CN1331700A

CN1331700A - 通过禽类中使用多核苷酸疫苗接种生成抗体的方法

Info

Publication number: CN1331700A
Application number: CN99814774A
Authority: CN
Inventors: 段陵浔
Original assignee: GenWay Biotech Inc
Current assignee: GenWay Biotech Inc
Priority date: 1998-11-16
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2002-01-16
Also published as: WO2000029444A9; KR20020007281A; AU1818600A; CA2350111A1; EP1133523A1; IL143027A0; US20050208628A1; WO2000029444A1; US6951742B1; BR9915732A; JP2002532066A

Abstract

本方明涉及一种使用多核苷酸疫苗接种在禽类中产生针对抗原的抗体方法。本方明还涉及一种确定分离自生物样品的一组预选DNA序列的蛋白质组学谱型,优选为人cDNA文库的蛋白质组学谱型的方法。本发明进一步涉及一种鉴定生理可辨别的、与生理异常的生物样品相联系的标志的方法。

Description

通过禽类中使用多核苷酸疫苗接种生成抗体的方法

依据美国法典第35章第119条(e)，本专利申请要求于1998年11月16日、给予Linxun Duan的美国临时专利申请60/108,487的优先权，发明名称为通过在禽类中使用多核苷酸疫苗接种产生抗体的方法和载体。

1.发明领域

本发明涉及一种通过使用多核苷酸疫苗接种在禽类中，优选地在鸡内，生产针对一种抗原的多克隆和单克隆抗体的方法。本发明也涉及一种确定依据从生物样品中分离出的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型的方法，优选为人cDNA文库的蛋白质组学谱型。本发明进一步涉及一种确认与生理异常的生物样品相联系的生理上可区分的标记物的方法。

2.发明背景

2.1在鸡中进行多核苷酸疫苗接种

遗传免疫代表疫苗免疫治疗发展的一种新的方法。与传统的疫苗接种相比，遗传疫苗接种具有相对较短的开发时间、易于大规模生产、低开发一生产一销售成本和对疫苗生产者、管理者和接受者更安全的优点。

遗传疫苗接种可以分为DNA疫苗接种和mRNA疫苗接种。近来已经有研究表明质粒DNA免疫具有下列重要特点(Chattergoon等人，FASEB，1997，11：753-763)。第一，以传递方法为基础(特别是肌肉和皮肤)，不同组织能够被质粒DNA在体内转染，并作为生产抗原的工厂。第二，在一些模型系统中通过多种传递方法可以诱导产生保护性的细胞和体液应答。第三，抗原刺激只需要少量的质粒DNA。质粒DNA免疫通过若干免疫位点和利用若干独特传递技术在诱导针对若干靶抗原的免疫应答中的成功巩固了DNA疫苗接种的概念。从此这项技术已被应用于很多疾病模型，包括乙型流感、乙型肝炎病毒、疟疾、结核病、SIV和I型HIV以及多种癌症(1d)。

传统上，多克隆抗体是在哺乳动物如小鼠、兔、绵羊、山羊和猪中生产的。在免疫期后可从血清中获得抗体。这项技术对动物有侵害性，耗费时间且花费高，涉及约束动物及从动物收集血液样品。与之相对，在鸡中生产多克隆抗体，特别是以鸡蛋黄为抗体来源物，是一种非侵害性技术。鸡蛋黄中免疫球蛋白的浓度与之在血清中相似(Altchul等人，自然遗传)(Nature Genetics，1994，6：119-129)。另外，家禽比哺乳动物处在更低的系统发育地位(欧共体指令86/609第7条European Community Directive，86/609 Article7)，因而希望使用禽类而不是哺乳动物。

对特别自然保护的哺乳动物蛋白质产生具有高度特异性的抗体是困难的。由于鸡与哺乳动物间有巨大的进化差距，因而它可用于生产抗体(Burke等人，科学(Science)，1987，236：806-812)。用鸡来生产抗体的另一个好处是鸡抗体经常被用于分析其它种属动物中的抗原的类似物(Bonaldo等人，基因组研究(Genome Research)，1986，6：791-806；Buckler等人，美国国家科学院院刊，1991，88：4005-4009)。

用鸡来大规模生产抗体具有明显的优越性。饲养鸡的成本与饲养传统上用于多克隆抗体生产的兔子的成本相近或比之更低，因此这种替代具有经济优势，此外所需动物的数量会更少。当使用鸡蛋作为生产抗体的来源物时，其产率比使用哺乳动物要高很多。自交品系的鸡是可以得到的，因而最大程度地减小了使用兔子生产抗体时的一个常见问题，即抗体应答中基因的变异(Busse，酵母菌(Yeast)，1997，13(16)：1501-1503)。在收集和标记鸡蛋时不需要技术帮助。

Fynan等人，美国国家科学院院刊，1993，90：11478-11482，描述了使用表达一种流感血细胞凝集糖蛋白的纯化的DNA对小鼠和鸡进行DNA疫苗接种。Fynan等人发现67％-95％的受试小鼠和25％-63％的受试鸡受到了保护而抵抗致命的流感威胁。发生了保护作用的小鼠和鸡在威胁前在其中均检测不到抗流感抗体。在威胁前，DNA疫苗接种和加强接种将小鼠中不能被检测出的或极低的抗流感抗体的水平提高了。没有描述有关DNA疫苗接种后在鸡中抗体应答的数据。

Kodihalli等人，病毒学杂志(J.Virol)，1997，71(5)：3391-3396，证明由基因枪转入的编码H5 HA蛋白质的DNA给予受致命的H5病毒威胁的鸡完整的免疫保护。但是，在免疫后的头三周内，在疫苗接种组内未见可检测抗体。另外，在威胁前，随DNA疫苗接种组进行加强接种后，没有检测到针对于任何三种H5病毒抗原的抗体。

2.2基因组和蛋白质组研究

根据以表达序列标签(ESTs)为基础的数据库，人类基因组包含大约60,000-100,000个基因，散布于基于染色体的DNA密码的30-40亿个核苷酸中，对其测序最早可于2005年完成(James，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，1997，231：1-6)。但是，DNA序列信息对细胞可能利用其基因的所有可能途径仅提供了一幅静态简图。因此，为了对基础生物过程提供一个有意义的见解并将其应用于多个领域中，需要将这些大量的静态DNA序列信息与基因产物和它们相互作用的动态信息相关联。

蛋白质组这个词最先出现于1995年7月，并被定义为“基因组的总蛋白质互补”(Wasinger等人，电泳(Electrophoresis)，1995，16：1090-1094)。蛋白质组学目的在于为基因序列数据补充信息，即何种蛋白质在何处以何种量并在何种条件下制造(Persidis，自然生物技术Nature Biotechnology，1998，16：393-394)。其目的在于揭示特定疾病是如何导致细胞中蛋白质级联改变的，并由此鉴别新的潜在的药物靶点。通过提供这些先导物如何影响蛋白质组级联的信息，接着可以达到证实特定药物先导物对那些靶点的作用的目的(Persidis，自然生物技术Nature Biotechnology，1998，16：100-101)。因而，除了对任何时间点上的细胞状态的分子学基础的基本问题提供答案外，通过对临床相关分子现象的自动分析蛋白质组学将肯定加速新药的发现。

相对于基因组研究的快速发展，蛋白质组研究正落在后面。例如，假定由当前已知的人DNA序列编码的大部分蛋白质组的性质包括其存在、数量、细胞定位和组织或发育的表达特异性还是未知。尽管现有的大型2-DE能够制作出包含多至10,000个不同蛋白质和肽斑点的凝胶，但是由这种2-DE凝胶中分离出来的斑点中有95％无法进行测序，因为它们已经超出了现有的高灵敏度的Edman测序技术的范围(Persidis，自然生物技术Nature Biotechnology，1998，16：393-394)。

特异的抗体，如果能够得到的话，是研究蛋白质组的有力工具。传统上抗体是从由蛋白质或肽疫苗接种的哺乳动物如小鼠、兔子、大鼠或绵羊身上产生的。但是这种疫苗接种耗时耗钱。因而，由于有大量已知DNA序列的特性尚待研究，实际上不可能使用传统的蛋白质或肽疫苗接种技术产生抗体来进行大规模蛋白质组研究。

由于对蛋白质组研究的巨大兴趣和抗体在蛋白质组研究中应用，迫切需要一种快速、经济可行的方法产生抗体用于大规模蛋白质组研究。本申请强调了这一点以及本领域的其他需求。

不应将本文中上面引用的参考文献理解为同意这些文献代表本发明的现有技术。

3.发明概述

在本文中，本发明包括一种在禽类中生产针对于一种抗原的抗体的方法，它包括：1)将编码与启动子可操作地连接的所述的抗原DNA序列传递至所述的禽类，其数量足以诱导产生可探测到的针对所述抗原的抗体，所述的启动子能指导所述的抗原或者编码所述的抗原的mRNA序列，在所述的禽类中表达；和2)从所述的禽类中回收所述抗体。优选地，用于疫苗接种的禽类是鸡，并从鸡的鸡蛋黄中回收抗体。

本发明也包括一种在鸡中生产针对抗原的单克隆抗体的方法。它包括：1)将编码与一个启动子可操作地连接的所述抗原的DNA序列传递到所述的禽类中，其数量足以诱导产生可被检测出的针对于所述抗原的抗体，所述启动子能够指导所述抗原，或者编码所述抗原的mRNA序列在所述的禽类中表达；2)从所述鸡中移出至少部分抗体产生细胞；3)永生化移出的所述抗体产生细胞；4)繁殖所述永生化抗体产生细胞；和5)收集由所述永生化抗体产生细胞产生的单克隆抗体。优选地，通过与鸡B类淋巴母细胞细胞系的细胞融合或通过癌基因转化将抗体产生细胞永生化。

本发明还包括一种用于在禽类和细菌细胞中表达基因的载体，其包括如图3A和3C所示的质粒；以及一种用于使鸡抗体产生细胞永生化的载体，其包括如图12所示的质粒。

本发明进一步包括一种确定从生物样品中分离出来的预选DNA序列组的蛋白质组谱型的方法，它包括：1)将每个所述DNA序列克隆到一个能够在禽类和细菌细胞中表达所述DNA序列的双表达载体上；2)将步骤1中形成的位于所述双表达载体中的所述DNA序列，以足以诱导可检测出由所述DNA序列编码的针对抗原的抗体的量，传递到禽类中，并从所述的禽类中回收所述抗体；3)将在步骤2)中传递到所述禽类中的所述DNA序列传递到细菌细胞，并从所述细菌细胞中回收由所述DNA序列编码的蛋白质或肽；4)将步骤2中回收的所述抗体与步骤3)中回收的所述蛋白质或肽进行免疫反应以证实所述抗体的免疫特异性；5)将步骤2)中回收的所述抗体与所述生物样品进行免疫反应，以确定所述预选DNA序列组的蛋白质组学谱型。优选的是，此预选DNA序列组是人cDNA文库。

最后，本发明包括一种确定与生理上异常的生物样品相联系的生理上可区分的标志物的方法，其包括：1)通过以上描述的方法确定所述生理上异常的生物样品的蛋白质学组谱型；2)通过以上描述的方法确定可比较的生理上正常的生物样品的蛋白质组学谱型；和3)将步骤1)中获得的蛋白质组学谱型与步骤2)中获得的蛋白质组学谱型比较，以鉴别与生理异常的生物样品相联系的生理可区分的标志物。

附图的简要说明

图1描述选择目的DNA克隆的方法。

图2描述鉴定基因和蛋白质的抗体辅助方法的图解(AMIGAP)。

图3A描述pS&DV的限制酶切图；图3B描述pS&DV的构建；图3C描述pS&DV-S的限制酶切图；和图3D描述pS&DV-S的构建。

图4说明由DNA疫苗接种引发的潜在的免疫应答。

图5描述对由DNA疫苗接种三种由pCMV-HBx、pCI-HBV-pol和pZeoSV2-hCD34编码的抗原在鸡中产生的抗体进行ELISA滴定。

图6描述HbxAg抗原特异性表达载体pCMV-HBx的限制酶切图。

图7描述乙型肝炎病毒Polymorantz抗原特异性表达载体pCI-HBV-pol的限制酶切图。

图8描述人CD34抗原特异性表达载体pZeoSV2-hCD34的限制酶切图。

图9描述由DNA疫苗接种产生的IgY与HbxAg的结合亲和力。

图l0描述从鸡蛋黄中纯化的IgY的SDS-PAGE分析。

图11描绘由DNA疫苗接种产生的抗HBxAg的IgY的Westem印迹。

图12描绘可用于永生化鸡B细胞的plmmo载体的限制性酶切图。

图13阐明抗体芯片的原型和其操作流程。

5.发明详述

尽管以前在鸡中用DNA疫苗接种来产生抗体失败了，申请人惊奇地发现多核苷酸疫苗接种可在禽类中产生所需的抗体。因而，本发明包括用多核苷酸疫苗接种在禽类中获得所需的抗体的方法、确定分离自生物样品中的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型的方法，以及通过使用多核苷酸疫苗接种禽类所产生的抗体来鉴定生理可区分的与生理异常的生物样品相联系的标志物的方法。

为清晰地公开发明内容而不是通过限定方式，将发明详述分成以下部分。

5.1由多核苷酸疫苗接种在禽类中产生抗体的方法

本发明提供一种在禽类中产生针对抗原的抗体的方法，其包括：1)将编码与启动子可操作地连接的所述的抗原DNA序列，所述的启动子具有指导所述的抗原，或者编码所述的抗原的mRNA序列在所述的禽类中表达的能力，其数量足以诱导产生可探测到的针对所述抗原的抗体，和2)从所述的禽类中回收所述的抗体。

在优选的实施方案中，被疫苗接种的禽类选自鸡(Gallus)，火鸡(Meleagrisgallopavo)，鸭，鹅和日本鸭(Coturnix japonica)，更优选地，将被疫苗接种的禽类为鸡。

鸡的名称包括但不限于Gallus(G.domesticus)，鸡和母鸡。本专利涵盖这类同义词，为了一致起见，而不是为了限制本发明申请保护的范围，在此只用鸡这个名称。

可以将DNA或mRNA序列传递到动物体组织的间质间隙，这些组织包括肌肉、皮肤、大脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾脏、膀胱、胃、肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、眼、腺体和结缔组织。组织的间质间隙包括细胞间的、液体、在竖直纤维或器官组织中的粘多糖基质、血管壁或腔的弹性纤维、纤维组织的胶原纤维或位于护鞘肌肉细胞的结缔组织中或者在骨腔隙中的同样基质。淋巴管道内的淋巴液循环的血浆所占据的间隙也是相似的。

可以将DNA或mRNA序列通过注射方便地传入包含这些细胞的组织中。优选地将它们传递到并表达于持久的、非分裂的分化细胞中，尽管在非分化的或没有完全分化的细胞例如，血液干细胞或皮肤成纤维细胞中可以实现传递和表达。

在特定的实施方案中，将DNA或mRNA序列直接传递至禽类的组织中。优选地，将DNA或mRNA序列直接传递至肌肉，皮肤或粘膜。优选传递至肌肉细胞的间质间隙，因为肌肉细胞在吸收和表达多核苷酸方面尤其胜任。

DNA或mRNA序列可通过注射、通过基因枪技术，或通过脂质介导的传递技术直接传递至禽类的组织中。可通过针或其他注射器械实施注射。基因枪技术在美国专利5302509中公开，脂质介导的传递技术在美国专利5703055中公开，此处引用其内容作为参考。

在另一个的特定的实施方案中，将DNA或mRNA序列传递至禽类的细胞并且包含DNA或mRNA序列的所述细胞被传递到禽类的适当组织。优选地，将DNA或mRNA序列传递至禽类的血液细胞，更优选地，将DNA或mRNA序列传递至禽类的脾脏B细胞。

可由多种方法(一般参见Koprouski和Weiner，DNA疫苗接种/遗传疫苗接种，1998，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg)将DNA或mRNA序列传递至禽类的细胞中，包括磷酸钙-DNA转染法(Sambrook等人，分子克隆，第2版，Plainview，纽约，冷泉港出版社，1989)、DEAE葡聚糖-DNA转染法(Sambrook等，分子克隆第2版，Plainview，纽约，冷泉港出版社，1989)，电穿孔法(例如，Bio-Rad说明书)、使用“LIPOFECTIN”TM试剂转染法(例如，BRL—Life Science说明书)、基因枪技术(美国专利5302509)或病毒基因传递系统(Kaplitt等人，病毒载体，Academic Press Inc.，1995)。

基于金颗粒的基因枪传递是传递DNA或mRNA序列的优选方法(美国专利5,302,509)。在特定的实施方案中，将Bio-Rad的氦基因枪系统用于DNA疫苗接种程序(RIO-RAD公司，英国)。氦基因枪是方便的手提式设备，可提供快速而直接的体内基因传递。该设备使用可调节的氦脉冲将小的塑料支架内壁的包裹DNA的金质微载体高速射入靶细胞中。管式制备和管子切割机为一次制备50个支架“子弹”提供了简单的方式。

在另一个特定的实施方案中，传递编码与启动子有效地连接的抗原的DNA序列，启动子能够指导抗原在禽类中表达。优选地，被传递的DNA序列为质粒。

所使用的启动子可以是禽类的内源启动子。或者，启动子可以是能够指导抗原在禽类中表达的外源启动子，诸如病毒启动子。优选地，病毒启动子是RSVLTR、MPSV LTR、SV40 IEP、CMV IEP、金属硫蛋白启动子(美国专利5,703,055)或脾脏坏死病毒的LTR(SNV LTR)(美国专利5703055)。

在另一个的特定的实施方案中，疫苗接种禽类的DNA序列进一步包含指导所编码的抗原在禽类中分泌的序列。优选地，指导分泌的序列是引导序列。更优选地，引导序列是禽类的内源性引导序列，诸如鸡IgY的VH1的引导序列(Kabat等人，免疫学相关的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interests)，1983，U.S.Department of Health and Human Services，华盛顿特区)、鸡SPARC(Genbank接受号L24906，Bassuk等人，欧洲生物化学杂志，1993，218(1)：117-127)、鸡血清白蛋白(Genbank接受号V00381和J00806，Hache等人，生物化学杂志，1983，258(7)：4556-4564)和鸡的组织型纤溶酶原激活剂(tPA)(Genbank接受号U31988)。尽管优选内源性禽引导序列，其他类型的引导序列也可用于本发明。除了引导序列外，任何已知膜蛋白的细胞膜导向序列均可使用。这些细胞膜导向序列的例子包括但不局限于白细胞介素1、CD4和主要组织相容性复合体。

在另一个的特定的实施方案中，传递编码抗原的mRNA序列。

根据本发明，被传递多核苷酸物质可呈任何多种形式并且本发明并不局限于编码任何特定多肽的任何特定多核苷酸。

随着自动化核酸合成装备的使用，当通过PCR克隆结合发酵获知核苷酸序列时，DNA和RNA均可直接合成。而且，当已知所希望的多肽的序列时，可推知多核苷酸合适的编码序列。

正如美国专利5,703,055号所公开，当所使用的多核苷酸是mRNA时，可快速地在体外从相应的DNA制备它。例如，在单个核苷三磷酸存在下，常规的方法是利用噬菌体RNA聚合酶SP6，T3或T7从DNA模板来制备RNA。可以将合适的噬菌体启动子诸如T7复制起始位点置于模板DNA中待转录基因的紧靠上游部位。以这种方式利用T7的系统已广为所知，并在文献例如现代分子生物学方法，1998年第一卷3.8节中予以描述。

获得用于本发明的mRNA的一个特别优选的方法是使用pXGB质粒或任何可由本领域的普通技术人员快速构建的相似的质粒，并在实施本发明中几乎可无限次使用cDNA(美国专利5,703,055)。这类质粒优越性是包含所希望的RNA聚合酶的启动子，随后是5’非翻译区、3’非翻译区和多聚A尾的模板。在这些5’和3’区域之间应有一个独特的限制性酶切位点，以有利于将任意cDNA插入到质粒中。于是，在克隆了含所需基因的质粒后，通过在多腺苷酸化区域切割将质粒线性化，并在体外转录以形成mRNA转录本。优选地，为这些转录本提供5’帽子。或者，在不需要5’帽子的情况下，可使用5’非翻译序列诸如EMC。

虽然前面所述代表了制备mRNA的优选方法，但是显然对本领域的技术人员来说还有许多替代方法。例如，在商业可获得的核苷酸合成仪中制备mRNA。另外，也可制备环状mRNA。优选抗外切酶的RNAs如环状mRNA、化学阻断mRNA以及5’加帽的mRNA，因为它们有较长的体内半衰期。

特别是，一个优选的mRNA是一个含有目的基因并在其前方为脊髓灰质炎病毒5’非翻译区的自身环化的mRNA(美国专利第5,703,055号)。已经证明环状mRNA有着极长的半衰期(Harland和Misher，发育1998，102：837-852；Pelletier和Sonnenberg，自然，1998，334：320-325)。通过使用Been和Cech，细胞，1986，47：206-216中方法，可以从自我拼接的DNA模板中制备本材料并产生环形“套索状”mRNA。此处引用这些文章的内容作为参考。

也正如美国专利5,703,055所公开，本发明包括使用mRNA，该mRNA的5’和/或3’端被化学阻断以阻止RNA酶的接触。(这个酶是外切酶，因而不在链中部剪切RNA)。这种化学阻断显著地延长了RNA在体内的半衰期。两种可用于修饰RNA的试剂，C2 AminoModifier(货号#5204-1)和氨基-7-dUTP(货号#K1022-1)可从Clonetech Laboratories，Palo Alto，加州得到。这些材料在RNA上加入反应基团。在引入任一这些试剂至目的RNA分子上后，按制造商的说明书可以将反应取代基连接到RNA。通过加入足够的大量就可阻止RNA酶接触到化学修饰的RNA。

在另一个特定的实施方案中，将鸡疫苗接种并从鸡的鸡蛋黄中回收抗体。优选地，通过硫酸铵沉淀、聚乙二醇6000沉淀或辛酸沉淀从鸡蛋黄中纯化抗体。

从卵黄中回收抗体的方法为本领域所公知。在Svendsen等人.，实验室动物科学(Laboratory Animal Science)，1995，45(1)：89-93中公开了一个这样的例子，引用其内容作为参考。根据Svendsen，每天收集鸡蛋。将蛋黄通过家用鸡蛋收集器，从蛋清中分离出，并用水充分洗涤以避免蛋清蛋白质污染。将蛋黄膜穿孔，收集蛋黄。用蒸馏水将蛋黄稀释几倍，然后储存于-20C，直到进一步纯化免疫球蛋白时为止。为去除蛋黄脂质，将冷冻的稀释蛋黄在室温溶化，离心，过滤以去除沉淀的脂质部分。通过将溶液置于透析袋中并用固体聚乙二醇20000去除水将该蛋黄溶液浓缩至蛋黄原始体积。

对于硫酸铵沉淀法，是在搅拌条件下将固体硫酸铵加至蛋黄溶液中进行沉淀的。为找到最佳沉淀条件，可将硫酸铵浓度逐步增加至50％(例如，0％-10％，10％-20％，20％-25％，25％-30％，30％-40％，40％-50％)。在室温温育一段时间后，将溶液离心。沉淀溶于磷酸盐缓冲液(PBS)，其中含叠氮化钠(NaN₃)以避免微生物生长，上清液可用于下一步沉淀。

对于聚乙二醇沉淀，是搅拌加入固体聚乙二醇6000(PEG)进行沉淀的，为找到最佳沉淀条件，可逐步增加聚乙二醇浓度至12％(例如，0-2％，2％-4％，4％-6％，6％-8％，8％-10％，10％-12％)。在室温温育一段时间后，将溶液离心。沉淀溶于含叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。收集上清液并用于下一步沉淀。

对于辛酸沉淀法，将蛋黄溶液用醋酸盐缓冲液稀释。将辛酸搅拌加入溶液至最终浓度为0.02％，0.05％，0.1％，0.5％或l％。在室温温育一段时间后，将溶液离心。沉淀溶于含叠氮化钠的磷酸盐缓冲液。

在另一个特定的实施方案中，疫苗接种鸡，并从鸡的抗体产生B细胞，优选地从脾脏B细胞中回收抗体。

尽管本申请保护的方法可用于产生针对任何蛋白质或肽抗原的抗体，本申请保护的方法可优选地用于产生针对分泌蛋白质或肽抗原的抗体。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供一种在禽类和细菌细胞中表达基因的载体，其分别包括在图3A和3C中描绘的质粒，以及一种永生化鸡的抗体产生细胞的载体，其包括在图12中描绘的质粒。

5.2使用多核苷酸疫苗接种在鸡中产生单克隆抗体的方法

本发明提供一种在鸡中产生针对抗原的单克隆抗体的方法，其包括1)：将编码与启动子可操作地连接的所述的抗原DNA序列传递至所述的鸡，其数量足以诱导产生可探测到的针对所述抗原的抗体，所述的启动子能指导所述的抗原，或者编码所述的抗原的mRNA序列在所述的禽类中表达；2)从所述鸡中移出至少一部分产生抗体的细胞；3)将所述的移出的抗体产生细胞永生化；4)繁殖所述的永生化的抗体产生细胞；和5)收集由所述的永生化的抗体产生细胞产生的单克隆抗体。

在上述方法的步骤2)中可移出任何抗体产生细胞。在特定的实施方案中，在步骤2)中从脾脏移出抗体产生细胞。

鸡的脾脏B细胞可使用本领域公知的任何方法永生化。在特定的实施方案中，通过与鸡的B类成淋巴细胞细胞系的细胞融合将鸡脾脏B永生化。鸡的B类成淋巴细胞细胞系的例子包括但不限于HU3R27，HU3R27N和R27H4。在Nishinaka等人.，免疫学方法杂志(J.Immunological Methods)，1991，139：217-222中公开了HU3R27，HU3R27N和R27H4，此处引用其内容作为参考。

永生化鸡的抗体产生细胞的方法为本领域所公知，并披露在现代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)(Coligan等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.，1997)中公开的方法中均可用于本发明。在Nishinaka等人，免疫学方法杂志，1991，139：217-222中公开了一个这样的例子，此处引用其内容作为参考。根据Nishinaka，将鸡的B类成淋巴细胞细胞系克隆诸如HU3R27，、HU3R27N和R27H4与来自免疫后的鸡的脾脏细胞以一定的亲代细胞/淋巴细胞比例，例如1∶5，在室温下使用溶于磷酸盐缓冲液的聚乙二醇6000和聚L-精氨酸融合。融合细胞经轻轻洗涤后，悬浮于补加胎牛血清的IMDM培养基中并以3×10⁵个脾脏细胞(依据融合前的细胞计数)/孔的密度接种于96孔培养板中。在38℃温育24小时后，将HAT培养基加入到每孔中，在同样的培养基中培养10-14天，并按2-3天的间隔重复更换培养基。10-14天后，用来自这些孔中的培养基上清液鉴定分泌抗体的杂交瘤。

可以通过软琼脂培养法实施克隆化。将正在生长的杂交瘤细胞分散于60mm平板，其中的软琼脂含IMDM，Nobel琼脂(Difco)，EBS和来自亲代细胞培养物的条件培养基(Id)。让软琼脂平板室温冷却，接着在大约38℃温育于CO₂温育箱中。一个一个地将可见的克隆从软琼脂中移出，并使其适应液体培养基生长。

在另一个特定的实施方案中，通过癌基因转化将鸡的脾脏B细胞永生化，优选地，用于转化的癌基因是突变的鸡p53癌基因或Ras癌基因。

5. 3确定从生物样品中分离的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型的方法。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种确定从生物样品中分离的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型的方法，其包括1)将每一种所述DNA序列克隆至能在禽或细菌中表达所述DNA序列的双表达载体；2)将在步骤1)中生成的双表达载体中的所述DNA序列以足够诱导产生可检测到的针对由所述的DNA序列编码的抗原的抗体的量，传递至禽类中，并从所述的禽类中回收所述的抗体；3)将所述的DNA序列(其在步骤2)中被传递至所述的禽类)传递至细菌细胞中，并从所述的细菌细胞中回收由所述DNA序列编码的蛋白质或肽；4)将在步骤2)中回收的所述抗体与从步骤3)中纯化的所述的蛋白质或肽进行免疫反应以确证所述抗体的免疫特异性；和5)将在步骤2)中回收的抗体与所述的生物样品进行免疫反应以确定所述的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型。

用于疫苗接种的DNA序列组可依据人们的兴趣或目的按照任何标准或程序进行选择，以实施该疫苗接种。优选地，预选DNA序列组是cDNA文库。

cDNA文库可来自任何生物样品诸如人类、动物、植物或微生物样品。优选地，生物样品为人源的。另外，可依据人们兴趣或目的，可以从处于任何生理状态的生物样品中获得cDNA文库以实施该疫苗接种。

在一个特定的实施方案中，本发明提供一种选择和构建DNA序列组的方法以产生针对由此DNA序列编码的蛋白质或肽的抗体，其方法包括(1)选择特定的感兴趣的组织样品；(2)从所选样品中提取mRNA；(3)进行cDNA合成，优选地使用修正的RNA均一化步骤；(4)分级分离合成的cDNA，优选地通过凝胶电泳法；(5)在既能在禽细胞又能在细菌细胞中表达此cDNA的载体诸如在图3A中描绘的pS&DV和在图3C描绘的pS&DV-S中构建cDNA文库；(6)建立经分级分离的母版cDNA文库；(7)对母版cDNA文库进行质量确信分析；(8)纯化克隆的cDNA；(9)确定克隆的cDNA的序列；和(10)对DNA序列数据进行生物信息学分析以便为进一步的DNA疫苗接种选择DNA序列组。其他选择和构建目的DNA序列组的标准和方法为本领域所公知，这些其他方法也包含在本发明中。

可以从或者新鲜的或者冷冻的来源物获得组织样品。组织样品可从人类、动物、植物或微生物获得。特定组织的选择将在每个特定的研究中确定。例如，如果欲获得人肝脏特异性基因，可使用成人的肝脏或胚胎肝脏组织作为mRNA提取的来源物。在优选的实施方案中，使用尽可能新鲜的组织。

制备mRNA的技术为本领域所公知。例如，可以使用在Ausubel等人.，分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，纽约，John Wiley andSons。1995；Drocopoil等人.，人类遗传学现代方法(Current Protocols in HumanGenetics)，纽约，Wiley and Sons，1995和Sambrook等人.，分子克隆，第二版，Plainview，纽约，冷泉港出版社，1989中描述的方法。或者，可以使用从商业获得的mRNA提取试剂盒，诸如来自Life Science BRL(Gaithsburg，马里兰州)和Promega Inc.(麦迪逊，威斯康星州)的试剂盒。在提取特异性的信使RNA的优选程序中，可将组织样品在液氮中快速冷冻、研磨并悬浮于RNA提取缓冲液如4M的胍溶液中。或者，用裂解缓冲液可以从组织直接提取mRNA，提取的mRNA可通过离子交换柱，诸如来自Qiagen(Chartsworth，加州)的柱，予以进一步纯化。

下面所阐明的是通过使用修正的RNA均一化方法，获得包含低水平看家基因的cDNA文库的方法。从文库中随机选择的cDNA克隆的大规模一过性测序已被证明是非常有效的发现基因的方法(Adams等人.科学，1991，252：1651-1656；Okubo等人.Nature Genet.，1992，2：173-179)。然而普通的cDNA文库可能包含高频率的不需要的“垃圾”克隆，其不仅会极大地地损害方法的总体效率，还严重地降低所得数据的完整性。在这些“垃圾”克隆有(a)只包含多聚A尾的克隆；(b)含有非常短的cDNA插入的克隆；(c)只含有3’端一半的用于合成cDNA第一链(连接于adopter)的NotI-寡(dT)18引物的克隆；和(d)嵌合克隆。为解决这些问题，可以使用经典的均一化和减去RNA方法来合成cDNA(Bonaldo等人.基因组研究(Genome Research)，1996，6：791-806；Neto等人.基因(Gene)，1997，186：135-142)。该方法的缺点在于多个mRNA操作步骤导致在最终的cDNA产物中生成短RNA。然而，有替代方法可以使用。因为所有人类基因中的一大部分已被鉴定，从不同的组织中鉴定的冗余基因现在可以简单地通过使用与合成cDNA的寡dT引物混合的生物素标记的特异的冗余基因来避免。在完成反转录反应后，可以通过使用抗生物素蛋白-磁化珠从cDNA混合物中去除冗余基因的cDNA。该方法能够生成看家基因cDNA背景非常低的cDNA(Diatchenko等人.美国国家科学院院刊，1996，93：6025-6030)。也可以使用另一个方法增强从mRNA至cDNA的逆转录反应(Gastel和Suter，生物技术(BioTechniques)，1996，20：870-875)。

下面阐述利用凝胶电泳法分级分离cDNA的方法。大规模DNA测序的负担在于对相同克隆的多次重复测序。使用非扩增的cDNA文库有助于提高DNA序列和检验第一链cDNA的合成的效率，合成效率也可作为确定逆转录反应的质量的标志)(Bodescot和Brison，生物技术，1997，22(6)：1119-1125)。在优选的方法中，总cDNA产物可通过凝胶电泳，诸如0.8％至1.0％的琼脂糖凝胶，加以分级分离。接着，在连接到诸如来自Qiagen公司(Chatesworth，加州)的载体前，汇集所需大小的cDNA并提取。cDNA样品可按0.5kb的大小分部收集。接着，在指定用于不同转化实验的不同连接反应管中，可以将汇集的cDNA插入到载体中。在混合的cDNA文库中，全长cDNA常常存在于小的cDNA混合物的复合背景中。该cDNA制备的分级分离步骤可产生cDNA文库的亚群，一旦己知3’表达标签序列并且从标准RNA Northern印迹实验中获得基因转录本的大小，确定长度的cDNA克隆也有助于从cDNA亚群中鉴定全长的克隆(Chenchik等人.生物技术，1996，21：526-534)，此方法也可应用于从不同组织样品中构建多种cDNA文库。

下面阐述了利用双表达载体诸如分别在图3A和图3C描绘的pS&DV和pS&DV-S，构建cDNA文库的方法。直接将cDNA克隆至双表达载体的目的是在禽类中能够进行DNA疫苗接种和用同样的DNA在细菌中表达编码的蛋白质或肽抗原。这种双功能载体携带为了禽细胞基因表达的那些片段，诸如内源性禽启动子或者病毒启动子例如CMV启动子、SV40内含子和SV40多聚腺苷酸化位点。该载体还携带T7 RNA聚合酶启动子表达系统，其中克隆基因将在携带T7RNA聚合酶诸如BL21(DE3)的大肠杆菌(E.coli)菌株中表达(Studier等人.酶学方法(Methods in Enzymology)，1990，185：60-89)。通过用不同的限制性内切酶在cDNA的两端消化，诸如PacI在5’端和NotI在3’端，将cDNA片段具方向性地插入到载体中。克隆具有正确的方向cDNA将保证基因的表达。考虑到大多数cDNA片段在其片段中可能缺乏5’区或翻译起始密码(ATG)，在载体中通过调节ATG间Shine-Dalgarno/Kozak保守序列的距离产生出人工ATG以增强细菌中蛋白质的表达水平。在ATG的正下游有多克隆位点，在载体上已构建了三套不同的开放阅读框(ORF)。在载体中的cDNA没有位于所希望的或正确的ORF情况下，使用限制酶消化可以容易地将其转至正确的ORF载体。除了含有pS&DV都有的元件外，pS&DV-S含有鸡的IgY引导序列，它可在鸡细胞中指导由cDNA插入物编码的蛋白质或肽的分泌。

下面阐述构建包含分级分离的cDNA克隆亚群的母版cDNA文库的方法。使用标准方法，优选地通过电穿孔，将载体和cDNA的连接混合物有效地转化入细菌细胞，诸如HBl01细胞(其可从不同的商业公司，诸如Life Science BRL(Gaithersburg，马里兰州)等获得)。将转化细菌细胞涂布于培养平板，并温育细胞过夜后，可以挑取克隆，然后转至含有冷冻的保存液诸如15％甘油的320孔平板中(Ausubel等人.现代分子生物学方法，纽约，John Wiley and Sons，1995和Sambrook等人.分子克隆第二版，Plainview，纽约州，冷泉港出版社，1989)。因为每个分级分离的cDNA制备物是以亚群库的形式汇集，总文库的分离出的克隆数应该，优选地至少多于10倍潜在的人基因数目。来自出版的数据库的初步数据显示人类基因组大约有100000个功能基因。因此对每个组织特异性的cDNA文库必须挑取大约一百万个克隆作为进一步DNA测序分析。自动克隆挑取系统可从不同的商业公司诸如加州的斯坦福大学DNA测序中心获得。

下面阐述了对母版cDNA文库进行质量确信分析的方法。这种在大规模DNA测序前的质量确信分析将确保以有效率的花费方式获得所需结果。有几个这样的方法，其中可以分析部分cDNA文库，接着将数据用于确定总cDNA文库的质量。按照一个方法，可以从文库中随机挑取大约1000个克隆，利用针对cDNA5’端的专用引物进行DNA测序。对这些有限的测序数据进行分析会给出诸如基因分布形式、插入基因的长度和载体自身连接的百分比的有用信息。另一种方法是在平板上培养大约2000克隆并影印至硝酸纤维素膜上，并以看家基因序列作为探针通过DNA杂交筛选。例如，如果cDNA文库来自肝脏组织，β—激动素和/或白蛋白核苷酸序列就可用作探针。探针可以通过本领域任何已知技术进行标记。在优选的方法中，使用随机引物方法，对探针进行标记(Feinberg和Vogelstein，分析生物化学(Analyt.Biochem.)，1983，132：6-13；Dracopoli等人.CurrentProtocols in Human Genetics，New York，John Wiley and Sons，1995)。优选地，使用试剂盒诸如DEC primeII DNA标记试剂盒(得克萨斯，休斯敦，Ambion)，将³²p-dNTP掺入到随机引物标记反应中。其他同位素诸如³⁵S或³³p也可以用于标记反应。或者，可以使用非同位素标记的试剂(Kricka编辑，非同位素标记探针、印迹和测序(Nonisotopic Probing，Blotting，and Sequencing)，第二版，圣迭哥，加州，Academic Press，1995)。杂交的结果可用于评价均一化cDNA文库中看家基因的污染背景。由于一般情况下大多数看家基因在cDNA文库中出现的机率大致相同，看家基因的杂交率可用确决定cDNA文库的质量。也可用基于PCR的方法来确定cDNA文库的质量(Pacchioni等人.生物技术，1996，21：644-649)。在优选的方法中，使用看家基因诸如β—肌动蛋白基因，作为3’端DNA专一性的寡聚物和T7启动子寡聚物作为5’端引物，在随机挑取的cDNA文库克隆中进行PCR扩增。或者通过凝胶电泳或者通过内部寡核苷酸杂交，随后检测存在或不存在PCR产物(+/-表示)。PCR扩增的结果将不仅揭示看家基因在cDNA文库中存在的比例，而且也可以用于确定cDNA插入物的平均长度。可以使用商业提供的试剂或试剂盒诸如由Origene Technologies公司(Rockville，马里兰州)生产的试剂或试剂盒，进行cDNA文库中随机克隆的PCR扩增反应。

克隆的质粒DNA可由本领域公知的任何方法纯化。优选地，可使用自动化质粒纯化设备诸如Qiagen公司的自动化系统9600(Valencia，加州)提供用于随后的DNA测序分析的高度纯化的模板。或者，可将cDNA克隆用于PCR扩增以及再进行巢式-PCR以提供DNA测序模板。因为序列是已知的，所以可以容易地对PCR的两套引物标准化以用于文库中所有克隆。

通过本领域任何已知方法可以确定DNA序列。优选地，将每个随机选择的克隆从cDNA库中纯化，制备DNA测序模板。该模板用双脱氧法测序，优选地使用自动化DNA测序仪诸如A.L.F(Pharmacia Biotech，Piscataway，新泽西州)或ABI/373或ABI/377(Applied Biosystems，Foster City，加州)。除了这种“鸟枪法”(其中鸟枪法为使用通用引物从每个克隆中获取最初的读数)外，“步行法”使用定做的引物从所选克隆中获得额外的读数。这些和相关的测序方法的完整步骤在Ausubel等人.现代分子生物学方法，纽约州，John Wiley and Sons，1995和Sambrook等人.分子克隆第二版，Plainview，纽约州，冷泉港出版社，1989中予以了描述。有效的设计得到的是短的(优选地，18碱基对-22碱基对)寡核苷酸，用于DNA序列的“步行”引物。寡核苷酸序列的设计一般是优选地检测与以前的DNA序列数据库中的基因的末端相关的序列。这种选择倾向性可以通过人工阅读序列或检验要比较的序列而实现。一旦设计好后，这些寡核苷酸可从DNA合成服务机构诸如Research Genetics(Huntsville，阿拉巴马州)定购。或者，寡核苷酸可在DNA合成仪诸如在Applied Biosystems(Foster City，加州)上合成。

DNA测序反应产物可通过电泳分离，优选地使用荧光检测的聚丙烯酰胺凝胶上。其他DNA大小分离技术诸如超薄凝胶平板(Kostichka等人.生物技术，1992，10：78-81)，毛细管阵列(Mathies和Huang.自然，1992，359：167-169)和质谱(Wu等人.质谱快讯(Rapid Commun.Mass Spectrum.)，1993，7：142-146)也可使用。已经通过杂交技术实现了不使用凝胶电泳进行DNA序列分析(Drmanac等人.科学，1993，260：1649-1652；Souhern等人.基因组，1991，13：1008-10017)。另外一种方法是碱基相加测序策略(BASS)，它使用同一化的DNA聚合物构建来确定未知DNA模板的序列(美国专利5,302,509，国际专利93/21340和91/06678)。

所选克隆经“步行法”得到的序列可通过配对交叉法拼接成插入DNA的完整cDNA序列。已有计算机程序用于这些任务(例如，Rodger Staden programs，英国剑桥；DNAStar，麦迪逊，威斯康星州)。在序列装配后，可在相关序列数据库(例如，Genbank，Bethsda，MD；EMBL，Cambriage，UK；Phil Geen的GENEFINDER，Seattle，Wash)进行相似性和同源性的寻找以鉴别基因和重复元件，推测功能，以及决定序列与基因组和细胞的其他部分的相关性(Gonzalez和Sylvester.基因组研究，1997，7：65-70)。

上述方法已成功地应用于测定几种细菌的基因组序列(人类基因组科学(Human Genome Sciences，Gaitherburg，MD)诸如大肠杆菌(Plunker等人.核酸研究，1993，21：3391-3398)和高等生物体诸如酵母(Oliver等人.自然，1992，357：38-46)，人类(Martin-Gallardo等人.Nature Genetics，1992，1：34-39)、小鼠(Wilson等人.基因组，1992，13：1198-1208)和线虫(Wilson等人.自然，1994，368：32-38：Sulston等人.1992，356：37-41)。从作图后的粘粒(或其他)克隆中自动化测定甚至大的基因组区域的序列在几个中心已成为常规(Sanger center，英国剑桥；华盛顿大学，St.Louis，Mo.)，很少出错，平均每个碱基花费0.38-0.50美元或更少。为了这些努力而实施的特定策略和方法在Griffin和Griffin编辑的DNA测序：实验室手册(DNA Sequencing：Laboratory Protocols)，新泽西，1992中已有描述。

下面阐述了基于计算机的对cDNA序列数据进行生物信息学分析的步骤。在优选的步骤中，可以对通过使用通用引物得到的所选克隆的插入DNA的5’端序列，采用专一性的计算机程序，首先进行分析。例如，可以进行相似性或同源性寻找(Genbank，Bethesda，MD；EMBL，Cambridge，UK；Phil Green的GENEFINDER，Seattle，Wash)以鉴别功能已知基因和未鉴别cDNA片段。也可以分析载体和插入DNA和潜在的ORF间的连接DNA序列，这样可以协助推测基因的功能和决定序列与基因组和细胞的其他部分的相关性(Altchul等人.NatureGenetics，1994，6：119-129)。对一些新鉴别的序列，在“步行”步骤完成后可通过配对交叉法将那些新序列装配成插入DNA的完整cDNA序列。已有计算机程序用于这些任务(例如，Rodger Staden programs，英国剑桥；DNAStar，麦迪逊，威斯康星州)。在序列装配后，编码推测的蛋白质的全长cDNA可进一步进行分析诸如功能结构域寻找。可将分析数据归类到计算机数据库中。其他实验，诸如在cDNA功能确定后寻找DNA转录控制元件也可以进行(Fickett和Hhatzigeorgious，基因组研究，1997，7：861-878)。

一旦选定DNA序列后，可以用在§§5.1和5.2描述的方法来产生针对由该DNA序列编码的蛋白质或肽的所需的抗体，不管是多克隆还是单克隆抗体。

在一个特定的实施方案中，也可以将用于DNA疫苗接种的DNA序列传递到感受态的细菌细胞中以产生所编码的蛋白质或肽，其可用于确定由DNA接种产生的抗体的特性。优选地，细菌细胞是感受态的大肠杆菌细胞。还优选地，将在图3A或3C中描绘的双表达载体用于将DNA序列传递到细菌细胞中。如图3A或3C中描绘的那样，当将双表达载体中含有的DNA序列转化到细菌细胞诸如携带T7 RNA聚合酶的BL21(DE3)细胞中时，由传递入的DNA序列编码的蛋白质在诱导物例如IPTG的存在下可以高水平地表达。可以通过本领域任何已知方法将DNA序列传递到细菌细胞中(例如，Ausubel等人.现代分子生物学方法，纽约，John Wiley and Sons，1995和Sambrook等人.分子克隆第二版，Plainview，纽约，冷泉港出版社，1989)。优选地，可以使用商业提供的系统进行DNA转化，诸如Life Science BRL(Geitesburg，MD)。

通过本领域任何已知方法可以回收细菌表达的蛋白质或肽(例如，Ausubel等人.现代分子生物学方法，纽约，John Wiley and Sons，1995和在Sambrook等人.分子克隆第二版，Plainview，纽约，冷泉港出版社，1989中)。例如，可挑取转化的细菌克隆并在LB培养基中生长。在收集细菌细胞之前，可加入诱导物诸如IPTG以诱导蛋白质表达。通过离心收集细菌细胞，直接再悬浮于SDS-PAGE裂解缓冲液中，并通过使用商业提供的系统诸如Bio-BAD公司(Hercules，CA)的系统进行SDS-PAGE分析。

由DNA疫苗接种产生的抗体和细菌表达的蛋白质或肽间的免疫反应可为本领域任何已知方法所分析(例如，Ausubel等人.现代分子生物学方法，纽约，John Wiley and Sons，1995和在Sambrook等人.分子克隆第二版，Plainview，纽约，冷泉港出版社，1989中)。优选地，这种免疫反应可由免疫印迹反应所分析。例如SDS-PAGE分离后，可以将待分析的蛋白质或肽，根据在Schielen等人.免疫学方法杂志，1995，188：33-41中所描述的方法，转到一种合适的膜上，例如PVDF膜。免疫印迹反应可为本领域任何已知方法所分析。优选地，使用商业提供的系统诸如BIO-RAD公司(Hercules，CA)的化学发光检测系统来检测免疫印迹反应。

抗体和细菌表达的蛋白质或肽之间进行的免疫反应的阳性结果只能确证蛋白质或肽是由从生物样品分离的DNA序列所编码。当通过上述的细菌表达的蛋白质或肽间的免疫反应对抗体的特性予以阐明后，可以从其中分离出DNA序列的抗体和生物样品间实施进一步的免疫反应，鉴定所选DNA序列组的蛋白质组学谱型。

如果在阅读框不确定，和因为与已知序列缺乏序列同源性或相似性而不能鉴定独特的ORF，可将DNA片段插入到三种开放阅读框中，利用三种不同的抗体可以进行蛋白质印迹实验。

任何已知的方法都可用来分析抗体和生物样品间的免疫反应。优选地，使用免疫印迹、免疫沉淀和原位免疫染色实验。另外，基于抗体的方法可与其他方法诸如双向电泳(2-DE)、超敏感质谱(MS)和其他高通量的功能性筛选测定法(Persidis，自然生物技术，1998，16：393-394)结合在一起，在蛋白质组学研究中使用。这类2-DE和MS分析的例子包括但不限于等电聚焦后接基于质量的分离(ISO-DALT)、基于非平衡的电泳(NEPHGE)和固定化的第一向为pH梯度(IPG-DALT)(Humphery-Smith等人.电泳，1997，.18：1217-1242)。

一种分析抗体和生物样品间的免疫反应的技术是组织染色，此技术为本领域所熟知(Feitelson和Zem.实验室医学临床(Clinics in Laboratory Medicine)，W.B.Saunders Com.1996)。优选地，使用组织样品的冷冻切片来进行免疫染色测定，因为用这种方法固定的组织样品可保持细胞的抗原结构。本测定所得之数据可很好地反映出测试组织的细胞蛋白质表达图。或者，用石蜡固定的组织样品可用于进行抗体免疫染色，因为这种组织固定法可长时间地保存组织，还可以很容易地从不同的医学研究来源物收集到。有几种技术可用于提高使用石蜡固定样品的免疫染色的灵敏性(Lantis等人，外科内镜检查(Surgical Endoscopy)，1998，12(2)：170-176)。

由本发明所产生的抗体和由分析这些抗体和生物样品间的免疫反应所得到的信息可用于许多方面。其中的一种用途是抗体标签的产生并将此抗体标签纳入已知的核苷酸序列数据库中。

大规模基因组测序的最近进展，需要更加有力的工具，用于分析和解释得到的DNA序列。同源性和相似性搜索程序，诸如BLAST是非常有效和值得信赖的计算工具。新的powerBLAST己开发出来，以增强这种计算机分析程序的功能(Zhang和Madden，基因组研究，1997，7：649-656)。在这种新的powerBLAST程序中，可将寻找的结果输出至交互式浏览器Chromoscope，或以ASCII格式归档，或以HTML页面通过万维网与Genbank，MEDLINE和其他Entrz查找部分相连结。文本和图形结果均以cDNA序列的多重排列比较显示出结果。在多重排列上添加了对配对序列的注明，该特性大大地促进了在所分析序列中功能结构域的鉴别。由本发明所产生的抗体标签，可自动链接于每个相应的cDNA序列，Western印迹数据和组织免疫染色数据可在数据库中交叉引用。可储存用由cDNA产生的抗体的免疫染色而得到的亚细胞图像，Western印迹分析数据可从数据库中查找以估计特定cDNA编码的蛋白质的大小。

由本发明产生的抗体，可用于对新的cDNA序列编码的蛋白质和肽进行功能分析。由cDNA产生的抗体的信息可按功能索引进行分类(Pouskta等人.冷泉港定量生物学研讨会(Cold Spring Harbor Symp.Quanti.Biol.)，1986，51：131-139)。通过基于抗体的分析，可得到靶基因的几种类型的信息。首先，是否克隆的cDNA片段确实编码蛋白质；其次，通过组织染色步骤，可得知什么是该基因的正确的开放阅读框架；第三，基因编码的蛋白质在哪里表达，可确定其组织分布图和细胞定位。特定基因的表达水平可用具有良好记录的蛋白质，诸如GAPDH或β-肌动蛋白作为内参比而决定。如果该基因与疾病或障碍有关的话，可以基于针对特定基因的那些首要信息，设计多个基因功能测定，进一步阐明基因的细胞功能和理解该基因与特定疾病的关系。

DNA序列提供关于存储在细胞核内，长期遗传的DNA信息和关于在基因组范围内基因的物理相关性。然而，知道这些基因是如何表达的，以及它们的细胞定位也有用途。如上所述，针对这个目的，已构建了cDNA文库以评价特定组织中的基因表达，已开发了诸如直接选择方法以确定这些cDNA相对于基因组的图形(Lovett等人.美国国家科学院院报，1991，88：9628-9632)。其他方法，诸如外显子捕获，可同样地用来检测基因的表达和定位外显子(Brukler等人.美国国家科学院院报，1991，88：4005-4009)。许多经良好开发的技术和系统可用于基因的功能分析(Christofferson.Nature Biotechnology，1997，15：484-484；Nemotoy.日本临床医学杂志(Japanese Journal of Clinical Medicine)，1998，56(1)：242-232；Bussey.酵母，1997，13(16)：1501-1503)。本发明可用于研究这类所选DNA序列的蛋白质组学。

突变是研究基因功能的有力工具。可将所选基因突变并克隆至特定载体以产生转基因动物诸如小鼠，并且转基因动物的表型可用于阐明靶基因的体内功能(Stewart.今日分子医学(Molecular Medicine Today)，1997，3(3)：93；Hickset等人.Nature Genetics，1997，16(4)：338-344)。或者，特定的cDNA编码的蛋白质的活性可为许多方法，诸如修正的寡聚物反义抑制法(Milner和Southern.Nature Genetics，1997，15：537-541)，、靶序列专一性核酶抑制(Duan等人.基因治疗(Gene Therapy)，1997，4：533-543)或基于单链抗体(SFv)的细胞内免疫法(Duan等人.美国国家科学院院报，1994，91：5075-5079)所抑制。本发明可用于研究该敲除生物体的所选cDNA序列的蛋白质组学研究。

在特定的实施方案中，本发明提供了一种确定从生理正常的生物样品中分离出的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型的方法，在另一个特异的实施方案中，本发明提供了一种确定从生理异常的生物样品中分离的预选DNA序列组的蛋白质组谱型的方法。该生物样品的异常性可以是永久性的或者暂时性的，并且可由遗传变化或其他而导致。优选地，生理异常的生物样品是从已知或被告知处于具有任何疾病或障碍的高危险的受治疗者中获得。

在特异的实施方案中，本发明提供一种鉴定生理可区分的与生理异常的生物样品相联系的标志的方法，其包含：1)通过上述方法确定所述的生理异常生物样品的蛋白质组谱型；2)通过上述方法确定可比较的生理正常生物样品的蛋白质组谱型；和3)将在1)中获得的蛋白质组谱型与在2)中获得的蛋白质组谱型比较，以鉴定生理可区分的与生理异常的生物样品相联系的标志。

通过以下实施例将对本发明更完整地予以描述，应当认为这种描述是阐明性的而不是限制性的。

6.实施例

6.1双功能表达载体的构建为构建pS&DV载体，以pDual载体(购自STRATAGENEInc.，La Jolla，CA)为模板载体，扩增巨细胞病毒/T7两种启动子表达盒。在100μl PCR反应管中，通过使用标准的PCR反应(Promega PCR试剂盒)将10ng pDual质粒DNA加热到95C 5分钟，接着与10pM的CMV-1(5’CACCCTGAATTGACTCTCTTTC3’)(SEQ ID NO：1)和PacII-1(5’ATATGAATTCTTAATTAAGATCTCCATGGTGGCCTCTCCTTC3’)(SEQ ID NO：2)两种寡聚物混合。PCR反应按如下进行：95℃1.45分钟、55℃1.30分钟、72℃2分钟，40个循环。最后，将PCR产物再在72℃温育10分钟。将产物命名为Fragment-I(0.75kb)。在第二个试管中，采用上述条件用寡聚物Pac I(5’CGCGGAATTCGCGGCCGCTACCAGGTAAGTGTACC3’)(SEQID NO：3)和ter-2(5’CGAGTAGTTTAAACAAAAAACCCCTCAAGTCCCG3’)(SEQ ID NO：4)通过PCR扩增10 ng的pDual质粒DNA。将该产物命名为Fragment-II(0.6kb)。将Fragment-I和Fragment-II两种(每种1μg)均用EcoRI消化，接着在1％琼脂糖凝胶上纯化。在用T4DNA连接酶将两个片段连接(在50μl体积中于16℃过夜)后，将5μl连接混合物转至一个新的PCR试管，并与寡聚物CMV-1和Ter-2混合以便使用上述相同的条件进行PCR扩增。在用PmeI将1.36kb的PCR产物消化后，将该1.36kb片段插入到PmeI消化的克隆载体pT7^*。将最后的载体命名为pS&DV。

为制备克隆载体pT7^*，以纯化的pT7Blu(R)质粒(购自Novagen Inc.)作为PCR扩增的DNA模板。在有10ng pT7Blu(R)质粒的100μl的PCR反应混合物中，将两种寡聚物T7A和T7B加入到反应中，并且采用上述相同的条件进行PCR(T7A：5’AGATCTGTTTAAACCAGGTGGCACTTTTCGG3’)(SEQ IDNO：5)和T7B：(5’AGATCTGTTTAAACAGCTGTTTCCTGTGTGA3’)(SEQ IDNO：6))。接着用Bgl II消化2.1 kb的PCR产物，为自我连接进行凝胶纯化。将所得载体命名为pT7^*，其携带有两个独特的PmeI位点。为构建携带有鸡IgY Vhl信号结构域(MSPLVSSLLLLAALPGLMAA)(SEQ ID NO：7)的pS&DV-S载体，合成了两个如下的寡聚物：

Linker-1：(5’AACCCTCTTCCATGAGCCCACTCGTCTCCTCCCTCCTGCTCCTGGCCGCCCTGCCAGGGCTGATGGCGGCC3’)(SEQ ID NO：8)和Linker-2：(5’CAGATCCTCTTCGAAGCTAGCGGCCGCGAATTCTTAATTAAGGCCGCCATCAGCCCTGGCAG3’)(SEQ ID NO：9)。Linker-1和Linker-2每种各1μg混合于50μl的没有Taq聚合酶的PCR反应条件。加热到94℃5分钟，并且接着慢慢冷却至室温。在加入2.5单位Taq聚合酶后，采用上述相同的条件进行PCR反应，但是只走10个循环。用Eam 1104-1消化105 bp的PCR产物并将其插入到载体pDual的Eam 1140-1位点。将所得载体命名为pDual-S。以pDual-S作为DNA模板，采用CMV-1和Ter-2寡聚物通过进一步的PCR扩增生成了携带有基因表达盒的1.5kb的DNA片段。在用Pme I消化后，将1.5kb的DNA片段插入到pT7^*载体的PmeI位点以生成双功能载体pS&DV-S载体。

6.2由DNA疫苗接种引发的体内免疫应答的机制的阐明

DNA表达盒的直接细胞内接种导致宿主细胞的体内转染。质粒编码的蛋白质的表达可能引发免疫应答。分泌性的免疫原经吞噬细胞内吞后，由专一性的抗原递逞细胞以肽-MHC复合物递逞。这些细胞能够提供初级激活信号、共刺激性配体以及刺激新生T细胞必需的细胞素。用白细胞介素4刺激Th0 T细胞导致Th2CD₄ ^-辅助T细胞的发育，而Th2CD₄ ^-辅助T细胞将分泌包括白细胞介素4、白细胞介素5、白细胞介素6和白细胞介素10在内的细胞素以及启动B细胞的发育。用促炎症细胞素白细胞介素2和IFN-γ刺激Th0细胞导致ThlCD₄ ^-辅助T细胞的发育。这些细胞分泌将会启动CD8⁺细胞毒T淋巴细胞的发育的细胞素。(Koprowski等人.DNA疫苗接种/遗传性疫苗接种，1998，Springer-Verlag Berlin，Heideberg)

6.3由颗粒介导的DNA传递实验免疫的鸡的ELISA滴定

正如图5所示，用分别由巨细胞病毒或SV40的启动子驱动的三种抗原cDNA疫苗接种鸡。在本实验中所用的鸡的品系为Hy-line SC品系，从Hy-line SC Inc.(Dallas Center，Iowa)获得。

对于每一种转染，将外包有0.5mg金微粒的1μg载体DNA按如前所述(Williams等人.美国国家科学院院刊，1991，88：2726-2730)装载到Kapton巨型抛射仪上。使用手提式的氦驱动的弹道基因枪将相当于200ng质粒的DNA传递进入靶位点(鸡后皮)(Sanford等人.Bio Technique，1991，3：3-16)。将枪中的压力调至12000psi。在注射DNA后，在注射后不同天，收集被免疫的鸡的卵，并贮存于-4C，并且使用§6.8中描述的方法纯化IgY。在该实验中，用等量的质粒DNA反复地进行DNA注射以观察宿主对抗原的免疫应答。

为了从大肠杆菌中纯化每一种相应的抗原，即HbxAg、HBV-pol和CD34以测定来自被免疫的鸡的抗体的特异性和结合亲和力，将HbxAg基因克隆到pET3a(Wu等人.Cell，1990，63，687-695)。使用pol-1和pol-多聚物对乙型肝炎病毒聚合酶蛋白质的RNaseH结构域PCR扩增，并将其插入到pET28a的Nde I-Hind III位点。正如随后一节中所描述，得到了人CD34的cDNA并将其插入到pET28a载体。所有的pET载体均购自Novagen Inc.，每种构建体均通过DNA测序证实。依据Novagen试剂盒(也见Studier等人.酶学方法(Methods Enzymology)，1990，185，60-89)的说明书测定重组蛋白质的表达。简而言之，将构建的质粒转化进入BL21(DE3)感受态细胞中，将克隆转至含羧苄青霉素(Sigma Inc.货号#C1389)或卡那霉素的3ml LB培养基中并在37℃培养过夜。第二天将培养物转至500ml带选择的LB培养基中并在37℃振荡至OD600达到0.45。此时加0.2mMIPTG于细菌培养物中并再培养细菌细胞2个小时。将细胞在冰上冷却5分钟，接着通过离心，5000×g、4℃、5分钟，收集细胞。将细胞沉淀物用冷的PBS缓冲液冲洗一次。将细胞再悬浮于50ml Tris-缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，pH8.0)并超声破坏。经5000×g、4℃、5分钟离心，将超声破坏后的样品分离成可溶的或不可溶的(沉淀物)部分。将沉淀物再悬浮于45ml Tris-HCl缓冲液(含100μg/ml溶菌酶和5ml 1％triton X-100)之后，将10μl可溶的及不可溶的两种样品均加载于12.5％ SDS-PAGE(BioRad微型凝胶系统)，用未转化的细菌样品作对照。凝胶染色显示所有三种细菌表达的蛋白质即HbxAg、HBV-pol和CD34均主要发现于可溶性部分。在4℃搅拌条件下缓慢地将尿素加入到50ml不可溶部分中，至终浓度为8M。在沉淀物完全溶解后，将样品进一步在5000×g、4℃下离心5分钟以移出沉淀物并将上清液加载到3ml的组氨酸结合树脂柱以纯化重组的蛋白质(使用Novagen Inc.试剂盒建议的方法)。在冲洗步骤后，用10ml1×剥离缓冲液(含6M尿素)将纯化的蛋白质从柱子中洗脱下来。将纯化的蛋白质样品转移到透析袋中并在4℃下对4升体积的PBS透析过夜。最后，通过Amicon旋转浓缩柱(Amicon Inc.，分子量截取值为10000道尔顿)将透析袋中的蛋白质样品进一步浓缩至lml体积。在检测了蛋白质浓度后，将3μl纯化的蛋白质上SDS-PAGE分离。通过蛋白质带的密度(使用分子密度计，MolecularDynamic Inc.)测量出的蛋白质的纯度大于93％。

将处于200μl PBS缓冲液中的纯化的细菌产生的抗原蛋白质5μg在4℃下外包于ELISA平板孔上。外包孔用PBS冲洗一次后，加入5％BSA溶液200μl以便阻断测定中的非特异性结合。将DNA免疫(见§6.8)后用聚乙二醇方法纯化的鸡IgY(1mg/ml)进行系列稀释，并加入到每个外包孔，然后在37℃温育2小时。在用PBS缓冲液冲洗五次后，将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡抗体(Sigma Inc.，1∶10000稀释)加入到孔中并温育1小时。在用PBS冲洗五次后，加入底物缓冲液并温育15分钟(每5分钟用ELISA读值一次)。

在图5中，每个不同的条带代表不同的鸡。在图5A中，鸡是用pCMV-HBx载体免疫；在图5B中，鸡是用pCMV-HBV-pol载体免疫；和图5C中，鸡是用pZeoSV2-hCD34免疫。测定时间点如下：免疫前(Pre)；或者在boot1(B1)、boot2(B2)、和boot3(B3)后12天。多DNA疫苗接种宿主的免疫反应数据分析证明在单DNA注射后12天，鸡特异性抗体的产生已经达到可探测水平。

6.4 pCMV-HBx表达载体的构建

按如下进行乙型肝炎X基因表达载体的构建：将10ng pTKHH2 DNA(乙型肝炎病毒全长病毒基因组二聚体质粒)与MF18(MF18：5GGAAGCTTGCCGCCATGGCTGCTAGGCTGTGC3’)(SEQ ID NO：10)和MF19(MF19：5’GTGGAGACGGATTAGTACCATGGCC3’)(SEQ ID NO：11)寡聚物混合于100μl PCR反应管中。按如下条件PCR扩增乙型肝炎病毒聚合酶基因：95℃1.3分钟、55℃ 1.3分钟、72℃ 2分钟，共循环40次。最后将PCR产物温育于72℃ 10分钟。将488bp的PCR产物进行凝胶纯化，然后用HindIII和KpnI消化。将所消化的HBx片段插入到用相同的酶消化的pTTW-1载体中(Condreay等人.病毒学杂志，1990，64，3249-3258)，以生成pCMV-HBx质粒。

通过将pCMV-HBx转染到人肝细胞的癌细胞系HepG2细胞中测试HBx蛋白质的表达。将1×10⁶ HepG2细胞接种到含有10ml DMEM培养基(补充有10％胎牛血清)的10ml培养平皿中，于37C在CO₂温育箱中过夜。在转染前4小时用补充有10％胎牛血清的预温热的10ml DMEM新鲜培养基置换。根据制造商的方法(Promega Inc.钙转染试剂盒)，将5μg纯化的pCMV-HBx质粒混合于钙沉淀混合物中。混合物在室温下沉淀30分钟后，将混合物缓慢滴入HepG2细胞中并培养12小时。第二天，用10ml预温热的新鲜的培养基置换并将细胞再培养1天。

用10ml冷的PBS缓冲液冲洗转染细胞，并用橡胶淀帚将细胞收集到1.5mlPBS中。离心后，将细胞沉淀再悬浮到100μl H₂O中，取20μl细胞样品与等体积的SDS-PAGE上样缓冲液混合，并煮沸3分钟。煮沸后的样品用Eppendorf以最大速度离心2分钟，取5μl上清液加载到12.5％的SDS-PAGE进行凝胶分离。用特异性的兔抗-HBx抗体(1∶800稀释)(Wu等人.细胞，1990，63，687-695)进行的Western印迹分析证明在提取的细胞蛋白质中HBxAg的表达为阳性。

6.5乙型肝炎聚合酶抗原特异性表达载体的构建

按如下进行乙型肝炎聚合酶(HBV pol)基因表达载体的构建：在100μl PCR反应(如在§6.4中所描述)中，将pTKHH2质粒DNA模板与寡聚物MF26(MF26：5’AAGAGCTCGCCACCATGGCCCTATCCTATCAAC3’)(SEQ ID NO：12)和HBV pol-2(5’TCACCTTAAGGTGTTGGAAGGTGGTTTGA3’)(SEQ ID NO：13)混合。将868 bp的HBV pol 5’末端凝胶纯化并用Sac I和EcoRI消化，接着插入到用相同的酶消化的载体pGE3Z(Promega Inc.)中以生成质粒pGE3Zpol-5’。使用与如下寡聚物，pol-3(5’GGCCATGCAGTGGAATTCCACTGCCTTCC3’)(SEQ ID NO：14)和pol-4(5’AACCAAGCTTCACGGTGGTCTGGATGCAAC3’)(SEQ ID NO：15)，混合的pTKHH2质粒，从pTKHH2载体中PCR扩增出另一个1638bp的乙型肝炎病毒聚合酶3’端的DNA片段。将该PCR产物用EcoR I和Hind III消化，将消化的片段插入到pGE3Zpol 5’的EcoRI-Hind III位点中，以生成2874 bp的全长乙型肝炎病毒聚合酶基因。将所得质粒命名为p3Zpol。首先用Sac I消化乙型肝炎病毒聚合酶基因并且接着用Klenow反应填补(Sambrook等人.分子克隆，第二版，Plainview，N.Y.，Cold Spring Harbor Press，1989)成钝末端。在用Sal I再消化后，接着将全长的聚合酶基因插入到用Mul I消化、钝化并接着用Sal I消化的pCI载体(Promega Inc.)中，以生成pCI-HBV-pol表达载体。

通过将pCI-HBV-pol转染到人肝细胞瘤细胞系HepG2(如在§6.4中所描述)中，也对乙型肝炎病毒聚合酶蛋白质的表达进行了测试。用特异性的兔抗-乙型肝炎病毒抗体(Feitelson等人.Clinics In Laboratory Medicine，1996，W.B.Saunders Com)进行的Western印迹分析证明在所提取的细胞蛋白质中为阳性。

6.6 pZeoSV2-hCD34表达载体的构建

为了获得人CD34全长的cDNA用于DNA疫苗接种，用CD34阳性细胞系KG-1a以提取RNA(Simmons等人.免疫学杂志，1992，148：267-271)。利用在Puissant等人.BioTechniques，1990，8：148-149中描述过的技术并略有修改，将1×10⁶个培养的KG-1a细胞悬浮在5ml缓冲液(4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠、0.5％Sarkosyl、0.1M 2-巯基乙醇、pH7.0)中。加入如下试剂并不时地旋涡振荡试管：2M乙酸钠pH4.0(0.5ml)、苯酚(5ml)和氯仿(1ml)。在冰上温育15分钟后，接着将试管离心，10000g(7000转/分钟)、10分钟。加异丙醇(5ml)于上相中并在冰上温育10分钟，接着按上面所述离心。将RNA沉淀溶解于1ml4M LiCl并转至微离心管中。原始管用0.5ml LiCl淋洗并将合并液中的沉淀旋涡振荡5分钟。对RNA进行离心(10分钟)沉淀，再悬浮在1ml 4M LiCl中并再沉淀。将沉淀完全悬浮于TE/0.5％SDS中并用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提。再抽提一次水相，然后通过加入2M乙酸钠(0.1ml)和异丙醇(600μl)沉淀RNA。将RNA进行沉淀和再悬浮于水中。

按照制造商的方法(BRL Life Science Inc.RT试剂盒)，1μg纯化的总RNA用于加有寡聚物dT₁₈引物的逆转录(RT)反应。使用寡聚物hCD34-1(5’GAAGGATGCTGGTCCGCAGGGG3’)(SEQ ID NO：16)和hCD34-2(5’CACCTAGCCGAGTCACAATTCG3’)(SEQ ID NO：17)引物，PCR扩增了全长的人CD34 cDNA。PCR反应按如下条件进行：95℃ 1.3分钟、53℃ 1.3分钟、72℃ 2分钟，共进行40个循环。最后，将PCR产物于72℃温育2分钟。将1.2kb的PCR产物直接插入到Hinc II消化的pUC18载体(Pharmacia Inc.)中。使用ABI 373 DNA序列仪和M13引物，通过DNA测序分析证实所得质粒pUC1 8-hCD34含有全长的hCD34序列。

再用Hind III和EcoR I消化pUC18-hCD34后，凝胶纯化该1.2kb的hCD34片段，并通过Hind III和EcoR I位点插入到哺乳动物表达载体pZeoSV2＋(Invitrogen Inc.)中，生成载体pZeoSV2-hCD34。通过将其转染到Hela细胞中并用鼠抗人CD34单克隆抗体(Pharmingen Inc.，CA)免疫染色证实了pZeoSV2-hCD34的表达。

6.7针对HbxAg的鸡抗体的酶联免疫测定

在该实验中，将来自大肠杆菌的纯化的HbxAg抗原用于测定鸡抗HBx抗体(如§6.3中所描述，从DNA疫苗接种中生成)。将处于200μl PBS缓冲液中的纯化的HbxAg抗原5μg，外包于ELISA平板孔(Nalge Nunc Internation.，Rockester，NY)上过夜。在用PBS缓冲液冲洗后，加入200μl 5％BSA以进一步外包孔以便阻断测定中的非特异性结合。将鸡抗体系列地稀释于含0.1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液中并在用HbxAg抗原外包的微量滴定板中温育2小时。在用PBS冲洗五次后，将HPR标记的山羊抗鸡抗体(Sigma Inc.，1∶10000稀释)加入到孔中，并温育1小时。在用PBS再冲洗五次后，加入底物缓冲液并温育15分钟(每5分钟ELISA读值一次)。数值为2份样品的平均值。图9显示DNA疫苗接种生成了对HbxAg抗原具有很高的结合亲和力的鸡抗体。

6.8从DNA免疫的鸡的鸡蛋黄中纯化鸡IgY

将来自Hyline Inc.(Dallas Center，Iowa)的下蛋母鸡置于固定的光周期中。在pCMV-HBx载体单注射(按§6.3中所描述)免疫鸡后二十天，收集鸡蛋直到收集到第10个鸡蛋为止。根据Polson等人.免疫学通讯(Immunol.Commun.)，1980，9，475-493中所描述的方法提取IgY。简而言之，将鸡蛋黄从蛋清中分离出，并通过漏斗滴入带刻度的圆筒中予以破坏。加入等体积的缓冲液(0.01M磷酸、0.1M NaCl和0.01％NaN₃，pH7.5)并搅拌。加入研碎的聚乙二醇6000(SigmaInc.)至终浓度为3.5％并搅拌直至其全部溶解。通过在13000g离心10分钟使所形成的沉淀物沉淀下来。轻轻倒出上清液并通过干酪滤布过滤。然后加入聚乙二醇6000至终浓度为12％。彻底搅拌混合物并再次在13000g离心10分钟。将沉淀物再溶解于0.01M磷酸、0.1M NaCl(pH7.5)中至原始的鸡蛋黄体积，然后加入聚二醇6000至12％以进行第二次沉淀。轻轻倒出上清液，并将沉淀物离心二次以挤出聚乙二醇6000。将最后的IgY沉淀物溶于50mM Tris—0.1mMEDTA—25％甘油—0.02％NaN₃(pH7.9)中。

为进一步纯化，通过在0.015M KPO₄(pH8.0)中将IgY吸附于DEAE-纤维素上，并用0.015M-0.3M KPO₄(pH8.0)梯度洗脱，以纯化IgY。在4-20％聚丙烯酰胺梯度凝胶(BIO-RAD商品型微型凝胶)上分离4μg纯化的样品，并用银染显现(Sambrook等人.分子克隆，第二版，Plainview,N.Y.，Cold Spring HarborPress，1989)。纯化结果见图10。道1是通过聚乙二醇沉淀纯化的IgY，道2是通过DEAE-纤维素纯化的IgY。H和L分别表示免疫球蛋白重链和轻链的位置。

6.9通过免疫印迹分析确定在母鸡中产生抗-HBx的产生时间过程

图10说明宿主对DNA疫苗接种的免疫应答时间过程。通过使用纯化的来自E coli.的重组的HbxAg抗原分析了抗-HbxAg抗体的水平。如§6.3所描述，将每孔8μg纯化的来自E coli.的重组的HbxAg抗原在12.5％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，将所分离的蛋白质根据制造商的方法(Bio-Rad微型凝胶试剂盒)转至PVDA膜上。如在§6.3中所描述，将通过聚7二醇6000沉淀纯化的蛋黄抗体以1∶1200在Tris-缓冲液中稀释，并将10ml纯化的IgY溶液涂于PVDA膜，并在37C温育2小时。在用PBS缓冲液冲洗五次后，将膜转至20ml辣根过氧化物酶-标记的山羊抗鸡抗体(1∶8000稀释，Sigma Inc.)溶液中，并在37℃温育1小时。在用PBS缓冲液再冲洗五次后，通过使用增强的化学发光系统(PIERCE Inc.，ECL试剂盒)进行免疫印迹分析。图11说明在DNA疫苗接种后12天，鸡抗-HbxAg抗体达到了可探测水平。

6.10用于永生化鸡B细胞的(plmmo)图谱

由于可以将人B细胞通过EBV感染而永生化以及可以将小鼠B细胞通过用癌基因诸如突变体p53和Ras癌基因转染而直接永生化。通过采用逆病毒载体转导系统特别是具有感染静息细胞能力的lantiviral载体系统将用鸡特异性的癌基因永生化的鸡B细胞选择出来。在转化鸡细胞中已广泛使用了基于ASV(禽肉瘤病毒)的载体(Kaplitt等人.病毒载体，Academic Press，1995)。本节描述含有鸡突变体p53或Ras基因片段(其能够被用于鸡B细胞的永生化)的基于HIV的载体的构建。

在此详细地描述了基于lantiviml载体的新的鸡B细胞永生化载体的构建。将基于HIV的lantiviral载体(Naldini等人.科学，1996，272：263-268)用作新载体构建的起始材料。通过使用随后的两种多聚物：Cp53-1(5’ATGGCGGAGGAGATGGAACCA3’)(SEQ ID NO：18)和Cp53-2(5’TCAGTCCGAGCCTTTTTGCAGCAG3’)(SEQ ID NO：19)(Soussi等人.核酸研究，1988，16：11383)，PCR扩增了鸡突变体p53癌基因。从pCITE-5b(t)(Novagen Inc.；Parks等人.病毒学杂志，1986，60：376-384)中PCR扩增400bp的帽子非依赖的翻译增强(CITE)DNA片段，并将其插入到pT7-p53载体中的p53癌基因的下游，以产生pT7-p53-CITE载体。通过使用两种寡聚物，C-Ras-1(5’ATGACCGAGTACAAGCTG3’)(SEQ ID NO：20)和C-Ras-2(5’TCACGATATCACGCATTTACAG3’)(SEQ ID NO：21)，PCR扩增鸡Ras癌基因并将Ras癌基因DNA片段插入到pT7-p53-CITE中以生成双癌基因表达载体：pT7-p53-CITE-Ras。

通过Hind III-Xho I消化将HIV-1载体中的LacZ基因DNA片段置换为鸡突变体p53-CITE-Ras癌基因DNA片段以生成表达载体pHIV-l-Ch-p53-Ras。通过将两种癌基因与CITE DNA片段相连，使癌基因在单个巨细胞病毒启动子的驱动下表达。

假打印泡状口炎病毒的G蛋白质克服了HIV病毒宿主细胞特异性问题。为测试该lantiviral载体的转导效率，按如下进行了生成基于HIV的lantiviral载体转染母液的实验。将5μg pCMV-VSV-G质粒、5μg HIV-1辅助质粒pCMV*-R9和10μg表达载体pHIV-LacZ混合并使用钙沉淀步骤(Promega Inc.)将其转染到1×10⁶个293细胞中。将从ATCC获得的1×10⁶个293细胞接种于100mm的细胞培养平板中，置于含5％CO₂的37℃温育箱(在标准的细胞培养环境下用补充有10％FCS的DMEM培养基)。在转染前4小时，将预温热的10％FCS培养基换掉，并且48小时以后，收集上清液，并与相同体积的FCS混合以在-80℃储存病毒母液样品。或者根据在Chen等人。美国国家科学院院刊，1996，93：10057-10062中描述的方法生成病毒母液样品。

lantiviral载体对鸡细胞的转导按如下测试。将5×10⁵个SL-29细胞(从ATCC获得的鸡胚成纤维细胞)接种于加有MEM培养基(补充有5％FCS)的培养平皿中。第二天，将100μl经系列稀释的HIV-1-LacZ病毒母液加入到SL-29培养物中并温育48小时。所有样品均作双份操作以便控制变异。在用PBS缓冲液冲洗细胞一次后，将转导细胞与0.25％(体积/体积于PBS中)戊二醛溶液混合15分钟，用X-gal溶液(1mg/ml X-gal，2mM MgCl₂，5mM K₄Fe(CN)₆－3×H₂O，5mM K₃Fe(CN)6)于37℃染色2小时。通过计数蓝染细胞，确定出该实验中标为假打印的lantiviral母液为1.32×10⁵/细胞。

经DNA疫苗接种的鸡脾脏B细胞按如下永生化。收集并使用Hypaque-Density Ficoll Gradient方法(Sigma Inc.)纯化鸡脾脏细胞。在用PBS缓冲液冲洗三次后，将1×10⁵个混合的B细胞接种于加有1ml MEM-10％FCS培养基的六孔平板中，并与2ml病毒母液直接混合过夜。优选地，用5mM dNTP和2mM亚精胺在37℃下处理病毒母液的上清液2小时以增强病毒的感染性(Zhang等人。病毒学杂志，1995，69：3929-3932)。将4μg/ml Polybrene(SigmaInc.)加入到B细胞培养物中以便在病毒/细胞温育过程中增强病毒的转导效率。在B细胞与病毒溶液在37℃温育过夜后，将B细胞稀释到单孔培养基(10个细胞/孔)中，在96孔板中单孔培养基含有喂养细胞(400-500个用20 Gays照射的鸡B细胞/孔)。将转化细胞温育2-3周，首先测试成熟细胞的上清液产生的IgY抗体(Davis编辑，分子生物学方法，单克隆抗体方法，1995，Human出版社)或者使用如上所述的ELISA筛选特异性地结合抗原的IgY。

6.11确定在非正常化的来自人肝脏的cDNA文库中看家基因的发生率

在该实验中，探测了一过性DNA测序中管家基因的发生率。分别从InvitrogenInc.(Carsbad，CA)，货号^#：A550-39，和Clontech Inc.(Palo Alto，CA)，货号^#：HL400 2A2购来两种肝脏特异性的cDNA文库。在将1μl文库母液转至500μ1 LB培养基后，取10μl用于涂布含有选择性抗生素的LB平板。在将平板在37℃温育过夜后，从每个cDNA文库中挑出300个单独的克隆并在3ml LB中振荡培养过夜。使用Quigen Tip 20试剂盒制备每种质粒，利用ABI 377自动DNA测序系统，用文库制造商建议的引物将1μg质粒DNA测序。将序列数据与GenBank数据库比较，对测序数据进行了分析。表1对数据进行了总结。

表1在人肝脏cDNA文库中含量丰富的转录本

基因名称频率

NADH-脱氢酶链 7.2

白蛋白 4.8

肌动蛋白 4.0

ATP酶 4.0

α-微管蛋白 3.2

细胞色素氧化酶链 2.1

延长因子1α 1.0

肌球蛋白轻链 1.0

醛缩酶 0.8

6.12抗体芯片的原型结构

在受到特异性抗原刺激后，每个宿主B细胞生成特异性的抗体，其与抗原特异性的连续结构域或构象结构域结合。多克隆抗体通过多个结合位点与特异性的抗原结合。在固定基质支持上含有多组特异性抗体的抗体芯片可用于捕获蛋白质样品溶液中游离的靶蛋白质(抗原)。在冲洗步骤后，由于多克隆抗体具有多个结合结构域，所以与酶(诸如辣根过氧化物酶)或可探测的标记物(诸如荧光染料(FITC或C3))偶联的相同的抗体组能够用于进一步结合那些被捕获的抗原以及确定与酶的底物诸如ECL系统或激光发射系统(流式细胞仪)的结合信号的密度。与此相反，如果用单克隆抗体实施上述捕获或标记步骤，由于单克隆抗体对特异性的抗原具有单个结合结构域而使结合效率非常低。尽管在理论上通过使用针对每一种单一抗原的两种单克隆抗体可能会克服该问题，但是阐明不同的单克隆抗体的特性是非常非常耗费时间的并且几乎是不切实际的。

通过使用本发明的AMIGAP，可以生成针对未知蛋白质或功能未定的蛋白质的多重抗体。在对每种IgY抗体纯化后，可以将每种抗体分为两份，将其中的一份用生物素(PIERCE Inc.，IL.EZ-Link Biotinylating Reagents)标记。将几百或者几千种特异的非标记抗体单独地、随机地点在两个完全相同的固体支持介质上(例如，在PVDF膜或标记的单个的玻璃珠上，每个斑点每种抗体点1μg；并且每个斑点或珠代表一种已知的抗体)。用5％BSA—PBS缓冲液阻断点后的基质以减小非特异性结合背景。可以使用特异的抗体组诸如靶向细胞周期的特异的调节蛋白质或G-偶联的受体家族蛋白质。可以将抗体芯片空气干燥并在密封的塑料袋中在4℃保存几个月。在进行实验前，将芯片在PBS缓冲液中润湿30分钟能够将抗体芯片激活。

可以将此处描述的系统用于比较靶蛋白质在两种样品(诸如肝脏肿瘤细胞针对正常的肝脏细胞或者用抗癌药物处理的人肺癌细胞针对未处理的对照细胞)中的表达。为制备蛋白质样品，用处于PBS溶液中的温和去污剂或者冻融方法(Sambrook等人.分子克隆，第二版，Plainview，N.Y.，Cold Spring Harbor Press，1989)可以将两种靶细胞样品或组织裂解。相同数量的细胞将可以用于比较蛋白质表达。或者，首先测量细胞裂解物的蛋白质浓度，接着将等量的蛋白质样品加载到抗体芯片上。

通常每次测定需用1×10⁶个细胞/裂解物样品或50-100μg蛋白质。将每种蛋白质样品加到那些相同的抗体芯片并在37℃慢慢振荡温育2小时。在停泊抗体与其靶抗原特异性地结合后，采用简单的冲洗步骤以移出未捕获的细胞蛋白质。将抗体芯片用PBS缓冲液冲洗四次，每次冲洗15-30分钟。

由于膜结合的停泊抗体捕获了细胞靶蛋白质，所以那些被捕获的靶蛋白质通过生物素标记的抗体(其对应于每一种原始的被点抗体)的混合物溶液，以三明治方式发挥作用，被探测到并在37℃温育2小时。

被捕获的生物素标记的抗体的信号密度与停泊的细胞蛋白质(抗原)水平相联系。对被捕获的生物素标记的抗体的进一步定量表明在该测定中抗原的表达水平。在用PBS缓冲液冲洗五次后将非捕获的生物素标记的抗体从抗体芯片上移出。最后，加入偶合有抗生物素蛋白的辣根过氧化物酶(SigmaInc.，1∶8000稀释于含2％BSA的PBS)并温育15分钟。在将抗体芯片用PBS溶液冲洗6次以及用ECL底物溶液(PIERCE Inc.，IL.)浸泡抗体芯片后，将芯片暴露于X-射线底片。

并不准备将本发明限制在本文中描述的特异的实施方案的范围内。确实，除了那些在本文中所描述的以外，从前面的描述中对本发明的多种修正对本领域的技术人员将是显而易见的。旨在将这类修正落入到附加的权利要求书的范围中。

本文引用了多种参考文献，其所公开的全部内容仅供参考。

序列目录<110>Duan，Linxun<120>在鸟类中用多核苷酸接种生成抗体的方法和载体<130>0003<140><141><150>60/108，487<151>1998-11-16<160>21<170>PatentIn Vet.2.0<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>1caccctgaat tgactctctt tc 22<210>2<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>2atatgaattc ttaattaaga tctccatggt ggcctctcct tc 42<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>3cgcggaattc gcggccgcta ccaggtaagt gtacc 35<210>4<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>4cgagtagttt aaacaaaaaa cccctcaagt cccg 34<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>5agatctgttt aaaccaggtg gcacttttcg g 31<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>6agatctgttt aaacagctgt ttcctgtgtg a 31<210>7<211>20<212>PRT<213>鸡IgY Vhl信号结构域<400>7Met Ser Pro Leu Val Ser Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Pro Gly1 5 10 15Leu Met Ala Ala

20<210>8<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>8aaccctcttc catgagccca ctcgtctcct ccctcctgct cctggccgcc ctgccagggc 60tgatggcggc c 71<210>9<211>62<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pS&DV的寡聚物<400>9cagatcctct tcgaagctag cggccgcgaa ttcttaatta aggccgccat cagcccggag 62<210>10<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pCMV-HBx的寡聚物<400>10ggaagcttgc cgccatggct gctaggctgt gc 32<210>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建pCMV-HBx的寡聚物<400>11gtggagacgg attagtacca tggcc 25<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建乙型肝炎聚合酶的寡聚物<400>12aagagctcgc caccatggcc ctatcctatc aac 33<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建乙型肝炎聚合酶的寡聚物<400>13tcaccttaag gtgttggaag gtggtttga 29<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建乙型肝炎聚合酶的寡聚物<400>14ggccatgcag tggaattcca ctgccttcc 29<210>15<211>30<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建乙型肝炎聚合酶的寡聚物400>15aaccaagctt cacggtggtc tggatgcaac 30<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建hCD34表达载体的寡聚物<400>16gaaggatgct ggtccgcagg gg 22<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：为构建hCD34表达载体的寡聚物<400>17cacctagccg agtcacaatt cg 22<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：Cp53-1<400>18atggcggagg agatggaacc a 21<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：Cp53-2<400>19tcagtccgag cctttttgca gcag 24<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：C-Ras-1<400>20atgaccgagt acaagctg 18<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：C-Ras-2<400>21tcacgatatc acgcatttac ag 22

Claims

1一种产生针对禽类中的抗原抗体的方法，包括：

1)将编码与启动子可操作地连接的所述的抗原DNA序列传递至所述的禽类，其数量足以诱导可探测到的针对所述抗原的所述抗体的产生，所述的启动子能够指导所述的抗原或者编码所述的抗原的mRNA序列在所述的禽类中表达；和

2)从所述的禽类中回收所述的抗体。

2如权利要求1的方法，其中所述禽类选自鸡、火鸡、鸭和鹅。

3如权利要求2的方法，其中所述禽类为鸡。

4如权利要求1的方法，其中将DNA或mRNA序列直接传递至所述禽类的组织中。

5如权利要求4的方法，其中所述组织为肌肉。

6如权利要求4的方法，其中所述组织为皮肤。

7如权利要求4的方法，其中所述组织为粘膜。

8如权利要求4的方法，其中通过注射、基因枪技术或脂质介导的传递技术传递DNA或mRNA序列。

9如权利要求1的方法，其中将DNA或mRNA序列传递至适合的禽类细胞以及将含有DNA或mRNA序列的所述的细胞传递到适合的禽类组织。

10如权利要求9的方法，其中所述细胞选自血液细胞和脾脏B细胞。

11如权利要求9的方法，其中通过选自Ca₃(PO₄)₂-DNA转染、DEAE葡聚糖-DNA转染、电穿孔、使用“LIPOFECTIN”TM试剂转染、基因枪技术和病毒基因传递系统的方法将DNA或mRNA序列传递至所述的细胞。

12如权利要求1的方法，其中传递与启动子可操作连接的编码抗原的DNA序列。

13如权利要求12的方法，其中所述的DNA序列为质粒形式。

14如权利要求12的方法，其中所述的启动子为禽类的内源性启动子。

15如权利要求12的方法，其中所述的启动子为具有指导抗原在禽类中表达的能力的病毒启动子。

16如权利要求15的方法，其中的所述的病毒启动子选自RSV LTR、SV40IEP、CMVIEP、脾脏坏死病毒LTR(SNV LTR)和金属硫蛋白启动子。

17如权利要求12的方法，其中所述的DNA序列进一步包含指导编码的抗原在禽类中分泌的序列。

18如权利要求17的方法，其中所述的指导分泌的序列为前导序列。

19如权利要求18的方法，其中所述的前导序列为内源性的禽类前导序列。

20如权利要求18的方法，其中所述的前导序列选自鸡IgY、鸡SPARC、鸡血清白蛋白和鸡组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的前导序列。

21如权利要求18的方法，其中所述的前导序列选自白细胞介素1、CD4和MHC的前导序列。

22如权利要求1的方法，其中传递编码抗原的mRNA序列。

23如权利要求1的方法，其中所述的禽类为鸡，并且从鸡的鸡蛋黄中回收抗体。

24如权利要求23的方法，其中通过硫酸铵沉淀、通过聚乙二醇6000沉淀、或辛酸沉淀从鸡蛋黄中纯化抗体。

25如权利要求1的方法，其中禽类为鸡，并且从鸡的抗体产生B细胞中回收抗体。

26如权利要求1的方法，其中所述的抗原为分泌蛋白质或肽。

27一种在鸡中产生针对抗原的单克隆抗体的方法，包括：

1)将与启动子可操作地连接的编码所述的抗原DNA序列传递至所述的鸡，其数量足以诱导可探测到的针对所述抗原的所述抗体的产生，所述的启动子能指导所述的抗原或者编码所述的抗原的mRNA序列在所述的鸡中表达；

2)从所述的鸡中移出至少一部分抗体产生细胞；

3)将所述的移出的抗体产生细胞永生化；

4)繁殖所述的永生化的抗体产生细胞；和

5)收集由所述的永生化的抗体产生细胞产生的所述的单克隆抗体。

28如权利要求27的方法，其中从步骤2)移出的抗体产生细胞为鸡脾脏B细胞。

29如权利要求28的方法，其中通过与鸡B类成淋巴细胞系的细胞融合而将鸡脾脏B细胞永生化。

30如权利要求29的方法，其中鸡B类成淋巴细胞系选自HU3R27、HU3R27N和R27H4。

31如权利要求28的方法，其中通过癌基因转化将鸡脾脏B细胞永生化。

32如权利要求31的方法，其中用于转化的癌基因为突变体鸡p53癌基因或Ras癌基因。

33一种在禽类和细菌的细胞中表达基因的载体，其包含如图3A或图3C所述的质粒。

34一种确定从生物样品中分离的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型的方法，包括：

1)将每一种所述的DNA序列克隆到具有在禽的或细菌的细胞中表达所述的DNA序列的双表达载体中；

2)将位于在步骤1)中形成的双表达载体中的所述DNA序列，以足够诱导针对由所述的DNA序列编码的抗原的所述抗体可探测到的产生的量传递到禽类中，并从所述的禽类中回收所述的抗体；

3)将在步骤2)中传递至所述禽类的DNA序列传递到细菌细胞中，并回收由来自所述细菌细胞的所述的DNA序列编码的蛋白质或肽；

4)对在步骤2)中回收的所述的抗体和在步骤3)中回收的所述的蛋白质或肽二者之间实施免疫反应，以阐明所述的抗体的免疫特异性；和

5)对在步骤2)中回收的所述的抗体和所述的生物样品二者之间实施免疫反应，以确定所述的预选DNA序列组的蛋白质组学图谱。

35如权利要求34的方法，其中预选DNA序列组为cDNA文库。

36如权利要求34的方法，其中生物样品来源于人。

37如权利要求34的方法，其中所述的双表达载体为在图3A或3C所述的质粒。

38如权利要求34的方法，其中所述的禽类选自鸡、火鸡、鸭和鹅。

39如权利要求38的方法，其中所述的禽类为鸡。

40如权利要求34的方法，其中将所述的DNA序列直接传递至禽类的组织中。

41如权利要求40的方法，其中所述的组织为肌肉。

42如权利要求40的方法，其中所述的组织为皮肤。

43如权利要求40的方法，其中所述的组织为粘膜。

44如权利要求40的方法，其中通过注射、基因枪技术或脂质介导的传递技术将DNA序列传递。

45如权利要求34的方法，其中将DNA序列传递至禽类的细胞以及将含有DNA序列的所述的细胞传递到适合的禽类组织。

46如权利要求45的方法，其中所述的细胞选自血液细胞和脾脏B细胞。

47如权利要求44的方法，其中通过选自Ca₃(PO₄)₂-DNA转染、DEAE葡聚糖-DNA转染、电穿孔、使用“LIPOFECTIN”TM试剂转染、基因枪技术和病毒基因传递系统方法将DNA序列传递至细胞。

48如权利要求34的方法，其中所述的禽类为鸡以及在步骤2)中从鸡的鸡蛋黄中回收抗体。

49如权利要求48的方法，其中通过硫酸铵沉淀、通过聚乙二醇6000沉淀、或辛酸沉淀从鸡蛋黄中纯化抗体。

50如权利要求34的方法，其中所述的禽类为鸡并且在步骤2)中从鸡的抗体产生B细胞中回收抗体。

51如权利要求34的方法，其中所述的细菌细胞为大肠杆菌细胞。

52如权利要求34的方法，其中通过免疫印迹、免疫沉淀或原位免疫染色测定免疫反应。

53如权利要求34的方法，其中在评价生物样品中的预选DNA序列组的蛋白质组学谱型中，在步骤5)中实施免疫反应以确定由预选DNA序列组编码的蛋白质或肽的存在、数量、亚细胞定位或组织表达特异性。

54如权利要求34的方法，其中预选的DNA序列是从生理正常的生物样品中分离。

55如权利要求34的方法，其中预选的DNA序列是从生理异常的生物样品中分离。

56如权利要求34的方法，其中DNA序列进一步包含在禽类中指导编码的抗原分泌的序列。

57如权利要求56的方法，其中指导分泌的序列为前导序列。

58如权利要求57的方法，其中前导序列为禽类的内源性前导序列。

59如权利要求57的方法，其中前导序列选自鸡IgY、鸡SPARC、鸡血清白蛋白和鸡组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的前导序列。

60如权利要求58的方法，其中前导序列选自白细胞介素1、CD4和MHC的前导序列。

61如权利要求35的方法，其中cDNA文库编码生物样品中分泌性的蛋白质或肽。

62一种鉴定与生理异常的生物样品相联系的生理性可区分的标志的方法，包括：

1)通过权利要求34的方法，确定所述的生理异常的生物样品的蛋白质组学谱型；

2)通过权利要求34的方法，确定可比较的生理正常的生物样品的蛋白质组学谱型；和

3)通过比较获得自步骤1)中的蛋白质组学谱型与获得自步骤2)中的蛋白质组学谱型，鉴定与生理异常的生物样品相联系的生理性可区分的标志。

63一种为将鸡抗体产生细胞永生化的载体，其包括如图12中所述的质粒。