CN1330630A - 作为细胞凋亡诱导化合物的7－芳基－6(z)庚三烯酸维生素a酰胺及其作为抗癌药剂的应用 - Google Patents
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Abstract
式(Ⅰ)的新颖的三烯酸类维生素A化合物,其中R1－R7的定义如说明书中的定义,具有细胞凋亡活性,并用于预防和治疗癌症。
Description
维生素A酸(RA)可调节体内和体外的正常和恶性细胞的生长和分化，现在已深入地研究了其作为多种恶性肿瘤的治疗剂和预防剂的潜在用途。已知通过细胞核的维生素A酸受体(RAR)α，β和γ发挥作用的全反式RA和13-顺式RA，在体外会引起某些肿瘤细胞的分化。已知可与一组被称为维生素A酸X(RXR)α，β和γ受体的受体相结合，也可与RAR α，β和γ受体结合的9-顺式RA及其类似物，可引起肿瘤萎缩。全反式RA和13-顺式RA诱导细胞凋亡的能力是非常有限的，然而，全反式RA的4-羟基苯基酰胺(4-HPR)，通过使细胞凋亡，可抑制肿瘤的形成及肿瘤的生长[JBC 271，22441(1996)A.N.Fanjul等；BBRC 224，837(1996)A.Dipietrantonio等；Cancer Res.，55，853(1995)M.Ponzoni等]。
细胞凋亡，或按照程序的细胞死亡，是真核细胞死亡的最普通的形式之一，其特征在于与相邻细胞的接触减少，染色质聚集，膜起泡，细胞质浓缩，及产生特征DNA片段(一种细胞凋亡的基准)的内生核酸内切酶的活化，并最终形成被其它细胞吞噬的凋亡体。细胞凋亡是一种正常过程，并且在发育及整个一生中组织的建立，塑造及维持，均涉及该过程。细胞凋亡还是抵抗病毒传染及癌症出现的重要的防御机制。癌症的发展似乎既涉及过量的细胞增殖，同时还抵抗了正常的细胞凋亡。许多肿瘤促进剂显示出可引起对细胞凋亡的抵抗[FASEB Journal 8，864(1994)S.C.Wright等]。
虽然已发现维生素A酸在治疗癌症中是有效的，但很多维生素A酸和其它类维生素A化合物是非常有毒的，会产生有害的副作用，例如维生素A过多症，这限制了其在癌症的预防及治疗中的应用。在治疗乳癌时情况变得更加复杂，因为癌细胞能够改变其对治疗中使用的化合物的灵敏性。随着抗雌激素治疗的进行，最初对雌激素受体显阳性(ER+)的细胞，可以变为对雌激素受体显阴性(ER-)。维生素A酸和类维生素A化合物与大多数化学治疗剂一样仅对ER+乳癌细胞具有活性，对雌激素受体阴性ER-乳癌细胞没有活性。[Can Res 50，1997(1990)J.A.Fontana等；Mol Cell Endocrinol 91，149(1993)B.Van der Burg等]。因此，对ER-和ER+乳癌细胞都显示活性的化合物，对治疗乳癌是非常重要的。
对可能的抗肿瘤/抗癌治疗活性的初步测定，是在未死亡的癌细胞中对细胞凋亡，或按程序的细胞死亡的诱导作用。许多现有的化学治疗剂(例如5FU，Adriamycin，Taxol)，及放射疗法，可在体外导致人体癌细胞的凋亡[Cancer 79，12(1997)K.Sugamura等；Cancer Lett.93，147(1995)S.M.Tu等；Ann NY Acad.Sci784，550(1996)R.M.Gangemi等]。另一种测定抗肿瘤或抗癌活性的方法，是对细胞生长的抑制，或细胞循环静止，这可抑制细胞分裂，尽管不必杀死细胞。现已表明，一种特定的维生素A酸酰胺，即全反式4-羟基苯基维生素A酰胺(4-HPR)，在ER+和ER-乳癌细胞中都能够抑制细胞生长并引起细胞凋亡[Cancer Lett.107，65(1996)T.T.Y. Wang等]。
已知这种化合物在很多其它类型的肿瘤细胞，包括肺癌细胞和血癌中，也可以抑制细胞生长并导致细胞凋亡。在对能有效地活化RAR的类维生素A具有抵抗力的细胞中，4-HPR可有效地诱导细胞凋亡[Carcinogenesis 16，2477(1995)M.S.Sheikh等；Cancer Res.53，6036(1993)D.Delia等]。4-HPR在体内能够引起肿瘤的萎缩[Clin.Cancer Res.4，1345(1998)C.P. Zou等；Otolaryngol Head Neck Surg 118，464(1998)R.L.Scher等；Cancer Lett 47，187(1989)K.Dowlatshahi等]，并作为许多恶性肿瘤的有效的化学预防剂[Cance Res.39，1339(1979)R.C.Moon等；Cancer Res.54，2032S(1994)A.Costa等；Anticancer Res.17，499(1997)L.N.Chan等]。在体外，4-HPR表现出能引发ER+和ER-乳癌细胞系细胞凋亡，并能抑制细胞生长。4-HPR在临床上表现出的主要毒性为夜盲症。
已有报道，芳香6-顺式三烯酸能引起癌细胞凋亡，并具有较低的毒性(WO96/20913)。然而，现已发现，一种这样的化合物对ER+和ER-癌细胞是没有活性的，因为它不能引起细胞凋亡[(2E，4E，6Z)-7-(3，5-双(三氟甲基)苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸]。因此，这种化合物吸引力就很小了。
令人惊讶的是，本发明的7-芳基-6顺式庚三烯酸维生素A酰胺在体外对ER+和ER-乳癌细胞都是有效的，在NMU大鼠肿瘤模型中可减少肿瘤的数量，并且未表现出通常与类维生素A相伴的毒性或副作用。
一方面，本发明包括式I的化合物：
其中R1和R2独立地为氢，卤素，烷基，烷氧基或三卤代甲基；R3为氢或烷基；R4为氢，只有当R3为烷基时，R4可以为烷基；R5，R6，及R8和R9独立地为卤素，氢，羟基，烷基或烷氧基；并且R7为氢或烷基；其中没有6-反式异构体。
这些6Z(例如7-芳基-6-顺式)庚三烯酸维生素A酰胺化合物，对于引发恶变前的细胞及恶性细胞凋亡是有效的。这种化合物可抑制癌性的块状肿瘤细胞增殖，特别是非小型细胞的肺癌，直肠癌和乳癌，因此其对于治疗形成块状肿瘤的癌症，特别是非小型细胞肺癌，结肠直肠癌和乳癌是有效的。
此处所述的这种化合物，在ER-乳癌细胞及ER+细胞中，对于引发细胞凋亡都是特别有效的。而且，本发明的6-顺式维生素A酰胺(6-cisretinamide)化合物在癌细胞中引发细胞凋亡是有效的，所述的癌细胞曾经是ER+的，最终变成ER-。最后，这些化合物在足以避免有害的或有毒副作用的较低的剂量水平下也是有效的。
尽管优选R7为氢，在本发明的任何一个化合物中R7可以是诸如甲基的烷基。类似地，尽管优选的化合物是如下式II所示的那些化合物，其中在式I中被R5，R6，及R8和R9占据的位置都为氢，但是在本发明的任何一个化合物中，这些取代基中的任何一个或多个，可以是任意组合的卤素，或羟基，或烷基，或烷氧基。
特别感兴趣的化合物是式II的化合物：
其中R1，R2，R3和R4如上所定义。
其它感兴趣的化合物包括式I的化合物，其中R3为诸如甲基的烷基，并且R4为氢，或R3和R4都为诸如甲基的烷基，或R3和R4都为氢。感兴趣的化合物还有式I的化合物，其中R1和R2独立地为氢，诸如溴的卤素，诸如甲基的烷基，诸如甲氧基的烷氧基，或三卤代甲基，特别是三氟甲基。本发明还有一部分是式II的化合物，其中R3为诸如甲基的烷基，并且R4为氢，或R3和R4都为诸如甲基的烷基，或R3和R4都为氢，及式II的化合物，其中R1和R2独立地为氢，诸如溴的卤素，诸如甲基的烷基，诸如甲氧基的烷氧基，或三卤代甲基，特别是三氟甲基。
在本发明的任何一个组合物中，R1和R2可以是相同的或不同的。因此，在如下所述的任何一个化合物中(式I的化合物：i，ii，或iii，式II的化合物：i，ii，或iii)，R1和R2优选相同，但也可以不同。因此在其中R1和R2为卤素的化合物中，R1和R2可以是相同的或不同的卤素。类似地，R1和R2可以是相同或不同的烷基或烷氧基。另外，R1和R2可以是不同的基团，即R1可以为卤素，而R2为烷基，或R1可以为烷基，而R2为氢等等。
感兴趣的是式I的化合物，其中：i)R3为诸如甲基的烷基，并且R4为氢；或ii)R3和R4都为氢；或iii)R3和R4都为诸如甲基的烷基。当R1和R2都为三氟甲基时，i，ii，或iii这样的化合物是特别感兴趣的。在i，ii，或iii的其它化合物中，R1和R2也可以是诸如溴的卤素，诸如甲基的烷基，诸如甲氧基的烷氧基，或氢。在更优选的化合物中，R3为诸如甲基的烷基，并且R4为氢。因此，例如这样一些化合物，其中R3为烷基，R4为氢，并且R1和R2都为三氟甲基，或其中R3和R4都为氢，并且R1和R2都为卤素，或R3和R4都为氢，和R1和R2都为甲氧基，以及具有在本段第一部分所述特征的其它化合物，例如，如上所述的i或ii或iii的化合物，其中R1和R2为卤素，烷基，烷氧基或氢等，是本发明的一部分。
另外感兴趣的是式II的化合物，其中：i)R3为诸如甲基的烷基，并且R4为氢；或ii)R3和R4都为氢；或iii)R3和R4都为诸如甲基的烷基。当R1和R2都为三氟甲基时，i，ii，或iii这样的化合物是特别感兴趣的。在i，ii，或iii的其它化合物中，R1和R2也可以是诸如溴的卤素，诸如甲基的烷基，诸如甲氧基的烷氧基，或氢。在更优选的化合物中，R3为诸如甲基的烷基，并且R4为氢。因此，例如这样一些化合物，其中R3和R4都为氢，并且R1和R2都为溴，或R3和R4都为烷基，并且R1和R2都为卤素，或R3为烷基，R4为氢，并且R1和R2都为甲氧基，以及具有在本段第一部分所述特征的其它化合物，例如，如上所述的i或ii或iii的化合物，其中R1和R2为卤素，烷基，烷氧基或氢等，是本发明的一部分。
因此，本发明的化合物包括例如其中R3为甲基，并且R4为氢的式II的化合物。在一个这样的化合物中，R1和R2都为三氟甲基。这样的化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，是特别优选的化合物。在另一个这样的化合物中，R1和R2都为溴。这样的化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。在另一个这样的化合物中，R1和R2都为甲基。这样的化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。在另一个这样的化合物中，R1和R2都为甲氧基。这样的化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。还有一种这样的化合物，其中R1和R2都为氢。这样的化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。
本发明还包括其中R3和R4都为氢的式II的化合物。在一种这样的化合物中，R1和R2都为三氟甲基。这种化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。在另一种这样的化合物中，R1和R2都为溴。在另一种这样的化合物中，R1和R2都为甲基。在另一种这样的化合物中，R1和R2都为甲氧基。还有一种这样的化合物，其中R1和R2都为氢。
本发明还包括其中R3和R4都为甲基的式II的化合物。在一种这样的化合物中，R1和R2都为三氟甲基。这种化合物的一个实例为N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。在另一种这样的化合物中，R1和R2都为溴。在另一种这样的化合物中，R1和R2都为甲基。在另一种这样的化合物中，R1和R2都为甲氧基。还有一种这样的化合物，其中R1和R2都为氢。
此处使用的术语“烷基”，是指含有最高达7个碳原子的饱和烃基。类似地，术语“烷氧基”，是指含有最高达7个碳原子，并通过氧原子相连的化合物。烷基和烷氧基可以是直链的或支化的，例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基和叔丁基，或甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基和叔丁氧基。三卤代甲基是指被三个卤原子取代的甲基，优选三个卤原子相同，但也可以不同。三氟甲基是三卤代甲基的一个实例。术语“卤代”，是指氟代，氯代，溴代，或碘代，而术语“卤素”，是指氟，氯，溴，或碘。
这些化合物对于抑制或防止恶变前及恶性细胞的肿瘤生长是有效的，并且对于治疗形成块状肿瘤的癌症，特别是结肠癌，前列腺癌，或宫颈癌，非小型细胞肺癌，小型细胞肺癌，头颈癌，及乳癌是有用的，而不管涉及的细胞是ER+还是ER-。这些化合物对于乳癌，结肠直肠癌和非小型细胞肺癌是特别有效的。本发明的化合物可用于治疗这类肿瘤，阻碍这类肿瘤的发展，并防止肿瘤数量的增加。
本发明化合物的抗癌治疗活性，可以用各种标准的体外试验证明。已知在下面及实施例中公开的这类试验，可显示抗癌活性，并且是癌症治疗的试验。本发明的化合物具有式I所示的结构，并具有用任何标准试验，特别是细胞凋亡试验测定的抗癌活性。该化合物对于诱导癌细胞凋亡，引起细胞死亡是特别有效的。因此，如果一种化合物能引起暴露于化合物的癌细胞死亡，则该化合物具有所需的活性。试验用的癌细胞(例如乳癌，肺癌，结肠直肠癌细胞等)，很容易由细胞仓库，例如美国典型培养物收藏中心(ATCC)获得，或可由技术人员由癌症患者身上分离得到。可用试验中使用的细胞类型来确定化合物最有效地抵抗的癌症的类型。例如，一种影响ER-乳癌细胞的化合物，将对治疗乳癌，特别是反转的ER+细胞是有效的。
在培养物中生长的癌细胞，可以用特定的化合物孵育，并且可以用例如对死亡细胞选择染色的染料或用光密度(O.D.)测量的方法测定细胞生存能力的改变。如果有超过10％的细胞死亡，则该化合物对于诱导细胞凋亡是有活性的。该化合物可能不直接杀死细胞(细胞毒性)，但可以调节某些细胞内或细胞外的活动，而导致细胞凋亡。本发明化合物的抗癌活性，也可以通过获取化合物对细胞生长及分化的影响试验来确定。对细胞生长的抑制作用，可通过下列方法来确定：向培养物中的癌细胞中加入研究的化合物和染料或放射性前体，并用显微镜细胞计数计，闪烁计数计，或O.D.测量法来确定在培育期中细胞的数量是否增加。如果细胞的数量没有增加，则表明细胞的生长被抑制，并且认为该化合物具有治疗活性。类似地，加入试验化合物后，发生分化的细胞比例可用已知的方法来确定(例如，在HL-60细胞中测定氧化脉冲，分化指示剂，NBT)。如果有10％或更多的细胞分化，则认为该化合物具有治疗活性。实施例IIA中提供了特殊试验的例子。
体内试验也用于证明抗癌活性。本发明的化合物在已经诱导肿瘤生长的试验动物，例如小鼠中，可起到减小肿瘤大小和/或肿瘤数量的作用。肿瘤的类型显示出初级活性预期可以抵抗的癌症类型。特定的肿瘤可以通过用致癌物扰乱特定的组织来诱导，或通过注射特定类型的癌细胞来诱导。在实施例IIB中提供了这样的试验。当评价在大鼠中抵抗NMU引发的乳房肿瘤时，本发明的化合物显示出明显的预防和治疗活性。令人惊讶的是，在有效的剂量和施用方法下，没有明显的毒性。该化合物以不产生毒性的剂量和施用方法，在试验过程(即化学预防)中对于减少肿瘤的数量也是有效的。而且，该化合物是治疗活性的，即，能够引起已出现的初期肿瘤萎缩。该化合物还有预防性，即，能够显著防止新肿瘤的形成。以前在这种实验的动物模型中没有观察到具有这些治疗和预防活性的类维生素A。
因此，本发明的化合物是治疗活性的，可引起块状肿瘤的萎缩或缓解，特别是那些与癌症，例如乳癌(ER+，和特别是ER-)，肺癌和直肠结肠癌相关联的肿瘤。
按照本发明，通过给患者系统地施用治疗癌症有效量的本发明的化合物，来达到治疗癌症的目的。特别地，本发明包括治疗乳癌的方法，该方法是通过向患有乳癌的个体提供能够有效抑制癌症，或癌细胞生长的量的本发明化合物来实现的。抑制癌细胞的生长是指使生长停止，引起细胞凋亡，或引起分化，或者改变细胞本质以使其无害。该化合物也可预防性地施用，例如给有患癌症危险的人施用，或给已进行了有效治疗的人施用，通常是以比治疗量低的剂量施用。化合物的用量取决于癌症的类型，肿瘤的数量和大小，及患者的需要。通常，约1mg/kg～约500mg/kg体重，优选约20mg/kg～约100mg/kg的日用量，是有益的基本范围，该日剂量可由医生根据病人的特征和需要及病人的状况进行改变。这种治疗典型地是进行约3个月，但这取决于病人的情况和医生的诊断。在预防性服用时，服用的持续时间取决于病人的情况和医生的计划，但通常会持续长于3个月的时间。对于如上所述的治疗，本发明的化合物是以组合物的形式系统地服用的，该组合物含有本发明的化合物，及与所述化合物相容的适合药用的载体。在制备这种组合物时，可以使用任何常规的适合药用的载体。通常，优选的单位剂量形式是片剂或胶囊，根据病人的体重和大小，一天可以服用一次或两次。本发明的化合物可以作为单一的治疗手段服用，或可以与其它化学或生化治疗联合使用，或与放射或外科手术联合使用。
按照本发明，本发明的化合物可以以其适合药用的可水解的酯或前体药物形式服用。在本发明的组合物和方法中，可以使用任何适合药用的可水解的酯。在酯中有芳香酯，例如苯甲酰基酯，例如其中R7为C(O)苯基，或烷酰基酯，例如其中R7为C(O)烷基，其中烷基可以为甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基等。
本发明的药物组合物可以制成任何常规的形式，包括：(a)适于口服或栓剂服用的固体形式，例如片剂，胶囊，药丸，粉末，颗粒等；(b)适于静脉内或肠胃外给药的无菌的，典型的水溶液或悬浮液，和(c)适于局部用药的制剂，例如溶液，悬浮液，药膏，乳膏，胶冻，微粉化的粉末，气溶胶等。该药物组合物可以被消毒，和/或可以含有辅剂，例如防腐剂，稳定剂，湿润剂，乳化剂，调节渗透压的盐，和/或缓冲液。
本发明的化合物特别适合用于适合药用的口服形式中。这些药物组合物含有一种或多种本发明的化合物，或其适合药用的盐，及其适合药用的可水解的酯，还含有相容的适合药用的载体材料。可以使用任何通用的载体材料。该载体材料可以是适于口服给药的有机或无机惰性载体材料。合适的载体包括水，明胶，阿拉伯树胶，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，滑石，植物油，聚(亚烷基)二醇，石油膏等。而且，该药物制剂可以含有其它药物活性剂，优选具有RARα活性的类维生素A。可以按照药物组合物可接受的方式，加入另外的添加剂，例如调味剂，防腐剂，稳定剂，乳化剂，缓冲液等。
该药物制剂可以制成任何常规的口服剂量形式，包括适于口服的固体形式，例如片剂，胶囊，药丸，粉末，颗粒等。优选的口服剂量形式包括片剂，硬或软的明胶胶囊，甲基纤维素或其它在消化道中易于溶解的合适材料的胶囊。按照本发明的口服剂量，应根据病人个体的需要而改变，由开处方的医生确定。
采用标准的起始原料，试剂，并按照下面及实施例1中提供的方法的指导，技术人员可以制备没有6-反式异构体的本发明化合物。
流程图1
采用标准的偶合反应条件(例如，CuI，PPh3，Pd(PPh3)2Cl2，在二异丙基胺中)，使其中R1和R2如式I中所定义的卤代的苯基衍生物(优选溴代或碘代)(1)与乙炔，例如三甲基硅基乙炔(a)反应，用乙炔取代溴(2)，该反应优选在0℃～室温进行。硅基的水解采用强碱，例如氢氧化钾，和混合溶剂，优选醚，乙醚或四氢呋喃，和合适的含水溶剂，例如低级醇(优选甲醇)和水(b)。将得到的乙炔化物(3)与强碱，例如双(三甲基硅基)氨化锂和CO2(c)反应，得到羧酸(4)。该酸用标准的酯化试剂(d)进行酯化，例如可以使用重氮甲烷得到甲酯(5)。然后在标准的还原条件下，将三键还原为顺式双键，例如在Lindlar催化剂催化下用氢气还原(e)，得到(Z)或顺式化合物(6)。
流程图2
在流程图2中，步骤(a)和(b)按照流程图1中所述的条件进行。得到的乙炔化物(3)与强碱例如正丁基锂，和氯甲酸甲酯，在非质子传递溶剂例如四氢呋喃中(c)反应，得到酯(4)。在非质子传递溶剂，例如四氢呋喃和乙酸乙酯中，优选在约-70℃(d)，将(4)与二甲基铜锂反应，可形成三取代的顺式双键，得到(Z)或顺式化合物(5)。
流程图3
采用标准的Horner反应条件，使用碱例如氢化钠，在二甲氧基乙烷中，优选在-78℃～0℃，使其中R1和R2如式I中所定义的苯甲醛衍生物(1)与膦酰基乙酸酯，例如2-碘代膦酰基乙酸三乙酯反应。将该反应的产物与双(三甲基硅基)氨化锂，在四氢呋喃中(a)反应，将中间产物乙烯基碘化物完全转化成乙炔化物(2)。使(2)与二甲基铜锂在四氢呋喃中，优选在约-70℃(b)反应，可形成三取代的顺式双键，得到(Z)或顺式化合物(3)。
流程图4
采用标准的Horner反应条件(例如叔丁氧基钾)，使其中R1和R2如式I中所定义的甲基苯基酮衍生物(1)，与Horner试剂(a)(例如2-膦酰基烷酸三烷基酯，例如当其中R4为H时用膦酰基乙酸三乙酯，或当其中R4为CH3时用2-膦酰基丙酸三乙酯)反应，得到E/Z异构体混合的酯(2)。然后用标准方法将得到的E和Z(反式和顺式)异构体分离。
流程图5采用标准的Peterson烯化反应条件，使用强碱例如二异丙基氨化锂，或烷基锂，在非质子传递醚溶剂，例如THF或乙醚中，使其中R1和R2如式I中所定义的甲基苯基酮衍生物(1)，与(三甲基硅基)乙酸乙酯(a)反应，得到E/Z异构体混合的酯(2)。然后用标准方法将得到的E和Z异构体分离。
流程图4和5是直接的，但是得到的产物是需要分离的异构体混合物，而其它流程得到的都只是(Z)或顺式异构体。
流程图6在标准条件下，使用将酯还原为醇的试剂，例如氢化锂铝或氢化二异丁基铝(a)，在合适的溶剂，例如甲苯，乙醚或其它己烷中，优选在约-30℃～0℃，将前面流程的(Z)丙酸的甲酯或乙酯(1)，还原成相应的醇(2)。使用合适的试剂，例如二氧化锰(b)，将醇(2)氧化成醛(3)。该醛与3-甲基-4-膦酰基丁烯酸酯和合适的碱，例如双(三甲基硅基)氨化锂反应，优选在约-70℃～约5℃进行(c)，得到酯(4)。该酯与水解试剂，例如诸如氢氧化钾或氢氧化钠的强碱，在含水溶剂，例如水和低级醇(例如甲醇或乙醇)中，优选在约80℃(d)反应，得到羧酸(5)。该羧酸与生成酰氯的试剂，例如氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐，或草酰氯(e)反应，得到酰氯(6)。在将酰氯转化成酰胺的标准条件(例如吡啶和二甲基甲酰胺)下，使该酰氯与如下物质反应：
，其中R5，R6，R8和R9如式I所定义，并且R7’是标准的羟基保护基，例如三甲基硅基(f)，得到6(Z)或6-顺式酰胺(7)。然后，采用技术人员众所周知的原料和方法，可以制备任意一种带R5～R9基团的氨基酚。
下面的实施例是用于说明本发明的，而不是以任何方式对其进行限制。
实施例I合成总述：所有反应都是在氩气氛和避光下进行的。HPLC柱为Waters Prep Pak硅胶(Porasil)15-20um，125A。LA)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺的制备
将1-[3，5-双(三氟甲基)苯基]乙炔(31.0g，130mmol)在600mL THF中的溶液冷却到-40℃，并用双(三甲基硅基)氨化锂(1.0M)(135mL，135mmol)处理。搅拌几分钟后，将二氧化碳气体通过套管鼓入该冷溶液中。加入过量的二氧化碳后，将反应物在室温下搅拌直到其温度升至-20℃。将该反应物倾注到1.5L水中，并用磷酸水溶液(50％)将其pH值调节到3。加入盐水，并用氯仿萃取产品(2x)。有机萃取物用水/盐水洗涤，干燥(MgSO4)，除去溶剂，得到31g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]丙炔酸，其放置可固化，并且不需进一步纯化。1H NMR(CDCl3)δ 8.80(1H，宽)，8.06(2H，s，芳香氢)，7.98(1H，s，芳香氢)。
将3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]丙炔酸溶解在THF和乙醚的混合物中，并用重氮甲烷处理至所有的酸都被甲基化为止。除去所有的溶剂，并将得到的油状物用色谱法(10％乙醚/己烷)纯化，得到30.5g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]丙炔酸甲酯。1H NMR(CDCl3)δ 8.06(2H，s，芳香氢)，7.94(1H，s，芳香氢)，3.88(3H，O-CH3)。
将溴化亚铜(I)-二甲硫醚复合物(22.6g，110mmol)，悬浮于已脱气并置于氩气氛下的1.2L THF(干燥)中。将悬浮液搅拌下冷却到0℃，并滴加1.4M的MeLi乙醚溶液(157mL，220mmol)。搅拌15分钟后，将该反应物冷却到-78℃，并滴加3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]丙炔酸甲酯的THF(150mL)溶液。反应混合物在该温度下搅拌1h。然后将该反应物直接倾注到充分搅拌的，含有250mL 20％磷酸水溶液的THF(500mL)溶液中。得到的混合物在室温搅拌10分钟，并用己烷萃取。将有机萃取物合并，用水/盐水洗涤，干燥(MgSO4)，除去溶剂，得到35g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(Z)-丙炔酸甲酯，其未经纯化，但直接还原。1HNMR(CDCl3)δ7.83(1H，s，芳香氢)，7.72(2H，s，芳香氢)，6.04(1H，s，C2-H)，3.59(3H，O-CH3)，2.21(3H，s)。
将酯，3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(Z)-丙炔酸甲酯(15g，53mmol)溶解在己烷(600mL)中，并冷却到-40℃，滴加氢化二异丁基铝(DIBAH，1M的己烷溶液，122mL，122mmol)。一旦滴加完成，就将反应温度自然升至+5℃，并用10％的Rochelle盐水溶液(100mL)处理，并再搅拌2h。将盐过滤出来，并用水洗涤滤液，干燥(MgSO4)，浓缩，得到12g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇：1HNMR(CDCl3)δ7.77(1H，s，芳香氢)，7.61(2H，s，芳香氢)，5.88(1H，t，C2-H)，4.02(2H，O-CH2)，2.14(3H，s，CH3)。
将醇，3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇(12g，40mmol)的EtOAc(800mL)溶液，加入到剧烈搅拌下的MnO2(100g)的EtOAc(800mL)悬浮液中。在32℃搅拌4h后，将反应混合物冷却，并通过硅藻土饼过滤。滤液浓缩，并用HPLC(15～20％EtOAc/己烷)纯化产品，得到8g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(Z)-丙烯醛：1HNMR(CDCl3)δ9.40(1H，d，CHO)，7.93(1H，s，芳香氢)，7.72(2H，s，芳香氢)，6.24(1H，d，C2-H)，2.37(3H，s，CH3)。
将3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯(13g，49mmol)溶解在THF(600mL)中并冷却到-75℃，并用双(三甲基硅基)氨化锂(1M的THF溶液，45mL，45mmol)处理。将该反应物保持在-75℃，同时缓慢加入3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(Z)-丙烯醛(10.5g，37mmol)的THF(50mL)溶液。在-75℃搅拌0.5h，然后将反应物缓慢自然升温至+5℃，并倾注到稀磷酸水溶液中。用己烷萃取产品，有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩，得到粗产品。先用硅胶色谱(5％乙醚/己烷)分离，然后用己烷结晶，可实现对所需异构体的纯化，得到纯净的7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯：1H NMR(CDCl3)δ 7.82(1H，s，芳香氢)，7.70(2H，s，芳香氢)，6.49(1H，dd，C5-H)，6.40(2H，m，C4，6-H)，5.79(1H，s，C2-H)，4.18(2H，q，CH2-O)，2.22(3H，s，C3-CH3)，2.13(3H，s，C7-CH3)，1.30(3H，t，CH2CH3)。
用乙醇(20mL)和10％KOH水溶液(4mL)配成的溶液，处理7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(0.46g，1.0mmol)，回流1.5h，可将后者转化成7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸。将该溶液冷却，并倾注到10％的磷酸水溶液(100mL)中。用CHCl3萃取该混合物，并将CHCl3萃取物用水洗涤一次，干燥(MgSO4)，浓缩得到固体。该固体用THF/己烷结晶，得到0.3g7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸：1HNMR(CDCl3-DMSO)δ7.82(1H，s，芳香氢)，7.72(2H，s，芳香氢)，6.50(1H，dd，C5-H)，6.40(2H，m，C4，6-H)，5.80(1H，s，C2-H)，2.24(3H，s，C3-CH3)，2.12(3H，s，C7-CH3)。
将干燥乙醚(60ml)和DMF(1.4g，18mmol)的溶液冷却到15℃，用草酰氯(1.1g，8.7mmol)处理，并搅拌15分钟。蒸发掉所有溶剂，并将得到的氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐白色固体悬浮在DMF(50mL)中(按照Helv.Chim.Acta 42，1653(1959)中公开的方法制备氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐)。向该悬浮液中加入7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸(0.95g，2.6mmol)，并将该混合物搅拌3～4h。冷却到0℃，用10min时间，用O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(4.8g，19mmol)的DMF(50mL)溶液处理。该反应物搅拌1h后，倾注到5％的KF水溶液(100mL)中，并再搅拌1h。该水溶液混合物用乙醚萃取，用水洗涤，干燥(MgSO4)并除去溶剂，得到油状物。用色谱法(HPLC-35％EtOAC/己烷)纯化，得到N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺黄色固体。FABMSm/z(利尔强度)455(M＋H+.碱)，347(50)，239(22)；1H NMR(DMSO)δ9.80(1H，s，NH)，9.18(1H，s，OH)，8.08(1H，s，芳香氢)，7.98(2H，s，芳香氢)，7.41(2H，d，芳香氢)，6.67(2H，d，芳香氢)，6.6-6.4(3H，宽，C4，5，6-H)，6.02(1H，s，C2-H)，2.26(3H，s，C3-CH3)，2.09(3H，s，C7-CH3)。IB)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺的制备
将5-溴-间二甲苯(19.4g，105mmol)和二异丙基胺(100mL)的溶液用氩气脱气，并保持在氩气氛下。加入CuI(2.07g，10.7mmol)，PPh3(4.06g，15.3mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(2.09g，2.92mmol)，然后加入三甲基硅基乙炔(12.3g，18mL，125mmol)。将该反应物加热到75℃并保持2h，得到咖啡色粘稠混合物。加入另外的三甲基硅基乙炔(6.15g，9mL，63mmol)，PPh3(2.04g，7.78mmol)，CuI(1.05g，5.51mmol)和Pd(PPh3)2Cl2(1.62g，2.31mmol)，然后将反应物加热到80C并保持4h。将反应物冷却到室温后，加入己烷(300ml)，并通过硅藻土过滤溶液。己烷层用1N HCl(600ml)，盐水(300mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到下一步中使用的1-三甲基硅基-2-(3，5-二甲基苯基)乙炔粗品。1H NMR(CDCl3)δ7.10(2H，d)，6.94(1H，s)，2.27(6H，s)，0.23(9H，s)。
向在冰/水浴中冷却的1-三甲基硅基-2-(3，5-二甲基苯基)乙炔粗品(105mmol，理论最大量)在THF(70mL)和MeOH(280mL)中的溶液中，加入8N KOH(16mL，128mmol)和水(25mL)，然后将反应物从冰/水浴中取出。1h后，抽真空除去约一半的有机溶剂。加入己烷(1L)和水(400mL)。有机层用饱和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到11.3g1-(3，5-二甲基苯基)乙炔棕色油状物：1H NMR(CDCl3)δ7.12(2H，s)，6.98(1H，s，)，3.00(1H，s)，2.29(6H，s)。
在氩气氛下，将1-(3，5-二甲基苯基)乙炔(11.3g，86.3mmol)的干燥THF(80mL)溶液在干冰/丙酮浴中冷却。缓慢加入n-BuLi(1.6M的己烷溶液，65mL，104mmol)，随后加入氯甲酸甲酯(11.4g，9.4mL，121mmol)。将反应容器转移至冰/水浴中并搅拌1h。向反应混合物中加入饱和碳酸氢钠溶液和乙醚。有机层用饱和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到下一步中使用的3-(3，5-二甲基苯基)丙炔酸甲酯粗品。1H NMR(CDCl3)δ7.22(2H，s)，7.08(1H，s，)，3.83(3H，s)，2.29(6H，s)。
2L三口RB烧瓶，在顶部装有机械搅拌器，并置于氩气氛下。将其中的CuBr·SMe2(21.2g，103mmol)的THF(200mL)溶液，在NaCl/冰/水浴中冷却到-5℃。加入MeLi(1.4M的Et2O溶液，180mL，252mmol)，并将温度控制在10℃以下。然后将反应容器用干冰/异丙醇浴冷却到-70℃。缓慢加入3-(3，5-二甲基苯基)丙炔酸甲酯(16.2g，86.1mmol)在70mL THF中的溶液，使反应温度不超过-65℃。撤去冷却浴，并让反应物温度自然升至-35℃。然后将该反应混合物快速加入到已在干冰/异丙醇浴中冷却的乙酸(40mL)和己烷(300mL)的混合物中。刚一加入，就在浅蓝色溶液中生成白色沉淀。在室温用浆状物手动搅拌该混合物。通过硅藻土塞过滤除去沉淀物，并用Et2O洗涤固体。抽真空除去大部分有机溶剂后，有机层用水(2×300mL)，饱和盐水(300mL)洗涤，并干燥(Na2SO4)。除去溶剂，随后用Et2O作为流动相，通过硅胶塞过滤，得到黄色油状物(16.9g，含有8％不需要的E异构体)。使用4％Et2O/己烷作为流动相，用硅胶填充的中压液相色谱，进行多步纯化，得到3-(3，5-二甲基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙炔酸甲酯(11.8g，57.8mmol，4步的产率为55％)。1HNMR(CDCl3)δ6.93(1H，s，)，6.80(2H，s)，5.87(1H，d)，3.55(3H，s)，2.30(6H，s，具有精细裂分，2CH3)，2.14(3H，s，具有精细裂分，CH3)。
使用装有顶部机械搅拌器的2L三口RB烧瓶，将3-(3，5-二甲基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙炔酸甲酯(14.9g，73mmol)的Et2O(418mL)溶液冷却到-50℃，并保持在氩气氛下。缓慢加入氢化二异丁基铝(DIBAH，1.5M的甲苯溶液，108mL，162mmol)。将反应容器置于冰/水浴中并保持在0℃，在持续的剧烈搅拌下加入20％的Rochelle盐溶液(585mL)，并让反应温度自然升至室温。滗去有机层，随后向水层加入8∶2的己烷/Et2O溶液(1.25L)。接着用手摇动该层，滗去有机层。合并后的有机层用饱和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到3-(3，5-二甲基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇油状物(15g，理论产率的116％)，该化合物没有进行进一步的纯化即进行氧化。1H NMR(CDCl3)δ6.92(1H，s，)，6.78(2H，s)，5.67(1H，dt)，4.07(2H，d)，2.31(6H，s)，2.06(3H，s，具有精细裂分)。
在装有顶部机械搅拌器并保持在氩气氛下的5L三口RB烧瓶中，将在Et2O(3L)中的MnO2(271g，3.12mol)却到10℃。向MnO2悬浮液中缓慢加入3-(3，5-二甲基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇(17.8g粗品，最多90.8mmol)的Et2O(250mL)溶液。用1h将反应物的温度升至室温。加入另外的MnO2(30.7g，353mmol)。20分钟后，用TLC检测该反应已完成。混合物通过硅藻土过滤，滤液经干燥(Na2SO4)和浓缩，得到3-(3，5-二甲基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛油状物(14.1g，未纯化的产品，2步的最大产率的89％)。1H NMR(CDCl3)δ9.48(1H，d)，7.04(1H，s)，6.91(2H，s)，6.17(1H，d)，2.35(6H，s)，2.29(3H，s)。
在装有顶部机械搅拌器并保持在氩气氛下的5L三口RB烧瓶中，将3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯(43.6g，165mmol，1∶1的顺式/反式混合物)的THF(1.25L)溶液，用干冰/丙酮浴冷却到-70℃。缓慢加入双(三甲基硅基)氨化锂(1M的THF溶液，116mL，116mmol)。将该反应物搅拌10分钟，然后向其中缓慢加入3-(3，5-二甲基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛(16.4g粗品，94.1mmol)的THF(250mL)溶液。反应物温度自然升至-40℃。向反应混合物中加入氯化铵(55g，在500mL水中)溶液，随后加入3N磷酸(163mL)，并在室温搅拌1h，然后加入Et2O(1500mL)，随后加入己烷(4L)和水(3L)。有机层用饱和盐水(500mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到棕色油状物(46.7g)，使其通过硅胶塞，用Et2O/CH2Cl2/己烷(3∶20∶77)作为洗脱液，得到在2，3-位的E/Z异构体(8∶2)的混合物(24.7g，86.8mmol，混合物的产率为92％)。使用中压硅胶色谱法，得到90％纯度的7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2(9∶1E/Z)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(20.7g，产率为90％)，该化合物可用于后面的水解反应。1H NMR(CDCl3)δ6.96(s，1H)，6.87(s，2H)，6.73(dd，1H)，6.26(d，1H)，6.22(d，1H)，5.74(s，1H)，4.15(q，2H)，2.34(s，6H)，2.17(s，6H)，1.28(t，3H)。
在1L RB烧瓶中，将NaOH(10M，50.7mL)加入到7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2(9∶1E/Z)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(14.4g，50.6mmol)在MeOH(70mL)和THF(30mL)中的溶液中。将反应物加热到80℃并恒温1h，然后置于冰/水浴中。向其中加入冷的3N磷酸溶液(525mL)以酸化该溶液。加入水(300mL)，并用Et2O(1100mL)萃取该溶液。有机层用饱和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到黄色粉末(12.4g，95％)。用热THF/己烷重结晶，得到7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸单个异构体的灰白色晶体(8.64g，产率67％)。1H NMR(CDCl3)δ6.96(s，1H)，6.87(s，2H)，6.76(dd，1H)，6.26(d，1H)，6.23(d，1H)，5.77(s，1H)，2.33(s，6H)，2.17(s，6H)；C17H20O2的HRMS计算值：256.1463；实测值256.1465。
将氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐(Helv.Chim.Acta 42，1653(1959))(65.1mmol)溶解在干燥的DMF(180mL)中，并在冰/水浴中冷却。加入7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸(10.2g，39.7mmol)的DMF(50mL)溶液，并将反应物在室温搅拌70分钟。将7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酰氯在冰/水浴中冷却，并在下一步反应中使用。
按照专利WO95/03274公开的方法制备O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚。将在DMF(50mL)和吡啶(19.3mL，238mmol)中的O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(26.5g，105mmol)，加入到在冰/水浴中冷却的7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酰氯的DMF溶液。将该反应物的温度升至室温，并在30分钟后完成反应。使用KF(9.14g，157mmol)的水(80ml)溶液除去三甲基硅基，反应在20分钟完成。向该反应混合物中加入EtOAc(1400mL)和水(1400mL)。分离后，有机层用饱和盐水(500mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩，得到棕色油状物(25.6g)。该物质用285g硅胶(230～400目)进行色谱分离，使用1∶1己烷/EtOAc作为流动相，得到13.6g产品。用热EtOAc/己烷重结晶，得到纯净的N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6庚三烯酰胺(10.3g，产率75％)。1H NMR(CDCl3)δ7.37(d，2H)，7.03(s，1H)，6.95(s，1H)，6.87(s，2H)；6.77(d，2H)，6.72(dd，1H)，6.24(d，1H)，6.23(d，1H)，5.75(s，1H)，4.94(宽，1H)，2.34(s，6H)，2.23(s，3H)，2.17(s，3H)；C23H25NO2的HRMS计算值：347.1885；实测值347.1895。IC)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2，4，6-庚三烯酰胺的制备
如实施例IA中步骤1和2给出的方法，制备3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]丙炔酸甲酯。
将3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]丙炔酸甲酯溶解在己烷(300mL)中，用1.0g Lindlar催化剂处理，并在22℃，用1atm的氢气还原。当吸收了1.1当量的氢气后，将反应物通过硅藻土过滤，并除去溶剂。油状物粗品用HPLC(5％乙醚/己烷)纯化，得到3.5g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2(Z)-丙烯酸甲酯。1H NMR(CDCl3)δ8.02(2H，s，芳香氢)，7.83(1H，s，芳香氢)，7.00(1H，d，C3-H)，6.17(1H，d，C2-H)，3.73(3H，O-CH3)。
将3.5g(11mmol)3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2(Z)-丙烯酸甲酯溶解在350mL己烷中。在氩气氛下将其冷却到-40℃，并缓慢加入氢化二异丁基铝(DIBAH，1.0M的己烷溶液，35mL，35mmol)。加完后，搅拌该反应物，并将其温度缓慢升至+5℃。然后用50mL 30％Rochelle盐的水溶液和100mL乙醚处理该反应物，并在30～35℃搅拌2h。有机萃取物用水洗涤，干燥(MgSO4)并除去溶剂，得到3.0g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2(Z)-丙烯-1-醇油状物：1H NMR(CDCl3)δ7.80(1H，s，芳香氢)，7.68(2H，s，芳香氢)，6.62(1H，d，J＝10Hz)，6.12(1H，dd，J＝10和6Hz)，4.40(2H，t，HO-CH2-)。
将3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2(Z)-丙烯-1-醇(3.0g，10mmol)溶解在300ml乙醚(干燥)中，并加入到充分搅拌下的冷的(10℃)MnO2(40g)在300mL乙醚中形成的淤浆中。在室温搅拌1h。将该悬浮液过滤，并用THF洗涤滤液。合并有机层并除去溶剂，得到3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2(Z)-丙烯醛油状物。该产物未经纯化并用于下一步中：1H NMR(CDCl3)δ9.88(1H，d，J＝4Hz，CHO)，7.94(1H，s，芳香氢)，7.85(2H，s，芳香氢)，7.61(1H，d，J＝8Hz)，6.35(1H，dd，J＝8 & 4Hz)。
将3.4g(13mmol)3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯溶解在150mL THF中，冷却到-78℃，并用12mL(12mmol)(1.0M的THF溶液)双(三甲基硅基)氨化锂处理。在-78℃，缓慢加入3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2(Z)-丙烯醛(2.5g，9.3mmol)的THF(5mL)溶液。该反应物在-78℃搅拌0.5h，并在搅拌下使温度自然升至+15℃。将其倾注到冷的稀磷酸水溶液中。用己烷萃取产物，有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)，除去溶剂得到含有4种异构体的油状物粗品。用硅胶色谱(5％乙醚/己烷)进行纯化和异构体分离，得到两种异构体。从己烷中结晶出需要的E，E，Z异构体，得到500mg7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯：1HNMR(CDCl3)δ 7.80(1H，s，芳香氢)，7.78(2H，s，芳香氢)，6.96(1H，dd，C6-H)，6.48-6.78(3H，烯烃氢)，5.78(1H，s，C2-H)，4.18(2H，q，O-CH2)，2.23(3H，s，C3-CH3)，1.30(3H，t，CH3)。
将7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(500mg，1.2mmol)溶解在50mL乙醇中，并用KOH的水溶液(0.5gKOH/5mL水)处理。将其回流1.5h。将溶液冷却，倾注到水中并用稀磷酸酸化。用氯仿萃取沉淀出来的固体。有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)，除去溶剂得到固体，该固体用THF/己烷结晶得到7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸：1H NMR(CDCl3)δ7.79(1H，s，芳香氢)，7.77(2H，s，芳香氢)，6.96(1H，dd，J＝11.5Hz)，6.50-6.63(3H，烯烃氢)，5.89(1H，s，C2-H)，2.24(3H，s，C3-CH3)。
将干燥的乙醚(60mL)和DMF(1.0g，12mmol)溶液冷却到15℃，用草酰氯(0.7g，5.9mmol)处理，并搅拌15分钟。蒸发掉所有溶剂，并将得到的氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐(Helv.Chm.Acta 42，1653(1959))白色固体悬浮在DMF(10mL)中。向其中加入7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸(0.90g，2.6mmol)，并将该混合物搅拌3h。将其冷却到0℃，并用10分钟时间，用O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(1.6g，5.9mmol)在5mL DMF中的溶液处理。将其搅拌1h并倾注到15％的KF水溶液(20ml)中，并再搅拌1h。用乙醚萃取该水溶液混合物，用水洗涤，干燥(MgSO4)，除去溶剂得到油状物。该油状物用色谱法(40％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2，4，6-庚三烯酰胺黄色固体：1HNMR(DMSO/CDCl3)δ8.50(1H，s，NH)，7.78(3H，s，芳香氢)，7.31(2H，d，芳香氢)，6.68(2H，d，芳香氢)，6.48(1H，-OH)，6.9-6.4(3H，宽，C4，5，6-H)，5.92(1H，s，C2-H)，2.26(3H，s，C3-CH3)。ID)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺的制备
向装有电磁搅拌器，氩气导管和加料漏斗的1L 3口圆底烧瓶中，加入氢化钠(60％含量，在矿物油中，2.53g，63.3mmol)和无水二甲氧基乙烷(60mL)。将该灰色淤浆用冰浴冷却到0℃，并滴加膦酰基乙酸三乙酯(11.94mL，60.2mmol)，同时保持温度低于10℃。在0℃，向得到的浅棕色透明溶液中，缓慢加入碘(15.27g，60.2mmol)的无水二甲氧基乙烷(50mL)溶液，同时控制温度在10℃以下。将得到的棕色混合物在10℃左右搅拌半小时。将反应混合物再次冷却到0℃后，将氢化钠(60％含量，在矿物油中，5.05g，126.3mmol)分两批小心地加入。然后在25℃搅拌该黄绿色淤浆直至不再产生氢气为止。将混合物再次冷却到0℃后，缓慢加入3，5-二甲氧基苯甲醛(9.5g，57.2mmol)的无水二甲氧基乙烷(30mL)溶液，然后将混合物温度升至室温并搅拌过夜。抽真空浓缩该浅棕色混合物，用水(300mL)稀释，并用乙醚萃取(2×400mL)。合并后的有机层用饱和硫代硫酸钠溶液，水，盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并抽真空浓缩，得到浅棕色油状物粗品(18.65g，超过理论产率)。将粗品溶解在己烷中，并用硅胶填充的色谱进行分离。使用己烷(1.2L)---＞30％乙酸乙酯/己烷进行淋洗，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-丙炔酸乙酯和3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-碘代-2-丙烯酸乙酯的约2∶1的混合物(12g)。
向装有电磁搅拌器，温度计和氩气导管的500mL 3口圆底烧瓶中，加入上步得到的3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-丙炔酸乙酯和3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-碘代-2-丙烯酸乙酯的约2∶1的混合物和无水四氢呋喃(100mL)。该混合物用干冰/丙酮浴冷却到-70℃，并缓慢加入双(三甲基硅基)氨化锂(1.0M的THF溶液，15.8mmol)。当等分试样的NMR分析显示3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-碘代-2-丙烯酸乙酯没有完全转化成3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-丙炔酸乙酯时(只有3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-碘代-2-丙烯酸乙酯的E-异构体剩下没有反应)，立即将混合物温度升至-20℃并搅拌半小时。在-20℃向该混合物中再加入一定量的双(三甲基硅基)氨化锂(1.0M的THF溶液，4.0mL，4.0mmol)，并再搅拌1h。等分试样的NMR分析显示存在3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-碘代-2-丙烯酸乙酯。将该混合物升温至0℃并搅拌90分钟。用饱和氯化铵溶液(60mL)终止该反应，并在室温搅拌10分钟。该混合物用乙酸乙酯萃取(2×200mL)，合并后有机层用水，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并抽真空浓缩，得到油状物粗品(11.0g)。在制备HPLC上，使用1∶5的乙酸乙酯/己烷作为洗脱液，对该物质进行色谱分离。浓缩合适的组分，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-丙炔酸乙酯(9.32g，产率93％)无色油状物：1H NMR(400MHz，CDCl3)δ6.73(2H，宽s)，6.55(1H，宽)，4.30(2H，q)，3.79(6H，s)，1.36(3H，t)。C13H14O4的HRMS计算值：234.09892。实测值：234.0900。
向装有电磁搅拌器，温度计和氩气导管的2L 3口圆底烧瓶中，加入溴化亚铜(I)-二甲硫醚复合物(10.63g，51.71mmol)和无水THF(450mL)。将该淤浆用干冰/丙酮浴冷却，并以一定的速度加入MeLi(1.5M的乙醚溶液，69.0mL，103.5mmol)，使内部温度保持在-5℃左右。然后将该透明无色溶液用干冰/丙酮浴冷却到-70℃。缓慢加入3-(3，5-二甲氧基苯基)-2-丙炔酸乙酯(9.32g，39.8mmol)的无水四氢呋喃(50mL)溶液，使反应温度不超过-65℃。在-70℃搅拌2h后，将该反应混合物快速转移至在分液漏斗中的，冷却的，不断摇动的乙酸(75mL)和己烷(750mL)的混合物中。加入水，并剧烈摇动该混合物，得到白色淤浆，放置分为两层。底层白色淤浆通过硅藻土过滤，并用己烷彻底漂洗。合并滤液和洗液，用水(3次)和盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。将分液漏斗中的顶层用水(3次)和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)并抽真空浓缩，得到浅棕色油状物粗品(9.19g，92％)，该化合物未进一步纯化即用于下一步中。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ6.40(t，2H)，6.33(d，1H)，5.86(d，1H)，4.01(q，2H)，3.75(s，6H)，2.13(s，6H)，1.09(t，3H)。
向装有电磁搅拌器，温度计和氩气导管的2L 3口圆底烧瓶中，加入3-(3，5-二甲氧基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯酸乙酯粗品(10.42g，41.63mmol)和己烷(1000mL)。向该反应混合物中缓慢加入氢化二异丁基铝(DIBAH，1.0M的己烷溶液，104mL，104mmol)，同时用干冰/丙酮浴使温度保持在-20℃～-30℃。然后将该混合物温度升至0℃并搅拌75分钟。在剧烈搅拌下，向该反应混合物中加入Rochelle盐溶液(30％溶液，60mL)，并将整个混合物在35℃恒温30分钟。在室温再搅拌30分钟后，将透明的己烷层滗到分液漏斗中，并用水和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)。留在反应瓶中的含水白色乳液用乙醚进行反萃取(4×150mL)。合并后的有机萃取物用水，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇浅棕色粘稠油状物粗品(8.68g，＞100％)，该化合物未进一步纯化即用于下一步中。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.39(1H，t)，6.33(2H，d，)，5.68(1H，t)，4.09(2H，d)，3.79(6H，s)，2.06(3H，s)。C12H16O3的HRMS计算值：208.1099。实测值：208.1096。
向装有顶部机械搅拌器，加料漏斗和氩气导管的2L 3口圆底烧瓶中，加入在乙酸乙酯(700mL)中的活化MnO2(85％，86.8g，849mmol)。向该黑色悬浮液中加入3-(3，5-二甲氧基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇粗品(8.68g，41.7mmol)的乙酸乙酯(160ml)溶液。该反应混合物在室温搅拌约3h。该混合物通过硅藻土过滤，并用乙酸乙酯(3L)彻底冲洗滤饼。抽真空浓缩合并后的滤液，得到浅棕色油状物(8.45g，粗品产率98％)。该油状物粗品用制备HPLC进行纯化，使用15％乙酸乙酯/己烷作为洗脱液。合并合适的组分，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛浅棕色油状物。1H NMR(200MHz，CDCl3)δ9.52(1H，d)，6.47(1H，t)，6.41(2H，d，)，6.07(1H，d)，3.79(6H，s)，2.27(3H，s)。
向装有电磁搅拌器，温度计和氩气导管的2L 3口圆底烧瓶中，加入3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯(新蒸馏的，14.75g，55.82mmol)和无水四氢呋喃(670mL)。向上述溶液中缓慢加入双(三甲基硅基)氨化锂(1M的THF溶液，55.7mL，55.7mmol)，同时用干冰/丙酮浴使内部温度保持在-40℃。加完后，混合物在-40℃搅拌15分钟，然后进一步冷却到-70℃。缓慢加入3-(3，5-二甲氧基苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛粗品(6.38g，30.93mmol)在无水四氢呋喃(50mL)中的溶液，并用约2h的时间将该混合物的温度升至5℃。用冷却的磷酸(85％，5mL)的水(300mL)溶液终止该反应，然后用己烷(300mL)稀释。水层用1∶1的乙醚/己烷萃取1次。合并后的有机层用水，盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。过滤并抽真空浓缩，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯棕色油状物粗品。该油状物粗品用制备HPLC进行纯化，使用15％乙酸乙酯/己烷作为洗脱液。合并合适的组分并浓缩，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(9.68g，99％产率，～80∶20的C-2位E/Z异构体)浅棕色油状物。将该油状物溶解在5mL乙酸乙酯和100mL己烷中，溶液保存在冰箱中，并进行冷过滤，得到第一批产品，2.83g白色针状物。使用2.5mL乙酸乙酯和50mL己烷，以同样的方式对母液进行重结晶，得到1.04g的第二批产品。纯净的3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯的总量为3.87g。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 6.76(1H，dd)，6.42(1H，t)，6.40(2H，d)，6.24(1H，d)，6.22(1H，d)，5.75(1H，s)，4.15(2H，q)，3.80(6H，s)，2.18(3H，s)，2.16(3H，s)，1.28(3H，t)。C19H24O4的HRMS计算值：316.1675。实测值：316.1673。
向装有电磁搅拌器，水冷凝器和氩气导管的500mL单口圆底烧瓶中，加入重结晶的3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(3.87g，12.23mmol)和乙醇(190标准强度，110mL)。然后加入氢氧化钾(2.21g，39.39mmol)的水(22mL)溶液，并将该混合物加热到80℃恒温90分钟。反应混合物在冰浴中冷却，然后缓慢加入冷却的1M的磷酸溶液，至溶液的pH值约为3为止。白色淤浆用1∶1的乙酸乙酯/乙醚萃取两次。合并后的有机萃取物用水，盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥。过滤并抽真空浓缩，得到浅黄色固体。将该固体溶解在THF中，并通过一个短的硅胶柱，使用乙酸乙酯作为洗脱液。浓缩合适的组分，得到3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸(3.45g，98％产率)黄色固体，该化合物未经过进一步纯化即用于下一步中(由3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(Z)-丙烯醛起，包括皂化和从母液中纯化的两步的产率为56％)。1H NMR(200MHz，CDCl3)δ6.78(1H，dd)，6.42(1H，t)，6.39(2H，d，)，6.25(1H，d)，6.21(1H，d)，5.75(1H，s)，3.79(6H，s)，2.18(3H，s)，2.16(3H，s)。
向装有电磁搅拌器和氩气导管的500mL单口圆底烧瓶中，加入草酰氯(1.74mL，19.95mmol)和乙醚(50mL)。将该溶液在干冰/丙酮浴中冷却，并缓慢加入无水二甲基甲酰胺(1.62mL，20.92mmol)(Helv.Chim.Acta，42，1653(1959))。加完后，将该混合物温度升至0℃，并搅拌30分钟。小心抽真空除去挥发物，并将含有氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐的烧瓶注满氩气。向氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐中加入无水二甲基甲酰胺(50mL)和3-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸粗品(3.45g，11.96mmol)在无水二甲基甲酰胺(35mL)中的溶液。该反应物在室温搅拌90分钟。将得到的透明溶液冷却到0℃，并加入O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(7.98g，31.48mmol)在无水二甲基甲酰胺(18mL)中的溶液，同时保持温度在12℃以下。加完O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚后，立刻加入吡啶(5.8mL，71.71mmol)，并将该混合物在室温搅拌150分钟。将该混合物再次冷却到0℃，并加入氟化钾(2.74g，47.2mmol)溶液，并在室温将该混合物剧烈搅拌1h。用水(450mL)稀释该反应混合物，并用乙酸乙酯(450mL)和己烷(200mL)萃取。有机层用1N磷酸(2×200mL)，水，盐水洗涤，并干燥(Na2SO4)。合并后的含水相用乙酸乙酯(2×250mL)进行反萃取。合并后的有机层用水，盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并浓缩，得到咖啡色泡沫状物。该物质用制备HPLC进行色谱分离，使用45％乙酸乙酯/己烷作为洗脱液。浓缩合适的组分，得到N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺(4.24g，93％产率)黄色泡沫状物。用热的乙酸乙酯/己烷重结晶，得到两批产物共2.61g(57％)的N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲氧基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，mp162～163℃。1HNMR(200MHz，CDCl3)δ7.34(2H，d，)，7.05(1H，宽s)，6.65-6.85(3H，m)，6.40(3H，bs)，6.15-6.30(2H，m)，5.74(1H，s)，4.98(1H，s)，3.79(6H，s)，2.22(3H，s)，2.16(3H，s)；C23H25NO4的HRMS计算值：379.1784。实测值：379.1779。IE)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6-庚三烯酰胺的制备
将2-膦酰基丙酸三乙酯(20g，84mmol)溶解在300mL THF中并冷却到0℃，用叔丁醇钾(1.0M的THF溶液)(80mL，80mmol)处理。5分钟后，加入3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]苯乙酮(12g，47mmol)在20mLTHF中的溶液，并在室温搅拌3h。将其倾注到水中，并用己烷进行萃取。有机萃取物用水和盐水洗涤，干燥(MgSO4)，除去溶剂，得到15g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(E/Z)-丙烯酸乙酯粗品，用HPLC(硅胶，5％乙醚/己烷)纯化得到单独的异构体，3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(Z)-丙烯酸乙酯。1H NMR(CDCl3)δ7.80(1H，芳香氢)，7.61(2H，s，芳香氢)，3.85(2H，q，CH2)，2.13(3H，s，CH3)，2.08(3H，s，CH3)。
将5.0g(14.7mmol)3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(Z)-丙烯酸乙酯溶解在300mL己烷中。在氩气氛下将其冷却到-20℃。缓慢加入氢化二异丁基铝(DIBAH，1.0M的己烷溶液)(35mL，35mmol)。加完后，在室温搅拌该反应物，直到其温度达到5℃。然后用50mL 30％Rochelle盐的水溶液，100mL乙醚处理该反应物，并在30～35℃充分搅拌2h。有机萃取物用水洗涤，干燥(MgSO4)，除去溶剂得到3.0g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(Z)-丙烯-1-醇油状物：1H NMR(CDCl3)δ7.75(1H，s，芳香氢)，7.61(2H，s，芳香氢)，3.90(2H，s，CH2-)，2.04(3H，s，CH3)，1.96(3H，s，CH3)。
将醇，3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(Z)-丙烯-1-醇(4.0g，12mmol)溶解在200mL乙酸乙酯中，并加入到充分搅拌下的冷的(10℃)MnO2(40g)与200mL乙醚形成的淤浆中。将其在室温搅拌1h。过滤该悬浮液，并用THF洗涤固体。合并有机物并除去溶剂，得到油状物。用HPLC(硅胶，10％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到3.4g 3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(Z)-丙烯醛：1H NMR(CDCl3)δ9.40(1H，s，醛)，7.90(1H，s，芳香氢)，7.70(2H，s，芳香氢)，2.32(3H，s，CH3)，1.96(3H，s，CH3)。
将4.0g(15mmol)3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯溶解在180mL THF中，冷却到-78℃，并用双(三甲基硅基)氨化锂(1.0M的THF溶液，14.5mL，14.5mmol)处理。在-78℃，缓慢加入3-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-2，3-二甲基-2(Z)-丙烯-1-醛(3.4g，11.3mmol)在5mL THF中的溶液。在-78℃搅拌0.5h，并在室温搅拌直到温度升至15℃。将其倾注到冷的稀磷酸水溶液中。用己烷萃取产品，有机相用水洗涤，Na2SO4干燥，并除去溶剂，得到含有四种异构体的油状物粗品。用硅胶色谱法(5％乙醚/己烷)进行纯化和异构体分离，得到两种异构体。然后从己烷中结晶出所需的异构体，得到500mg 7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯：1H NMR(CDCl3)δ7.80(1H，s，芳香氢)，7.61(2H，s，芳香氢)，6.43(2H，dd，C4和C6-H)，5.71(1H，s，C2-H)，4.18(2H，q，O-CH2CH3)，2.20(3H，s，C3甲基)，2.02(3H，s，CH3)，2.00(3H，s，CH3)，1.30(3H，t，O-CH2CH3)。
将酯，7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(2.9g，6.5mmol)溶解在50mL乙醇中，并用KOH的水溶液(0.5gKOH/5mL水)处理。将其回流1.5h。将该溶液冷却，倾注到水中并用稀磷酸酸化。用氯仿萃取沉淀出来的固体。有机相用水洗涤，干燥(Na2SO4)，并除去溶剂，得到的固体，用THF/己烷结晶，得到7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸：1H NMR(DMSO)δ8.07(1H，s，芳香氢)，7.78(2H，s，芳香氢)，6.96(2H，dd，C4和C5-H)，5.88(1H，s，C2-H)，2.22(3H，s，C3CH3)，2.02(3H，s，CH3)，1.93(3H，s，CH3)。
将干燥乙醚(20mL)和DMF(0.50g，6mmol)的溶液冷却到15℃，用氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐(Helv.Chim.Acta 42，1653(1959))(0.3g，2.4mmol)处理，并搅拌15分钟。蒸发掉所有溶剂，并将得到的白色固体悬浮在DMF(20mL)中。向其中加入7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸(0.60g，1.6mmol)，并将混合物搅拌3h。将其冷却到0℃，并用10分钟时间，用O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(1.1g，4.3mmol)(CAS # 52726-86-0)在5mL DMF中的溶液处理。搅拌1h，并将其倾注到15％的KF水溶液(20mL)中，并再搅拌1h。用乙醚萃取该含水混合物，用水洗涤，干燥(MgSO4)，并除去溶剂，得到油状物。用色谱法(40％乙酸乙酯/己烷)纯化该油状物，得到N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6-庚三烯酰胺黄色固体：1H NMR(DMSO)δ9.75(1H，s，NH)，9.20(1H，-OH)，8.18(1H，s，芳香氢)，7.89(2H，s，芳香氢)，7.40(2H，d，芳香氢)，6.88(2H，d，芳香氢)，6.42(2H，dd，C4，5-H)，6.04(1H，s，C2-H)，2.22(3H，s，CH3)，2.04(3H，s，CH3)，1.98(3H，s，CH3)。IF)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺
在搅拌下，将膦酰基乙酸三乙酯(28g，125mmol)的二甲氧基乙烷(DME)溶液冷却到5℃，并用NaH(含量55％，在矿物油中，5.9g，135mmol)处理。当不再有氢气放出后，滴加在150mL DME中的碘(32g，125mmol)溶液。然后将反应物冷却到-20℃，并滴加双(三甲基硅基)氨化锂(1.0M的THF溶液，125mL，125mmol)。该反应物在-10℃搅拌10分钟，加入在150mL DME中的3，5-二溴苯甲醛(33.0g，125mmol)溶液。将其在室温搅拌1h，并在40～45℃搅拌4h。将该反应物倾注到冷水中，并用己烷萃取。有机相用水和盐水洗涤。经干燥(MgSO4)并除去溶剂，得到重油。用HPLC(10％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到碘代烯烃异构体的混合物。该原料用于下一步中。
在搅拌下，将2-碘代-3-(3，5-二溴苯基)-2(E，Z)-丙烯酸乙酯(44g，96mmol)的THF(700mL)溶液冷却到-75℃，并滴加双(三甲基硅基)氨化锂(1.0M的THF溶液，100mL，100mmol)处理。将温度小心地升到-30℃，倾注到水中并用己烷萃取。将其干燥(MgSO4)并除去溶剂，得到重油。用HPLC(3％乙醚/己烷)纯化，得到纯净的3-(3，5-二溴苯基)-2-丙炔酸乙酯。1H NMR(CDCl3)δ7.73(1H，d，芳香氢)，7.65(2H，d，芳香氢)，4.30(2H，q，OCH2)，1.35(3H，t，CH3)。
将溴化亚铜(I)-二甲硫醚复合物(20.7g，101mmol)，悬浮在1.0L已脱气并置于氩气氛下的THF(干燥)中。搅拌下，将悬浮液冷却到-50℃，并加入1.5M的甲基锂的乙醚溶液(137mL，205mmol)。搅拌10分钟后，将反应物冷却到-78℃，滴加3-(3，5-二溴苯基)-2-丙炔酸乙酯(31g，91mmol)的THF(150mL)溶液。将该反应混合物在-65～-60℃搅拌2h。然后将该反应物直接倾注到含有100mL乙酸的充分搅拌下的己烷(500mL)溶液中。在室温搅拌10分钟，然后用水，盐水洗涤，干燥(MgSO4)，并除去溶剂。用HPLC(5％EtOAc/己烷)纯化，得到14g 3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2-(Z)-丙烯酸乙酯。1H NMR(CDCl3)δ7.61(1H，s，芳香氢)，7.25(2H，s，芳香氢)，5.92(1H，s，C2-H)，4.01(2H，q，CH2)，2.13(3H，s，CH3)，1.11(3H，t，CH3)。
将3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2-(Z)-丙烯酸乙酯(14g，41mmol)溶解在己烷(1.1L)中，并冷却到-40℃。滴加DIBAH(90mL，1.0M的己烷溶液)进行处理，并在室温搅拌直到其温度达到+5℃。用10％Rochelle盐水溶液(100mL)处理并搅拌2h。过滤出盐，并用水洗涤有机残余物，干燥(MgSO4)并除去溶剂，得到12g 3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇：1HNMR(CDCl3)δ7.58(1H，s，芳香氢)，7.25(2H，s，芳香氢)，5.75(1H，t，C2-H)，4.05(2H，d，CH2-O)，2.04(3H，s，CH3)。
将3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇(12g，40mmol)的乙酸乙酯(200mL)溶液，加入到充分搅拌下的在乙酸乙酯(1.8L)中的MnO2悬浮液中。在35℃反应2h后，将其冷却，通过硅藻土过滤，并除去溶剂。用HPLC(10-15％乙酸乙酯/己烷)纯化，得到9.4g 3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛。1H NMR(CDCl3)δ9.45(1H，d，醛)，7.71(1H，s，芳香氢)，7.38(2H，s，芳香氢)，6.24(1H，d，C2-H)，2.29(3H，s，CH3)。
将10.6g(40mmol)3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯溶解在500mLTHF中，冷却到-78℃，并用36mL(36mmol/1.0M的THF溶液)双(三甲基硅基)氨化锂处理。在-78℃，缓慢加入3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛(9.3g，31mmol)在50mL THF中的溶液。将其在-78℃搅拌0.5h，并在室温搅拌直到其温度达到10℃。将其倾注到稀磷酸水溶液中。用己烷萃取产品，并用水洗涤有机相，干燥(Na2SO4)，除去溶剂，得到油状物粗品。用硅胶色谱法(5％乙醚/己烷)进行纯化和异构体的分离，得到5.5g(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸乙酯。1H NMR(CDCl3)δ7.60(1H，s，芳香氢)，7.31(2H，s，芳香氢)，6.52(1H，dd，C5-H)，6.28(2H，m，C4和C6-H)，5.74(1H，s，C2-H)，4.10(2H，q，O-CH2)，2.20(3H，s，C3CH3)，2.13(3H，s，C7CH3)，1.30(3H，t，CH3)。
按照在Ia，b，c，d中给出的方法转化为(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸：将(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸乙酯(113mg，0.272mmol)溶解在800μL THF，800μL甲醇，70μ1水，和2.7mL 10N NaOH溶液中，加热到80℃。用3NH3PO4(900μl)中和冷却的反应溶液。用THF/己烷重结晶，得到50mg(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸：1H NMR(CDCl3)δ7.62(1H，s，芳香氢)，7.33(2H，s，芳香氢)，6.60(1H，dd，C5-H)，6.32(1H，d)，6.28(1H，d)，5.80(1H，s，C2-H)，2.20(3H，s，C3CH3)，2.15(3H，s，C7CH3)；C15H14Br2O2的HRMS计算值：383.9361；实测值：383.9360。
将干燥乙醚(30mL)和DMF(0.5g，7mmol)溶液冷却到15℃，然后用草酰氯(0.2g，1.5mmol)处理并搅拌15分钟。然后除去所有溶剂，并将氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐(Helv.Chim.Acta 42，1653(1959))白色固体悬浮在DMF(5mL)中。向其中加入(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸(0.30g，0.8mmol)，并将该混合物在室温搅拌3～4h。将反应物冷却到0℃，并用10分钟时间，用O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(0.6g，2.4mmol)的DMF(5mL)溶液处理。加料完毕后，继续搅拌1h，然后倾注到5％KF水溶液(10mL)中，并再搅拌1h。用乙醚萃取该含水混合物，用HPLC纯化，使用35％EtOAc/己烷作为洗脱液，得到N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。1H NMR(DMSO)δ9.80(1H，s，NH)，9.18(1H，s，OH)，7.82(1H，s，芳香氢)，7.51(2H，s，芳香氢)，7.41(2H，d，芳香)，6.67(2H，d，芳香氢)，6.6-6.4(3H，brm，C4，5，6-H)，6.00(1H，s，C2-H)，2.16(3H，s，C3CH3)，2.13(3H，s，C7CH3)。IG)N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺的制备
将(三甲基硅基)乙酸乙酯(4.2g，40mmol)溶解在40mLTHF中，在NaCl/冰/水浴中冷却到0℃，然后缓慢加入二异丙基氨化锂(2.0M的庚烷/THF/乙苯溶液，18.2mL，36.3mmol)。然后将该反应容器在干冰/异丙醇浴中冷却到-70℃，并向该反应混合物中加入苯乙酮(2.0g，16.5mmol)。撤去冷却浴，并将反应温度自然升至0℃，在该温度下向反应混合物中加入磷酸(3N，100mL)。然后用水稀释该反应混合物，并用乙醚萃取，用饱和盐水洗涤有机溶液，干燥(MgSO4)并浓缩，得到黄色油状物。使用中压硅胶色谱将两种异构体分离，使用3％乙醚/己烷作为洗脱液。纯净的3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯酸乙酯(604mg)：1H NMR(CDCl3)δ7.12-7.40(5H，m，芳香氢)，5.90(1H，s)，3.97(2H，q，O-CH2)，2.14(3H，s，乙烯基-CH3)，1.06(3H，t，-CH3)。
按照上面IF)部分制备3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇同样的方式，制备3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇。使用3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯酸乙酯(543mg，2.96mmol)和DIBAH(1.5M的甲苯溶液，5.9mL，8.9mmol)，得到423mg 3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇：1H NMR(CDCl3)δ7.1-7.40(5H，m，芳香氢)，5.71(1H，dt)，4.08(2H，d)，2.09(3H，d)，1.25(1H，bs，OH)。
按照上面IF)部分制备3-(3，5-二溴苯基)-3-甲基-2(Z)-丙烯醛同样的方式，制备3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯醛。使用3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯-1-醇(400mg，2.7mmol)；MnO2(2.8g，32.3mmol)，10mL乙醚，得到340mg 3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯醛：1H NMR(CDCl3)δ9.48(1H，d，CHO)，7.20-7.45(5H，m，芳香氢)，6.14(1H，d)，4.08(2H，d)，2.32(3H，s，具有精细裂分)。
按照上面IF)部分制备7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯同样的方式，制备7-苯基-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯。使用在3mL THF中的3-甲基-4-膦酰基丁烯酸三乙酯(433mg，1.64mmol)，双(三甲基硅基)氨化锂(1M的THF溶液，1.5mL，1.5mmol)，在2mL THF中的3-苯基-3-甲基-2(Z)-丙烯醛(200mg，1.37mmol)。得到270mg 7-苯基-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯：1H NMR(CDCl3)δ7.23-7.45(5H，m，芳香氢)，6.70(1H，dd)，6.26(2H，d)，5.74(1H，s)，4.26(2H，q)，2.19(3H，s)，2.16(3H，s)，1.28(3H，t)。
按照上面IF)部分制备7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸同样的方式，制备7-苯基-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸。使用在4mL MeOH中的7-苯基-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸乙酯(259mg，1.01mmol)，0.5mL THF和1mL 10N NaOH。结晶得到93mg 7-苯基-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸：1H NMR(CDCl3)δ7.41(2H，t，芳香氢)，7.32(1H，t，芳香氢)，7.25(2H，d，芳香氢)，6.73(1H，dd)，6.29(1H，d)，6.27(1H，d)，5.76(1H，s)，2.20(3H，s)，2.17(3H，s)；C15H16O2的HRMS计算值：228.1150；实测值：228.1152。
按照上面IF)部分制备N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺同样的方式，制备N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。使在1mL DMF中的氯化(二甲基氯代甲酰胺鎓)盐(Helv.Chim.Acta 42，1653(1959))(42.1mg，0.33mmol)与在1mL DMF中的7-苯基-3，7-二甲基-2(E)，4(E)，6(Z)-庚三烯酸(50mg，0.22mmol)反应得到酰氯。该酰氯与在1mL DMF中的O，N-双(三甲基硅基)-4-氨基苯酚(167mg，0.66mmol)和吡啶(106mL，1.32mmol)反应，并经过结晶，得到12mg N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺：1H NMR(CDCl3)δ7.40(2H，d，芳香氢)，7.22-7.40(5H，m，芳香氢)，7.03(1H，brm)，6.77(2H，d)，6.68(1H，dd)，6.24(1H，d)，5.75(1H，s)，4.77(IH，brs)，2.22(3H，s)，2.19(3H，s)；C21H21NO2的HRMS计算值：319.1572；实测值：319.1576。
实施例II药理学活性IIA.体外试验：
使用下列细胞系，在细胞试验中测试式I的化合物对细胞生长的抑制及细胞凋亡活性：
得自ATCC(CRL1500)的人的ER+乳癌细胞(ZR-75-1)，在用丙酮酸钠，10％FBS和13ng/mL庆大霉素补充的Gibco’s RPMI 1640培养基中生长。在37℃，4.5％CO2和95.5％潮湿空气条件下培养细胞。
得自Dr.Janet Price，MDA Cancer Center，Houston，Texas的人的ER-乳癌细胞(MDA-435)，在用丙酮酸钠，10％FBS和13ng/mL庆大霉素补充的Gibco’s RPMI 1640培养基中生长。在37℃，4.5％CO2和95.5％潮湿空气条件下培养细胞。
得自ATCC(HTB 22)的人的ER-乳癌细胞(MDA-231)，在用非必需的氨基酸，丙酮酸钠，和Earle’s BSS，10％FBS，和13ng/mL庆大霉素补充的Eagle’s MEM培养基中生长。在37℃，4.5％CO2和95.5％潮湿空气条件下培养细胞。
得自ATCC(CRL-5803)的人的肺部大细胞癌细胞(H1299)，在用丙酮酸钠，10％FBS和13ng/mL庆大霉素补充的，高葡萄糖的Gibco’s DelbeccoMinimum Essential培养基(DMEM)中生长。在37℃，4.5％CO2和95.5％潮湿空气条件下培养细胞。
得自Dr.Bernie Vogelstein的人的结肠直肠癌细胞(RKO)，在用丙酮酸钠，10％FBS和13ng/mL庆大霉素补充的，高葡萄糖的Gibco’s DelbeccoMinimum Essential培养基(DMEM)中生长。在37℃，4.5％CO2和95.5％潮湿空气条件下培养细胞。1.细胞生长的抑制作用：MTT试验
采用标准的MTT试验，一种基于四唑的测试细胞在培养物中生存能力的试验，来测试式I的化合物抑制细胞生长的能力。当细胞达到70-80％汇合时，收集细胞，并离心收集。然后将细胞重新悬浮在培养基中，其中用经Hyclone’s Charcoal/Dextran脱色的(stripped)FBS取代FBS，并以一定的密度接种(2mL/孔)于6-孔板(Corning)中，使其在四天的测试期内能进行线性生长。接种18-24h后，加入式1的化合物(10mM的储存液，在二甲亚砜(DMSO)中)。在合适的生长培养基中制备化合物的稀释液，并加入到细胞中，使最后在0.1％DMSO中的终浓度为10，3.3和1μM。在24，48和72小时时间点，将MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基-2，5-二苯基四唑溴化物)储备溶液(5mg/mL，在l×PBS中)加入到细胞板中(625μL/孔)，然后培养2.5h。从孔中吸出液体，并加入1mL/孔95％的乙醇以溶解反应产物甲。将该板摇动(Bellco Mini-Orbital Shaker)15分钟。然后将溶解的甲(50μL)转移到96-孔板中，并在570nm和参考波长660nm处测量(Bio-Tek Microplate Reader)光密度(OD)。按照下面的公式计算细胞生长的抑制百分比：结果列于表1-3中。
表1
在ZR-75-1细胞中细胞生长的抑制作用
化合物 小时 抑制％1)
药物浓度(μM)
1.0 3.3 10.0N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双 24 1.0 14.0 21.0(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6- 48 0 18.0 30.0庚三烯酰胺 72 13.0 56.0 64.0N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5- 48 3.0 0 60.0双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 72 16.0 10.0 80.01)抑制％是指与没有药物的对照样相比的细胞生长的抑制％。
表2
在MDA231细胞中细胞生长的抑制作用化合物 小时 抑制％1)
药物浓度(μM)
1.0 3.3 10.0N-(4-羟基苯基)-(2E 4E，6Z)-7-[3，5- 24 18 30 26双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6- 48 39 35 61庚三烯酰胺 72 46 62 71N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双 24 0 0 40(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6- 48 0 0 57庚三烯酰胺 72 38 48 76N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双 24 22 33 37(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2，4，6-庚三烯 48 42 51 50酰胺 72 50 68 73N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲 24 50 51 58基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 48 60 70 72
72 81 82 85N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲 24 18 21 30氧基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰 48 30 52 65胺 72 25 61 64N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二 24 6 65 65溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 48 72 81 82
72 78 86 87N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3， 24 45 57 587-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 48 67 80 81
72 76 87 881)抑制％是指与没有药物的对照样相比的细胞生长的抑制％。
表3
在MDA435细胞中细胞生长的抑制作用化合物 小时 抑制％1)
药物浓度(μM)
1.0 3.3 10.0N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5- 24 47 78 77双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6- 48 59 91 95庚三烯酰胺 72 94 96 98N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双 24 3 67 68(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6- 48 3 95 96庚三烯酰胺 72 4 98 99N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双 24 19 81 91(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2，4，6-庚三烯 48 45 93 99酰胺 72 73 83 100N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲 24 56 53 53基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 48 95 92 98
72 95 94 91N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二甲 24 21 36 25氧基苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰 48 64 61 61胺 72 86 87 87N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-(3，5-二 24 27 28 37溴苯基)-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 48 70 66 70
72 86 88 87N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3， 24 3 3 27-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺 48 39 40 42
72 41 51 681)抑制％是指与没有药物的对照样相比的细胞生长的抑制％.
这些结果表明，式I的化合物能够抑制细胞的生长。在ER-乳癌细胞和结肠直肠癌细胞中，抑制百分比(％)随浓度和培养时间增长而增长。不管怎样，所有测试的化合物都减缓了细胞的生长。例如，表3显示，在10μM，72h后，与没有药物的对照样相比，N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-苯基-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺对MDA-435细胞生长的抑制为68％。这意味着，用式I的化合物处理的那些细胞显示出其将基质转化为甲的量相应减少，这是由于细胞生长的数量减少或引发了细胞凋亡。2.细胞凋亡：用ELISA检测细胞死亡：
按照下面的方法测试式I的化合物引起细胞凋亡的能力：a)样品制备
收集细胞和培养基，将细胞离心并收集，重新悬浮在100μL裂解缓冲液(50mM Tris-Cl(pH＝8.0)，20mM EDTA，1％NP-40e)，并在4℃温浴30分钟使其裂解。离心出细胞碎片，并取出补充液的等分试样(30μL)以测定蛋白质，并在-20℃储存。加入另外的280μL裂解缓冲液，彻底混合，并在4℃以14,000RPM的速度离心10分钟。取出等分试样(180μL)，并将样品储存在-20℃直至测试。b)ELISA
使用购自Boehringer Mannheim(产品号1544-674)的商品化的细胞凋亡检测试剂盒，并按照随试剂盒提供的说明书进行操作(细胞死亡检测ELISA)。然而，该方案是经修改的，制备的是1∶40～1∶100的样品稀释液，而不是推荐的1∶10稀释液，因为用于制备样品抽提物的细胞数目增加，相应地增加了ELISA反应性。该试验通过确定用测试化合物(样品)处理的细胞抽提物中核小体片段的数量来测定细胞的凋亡。这些由于核酸内切酶的活化而形成的核小体片段，是已知的细胞凋亡的下游效应物。使用抗组蛋白抗体来将样品中的所有核小体片段固定在微量滴定板的孔中。然后用与过氧化物酶共联的抗-DNA抗体温浴该样品，并随后用过氧化物酶底物，ABTS温浴。用分光光度计在405/490nm测量所发生的色度变化。c)蛋白质的检测
为了将ELISA值与样品量建立标准化关系而测定每个样品的蛋白质总含量。在(Biorad DC试验，产品号500-0116)使用手册5.2节中公开了微板试验的规程。根据线性回归曲线计算蛋白质的浓度。d)ELISA试验的计算
通过减去ELISA板背景O.D.值来确定相对ELISA O.D.读数。从样品O.D.值中减去没有药品的对照样的O.D.值(只有裂解缓冲液)。根据样品蛋白质浓度及没有药品的对照样结果，确定校正系数(CC)，来校正样品的O.D.值，然后减去背景的O.D.值(BCS O.D.)。计算出相对于没有药品的对照样提高的倍数，并通过乘以校正系数，与样品的蛋白质总浓度建立标准化关系。
为确定ELISA O.D.提高的倍数，得到下列O.D.测量值：
ELISA板背景—只有裂解缓冲液(EPB)；
不用药物处理的对照样—用DMSO处理的细胞样品(NDT)；
药物处理的样品—用式I的化合物处理的细胞样品(DT)
从NDT中减去EPB(NDT-EPB)，从DT中减去EPB(DT-EPB)。那么处理的样品相对于对照样的提高倍数为(DT-EPB)/(NDT-EPB)。
为确定样品的蛋白质总浓度，使用基于BSA标准的标准线性回归公式(y＝mx＋b)，计算蛋白质的总浓度(mg/ul)。B＝ELISA背景。蛋白质浓度(PC)(mg/ml)＝(样品吸光率-b)/x。
校正系数(cc)为(NDT)(PC)/(DT)(PC)。
确定对总PC标准化的ELISA提高的倍数(FI)。
nDT为DT×cc(这是对PC标准化的DT O.D.)
nNDT为NDT×cc(这是对PC标准化的NDT O.D.)
对PC标准化的FI为nDT/nNDT。
结果列于下面的表4中。
表4
细胞凋亡的引发
化合物 小时 ZR-75-1- MDA-435 RKO H1299
诱导倍数1) 诱导倍数1) 诱导倍数1) 诱导倍数1)
10μM 3.3μM 1μM 10μM 3.3μM 1μM 10μM 3.3μM 1μM 10μM 3.3μM 1μM
(含量2) (含量2) (含量2) (含量2)(2E，4E，6Z)-7- 24 1(1) 1 1 1(13) 1 1 ND ND ND ND ND ND[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7- 48 1(1) 1 1 1(15) 1 1 ND ND ND ND ND ND二甲基-2，4，6-庚三烯酸 72 2(9) 1 1 2(19) 1 1 ND ND ND ND ND NDN-(4-羟基苯 24 3(2) 2 2 6(5) 6 3 21(8) 14 2 2(1) 3 1基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟 48 15(30) 19 2 16(10) 10 3 23(9) 5 4 12(15) 10 1甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6- 72 67(47) 69 2 34(12) 12 4 15(5) 1 1 20(25) 17 1庚三烯酰胺1)诱导倍数-对蛋白质量进行修正后，与没有药物的对照样相比较的细胞凋亡增加的倍数。2)含量-与内部正对照样9-顺式-4-HPR试验的活性比较。
表4的结果表明，在本试验中测试的式I的化合物能够引起ER+和ER-乳癌细胞和结肠直肠癌细胞的凋亡。例如，N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺在24～48h导致明显的细胞凋亡，而相应的酸(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酸仅在72h后引起相当少量的细胞凋亡。这样的实例N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，在MDA-435和RKO细胞系中于24h后，在ZR-75-1细胞中于48h后引起明显的细胞凋亡。IIB.体内试验
测试了化合物N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，发现其既能减小肿瘤的大小，又能减少肿瘤的数量。因此，式I的化合物在大鼠体内可有效地抵抗已产生的亚硝基甲脲(NMU)引发的乳瘤。在大鼠体内，由NMU诱导侵袭性乳腺组织的特定肿瘤(Gullino等，1975)，是在服用一剂低毒性的剂量(McCormick等，1981)最少仅4周内，即产生主要取决于雌激素的癌症(Arafah等，1980)，并导致高比例地引发肿瘤。在本试验模型中的由NMU在大鼠体内诱导的肿瘤的性质是有代表性的人类乳癌，并且是侵袭性McCormick等，1981)。材料和方法.将750只26～32天大的年幼的雌性Sprague-Dawley大鼠(Harlan实验室)关在聚碳酸酯的笼子中(3只大鼠/笼子)，并随意提供食物和水。基本上按以前公开的方法引发乳瘤(Gullino等，1975和McCormick等，1981)。在50+/-3天大时，每只动物接受一剂(50mg/kg体重)NMU(Sigma，St.Louis，MO)，所述的NMU是在用乙酸酸化到pH值为5.0的0.85％的氯化钠中。该致癌物是使用26g针通过尾部静脉注射的，体积为0.5ml。
服用NMU后四周起，每周检查大鼠是否有可触摸的肿瘤，那些带有至少一个乳房肿瘤的大鼠，在可触摸到后11天或不足11天，在服用NMU61天后进行研究。将15只动物分配到治疗组或对照样组。每周用测径器沿长轴和短轴测量肿瘤的直径，并用椭圆体公式(D×d2)/2，其中D为长直径，d为短直径，计算出肿瘤的体积。将新的可触知的肿瘤出现的天数，或已产生的肿瘤消失的天数，与其解剖学部位一起记录下来。在以前完全萎缩的肿瘤的同一解剖学部位出现的肿瘤，视为是相同肿瘤的再生。对出现肿瘤溃疡的大鼠立即终止研究。进入试验组的所有动物，在6周的时间内每天称量体重。
在4％乙醇，8％PEG400，7.2％Cremophor RH40和80％D5W中配制N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，并用21g的针通过腹膜内给药2.8ml，每周5次，持续4周。结果与讨论
为治疗在大鼠体内NMU引发的肿瘤，每天在4％乙醇，8％PEG400，7.2％Cremophor RH40和80％D5W中配制试验化合物N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。
这些结果(见表5-7)表明，在用该化合物治疗的动物中，试验化合物能引起现有的肿瘤收缩，并且通过消除最初的肿瘤和抑制另外的肿瘤出现而导致肿瘤数量减少。
表5在Sprague-Dawley大鼠体内，腹膜内给药N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺(化合物)四周，对NMU引发的最初的肿瘤的影响
量初的肿瘤萎缩至触摸不到的数量/在几周里第0
天可触模到的肿瘤的数量组 1 2 3 4 5 6载体对照-2.8ml， 0/22 0/22 1/21 0/20 0/19 0/155次/周化合物25mg/kg/2.8ml，7/20** 5/19* 3/19 4/19* 4/18* 5/18*5次/周最初的肿瘤萎缩至触摸不到的百分比，大于载体对照组(Fisher萃取物试验)；*p＜0.05，**p＜0.005
表6在Sprague-Dawley大鼠体内，腹膜内给药N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺(化合物)四周对NMU引发的最初肿瘤的体积的影响
在几周里的平均肿瘤体积±SEM(mm3)组 1 2 3 4 5 6载体对照-2.8 1600±56 3684±13 6060±26 5176±14 8600±28 6485±23ml，5次/周 3 30 32 90 38 75化合物25 358±243 801±395 2162±70 3370±10 5433±17 8052±25mg/kg/2.8ml， ** * 5 22 21 845次/周每只大鼠的平均肿瘤体积明显小于载体对照组(Wilcoxon Rank Sum Test)；*p＜0.05，**p＜0.005
表7在Sprague-Dawley大鼠体内，腹膜内给药N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺(化合物)，抗NMU引发的最初的乳瘤的效果*相对于第0天的肿瘤的体积 治疗后的周数
1 2 3
载体 化合物 载体 化合物 载体 化合物萎缩＞50％ 0 10 0 8 2 6不变 6 5 1 5 1 3增长＞100％ 16 4 21 6 18 6总计 22 19 22 19 21∧ 19*每日服用在4％乙醇，8％PEG400，7.2％Cremophor RH40和80％D5W中配制的化合物25mg/kg/2.8ml，每周5次，持续4周；将15只大鼠中的3只毒死，并检查数据。∧随着时间的推移，肿瘤总数减少，是因为肿瘤溃烂造成动物死亡。
Claims (11)
1.式I的化合物：
其中R1和R2独立地为氢，卤素，烷基，烷氧基或三卤代甲基；R3为氢或烷基；R4为氢，只有当R3为烷基时，R4可以为烷基；R5，R6，及R8和R9独立地为卤素，氢，羟基，烷基或烷氧基；并且R7为氢或烷基；其中不含6-反式异构体。
2.式II的权利要求1的化合物：其中R1，R2，R3和R4的含义如权利要求1。
3.权利要求2的化合物，其中R3为甲基，并且R4为氢。
4.权利要求2的化合物，其中R3和R4为氢。
5.权利要求2的化合物，其中R3和R4都为甲基。
6.权利要求2的化合物，即N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。
7.权利要求2的化合物，即
N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3-甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，
N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(三氟甲基)苯基]-3，6，7-三甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，
N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(溴)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，
N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(甲基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，
N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[3，5-双(甲氧基)苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺，和
N-(4-羟基苯基)-(2E，4E，6Z)-7-[苯基]-3，7-二甲基-2，4，6-庚三烯酰胺。
8.一种药物组合物，包括权利要求1—7中任何一项的化合物和适合药用的载体。
9.作为药物的权利要求1—7中任何一项的化合物。
10.权利要求1—7中任何一项的化合物在制备用于治疗乳癌的药物中的应用。
11.基本上如此前所公开的新颖的化合物，组合物及应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
| C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |