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CN1342207A - 使用聚合酶链反应检测链核盘菌属种类的方法 - Google Patents

使用聚合酶链反应检测链核盘菌属种类的方法 Download PDF

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CN1342207A
CN1342207A CN00804493A CN00804493A CN1342207A CN 1342207 A CN1342207 A CN 1342207A CN 00804493 A CN00804493 A CN 00804493A CN 00804493 A CN00804493 A CN 00804493A CN 1342207 A CN1342207 A CN 1342207A
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CN
China
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seq
primer
dna
oligonucleolide primers
fungal pathogens
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CN00804493A
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English (en)
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J·J·贝克
C·V·派瑞
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Syngenta Participations AG
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明涉及聚合酶链反应试验中的引物在检测真菌病原体、特别是核果链核盘菌和Monilinia fructicola中的用途。使用以PCR为基础的技术将特定的引物鉴定为用于鉴定真菌病原体、特别是核果链核盘菌和Monilinia fructicola。

Description

使用聚合酶链反应检测链核盘菌属种类的方法
本发明涉及聚合酶链反应试验中的引物在检测核果链核盘菌和Monilinia fructicola中的用途。使用这些引物能够检测真菌病原体的特定分离物并监测植物种群中疾病的发展情况。
植物疾病年复一年地使得农作物遭受相当大的损失，从而导致农场主的经济损失且在世界许多地区使地方种群的营养储备不足。杀真菌剂的广泛应用已经对植物病原体的侵害提供了可观的安全性。然而，尽管花费在杀真菌剂上的价值达10亿美元，但是在1981年世界范围内的农作物损失约占农作物价值的10％(James，1981；Seed Sci.& Technol.9：679-685)。
疾病破坏过程的严重性取决于病原体的侵染性和宿主的反应。大多数植物繁殖过程的一个目的是增加宿主植物对疾病的抗性。一般来说，不同品种的病原体以可区分的方式与不同品种的相同农作物种类发生相互作用且许多来源的宿主抗性仅可预防特定的病原体品种。此外，某些病原体品种表现出疾病症状的早期征兆，而几乎对农作物却没有损害。Jones和Clifford(1983；Cereal Disease，John Wiley)报导预计病原体的毒力形式在病原体种群中出现以作为对抗性进入宿主栽培品种的反应且由此对病原体种群进行监测是必不可少的。此外，存在几个得到证实的对特定杀真菌剂具有抗性的真菌菌株进化的实例。早在1981年，Fletcher和Wolfe(1981；Proc.1981 Brit.CropProt.Conf.)主张24％来自春季大麦的白粉菌种群和53％来自冬季大麦的白粉菌种群在对杀真菌剂唑菌醇的反应中表现出明显变化且这些种群的分布在不同品种之间改变，其中大部分敏感性品种还产生了最高发生率的低敏感性类型。在真菌对杀真菌剂的敏感性中的相似变化形式已经在下列品种中得到了证明：小麦霉(还对唑菌醇)，葡萄孢霉(对苯菌灵)，核腔菌属(对有机汞)，Pseudocercosporella(对MBC-型杀真菌剂)和Mycosphaerella fijiensis对仅提及的几种三唑类(Jones和Clifford；Cereal Disease，John Wiley，1983)。
褐腐病是一种商用生长的樱桃属种类的主要的全球性疾病(1995；Compendium of Stone Fruit Diseases，Amer.Phytopath.Soc.Pp7-10)。随地域的不同而变化的褐腐病可以由核果链核盘菌、M.fructicola和果生链核盘菌所导致。在北美尚未检测到果生链核盘菌，而在欧洲尚未发现M.fructicola。已经在欧洲的梨果和核果上检测到了果生链核盘菌，而核果链核盘菌是导致大多数明显的农作物损害的原因。褐腐病可以因包括杀真菌剂花费在内的开花和桠枝枯萎以及果实腐烂而直接由农作物损失导致财政损失。
鉴于上述原因，确实存在对在感染过程早期鉴定病原体真菌特定品种的技术进行开发的需求。在疾病症状在农作物不生长变得明显之前，通过鉴定病原体的特定品种，农学家可以评价病原体在农作物品种中的进一步发育的可能作用，其中所述病原体品种已经得到鉴定，且如果认为这类应用是必不可少的，那么农学家可以选择合适的杀真菌剂。定义：基因：指的是编码序列和相关的调节序列，其中编码序列被转录成诸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA或反义RNA这样的RNA。调节序列的实例是启动子序列、5’和3’非翻译序列和终止序列。例如，可以存在的其它元件是内含子。同一性：使用以动态编程算法为基础的计算机程序测定序列同一性的百分比。在本发明范围内优选的计算机程序包括设计成研究所有可得到的序列数据库的BLAST(基础局部序列对比检索工具)检索程序，而与问题是蛋白质还是DNA无关。该检索工具的BLAST 2.0版(缺口BLAST)已经在国际互联网上可以被公众所得到(目前的网址是http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。它使用将局部定位为与总体排列相反的启发式算法且由此能够检测仅共有分离区的序列之间的相关性。在BLAST检索中指定的评分具有清楚的统计学分析。植物：指的是任意植物、特别是种子植物。重组DNA分子：使用重组DNA技术彼此连接的DNA序列的组合。序列表中序列的简要描述SEQ ID NO：1寡核苷酸引物ITSl。SEQ ID NO：2寡核苷酸引物ITS2。SEQ ID NO：3寡核苷酸引物ITS3。SEQ ID NO：4寡核苷酸引物ITS4。SEQ ID NO：5寡核苷酸引物JB668。SEQ ID NO：6寡核苷酸引物JB669。SEQ ID NO：7寡核苷酸引物JB670。SEQ ID NO：8寡核苷酸引物JB671。SEQ ID NO：9寡核苷酸引物JB672。SEQ ID NO：10寡核苷酸引物JB673。SEQ ID NO：11寡核苷酸引物JB674。
本发明提供了用于鉴定不同致病型植物病原体真菌的独特DNA序列。本发明的一个目的是提供一种用于鉴定真菌病原体的寡核苷酸引物，其中所述的寡核苷酸引物选自由SEQ ID NOs：5-11组成的组。本发明中还包括用于以扩增为基础检测真菌内转录间隔区DNA序列的寡核苷酸引物对，其中至少一种所述的引物是选自由SEQ ID NOs：5-11组成的组的寡核苷酸引物。本发明还包括一对本发明的寡核苷酸引物，其中所述引物中的至少一种选自由SEQ ID NOs：1-4组成的组。优选的是本发明的寡核苷酸引物对，其中所述的寡核苷酸引物对选自下列引物对：SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：7；以及SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4。更优选的是本发明的寡核苷酸引物对，其中将所述的引物对用于检测核果链核盘菌和Moniliniafructicola，且其中所述的寡核苷酸引物对选自下列引物对：SEQ IDNO：6和SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；以及SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7。更优选权利要求4所述的寡核苷酸引物对，其中将所述的引物对用于检测核果链核盘菌，且其中所述的引物对选自下列引物对：：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：7；以及SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4。
本发明的进一步目的是提供一种用于检测真菌病原体的方法，该方法包括下列步骤：
(a)从感染了病原体的植物叶中分离DNA；
(b)使用至少一种权利要求1的引物使所述的DNA进行聚合酶链反应扩增；和
(c)通过目测观察所述聚合酶链反应扩增的产物来检测所述的真菌病原体。
优选的是一种本发明的方法，其中所述的真菌病原体选自核果链核盘菌和Monilinia fructicola。
本发明包括一种用于检测真菌病原体的方法，该方法包括下列步骤：
(a)从感染了病原体的植物叶中分离DNA；
(b)使用所述的DNA作为用一对权利要求4的引物进行的聚合酶链反应中的模板扩增所述病原体的部分内转录间隔区序列；和
(c)通过目测观察内转录的间隔区序列扩增部分来检测所述的真菌病原体。
优选的是本发明的方法，其中所述的真菌病原体选自核果链核盘菌和Monilinia fructicola。
一种具体的实施方案涉及一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，它包括本发明的引物。本发明还包括一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，它包括本发明的引物对。
本发明涉及鉴定不同致病型植物病原体真菌的方法。本发明提供了在不同真菌致病型之间表现出变异性的内转录间隔区(ITS)DNA序列。将这类DNA序列用于本发明的方法中，此时可以将它们用于使引物参与以聚合酶链反应(PCR)为基础的诊断试验。这些引物在DNA模板由特定真菌致病型提供的PCR反应中生成独特片段且由此可以将这些引物用于在疾病症状发作前鉴定在宿主植物材料中存在或不存在特定的致病型。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于检测核果链核盘菌的ITS衍生的诊断用引物。在另外一个优选的实施方案中，本发明提供了用于检测核果链核盘菌和Monilinia fructicola的ITS衍生的诊断用引物。
本发明为评价特定农作物品种-病原体菌株相关性中的潜在危害和谨慎应用各种变化的可得到的杀真菌剂提供了可能性。此外，可以将本发明用于提供关于在延伸地域内特定病原体品种的发育和传播的详细信息。本发明提供了一种特别适合于具有长潜伏期疾病的检测方法。
本发明还提供了用于实施本发明的试剂盒。该试剂盒特别应用于鉴定真菌病原体核果链核盘菌和Monilinia fructicola。
本发明提供了用于鉴定不同致病型植物病原体真菌的独特DNA序列。特别地，可以将所述的DNA序列用作用于鉴定真菌致病型的以PCR为基础的分析的引物。本发明的DNA序列包括特定真菌病原体核糖体RNA基因区的内转录间隔区(ITS)序列以及来源于能够鉴定特定病原体的这些区的引物。可以将这些来自病原体种或属中的不同致病型的ITS DNA序列用于鉴定那些特定的成员，其中所述的病原体种或属在不同种或属中的成员之间改变。
生物医学研究人员已经使用了以PCR为基础的技术一段时间并且已经适度成功地检测了受感染动物组织中的病原体。然而，仅在最近以来才将这项技术用于检测植物病原体。已经使用对病原体线粒体基因组具有特异性的序列的PCR检测了受感染小麦中存在的Gaumannomyces graminis(Schlesser等，1991；Applied and Environ.Microbiol.57：553-556)，而随机扩增的多态DNA(即RAPD)标记能够区分许多品种的Gremmeniella abietina、即针叶树中Scleroderris蛀孔的原因。美国专利号5,585,238(将该文献的全部内容引入本文作为参考)描述了来源于壳针孢属、假尾孢属和球腔菌属菌株核糖体RNA基因区的ITS序列的引物且其用于使用以PCR为基础的技术鉴定这些真菌分离物。此外，美国申请顺序号08/722,187(将该文献的全部内容引入本文作为参考)描述了来源于镰孢属菌株核糖体RNA基因区的ITS序列的引物且其用于使用以PCR为基础的技术鉴定这些真菌分离物。此外，美国专利申请顺序号08/742,023(将该文献的全部内容引入本文作为参考)描述了来源于尾孢属、长蠕孢属、球梗孢属和柄锈菌属菌株核糖体RNA基因区的ITS序列的引物且其用于使用以PCR为基础的技术鉴定这些真菌分离物。
核糖体基因因其高拷贝数而适合用作分子探针靶物。尽管成熟rRNA序列之间存在高度保守性，但是非转录和转录间隔区序列通常难以保守且由此适合作为检测近来进化趋异的靶序列。真菌rRNA基因以单位形式组织化，它们各自编码18S(小亚单位)、5.8S和28S(大亚单位)的三种成熟亚单位。这些亚单位被约300bp的两种内转录间隔区ITS1和ITS2分隔开(White等，1990；见：PCR方案，编辑：Innes等；315-322页)。此外，转录单位被非转录间隔区序列(NTSs)分隔开。ITS和NTS序列特别适合于检测不同真菌病原体的特定致病型。
本发明的DNA序列来自不同植物病原体核糖体RNA基因区的内转录间隔区序列。来自病原体种或属中不同致病型的ITS DNA序列在不同数量的种或属中改变。一旦测定了病原体的ITS序列，则可以将这些序列与其它ITS序列进行序列对比。在这种方式中，引物可以来源于ITS序列。即，可以以含有真菌病原体中序列具有最大差异的ITS序列中的区为基础设计引物。可以将这些序列和以这些序列为基础的引物用于鉴定特定病原体。
来源于ITS序列的有代表性的寡核苷酸引物的序列以SEQ IDNOs：1-11来描述。这些序列应用于以PCR为基础的所关注病原体的鉴定。
在PCR分析中使用本发明引物序列的方法在本领域中是众所周知的。例如，参见美国专利号4,683,195和4,683,202以及Schlesser等，1991；Applied and Environ.Microbiol.57：553-556。另外参见Nazar等(1991；Physiol.and Molec.Plant Pathol.39：1-11)，它使用PCR扩增以利用棉黄萎轮枝孢和大丽花轮枝孢ITS区中的差异且由此区分这两个种；而Johanson和Jeger(1993；Mycol.Res.97：670-674)使用类似技术区分了香蕉病原体Mycosphaerellafijiensis和芭蕉生球腔菌(Mycosphaerella musicola)。
本发明的ITS DNA序列可以通过本领域中公知的方法克隆自真菌病原体。一般来说，用于从真菌分离物中分离DNA的方法是公知的。参见Raeder & Broda(1985)，Letters in Applied Microbiology2：17-20；Lee等(1990)，Fungal Genetics Newsletter 35：23-24；以及Lee和Taylor(1990)见：PCR方案：A Guide to Methodsand Applications，Innes等(编辑)；282-287页。
在各病原体组中比较公开的ITS序列以便确定序列差异百分比，这种序列差异百分比可能用于在PCR中测试以区分不同的种和/或菌株。根据序列差异的鉴定合成大量引物并将其在PCR扩增中进行测试。用于PCR扩增测试的模板首先是纯化的病原体DNA且随后是分离自受感染宿主植物组织的DNA。因此，能够鉴定诊断用即鉴定一种特定病原体种或菌株而非相同病原体的另一个种或菌株的引物对。另外将引物用于所述种中高度保守的区以便开发属特异性引物和鉴定导致特定疾病的任意几种真菌病原体的引物。例如，将引物开发成可检测核果链核盘菌和M.fructicola。
优选的引物组合能够区分受感染宿主组织、即预先已经感染了特定病原体种或菌株的宿主组织中的不同的种或菌株。本发明提供了符合用于核果链核盘菌和M.fructicola标准的许多引物组合。以真菌ITS区中的序列差异为基础设计本发明的引物。序列之间最少为一个碱基对的差异就可使判别引物的设计成为可能。可以将为特定真菌DNA的ITS区设计的引物与成为核糖体DNA编码区内保守序列区的引物组合使用以便扩增种特异性PCR片段。一般来说，引物应具有的理论解链温度约为60℃-约70℃以便达到良好的敏感性且应不具有明显的二级结构和引物组合之间的3’重叠序列。引物一般与至少约5-10个连续的ITS1或ITS2核苷酸碱基具有序列同一性。在优选的实施方案中，无论如何，引物具有约5-30个核苷酸碱基的长度。
本发明本身便利地有助于含有实施所述方法必不可少的成分的“试剂盒”的制备方法。这类试剂盒可以包括区室化以容纳局限在其中的一种或多种诸如管或小瓶这样容器的载体。这些容器之一可以装有未标记或可检测标记的DNA引物。如果必要，标记的DNA引物可以以冻干形式或在合适的缓冲液中存在。一种或多种容器中可以装有用于PCR反应的一种或多种酶或试剂。这些酶可以以其自身形式或混合物形式、冻干形式或在合适的缓冲液中存在。
最后，该试剂盒中可以装有实施本发明技术必不可少的所有其它成分，诸如缓冲液、提取试剂、酶、移液管、平板、核酸、三磷酸核苷、滤纸、凝胶物质、转移物质、放射自显影源等。
下列实施例表明了可以用于下列目的的典型实验方案：合适引物序列的选择、选择和诊断功效引物的测试和应用这类引物检测疾病和真菌分离物。提供这类实施例用于解释目的而非起限定作用。
                      实施例
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中是众所周知的且记载在下列文献中：J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。
实施例1：真菌分离物和基因组真菌DNA的提取
参见表1列举的所用的真菌分离物及其来源。使真菌生长在接种了来自PDA(马铃薯右旋糖琼脂)培养物的菌丝体片段的150ml马铃薯右旋糖肉汤中。在28℃下的定轨振荡器上将培养物培养7-11天。另一方面，直接从PDA平板上分离菌丝体。通过离心沉淀菌丝体且然后将其在液氮中研磨并使用Lee和Taylor的方案提取总基因组DNA(1990；见：PCR方案：A Guide to Methods and Applications，Innes等(编辑)；282-287页)。
表1：测试用分离物的来源
    分离物     生物体     来源     分离      产地
    26255  Colletotrichumacutatum     ATCC1     番茄     新西兰
    66367  Colletotrichumacutatum     ATCC1     草莓    印第安纳
    60468  Colletotrichumacutatum     ATCC1  伞房花越桔     新西兰
    42373  Colletotrichumacutatum     ATCC1     芒果    澳大利亚
    38689  Colletotrichumacutatum f.sp.pinea     ATCC1    辐射松     ---
    12117  桃疮痂病     ATCC1      桃    威斯康星
    46762  油菜核盘菌     ATCC1    花椰菜    澳大利亚
    26261  盘长孢状刺盘孢     ATCC1      橙      ---
    38237  盘长孢状刺盘孢     ATCC1     芒果      ---
    44228  盘长孢状刺盘孢     ATCC1 Stylosantheshamata    澳大利亚
    66106  核果链核盘菌     ATCC1      杏     西班牙
    32671  核果链核盘菌     ATCC1     油桃      ---
    9953  核果链核盘菌     ATCC1      桃   加利福尼亚
    32670  Moniliniafructicola     ATCC1      桃     华盛顿
    46607  Moniliniafructicola     ATCC1      桃     新西兰
    42248  Moniliniafructicola     ATCC1     ----      ----
    BC29  灰葡萄孢   Novartis2
1美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，USA2Novartis Crop Protection，Research Triangle Park，NorthCarolina，USA
            实施例2：从杏仁组织中提取DNA
如下从杏仁植物部位中提取DNA：
大块浸解法：
(1)将杏仁花或等分的杏仁置于Bioreba(Reinach，Switzerland)大容量塑料袋(目录#490100)中。将植物组织称重、将装有叶的塑料袋减去包装重量(塑料袋重量)。
(2)每重量份(g)小麦组织加入等体积(ml)的Muller提取缓冲液(0.1％w/v Tween-80；0.04M Tris-Cl，pH7.7；0.15M NaCl；0.1％w/v BSA-Pentex级分V；0.01％w/v叠氮化钠；200mM EDTA)。使用设定在70的Bioreba Homex 6匀浆器浸渍该组织。将所述组织研磨至纤维状为止。
(3)将提取汁液等分入冰上的微量离心管。
(a)将浓缩的提取物煮沸5分钟。
(b)将煮沸的提取物置于冰上。将煮沸的提取物微量离心5分钟。
(c)由来自微量离心的提取物dH2O溶液制成1∶2、1∶5、1∶10和1∶50的上清液稀释液。
(d)在冰上将稀释的提取物储存至备用。
              实施例3：聚合酶链反应扩增
使用来自Perkin-Elmer/Cetus的GeneAmp试剂盒(Norwalk，CT；部件号N808-0009)、应用下列物质来进行聚合酶链反应：50mM KCl；2.5mM MgCl2；10mM含有各自为200μM的dTTP、dATP、dCTP和dGTP的Tris-HCl(pH8.3)；50pmol各引物；2.5个单位的Taq聚合酶以及10ng的基因组DNA或1μl稀释成终体积为50μl的杏仁提取物。在Perkin-Elmer 9600或9700型热循环仪上使反应进行30-40个循环，每个循环由94℃下15秒、50℃-70℃下15秒和72℃下45秒组成。通过使10μl各PCR样品上1.0％琼脂糖凝胶并进行电泳来分析产物。
           实施例4：寡核苷酸的合成和纯化
例如，由整合DNA技术(Coralville，IA)或Midland CertifiedReagent Company(Midland，Texas)来合成寡核苷酸(引物)。
           实施例5：种特异性引物的选择
用来自GenBank(National Center for BiotechnologyInformation，Bethesda，Maryland)表的核果链核盘菌和M.fructicola ITS区序列：AF010500、AF010503、AF010504、Z73777和Z73784进行多重序列对比。使用核果链核盘菌(Z73784)、M.fructicola(Z73777)、油菜核盘菌(Z73799)和灰葡萄孢(B.cinera)(U21817)进行第二次序列对比。以对进行序列对比的序列的分析为基础、按照实施例4合成诸如下表2中所示的那些寡核苷酸引物。将引物用于在真菌种中含有最大序列差异的区。还将引物用于两种链核盘菌属种中高度保守的区以尝试开发属特异性引物。
此外，合成公开的核糖体基因特异性引物ITS1、ITS2、ITS3和ITS4(White等，1990；见：PCR方案；编辑：Innes等，315-322页)用于与对ITS区具有特异性的引物一起进行测试。
                表2：为真菌检测设计的引物
1.引物模板    引物                引物序列
18S rDNA      ITS1     5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’(SEQ ID NO：1)
5.8S rDNA     ITS2     5’GCTGCGTTCTTCATCGATGC3’(SEQ ID NO：2)
5.8S rDNA     ITS3     5’GCATCGATGAAGAACGCAGC3’(SEQ ID NO：3)
25S rDNA      ITS4     5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’(SEQ ID NO：4)
M.fructicola  JB668    5’GTATGCTCGCCAGAGGATAAT3’(SEQ ID NO：5)
核果链核盘菌  JB669    5’GTATGCTCGCCAGAGAATAAT3’(SEQ ID NO：6)
核果链核盘菌  JB670    5’ATAGACTCAATACCAAGCTGT3’(SEQ ID NO：7)
/M.fructicola
M.fructicola  JB671    5’TATGCTCGCCAGAGGATAATT3’(SEQ ID NO：8)
核果链核盘菌  JB672    5’TATGCTCGCCAGAGAATAATC3’(SEQ ID NO：9)
M.fructicola  JB673    5’GGTTTTGGCAGAAGCACACT3’(SEQ ID NO：10)
核果链核盘菌  JB674    5’GTTTTGGCAGAAGCACACC3’(SEQ ID NO：11)
实施例6：对纯化真菌基因组DNA的引物特异性的测定
按照实施例3、使用不同的引物组合(表3)进行PCRs以尝试扩增单一特异性片段。由根据所关注的各真菌菌株的小与大核糖体DNA亚单位之间的ITS区设计的引物生产特异性PCR扩增产物。
                 表3：ITS衍生的诊断PCR引物
引物特异性        5’引物              3’引物        扩增片段的
                                                       大约大小
核果链核盘菌  JB669(SEQ ID NO：6)  ITS4(SEQ ID NO：4)   433bp
/Monilinia
fructicola
核果链核盘菌  JB672(SEQ ID NO：9)  ITS4(SEQ ID NO：4)   473bp核果链核盘菌/M.   JB668(SEQ ID NO：5)  ITS4(SEQ ID NO：4)   498bp
fructicola核果链核盘菌/M.   JB669(SEQ ID NO：6)  JB670(SEO ID NO：7)  448bp
fructicola
核果链核盘菌  JB672(SEQ ID NO：9)  JB670(SEQ ID NO：7)  438bp核果链核盘菌/M.   JB668(SEQ ID NO：5)  JB670(SEO ID NO：7)  357bp
fructicola核果链核盘菌/M.  ITS1(SEO ID NO：1)    JB670(SEQ ID NO：7)  512bp
fructicola实施例7：对受真菌感染的植物组织的引物特异性和与其它真菌病原
               体的交叉反应性的测定
如实施例2中所述从明显感染和未感染的杏仁树部位中分离总基因组DNA。如实施例3中所述进行PCRs以测试诸如表3中所列的那些引物组合对来自杏仁组织的DNA的作用。如实施例1中所述获得纯化的真菌基因组DNAs并如实施例3中所述使用诊断引物测定PCR。对其它真菌DNA种类和分离物测试诊断引物与其发生交叉反应的能力。有代表性的实验结果如下：
核果链核盘菌/M.fructicola特异性引物组合JB669(SEQ ID NO：6)和JB670(SEQ ID NO：7)由来自表1中所列的所有核果链核盘菌和M.fructicola分离物和来自链核盘菌属种类感染的杏仁组织的DNA中扩增了256bp的片段。该引物组合既没有从健康杏仁组织中也没有从来自下列表1中所列的常见杏仁病原体的纯化基因组DNA中扩增诊断用片段：C.acutatum、桃疮痂病、油菜核盘菌、盘长孢状刺盘孢和灰葡萄孢。使用下列核果链核盘菌/M.fructicola特异性引物组合获得了类似的诊断结果：JB669(SEQ ID NO：6)和ITS4(SEQ ID NO：4)、JB668(SEQ ID NO：5)和ITS1(SEQ ID NO：4)、ITS1(SEQ IDNO：1)和JB670(SEQ ID NO：7)、JB668(SEQ ID NO：5)和JB670(SEQ ID NO：7)。
引物JB672(SEQ ID NO：9)和JB670(SEQ ID NO：7)由来自核果链核盘菌分离物#32671、#66106和#9953的DNA中扩增了255bp的片段。这些引物没有从来自下列表1中所列的常见杏仁病原体的纯化基因组DNA中扩增：M.fructicola、C.acutatum、桃疮痂病、油菜核盘菌、盘长孢状刺盘孢和灰葡萄孢。使用核果链核盘菌特异性引物组合JB672(SEQ ID NO：9)和ITS4(SEQ ID NO：4)获得了类似的诊断结果。
尽管已经参照具体的实施方案描述了本发明，但是显然许多变化形式、修改和其它实施方案也是可行的；且由此应将所有这类变化形式、修改和实施方案看作属于本发明的范围。
序列表<110>Novartis AG<120>使用聚合酶链反应检测链核盘菌属种类的方法<130>PB/5-30846/RTP 2094<140>US09/258,967<141>1999-03-01<160>11<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>1tccgtaggtg aacctgcgg                                      19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>2gctgcgttct tcatcgatgc                                     20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>3gcatcgatga agaacgcagc                                     20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>4tcctccgctt attgatatgc                                     20<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>5gtatgctcgc cagaggataat                                    21<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>6gtatgctcgc cagagaataa t                                   21<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>7atagactcaa  taccaagctgt                                   21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>8tatgctcgcc agaggataat  t                                  21<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>9tatgctcgcc agagaataat c                                   21<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>10ggttttggca gaagcacact                                     20<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>11gttttggcag aagcacacc                                      19

Claims (12)

1.一种用于鉴定真菌病原体的寡核苷酸引物，其中所述的寡核苷酸引物选自由SEQ ID NOs：5-11组成的组。
2.一对用于以扩增为基础检测真菌内转录间隔区DNA序列的寡核苷酸引物，其中至少一种所述的引物是选自由SEQ ID NOs：5-11组成的组的寡核苷酸引物。
3.权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述引物中的至少一种选自由SEQ ID NOs：1-4组成的组。
4.权利要求2的寡核苷酸引物对，其中所述的寡核苷酸引物对选自下列引物对：
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7；
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：7；以及
SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4。
5.权利要求4的寡核苷酸引物对，其中将所述的引物对用于检测核果链核盘菌和Monilinia fructicola且其中所述的寡核苷酸引物对选自下列引物对：
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7；
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7；以及
SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7。
6.权利要求4的寡核苷酸引物对，其中将所述的引物对用于检测核果链核盘菌且其中所述的寡核苷酸引物对选自下列引物对：SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：7；以及SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：4。
7.一种用于检测真菌病原体的方法，该方法包括下列步骤：
(a)从感染了病原体的植物叶中分离DNA；
(b)使用至少一种权利要求1的引物使所述的DNA进行聚合酶链反应扩增；和
(c)通过目测观察所述聚合酶链反应扩增的产物来检测所述的真菌病原体。
8.权利要求7的方法，其中所述的真菌病原体选自核果链核盘菌和Monilinia fructicola。
9.一种用于检测真菌病原体的方法，该方法包括下列步骤：
(a)从感染了病原体的植物叶中分离DNA；
(b)使用所述的DNA作为用一对权利要求4的引物进行的聚合酶链反应中的模板扩增所述病原体的部分内转录间隔区序列；和
(c)通过目测观察内转录间隔区序列的扩增部分来检测所述的真菌病原体。
10.权利要求10的方法，其中所述的真菌病原体选自核果链核盘菌和Monilinia fructicola。
11.一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，它包括权利要求1的引物。
12.一种用于检测真菌病原体的诊断试剂盒，它包括权利要求2的引物对。
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