CN1300319A

CN1300319A - 脂肪酶变体

Info

Publication number: CN1300319A
Application number: CN 99803019
Authority: CN
Inventors: 金·博尔奇; 贾斯珀·文德; 阿伦·斯文德森; 多尔特·A·彼得森; 沙姆坎特·A·帕特卡; 柯尔斯滕·博杰森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2001-06-20
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: DE69931607T2; CN1247776C; ATE328070T1; DE69931607D1

Abstract

具有带电氨基酸的特定分布的立扑莱斯^○(野生型Humicola lanuginosa的脂肪酶)的变体在具有高的阴离子与非离子表面活性剂比例的洗涤剂溶液中具有特别好的首次洗涤性能。该作用是通过在N－末端连接一个带正电的肽延伸部分并且通过对在对应于第90—101位以及第210位上的氨基酸区域中的电荷分布施加特定的限制来实现的。通过在N－末端连接一个肽延伸部分以及取代90—101区域中的或者三维结构中紧靠着的环境中的氨基酸,本发明人进一步发明了一种由立扑莱斯开发具有所述性能的变体的方法。所述脂肪酶可以进一步提供其它的益处,诸如白度的维持和脏物的清洗。

Description

脂肪酶变体

发明领域

本发明涉及适用于洗涤剂组合物、特别是具有高含量阴离子表面活性剂的洗涤剂中的脂肪酶变体。更具体地讲，本发明涉及来自Humicola lanuginosa菌株DSM 4109的野生型脂肪酶的变体。

发明背景

许多年来，已将脂肪酶用作洗涤剂酶以除去来自衣物和其它纺织物的脂类或脂肪的污物，其中特别是来源于Humicola lanuginosa的(EP 258 068和EP 305 216)以商品名立扑莱斯^(Novo Nordisk A/S的产品)销售的脂肪酶。

WO 92/05249,WO 94/25577,WO 95/22615,WO 97/04079与WO97/07202公开了H.lanuginosa脂肪酶的变体，该变体针对洗涤用途而言具有改善的特性。于是，WO 97/04079公开了在N-末端具有肽添加部分(延伸部分)的变体。WO 97/07202公开了具有“首次洗涤(first-wash)性能”的脂肪酶变体，该变体能够在一个循环的洗涤中从被猪油弄脏的样品(swatch)中除去大量的猪油。

目前始终存在着对提供具有改善的特性(特别是在包括具有高含量阴离子表面活性剂的洗涤剂在内的商用洗涤剂中具有改善的洗涤特性)的新脂肪酶的需要。本发明涉及这样的新的脂肪酶。

发明概述

本发明人已经发现具有带电氨基酸的特定分布的立扑莱斯(野生型Humicola lanuginosa的脂肪酶)的变体在具有高的阴离子与非离子表面活性剂之比的洗涤剂溶液中具有特别好的首次洗涤性能。

本发明人发现该作用是通过在N-末端连接一个带正电的肽延伸部分并且通过对在对应于第90-101位以及第210位上的氨基酸区域中的电荷分布施加一定的限制来实现的。通过在N-末端连接一个肽延伸部分以及取代90-101区域中的或者三维结构中紧靠着的环境中的氨基酸，本发明人进一步发明了一种由立扑莱斯开发具有所述性能的变体的方法。所述脂肪酶可以进一步提供其它的益处，诸如白度的维持和脏物的清洗。

因此，本发明提供了一种脂肪酶，该脂肪酶为具有如下氨基酸序列的多肽：

a)所述序列与来源于Humicola lanuginosa菌株DSM 4109的野生型脂肪酶之间具有至少90％的同一性；

b)与所说的野生型脂肪酶相比，所述序列包括一个带正电的与N-末端相连的肽延伸部分；

c)所述序列包括一个在所说野生型脂肪酶的E210位置上的带负电的氨基酸。

此外，所述的氨基酸序列可以：

d)包括一个在对应于所说野生型脂肪酶第90-101位的区域中的带负电的氨基酸；

e)包括一个在对应于所说野生型脂肪酶之N94的位置上的中性或带负电的氨基酸和/或在对应于所说野生型脂肪酶第90-101位的区域中具有负的或中性的净电荷。

另一方面，所述的氨基酸序列可以：

d)包括在所说野生型脂肪酶的N94、D96和E99位的至少两个位置上带有负电或没有改变电荷的氨基酸。

本发明还提供了一种包括所述脂肪酶的洗涤剂组合物，编码所述脂肪酶的DNA序列，携带所述DNA序列的表达载体，含有所说DNA序列或所说表达载体的转化的宿主细胞，以及通过培养所述转化的宿主细胞生产所述脂肪酶的方法。

此外，本发明提供了一种生产变体脂肪酶的方法，该方法包括：

a)选择具有某一氨基酸序列的亲代脂解酶，所述的氨基酸序列与来源于Humicola lanuginosa菌株DSM 4109的野生型脂肪酶之间具有至少90％的同一性；

b)修饰编码所述亲代脂肪酶的核酸序列以产生编码某一脂肪酶的核酸，所述的脂肪酶包括在N-末端的肽延伸部分以及在如下位置上的氨基酸的取代：

ⅰ)在对应于所说野生型脂肪酶的第90-101位的区域中，或

ⅱ)在所述第90-101位之任一位置的6埃范围内之三维结构的表面上，

c)在宿主细胞中表达所述修饰的核酸以产生变体脂肪酶，

d)测试洗涤剂溶液中变体脂肪酶的首次洗涤效果，所述洗涤剂溶液包括其量超过总表面活性剂重量的70％的阴离子表面活性剂，

e)可以选择性地重复步骤b-d，以及

f)选择具有改善的首次洗涤效果的变体。

附图的简要描述

图1显示出质粒pEVi 1163的构建。

图2显示出曲霉属载体pCaHj 483的构建。

图3显示出表达质粒pCaHj 521的构建。

发明详述

Humicola lanuginosa的脂肪酶

本发明中采用的参考脂肪酶为来源于Humicola lanuginosa菌株DSM4109的野生型脂肪酶。它在EP 258068和EP 305216中加以描述并且具有US 5,869,438的SEQ ID NO:2第1-269位中所示的氨基酸序列。在本说明书中，该参考脂肪酶又被称作立扑莱斯。

在N-末端的肽延伸部分

与立扑莱斯相比，本发明的脂肪酶包括一个与N-末端相连的带正电的肽延伸部分。肽延伸部分优选由1-15个(特别是4-10个)氨基酸残基组成，并且优选包括1,2或3个带正电的氨基酸，最优选为1,2或3R。

选择性地，通过用电中性的或带正电的氨基酸(例如E1P)取代E1，可以进一步增加N-末端的电荷。

一些优选的肽延伸部分为SPIRR,RP(-E),SPIRPRP(-E),SPPRRP(-E)和SPIRPRP(-E)。

肽延伸部分可以包括通过二硫键与所述多肽中的第二个C(或是存在于立扑莱斯中的C或是通过取代引入的C)相连的C(半胱氨酸)，例如与E239C相连的SPPCGRRP(-E),SPCRPR,SPCRPRP(-E),SPPCGRRPRRP(-E),SPPNGSCGRRP(-E),SPPCRRRP(-E)或SCIRR。这样的变体可能具有改善的稳定性。

此外，可以使用在WO 97/04079和WO 97/07202中描述的任何肽延伸部分。

在第90-101位和E210上的氨基酸

本发明人已经发现对于在阴离子洗涤剂中良好的首次洗涤性能而言，氨基酸E210必须是带负电的。因此，E210可以不改变或者可以进行E210D/C/Y的取代、特别是E210D的取代。

脂肪酶可以包括一个在第90-101位(特别是第94-101位)之任一位置上(例如在D96和/或E99的位置上)的带负电的氨基酸。

此外，脂肪酶可以包括一个在N94位置上的电中性的或带负电的氨基酸，即N94(电中性的或带负电的)，例如N94N/D/E。

而且，脂肪酶可以在90-101(特别是94-101)区域中具有负的或者中性的净电荷，即带负电的氨基酸的数目等于或大于带正电的氨基酸的数目。因此，该区域可以未从立扑莱斯进行改变，其具有两个带负电的氨基酸(D96和E99)和一个带正电的氨基酸(K98)并且在第94位上具有一个电中性的氨基酸(N94)，或者该区域可以通过一个或多个取代加以修饰。

另一方面，三个氨基酸N94,N96和E99中的两个可以具有负的或者未改变的电荷。因此，所有的三个氨基酸都可以是没有改变的或者可以通过保守或带负电的取代而改变，即N94(电中性的或带负电的)、D(带负电的)和E99(带负电的)。例子为N94D/E和D96E。而且，可以取代三个之中的一个以增加电荷，即N94(带正电的)、D96(电中性的或带正电的)或E99(电中性的或带正电的)。例子为N94K/R,D96I/L/N/S/W或E99N/Q/K/R/H。

用带负电的氨基酸取代电中性的氨基酸(N94D/E)可以改善阴离子洗涤剂的性能。用带正电的氨基酸取代电中性的氨基酸(N94K/R)可以在阴离子洗涤剂和阴离子/非离子洗涤剂(例如具有占总表面活性剂的40-70％的阴离子表面活性剂的洗涤剂)两者中提供具有良好性能的变体脂肪酶。

其它位置上的氨基酸

本发明人已经发现用电中性的或带负电的氨基酸取代R209(例如R209P/S)可以改善阴离子洗涤剂的性能，并且取代Q249R/K/H可以改善阴离子和阴离子/非离子洗涤剂两者的性能。

G91可以是未改变的或者可以用另一种电中性的氨基酸取代，例如G91G/A/S/T。K98可以是未改变的，或者它可以被电中性的或带负电的氨基酸取代。N11,D137,E239可以被选择性地取代，例如N11E/G/K/Q/R/T,D137C/E/G/N/V/Y,E239D/G/V。

可以将取代E99N+N101S的组合用于引入一个糖基化位点。

取代的组合

通过把如上所述的肽延伸部分与下列各组取代之一组合，可以获得在阴离子洗涤剂中具有良好性能的脂肪酶变体：

A．G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y

B．G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96D/E/C/Y+E99N+N101S

C．G91G/A/S/T+N94R/K/H+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y

D．G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96(电中性或带正电的)+E99E/D/C/Y

E．G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96D/E/C/Y+E99(电中性或带正电的)

F．A-E之任一与Q249R的组合

G．A-F之任一与R209(电中性或带负电的)的组合

H．A-G之任一与K98(电中性或带负电的)的组合

I．以上组合之任一进一步与前面提到的任一取代的组合。

通过把如上所述的肽延伸部分与下列各组取代之一组合，可以获得在阴离子和阴离子/非离子洗涤剂两者中具有良好性能的脂肪酶变体：

G91A+E99R/K/H+Q249R/K/H

G91A+N94R/K/H+Q249R/K/H

G91A+D96(电中性或带正电的)+Q249R/K/H。

用于氨基酸修饰的命名法

本文用于定义突变的命名法基本上如WO 92/05249所述。因此，E99N表示用N取代第99位上的E。D96I/L/N/S/W表示用I,L,N,S或W取代第96位上的D。G91G/A/S/T表示G91可以未进行改变(G)或者可以被A,S或T所取代。D96X表示用任意其它的氨基酸取代D96。N94(电中性或带负电的)表示用任意的带负电的或带正电的氨基酸取代N94。

SPCRPR表示在N-末端连接了肽延伸部分SPCRPR(即E1)。ElSPPCGRRP或SPPCGRRP(-E)表示E1P的取代以及将肽延伸部分SPPCGRRP连接到取代的N-末端上。

氨基酸的分组

在本说明书中，根据其在pH10下所带的电荷，将氨基酸划分为带负电、带正电或者电中性这几类，这是本发明洗涤剂的特征。因此，带负电的氨基酸为E、D、C和Y，特别是E和D。带正电的氨基酸为R、K和H，特别是R和K。电中性氨基酸为G、A、V、L、I、P、F、W、S、T、M、N、Q。用同一小组(带负电的，带正电的或电中性)中的另一种氨基酸的取代被称作保守取代。

可以把电中性氨基酸划分为疏水的(G、A、V、L、I、P、F、W)和亲水的(S、T、M、N、Q)。

氨基酸的同一性

本发明的脂肪酶变体与立扑莱斯之间具有至少90％(优选大于95％或大于98％)的氨基酸同一性。对本发明而言，N-末端的肽延伸部分在计算氨基酸的同一性时不予考虑。

通过本领域中公知的计算机程序，比如GCG程序包中提供的缺口(gap)程序(威斯康星软件包程序手册，第8版，1994年8月，遗传学计算机小组，575科学道，麦迪逊市，威斯康星州，美国53711)(Needleman,S.B.与Wunsch,C.D.,(1970)《分子生物学杂志》48:443-45)，使用具有用于多肽序列比较的下列设置的缺口程序，可以适当地测定同一性的程度：缺口产生罚分(penalty)为3.0且缺口延伸罚分为0.1。

本发明的脂肪酶变体优选包括肽的添加部分以及0-10个(特别是2-6个)氨基酸的取代。

生产变体脂肪酶的方法

正如以上所指出的那样，本发明提供了一种由亲代脂肪酶生产变体脂肪酶的方法。亲代脂肪酶可以是立扑莱斯或其变体，例如具有诸如下列取代的变体：

E99N+N101S+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，

E99K+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，

E99N+E239C+Q249R SPPCGRRP(-E)，

变体脂肪酶包括一个肽延伸部分和氨基酸的取代。以上描述了N-末端的肽延伸部分(可以选择性地与E1的取代组合)。

将要被取代的氨基酸可以位于对应于第90-101位(优选第94-101位)的区域中。另一方面，将要被取代的氨基酸可以位于第90-101位之任一位置的6埃范围内之脂肪酶三维结构的表面上，例如在第83,85-115,118,147,154,174,176-178,181,202-203,206-208,211-213,255或258位上的氨基酸。

优选的氨基酸为那些位于90-101区域中的氨基酸或者紧邻这些氨基酸的氨基酸，即与所述区域中的氨基酸直接接触的氨基酸。这样的氨基酸为D102,S105,S115,D111,G112,G106,C107,R108,N178,G212,F211,P208,P207,L206,I202。特别感兴趣的氨基酸为R108,D111,S115,N178,F211,G212,G112，尤其是R108和D111。

特别感兴趣的是用带有不同电荷的氨基酸进行取代，例如用E、D、Y或C取代电中性的或带正电的氨基酸；用R、K或H取代电中性或带负电的氨基酸；或者用L、I、V、A、N或Q取代带正电的或带负电的氨基酸。

通过本领域中公知的方法、例如定点诱变或者局部随机诱变，可以进行DNA序列的修饰。

DNA序列

通过在编码亲代脂肪酶的cDNA或基因组DNA序列中引入有关的突变，可以适当地制备出编码脂肪酶变体的DNA序列。根据众所周知的技术、比如那些由Sambrook等人公开的技术，可以引入突变。DNA构建体可以进一步包括为实现修饰的DNA序列的表达所必须的控制序列。控制序列可以是一种合适的启动子序列，即一种由用于表达所述核酸序列的宿主细胞识别的核酸序列。启动子序列含有介导首次洗涤脂解酶表达的转录和翻译控制序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示出转录活性的任意的核酸序列，并且可以从编码与宿主细胞或同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。

控制序列也可以是一种合适的转录终止子序列，即一种由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地连接到编码脂肪酶变体的核酸序列的3’端。终止子序列可以是编码脂肪酶变体的核酸序列的天然序列或者可以从外源来源获得。

控制序列也可以是一种合适的前导序列、一种聚腺苷酸化序列、一种信号肽编码序列或是任意其它的转录或翻译调节序列。此外，DNA构建体可以包括一种编码生产呈活性形式的脂肪酶变体所必须的因子的DNA序列，即所谓的脂肪酶调制子或陪伴分子(参见WO 91/00908,WO 93/13200和EP331376)。

表达载体

本发明的表达载体可以包括用于正确表达编码本发明脂肪酶变体的DNA序列所必须的如上所述的控制序列。表达载体的选择将取决于例如在生产所述脂肪酶中打算采用的宿主细胞。例如在WO 91/00908,WO 93/13200,EP 331376和WO 95/14783中公开了合适的表达载体。

宿主细胞

宿主细胞可以是单细胞微生物或是非单细胞微生物。宿主细胞可以是真核生物并且优选真菌，即酵母细胞或丝状真菌细胞。

真菌宿主细胞优选是丝状真菌细胞，诸如支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、链孢霉属、青霉属、草根霉属、Tolypocladium和木霉属的细胞，特别是曲霉属或镰孢属的细胞，例如米曲霉、黑色曲霉、臭曲霉、日本曲霉、尖孢镰孢或禾谷镰孢的细胞。

真菌细胞可以通过涉及原生质体的形成、原生质体的转化和细胞壁的再生的方法以本身公知的方式进行转化。这样的方法在本领域中是众所周知的。宿主细胞优选在一个或多个蛋白酶或者其它酶处理方式方面是缺陷的。蛋白酶缺陷型宿主细胞是本领域中众所周知的。

宿主细胞优选用包括本发明核酸序列的载体进行转化，接下来将所述载体整合到宿主染色体中。转化起到将载体引入宿主细胞中的作用，从而保持载体为染色体的整合体或者为自我复制的染色体外的载体。整合可以有一个优点，这是因为所述核酸序列可以稳定地保持在细胞中。将载体整合到宿主染色体中可以通过同源或者非同源重组来进行。

脂肪酶的生产

本发明的变体脂肪酶以及本发明的DNA序列、本发明的表达载体、本发明转化的宿主细胞可以通过本领域众所周知的方法来制备，这些方法例如为在WO 97/04079和WO 97/07202或在本说明书实施例中所述的方法。

采用本领域公知的方法，可以在适合于生产脂肪酶变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适的培养基中以及在使得脂肪酶变体表达和/或分离的条件下进行的摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。采用本领域公知的步骤(参见例如针对细菌和酵母的参考文献；Bennett,J.W.与LaSure,L.编辑，《真菌中更多的基因操作》学术出版社，CA,1991)，在包括碳和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。合适的培养基可以从商业供应商那里得到或者可以根据出版的组成来制备(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中记载的)。如果脂肪酶变体被分泌到营养培养基中的话，那么所述变体可以从培养基中直接回收。如果变体不被分泌的话，则从细胞裂解物中回收它。

得到的脂肪酶变体可以通过本领域公知的方法回收。例如，变体可以通过常规的步骤从营养培养基中回收，其中包括但却不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后可以通过多种层析步骤进一步纯化回收的变体，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

本发明的脂肪酶变体可以通过多种本领域公知的步骤纯化，其中包括但却不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排阻)、电泳步骤(例如制备等电聚焦(IEF))、差别溶解度(例如硫酸铵沉淀)或萃取(例如参见《蛋白质纯化》J.-C.Janson与Lars Ryden编辑，VCH出版社，纽约，1989)。

洗涤剂添加剂

根据本发明，所述的脂肪酶通常可以用作洗涤剂组合物中的添加剂。将这种添加剂常规地配制成无粉尘的颗粒、稳定化的液体、浆液或被护的酶。无粉尘的颗粒例如可以如US 4,106,991与4,661,452(两者均属于NovoIndustri A/S)中公开的那样生产，并且可以选择性地通过本领域公知的方法进行涂覆。蜡状表面涂覆材料的例子为具有1000-20000平均分子量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚；其中醇含有12-20个碳原子并且其中有15-80个环氧乙烷单元的乙氧基化的脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯。在GB 1483591中给出了适合于通过流化床技术应用的成膜表面涂覆材料的例子。根据已确立的方法，例如可以通过添加如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸之类的多元醇来稳定液态酶制剂。其它的酶稳定剂是本领域众所周知的。根据EP 238,216中公开的方法可以制备被护的酶。

对于含有本发明脂解酶的洗涤剂添加剂而言，合适的活性范围为每克添加剂有0.01-100毫克纯的酶蛋白。

洗涤剂组合物

本发明的洗涤剂组合物例如可以配制成包括洗衣添加剂组合物在内的手洗和机洗洗涤剂组合物和适用于预处理脏污的织物的组合物、漂洗时添加的织物柔软剂组合物、以及通常用于家庭坚硬表面清洁操作和洗碗操作的组合物。

本发明的洗涤剂组合物包括本发明的脂肪酶和表面活性剂。此外，它可以选择性地包括助洗剂、另一种酶、抑泡剂、柔软剂、染料转移抑制剂以及其它在洗涤剂中常规采用的组分，比如污垢悬浮剂、污垢释放剂、荧光增白剂、研磨剂、杀菌剂、晦暗抑制剂、着色剂、和/或包胶的或者未包胶的香料。

本发明的洗涤剂组合物可以是液体、膏状、凝胶、条状或颗粒的形式。pH(在使用浓度下的水溶液中测量的)通常为中性或碱性，例如在7-11的范围内，特别是9-11。本发明的颗粒组合物也可以呈“压缩的形式”，即它们可以比常规的颗粒洗涤剂具有高出很多的密度，即为550-950 g/l。

在洗涤剂组合物中，本发明的脂肪酶或者任选掺入洗涤剂组合物中的另一种酶通常以占组合物重量的0.00001％-2％的酶蛋白的水平掺入，优选以占组合物重量的0.0001％-1％的酶蛋白的水平掺入、更优选以占组合物重量的0.001％-0.5％的酶蛋白的水平掺入、甚至更优选以占组合物重量的0.01％-0.2％的酶蛋白的水平掺入。

本发明的洗涤剂组合物可以包括对应于每克洗涤剂为10-50,000 LU的量的脂肪酶，优选20-5,000 LU/g，例如100-1000 LU/g。可以将洗涤剂溶解在水中以便产生含有脂解酶的洗液，其中所述脂解酶的量相当于每升洗液为25-15,000 LU，特别是100-5000 LU/1，例如为300-2000 LU/1。脂肪酶蛋白的量可以为0.001-10 mg/g洗涤剂或者为0.001-100 mg/l洗液。

更具体地讲，可以把本发明的脂肪酶掺入在WO 97/04079,WO 97/07202,W0 97/41212,PCT/DK WO 98/08939以及WO 97/43375中所述的洗涤剂组合物中。

表面活性剂体系

表面活性剂体系可以包括非离子、阴离子、阳离子、两性和/或两性离子表面活性剂。如上所述，本发明的脂肪酶变体特别适合于包括阴离子与非离子表面活性剂之组合的洗涤剂，其中阴离子表面活性剂按重量计占70-100％而非离子表面活性剂按重量计占0-30％，特别是占80-100％的阴离子表面活性剂和占0-20％的非离子表面活性剂。正如进一步描述的那样，本发明一些优选的脂肪酶也适用于包括40-70％阴离子表面活性剂和30-60％非离子表面活性剂的洗涤剂。

表面活性剂通常以0.1％-60％(重量)的水平存在，例如1％-40％，特别是10-40％，优选约3％-约20％(重量)。下面描述了表面活性剂的一些例子。

阴离子表面活性剂

优选的阴离子表面活性剂包括烷基硫酸盐、烷基乙氧基硫酸盐、线性烷基苯磺酸盐以及这些物质的混合物。

烷基硫酸盐表面活性剂为通式ROSO₃M的水溶性盐或酸，其中R优选为C₁₀-C₂₄烃基，优选为具有C₁₀-C₂₀烷基成分的烷基或羟烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟烷基，并且M为氢或阳离子，例如碱金属阳离子(例如钠、钾、锂)，或者为铵或取代的铵。

烷基苯磺酸盐是适合的，尤其是其中所述的烷基优选含有10-18个碳原子的线性(直链)烷基苯磺酸盐(LAS)。

合适的阴离子表面活性剂包括烷基烷氧基化的硫酸盐，其为通式RO(A)_mSO₃M的水溶性盐或酸，其中R为未取代的C₁₀-C₂₄烷基或具有C₁₀-C₂₄烷基成分的羟烷基，优选C₁₂-C₂₀烷基或羟烷基，更优选C₁₂-C₁₈烷基或羟烷基；A为乙氧基或丙氧基单元；m大于0，通常介于大约0.5与大约6之间，更优选介于大约0.5与大约3之间；并且M为氢或阳离子，所述阳离子例如可以为金属阳离子(例如钠、钾、锂、钙、镁等)、铵或取代的铵阳离子。在本文中考虑采用烷基乙氧基化的硫酸盐以及烷基丙氧基化的硫酸盐。取代的铵阳离子的具体例子包括甲基铵阳离子、二甲基铵阳离子、三甲基铵阳离子和季铵阳离子(诸如四甲基铵阳离子和二甲基哌啶鎓阳离子)以及来源于烷基胺的那些物质(诸如乙胺、二乙胺、三乙胺)，其混合物等。

其它的阴离子表面活性剂包括肥皂的盐(包括例如钠盐、钾盐、铵盐和取代的铵盐，诸如单乙醇胺、二乙醇胺和三乙醇胺的盐)，C₈-C₂₂伯链烷磺酸盐或仲链烷磺酸盐，C₈-C₂₄烯烃磺酸盐，以及通过碱土金属柠檬酸盐之热解产物的磺化制备的磺化多羧酸。

非离子表面活性剂

所述表面活性剂可以包括烷基酚的聚亚烷基氧化物(polyalkyleneoxide)(例如聚环氧乙烷)的缩合物。所述的烷基可以含有大约6个至大约14个碳原子，所述烷基为直链或支链的。环氧乙烷可以以等于每摩尔烷基酚为大约2至大约25摩尔的量存在。

所述表面活性剂也可以包括伯脂肪醇和仲脂肪醇与大约1至大约25摩尔的环氧乙烷的缩合产物。脂肪醇的烷基链可以是直链的或是支链的，并且通常含有大约8个至大约22个碳原子。

此外，非离子表面活性剂可以包括烷基酚的聚环氧乙烷的缩合物、伯脂肪醇和仲脂肪醇与大约1至大约25摩尔的环氧乙烷的缩合产物、烷基多糖及其混合物。最优选的是具有3-15个乙氧基的C₈-C₁₄烷基酚乙氧基化物和具有2-10个乙氧基的C₈-C₁₈醇的乙氧基化物(优选平均为C₁₀)及其混合物。

优选的非离子表面活性剂为醇乙氧基化物、醇酚乙氧基化物、多羟基脂肪酸酰胺、烷基多聚葡糖苷以及这些物质的混合物。

助洗剂体系

本发明的组合物可以进一步包括一种助洗剂体系。任何常规的助洗剂体系都适用于本文，其中包括硅铝酸盐材料、硅酸盐、聚羧酸酯和脂肪酸、诸如乙二胺四乙酸(EDTA)这样的材料、诸如氨基多膦酸盐(aminopolyphosphonate)这样的金属离子螯合剂。在本文中也可以使用磷酸盐助洗剂。

合适的助洗剂可以是无机离子交换材料，通常为无机水合的硅铝酸盐材料，更具体地为水合的合成沸石，比如水合沸石A、X、B、HS或MAP。

洗涤助洗剂盐通常以占组合物重量的5％-80％的量包含在组合物中。对液态洗涤剂而言，助洗剂的优选水平为5％-30％。

其它酶

除了本发明的脂肪酶之外，洗涤剂组合物还可以包括其它提供清洁效果和/或织物护理益处的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)。

合适的蛋白酶包括那些动物、植物或微生物来源的酶。微生物来源是优选的。也包括经化学或基因修饰的变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶类蛋白酶。碱性蛋白酶的例子为枯草蛋白酶，尤其是那些来源于芽孢杆菌属的枯草蛋白酶，例如枯草蛋白酶Novo、枯草蛋白酶Carlsberg、枯草蛋白酶309、枯草蛋白酶147和枯草蛋白酶168(在WO 89/06279中进行了描述)及其变体。

漂白剂：

洗涤剂组合物(尤其是在粒状洗涤剂的情况下)也可以包括漂白剂，例如氧漂白剂或卤素漂白剂。氧漂白剂可以是如过硼酸盐(例如PB1或PB4)或过碳酸盐之类的过氧化氢释放剂，或者例如可以是过羧酸。颗粒大小可以为400-800微米。当存在时，氧漂白化合物通常以大约1％至大约25％的水平存在。

可以将过氧化氢释放剂与漂白活化剂结合使用，所述活化剂如四-乙酰基乙二胺(TAED)、壬酰氧基苯磺酸盐(NOBS)、3,5-三甲基-hexsanol氧基苯磺酸盐(ISONOBS)或五乙酰基葡萄糖(PAG)。

卤素漂白剂例如可以为次卤酸盐(hypohalite)漂白剂，例如三氯异氰脲酸、二氯异氰脲酸的钠盐和钾盐以及N-氯代和N-溴代链烷基磺酰胺。常常以占最终产品重量的0.5-10％的量加入这类材料，优选为1-5％(重量)。

洗涤剂类型

阴离子型洗涤剂A

通过混合下列成分(％重量)来制备A型粒状洗涤剂(阴离子占总表面活性剂的90％，溶液中的pH为10.2)：

8.7％的阴离子表面活性剂：LAS(C₁₀-C₁₃)

7.4％的阴离子表面活性剂：AS(C₁₂)

1.8％的非离子表面活性剂：脂肪醇乙氧基化物(C₁₂-C₁₅,7EO)

30％的沸石P(Wessalite P)

18％的碳酸钠

5％的柠檬酸钠

17％的硫酸钠

0.3％的羧甲基纤维素

6.5％的过碳酸钠一水合物

2.1％的NOBS

阴离子型洗涤剂B

通过混合下列成分(％重量)来制备第二种型式的粒状洗涤剂(阴离子占总表面活性剂的79％，溶液中的pH为10.2)：

27％的阴离子表面活性剂：AS(C₁₂)

7％的非离子表面活性剂(C₁₂-C₁₅,7EO)

60％的沸石P(Wessalite P)

5％的碳酸钠

0.6％的Sokalan CP5

1.5％的羧甲基纤维素

阴离子/非离子型洗涤剂

通过把下列成分添加到溶于纯水中的3.2mM Ca2+/Mg2+(5:1)中，制备一种型式的洗涤剂溶液(阴离子占总表面活性剂的32％,pH 10.2)：

0.300g/l的烷基硫酸盐(AS；C14-16)；

0.650g/l的醇乙氧基化物(AEO；C12-14,6EO)；

1.750g/l的沸石P

0.145g/l的Na₂CO₃

0.020g/l的Sokalan CP5

0.050g/l的CMC(羧甲基纤维素)

材料与方法

方法

脂肪酶的活性(LU)

通过采用阿拉伯树胶作乳化剂乳化甘油三丁酸酯来制备脂肪酶的底物。使用pH静态法在pH值为7时测定脂肪酶的活性。将1个单位的脂肪酶活性(LU)定义为每分钟释放出1微摩尔脂肪酸所需的量。

定点诱变

为了构建立扑莱斯酶的变体，可以根据制造商的说明使用商业试剂盒、Chameleon双链定点诱变试剂盒。

编码所述立扑莱斯酶的基因位于pAHL上。根据制造商的说明，通过使用引物7258(SEQ ID NO:1)将pAHL的氨苄青霉素基因的ScaI位点改变成MluI位点，从而改变了在氨苄青霉素抗性基因中发现的并用于切入到MluI位点的ScaI位点。

然后，将包括所述立扑莱斯基因的pAHL载体用作DNA聚合酶以及寡核苷酸7258和7770(SEQ ID NO:2)的模板，从而改变了在立扑莱斯基因中发现的ScaI位点并且没有改变所述氨基酸序列的位点。

通过添加包括所需突变的合适的寡核苷酸，将所需的突变(例如引入半胱氨酸残基)引入到所述的立扑莱斯基因中。

实施例

实施例1：脂肪酶变体的构建

将如上所述的定点诱变用于构建携带有编码立扑莱斯变体1S、E239C、Q249R的基因的质粒。使用了下列引物。

将引物106659(SEQ ID NO:3)用于引入E99N,N101S。

将引物101782(SEQ ID NO:4)用于引入SPPCGRRP(-E)。

将引物9639(SEQ ID NO:5)用于引入E239C。

将引物8829(SEQ ID NO:6)用于引入Q249R。

通过测定整个基因的序列验证了突变。将得到的质粒命名为pEVi1163，并且在图1中显示出限制图。

曲霉属载体pCaHj483的构建

由下列片段构建出图2中所示的曲霉属载体pCaHj483：

a)用EcoRI和XbaI切割的载体pToC65(WO 91/17243)。

b)来自携带amdS基因的构巢曲霉的2.7 kb XbaI片段(C.M.Corrick等人《基因》53(1987),63-71)。把amdS基因用作真菌转化中的选择标记。已经修饰了amdS基因，以便破坏掉在该基因中正常存在的BamHI位点。通过使用SEQ ID NO:7中所示的引物引入沉默点突变，已经实现了这一过程。

c)携带黑色曲霉NA2启动子的0.6 kb EcoRI/BamHI片段，所述启动子融合到编码构巢曲霉tpi基因的mRNA 5’非翻译端的序列的60 bp DNA片段上。通过PCR，从融合到60 bp tpi序列上的质粒pNA2(EP-B-O383779)中分离出NA2启动子。编码60 bp tpi序列的引物具有SEQID NO:8中所示的序列。

d)携带黑色曲霉葡糖淀粉酶转录终止子的675 bp的XbaI片段。该片段是从质粒pICAMG/Term中分离出来的(EP 238023，申请号为EP 87103806.3的申请)。

将片段c的BamHI位点通过pIC19R接头与位于片段d上转录终止子之前的XbaI位点相连(BamHI至XbaI)。

表达质粒pCaHj521的构建

用BamHI和SalI消化脂肪酶变体质粒pEVi 1163，并且分离出所得的编码脂肪酶变体的片段。

用BamHI和XhoI消化pCaHj483，并将大的载体片段(6757)连接到脂肪酶片段上。将连接混合物用于转化大肠杆菌DH 5a细胞，并且分离出携带有预期质粒的转化体。将该质粒命名为pCaHj 521。

pCaHj 521转化到JaL228中

米曲霉JaL 228(PCT/DK 97/00037)为缺失了碱性蛋白酶和中性金属蛋白酶I的米曲霉IFO 4177。采用如在专利EP 0531372B1中所述的在乙酰胺上的选择，用pCaHj 521转化该菌株。转化体经孢子再分离两次。测试来自各转化体第二次再分离的孢子用于小规模发酵(摇瓶和微量滴定皿)中的脂肪酶的生产。

实施例2：阴离子洗涤剂中的首次洗涤性能

在阴离子洗涤剂中测试本发明的多种变体。实验条件如下：

设备：恒温涤垢仪(Terg-O-tometer)

方法： 1个循环的洗涤，接下来为系列干燥

洗液： 1000ml/烧杯

样品： 7个(棉织品类型#400)样品(9^*9cm)/烧杯

污物：用苏丹红染色的猪油(0.75mg苏丹红/g猪油)

将加热到70℃的50ml猪油/苏丹红涂到每个样品的中心。在

涂了污物后，在烘箱中于75℃下将样品加热25分钟。在洗

涤前在室温下储存过夜。

水： 1.07mM Ca²⁺/Mg²⁺(5:1)～6°dH

洗涤剂： 1.4g/l市售的Tide w.Bleach

脂肪酶浓度：0.1000 LU/l

洗涤时间： 12分钟

温度： 25℃

漂洗：在流动的自来水中漂洗15分钟

干燥：在室温下(～20℃,30-40％RH)过夜

评价：在Machbeth Coloreye 7000反射计中在460 nm下测量反射

度。以△R的形式给出结果，△R(△反射度)=在含有脂肪酶的

洗涤剂中洗涤的样品的反射度-在不含脂肪酶的洗涤剂中洗涤

的样品的反射度。

突变	N-末端	△R
突变	N-末端	△R	N94K	SPPRRP(-E)	3
N94K+Q249R	SPPRRP(-E)	4	N94K	SPPRRP(-E)	3
N94K+Q249R	SPPRRP(-E)	4	G91A+D96N+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	3
G91A+D96E+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	3	G91A+D96N+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	3
G91A+D96E+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	3	G91A+D96W+Q249R	SPIRPRP(-E)	3
G91A+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	4	G91A+D96W+Q249R	SPIRPRP(-E)	3
G91A+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	4	E239C	SPPCGRRP(-E)	3
S83T+N94K+D96L+E239C+Q249R	SPCRPRP(-E)	3	E239C	SPPCGRRP(-E)	3
S83T+N94K+D96L+E239C+Q249R	SPCRPRP(-E)	3	E99N+N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	4
E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	2	E99N+N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	4
E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	2	G91A+Q249R	SPIRPRP(-E)	4
G91A+E99K	SPIRPRP(-E)	4	G91A+Q249R	SPIRPRP(-E)	4
G91A+E99K	SPIRPRP(-E)	4	E99N+N101S+E239C	SPPCGRRP(-E)	4
G91A+E99N+N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3	E99N+N101S+E239C	SPPCGRRP(-E)	4
G91A+E99N+N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3	S83T+E99N+N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	5
E99N+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3	S83T+E99N+N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	5
E99N+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3	N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	2
D96S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E),	3	N101S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	2
D96S+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E),	3	N94S+D96L+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3
E99K+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3	N94S+D96L+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3
E99K+E239C+Q249R	SPPCGRRP(-E)	3	Q249R	SPIRPRP(-E)	3
K98D+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	3	Q249R	SPIRPRP(-E)	3
K98D+E99K+Q249R	SPIRPRP(-E)	3	E99K+D137E+Q249R	SPIRPRP(-E)	4^*)
E99K,R209P,Q249R	SPIRPRP(-E)	2	E99K+D137E+Q249R	SPIRPRP(-E)	4^*)
E99K,R209P,Q249R	SPIRPRP(-E)	2	E99K,R209S,Q249R	SPIRPRP(-E)	3^***)

E99K,D137E,E183D,E239C,Q249R	SPPCGRRP(-E)	2
E99K,D137E,E183D,E239C,Q249R	SPPCGRRP(-E)	2	E99K,R209P,E239C,Q249R	SPPCGRRP(-E)	6
N94D,E99N,E239C,Q249R	SPPCGRRP(-E)	5	E99K,R209P,E239C,Q249R	SPPCGRRP(-E)	6
N94D,E99N,E239C,Q249R	SPPCGRRP(-E)	5	S83T+Q249R	SPIRR	5
S83T+E87K+Q249R	SPIRR	3^)*)	S83T+Q249R	SPIRR	5
S83T+E87K+Q249R	SPIRR	3^)*)	D57G+W89F+190V+G91S+Q249R	SPIRPRP(-E)	4
E1A+N11H+L121+D137G+V187A+K237R+T244S+Q249R	SPIRR	2	D57G+W89F+190V+G91S+Q249R	SPIRPRP(-E)	4
E1A+N11H+L121+D137G+V187A+K237R+T244S+Q249R	SPIRR	2	N8K+F10L+N11C+Q15H+R232G+E239C	SPPCGRRP(-E)	3
T231K+R232G+N233H+E239C	SPPCGRRP(-E)	3	N8K+F10L+N11C+Q15H+R232G+E239C	SPPCGRRP(-E)	3

^*特殊的洗涤条件：1250 LU/l

^**特殊的洗涤条件：30℃，20分钟的洗涤

^***特殊的洗涤条件：500LU/l

为了进行比较，在相同的条件下测试下列根据WO 97/07202的脂肪酶变体：

现有技术：用E1SPIRPRP+D57G+N94K+D96L+L97M+Q249R修饰的立扑莱斯

结果显示出在1000 LU/l的现有技术脂肪酶变体中△R=1.3。因此，结果清楚地表明脂肪酶变体在主要含阴离子表面活性剂(占总表面活性剂的80％以上)的洗涤剂中具有改善的首次洗涤效果。

实施例3：首次洗涤效果的比较试验

如下所述，将本发明的脂肪酶变体与WO 97/07202中现有技术的脂肪酶变体进行比较：

本发明：用E1SPPCGRRP+E99N+N101S+E239C+Q249R修饰的立扑莱斯

现有技术：用E1SPPRRP+D57G+N94K+D96L+Q249R修饰的立扑莱斯。

使用1250或12,500 LU/l，以与实施例2相同的方式在市售的美国洗涤剂(Tide)中测试所述的两种变体。结果如下

	1250 LU/l	12,500 LU/l
	1250 LU/l	12,500 LU/l	本发明	4.9	11.1
现有技术	2.1	8.3	本发明	4.9	11.1

结果表明在各种情况下，本发明的变体都比现有技术的变体具有更好的在阴离子洗涤剂中的首次洗涤效果。

实施例4：各种洗涤剂中的首次洗涤性能

所述的脂肪酶变体为在实施例1中制备的具有E1SPPCGRRP+E99N+N101S+E239C+Q249R修饰的立扑莱斯。在与实施例2相同的条件下测试下列的两种洗涤剂：

阴离子洗涤剂

水： 1.07 mM Ca²⁺/Mg²⁺(5:1)～6°dH

洗涤剂： 1.4 g/l市售的Tide w.Bleach

立扑莱斯的浓度：0,800,1600,3200,6400,12800 LU/l

洗涤时间： 12分钟

温度： 30℃

阴离子/非离子洗涤剂

水： 3.2 mM Ca²⁺/Mg²⁺(5:1)～18°dH

洗涤剂： 3.6 g/l市售的Ariel Futur.

立扑莱斯的浓度：0,800,1600,3200,6400,12800 LU/l

洗涤时间： 20分钟

温度： 30℃

变体的剂量	阴离子洗涤剂	阴离子/非离子洗涤剂
变体的剂量	阴离子洗涤剂	阴离子/非离子洗涤剂	800 LU/l	4	6
1600 LU/l	7	7	800 LU/l	4	6
1600 LU/l	7	7	3200 LU/l	7	8
6400 LU/l	10	10	3200 LU/l	7	8
6400 LU/l	10	10	12800 LU/l	11	11

以上的结果表明所述的脂肪酶变体在含有80％以上的阴离子表面活性剂的洗涤剂与含有大约等量的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的洗涤剂两者中都具有良好的首次洗涤性能。

实施例5：洗涤剂溶液中的稳定性

为了评价所述脂肪酶变体在洗涤剂溶液中的稳定性，测定在培养后的剩余活度。测试了具有高含量(＞80％)的阴离子表面活性剂的两种洗涤剂：一种市售的美国洗涤剂(1.4g/l的Tide w.Bleach HDP)和一种日本洗涤剂(0.5 g/l的Super Compact Top)。还测试了含有几乎等量的阴离子表面活性剂与非离子表面活性剂的洗涤剂：一种市售的欧洲洗涤剂(5g/l的Ariel Futur HDP)。

将各种洗涤剂的溶液加热到85℃5分钟，以灭活所述的酶。将洗涤剂溶液冷却到室温并调节pH至pH10.0。在5ml的体积中添加纯化的脂肪酶至浓度约为10LU/ml，并将该溶液分成两个部分：

a)一部分用于立即测定活度(参照)，以及

b)一部分用于在30℃下培养30分钟(样品)。

从溶液a)和b)中取出100μl的样品(在迅速冷却的过程中)用于通过上述LU方法重复测定活度。

将培养后的剩余活性计算为样品中的活性

表面活性剂洗涤剂剩余活度

主要为阴离子美国 65％

主要为阴离子日本＞90％

阴离子+非离子欧洲 91％

b)相当于样品a)中的活度。结果如下：

在40℃下采用欧洲洗涤剂溶液的类似实验显示出在20分钟后有61％的剩余活度。

结果表明所述的脂肪酶变体在主要含阴离子表面活性剂的洗涤剂溶液与含有几乎等量的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂的洗涤剂溶液两者中都是相当稳定的。

序列表<110>Novo Nordisk A/S<120>脂肪酶变体<130>5469-WO<140><141><160>8<170>PatentIn 2.0版<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物7258<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>p<400>1ngaatgactt ggttgacgcg tcaccagtca c 31<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物7770<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>p<400>2ntctagccca gaatactgga tcaaate 27<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物106659<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>p<400>3ncttaacttt gacttgaaaa acatatctga catttgctcc 40<210>4<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物101782<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>p<400>4nggacggcct tggctagccc tccgtgcggc cgccggccgg tctcgcagga tctgtttaac 60<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物9639<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>p<400>5natatcgtga agatatgcgg cattgatgcc acc 33<210>6<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：P 8829<220><221>修饰的碱基<222>(1)<223>p<400>6nggcggcaat aaccggccga acattccgga tatccc 36<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>7agaaatcggg tatcctttca g 21<210>8<211>105<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>8gctcctcatg gtggatcccc agttgtgtat atagaggatt gaggaaggaa gagaagtgtg 60gatagaggta aattgagttg gaaactccaa gcatggcatc cttgc 105

Claims

1、一种脂肪酶，所述的脂肪酶为具有如下氨基酸序列的多肽：

c)所述序列包括一个在所说野生型脂肪酶的E210位置上的带负电的氨基酸；以及

d)所述序列包括一个在对应于所说野生型脂肪酶第90-101位的区域中的带负电的氨基酸；以及

e)所述序列包括一个在对应于所说野生型脂肪酶之N94的位置上的电中性的或带负电的氨基酸和/或在对应于所说野生型脂肪酶第90-101位的区域中具有负的或中性的净电荷。

2、一种脂肪酶，所述的脂肪酶为具有如下氨基酸序列的多肽：

d)所述序列包括在所说野生型脂肪酶第N94、D96和E99位的至少两个位置上的带有负电或者没有改变的电荷的氨基酸。

3、权利要求1或2的脂肪酶，其中所述的肽延伸部分由1-15个氨基酸残基(优选4-10个)组成，并且优选包括1,2或3个带正电的氨基酸，优选为1,2或3R。

4、权利要求3的脂肪酶，其中所述的延伸部分为SPIRR,RP(-E),SPIRPRP(-E),SPPRRP(-E)或SPIRPRP(-E)。

5、权利要求1-3之任一的脂肪酶，其中所述的延伸部分包括与所述多肽中的第二个C相连的C，优选与E239C相连的SPPCGRRP(-E),SPCRPR,SPCRPRP(-E),SPPCGRRPRRP(-E),SPPNGSCGRRP(-E),SPPCRRRP(-E)或SCIRR。

6、前述权利要求中任一的脂肪酶，所述的酶包括取代G91A,N94D/E/K/R,D96E/I/L/N/S/W,E99N/Q/K/R/H,N101S,R209P/S或Q249R/K/H。

7、前述权利要求中任一的脂肪酶，所述的脂肪酶包括下列各组取代之一，所述取代可以选择性地与Q249R/K/H和/或K98X组合：

a)G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y，

b)G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96D/E/C/Y+E99N+N101S，

c)G91G/A/S/T+N94R/K/H+D96D/E/C/Y+E99E/D/C/Y，

d)G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96(电中性或带正电的)+E99E/D/C/Y，或

e)G91G/A/S/T+N94(电中性或带负电的)+D96D/E/C/Y+E99(电中性或带正电的)。

8、权利要求1-6之任一的脂肪酶，所述的脂肪酶包括下列各组取代之一，所述取代可以选择性地与Q249R和/或R209(电中性或带负电的)组合：

a)E99R/K/H+Q249R/K/H，

b)N94R/K/H+Q249R/K/H，或

c)D96(电中性或带正电的)+Q249R/K/H。

9、一种脂肪酶，所述的脂肪酶为具有下列修饰的来源于Humicolalanuginosa菌株DSM 4109的亲代脂肪酶的变体：

a)E99N+N101S+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，

b)E99K+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)，或

c)E99N+E239C+Q249R+SPPCGRRP(-E)。

10、一种洗涤剂组合物，所述的洗涤剂组合物包括表面活性剂和权利要求1-9之任一的脂肪酶。

11、前述权利要求的洗涤剂组合物，其中所述的表面活性剂包括占总表面活性剂重量的70％以上的量的阴离子表面活性剂。

12、权利要求10的洗涤剂组合物，其中所述的表面活性剂包括占总表面活性剂重量的40-70％的量的阴离子表面活性剂和占总表面活性剂重量的30-60％的量的非离子表面活性剂，所述的脂肪酶为权利要求8或9的脂肪酶。

13、权利要求10-12之任一的洗涤剂组合物，所述的洗涤剂组合物包括10-40％(重量)的表面活性剂，优选包括40-70％的助洗剂，并且当以0.5-5g/l溶解于水中时优选具有9-11的pH值。

14、编码权利要求1-9之任一的脂肪酶的DNA序列。

15、携带前述权利要求的DNA序列的表达载体。

16、含有权利要求14的DNA序列或权利要求15的表达载体的转化的宿主细胞。

17、一种生产脂肪酶的方法，该方法包括在有助于生产所述脂肪酶的条件下培养权利要求16的转化的宿主细胞，以及从得到的肉汤中回收所述的脂肪酶。

18、一种生产变体脂肪酶的方法，该方法包括：

b)修饰编码所述亲代脂肪酶的核酸序列以产生编码变体脂肪酶的核酸，所述的变体脂肪酶包括在N-末端的肽延伸部分以及在如下位置上的氨基酸的取代：

ⅰ)在对应于所说野生型脂肪酶第90-101位的区域中，或

c)在宿主细胞中表达所述修饰的核酸以产生所述的变体脂肪酶，

d)测试洗涤剂溶液中所述变体脂肪酶的首次洗涤效果，所述洗涤剂溶液包括其量超过总表面活性剂重量的70％的阴离子表面活性剂，

e)可以选择性地重复步骤b-d，以及

f)选择具有改善的首次洗涤效果的变体。