CN1366049A

CN1366049A - 中华蜜蜂蜂毒AcHA基因及其编码的多肽和制备方法

Info

Publication number: CN1366049A
Application number: CN01135659A
Authority: CN
Inventors: 沈立荣; 和传溪; 程家安
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2001-10-12
Filing date: 2001-10-12
Publication date: 2002-08-28

Abstract

本发明公开了一种中华蜜蜂蜂毒AcHA基因序列及其编码的多肽和制备方法。该cDNA序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒AmHA的一个同系物,它与SEQ ID No.3中从核苷酸1－1164位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列编码—具有SEQ ID No.4所示的序列的多肽。此外,还提出了含中华蜜蜂蜂毒AcHA基因的载体、宿主细胞,与中华蜜蜂蜂毒AcHA基因相关的抗体,具有蛋白活性中华蜜蜂蜂毒AcHA的多肽、相关抗体的制备方法。本发明为进一步研究AcHA相关的酶活分子机理,开发与AcHA相关的生物医药、诊断试剂及生物试剂打下了基础。

Description

中华蜜蜂蜂毒AcHA基因及其编码的多肽和制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及中华蜜蜂蜂毒AcHA基因及其编码的多肽和制备方法。

背景技术

意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒透明质酸酶(Bee venomous hyaluronidase，BvHA)是意大利蜜蜂蜂毒的二个主要过敏原之一，约占蜂毒干重的2％-3％(Science 1972，177：314-322)按来源和生化性质，它属糖蛋白，是一种催化透明质酸长链中N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)与D-葡糖醛酸(GlcA)间β-1，4糖苷键水解，产生4糖产物GlcA-GlcNAc-GlcA-GlcNAc的一种β-N-乙酰-D-氨基己糖苷酶(β-N-acetyl-D-hexosaminidase)，或称透明质酸氨基己糖苷酶(Hyaluronoglucosaminidase)。BvHya具有很强的生物活性，使蜂毒在局部组织间渗透和扩散(Structure.2000，8：1025-1035)。

1993年，Gmachl等人应用生物技术方法，利用意大利蜜蜂蜂毒腺总RNA反转录成cDNA，通过噬菌体构建cDNA文库，并根据该蜂蜂毒透明质酸酶N端氨基序列合成简并核苷酸序列作为引物，以意蜂基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增出一段47bp的上游序列。然后以此序列作为探针作文库筛选，获得了3个阳性克隆，其中两个克隆插入片段为1.45kb，一个克隆插入片段为1.25kb。根据前两个克隆插入片段的测序结果，该cDNA所编码的HA成熟肽为349个氨基酸残基。后一个克隆插入片段中，除起始端198bp及第199-416位为内含子外，其余为前两个克隆中的编码序列(Insect Biochem.1988，18：511-514)。它们的cDNA被命名为AmH。

发明内容

本发明目的之一是提供一种中华蜜蜂蜂毒AcHA的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒AmHA蛋白的一个同系物。

本发明目的之二是提供一种由中华蜜蜂蜂毒AcHA多核苷酸编码的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白。

本发明目的还提供了这种制备中华蜜蜂蜂毒AcHA核苷酸探针、含中华蜜蜂蜂毒AcHA核苷酸的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。

在本发明，提供了一种分离出的DNA分子，它包括：编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列。

在本发明还提供了一种分离的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽，它包括：具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。

本发明还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。

本发明还提供了一种制备具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的方法，该方法包括：

(a)将编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成中华蜜蜂蜂毒AcHA表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3核苷酸1-1164位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽。

本发明发现了一种编码中华蜜蜂蜂毒AcHA的基因，该基因所编码的AcHA(中华蜜蜂蜂毒透明质酸酶)是一种生物活性物质，可应用于医学上心血官疾病、肿瘤等疾病的治疗，可作为药物的透皮因子用于药物制剂，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂、蜂毒过敏诊断试剂的制备，可作为生物学研究的工具酶。中华蜜蜂AcHA基因可为研究中华蜜蜂蜂毒过敏的分子机理，为开发利用中华蜜蜂蜂毒资源提供新的依据。

具体实施方式

在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1164个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.3，开放读框位于1-1164位核苷酸。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.3中1-1164位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.3序列的编码框1-1164位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.3中1-1164位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID No.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与中华蜜蜂蜂毒AcHA相同功能的蛋白的、SEQID No.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。

在本发明中，术语“中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽”指具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的SEQ ID No.4序列的多肽。该术语还包括具有与中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白相同功能的、SEQ ID No.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与中华蜜蜂蜂毒AcHA DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽的可溶性片段。通常，该片段具有中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽编码序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内中华蜜蜂蜂毒AcHA的表达。

本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽编码序列的8-100个，较佳地1-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码中华蜜蜂蜂毒AcHA核苷酸分子。

本发明还包括检测中华蜜蜂蜂毒AcHA核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞、COS细胞等。

另一方面，本发明还包括对中华蜜蜂蜂毒AcHA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物或片段。较佳地，指那些能与中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白的分子，也包括那些并不影响中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自中华蜜蜂的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，例如，纯化的中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达中华蜜蜂蜂毒AcHA或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来制备抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nnature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6：511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6：2921976；Hammerling等人，In Monoclonai Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断中华蜜蜂蜂毒AcHA功能的抗体以及不影响中华蜜蜂蜂毒AcHA功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术而获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中制备的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

在本发明的一个实施例中，中华蜜蜂蜂毒AcHA的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以中华蜜蜂毒腺总RNA反转录的cDNA为模板，或以中华蜜蜂毒腺λgtllcDNA文库为模板，用一对寡核苷酸为引物-A：5’-AGAATTCATGTCTCGGCCTCTCGTGATC-3’为正向向引物，寡核苷酸B：5’-GAAGCTTACACTTGGTCCACGCTCA-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID No.3的全长cDNA序列。

中华蜜蜂蜂毒AcHA为中华蜜蜂毒腺表达的蛋白，本发明的中华蜜蜂蜂毒AcHA为研究中华蜜蜂蜂毒相关的分子机理提供了基础。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例1，中华蜜蜂蜂毒AcHA的cDNA的克隆和测定

1.引物扩增

以中华蜜蜂毒腺总RNA反转录的cDNA为模板，或以中华蜜蜂毒腺λgtllcDNA文库为模板，用一对寡核苷酸为引物-A：5’-AGAATTCATGTCTCGGCCTCTCGTGATC-3’(SEQ ID No.1)为正向向引物，寡核苷酸B：5’-GAAGCTTACACTTGGTCCACGCTCA-3’(SEQ IDNo.2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为94℃ 1分钟，随之以94℃45秒钟，58℃45秒钟和72℃ 90秒钟进行30个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测得到约1200bp的目的片段。

2.PCR产物的测序

将上述PCR扩增产物A/B与PGEM^-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌TG1，用碱法提取质粒，用SequiTherm EXCEL^TMDNA测序试剂盒(EpicentreTeclnologies)对抽提的质粒进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1164bp，详细序列见SEQ ID No.3，其中开放读框位于1-1164位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出中华蜜蜂蜂毒AcHA的氨基酸序列，共387个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID No.4。

实施例2，同源比较

用本发明的中华蜜蜂蜂毒AcHA的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBankCDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与意大利蜜蜂蜂毒AmHA有显著的同源性。用GENTYX软件分析可以看出，它们的蛋白的同源性为90％(见附表1)。因此，可以推测本发明的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白为意大利蜜蜂蜂毒AmHA的同系物，并具有类似的功能。

1993年，Gmachl等人应用生物技术方法，利用意大利蜜蜂毒腺总RNA反转录成cDNA，通过构建cDNA文库。然后用探针作文库筛选，获得了编码意大利蜜蜂蜂毒AmHA的新基因。该cDNA所编码的AmHA成熟肽和信号肽为382个氨基酸残基，其中含4 Cys，3个N-糖基化位点Asn-Leu-Thr。本发明中中华蜜蜂蜂毒AcHA基因所编码氨基酸序列含有相应的4 Cys，3个N-糖基化位点Asn-Leu-Thr。意大利蜜蜂意蜂蜂毒AmHA、中华蜜蜂蜂毒AcHA与人精液HA(PH20)具有30％的同源性，根据同源性和生物活性特点，意大利蜂蜂毒AmHA与哺乳动物睾丸HA同属糖苷酶56家族。HA是目前医学上已应用于心血官疾病、肿瘤等治疗的生物活性物质，也是一种生物学研究的工具酶。本发明人的中华蜜蜂AcHA基因为研究中华蜜蜂蜂毒过敏的分子机理，为开发利用中华蜜蜂蜂毒资源提供了新的依据。

实施例3，中华蜜蜂蜂毒AcHA在大肠杆菌中的表达

在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

5’-AGAATTCATGTCTCGGCCTCTCGTGATC-3’(SEQ ID No.1)，该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是起始密码子开始的中华蜜蜂蜂毒AcHA编码序列的18个核苷酸；

3’端引物序列为：

5’-GAAGCTTACACTTGGTCCACGCTCA-3’(SEQ ID No.2)该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和中华蜜蜂蜂毒AcHA的部分编码序列。

引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pET-28a(+)上的限制性内切酶的酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Kan^r)、一个细菌复制起点(Ori)、一个IPTG可调启动子/操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。

用EcoR I和Hind III58消化pET-28a(+)载体及插入片段，随后将插入片段连接到pET-28a(+)载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化商品名为TG I的E.coli菌株，TG I含有多拷贝的重组质粒，其表达lac I阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kan^r)，在含有Kan^r的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证中华蜜蜂蜂毒AcHA的cDNA片段已正确插入了载体。

在补加Kan^r(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积LB液体培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD₆₀₀)为0.4-0.6时，加IPTG(“异丙基硫代-□-D半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中，澄清后，通过在能使含6His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-NTA柱层折从溶液中纯化溶解的中华蜜蜂蜂毒AcHA。用6M盐酸胍(PH7.9)从柱中洗脱中华蜜蜂蜂毒AcHA，可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤酴去盐酸胍。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。

用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为约46.3KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.4的序列一致。

实施例4，中华蜜蜂蜂毒AcHA在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹野蛾细胞株)中的表达

在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物作为插入片段。

PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为：

3’端引物序列为：

5’-GAAGCTTACACTTGGTCCACGCTCA-3’(SEQ ID No.2)，该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和中华蜜蜂蜂毒AcHA的部分编码序列。

引物上限制性内切酶酶切位点对应于Tn细胞表达载体pBacFastHTa上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Amp^r和Gm^r)，一个噬菌体复制起点(Ori)、一个病毒复制起点(SV40)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)，一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。

用EcoR I和HindIII消化pBacFastHTa载体及插入片段，随后用连结混合物转化E.coli TG I菌株，在含有Amp^r和Gm^r的LB培养皿上筛选转化子，补加Amp^r和Gm^r的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，测序验证中华蜜蜂蜂毒AcHA的cDNA片段已正确插入了载体。随后用重组质粒转化E.coli DH10Bac菌株，在含有Kan^r、Gm^r、四环素的LB培养皿上筛选转化子，在补加Kan^r、Gm^r、四环素的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，经Sepharose 2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。

质粒转染Tn细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2-3周的TC-100连续传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，以含NaCl0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液为平衡液及洗脱液，蛋白液用经预平衡的Ni²⁺Sepharose 6B柱过柱；再用含imdazola50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液，洗去杂蛋白，专一性的吸附的6×His的融合蛋白，再用含imdazola 500mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液进行洗脱.然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。

用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为45.3KDa。

此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ白ID No.4的蛋白，序列一致。

实施例5，制备抗体

将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用亲和层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund′s佐剂乳化。用200-300μg/头乳化过的蛋白，对皮下注射21天后，用非完全Freund′s佐剂乳化的同样抗原，对12周龄的家兔以100-200μg/头的剂量进行皮下多点及腿部肌肉注射以加强免疫。21天后再进行一次臀部肌肉注射加强免疫。抗血清的特异反应活性用它在体内沉淀中华蜜蜂蜂毒AcHA基因翻译产物的能力来评估。

SEQ ID No.1∽4的说明，SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征CA)长度：28碱基CB)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑；线性(ii)分子型：寡核苷酸(vi)序列描述：SEQ ID NO.1AGAATTCATGTCTCGGCCTCTCGTGATCSEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度：25碱基(B)类型：核酸、(C)链性：单链(D)拓扑：线性(ii)分子型：寡核苷酸(vi)序列描述；SEQ ID NO.2GAAGCTTACACTTGGTCCACGCTCASEQ ID NO.3的信息：(i)序列特征(A)长度：1164bp(B)类型：核酸(C)链性：单链(D)拓扑；线性(ii)分子型：cDNA(vii)(vi)序列描述：SEQ ID NO.31 ATGTCTCGGC CTCTCGTGAT CGCGGAAGAG ATGATGGTTG GAGTGTTGCT AATGCTAGCC61 CCCGTACTTC GGATAAACGC GTTATTACTC GGCTTCGTAC CGAGCACCCC CAACGACAAC121 AACAAAACCA AACGGGAGTT CAACGTTTAC TGGAACGTGC CCACCTTTAT GTGCCATAAA181 TACGGGCTAC GCTTCGAAGA AGTATCGGAG AAATATGGTA TTCTACAGAA CTGGATGGAT241 AAGTTTTGGG GCGAAGAGAT CGCGATCCTT TACGACCCTG GAATGTTCCC GGCGTTGCTG301 AAAGACTCGA ACGGGAACGT AGTGGCGAGG AACGGCGGTG TCCCGCAACT GGGCAATCTC361 ACCAAGCATC TCCAAGTATT TCGGGACCAC TTGATCAATC AGATCCCGGA CAAATCGTTC421 CCCGGCGTGG GGGTGATCGA TTTCGAAAGT TGGAGGCCGA TATTCAGACA GAATTGGGCC481 TCCCTCCAAC CCTACAAGAA ACTCTCCATA GACGTGGTTC GCCGTGAGCA TCCGTCCTGG541 GGCGATCAGA GGGTGGAGCA GGAGGCGAAA CGAAGGTTCG AGAAATACGG GAAACTTTTT601 ATGGAGGAGA CGTTGAAAGC TGCGAAACGG ATGAGGCCGG CCGCCAATTG GGGACACTAC661 GCTTACCCTT ATTGCTACAA TCTGACGCCG AATCAACCGA GCTCCCAATG CGAAGCAACC721 ACCATGCAGG AAAACGATAA AATGTCATGG CTGTTCGAGT CGGAAGACGT CCTCCTTCCG781 TCCGTTTATT TGAGATGGAA TCTGACGAGC GGCGAACGAG TGGGCCTGGT CGGTGGCCGC841 GTGAAGGAGG CGTTGAGAAT AGCGAGGCAA ATGACGACGA GCCGAAAGAA GGTTCTACCC901 TATTACTGGT ACAAATATCA GGATCGAAGG GACACGGATT TGAGCAGGGC TGACCTCGAG961 GCAACTTTAC GAAAAATCAC GGACCTCGGC GCCGATGGGT TTATCATTTG GGGAAGTTCC1021 AACGATATAA ACACGAAAGC GAAATGCGTA CAATTCAGGG AATACCTGAA CAACGATTTG1081 GGCCCTGTCG TTAAACGGAT CGCGTTGAAC AGCAACGCCC CTGCCGCGAA AAGTCGACTC1141 GACGTGAGCG TGGACCAAGT GTAASEQ ID NO.4的信息：(i)序列特征(A)长度：387个氨基酸(B)类型：氨基酸(C)拓扑结构；线性(ii)分子型：多肽(vi)序列描述：SEQ ID NO.41 Met Ser Arg Pro Leu Val Ile Ala Glu Glu Met Met Val Gly Val Leu Leu Met Leu Ala21 Pro Val Leu Arg Ile Asn Ala Leu Leu Leu Gly Phe Val Pro Ser Thr Pro Asn Asp Asn41 Asn Lys Thr Lys Arg Glu Phe Asn Val Tyr Trp Asn Val Pro Thr Phe Met Cys His Lys61 Tyr Gly Leu Arg Phe Glu Glu Val Ser Glu Lys Tyr Gly Ile Leu Gln Asn Trp Met Asp81 Lys Phe Trp Gly Glu Glu Ile Ala Ile Leu Tyr Asp Pro Gly Met Phe Pro Ala Leu Leu101 Lys Asp Ser Asn Gly Asn Val Val Ala Arg Asn Gly Gly Val Pro Gln Leu Gly Asn Leu121 Thr Lys His Leu Gln Val Phe Arg Asp His Leu Ile Asn Gln Ile Pro Asp Lys Ser Phe141 Pro Gly Val Gly Val Ile Asp Phe Glu Ser Trp Arg Pro Ile Phe Arg Gln Asn Trp Ala161 Ser Leu Gln Pro Tyr Lys Lys Leu Ser Ile Asp Val Val Arg Arg Glu His Pro Ser Trp181 Gly Asp Gln Arg Val Glu Gln Glu Ala Lys Arg Arg Phe Glu Lys Tyr Gly Lys Leu Phe201 Met Glu Glu Thr Leu Lys Ala Ala Lys Arg Met Arg Pro Ala Ala Asn Trp Gly His Tyr221 Ala Tyr Pro Tyr Cys Tyr Asn Leu Thr Pro Asn Gln Pro Ser Ser Gln Cys Glu Ala Thr241 Thr Met Gln Glu Asn Asp Lys Met Ser Trp Leu Phe Glu Ser Glu Asp Val Leu Leu Pro261 Ser Val Tyr Leu Arg Trp Asn Leu Thr Ser Gly Glu Arg Val Gly Leu Val Gly Gly Arg281 Val Lys Glu Ala Leu Arg Ile Ala Arg Gln Met Thr Thr Ser Arg Lys Lys Val Leu Pro301 Tyr Tyr Trp Tyr Lys Tyr Gln Asp Arg Arg Asp Thr Asp Leu Ser Arg Ala Asp Leu Glu321 Ala Thr Leu Arg Lys Ile Thr Asp Leu Gly Ala Asp Gly Phe Ile Ile Trp Gly Ser Ser341 Asn Asp Ile Asn Thr Lys Ala Lys Cys Val Gln Phe Arg Glu Tyr Leu Asn Asn Asp Leu361 Gly Pro Val Val Lys Arg Ile Ala Leu Asn Ser Asn Ala Pro Ala Ala Lys Ser Arg Leu381 Asp Val Ser Val Asp Gln Val表I 中华蜜蜂蜂毒HA与意大利蜜蜂蜂毒HA蛋白的比较进行同源比较的两个序列是：AcHA残基总数：387AmHA残基总数：382表示一致残基的符号为“*”AcHA 1：MSRPLVIAEEMMVGVLLMLAPVLRINALLLGFVPSTPNDNNKTKREFNVYWNVPTFMCHK 60AmHA 1：MSRPLVITEGMMIGVLLMLAP---INALLLGFVQSTPDNNKTV-REFNVYWNVPTFMCHK 56

******* * ** ******** ********* *** * ****************AcHA 61：YGLRFEEVSEKYGILQNWMDKFWGEEIAILYDPGMFPALLKDSNGNVVARNGGVPQLGNL 120AmHA 57：YGLRFEEVSEKYGILQNWMDKFRGEEIAILYDPGMFPALLKDPNGNVVARNGGVPQLGNL 116

********************** ******************* *****************AcHA 121：TKHLQVFRDHLINQIPDKSFPGVGVIDFESWRPIFRQNWASLQPYKKLSIDVVRREHPSW 180AmHa 117：TKHLQVFRDHLINQIPDKSFPGVGVIDFESWRPIFRQNWASLQPYKKLSVEVVRREHPFW 176

************************************************* ******* *AcHA 181：GDQRVEQEAKRRFEKYGKLFMEETLKAAKRMRPAANWGHYAYPYCYNLTPNQPSSQCEAT 240AmHA 177：DDQRVEQEAKRRFEKYGQLFMEETLKAAKRMRPAANWGYYAYPYCYNLTPNQPSAQCEAT 236

**************** ******************** *************** *****AcHA 241：TMQENDKMSWLFESEDVLLPSVYLRWNLTSGERVGLVGGRVKEALRIARQMTTSRKKVLP 300AmHA 237：TMQENDKMSWLFESEDVLLPSVYLRWNLTSGERVGLVGGRVKEALRIARQMTTSRKKVLP 296

************************************************************AcHA 301：YYWYKYQDRRDTDLSRADLEATLRKITDLGADGFIIWGSSNDINTKAKCVQFREYLNNDL 360AmHA 297：YYWYKYQDRRDTDLSRADLEATLRKITDLGADGFIIWGSSDDINTKAKCLQFREYLNNEL 356

**************************************** ******** ******** *AcHA 361：GPVVKRIALNSNAPAAKSRLDVSVDQV 387AmHA 357：GPAVKRIALNNNANDRLT-VDVSVDQV 382

** ******* ** *******同源性：90％

Claims

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA活性多肽的核苷酸序列。

所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164的核苷酸序列杂交。

2.根据权利要求1 SEQ ID No.3的DNA分子，其特征在于，所述编码的多肽具有SEQ No.4所示的序列，具有SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列。

3.一种分离的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽，其特征在于，它具有SEQ IDNo.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，该多肽具有SEQID No.4序列。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。

5.一种宿主细胞，其特征在于，它是用权利要求4所述载体转化的宿主细胞。

6.一种具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括：

(a)将编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(b)将步骤(a)中表达的载体转入宿主细胞，形成中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白的重组细胞；

(d)分离出具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽。

7.一种抗体，其特征在于，它是能与权利要求3所述的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽特异性结合的抗体。

8.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。

9.根据权利要求8所述的探针分子；其特征在于是指能与中华蜜蜂蜂毒AcHA基因产物或片断结合但不识别和结合与其它不相关抗原分子的抗体。

10.根据权利要求8所述的探针分子，其特征在于，它具有中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽编码序列中15-20个连续的核苷酸。