CN1332716C - 一种高分子抗肿瘤顺铂药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明以双臂RPEG₂Y-为载体，通过对抗肿瘤药物顺铂的偶合，得到了一种新的大分子抗肿瘤药物，并对其的药理性能进行了初步的研究。顺铂是一种目前在癌症治疗中获得广泛应用的抗肿瘤药物，但毒副作用大、在体内易被快速清除等缺点限制了其治疗指数的进一步提高。因此，降低顺铂的毒副作用，延长其在体内的代谢半衰期已经成为提高顺铂疗效的当务之急。而把其载体化无疑是一条有效的途径。本发明以双臂RPEG₂ Y-为载体，通过化学反应与顺铂偶合，得到了一种新的大分子载体药物。药理实验初步证明了以双臂PEG为载体的顺铂药物，比线型PEG为载体的顺铂具有更高的疗效。

Description

一种高分子抗肿瘤顺铂药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种药品，特别涉及一种以双臂聚乙二醇为载体的高分子抗肿瘤顺铂药物及其制备方法，即以双臂RPEG₂Y-(简称：双臂聚乙二醇)为载体，通过官能团化反应对小分子抗肿瘤药物顺铂进行改性。

背景技术

自从1969年B.Rosenberg和V.Camp首次报道顺式-二氯二氨合铂(简称顺铂)具有广谱的抗癌活性以来，顺铂在癌症治疗中的应用和研究得到了迅速的发展，目前已经成为各国普遍临床使用的抗肿瘤药物。然而，该药物存在毒副作用大、在体内代谢速度快、易被快速清除等缺点，因而限制了顺铂治疗指数的进一步提高。因此，降低顺铂的毒副作用，延长其在体内的代谢半衰期已经成为提高顺铂疗效的当务之急。而把其载体化则无疑为此提供了一条有效的途径。

聚乙二醇(PEG)是一种水溶性的两亲聚合物，具有良好的生物相容性、非免疫原性、无毒等特点，因此，它是顺铂改性的理想的大分子载体。与相同分子量的线型PEG相比，双臂及多臂PEG由于其有较大的流体力学体积，较小的静态黏度，预计对药物会产生更为有效的生理作用。目前尚未见到类似报导。

发明内容

本发明的目的是获得一种以双臂聚乙二醇为载体的高分子抗肿瘤顺铂药物及其制备方法。

本发明以双臂聚乙二醇(RPEG₂Y-)作为载体，通过其官能端基二酸的螯合作用对小分子抗肿瘤药物顺铂进行改性，化学通式为RPEG₂Y-B-C，其中RPEG₂Y-简称为双臂聚乙二醇，B为螯合顺铂的带有两个羧酸基团的结构，C为被修饰的小分子药物顺铂，其结构式如下：

或

其中R为10个碳以下的直链烷烃、异丙基或苄基；R₁为CH或苯基；R₂为1～9个碳原子的烃基；a、b、c为0～9的整数；k为0～6的整数；s、t是使RPEG₂-中的RO-(CH₂CH₂O)_s-及RO-(CH₂CH₂O)_t-部分的Mn约为2000～80000的整数；

W为O、S、

NH之一，同一分子中W可为不同基团；

Y为

NH、S、O、 CH＝、N＝之一；

V为

NH、S、O、

＝HC、＝N之一。

上述双臂聚乙二醇(RPEG₂Y-)载体结构中，R为甲基尤为优选。

上述高分子抗肿瘤药物的分子量为2000-160000。

上述高分子抗肿瘤药物的制备方法，是将用常规方法制备的官能化双臂聚乙二醇(RPEG₂Y-X)和含有丙二酸酯结构的化合物反应，然后水解得到含丙二酸结构的化合物RPEG₂Y-B，最后RPEG₂Y-B和氯原子被硝酸根取代的顺铂反应得到目标产物RPEG₂Y-B-C。

该化学反应利用了现有技术中现有反应条件而得。

上述高分子抗肿瘤药物中的载体双臂RPEG是以线性RPEG为原料，通过合成RPEG活性酯，利用多步反应分别在水相以及油相中与例如赖氨酸的ω及α位的胺基偶合得到的。双臂树杈状PEG的合成方法在本领域中已有描述，例如：Yamsuki等，Agric.Bio.Chem.1988，52，2185-2196；Monfardidi等，BioconjugateChem.1995，6，62-69。

上述高分子抗肿瘤药物制备是将双臂RPEG上的羧酸官能团与带丙二酸酯结构的化合物如氨基丙二酸二乙酯连接，然后水解得到丙二酸结构，最后与氯原子被取代为硝酸根的顺铂偶合。以单甲氧基聚乙二醇(mPEG)和赖氨酸(lysine)制备的双臂聚乙二醇为例，该高分子抗癌药物的合成路线如下：

关于线形PEG连接顺铂的方法在本领域中已有描述，例如Yuichi等，Macromol.Biosci.2001，1，No.8，355-363。

上述高分子抗肿瘤药物中小分子药物的接药率在90％-99％之间。

上述的高分子抗肿瘤药物RPEG₂Y-B-C及制备方法，所述的RPEG₂-的结构是：

其中R为10个碳以下的直链烷烃、异丙基或苄基；R₁为CH或苯基；a、b、c为0～9的整数；k为0～6的整数；s、t、为10～2000的整数；

W为O、S、NH

之一，同一分子中W可为不同基团。

例如：

等。

上述双臂聚乙二醇RPEG₂Y-的结构中R是甲基尤为优选。

上述的高分子抗肿瘤药物及制备方法中，

Y可以为

NH、S、O、

CH＝、N＝之一；

上述的高分子抗肿瘤药物及制备方法中，官能化的双臂聚乙二醇为RPEG₂CO-X时，其中的X可以为下述结构之一：

-H-OH-NH₂

上述的高分子抗肿瘤药物RPEG₂Y-B-C及制备方法中，B的结构可以是下述之一：

其中R₂为1～9个碳原子的烃基；

V为

NH、S、O、

＝HC、＝N之一。

例如：

等。

上述的高分子抗肿瘤药物及制备方法中，C的结构是两个氯原子被取代的顺铂。

上述高分子抗肿瘤药物以双臂RPEG为载体，通过化学反应，将小分子抗肿瘤药物顺铂与载体偶合。和相同分子量的线性RPEG比较，双臂RPEG具有更大的流体力学体积，这样就更有效的减少了药物在生物体内失活或被酶水解的速度。同时通过丙二酸的螯合作用与顺铂连接生成的稳定的六元环，使药物的释放更加缓慢，增加了药物在体内的半衰期。

上述具有通式RPEG₂CO-B-C的双臂mPEG顺铂偶合物(DImPEG-Pt)经体外细胞毒性实验表明，该药物保留了相当程度的抗肿瘤活性；同时，与相同分子量的线性mPEG顺铂偶和物相比，具有通式RPEG₂CO-B-C的高分子抗肿瘤药物具有更高的体外细胞毒活性，这也说明了双臂mPEG比线性mPEG更适合于对小分子药物的改性，可以更大限度的减少药物失活的程度。

附图说明

图1是双臂聚乙二醇改性的顺铂(DImPEG-Pt)系列的剂量反应曲线图

图2是单臂聚乙二醇改性的顺铂(mPEG-Pt)系列的剂量反应曲线图

具体实施方式

实施例一

RPEG₂CO-B-C的合成方法(以单甲氧基聚乙二醇(mPEG)分子量2000为例)1.将10g mPEG(Mn＝2000，5mmol)溶于约150mL甲苯，在氮气保护下常压蒸除绝大部分甲苯，以除去mPEG中所含的微量水分。冷至室温后，向其中加入约200mL无水THF，加热微沸至mPEG完全溶解。随后向mPEG溶液中滴加0.2mol/L的萘钠溶液直至溶液呈灰绿色。取5.24mL氯乙酸乙酯(6.03g，50mmol)用50mL THF稀释后加入反应溶液中，室温下搅拌反应4h。反应液经浓缩后用无水乙醚沉淀，所得粗产物加到300mL 0.1mol/L NaOH溶液中，50℃搅拌12h。然后用1mol/L HCl调节pH＝3，用CH₂Cl₂萃取三次，合并萃取液浓缩后用无水乙醚沉淀。再经两次溶解-过滤-沉淀后，真空干燥，得mPEG-CH₂COOH 9.5g，产率92％。经核磁共振测定，产物中mPEG-CH₂COOH摩尔含量为95％。(¹HNMR(CDCl₃)mPEG-C H ₂COOH，δ＝4.15)

2.将上述9.5g mPEG-CH₂COOH(Mn＝2058，4.6mmol)溶于约150mL甲苯，在氮气保护下常压蒸除绝大部分甲苯，以除去其中所含的微量水分。冷至室温后，向其中加入约120mL无水二氯甲烷溶解mPEG-CH₂COOH。随后向溶液中分别加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1.06g(9.2mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC)2.86g(13.8mmol)，于冰水浴下搅拌反应12h。反应液经浓缩后用无水乙醚沉淀，所得粗产物在加热下溶于约40mL干燥甲苯，过滤，除去其中的不溶物后用无水乙醚沉淀。再经两次溶解-过滤-沉淀后，真空干燥，得mPEG-CH₂COOSu(mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯)9.0g，产率90％。经紫外光谱法来测定，产物中琥珀酰亚胺碳酸酯的摩尔含量为94％。

3.称取赖氨酸(Lysine)1.46g(10mmol)溶于80mL pH＝8的硼酸、硼砂缓冲溶液中。将第2步中制得的mPEG-CH₂COOSu4.3g(2mmol)在1h内分批逐步加入，期间通过滴加0.2mol/L的NaOH溶液保持溶液的pH值为8(用pH计监控)。室温继续搅拌反应12h后，在冰水浴下将溶液的pH值用盐酸调至2-3，用二氯甲烷萃取产物。反复萃取三次，将萃取液合并，浓缩，于无水乙醚中沉淀。再溶解-过滤-沉淀二次后，真空干燥，得到产物mPEG-CH₂CO-Lysine，用于下一步反应。

4.将上步反应所得产物mPEG-CH₂CO-Lysine溶于约80mL无水二氯甲烷中，滴加三乙胺调节溶液pH值至8-9(将溶液滴至湿润的精密pH试纸测得)。在3小时内分批逐步加入第2步中制得的mPEG-CH₂COOSu 4.7g(2.2mmol)，并不断滴加三乙胺，保持溶液的pH值为8-9。然后将反应液升温至40℃，回流搅拌48小时后，过滤、浓缩，于无水乙醚中沉淀。所得产物再溶解-过滤-沉淀二次后，真空干燥，得产物8.0g。经GPC测定，其中双臂mPEG₂-CHCO-Lysine的含量约为80％。

将上述产物配成10％的水溶液，选择合适孔径的超滤膜，在1.5个大气压下，超滤分离，即可提纯双臂mPEG，最终得产物mPEG₂-CHCO-Lysine5.0g。

5.第4步中制得的将5.0g mPEG₂-CHCO-Lysine(Mn＝4226，1.2mmol)溶于约100mL甲苯溶液，在氮气保护下常压蒸除绝大部分甲苯，以除去其中所含的微量水分。冷至室温后，向其中加入约120mL无水二氯甲烷溶解mPEG₂-CHCO-Lysine。随后向溶液中分别加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.28g(2.4mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC)0.75g(3.6mmol)，于冰水浴下搅拌反应12h。反应液经浓缩后用无水乙醚沉淀，所得粗产物在加热下溶于约40mL干燥甲苯，过滤，除去其中的不溶物。再经两次溶解-过滤-沉淀后，真空干燥，得mPEG₂-CHCO-Lysine-OSu 4.5g，产率90％。经紫外光谱法来测定，产物中琥珀酰亚胺碳酸酯的摩尔含量为98％。

6.称取0.7g氨基丙二酸二乙酯(DEAM)(3.3mmol)，溶于50mL无水二氯甲烷中，加入三乙胺1mL，冰水浴下搅拌2小时。将4.5g第5步中制得的mPEG₂-CHCO-Lysine-OSu(1.1mmol)溶于约80mL无水二氯甲烷中，滴加三乙胺调节溶液pH值至8-9(将溶液滴至湿润的精密pH试纸测得)。冰水浴下将前面反应的氨基丙二酸二乙酯溶液加入到mPEG₂-CHCO-Lysine-OSu溶液中。0℃下反应12小时后，过滤、浓缩，于无水乙醚中沉淀。所得产物再溶解-过滤-沉淀二次后，真空干燥，得产物4.3g。经核磁共振测定，其中mPEG₂-CHCO-Lysine-DEAM的含量约为80％。(¹H NMR(CDCl₃)COOCH₂C H ₃，δ＝1.30)

7.冰水浴下将第6步中制得的4.3g mPEG₂-lysine-DEAM(0.98mmol)溶于NaOH甲醇溶液(甲醇92mL，1mol/L NaOH 13.5mL)中，搅拌2h。用1mol/L HCl调节pH＝6，40℃旋转蒸发溶剂，然后加入二氯甲烷溶解，加入无水硫酸镁干燥。过滤，将滤液浓缩，于无水乙醚中沉淀。再溶解沉淀两次后，真空干燥，得产物(mPEG₂-CHCO-Lysine-DA)4.0g，产率95％。经核磁共振测定，其中mPEG₂-CHCO-Lysine-DA含量为75％。(核磁中1.30处的峰消失)

8.将顺铂1.35g(4.5mmol)溶于约200mL去离子水，加热至60℃使之完全溶解。再加入硝酸银1.52g(9mmol)，于60℃避光搅拌反应6h后滤掉生成的氯化银沉淀。向滤液中加入4.0gmPEG₂-CHCO-Lysine-DA(0.92mmol)，继续于60℃避光搅拌反应24h后，用二氯甲烷萃取产物。反复萃取三次，将萃取液合并，浓缩，于无水乙醚中沉淀。再溶解-过滤-沉淀二次后，真空干燥，得产物mPEG₂-CHCO-Lysine-Pt产率82％。经原子吸收光谱法测定，产物中顺铂的摩尔含量为87.1％。

实施例二

RPEGCO-B-C-Pt的制备(以mPEG分子量4000为例)

称取10g mPEG(Mn＝4000，2.5mmol)，以实施例一相同的方法制备端基为羧基的mPEG-CH₂COOH，连接氨基丙二酸二乙酯，水解，最后合成mPEG-CH₂CO-Lysine-Pt。产率为81％，最终产物中顺铂的摩尔含量为85.2％。

实施例三

RPEG₂CO-B-C的合成方法(以单甲氧基聚乙二醇(mPEG)分子量80000为例)将16g mPEG(Mn＝80000，0.2mmol)，以实施例一相同的方法，得mPEG-CH₂CO-Lysine-Pt 4.5g，总产率28％。最终产物中顺铂的摩尔含量为80.4％。

按照以上实施例的步骤，本发明合成了三种分子量的高分子药物，用于体外细胞毒性实验。合成了载体分子量为4000、6000和9400的三种双臂mPEG(简称：DImPEG)顺铂偶合物：DImPEG-4000-Pt、DImPEG-6000-Pt、DImPEG-9400-Pt以及三种线性mPEG顺铂偶合物：mPEG-4000-Pt、mPEG-6000-Pt、mPEG-9400-Pt。以上各种药物中顺铂的摩尔含量列于下表1：

表.1大分子药物中铂的摩尔含量

药物	DImPEG-4000-Pt	DImPEG-6000-Pt	DImPEG-9400-Pt	mPEG-4000-Pt	mPEG-6000-Pt	mPEG-9400-Pt
							铂含量(％)	87.1	89.6	87.5	85.2	88.5	84.3

上述药物的体外细胞毒性实验过程及结果见实施例四。

上述药物的急性毒性实验过程及结果见实施例五。

实施例四

将C6人乳腺癌细胞株用含10％胎牛血清的DMEM培养液在37℃，5％CO₂条件下培养，传代。将生长旺盛的C6细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，配成终浓度为70000个细胞/mL的细胞悬液，将该悬液按100uL/孔均匀加入96孔平底培养板中。每孔细胞数为7000个。在37℃，5％CO₂，湿度100％的条件下孵育24h。将上述各大分子药物溶于DMEM培养液，用0.22um微孔滤膜过滤。所得药物溶液以大分子药物中顺铂的含量为基准，稀释成不同浓度，折算成小分子顺铂分别为0.02ug/mL，0.2ug/mL，2ug/mL，20ug/mL，200ug/mL，2mg/mL。向上述96孔平底培养板中加入不同浓度的药物100uL/孔，培养2天，  换液，培养一天。每孔加入20uL 0.5％四氮唑(MTT)溶液，4小时后，  吸出上清液，加入150uL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min。用酶标仪检测各孔570nm处的吸光值(OD值)，记录结果，按下列公式计算细胞存活率：

细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％

从附图中可求出各药物对癌细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)，根据大分子药物不同的接药率，以顺铂的含量为基准，各药物的IC₅₀值列于表.2。

表.2 DImPEG-Pt与mPEG-Pt系列药品的IC₅₀值

药物	IC50，10-5mol/L
		DImPEG-4000-Pt	6.265
DImPEG-6000-Pt	27.159
		DImPEG-9400-Pt	13.396
mPEG-4000-Pt	61.184
		mPEG-6000-Pt	30.725
mPEG-9400-Pt	61.817

从表中可以看出，在同系列药物中，载体PEG的分子量未对药物的体外细胞毒性产生规律性的影响，但DImPEG-Pt系列药物的IC₅₀值却均低于相同分子量的mPEG-Pt系列药物。这说明了相同分子量的DImPEG-Pt药物比mPEG-Pt药物体现出了更好的体外抗肿瘤活性。

图1是双臂聚乙二醇改性的顺铂(DImPEG-Pt)系列的剂量反应曲线图，

图2是单臂聚乙二醇改性的顺铂(mPEG-Pt)系列的剂量反应曲线图，

本发明以细胞存活分数对药物的剂量作图，得到了上述几个药物的剂量反应曲线。同期本发明也测得了对照样品顺铂的剂量反应曲线。从图中可以看出，不同分子量的DImPEG-Pt和mPEG-Pt在体外对C6细胞都有较好的抗肿瘤活性。

实施例五

为了检验顺铂经PEG修饰后的急性毒性变化，测定了上述高分子药物的LD₅₀。

TA1小白鼠随机分成5组，每组20只，雌雄各半，分别用顺铂，接了线型和两臂PEG的顺铂给药，用ip×1治疗方案，设五个计量组，给药后观察即时反应。记录二周内小鼠的死亡分布。以24小时为死亡高峰。死亡动物尸检未发现肉眼可见的，明显的实质性的病变。二周后存活动物一般情况良好。实验结果用Bliss方法计算，如表3所示。

表.3 DImPEG-Pt与mPEG-Pt系列药品的LD₅₀值

药物	LD50，mg/kg
		CDDP	25.8
DImPEG-4000-Pt	901.5
		DImPEG-6000-Pt	988.1
DImPEG-9400-Pt	1013.7
		mPEG-4000-Pt	895.6
mPEG-6000-Pt	976.0
		mPEG-9400-Pt	1095.3

从表中可以看出，顺铂通过PEG修饰后，其急性毒性明显降低。

Claims (5)

1.一种高分子抗肿瘤药物，其特征在于，化学通式为RPEG₂Y-B-C：

其中：RPEG₂-的结构式如下：

其中，R为10个碳以下的直链烷烃、异丙基或苄基；R₁为CH或苯基；a、b、c为0～9的整数；k为0～6的整数；s、t是使RPEG₂-中的RO-(CH₂CH₂O)_s-及RO-(CH₂CH₂O)_t-部分的Mn约为2000～80000的整数；

W为O、S、

NH、之一，同一分子中W可为不同基团；

其中，B的结构是下述之一：

R₂为1～9个碳原子的烃基；

所述C的结构是两个氯原子被取代的顺铂，结构式如下：

2.如权利要求1所述的高分子抗肿瘤药物，其特征在于R为甲基。

3、如权利要求1至2任一所述的高分子抗肿瘤药物，其特征在于，是按照以下步骤制备的：官能化双臂聚乙二醇RPEG₂Y-X和含有丙二酸酯结构的化合物反应，然后水解得到含丙二酸结构的化合物RPEG₂Y-B，最后RPEG₂Y-B和氯原子被硝酸根取代的顺铂反应得到目标产物RPEG₂Y-B-C，其中，X为下述结构之一：

4.如权利要求1至3任一所述的高分子抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：官能化双臂聚乙二醇RPEG₂Y-X和含有丙二酸酯结构的化合物反应，然后水解得到含丙二酸结构的化合物RPEG₂Y-B，最后RPEG₂Y-B和氯原子被硝酸根取代的顺铂反应得到目标产物RPEG₂Y-B-C，其中，X为下述结构之一：

其中，所述的RPEG₂-的结构式如下：

其中R为10个碳以下的直链烷烃、异丙基或苄基；R₁为CH或苯基；a、b、c为0～9的整数；k为0～6的整数；s、t是使RPEG₂-中的RO-(CH₂CH₂O)_s-及RO-(CH₂CH₂O)_t-部分的Mn约为2000～80000的整数；

W为O、S、NH、

之一，同一分子中W可为不同基团；

所述的B的结构是下述之一：

其中R₂为1～9个碳原子的烃基；

C的结构是两个氯原子被取代的顺铂，结构式如下：

5.如权利要求4所述的高分子抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，R为甲基。

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