amersham)上。将印迹与相应于以下任一种的³²P[dATP]随机引物标记的探针(Megaprime，Amersham)杂交(1.5M NaCl，65℃)：

1)BNM3A cDNA(SEQ ID NO：1)的大约第1个405bp，或

2)BNM3A cDNA(SEQ ID NO：1)的大约最后1200个核苷酸，

然后在低严格(2×SSC，0.1％SDS，65℃)或中等严格(0.2

×SSC，0.1％SDS，25℃)条件下清洗。

用CfoI限制性内切酶在生态型Columbia和Landsberg erecta之间鉴别一限制片段长度多态性(RFLP)。将这一RFLP用于用Lister和Dean重组近交(RI)品系(Lister和Dean，1993)定位拟南芥属BNM3同系物在拟南芥属基因组上的位置。来自100个产生自生态型Columbia和Landsberg erecta之间的杂交的重组inbred品系的DNA用CfoI消化，转移至Hybond N+尼龙膜，与BNM3A cDNA杂交(如上)并在低严格条件下清洗。得到的RFLP数据送至Nottingham拟南芥属寄存中心的RI数据库，以确定图谱位置(Lander等，1987)。结果在实施例2-2中讨论。拟南芥基因组DNA序列的分离

用截短的BNM3A cDNA探针(SEQ ID NO：1的约最后1200个核苷酸)筛选3个基因组当量的扩增拟南芥属生态型C24基因组λ噬菌体文库(Lambda-GEM 11，Promega)。印迹与³²P-[dATP]随机引物标记的探针(上述)杂交并在低严格条件(2×SSC，0.1％SDS，65℃)下清洗。最初鉴别了7个λ噬菌体。随后在低严格条件下与衍生自欧洲油菜BNM3 cDNA的5’末端(SEQ ID NO：1的核苷酸1-405)的探针杂交后鉴别了3个含有BNM3基因(SEQ ID NO：6)的拟南芥属同系物的潜在的全长λ噬菌体克隆。从这3个噬菌体中的每一个鉴别包含约8.0kb重叠序列的各个克隆，亚克隆进pBR322并测序。用于植物转化的质粒的构建

以下描述了含有在POLYUBIQUITIN或花椰菜花叶病毒35S启动子的控制下的BNM3 cDNA的质粒载体的构建。质粒pRAP2TUBI含有在质粒pRAP2T中的修饰的Helianthus annus POLYUBIQUITIN启动子(Binet等，1991)。质粒pRAP2T由pUCAP质粒(van Engelen等，1995)和插入Sac I和EcoRI限制位点中的胭脂氨酸合酶(nos)终止子。包含POLYUBIQUITIN UbB1的启动子的5’末端至第一个外显子的3’末端的该启动子PCR片段用M13反向引物和包括导入的NcoI和BamHI限制位点的UBIQ-3’引物5’-CCATGGATCCAGAGACGAAGCGAAAC-3’(SEQ ID NO：12)从该载体扩增。用PstI和BamHI消化该POLYUBIQUITIN启动子片段，凝胶纯化并连接进pRAP2T的PstI和BamHI位点，产生载体pRAP2TUBIHa。全长BANM3B cDNA用EcoRI和XhoI限制酶消化，用Klenow酶平端化，凝胶纯化并连接进pRAP2TUBI的SmaI位点，制备质粒pKB1S。含有修饰的POLYUBIQUITIN启动子、BNM3BcDNA和nos终止子的AscI/PacI DNA限制片段凝胶纯化，连接进AscI/PacI消化的二元载体pBINPLUS(van Engelen等，1995)，产生质粒pKBBIN1S。

含有在双倍增强35S启动子和AMV翻译增强子控制下的BNM3A cDNA的载体的构建如下所述。含有来自质粒pBI525(Datla等，1993)的双35S启动子和AMV翻译增强子的Hind III/XbaI DNA限制片段连接进Hind III/XbaI消化的pRAP2T，产生质粒pRAP2T35S。通过定点诱变将一NcoI位点导入BNM3A cDNA克隆中。用于诱变的BNM3ANCO1引物的序列为：

5’-ACTCCATGGATAATAACTGGTTAGGC-3’(SEQ IDNO：13).第2个引物BNM3AHINDIII：

5’-AAATTCTCAAGCTTTGGTCCATCTTG-3’(SEQ ID NO：14)与BNM3ANCO1引物一起应用以扩增BNM3A cDNA的305bp片段。用NcoI和HindIII消化这一PCR片段，并与NcoI/KpnI切割的pRAP2T35S和含有HindIII位点下游的BNM3A cDNA区域的HindIII/KpnI片段连接，产生载体p35S：BNM3。用AscI和PacI限制酶消化p35S：BNM3，凝胶纯化含有双35S启动子、AMV翻译增强子、BNM3A cDNA和nos终止子的片段，并与AscI/PacI消化的二元载体pBINPLUS连接，产生质粒p35S：BNM3BIN。

将pKBBIN1S和p35S：BNM3BIN质粒转移进携带无毒Ti质粒pMP90的根瘤农杆菌C58Cl菌株，并用于转化实验。植物转化

拟南芥生态型C24用作转化实验中的受体。用Clough和Bent(1998)描述的花沾方法或Vergunst等(1998)描述的根转化方法转化植物。

通过小孢子衍生胚的根瘤农杆菌介导的转化产生转基因欧洲油菜栽培品种“Topas”。以约每毫升1000个胚的密度培养小孢子衍生胚5周。在含有9％蔗糖的B5培养基中将农杆菌的过夜培养物稀释100倍。在黑暗下缓慢振荡将胚与稀释的细菌于24℃共培养48小时，然后将胚转移至补加350mg/L cefotaxim和200mg/L万古霉素的NLN13培养基，在25℃于黑暗下培养至少2周。

在弱光下于25℃在补加2％蔗糖、cefotaxim(200mg/L)和万古霉素(100mg/L)的固体B5上萌发胚约2周。分离来自萌发的胚的发育好的下胚轴，并转移至补加100mg/L卡那霉素的新鲜萌发培养基。在此培养基上2周后，在补加卡那霉素(25mg/L)的相似培养基上传代培养外植体。选择1个月后可见绿色的推定为转基因的次生胚。显微镜术

在含有4％仲甲醛的0.1M磷酸缓冲液pH7.0中于4℃固定所有植物材料过夜。在0.1M磷酸缓冲液中清洗样品，然后在直至100％乙醇的梯度乙醇系列中脱水。用于扫描电子显微镜术的样品在液体CO2(Balzers CPD020)中进行临界点干燥，并用导电碳胶固定在SEMstub上。用Polaron E5100溅射涂布机将样品用30nm钯/金。用加速电压为15kV的JEOL JSM 5200扫描电子显微镜观察样品，用OrionFramegrabber获得数字图像。光学显微镜术的样品包埋在Technovit7100(Kulzer)中。切片在于1％四硼酸钠中的1％甲苯胺蓝中染色10秒钟，用水洗，并在Euparal中制成标本。用索尼3 CDD相机记录数字图像。再生实验

将野生型和转基因拟南芥属种子进行表面消毒，置于含有20％蔗糖的1/2MS培养基(1/2MS-20)平板上，并使平板倾斜60℃角于21℃生长。萌发10天后收获八个野生型幼苗和来自7个不同转基因品系中每一个的八个幼苗，并分离成根、下胚轴和叶外植体。这一材料然后分成两批。一半的外植体继续在含有20％葡萄糖的B5培养基(B5-20)上培养，每2周将外植体转移至新鲜B5-20培养基。其余外植体在含有诱导根再生的植物生长调节剂(Vergunst等，1998)的B5-20上培养。首先将这些外植体置于愈伤组织诱导培养基(CIM；高植物生长素/细胞激动素比例)上2天，随后转移至枝诱导培养基(SIM；高细胞激动素/植物生长素比例)进行其余培养期间的培养。每2周将外植体转移至新鲜SIM培养基。实施例1：从欧洲油菜分离和鉴定BNM3基因

用扣除筛选途径分离在欧洲油菜栽培品种Topas小孢子胚胎发生诱导期间优先表达的基因(图1)。在扣除探针构建期间使用两种类型的小孢子培养物：胚胎发生的和非胚胎发生的。通过将晚期单核小孢子和早期双核花粉进行4天32℃热应力处理获得胚胎发生培养物。通过在25℃培养相同晚期单核小孢子和早期双核花粉起始群1天，随后在32℃培养3天获得非胚胎发生样品(Pechan等，1991)。聚(A)mRNA分离自胚胎发生样品并用于合成第一链cDNA，然后将该cDNA与过量的分离自非胚胎发生小孢子/花粉样品的聚(A)⁺RNA杂交。回收富集在胚胎发生样品中存在但在非胚胎发生样品中不存在或仅以低得多的水平存在的序列的非杂交单链cDNA，放射性标记，并用作扣除探针筛选衍生自上述胚胎发生样品的cDNA文库。选择与扣除探针杂交但不与衍生自非胚胎发生样品的探针杂交的噬斑，并进行随后两轮差异筛选。发现了包含在胚胎发生样品和非胚胎发生样品中差异表达的6个独特DNA序列的7个不同cDNA克隆。其中之一42A1，后来重新命名为BNM3A(代表Brassica napus microspore embryo，欧洲油菜小孢子胚)的克隆被进一步鉴定。实施例2-1：BNM3基因编码AP2结构域类别的转录激活物的新成员

用富集在胚胎发生小孢子和花粉中表达的基因的扣除探针筛选胚胎发生小孢子cDNA文库后分离到一个BNM3 cDNA克隆BNM3A。该cDNA克隆的大小(1.2kb)与在RNA凝胶印迹上检测的转录物的大小(2.2kb)的不同表明这一克隆不是全长cDNA。从10日龄欧洲油菜小孢子胚cDNA文库中分离了两个更长的cDNA克隆，一个相应于最初分离的克隆的全长cDNA，BNM3A(SEQ ID NO：1)，和一个新克隆BNM3B(SEQ ID NO：3)。这些DNA序列的对比示于图2。这两个BNM3 cDNA克隆长度分别为2011和1992个核苷酸，在核苷酸水平相似性为97％，仅在长度和其5′和3′非翻译区稍有不同。两个cDNA均潜在编码579个氨基酸的多肽(预计分子量为63.9kDa，pI为5.7)，其在氨基酸水平相似性为97％(图3)。

BNM3基因的基因组复杂性由BNM3 cDNA与含有欧洲油菜基因组DNA的凝胶印迹的杂交确定(图4)。BNM3 cDNA在严格条件下与两个DNA片段杂交，这两个杂交片段代表两个BNM3基因，BNM3A和BNM3B。欧洲油菜是衍生自二倍体B.rapa和B.oleracea基因组的杂交的双倍体物种，因此这两个BNM3序列可能衍生自每一亲本二倍体祖先的一个单拷贝基因座。

序列数据库检索发现BNM3翻译产物含有两个拷贝的AP2结构域(图3)。AP2结构域首先在调节分生组织同一性、花器官特化、种皮发育和花同源异型基因表达的拟南芥属蛋白APETALA2(AP2)中鉴别(Jofuku等，1994；WO98/07842)，从那时起已在具有不同功能的多种蛋白质中鉴别。

这些功能从激活参与应力(Zhou，1997；Stockinger，1997)和乙醇应答(Ohme-Takagi，1995)的基因至叶、花和胚珠发育的调控(Moose，1996；Jofuku，1994；Elliot，1996；Klucher，1996)。AP2结构域是一56-68个氨基酸重复基序，含有至少两个保守区：含保守YRG氨基酸基序的高度碱性YRG元件，和RAYD元件。RAYD元件含有18个氨基酸的保守中央核心，其预计形成两亲性α-螺旋，该结构被认为介导蛋白质-蛋白质相互作用。一些含有AP2结构域的蛋白质的结合DNA的能力与推定的核定位信号和可作为转录激活物的酸性区的存在偶联，提示这些蛋白质起转录因子的功能。

已鉴别了两个系统发育不同类别的AP2结构域蛋白，其由一个AP2结构域(类EREBP)或由一接头区连接的两个AP2结构域(类AP2)组成(Zhou，1997)。BNM3属于后一类。检索具有相应于BNM3的两个AP2结构域和接头区的区域的数据库揭示BNM3最接近于拟南芥属AINTEGUMENTA(ANT；Elliot，1996；Klucher，1996)和Zeamays ZMMHCFl含AP2蛋白质(ZM；Daniell，1996)。图5示出BNM3的两个AP2结构域与含有两个AP2结构域的其它蛋白质的AP2结构域的序列对比。在这一区域BNM3与ANT有85％的氨基酸序列相似性，与ZMMHCFl有88％相似性，但与AP2和GLOSSY15在这一区域仅有66％氨基酸相似性。在BNM3蛋白的第一个AP2结构域内的10个氨基酸插入使得这三个蛋白与其它含AP2结构域的蛋白质进一步区分开(Elliot，1996)。BNM3，AINTEGUMENTA和ZMMHCF1蛋白在其氨基末端区还共享一小的疏水性氨基酸基序，LG/SFSLS，但在其AP2结构域和接头之外的DNA或氨基酸序列没有显示显著相似性。这些结果表明BNM3序列编码独特的AP2结构域蛋白质家族的成员。

BNM3B cDNA和氨基酸序列与ANT或ZMMHCF-1序列的配对对比显示对于BNM3B核苷酸序列：

-其与ANT cDNA有56％相同性(在ANT的1905个核苷酸基础上)，与ZMMHCF1 cDNA有58％相同性(在ZM的1773个核苷酸序列基础上)；

对于BNM3B氨基酸序列：

BNM3B蛋白与ANT蛋白有41％相同性(在ANT的555个氨基酸序列基础上)，与ZMMHCF1蛋白有46％相同性(在ZM的485个氨基酸序列基础上)。实施例2-2：欧洲油菜BNM3基因由单个拟南芥直向同源物

在低和中等严格条件下与一些欧洲油菜BNM3A cDNA(SEQ IDNO：1)探针杂交的拟南芥属基因组DNA的DNA凝胶印迹分析显示在拟南芥属基因组中有一个欧洲油菜BNM3基因的同系物。用CfoI限制性内切酶在生态型Columbia和Landsberg erecta之间也鉴别了一RFLP。这一RFLP用于将该单个BNM3同系物定位在拟南芥属基因组的染色体5上的约34cM处(Lister and Dean，1993)。

筛选拟南芥属基因组文库的3个基因组等价物鉴别了含有推定的全长拟南芥属BNM3同系物(AtBBM)的3个λ克隆。对这三个AtBBM克隆进行的序列分析表明它们是相同的(SEQ ID NO：6)。图9A和9B分别示出分离的拟南芥属基因组克隆的限制片段模式和在拟南芥属基因组DNA与Brassica BNM3A cDNA杂交后获得的限制片段模式。两个图的对比表明拟南芥属AtBBM基因组克隆和用异源探针经DNA凝胶印迹分析鉴别的同系物是相同的。AtBBM基因组克隆的序列分析也将IRREGULAR XYLEM3(IXR3)基因的5’末端定位于推定的AtBBM编码区的下游(位置7479，图9A)。先前已示出IXR3定位于染色体5的标记nga106(33.26cM)和mi438(33.34cM；Taylor等，1999)之间的150kb区域。总结这些数据表明Brassica BNM3基因的拟南芥属直向同源物由定位于染色体5的单基因编码。一种与AtBBM非常相似的序列TAMU BAC克隆：T10B6(登录号AP002073；Nakamura，2000年5月18日)也位于染色体5。

Brassica BNM3A基因组克隆(SEQ ID NO：5)和拟南芥属AtBBM基因组克隆(SEQ ID NO：6)的结构对比表明在这两个序列之间预计的内含子/外显子交界是高度保守的。两个序列均预计含有9个外显子和8个内含子序列。

AtBBM基因(SEQ ID NO：6)的DNA序列与两个Brassica cDNA序列(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)的比较示出这三个序列在整个推定的蛋白编码区内有85％的相似性，在跨越两个AP2结构域和这两个AP2结构域之间的接头区的546个核苷酸内有95％相似性。在跨越两个AP2结构域和这两个AP2结构域之间的接头区的区域内，与其它相关AP2结构域编码基因如ANT以及位于染色体3上的克隆MOE17的序列(登录号AB025629)的核苷酸相似性分别为76％和78％。ANT和染色体3上的序列均不显示与AP2结构域编码区之外的AtBBM有显著的DNA相似性。

AtBBM的预测氨基酸编码序列和两个Brassica cDNA序列(SEQID NO：1和SEQ ID NO：3)之间的相似性在完整蛋白编码序列内约为80％，在跨越两个AP2结构域和这两个AP2结构域之间的接头区的182个氨基酸区域内约为99％。在跨越两个AP2结构域和这两个AP2结构域之间的接头区的氨基酸区域中，与ANT和位于染色体3上的克隆MOE17上的AP2结构域序列的氨基酸相似性约为85％。这两个蛋白质序列与该蛋白的AP2结构域之外的AtBBM无显著相似性。实施例3：BNM3基因在发育胚中优先表达

用RNA凝胶印迹分析(图6)确定小孢子衍生胚发育、种子发育过程中和非种子组织中的BNM3基因表达模式。分析显示BNM3基因在发育胚中优先表达。

RNA凝胶印迹分析显示在诱导经历胚胎发生的小孢子培养物中以及在随后的小孢子衍生胚发育的球形期、心期、鱼雷期和子叶期检测到BNM3 mRNA(图6A)。在非胚胎发生的小孢子培养物中，在新鲜分离的小孢子和花粉中或在培养继续配子体发育的小孢子和花粉中未检测到BNM3 mRNA(图6A)。发育种子的RNA凝胶印迹分析显示BNM3表达首先在相应于胚发育心期的传粉后14天(14DAP)检测到。在胚发育早期(21DAP)和子叶中期(28DAP)期间BNM3表达增加，之后保持恒定(图6B)。在所测试的任何非种子组织中未检测到BNM3转录物，反映出在这些组织中的转录物水平非常低或不存在。实施例4：在营养组织中表达BNM3促进无性胚形成

为确定欧洲油菜BNM3蛋白的功能，将BNM3 cDNA置于两个不同组成型启动子构建体的控制下并导入拟南芥属，这两个构建体为修饰的向日葵POLYUBIQUITIN启动子构建体(以下称为UBI：BNM3)和含有AMV翻译增强子的双倍增强的35S启动子构建体(以下称为35S：BNM3)。转化子表型分析表明BNM3 cDNA的异位过表达促进体细胞胚在营养结构如子叶、叶柄、叶缘和苗端分生组织上的形成(图7)。当BNM3基因在更强的双倍增强的35S启动子-AMV翻译增强子控制下表达时，与使用POLYUBIQUITIN启动子相比，产生异位胚的转化子的频率以及异位胚表型外显率均增加。因此，需要高阈值水平的蛋白产物以增加异位胚表型的频率和外显率。

BNM3衍生的异位胚含有在发育的合子胚中发现的所有器官系统和组织层。BNM3衍生的异位胚是双极性的(图7D和7E)，并由轴组成，该轴包含下胚轴和胚根区，条根分生组织和子叶(图7E)。另外，每个器官系统含有在合子胚中发现的三层特化组织层(表皮、基本薄壁组织和维管束原组织)的特征性放射排列(图7E)。BNM3基因在发育的异位胚中的持续表达导致胚形成过程的重复，结果是新胚持续在预先存在的胚的表面形成(图7D和7E)。这些结果提供了结论性证据，即单基因BNM3的表达足以起始信号转导级联，导致完全分化的无性衍生胚的形成。实施例5：BNM3表达增加植物组织的再生能力

我们检查了BNM3基因表达对拟南芥属植物在存在或不存在添加的生长调节剂时体外再生枝的能力的作用。将来自10日龄野生型拟南芥属和在POLYUBIQUITIN启动子控制下表达BNM3的转基因拟南芥属品系的幼苗的叶、根和下胚轴外植体置于含有生长调节剂的培养基上以首先诱导愈伤组织形成，随后枝器官发生。来自转基因品系的根外植体显示在存在激素情况下枝再生比野生型根外植体增加至少5倍(图8A)。这些枝在转基因外植体中也比在野生型中发育快。野生型叶和下胚轴外植体通过在叶柄切口端产生愈伤组织而发生应答(图8B)。相反，来自转基因品系的外植体叶柄切口端立即产生新枝(图8B)或者产生根。最初产生根的转基因外植体最终也产生枝。

转基因外植体也能在不存在添加的生长调节剂时再生。置于不含生长调节剂的培养基上的野生型叶和下胚轴外植体在叶柄切口端偶尔产生愈伤组织或根，但是从这些结构不再生枝(图8C，D)。野生型根成熟并在与侧根交界处形成增厚的根瘤状结构，但不再进一步发育。相反，置于不含生长调节剂的培养基上的转基因外植体从叶和下胚轴外植体的切口端再生枝或者从根外植体的根瘤状结构再生枝(图8C，D)。

所有引述文献引入本文作参考。

本发明已参照优选实施方案描述，但是本领域技术人员显而易见的是在本文所述本发明范围内可做出各种变化和修改。

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序列表<110>植物研究国际公司

由加拿大农业及农产品部代表的对加拿大行使权力的女王陛下<120>BNM3转录激活物控制植物胚胎发生和再生过程的用途<130>08-887547W0<140><141><150>EP 99201745.9-2106<151>1999-06-02<160>14<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2014<212>DNA<213>Brassica napus<400>1gttcatctct cttctttaag accaaaacct ttttctcctc ctcttcatgc atgaacccta 60actaagttct tcttctttta ccttttacca agaactcgtt agatcactct ctgaactcaa 120tgaataataa ctggttaggc ttttctctct ctccttatga acaaaatcac catcgtaagg 180acgtctactc ttccaccacc acaaccgtcg tagatgtcgc cggagagtac tgttacgatc 240cgaccgctgc ctccgatgag tcttcagcca tccaaacatc gtttccttct ccctttggtg 300tcgtcgtcga tgctttcacc agagacaaca atagtcactc ccgagattgg gacatcaatg 360gttgtgcatg caataacatc cacaacgatg agcaagatgg accaaagctt gagaatttcc 420ttggccgcac caccacgatt tacaacacca acgaaaacgt tggagatgga agtggaagtg 480gctgttatgg aggaggagac ggtggtggtg gctcactagg actttcgatg ataaagacat 540ggctgagaaa tcaacccgtg gataatgttg ataatcaaga aaatggcaat gctgcaaaag 600gcctgtccct ctcaatgaac tcatctactt cttgtgataa caacaacgac agcaataaca 660acgttgttgc ccaagggaag actattgatg atagcgttga agctacaccg aagaaaacta 720ttgagagttt tggacagagg acgtctatat accgcggtgt tacaaggcat cggtggacag 780gaagatatga ggcacattta tgggataata gttgtaaaag agaaggccaa acgcgcaaag 840gaagacaagt ttatttggga ggttatgaca aagaagaaaa agcagctagg gcttatgatt 900tagccgcact caagtattgg ggaaccacca ctactactaa cttccccatg agcgaatatg 960aaaaagaggt agaagagatg aagcacatga caaggcaaga gtatgttgcc tcactgcgca 1020ggaaaagtag tggtttctct cgtggtgcat cgatttatcg tggagtaaca agacatcacc 1080aacatggaag atggcaagct aggataggaa gagtcgccgg taacaaagac ctctacttgg 1140gaacttttgg cacacaagaa gaagctgcag aggcatacga cattgcggcc atcaaattca 1200gaggattaac cgcagtgact aacttcgaca tgaacagata caacgttaaa gcaatcctcg 1260aaagccctag tcttcctatt ggtagcgccg caaaacgtct caaggaggct aaccgtccgg 1320ttccaagtat gatgatgatc agtaataacg tttcagagag tgagaatagt gctagcggtt 1380ggcaaaacgc tgcggttcag catcatcagg gagtagattt gagcttattg caccaacatc 1440aagagaggta caatggttat tattacaatg gaggaaactt gtcttcggag agtgctaggg 1500cttgtttcaa acaagaggat gatcaacacc atttcttgag caacacgcag agcctcatga 1560ctaatatcga tcatcaaagt tctgtttcgg atgattcggt tactgtttgt ggaaatgttg 1620ttggttatgg tggttatcaa ggatttgcag ccccggttaa ctgcgatgcc tacgctgcta 1680gtgagtttga ttataacgca agaaaccatt attactttgc tcagcagcag cagacccagc 1740agtcgccagg tggagatttt cccgcggcaa tgacgaataa tgttggctct aatatgtatt 1800accatgggga aggtggtgga gaagttgctc caacatttac agtttggaac gacaattaga 1860aaaaatagtt aaagatcttt agttatatgc gttgttgtgt gctggtgaac agtgtgatac 1920tttgattatg tttttttctt tctctttttc tttttcttgg ttaatttctt aagacttatt 1980tttagtttcc attagttgga taaattttca gact 2014<210>2<211>579<212>PRT<213>Brassica napus<400>2Met Asn Asn Asn Trp Leu Gly Phe Ser Leu Ser Pro Tyr Glu Gln Asn1 5 10 15His His Arg Lys Asp Val Tyr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Val Val Asp

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3060gatcatattt tcatacacga tttactttca aactaatata ggtttttcga tcattgttca 3120tgtttttatc aaaatttgca cctggtggtt gtcttctcag tttatttggg taagtaattt 3180attataaatt ggacgaagct gtgatgggta aatctaaatt atataatcaa atttgtttat 3240tttttgtgta tacattcatt atataatcaa aatagcgata cgatctacat tcaattgttg 3300tctatatcat gcaggaggtt atgacaaaga agaaaaagca gctagggctt atgatttagc 3360cgcactcaag tattggggaa ccaccactac tactaacttc cccgtaagtc aatcaatgtt 3420gtacaagatt tcataactta gaaccaattt tattcttttt ttataagatg ctattatctt 3480attattaatt gccatgttta tatcgttaca tttattacaa taaaaagtac ttttggtttg 3540atataatatg tagatgagcg aatatgaaaa agaggtagaa gagatgaagc acatgacaag 3600gcaagagtat gttgcctcac tgcgcaggta tataatggaa cttctgatat tattgcatat 3660ggcatctatt attatacatg tatattagta ttttatatat agaacccatc acgctcacgt 3720ttatatttaa aaatatgtcc gtattcacgt cagattatca gcatacacct atatataata 3780gacattaaaa tatgcaggaa aagtagtggt ttctctcgtg gtgcatcgat ttatcgtgga 3840gtaacaaggt attcatacag agagaacgaa tcctattttg ttacgtacat atatatataa 3900aaatataatt ataagatatc acattttata ttatgaatat ttcttctaat gggtccaaaa 3960gacatcacca acatggaaga tggcaagcta ggataggaag agtcgccggt aacaaagacc 4020tctacttggg aacttttggt acgtttagtc ttctcttact aaacttcaca atcaaatcta 4080taacaaaaga tatcaactaa aaactacaac atatatctaa gtaagctgta catatattat 4140atatgaaggc acacaagaag aagctgcaga ggcatacgac attgcggcca tcaaattcag 4200aggattaacc gcagtgacta acttcgacat gaacagatac aacgttaaag caatcctcga 4260aagccctagt cttcctattg gtagcgccgc aaaacgtctc aaggaggcta accgtccggt 4320tccaagtatg atgatgatca gtaataacgt ttcagagagt gagaatagtg ctagcggttg 4380gcaaaacgct gcggttcagc atcatcaggg agtagatttg agcttattgc accaacatca 4440agagaggtac aatggttatt attacaatgg aggaaacttg tcttcggaga gtgctagggc 4500ttgtttcaaa caagaggatg atcaacacca tttcttgagc aacacgcaga gcctcatgac 4560taatatcgat catcaaagtt ctgtttcgga tgattcggtt actgtttgtg gaaatgttgt 4620tggttatggt ggttatcaag gatttgcagc cccggttaac tgcgatgcct acgctgctag 4680tgagtttgat tataacgcaa gaaaccatta ttactttgct cagcagcagc agacccagca 4740gtcgccaggt ggagattttc ccgcggcaat gacgaataat gttggctcta atatgtatta 4800ccatggggaa ggtggtggag aagttgctcc aacatttaca gtttggaacg acaattagaa 4860aaaatagtta aag 4873<210>6<211>5151<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<220><221>内含子<222>(2249)..(2578)<220><221>内含子<222>(2994)..(3220)<220><221>内含子<222>(3304)..(3420)<220><221>内含子<222>(3429)..(3521)<220><221>内含子<222>(3611)..(3770)<220><221>内含子<222>(3845)..(3969)<220><221>内含子<222>(4020)..(4151)<220><221>内含子<222>(4229)..(4310)<220><221>misc_特征<222>(2026)..(2028)<223>起始密码子<220><221>misc_特征<222>(5033)..(5035)<223>终止密码子<400>6tctcaaactc atccatctga ttttaataac agttttttct tctttttctt ttgttgtttt 60ttaccacttt tctttctttt tctcattttc tacttacttc cagatttttc attttcctat 120ttttggtcac acgctcttgt cagttgtaga tatcttcatc tacaggtgtt tccttttatt 180ttcagatgga atctcaatct acaggtgttt ctcacttcaa taaattacgg cccccaaaaa 240atttagtttt tgtatttaca agaaacatag cataatatga tacatatggt tttgaagtac 300tgttttttac acaaaacttt gattataaaa cctcagccgt tctttcgtat ttagaattta 360aacgcatgca atgaagtcat tcgtgaatga tatataaata gtttgtttat ttgttatata 420tcgtcccgcc ccggatcaaa acctaaagta agtgaataaa attttctttt gtagagataa 480gaaaatttgt accgcgtatc gaaaatgtaa aacctatttt aatttctaga tctactaatt 540gggtttgagg tattgaaata attgggtacc aaaggtttgg ggtactatat ataaaaagca 600gataagaaca aattgttagg aaaaaataat atgattttgt aggtaccgag gcaattctag 660aacgtgtgtt ggtggtgtgt tagatattgc aggcataata atggaagaag tgaaattata 720ttacaattaa ataggaagac gagaatccat tgaatcatat cttaccagtc caaacttttt 780ttaagtatat aaatctttga aagagtataa acccatgcac atgcccactt tcgtctcatt 840gatccatgtg tataccctat agtttcctcc ctaattactc taattcccct aaatcatttt 900ttaatttgat acaattagtc ggataagctc aaactacttt actattggtg cttagcatgt 960acagtacata tctagcatcc gaaccctact agccatccac atcttatgta cataattatg 1020actgttttaa gtactttttt actttcgttt acaatgtttg tttgaaaatt tgaggcgttt 1080tttactggtt gaactgtagc cactaagaca ctaagacttc aaaattcaaa taggaaaatc 1140tatactttta caatatcttt gcatgtcaaa ttatttttaa cgtggttata cattttgcct 1200aagatttaga gtacattcat aataacaaca ataaaatatt tctatatata gtaggtttag 1260tgaagttact atatgagata gttcatcgca ttgatcacgt ctgatgcgaa tcacatatcc 1320tatatctagt tgaacatatg tttcgtggaa gacaggaacc atctcttaga cccgcacttc 1380aaaatatcac aaaacacgaa accatgaatc ttttgagttt gttaaaaaat actaaaagtg 1440acgagttcgc gtttggaaaa aatgccaaac taaatcgctg gctcgtgtca tacgttcaca 1500catacacatg tctctaagag acacagcatc attggtctta aatcgacaac gagtgagttt 1560ttggactttt acctattggt cctcgacatg tttacccatt tttgtcattt acatttaaca 1620ttttatacgc atgaagagag agagacagaa agcagagatt tgaaatggtt tttgactgat 1680taattaaagt gtcatcaaaa caaattggga ttacgagatt atccagttga aacgacatta 1740ctacccctac ccttcaaacc gaccaataca tctccacatt tttcaagtaa atattttttc 1800tttctgaatt taattgcaaa attctctaaa tgcgcataat atgtcgcctc ggaagaaatg 1860aacattatat ttttgacttt tcttcttctt cttcctcttc tctcttcatt taacaccaaa 1920acctttttct ttctcctctt catgcatgaa ccctaactaa gttctttttc ctattcttct 1980tctctcatct atcacaagga gtagttagaa tattatatga actcgatgaa taactggtta 2040ggcttctctc tctctcctca tgatcaaaat catcaccgta cggatgttga ctcctccacc 2100accagaaccg ccgtagatgt tgccggaggg tactgttttg atctggccgc tccctccgat 2160gaatcttctg ccgttcaaac atcttttctt tctcctttcg gtgtcaccct cgaagctttc 2220accagagaca ataatagtca ctcccgaggt ttgtgtttta aaaatattta ttttatcttt 2280gtttttgtta ttttttcccc ttcttccaat gcatagaaca aagaccaaga ctcacgcacg 2340tagccctatt tttgtttttc attgtttatc gatttcatct cttttgagaa tttccatgag 2400tggggtttag tgtttgttca catgatcaca tctcatgaat ttaaacttag taaaacatga 2460aactagacat ttattttgta cccttttatc cttataaaat gaaaattcca tttcgtatat 2520tatagatcgg tgatgaatca aacccaacgt tggggatcgc tttgtttttt gtctatagat 2580tgggacatca atggtggtgc atgcaataca ttaaccaata acgaacaaaa tggaccaaag 2640cttgagaatt tcctcggccg caccaccacg atttacaata ccaacgagac cgttgtagat 2700ggaaatggcg attgtggagg aggagacggt ggtggtggcg gctcactagg cctttcgatg 2760ataaaaacat ggctgagtaa tcattcggtt gctaatgcta atcatcaaga caatggtaac 2820ggtgcacgag gcttgtccct ctctatgaat tcatctacta gtgatagcaa caactacaac 2880aacaatgatg atgtcgtcca agagaagact attgttgatg tcgtagaaac tacaccgaag 2940aaaactattg agagttttgg acaaaggacg tctatatacc gcggtgttac aaggttaatt 3000tcattgatct atgtatattt ttattgtgct taaattgtga ttttcttggt attgtttggg 3060acattctaat ggttcggttg agagagagtg caacggaatg tctctcaatg tatattaaag 3120agaaacatta attagtgtac atgggtttat atatacaata atacgtcata tatatggtat 3180gctcttgatc atagtatata atgtttgaat ttaatgtcag gcatcggtgg acaggtagat 3240acgaggcaca tttatgggac aatagttgca aaagagaagg ccagactcgc aaaggaagac 3300aaggtactat atatataaag ctaatttttt aattttcatt taccatttat tttcaaacta 3360atttaggttt tcttttcatg tgtttcatca aaatttgcac ctgatggctc tcttttcagt 3420ttatctgggt aagttcttga ttttaagcta taaattaata atagatgact attaaatcta 3480ttctaagcaa aatataattg ttgtgttatc tgatcctaca ggaggttatg acaaagaaga 3540aaaagcagct agggcttacg atttagccgc actaaagtat tggggaccca ccactactac 3600taacttcccc gtatgttaat taatcaataa tatatacata aattcctaac ttctaaccaa 3660ttttagtctg aataatgcca atctcttaaa ctagtattat cttactatta actgtcatgt 3720ttatattgtt acaataaaaa ttagtaatgt tggttggata taatattcag ttgagtgaat 3780atgagaaaga ggtagaagag atgaagcaca tgacgaggca agagtatgtt gcctctctgc 3840gcaggtacag aatgaaactc ttgaatttat tgcattttag aaacccatca cgtatatatt 3900tattaaaata tatcgtaaca ttgaataaat cattatttgg aaagatataa gaaacatgta 3960aatatgcagg aaaagtagtg gtttctctcg tggtgcatcg atttatcgag gagtaacaag 4020gtacgtataa tccatctaga tatggaacga atactagtgt ttcattattt tttttgatgt 4080atacataata attgtcatac aatactatta atctaatcta attaatattt cctttaaaat 4140ggttccaaaa ggcatcacca acatggaagg tggcaagcta ggatcggaag agtcgccggt 4200aacaaagacc tctacttggg aactttcggt acattttcca ataaaatcta tatactataa 4260gatattaaat atacacaaat atatctaagt gaatcataca aattatgtag gcacacagga 4320agaggctgct gaggcttatg acattgcagc cattaaattc agaggattaa gcgcagtgac 4380taacttcgac atgaacagat acaatgttaa agcaatcctc gagagcccga gtctacctat 4440tggtagttct gcgaaacgtc tcaaggacgt taacaatccg gttccagcta tgatgattag 4500taataacgtt tcagagagtg caaataatgt tagcggttgg caaaacactg cgtttcagca 4560tcatcaggga atggatttga gcttattgca gcaacagcag gagaggtacg ttggttatta 4620caatggagga aacttgtcta ccgagagtac tagggtttgt ttcaaacaag aggaggaaca 4680acaacacttc ttgagaaact cgccgagtca catgactaat gttgatcatc atagctcgac 4740ctctgatgat tctgttaccg tttgtggaaa tgttgttagt tatggtggtt atcaaggatt 4800cgcaatccct gttggaacat cggttaatta cgatcccttt actgctgctg agattgctta 4860caacgcaaga aatcattatt actatgctca gcatcagcaa caacagcaga ttcagcagtc 4920gccgggagga gattttccgg tggcgatttc gaataaccat agctctaaca tgtactttca 4980cggggaaggt ggtggagaag gggctccaac gttttcagtt tggaacgaca cttagaaaaa 5040taagtaaaag atcttttagt tgtttgcttt gtatgttgcg aacagtttga ttctgttttt 5100ctttttcctt tttttgggta attttcttat aacttttttc atagtttcga t 5151<210>7<211>581<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>7Met Asn Asn Trp Leu Gly Phe Ser Leu Ser Pro His Asp Gln Asn His1 5 10 15His Arg Thr Asp Val Asp Ser Ser Thr Thr Arg Thr Ala Val Asp Val

20 25 30Ala Gly Gly Tyr Cys Phe Asp Leu Ala Ala Pro Ser Asp Glu Ser Ser

35 40 45Ala Val Gln Thr Ser Phe Leu Ser Pro Phe Gly Val Thr Leu Glu Ala

50 55 60Phe Thr Arg Asp Asn Asn Ser His Ser Arg Asp Trp Asp Ile Asn Gly65 70 75 80Gly Ala Cys Asn Thr Leu Thr Asn Asn Glu Gln Asn Gly Pro Lys Leu

85 90 95Glu Asn Phe Leu Gly Arg Thr Thr Thr Ile Tyr Asn Thr Asn Glu Thr

100 105 110Val Val Asp Gly Asn Gly Asp Cys Gly Gly Gly Asp Gly Gly Gly Gly

115 120 125Gly Ser Leu Gly Leu Ser Met Ile Lys Thr Trp Leu Ser Asn His Ser

130 135 140Val Ala Asn Ala Asn His Gln Asp Asn Gly Asn Gly Ala Arg Gly Leu145 150 155 160Ser Leu Ser Met Asn Ser Ser Thr Ser Asp Ser Asn Asn Tyr Asn Asn

165 170 175Asn Asp Asp Val Val Gln Glu Lys Thr Ile Val Asp Val Val Glu Thr

180 185 190Thr Pro Lys Lys Thr Ile Glu Ser Phe Gly Gln Arg Thr Ser Ile Tyr

195 200 205Arg Gly Val Thr Arg His Arg Trp Thr Gly Arg Tyr Glu Ala His Leu

210 215 220Trp Asp Asn Ser Cys Lys Arg Glu Gly Gln Thr Arg Lys Gly Arg Gln225 230 235 240Val Tyr Leu Gly Gly Tyr Asp Lys Glu Glu Lys Ala Ala Arg Ala Tyr

245 250 255Asp Leu Ala Ala Leu Lys Tyr Trp Gly Pro Thr Thr Thr Thr Asn Phe

260 265 270Pro Leu Ser Glu Tyr Glu Lys Glu Val Glu Glu Met Lys His Met Thr

275 280 285Arg Gln Glu Tyr Val Ala Ser Leu Arg Arg Lys Ser Ser Gly Phe Ser

290 295 300Arg Gly Ala Ser Ile Tyr Arg Gly Val Thr Arg His His Gln His Gly305 310 315 320Arg Trp Gln Ala Arg Ile Gly Arg Val Ala Gly Asn Lys Asp Leu Tyr

325 330 335Leu Gly Thr Phe Gly Thr Gln Glu Glu Ala Ala Glu Ala Tyr Asp Ile

340 345 350Ala Ala Ile Lys Phe Arg Gly Leu Ser Ala Val Thr Asn Phe Asp Met

355 360 365Asn Arg Tyr Asn Val Lys Ala Ile Leu Glu Ser Pro Ser Leu Pro Ile

370 375 380Gly Ser Ser Ala Lys Arg Leu Lys Asp Val Asn Asn Pro Val Pro Ala385 390 395 400Met Met Ile Ser Asn Asn Val Ser Glu Ser Ala Asn Asn Val Ser Gly

405 410 415Trp Gln Asn Thr Ala Phe Gln His His Gln Gly Met Asp Leu Ser Leu

420 425 430Leu Gln Gln Gln Gln Glu Arg Tyr Val Gly Tyr Tyr Asn Gly Gly Asn

435 440 445Leu Ser Thr Glu Ser Thr Arg Val Cys Phe Lys Gln Glu Glu Glu Gln

450 455 460Gln His Phe Leu Arg Asn Ser Pro Ser His Met Thr Asn Val Asp His465 470 475 480His Ser Ser Thr Ser Asp Asp Ser Val Thr Val Cys Gly Asn Val Val

485 490 495

Ser Tyr Gly Gly Tyr Gln Gly Phe Ala Ile Pro Val Gly Thr Ser Val

500 505 510

Asn Tyr Asp Pro Phe Thr Ala Ala Glu Ile Ala Tyr Asn Ala Arg Asn

515 520 525

His Tyr Tyr Tyr Ala Gln His Gln Gln Gln Gln Gln Ile Gln Gln Ser

530 535 540

Pro Gly Gly Asp Phe Pro Val Ala Ile Ser Asn Asn His Ser Ser Asn

545 550 555 560

Met Tyr Phe His Gly Glu Gly Gly Gly Glu Gly Ala Pro Thr Phe Ser

565 570 575

Val Trp Asn Asp Thr

580

<210>8

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>8

gaggcagcgg tcggatcgta acagtactct 30

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>9

cataaggaga gagagaaaag cctaaccagt 30<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>10accaagaact cgttagatc 19<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>11aacgcatata actaaagatc 20<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>12ccatggatcc agagacgaag cgaaac 26<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>13actccatgga taataactgg ttaggc 26<210>14<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>14aaattctcaa gctttggtcc atcttg 26

Claims

1、一种分离的DNA分子，其包含在中等或严格杂交条件下与选自除AP2结构域重复1-接头-AP2结构域重复2区域之外的SEQID NO：1，3和5或其片段或衍生物的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

2、权利要求1的分离的DNA分子，其中所述的分离的DNA分子包含选自SEQ ID NO：1，3和5的核苷酸序列的至少27个连续核苷酸。

3、权利要求1的分离的DNA分子，其中所述的分离的DNA分子包含与选自SEQ ID NO：1，3和5的核苷酸序列或其片段或衍生物的同源性至少为70％的核苷酸序列。

4、一种分离的DNA分子，其包含一编码蛋白质的核酸序列，其中所述蛋白质当以足够水平存在于植物细胞中时使所述细胞胚胎发生，或增加所述植物细胞的再生能力，或者同时使所述植物细胞胚胎发生并增加所述植物细胞的再生能力，所述分离的DNA分子与选自SEQ ID NO：1，3和5的核苷酸序列或其片段或衍生物有至少70％的同源性。

5、权利要求4的分离的DNA分子，其包含在中等或严格条件下与SEQ ID NO：5的核苷酸1620-4873或其片段或衍生物杂交的核苷酸序列。

6、权利要求4的DNA分子，其包含在中等或严格条件下与SEQID NO：1的核苷酸序列或其片段或衍生物杂交的核苷酸序列。

7、权利要求4的DNA分子，其包含在中等或严格条件下与SEQID NO：3的核苷酸序列或其片段或衍生物杂交的核苷酸序列。

8、权利要求6的DNA分子，其中所述DNA编码由SEQ ID NO：2定义的蛋白质。

9、权利要求7的DNA分子，其中所述DNA编码由SEQ ID NO：4定义的蛋白质。

10、一种包含权利要求1-9任一项的分离的DNA分子的载体，其中所述分离的DNA分子由指导所述DNA在植物细胞中表达的调控元件控制。

11、权利要求10的载体，其中所述调控元件是一种组成型调控元件。

12、权利要求10的载体，其中所述调控元件是一种诱导型调控元件。

13、权利要求10的载体，其中所述调控元件是一种组织特异性调控元件。

14、权利要求10的载体，其中所述调控元件是一种发育活性的调控元件。

15、包含权利要求10-14任一项的载体的转化的植物细胞。

16、包含权利要求10-14任一项的载体的转化的植物。

17、得自权利要求16的转化的植物的种子。

18、一种由权利要求4-9任一项的分离的DNA分子编码的分离的蛋白质。

19、产生无性衍生胚的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体转化植物细胞；

ii)培养所述植物细胞产生转化的组织；

iii)选择存在所述分离的DNA分子的所述转化组织；和

iv)分析所述转化的植物中的无性胚产生。

20、权利要求19的方法，其中分析步骤涉及分析不定胚生殖。

21、权利要求19的方法，其中分析步骤涉及分析体细胞胚。

22、权利要求19的方法，其中分析步骤涉及分析配子体胚。

23、权利要求19的方法，其中分析步骤涉及分析胚囊中单倍体孤雌生殖。

24、权利要求19的方法，其中分析步骤涉及分析倍数孢子形成。

25、修饰植物再生能力的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体转化植物细胞；

ii)培养所述植物细胞产生转化的组织；

iii)分析所述转化的植物组织与野生型组织相比再生作用的增

强。

26、权利要求25的方法，其中培养所述转化的植物细胞的步骤，或者分析所述转化的植物组织的步骤，或者培养所述转化的植物细胞的步骤和分析所述转化的植物组织的步骤在不存在生长调节剂的情况下进行。

27、选择转化的植物的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体转化正常条件下非再生的植

物；

ii)确定所述转化的植物是否能在所述正常条件下非再生的植物

不再生的条件下再生。

28、权利要求1的分离的DNA分子，其包含与SEQ ID NO：5的核苷酸1-1619或其片段有至少约70％相似性的DNA序列。

29、权利要求1的分离的DNA分子，其包含SEQ ID NO：5的核苷酸1-1619内的至少22个连续核苷酸。

30、包含与感兴趣的基因可操纵相连的权利要求28或29的分离的DNA分子的载体，其中所述分离的DNA分子指导所述感兴趣基因在植物细胞中的表达。

31、权利要求30的载体，其中所述感兴趣的基因与所述分离的DNA分子是异源的。

32、权利要求31的载体，其中所述的感兴趣的基因选自药物活性蛋白、抗体、工业酶、蛋白补剂、营养药、贮藏蛋白、动物饲料和动物饲料补剂。

33、包含权利要求30、31或32的载体的转化的植物细胞。

34、包含权利要求30、31或32的载体的转化的植物。

35、得自权利要求34的转化的植物的种子。

36、指导感兴趣的基因在植物的发育胚中表达的方法，包括用权利要求30、31或32的载体转化所述植物。

37、权利要求4、5、6或7任一项的核苷酸序列作为选择标记的用途。

38、一种产生无性衍生胚的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体瞬时转化植物细胞，或将权

利要求18的蛋白质导入所述植物细胞，以产生修饰的植物细

胞；

ii)培养所述修饰的植物细胞以产生组织；和

iii)分析所述组织中的无性胚形成。

39、权利要求38的方法，其中分析步骤涉及分析不定胚生殖。

40、权利要求38的方法，其中分析步骤涉及分析体细胞胚。

41、权利要求38的方法，其中分析步骤涉及分析配子体胚。

42、权利要求38的方法，其中分析步骤涉及分析胚囊的单倍体孤雌生殖。

43、权利要求38的方法，其中分析步骤涉及分析倍数孢子形成。

44、修饰植物的再生能力的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体瞬时转化植物细胞，或将权

利要求18的蛋白质导入所述植物细胞，以产生修饰的植物细

胞；

ii)培养所述修饰的植物细胞以产生组织；和

iii)分析所述组织与野生型组织相比再生作用的增强。

45、权利要求44的方法，其中培养所述修饰的植物细胞的步骤，或者分析所述组织的步骤，或者培养所述修饰的植物细胞的步骤和分析所述组织的步骤在不存在生长调节剂的情况下进行。

46、产生无融合生殖植物的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体转化植物以产生转化的植

物；

ii)选择存在所述分离的DNA分子的所述转化的植物；和

iii)分析所述转化的植物中无性胚的产生。

47、权利要求46的方法，其中分析步骤涉及分析不定胚生殖。

48、权利要求46的方法，其中分析步骤涉及分析体细胞胚。

49、权利要求46的方法，其中分析步骤涉及分析配子体胚。

50、权利要求46的方法，其中分析步骤涉及分析胚囊的孤雌生殖。

51、修饰植物的再生能力的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体瞬时转化植物细胞，或将权

利要求18的蛋白质导入所述植物细胞；

ii)培养所述植物细胞形成组织；和

iii)分析所述组织与野生型组织相比再生作用的增强。

52、权利要求51的方法，其中培养所述植物细胞的步骤，或者分析所述组织的步骤，或者培养所述植物细胞的步骤和分析所述组织的步骤在不存在生长调节剂的情况下进行。

53、选择修饰的植物的方法，包括：

i)用权利要求10-14任一项的载体瞬时转化正常条件下非再生

的植物，或将权利要求18的蛋白质导入所述正常条件下非再生

的植物，以产生所述修饰的植物；和

ii)确定所述修饰的植物是否能在所述正常条件下非再生的植物

不再生的条件下再生。

54、一种分离的DNA分子，其包含编码由两个AP2 DNA结合结构域组成的蛋白质的序列，当所述蛋白质以足够水平在植物细胞中表达时其能使所述细胞胚胎发生，或增加所述植物细胞的再生能力，或使所述细胞胚胎发生并增加所述植物细胞的再生能力。

55、生产感兴趣的蛋白质的方法，包括：

i)用至少一种载体转化植物以产生转化的植物，所述至少一种

载体选择权利要求10-14任一项的载体；

ii)选择存在所述分离的DNA分子的所述转化的植物；和

iii)培养所述转化的植物以生产所述感兴趣的蛋白质，其中所述

感兴趣的蛋白质的表达由所述分离的DNA的表达产物诱导。

56、权利要求55的方法，其中所述转化的植物用第二种载体转化，该载体包含在调控元件控制下的编码所述感兴趣的蛋白质的核苷酸序列，所述调控元件由所述分离的DNA的表达产物诱导。

57、权利要求55的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是一天然蛋白。

58、权利要求55或56的方法，其中所述感兴趣的蛋白质选自药物活性蛋白、抗体、工业酶、蛋白补剂、营养药、贮藏蛋白、涉及油生物合成的酶、动物饲料和动物饲料补剂。

59、权利要求4-7任一项的分离的DNA分子，其中所述的分离的DNA分子编码与SEQ ID NO：2的氨基酸至少70％相似的蛋白质。

60、权利要求4-7任一项的分离的DNA分子，其中所述的分离的DNA分子编码与SEQ ID NO：4的氨基酸至少70％相似的蛋白质。

61、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列的约30-541个氨基酸。

62、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列的约30-561个氨基酸。

63、一种分离的DNA分子，其包含在严格条件下与除AP2结构域重复1-接头-AP2结构域重复2区域外的SEQ ID NO：6杂交的核苷酸序列。

64、权利要求4的分离的DNA分子，其包含在中等或严格条件下与SEQ ID NO：6的核苷酸1620-4873或其片段或衍生物杂交的核苷酸序列。

65、权利要求64的分离的DNA分子，其中所述DNA编码SEQ IDNO：7的蛋白质。

66、包含权利要求63-65任一项的分离的DNA分子的载体，其中所述分离的DNA分子在指导所述DNA在植物细胞中的表达的调控元件的控制下。

67、权利要求66的载体，其中所述调控元件是一种组成型调控元件。

68、权利要求66的载体，其中所述调控元件是一种诱导型调控元件。

69、权利要求66的载体，其中所述调控元件是一种组织特异性调控元件。

70、权利要求66的载体，其中所述调控元件是一种发育活性的调控元件。

71、包含权利要求66-70任一项的载体的转化的植物细胞。

72、包含权利要求66-70任一项的载体的转化的植物。

73、得自权利要求72的转化的植物的种子。

74、一种由权利要求65的分离的DNA分子编码的分离的蛋白质。