CN1321245A - 脂质修饰酶的制备方法及生物传感器 - Google Patents

Abstract

能精确地以高度储存可靠性地测定底物浓度的生物传感器。制备脂质修饰酶的方法,包括如下步骤:在含式(1)(其中,m和n各自独立地为14－18的整数,X^－为Cl^－、Br^－、I^－、H₂PO₄ ^－、HSO₄ ^－或NO₃ ^－)所示脂质的介质中加入酶,生成脂质/酶复合物;析出生成的复合物;将析出物干燥。上述生物传感器由在电绝缘性基板上形成的作用极和对极的电极系及在电极系或其附近形成的反应层组成,其中所述反应层具有至少2层,包括含上述方法所得脂质修饰酶的一层与含电子传递体的一层。

Description

脂质修饰酶的制备方法及生物传感器

技术领域

本发明涉及可对血液、尿液等生物试样、食品工业中的原料和制品及果汁等所含的特定成分(底物)进行高精度、迅速和容易的定量的生物传感器，以及该传感器中所用的脂质修饰酶的制备方法。

背景技术

有人提出，不进行试样液的稀释和搅拌等而可简易地对生物试样和食品中的特定成分(底物)进行定量的生物传感器。其一例为特开平3-202764号公报上公开了一种生物传感器，系用筛网印刷等方法在绝缘基板上形成电极系，在此电极系上形成含氧化还原酶和电子传递体(电子接受体)的反应层。

此生物传感器按如下方法对试料中的底物浓度进行定量。

首先，将试料液滴加在生物传感器的反应层上，反应层溶解，试料液中的底物与反应层的氧化还原酶之间进行酶反应。此酶反应的同时，电子传递体被还原。一定时间后，在传感器的电极上外加电压，将此被还原的电子传递体进行电化学氧化，从这时所得的氧化电流值可对试料样中的底物浓度进行定量。

使用脂质修饰酶的生物传感器在特开平7-110313号公报中有揭示。因为是脂质修饰，酶以不溶于水、可溶于有机溶剂、与可溶于水的电子传递体呈分离的状态形成反应层。这样，可提供迅速和保持高度保存可靠性的传感器。

以往不用脂质修饰酶的结构的生物传感器中，酶与电子传递体存在于同一反应层中，因而其优点为一旦供给试料样反应即迅速开始。然而，酶与电子传递体等化合物长期保持在混合状态，则存在酶活性降低、传感器应答性能恶化的问题。而且，不含底物的试料液也可产生有氧化电流值(本底值)。因此，虽然考虑到将酶和电子传递体分离为各自的层，但因酶与电子传递体均系水溶性，故难以形成完全分离的状态。

另一方面，有人提出将特定的脂质分散液与酶溶液混合的方法作为脂质修饰酶的制备方法(Thin solic Films,180,p65(1989))。但是，难以高收率地得到高活性脂质修饰酶。

本发明的目的在于有效地利用以往构成的生物传感器的优点、同时解决上述问题、提供高收率地得到高活性脂质修饰酶的制备方法。

本发明的目的还在于提供一种生物传感器，它利用该脂质修饰酶，可高精度地定量测定底物，其保存可靠性高，而且在底物浓度为0时的应答值(本底)低。

发明的揭示

本发明提供脂质修饰酶的制备方法，包括以下步骤：在含下式(1)所示脂质二烷基二甲基铵盐的介质中加入酶，生成脂质与酶的复合物；析出生成的前述复合物；将前述析出物干燥。

式中，m和n各自独立地为14-18的整数，X^-为Cl^-、Br^-、I^-、H₂PO₄ ^-、HSO₄ ^-或NO₃ ^-。

在含前述脂质的介质中加入酶时，酶与脂质的比例以重量计较佳为1∶0.2-1∶5。

前述式(1)的X^-以Cl^-或Br^-为佳。

本发明的生物传感器具有电绝缘性基板、具有在前述基板上形成的作用极和对极的电极系及在前述电极系或其附近形成的反应层，所述反应层至少由以酶和前述式(1)所示脂质为主体的脂质修饰酶层与含电子传递体层组成。

附图的简单说明

图1是本发明的一个实施例中除反应层外生物传感器的分解立体图。

图2是生物传感器的纵断面简图。

实施方面的最佳状态

下面对本发明的脂质修饰酶的制备方法加以说明。

将前述式(1)所示脂质分散或溶解于液体(较佳为水)中，配制成脂质分散液或脂质溶液。然后在该液体中添加酶，使用以固体粉末形式加酶的方法或添加含酶液体的方法均可。将含该酶和脂质的液体低温保存，使析出脂质和酶的复合物。然后，分离沉淀物，用水洗净后干燥，得到粉末状脂质修饰酶。干燥在常温下进行，较佳为使用冷冻干燥法。其中所用的溶剂以水为最佳，也可使用甲醇、乙醇、丁醇等醇类、乙醚等醚类、丙酮等有机溶剂。这些有机溶剂不溶解生成的脂质修饰酶，因此可容易地将生成的脂质修饰酶从溶剂中分离出来。

当前述式(1)中m、n均为13以下时，脂质与酶不生成复合物，即使生成，收率也低。当m、n均为19以上时，不能配制脂质分散液或脂质溶液。

在前述含脂质溶剂中加酶时，酶与脂质的比例按重量计为酶∶脂质=1∶0.2-1∶5，可得到70％以上的收率。

用脂质修饰的酶可溶于苯、甲苯等特定的有机溶剂，不溶于水。因此，在生物传感器中形成酶层时，可采用将脂质修饰酶溶于有机溶剂、滴加在基板的电极或其附近使其干燥的简便方法。另一方面，可将水溶性电子传递体水溶液滴加在规定的地方、干燥后形成电子传递体层。然而，用这样的方法形成各层时，含脂质修饰酶层与含电子传递体层以任何顺序形成均可，各自的层中所含的酶和电子传递体不受相互影响，可形成均匀的层。

这样的以脂质修饰的酶可列举葡糖氧化酶、葡糖脱氢酶、乳酸氧化酶、乳酸脱氢酶、果糖氧化酶、胆固醇氧化酶、胆固醇脱氢酶、胆固醇酯酶、变旋酶、转化酶、抗坏血酸氧化酶、醇氧化酶等。

本发明的生物传感器的反应层含如前所述的电子传递体。电子传递体可列举氰铁酸盐、对苯醌及其衍生物、吩嗪硫酸二甲酯、亚甲蓝、二茂铁及其衍生物等。电子传递体可使用一种或两种以上，特别以使用氰铁酸盐为佳。

除了上述酶类和电子传递体外，本发明的生物传感器的反应层还可含有亲水性高分子。通过在反应层中添加亲水性高分子，可防止反应层从基板或电极系表面剥离。而且，也有防止反应层表面破裂的效果，有效地提高生物传感器的可靠性。这样的亲水性高分子可列举羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚赖氨酸等聚氨基酸、聚苯乙烯磺酸酯、明胶及其衍生物、丙烯酸或其衍生物、无水马来酸或其盐的聚合物、淀粉及其衍生物等。特别以羧甲基纤维素为佳。

氧化电流的测定方法有仅涉及测定极和对极的二电极方式和加上参考电极的三电极方式，三电极方式可进行较正确的测定。

以下列举具体实施例对本发明作较详细的说明。

图1是本发明的生物传感器除反应层外的分解立体图。1表示由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成的电绝缘性基板。该基板1上用筛网印刷法印刷银糊，形成导线2、3。再在基板1上用同样的印刷法形成包括由含树脂粘合剂的导电性碳糊构成的作用极4和对极5的电极系，以及由电绝缘糊构成的电绝缘层6。电绝缘层6使作用极4和对极5露出部分的面积一定，并部分覆盖导线。

上述导线和电极的材料除银和碳之外，也可使用铂、金和钯等，但一次性使用的生物传感器中，以银糊形成的导线、以及以银糊打底然后在上面用碳糊覆盖所组成的电极为宜。

图2是本发明的生物传感器的纵断面简图。

在如图1所示的形成电极系的电绝缘性基板1上，形成含电子传递体的第一层7a，在该层上形成含酶类的第二层7b，从而形成了反应层7。

该生物传感器由聚对苯二甲酸乙二醇酯制成的电绝缘性基板1、盖板9和基板1和盖板9之间所夹的隔板8组合而成。它们按图1中虚线所示位置粘合，构成生物传感器。

在隔板8上，形成成为试料液供给路径的狭槽10，在盖板9上形成气孔11。基板1和盖板9之间夹入隔板8，层压，粘合，则在基板1和盖板9之间的狭槽10部分形成成为试料供给路径的空间部分。形成此空间部分起始端的狭槽10的开口端成为试料液的供给口，终端部与气孔11连通。

这里，是用盖板9和隔板8的组合构成盖板构件的，但是，所述盖板构件也可由一个设置了相当于隔板8的狭槽10的沟槽的构件构成。这样，在由绝缘性基板与盖板之间形成试料液供给通道的盖板构件组合构成的生物传感器中，在电极系上并非必需形成反应层。只要在试料液通过试料供给通道以毛细管现象到达电极系以前，试料供给通道的露出部分设法形成使得反应层能够溶解于试料液即可。

实施例1

在图1基板1的电极系上，滴加铁氰化钾水溶液，干燥，形成第一层7a。此第一层7a内所含的铁氰化钾的量为1mg/cm²。

然后，如下所述，形成脂质修饰的酶层。

首先，用如下方法制备脂质修饰酶。将式(1)中m=18、n=18表示的脂质氯化二十八烷基二甲基铵10mg与去离子水10ml混合，用超声波清洗机将脂质分散在去离子水中。在此分散液中溶解葡糖氧化酶(EC1.1.3.4：以下简称GOD)10mg。将此液体在冰浴中冷却2小时后，在冰箱中冷却24小时。由于这样的冷却，脂质和酶的复合物析出，沉淀。分取此沉淀物，用去离子水洗涤后，用冷冻干燥机干燥。这样，得到粉末状的脂质修饰酶。收率为99％，脂质修饰酶中酶蛋白的比例为50％(重量)。

然后，将脂质修饰酶粉末溶于二甲苯，将该溶液滴加在上述第一层7a上，干燥，形成第二层7b。此时，先形成的铁氰化钾层与脂质修饰酶层形成完全分离的状态。此第二层7b中所含的脂质修饰酶的量为0.2mg/cm²反应层。

将含葡萄糖的试料液供给反应层7，试料液中的葡萄糖被GOD氧化。与此同时，反应层中的电子传递体被还原。接着，供给试料液1分钟后在作用极4上外加相对于对极5为+0.5V的电压，将还原型电子传递体氧化。然后，测定5秒钟后的电流值。此电流值与所生成的电子传递体的浓度即试料液中的底物浓度成比例，因此，通过测定此电流值可求出试料液的葡萄糖浓度。

准备葡萄糖浓度为0、180、360、540mg/dl的试料液，测定传感器对各浓度的应答电流值，结果，应答电流值与葡萄糖浓度之间具有如表1所示的一定的相关性，显示良好的直线性。而且，本底值为0μA。

实施例2

与实施例1同样地，形成含铁氰化钾的第一层7a。

接着，用与实施例1同样的方法制备脂质修饰酶。其中使用式(1)中m=18、n=18表示的脂质氯化二十八烷基二甲基铵10mg、去离子水10ml和GOD 5mg。此时，脂质修饰酶的收率为90％，脂质修饰酶中酶蛋白的比例为37％(重量)。

形成含这样得到的脂质修饰酶的第二层7b。此第二层7b中所含的脂质修饰酶的量为0.3mg/cm²反应层。

用与实施例1同样的方法测定传感器对葡萄糖标准液的应答电流值，结果，应答电流值显示对葡萄糖浓度的良好直线性。而且，本底值为0μA。

实施例3

与实施例1同样地，形成含铁氰化钾的第一层7a。

接着，用与实施例1同样的方法制备脂质修饰酶。其中使用式(1)中m=18、n=18表示的脂质氯化二十八烷基二甲基铵10mg、去离子水10ml和GOD 2mg。此时，脂质修饰酶的收率为82％，脂质修饰酶中酶蛋白的比例为20％(重量)。

形成含这样得到的脂质修饰酶的第二层7b。此第二层7b中所含的脂质修饰酶的量为0.5mg/cm²反应层。

用与实施例1同样的方法测定传感器对葡萄糖标准液的的应答电流值，结果，应答电流值显示对葡萄糖浓度的良好直线性。而且，本底值为0μA。

实施例4

与实施例1同样地，形成含铁氰化钾的第一层7a。

接着，用与实施例1同样的方法制备脂质修饰酶。其中使用式(1)中m=18、n=18表示的脂质氯化二十八烷基二甲基铵5mg、去离子水10ml和GOD 10mg。此时，脂质修饰酶的收率为85％，脂质修饰酶中酶蛋白的比例为60％(重量)。

形成含这样得到的脂质修饰酶的第二层7b。此第二层7b中所含的脂质修饰酶的量为0.2mg/cm²反应层。

用与实施例1同样的方法测定传感器对葡萄糖标准液的的应答电流值，结果，应答电流值显示对葡萄糖浓度的良好直线性。而且，本底值为0μA。

实施例5

与实施例1同样地，形成含铁氰化钾的第一层7a。

接着，用与实施例1同样的方法制备脂质修饰酶。其中使用式(1)中m=18、n=18表示的脂质氯化二十八烷基二甲基铵2mg、去离子水10ml和GOD 10mg。此时，脂质修饰酶的收率为70％，脂质修饰酶中酶蛋白的比例为76％(重量)。

形成含这样得到的脂质修饰酶的第二层7b。此第二层7b中所含的脂质修饰酶的量为0.15mg/cm²反应层。

用与实施例1同样的方法测定传感器对葡萄糖标准液的的应答电流值，结果，应答电流值显示对葡萄糖浓度的良好直线性。而且，本底值为0μA。

比较例1

为了确认实施例1所示脂质修饰酶的脂质修饰效果，对使用未作脂质修饰的酶的传感器的应答性和本底值进行了评价。在图1的基板1的电极系上，滴加铁氰化钾和GOD的混合水溶液，干燥，形成反应层7。该层7中所含的铁氰化钾的量为1mg/cm²反应层，GOD量为0.1mg/cm²反应层。因为在第一层上形成了铁氰化钾和GOD的混合层，所以不再形成第二层。

接着，用与实施例1同样的方法测定传感器的应答电流。其结果，应答电流与葡萄糖浓度之间具有一定的相关性，显示良好的直线性。该应答直线性与实施例1所示大致相同。然而，本底值为0.1μA。

用脂质修饰酶的实施例1的传感器与用未修饰酶的比较例1的传感器应答特性的比较见表1。

然而，将实施例1的传感器与比较例1的传感器于50℃干燥状态下保存1个月后，与上述同样地测定本底值。其结果，用未修饰酶的比较例1的传感器本底值增加至0.2μA，而用脂质修饰酶的实施例1的传感器本底值为0.05μA。表1

应答电流值    (μA)
						葡萄糖浓度    (mg/dl)
0	180	360	540
				实施例1		0.0	6.1	12.0	18.7
比较例1	0.1	5.7	12.0		18.3

比较例2

用与实施例1同样的方法试制脂质修饰酶。其中使用式(1)中m=12、n=12表示的脂质氯化二十八烷基二甲基铵10mg、去离子水10ml和GOD 10mg。脂质修饰酶的收率为20％以下，脂质修饰酶中酶蛋白的比例为41％(重量)。

用式(1)中m和n值不同的脂质和酶各10mg，与实施例1同样地制备脂质修饰酶，收率和脂质修饰酶中酶蛋白比例的比较见表2。

                              表2

m     n  收率(重量％)  酶蛋白比例(重量％)
	12    12      25              4414    14      82              5716    16      88              7018    18      99              50

以上实施例中对用葡糖氧化酶作酶的葡萄糖传感器进行了说明，但本发明同样也可适用于乳酸传感器、胆固醇传感器、果糖传感器、蔗糖传感器、醇传感器、抗坏血酸传感器等各传感器中所用的酶。

产业上利用的可能性

按照如上所述的本发明，可得到能高精度、迅速、容易地对血液、尿等生物试料、食品工业中的原料野生品等试料中所含的底物进行定量的生物传感器。

Claims (5)

1．脂质修饰酶的制备方法，其特征包括以下步骤：在含下式(1)所示脂质二烷基二甲基铵盐的介质中加入酶，生成脂质与酶的复合物；析出生成的前述复合物；将前述析出物干燥式中，m和n各自独立地为14-18的整数，X-为Cl^-、Br^-、I^-、H₂PO₄ ^-、HSO₄ ^-或NO₃ ^-。

2．如权利要求1所述的脂质修饰酶的制备方法，前述介质中酶与脂质的重量比为1∶0.2-1∶5。

3．如权利要求1所述的脂质修饰酶的制备方法，其中前述式(1)的X^-为Cl^-或Br^-。

4．生物传感器，具有电绝缘性基板、具有在前述基板上形成的作用极和对极的电极系及在前述电极系或其附近形成的反应层，所述反应层至少由以酶和下述式(1)所示脂质为主体的脂质修饰酶层与含电子传递体层组成。

5．如权利要求4所述的生物传感器，其中前述式(1)的X^-为Cl^-或Br^-。