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CN1331474C - 治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物及其制备方法 Download PDF

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CN1331474C CNB2004100218281A CN200410021828A CN1331474C CN 1331474 C CN1331474 C CN 1331474C CN B2004100218281 A CNB2004100218281 A CN B2004100218281A CN 200410021828 A CN200410021828 A CN 200410021828A CN 1331474 C CN1331474 C CN 1331474C
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Abstract

治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，以大黄总游离蒽醌与黄芩苷为有效药物成分，与药物中可以接受的辅助添加成分组成，大黄总游离蒽醌/黄芩苷的重量比为1/1～1/5。其中有效药物成分大黄总游离蒽醌的制备方法，是将以含乙醇0-95%的水溶液对大黄药材加热提取得到的浸膏体于50℃-100℃和pH＜1的酸性条件下进行水解后，将其水解沉淀物置于体积含量为50%-80%的碱性乙醇水溶液中搅拌溶解，再将除去沉淀后的碱性含醇滤液再酸化至pH 1-5，沉淀物即为大黄总游离蒽醌的重量含量≥80%的大黄提取物。该药物组合物可具有显著防治包括糖尿病肾病、糖尿病眼病等多种糖尿病微血管病变所致的慢性并发症。

Description

治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，及其有效药物成分中大黄总游离蒽醌的制备方法。
背景技术
糖尿病是一种常见和多发性疾病，其对人体健康的危害主要表现在由其所导致的多种慢性并发症上，如糖尿病肾病、糖尿病眼病及其它多种微血管病变就是其中较常见的一些慢性并发症。以中药大黄或其所含的某些成分作为治疗药物已有研究和报导。
大黄是一个重要和常用的中药，具有泻热通肠，凉血解毒，逐瘀通经等功能。已有文献报导，其化学成分主要为鞣质和蒽醌。其中的大黄蒽醌主要是以甙形式存在的结合蒽醌和少量的游离蒽醌。已有研究显示，其中的大黄总游离蒽醌中可包括有大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚和芦荟大黄素等多种游离的蒽醌类衍生物。目前已有以其中的大黄酸、大黄素等成分用于对糖尿病的肾脏损伤防治的报导，如，公开号CN1178669A的中国专利文献公开了一种以大黄酸和大黄酸盐作为治疗糖尿病肾病的药物。公开号CN1324612A的中国专利文献公开了一种以大黄素和巯甲丙脯酸作为延缓慢性肾衰的药物。公开号CN1349966A的中国专利文献公开了一种对大黄总蒽醌的提取纯化方法及其将其用于制备治疗肾衰的药品。此外，戴春笋等在“大黄酸治疗STZ诱导糖尿病大鼠的远期实验研究”(《肾脏病与透析肾移植杂志》，1999，5)中提出了对长期应用大黄酸对糖尿病大鼠远期病变疗效的观察报告。刘栋等在“大黄酸抑制TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞肥大及细胞外基质产生”(《肾脏病与透析肾移植杂志》，2001，10(2))中报导了大黄酸对TGF-β1诱导的近端肾小管上皮细胞肥大及细胞外基质(ECM)影响的观察报告。
糖尿病可导致多种严重影响人体健康的慢性并发症产生，上述文献的内容多只是针对其中肾病的研究和报告。
发明内容
针对上述情况，本发明将提供一种能具有更好的防治糖尿病慢性并发症的药物组合物，其中不仅在对糖尿病慢性肾病的防治上能具有更为理想和满意的效果，而且对糖尿病眼病、糖尿病血管病变等多种糖尿病所致的慢性并发症也能具有可靠和满意的防治效果。
本发明治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，是以大黄总游离蒽醌与黄芩苷为有效药物成分，与药物中可以接受的辅助添加成分组成，大黄总游离蒽醌/黄芩苷的重量比为1/1～1/5，其中尤以大黄总游离蒽醌/黄芩苷以1/2～1/3重量比时为佳。
在上述的药物组合物中，所说有效药物成分中的大黄总游离蒽醌，是主要可包括大黄酸(I)、大黄素(II)、大黄酚(III)、大黄素甲醚(IV)和芦荟大黄素(V)等多种游离蒽醌衍生物成分在内的总游离蒽醌成分，这些成分的结构形式分别如式(A)的I～V所示：
Figure C20041002182800041
            (A)
关于大黄总蒽醌的制备已有研究和报导。例如，公开号CN1349966A的中国专利文献提出了一种采用大孔吸附树脂进行纯化的大黄总蒽醌的提取方法。夏之宁等在“吸附脱附法提取分离大黄蒽醌甙成分”(《中成药》1999，21(9)，478-9)，提出了利用聚酰胺的吸附活性对大黄中的蒽醌甙进行提取分离的方法。这些方法的操作过程繁琐，收率低，成本高，工业化生产可操作性差。郑志华在“大黄蒽类衍生物提取工艺研究概述”(《广东药学》2002，12(3)，58-9)还分别对煎煮法、渗漉法、回流法、夹层蒸汽水煎煮法和水温浸法；对醇提、渗漉和水提方式；以及对用纤维素酶处理、用超声技术提取等不同提取方法的特点和优劣进行了比较和分析。这些报道都只涉及了对包括有游离蒽醌和以甙形式存在的结合蒽醌在内的大黄总蒽醌的提取和制备方法。
在公开号CN1345597A的中国专利文献中，公开了一种从大黄中提取游离蒽醌的浸膏及制方法，采用常规方法以乙醇提取，经酸水解得到大黄游离蒽醌浸膏，该方法所得的是游离蒽醌提取物含量＞50％的大黄蒽醌浸膏，其总游离蒽醌的含量低，纯度差。《中药通报》1987，12(5)：286-288报导了一种分离大黄总游离蒽醌的方法，但由于采用的是有机溶剂萃取，易燃易爆。作为改进，公开号CN1242355A的中国专利文献提出了一种采用阴离子交换树脂分离纯化提取大黄总游离蒽醌的方法。公开号CN128228A的中国专利文献公开了一种采用将大黄碎块浸泡于数十倍的氨水溶液中，以提取大黄总游离蒽醌中的大黄酸的方法。袁倚盛等在“大黄游离蒽醌的制备与纯化”(《中草药》2000，31(7)，508-9)中介绍了采用乙醚提取或用大孔树脂吸附处理的方式制备总游离蒽醌，并进一步纯化大黄酸和大黄素的方法。陈琼华等在“中药大黄的综合研究”(《天然产物研究与开发》2001，13(3)，58-60)中介绍了采用20％硫酸和氯仿的混合液处理大黄药材，并分离大黄总游离蒽醌中的大黄素、大黄酚、大黄酸、大黄素甲醚和芦荟大黄素等成分的方法。本发明药物组合物有效药物成分中的大黄总游离蒽醌虽不排除也可以采用这些方法制备得到，但由于在这些方法中或需采用有机溶媒，或是需采用离子交换树脂等方式处理，或是大黄总游离蒽醌的收率/含量较低，使其在操作的方便性、安全性和利于工业化规模生产方面都尚不能令人满意。
为此，本发明提供一种更具有实施和实用价值，特别是更有利于工业化规模生产上使用的制备方法，是先按目前文献已有报导多种以水或含醇量最高可达95％的乙醇水溶液对大黄药材加热回流后，过滤并除去滤液溶媒得到浸膏体，将浸膏体于温度50℃-100℃和pH＜1的酸性条件下进行水解后，将水解沉淀物置于pH＞14和体积含量为50％-80％的碱性乙醇水溶液中搅拌溶解，将除去沉淀后的该碱性含醇滤液再酸化至pH1-5，即可得到含大黄总游离蒽醌的重量≥80％的大黄提取物。
在上述制备方法中，对所说的该大黄浸膏体在pH＜1条件下进行酸水解时，可以采用按100g大黄药材原料加重量体积比为1～10％的酸，一般以选用如盐酸或硫酸等最常用的酸为方便，在50-100℃的温度条件下处理1-10小时。
对水解产物用所说的pH＞14的碱性乙醇水溶液处理时，一般情况下可以采用含有重量比为1-8％的氢氧化钠或氢氧化钾等最常见易得的碱金属的乙醇溶液。处理后对所说的碱性含醇滤液一般也可以采用盐酸等常用的酸进行酸化处理。
在上述的制备方法中，为减少所得产物中杂质含量，可以对由酸化溶液中过滤得到的所说的含有大黄游离总蒽醌的大黄提取物，可以用含量为50-95％的乙醇先进行洗涤后，再进行最后的常规干燥处理。
对于该大黄总游离蒽醌有效成分，除可使用上述单一形式的总游离蒽醌外，在上述的药物组合物中，允许使用由大黄为原料经水/乙醇提取得到的同时还包含有如鞣质等允许存在的其它杂质成分的大黄提取物替代，但在用于替代的大黄提取物中大黄总游离蒽醌的重量含量应≥80％。
作为可供具体实施参考的一种基本的制备方法可以采用下述步骤进行：
(a)大黄药材原料用水或含水的乙醇加热回流，其中以60～80％的乙醇水溶液为佳，不仅能提出结合蒽醌，而且能提取出其中较多的游离蒽醌。提取液过滤并回收溶媒，得到约1-3g大黄/ml形式的浸膏体。
(b)按常规方法进行酸水解，例如可按以100g大黄药材原料加盐酸2-10ml或硫酸1-5ml的方式，在50℃～100℃温度条件下水解1-10小时，使结合蒽醌转化为游离蒽醌，大大提高游离蒽醌得率。提高温度可缩短水解所需时间短。水解后，冷却，过滤和水洗，得沉淀物。
(c)将上步的沉淀物粉碎，加入含1-8％氢氧化钠或氢氧化钾的50-80％乙醇溶液，充分搅拌，滤过，得碱醇溶液。用碱性乙醇进行处理是尽量除去杂质，是保证和提高大黄游离蒽醌的重要和关键操作，因为大黄鞣质在碱性乙醇中几乎不溶，可经过滤被最大限度地除去，而大黄游离蒽醌则能被最大限度地溶解保留在碱性乙醇溶液中。
(d)将上步过滤的碱醇溶液加盐酸酸化至pH1-5，析出大黄游离蒽醌沉淀，沉淀过滤并用50-95％乙醇溶液洗涤后干燥，即得到可作为药效药物成分的大黄总游离蒽醌含量≥80％(重量)的大黄提取物。
试验结果显示，采用该方法能大大提高大黄总游离蒽醌提取物的含量和纯度，明显优于上述已有报导的多种方法。
对所得提取物中的大黄总游离蒽醌按《中华人民共和国药典》2000年版一部18页大黄项下高效液相色谱方法和条件，与大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素标准品进行对比分析，证明其主要化学成分为上述式(A)所示结构I～V的大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素，其HPLC色谱图可如图1所示。
对所得提取物中的大黄总游离蒽醌的含量测定方法如下：
对照品溶液的制备：精密称取大黄素对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置25ml量瓶中，加混合碱溶液(10％氢氧化钠溶液与4％氨溶液等量混合)至刻度，摇匀，在暗处避光放置30分钟即得，
供试品溶液的制备：精密称取上述大黄总游离蒽醌提取物25mg，置50ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取2ml，置分液漏斗中，加乙醚50ml，摇匀，乙醚液用水洗涤2次，每次10ml，弃去水层，乙醚液再用混合碱溶液分4次振摇提取(30ml、30ml、20ml、10ml)，合并提取液，置100ml量瓶中，加混合碱溶液至刻度，摇匀，在暗处避光放置30分钟即得。
测定方法：分别取供试品溶液和对照品溶液，照分光光度法(《中华人民共和国药典》2000年版一部附录V B)，在525nm波长处立即测定吸收度，计算，即得。可得知上述大黄总游离蒽醌提取物以大黄素计，含大黄总游离蒽醌大于80％。
在本发明的药物组合物中，有效药物成分中除上述所说的大黄总游离蒽醌外，另一个有效药物成分是中药原料黄芩中的重要成分之一的黄芩甙。黄芩则是一个具有清热、泻火、解毒功效的传统中药。有研究表明，黄芩中的主要有效成分为包括黄芩苷在内的黄芩总苷。黄芩苷为淡黄色细针状结晶，熔点为223℃～225℃，结构如式(B)所示。其已知和常用的功效是具有抗感染和解热镇痛、抗变态反应、抗菌、保肝利胆、降压、利尿、镇静、解热等方面的药理作用，此外研究和报导其还具有抗凝血，抑制脂质过氧化和醛糖还原酶(AR)等方面的活性。
                   (B)
对于该黄芩苷成分，可由化学方式，例如通过直接化学合成或是由其它相关化合物经化学修饰改造后得到，也可以主要为由天然药用原料——除一般通常可直接采用的药用原料黄芩外，还可以由同样也含有黄芩苷成分的其它天然药用原料，如并头草的叶和根，紫葳科植物木蝴蝶的叶和茎皮，或是车前科植物大车前的叶等天然药用原料，经提取、分离而得到。与上述的大黄总游离蒽醌一样，在采用由天然药用原料提取物方式得到的黄芩苷成分时，除可采用纯化后的单一形式化合物成分外，也可以用还包含有主要存在于其水提取物中的如黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷及其它数十种黄酮化合物等成分，以及允许存在的其它杂质成分的提取混合物，或是采用市售的商品黄芩总苷替换，但其中所含黄芩苷的重量均应≥70％。
实验结果显示，在本发明的上述药物组合物中，采用大黄总游离蒽醒的重量含量≥80％的大黄提取物和/或黄芩苷的重量含量≥70％的黄芩总苷作为有效药物成分，一般不会对本发明所说药物的药效学作用产生明显或难以接受的不利影响。
以上述组成形式的有效药用成分，与药物中可以接受的相应药用辅料或载体等辅助添加成分组合，并按相应的制药方法加工，可制成为相应的剂型的药物制剂。例如，与口服制剂中可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为片剂、丸剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂、控释剂等固体制剂形式的口服药物；与常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物。
进一步的深入试验结果已充分显示，本发明上述组成形式的药物组合物，其有效成分明确，产品质量也易于控制，在治疗糖尿病慢性并发症，特别是在对糖尿病慢性肾病，以及糖尿病眼病和糖尿病微循环病变等多种糖尿病所致慢性并发症方面的疗效确切，而且明显表现出有协同增效的作用，且多数药效指标均优于目前已有报导和使用的以单独的大黄总游离蒽醌为有效成分的药物及黄芩总苷的效果。
以下再通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应就此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更的修改，均包括在本发明的范围内。
附图说明
图1是对用本发明方法制备的有效药物成分中大黄总游离蒽醌成分的HPLC色谱分析图。
具体实施方式
实施例1
大黄药材5kg，粉碎，加80％乙醇6倍量，加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并提取液，回收溶媒，得浸膏相当于约2.5g大黄/ml。搅拌下加入浓盐酸200ml，在60℃水解5小时，冷却，过滤、水洗至PH5-6，得沉淀。沉淀粉碎，加入含5％氢氧化钠的50％乙醇溶液中，充分搅拌溶解，滤过，得碱醇溶液。加盐酸酸化至pH1-2，产生沉淀，放置过夜，过滤，用80％乙醇洗涤，干燥，即得含总游离蒽醌的大黄提取物。按上述方法进行化学成分分析并测定总游离蒽醌的含量，其主要成分为大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素等蒽醌衍生物，总含量≥80％。
取该大黄总游离蒽醌提取物100g和黄芩苷重量含量≥70％的市售黄芩总苷200g，混合均匀，干压制粒，装制胶囊1000粒，即为所述的胶囊剂型药物。
实施例2：
大黄药材5kg，切片，加水10倍量，煎煮2次，每次0.5小时，滤过，合并提取液，浓缩，得浸膏相当于约1.5g大黄/ml。搅拌下加入浓硫酸150ml，在80℃水解3小时，冷却，过滤、水洗至pH5-6，得沉淀。沉淀粉碎，加入含5％氢氧化钾的70％乙醇溶液中，充分搅拌溶解，滤过，得碱醇溶液。加盐酸酸化至pH2-3，产生沉淀，放置过夜，过滤，用50％乙醇洗涤，干燥，即得含总游离蒽醌的大黄提取物。按上述方法进行化学成分分析并测定总游离蒽醌的含量，其主要成分为大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄索甲醚和芦荟大黄素等蒽醌衍生物，总含量≥80％。
取该大黄总游离蒽醌提取物100g和黄芩苷重量含量≥70％的市售黄芩总苷300g，加药用辅料适量，混合均匀，湿法制粒，压制2000片，即为所述的片剂型药物。
实施例3：
大黄药材5kg，粉碎，加50％乙醇7倍量，加热回流提取3次，每次1小时，滤过，合并提取液，回收溶媒，得浸膏相当于约2g大黄/ml。搅拌下加入浓盐酸300ml，在70℃水解4小时，冷却，过滤、水洗至pH5-6，得沉淀。沉淀粉碎，加入含5％氢氧化钠的60％乙醇溶液中，充分搅拌溶解，滤过，得碱醇溶液。加盐酸酸化至pH1-2，产生沉淀，放置过夜，过滤，用70％乙醇洗涤，干燥，即得含总游离蒽醌的大黄提取物。按上述方法进行化学成分分析并测定总游离蒽醌的含量，其主要成分为大黄酸，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素等蒽醌衍生物，其总含量≥80％。
取该大黄总游离蒽醌提取物100g和黄芩苷重量含量≥70％的市售黄芩总苷100g，加入乙醇中，加热溶解，再加入到PEG-6000熔融液中，搅拌混合除去乙醇，待熔融液气泡除尽，在滴丸机中制成5000滴丸，即为所述的丸剂型药物。
以上述两种有效药物成分按不同比例组成形式的药物组合物作为试验药物，进行了防治糖尿病不同慢性并发症的药效学试验。在试验药物中，对大黄总游离蒽醌含量≥80％(重量)的大黄提取物(DH)/黄芩苷含量≥70％(重量)的黄芩总苷(HQ)的组成比例选择分别为1/0、1/1、1/2、1/3、1/5、1/10和0/1。其中，DH/HQ组成比例中的1/0和0/1，分别相当于以其中单一组分的大黄总游离蒽醌或黄芩苷作为有效药物成分形式的试验药物，其余各组则均为DH/HQ的混合物组。
1.对STZ糖尿病大鼠动物模型所致肾脏病变的防治作用的试验
取体重为200～240g的雄性大鼠，禁食不禁水24小时后，随机分为两组，即造型组和正常对照组。给造型组动物一次性腹腔注射STZ(链尿佐菌素)65mg.kg-1(用0.1m mol.L-1，pH4.0的枸橼酸缓冲液配制成适宜浓度)，给正常对照组动物注射相同体积的缓冲液；在注射后72小时测定其非禁食血糖和尿糖水平，选择血糖水平在16.7mmol.L-1、尿糖++++的动物作为糖尿病肾病模型动物；然后将造型成功的动物根据血糖水平和体重随机按表1分组灌胃给药，阳性药组给糖适平20mg.kg-1+卡托普利20mg.kg-1(Glur+Cap)。模型组和对照组给予相同体积的0.5％CMC(羧甲基纤维素钠)。每天灌胃给药一次，连续8周。在给药前和给药后4周测所有动物24小时的血糖、尿糖等；在给药后4周测定所有动物的尿微量白蛋白，同时每组随机取5只动物测定其血清肌酐、总蛋白、白蛋白含量等，处死动物取肾脏称重计算其脏器指数；同时用4％多聚甲醛PBS液固定肾组织以便做病理切片检测，在给药后8周时取各组剩余动物进行上述指标的检测。
1.1对STZ糖尿病大鼠动物模型尿微量白蛋白的影响
在给药后4周和8周时，分别收集各大鼠24小时尿量，混匀后分别取样用酶联免疫(ELISA)法分别测定各大鼠的尿微量白蛋白。结果如表1所示。
表1  对STZ糖尿病肾病大鼠动物模型尿微量白蛋白的影响(x±S)
 组别   剂量(mg/kg)(HQ+DH)(HQ/DH)     尿微量白蛋白(μg/24h)
    给药后4周     8周
 ControlModelHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DH   0+00+050+50(1/1)100+50(2/1)150+50(3/1)250+50(5/1)500+50(10/1)50+100(1/2)     12.8±2.8***458.3±48.7434.9±36.5315.7±31.2***364.7±28.4***444.8±49.5436.8±37.5478.2±37.1     14.5±3.1***563.8±44.7494.7±33.8*356 3±37.3***385.7±35.4***514.3±56.8523.2±37.8513.2±39.6
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH   0+50(0/1)0+100(0/2)0+150(0/3)     428.3±37.2436.2±31.5413.2±41.8     531.3±31.7522.9±33.9535.7±44.3
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH   50+0(1/0)100+0(2/0)150+0(3/0)     448.9±39.7467.1±41.7437.9±37.8     524.2±34.2523.8±41.6513.7±44.1
 Glur+Cap   20+20     324.8±35.9***     338.7±30.1***
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表1的结果显示，STZ糖尿病大鼠的尿微量白蛋白排出量明显多于正常对照组(P＜0.01)，DH、HQ及DH/HQ混合物均可减少STZ糖尿病大鼠的尿微量白蛋白排出量。由DH和HQ单组分组的结果显示，在各单组分组中，随给药量的增加，对STZ糖尿病大鼠的尿微量白蛋白排出量的减少并未产生明显的变化和影响。但适当比例形式的DH/HQ混合物组的作用(DH/HQ分别为1/1、1/2、1/3)则均分别优于DH或HQ单用组，与模型组比较有统计学差异，显示DH和HQ以适当形式组合后，在对减少STZ糖尿病大鼠的尿微量白蛋白排出量方面能具有增强协同作用。
1.2对STZ糖尿病大鼠动物模型血清肌酐的影响
在给药后4周和8周时，分别取血清按试剂盒所给方法测定各大鼠血清肌酐水平，结果如表2所示。
表2的结果显示：STZ糖尿病大鼠的血肌酐水平明显高于正常对照组，DH、HQ及DH/HQ混合物均可显著减少STZ糖尿病肾病大鼠的血肌酐水平。由DH和HQ单组分组的结果显示，在各单组分组中，随给药量的增加，对STZ糖尿病肾病大鼠的血
表2  对STZ糖尿病肾病大鼠动物模型血清肌酐的影响(x±s，N＝5)
 组别     剂量(mg/kg)(HQ+DH)(HQ/DH)     Crea(μmol.L-1)
    4周后     8周后
 ControlModelHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DH     0+00+050+50(1/1)100+50(2/1)150+50(3/1)250+50(5/1)500+50(10/1)50+100(1/2)     113.3±12.8***294.8±38.5154.5±17.8***140.3±16.4***141.8±18.9***205.3±27.8*213.2±198*243.5±31.2     121.4±11.9***260.2±15.4190.3±28.9***175.2±20.2***174.4±13.3***213.7±27.8*224.8±31.2*254.8±23.8*
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH     0+50(0/1)0+100(0/2)0+150(0/3)     244.9±30.9*240.3±26.4*237.8±19.6*     247.8±28.4*245.7±30.2*241.8±37.6*
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH     50+0(1/0)100+0(2/0)150+0(3/0)     282.8±25.3273.6±20.1252.3±24.8     275.2±31.2255.3±21.2264.9±29.8
 Glur+Cap     20+20     151.7±21.4***     175.9±40.9***
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
肌酐水平的减少并未产生明显变化和影响。但适当比例的DH/HQ混合物组的作用(DH/HQ分别为1/1、1/2、1/3)则均分别优于DH或HQ单用组，与模型组比较有统计学差异，显示出DH和HQ以适当形式组合后，对STZ糖尿病大鼠肾功能的改善能具有明显的协同作用。
1.3对STZ糖尿病大鼠动物模型肾脏指数的影响
在给药后4周和8周时，分别处死部分动物，称体重；解剖取肾脏称湿重，并且算其脏器指数。结果如表3所示。
表3  对STZ糖尿病肾病大鼠动物模型肾脏指数的影响(x±S，N＝5)
  组别     剂量(mg/kg)(HQ+DH)(HQ/DH)   肾脏指数(g/100g)
After 4W after 8W
 ControlModelHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DH     0+00+050+50(1/1)100+50(2/1)150+50(3/1)250+50(5/1)500+50(10/1)50+100(1/2)   0.62±0.05**1.34±0.151.15±0.14*1.11±0.22*1.03±0.24*1.21±0.191.28±0.231.31±0.22   0.67±0.09**2.09±0.521.41±0.551.29±0.56**1.37±0.41**1.79±0.441.68±0.451.69±0.59
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH     0+50(0/1)0+100(0/2)0+150(0/3)   1.37±0.181.28±0.201.25±0.27   1.67±0.451.34±0.371.57±0.48
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH     50+0(1/0)100+0(2/0)150+0(3/0)   1.34±0.251.26±0.331.27±0.28   1.75±0.381.59±0.491.66±0.52
 Glur+Cap     20+20   0 92±0.17**   1.18±0.32**
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表3结果显示：STZ糖尿病肾病大鼠的肾脏指数明显高于正常对照组，DH、HQ及DH/HQ混合物和阳性药可显著降低STZ糖尿病肾病大鼠的肾脏指数。由DH和HQ单组分组的结果显示，在各单组分组中，随给药量的增加，对降低STZ糖尿病肾病大鼠的肾脏指数也并未产生明显的影响。但适当比例的DH/HQ混合物组的作用(DH/HQ分别为1/1、1/2、1/3)则均分别优于DH或HQ单用组，与模型组比较有统计学差异，显示出DH和HQ以适当形式组合后，在降低STZ糖尿病肾病大鼠的肾脏指数方面能具有协同作用。
1.4 对STZ糖尿病大鼠动物模型肾小球系膜面积的影响
肾小球系膜面积的测定：取给药后2个月的大鼠肾脏，每组5只，用4％多聚甲醛固定后，切片，PAS、HE双重染色后，组织切片在尼康E600显微镜下(400涪)，用SPOT Cool CCD摄像头进行图象采集(每张切片采图10个结构完整的肾小球)，然后用image pro plus 4，10图象分析软件。测定各肾小球面积和系膜面积及其IOD值(IOD)即积分光密度值，为被测物体面积与平均光密度的乘积)并计算其系膜面积/肾小球面积的比值，结果如表4所示。
表4  对STZ糖尿病肾病大鼠动物模型肾小球系膜面积的影响(x±S，N=5)
 组别   剂量(mg/kg)(HQ+DH)(HQ/DH)   mesangium area(×103U)     IOD(×103U)     mesangium area
    glomerular area
 ControlModelHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHO：DH   0+00+050+50(1/1)100+50(2/1)150+50(3/1)250+50(5/1)500+50(10/1)50+100(1/2)   26.8±10.8***47.1±18.239.4±14.5**36.2±14.5**37.7±13.2*44.3±18.843.6±16.949.6±16.9     53.7±34.3*163.2±20.461.3±32.2**51.9±32.2**54.3±28.7**149.8±45.1156.2±26.7172.1±28.1     0.36±0.09***0.53±0.190.45±0.13*0.44±0.12**0.42±0.12**0.49±0.190.58±0.150.58±0.15
 HQ：DHHQ：DHHO：DH   0+50(0/1)0+100(0/2)0+150(0/3)   46.2±15.841.2±17.939.8±29.4     189.4±26.7145.2±31.2144.7±29.8     0.51±0.170.48±0.190.47±0.16
 HQ：DHHQ：DHHO：DH   50+0(1/0)100+0(2/0)150+0(3/0)   36.0±28.041.3±17.639.7±21.5     98.2±37.6103.7±29.497.6±35.1     0.49±0.210.44±0.220.58±0.21
 Glur+Cap   20+20   39.1±14.8*     80.4±80.9**     0.51±0.23
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表4的结果显示，STZ糖尿病肾病大鼠的肾小球系膜面积及其IOD值以及系膜面积/肾小球面积的比值等均显著增加。由DH和HQ单组分组的结果显示，在各单组份组中，随给药量的增加，对减少STZ糖尿病肾病大鼠肾小球系膜面积及其IOD值认及系膜面积/肾小球面积并没有产生显著性的影响。但适当比例的DH/HQ混合物组的作用(DH/HQ分别为1/1、1/2、1/3)则均分别优于DH或HQ单用组，与模型组比较有统计学差异，显示DH和HQ以适当形式组合后，在减少STZ糖尿病肾病大鼠肾小球系膜面积及其IOD值以及系膜面积/肾小球面积等方面能具有协同增强作用。
2.对STZ糖尿病大鼠动物的死亡率和白内障发生率的影响试验
在实验期间，仔细记录各组动物在实验期间的死亡情况及眼白内障的发生情况，结果如表5所示。
表5  对STZ糖尿病大鼠动物死亡率、白内障发生率的影响(x±S)
 组别 剂量(mg/kg)(HQ+DH)(HQ/DH)     N   死亡情况   白内障发生
  动物数(只)     死亡率(％)   动物数(只)     发生率(％)
 ControlModelHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DHHQ：DH 0+00+050+50(1/1)100+50(2/1)150+50(3/1)250+50(5/1)500+50(10/1)50+100(1/2)     1022202020202020   0*1252*4*688     0*54.525.010.0*20.0*30.040.040.0   0*1230**2*2*35     0*54.515.00**10.0*10.0*15.025.0
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH 0+50(0/1)0+100(0/2)0+150(0/3)     202020   877     40.035.035.0   1089     50.040.045.0
 HQ：DHHQ：DHHQ：DH 50+0(1/0)100+0(2/0)150+0(3/0)     202020   11010     55.050.050.0   765     35.030.025.0
 Glur+Cap 20+20     20   4*     20.0   2*     10.0*
注：与模型组比较：*P＜0 05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表5的结果显示，STZ糖尿病大鼠在实验期间的死亡发生率和白内障的发生率等均显著增加。由DH和HQ单组分组的结果显示，在各单组分组中，随给药量的增加，在减少STZ糖尿病大鼠的死亡率和白内障发生率方面均没有能产生显著性的改善影响。但适当比例的DH/HQ混合物组的作用(DH/HQ分别为1/1、1/2、1/3)，则均分别优于DH或HQ单用组，特别是其中HQ/DH＝2/1组的死亡率及白内障发生率还均明显低于其他组，与模型组比较有统计学显著性差异，提示DH与HQ以适当形式组合后，对防治STZ糖尿病大鼠的死亡及白内障的形成有明显的协同和增强作用。
在上述试验结果的基础上，以本发明上述HQ/DH(2/1)组合形式的试验药物进一步进行了以下的相关试验。
3.急性毒性试验
对小鼠以灌胃方式给以试验药物，测得其LD50大于6.5g/kg，但未测出其LD50。除动物出现拉稀大便等不良反应外，未见明显其它的不良反应。
4.对STZ糖尿病大鼠的部分其它主要药效学指标的影响试验
取体重为200～240g的雄性大鼠，禁食不禁水24小时后，随机分为两组，即造型组和正常对照组。给造型组动物一次性腹腔注射STZ 65mg.kg-1(用0.1mmol.L-1，pH4.0的枸橼酸缓冲液配制成适宜浓度)，给正常对照组动物注射相同体积的缓冲液；在注射后72小时测定其非禁食血糖和尿糖水平，选择血糖水平在16.7mmol.L-1、尿糖++++的动物作为糖尿病肾病模型动物；然后将造型成功的动物根据血糖水平和体重随机按表5分组，分别灌胃试验药物75mg/kg、150mg/kg、300mg/kg，阳性药组给糖适平20mg.kg-1+卡托普利20mg.kg-1。模型组和对照组给予相同体积的0.5％CMC。每天灌胃给药一次，连续8周。在实验期间，记录各组动物的死亡数及动物出现白内障的时间，在给药后8周测定所有动物的尿微量白蛋白(μAlb)、尿肌酐(Crea)、血清肌酐(Crea)、血清尿素(BUN)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)含量及甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)等，处死动物取肾脏称重计算其脏器指数。结果如表6～表10所示。
表6  试验药物对STZ糖尿病肾病大鼠动物模型肾脏指数的影响(x±S)
组别    剂量(mg.kg-1)     N     肾脏指数(g/100g)
ControlModel试验药物试验药物试验药物Glur+Cap 7515030020+20     101010101010     0.60±0.03**1.33±0.321.19±0.361.10±0.19*1.05±0.21*1.03±0.18*
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表6的结果显示，模型组动物的肾脏指数明显增加，与对照组比较，有统计学差异；试验药物可显著对抗糖尿病肾病大鼠的肾脏肿大，与模型组比较有统计学差异；其作用与阳性药相似。
表7  试验药物对STZ糖尿病大鼠尿蛋白排泄量的影响(x±S)
组别  剂量(mg.kg-1)   N     TP   TP/Crea     uAlb/Crea
    (g/L)   g/mmol     ug/mmol
ControlModel试验药物试验药物试验药物Glur+Cap 7515030020+20   101010101010     3.9±1.4**8.6±2.86.2±3.88.5±2.35.3±2.4*8.6±3.8   1.5±0.4**18.2±9.712.4±9.216.3±8.89.3±7.6*15.1±10.0     6.1±5.8*51.8±52.940.8±35.944.2±36.110.1±10.0*45.5±71.6
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表7的结果显示：试验药物可显著降低STZ糖尿病大鼠总蛋白排泄量及尿微量蛋白的排泄率，其作用明显优于阳性药。
表8  试验药物对STZ糖尿病大鼠血脂的影响(N＝10，x±S)
组别    剂量(mg.kg-1)   TC(mmol/L)   HDL(mmol/L)  LDL(mmol/L)   VLDL(mmol/L)   TC/HDL
ControlModel试验药物试验药物试验药物Glur+Cap 7515030020+20   1.8±0.5**3.6±1.72.6±0.53.4±1.82.8±0.83.1±1.2   0 8±0.10.9±0.30.9±0.30.8±0.20.9±0.30.8±0.1  0.3±0.4**1.3±1.11.1±0.51.0±1.01.2±0.61.0±0.7   1.5±0.2**2.4±0.51.6±0.3**2.3±0.91.6±0.3**2.0±0.7   2.4±0.56.6±8.23.1±0.75.8±7.03.7±2.13.9±1.5
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表8的结果显示：试验药物可显著降低STZ糖尿病大鼠血清极低密度脂蛋白(VLDL)水平，与模型组比较有统计学差异，其作用明显优于阳性药，。
表9  试验药物对STZ糖尿病大鼠肾功能的影响(N＝10，x±S)
  组别     剂量(mg.kg-1)  血肌苷(mmol/L)   BUN(mmol/L)    BUN/Crea   内生肌苷清除率
  ControlModel试验药物试验药物试验药物Glur+Cap 7515030020+20  0.12±0.01*0.13±0.010.13±0.010.14±0.030.13±0.030.13±0.01   8.5±1.1*19.4±11.310.9±6.49.2±2.3**7.9±0.3**10.7±3.4*    73.6±13.5*145.7±84.180.7±42.266.0±14.7*60.8±22.6*80.0±21.8*   8.8±2.3**15.4±6.622.2±38.215.1±8.122.6±31.712.9±3.9
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表9的结果显示：试验药物可显著降低STZ糖尿病大鼠血清尿素水平及血清尿素与血清肌苷比值，其作用与阳性药的作用相似，与模型组比较有统计学差异，提示试验药物可显著改善糖尿病大鼠的肾功能。
表10  试验药物对STZ糖尿病大鼠的影响(x±S)
组别    剂量(mg.kg-1)     N   死亡数(只)     死亡率(％)    白内障(只)     白内障发生率(％)
ControlModel试验药物试验药物试验药物Glur+Cap 7515030020+20     222521202221   0134444     052192018.2*19.0     09210*0*     0369.55.00*0*
注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表10的结果显示：试验药物可显著降低STZ糖尿病大鼠的死亡率，降低其白内障发生率，其作用与阳性药的作用相近。
上述试验结果均显示：以大黄总游离蒽醌(DH)与黄芩苷(HQ)为有效药物成分的本发明药物组合物，其毒性甚小；对STZ大鼠的死亡率有显著的降低作用，并可显著减少STZ大鼠白内障的发生率；对STZ大鼠的尿微量蛋白排出量、尿总蛋白含量及尿总蛋白排泄率、血清尿素水平、BUN/Crea比值、血清VLDL水平、肾脏指数、肾小球面积等方面也均有显著的改善作用，该两类成分以适当形式的组合，并可以产生显著的增强协同作用，表明了本发明的药物组合物在防治糖尿病的多种慢性并发症，特别是在对如糖尿病微血管病变、糖尿病肾病及糖尿病眼病等方面，具有显著的意义和价值。

Claims (10)

1.治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，其特征是以大黄总游离蒽醌与黄芩总苷为有效药物成分，与药物中可以接受的辅助添加成分组成，大黄总游离蒽醌/黄芩总苷的重量比为1/1～1/5。
2.如权利要求1所述的治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，其特征是所说的有效药物成分中大黄总游离蒽醌与黄芩总苷的重量比为1/2～1/3。
3.如权利要求1所述的治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，其特征是所说有效药物成分允许采用大黄总游离蒽醌的重量含量≥80％形式的大黄提取物和/或黄芩总苷的重量含量≥70％形式的黄芩提取物。
4.如权利要求1至3之一所述的治疗糖尿病慢性并发症的药物组合物，其特征是所说的药物为口服型制剂。
5.制备权利要求1所述治疗糖尿病慢性并发症药物组合物中有效药物成分大黄总游离蒽醌的方法，其特征是将以含乙醇0-95％的水溶液对大黄药材加热回流提取后，过滤并除去滤液溶媒得到浸膏体，将浸膏体于温度50℃-100℃和pH＜1的酸性条件下进行水解后，将水解沉淀物置于pH＞14和体积含量为50％-80％的碱性乙醇水溶液中搅拌溶解，将除去沉淀后的该碱性含醇滤液再酸化至pH 1-5，其沉淀物即为大黄总游离蒽醌的重量含量≥80％的大黄提取物。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说的对来自大黄药材的浸膏体的水解采用按100g大黄药材原料加重量体积比为1～10％的酸，在50-100℃条件下处理1-10小时。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是水解用的酸为盐酸或硫酸。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说的pH＞14的碱性乙醇水溶液为含有重量比为1-8％的氢氧化钠或氢氧化钾的乙醇溶液。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征是对所说的碱性含醇滤液用盐酸进行酸化。
10.如权利要求5至9之一所述的制备方法，其特征是对由酸化溶液中过滤得到所说的含大黄总游离蒽醌的提取物后，再用含量为50-95％的乙醇进行洗涤。
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黄芩苷对糖尿病患者红细胞醛糖还原酶活性及周围神经传导速度的影响 刘长山，中国神经科学杂志，第18卷第2期 2002 *
黄芩苷对糖尿病患者红细胞醛糖还原酶活性及肾小球滤过率的影响 郭啸华等，中国中药杂志，第26卷第9期 2001 *

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