CN1329517C - 深圳5号非洲菊的转基因技术 - Google Patents
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Abstract
一种深圳5号非洲菊的转基因技术，其特征在于包括质粒导入根癌农杆菌、LBA4404种子液的制备和保存、农杆菌的转化三大步骤，其中，步骤三——农杆菌的转化包括活化农杆菌、外植体与菌液共培养、除菌培养、抗生素筛选、拟转基因植株的复壮和增殖培养五个分步骤。本方法将含有嵌合的CaMV35S.HPT基因和一个嵌合的CaMV35S.GUS基因转化深圳5号非洲菊单芽，获得了转基因植株，为生产上转化其它目的基因、获得转基因非洲菊新品系(种)提供技术。本方法具有稳定性好、再生和转化效率高的优点。
Description
(一)技术领域
本发明涉及非洲菊(Gerbera hybrida)深圳5号(S5)的转基因技术，即通过转基因技术获得转基因植株的方法。
(二)背景技术
非洲菊别名扶郎花，为世界六大切花之一，也是重要的盆栽花卉。它的园艺品种多，观赏价值高。育种工作者一直都在致力于获得各种花色、花型、花香、以及瓶插寿命长，具有抗性、耐热、耐冷的新品种。传统育种技术存在杂交育种时间长、杂交难以引入亲缘性较远种的优良性状，引入某一或某些优良性状时往往伴随一些不良的性状引入等缺点。利用基因工程技术将有望实现对非洲菊花色、花形、抗性、花期、瓶插寿命、花香等性状进行改良。
目前为止，国外对非洲菊转基因进行了初步的研究工作，但也仅限于一两个实验室的报道，且转化效率很低。例如，Elomaa等(1993)以红色品种Terra Regina试管苗的叶柄为外植体，利用根癌农杆菌将外源基因导入外植体，然后进行卡那霉素(Kan)选择，最后每100个外植体获得0.1-2个转基因苗(Biotechnology，1993，11：508-511)。国内的非洲菊转基因研究还只是处于摸索转化条件的阶段，尚未能获得转基因植株[叶华等，2003，云南大学学报(自然科学版)，25(增刊)：128-130；刘慧，2004，华中农业大学硕士学位论文]。深圳5号(S5)舌状花为桔黄色，内轮盘状花为黑色，花色鲜艳，很受人们喜爱。目前该品种植株再生频率很低。另外各种病毒、微生物和害虫的侵害以及本身的耐热性、耐冷性不高，使非洲菊的品质提高以及广泛应用于市场受到很大限制。
(三)发明的内容
本发明的目的在于提供一种深圳5号非洲菊的转基因方法，该方法具有稳定性好、再生和转化效率高的优点。将含有嵌合的CaMV35S.HPT基因(潮霉素磷酸转移酶基因)和一个嵌合的CaMV35S.GUS基因转化深圳5号非洲菊单芽，获得了转基因植株，为生产上转化其它目的基因、获得转基因非洲菊新品系(种)提供技术。
本发明的方法包括如下步骤：
步骤一，质粒导入根癌农杆菌：按照常规的中间载体质粒DNA直接导入农杆菌的方法(可参照王关林和方宏筠2002年编著的《植物基因工程原理与技术》，北京：科学出版社)，将pCAMBIA1301(CAMBIA公司，澳大利亚)导入根癌农杆菌LBA4404中；涂板培养，培养基采用配方为YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L链霉素的固体培养基A，在28±1℃条件恒温培养46～50h；
步骤二，LBA4404种子液的制备和保存：挑取上述培养获得的含pCAMBIA1301质粒的LBA4404单菌落，接种至培养基B：即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L链霉素的液体培养基中，28±1℃、180～220r/min条件下振荡培养24～36h；加入体积百分比浓度为80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最终甘油浓度为20％；将甘油菌液混合液，即LBA4404种子液分装至eppendof管中，置于-70～-80℃条件下保存备用；
步骤三，农杆菌的转化：包括如下步骤
(1)活化农杆菌：取步骤二所得LBA4404种子液5～8μl接种于10～15ml步骤二的培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件培养23～25h；取1ml的菌液转接到40～50ml新鲜培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件继续培养10～14h；将培养的菌液转入eppendof管中，5000r/min，离心5min，去除上清液；用植物诱导培养基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培养基悬浮沉淀；在分光光度计上测定所得菌液的OD600值，OD600值为0.4～0.5时为活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最终浓度为20～30mg/L，备用；
(2)外植体与菌液共培养：将分步骤(1)所获得的备用菌液，在28±1℃、180～220r/min条件下振荡培养1～2h；切取深圳5号非洲菊组培苗的单芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方为MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+琼脂1％、pH5.2～5.5的共培养基中，24±1℃、黑暗条件下共培养3～4d；
(3)除菌培养：将分步骤(2)培养后的单芽外植体用含500mg/L头孢拉定的无菌水冲洗，吸去表面水分；转入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+头孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的除菌培养基上除菌培养3～4d，培养条件为24±1℃、12h光照/12h黑暗；
(4)抗生素筛选：将除菌培养后的单芽转入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+头孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的选择培养基上培养，每7～10d转瓶一次，转瓶3～4次后，单芽基部诱导出不定芽；
(5)拟转基因植株的复壮和增殖培养：将分步骤(4)诱导出的不定芽切下，转入MS+BA0.5～0.8mg/L+IAA0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽复壮和增殖培养基上，进行复壮和增殖10～15d；再将不定芽转入与分步骤(4)相同的选择培养基上继续培养30～40d；最后将生活力强的拟转基因不定芽转至MS+IAA0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培养基上培养，20～30d可获得具有根的完整的拟转基因植株，用于分子鉴定。
在本办法步骤一中，中间载体质粒DNA直接导入农杆菌的方法一般包括根癌农杆菌感受态的制备、质DNA转化和检测等步骤；恒温培养一般是在恒温培养箱中进行的。步骤二和步骤三之(2)中，振荡培养一般是在恒温振荡培养箱中进行的。在步骤三之(2)中，组培苗的获得方法属于现有技术，一般包括花托外植体的消毒、接种、培养、幼苗增殖和继代培养等步骤而获得健壮幼苗的单芽。在步骤三之(3)中，单芽外植体一般用30～50mL含头孢拉定的无菌水冲洗2～3次，然后用吸水纸吸去表面水分。
本发明具有如下的优点和效果
1、通过转基因，经GUS稳定性表达检测和PCR、Southern杂交检测结果表明，转基因苗诱导频率最高可达到7.43％。
2、转基因方法中采用无菌组培苗的单芽为外植体，这样实验材料的获得就有了保证，而不受季节和外界环境条件变化的影响。
3、采用单芽直接诱导出不定芽(单芽增殖)这一基因转化途径可在较短时间(从单芽外植体接种于共培养基到获得抗性芽约30～45d)获得拟转基因不定芽，再经过20～30d可获得完整的拟转基因组培苗。
4、本转基因方法中不定芽再生途径在非洲菊各品种中的研究已很成熟，因此可实现非洲菊其它品种转基因体系的建立和后续基因工程的研究。
(四)具体的实施方式
下面结合实施例1-3对本发明进行进一步的说明。
实施例1：
步骤一，质粒导入根癌农杆菌：按照常规的中间载体质粒DNA直接导入农杆菌的方法，将pCAMBIA1301导入根癌农杆菌LBA4404中；涂板培养，培养基采用配方为YEB+50mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素的固体培养基A，在28±1℃条件恒温培养46h；
步骤二，LBA4404种子液的制备和保存：挑取上述培养获得的含pCAMBIA1301质粒的LBA4404单菌落，接种至培养基B：即YEB+50mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素的液体培养基中，28±1℃、180r/min条件下振荡培养24h；将已经配好的体积百分比浓度为80％的甘油与培养好的菌液混合，使甘油菌液混合液中的最终甘油浓度达到20％。将甘油菌液混合液分装至1.5ml的eppendof管中，置于-70℃条件下保存备用；
步骤三，农杆菌的转化：
(1)活化农杆菌：取步骤二所得LBA4404种子液5μl接种于10ml步骤二的培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件培养23h；取1ml的菌液转接到40ml新鲜培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件继续培养10h；将培养的菌液转入10ml eppendof管中，5000r/min，离心5min，去除上清液；用10ml植物诱导培养基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培养基悬浮沉淀；取所得的菌液1ml，在分光光度计上测菌液的OD600值，结果OD600值为0.4，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使最终浓度达到20mg/L，备用；
(2)外植体与菌液共培养：将分步骤(1)所获得的备用菌液，在28±1℃、220r/min条件下振荡培养1h；切取深圳5号非洲菊组培苗的单芽，在菌液中浸泡10min后置于配方为MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+乙酰丁香酮20mg/L+蔗糖3％+琼脂1％、pH5.5的共培养基中，24±1℃、黑暗条件下共培养3d；
(3)除菌培养：将分步骤(2)培养后的单芽外植体用含500mg/L头孢拉定的无菌水冲洗3次，用吸水纸吸去表面水分；转入MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+头孢拉定400mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6的除菌培养基上除菌培养3d，培养条件为24±1℃、12h光照/12h黑暗；
(4)抗生素筛选：将除菌培养后的单芽转入MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+头孢拉定300mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6的选择培养基上培养，每7d转瓶一次，转瓶3次后，单芽基部诱导出不定芽；
(5)拟转基因植株的复壮和增殖培养：将分步骤(4)诱导出的不定芽切下，转入MS+BA0.5mg/L+IAA0.3mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8的不定芽复壮和增殖培养基上，进行复壮和增殖10d；再将不定芽转入与分步骤(4)相同的选择培养基上继续培养30d；最后将生活力强的拟转基因不定芽转至MS+IAA0.3mg/L+10mg/L潮霉素的生根培养基上培养，20d可获得具有根的完整的拟转基因植株，用于分子鉴定。
检测结果：单芽外植体中GUS瞬时表达率为20％，抗性不定芽发生频率达20％，最终能获得转基因不定芽频率达7.43％。
实施例2：其它同实施例1，不同的是：
步骤一：培养基A为YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L链霉素的固体培养基，培养时间为50h；
步骤二：培养基B为YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L链霉素的液体培养基，培养条件28±1℃、220r/min，培养时间36h；LBA4404种子液分装至1.5ml eppendof管中，置于-80℃条件下保存备用。
步骤三：
(1)活化农杆菌：取步骤二所得LBA4404种子液8μ1接种于15ml步骤二的培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件培养25h；取1ml的菌液转接到50ml新鲜培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件继续培养14h；将培养的菌液转入10mleppendof管中，5000r/min，离心5min，去除上清液；用10ml植物诱导培养基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培养基悬浮沉淀；取所得的菌液1ml，在分光光度计上测菌液的OD600值，结果OD600值为0.5，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使最终浓度达到30mg/L，备用；
(2)外植体与菌液共培养：将分步骤(1)所获得的备用菌液，在28±1℃、180r/min条件下振荡培养2h；切取深圳5号非洲菊组培苗的单芽，在菌液中浸泡15min后置于配方为MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+乙酰丁香酮30mg/L+蔗糖3％+琼脂1％、pH5.2的共培养基中，24±1℃、黑暗条件下共培养4d；
(3)除菌培养：将分步骤(2)培养后的单芽外植体用含500mg/L头孢拉定的无菌水冲洗3次，用吸水纸吸去表面水分；转入MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+头孢拉定500mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8的除菌培养基上除菌培养4d，培养条件为24±1℃、12h光照/12h黑暗；
(4)抗生素筛选：将除菌培养后的单芽转入MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+头孢拉定400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH 5.8的选择培养基上培养，每10d转瓶一次，转瓶4次后，单芽基部诱导出不定芽；
(5)拟转基因植株的复壮和增殖培养：将分步骤(4)诱导出的不定芽切下，转入MS+BA0.8mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.8的不定芽复壮和增殖培养基上，进行复壮和增殖15d；再将不定芽转入与分步骤(4)相同的选择培养基上继续培养40d；最后将生活力强的拟转基因不定芽转至MS+IAA0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培养基上培养，30d可获得具有根的完整的拟转基因植株，用于分子鉴定。
检测结果：单芽外植体中GUS瞬时表达率为18％，抗性不定芽发生频率达18％，最终能获得转基因不定芽频率达6.86％。
实施例3：其它同实施例1，不同的是：
步骤1：培养基A为YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L链霉素的固体培养基；
步骤2：培养基B为YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L链霉素的液体培养基，培养时间36h；
步骤3：(1)完成后，OD600值为0.5；(2)中备用菌液振荡培养时间为2h；(3)外植体在除菌培养基pH为5.8条件下除菌培养3d；(4)中培养基pH为5.8；(5)中不定芽复壮和增殖培养基pH值为5.6；在生根培养基上培养的时间为30d。
检测结果：单芽外植体中GUS瞬时表达率为20.3％，抗性不定芽发生频率达20.3％，最终能获得转基因不定芽频率达7.35％。
Claims (2)
1、一种深圳5号非洲菊的转基因方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤一，质粒导入根癌农杆菌：按照常规的中间载体质粒DNA直接导入农杆菌的方法，将pCAMBIA1301导入根癌农杆菌LBA4404中；涂板培养，培养基采用配方为YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L链霉素的固体培养基A，在28±1℃条件恒温培养46～50h；
步骤二，LBA4404种子液的制备和保存：挑取上述培养获得的含pCAMBIA1301质粒的LBA4404单菌落，接种至培养基B：即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L链霉素的液体培养基中，28±1℃、180～220r/min条件下振荡培养24～36h；加入体积百分比浓度为80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最终甘油浓度为20％；将甘油菌液混合液，即LBA4404种子液分装至eppendof管中，置于-70～-80℃条件下保存备用；
步骤三，农杆菌的转化：包括如下步骤
(1)活化农杆菌：取步骤二所得LBA4404种子液5～8μl接种于10～15ml步骤二的培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件培养23～25h；取1ml的菌液转接到40～50ml新鲜培养基B中，按步骤二的温度和振荡培养条件继续培养10～14h；将培养的菌液转入eppendof管中，5000r/min，离心5min，去除上清液；用植物诱导培养基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培养基悬浮沉淀；在分光光度计上测定所得菌液的OD600值，OD600值为0.4～0.5时为活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最终浓度为20～30mg/L，备用；
(2)外植体与菌液共培养：将分步骤(1)所获得的备用菌液，在28±1℃、180～220r/min条件下振荡培养1～2h；切取深圳5号非洲菊组培苗的单芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方为MS+BA 2～3mg/L+IAA 0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+琼脂1％、pH 5.2～5.5的共培养基中，24±1℃、黑暗条件下共培养3～4d；
(3)除菌培养：将分步骤(2)培养后的单芽外植体用含500mg/L头孢拉定的无菌水冲洗，吸去表面水分；转入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+头孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的除菌培养基上除菌培养3～4d，培养条件为24±1℃、12h光照/12h黑暗；
(4)抗生素筛选：将除菌培养后的单芽转入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+头孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的选择培养基上培养，每7～10d转瓶一次，转瓶3～4次后，单芽基部诱导出不定芽；
(5)拟转基因植株的复壮和增殖培养：将分步骤(4)诱导出的不定芽切下，转入MS+BA 0.5～0.8mg/L+IAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+琼脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽复壮和增殖培养基上，进行复壮和增殖10～15d；再将不定芽转入与分步骤(4)相同的选择培养基上继续培养30～40d；最后将生活力强的拟转基因不定芽转至MS+IAA 0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培养基上培养，20～30d获得具有根的完整的拟转基因植株。
2、如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤一中，恒温培养是在恒温培养箱中进行的；步骤二和步骤三之(2)中，振荡培养是在恒温振荡培养箱中进行的；在步骤三之(3)中，单芽外植体用30～50mL含头孢拉定的无菌水冲洗2～3次，然后用吸水纸吸去表面水分。
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