CN1286987C - 一维生物芯片及其在基因、蛋白表达分析中的应用 - Google Patents
一维生物芯片及其在基因、蛋白表达分析中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1286987C CN1286987C CN 200410046790 CN200410046790A CN1286987C CN 1286987 C CN1286987 C CN 1286987C CN 200410046790 CN200410046790 CN 200410046790 CN 200410046790 A CN200410046790 A CN 200410046790A CN 1286987 C CN1286987 C CN 1286987C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- microchannel
- micro
- microparticles
- chip
- dimensional
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及微全分析系统的串行分析技术。一维生物芯片是在微流控芯片微分离通道上设置多个小室，不同的小室放置表面修饰了不同生物分子的微颗粒；在进行基因或蛋白分析时，当样品流经设置了多个小室的微通道，微颗粒特异性地识别和捕获多种目标分子，然后引入带荧光标记的试剂，微颗粒表面最终特异性地结合上荧光标记物，再用荧光成像检测。本发明设计的一维生物芯片不仅具微流控技术与阵列分析的优点，而且提高了检测灵敏度和目标分子特异性识别能力，为实现单细胞水平上的基因、蛋白表达分析，为肿瘤研究和药物筛选提供一个强有力的研究手段。
Description
技术领域：
本发明涉及微全分析系统领域，具体涉及一种基于微流控的基因或蛋白串性分析技术。
背景技术
微全分析系统(μ-TAS，又称芯片实验室，Lab-on-chip)现已成为当今生命科学研究领域发展最快的重要前沿之一。具备微型化、集成化、多功能以及高通量等特性的微全分析系统使得系统研究一个生物体系的基因表达及蛋白表达成为可能，并将革命性地改变生物医学检验与疾病诊断。目前国内外芯片技术大致朝着两个方向发展：一类是微流控芯片，主要以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，是当前微全分析系统发展的重点；一类是基于二维点阵式的、高通量大规模并行分析方法的微阵列芯片，主要以生物技术为基础，以亲和结合技术为核心，以在芯片表面固定一系列高密度的、有序并且可寻址的识别分子阵列为结构特征，是高通量地获取相关生物信息的一种新型技术手段。从目前的文献报道看，这两种芯片技术拥有各自的技术优势和研究领域，虽然发展迅速，却没有实现交叉和融合，一些相关技术的发展仍待跟进。如今，生命科学的发展已经深入到单细胞、亚细胞、单分子这样的层次，实现单细胞水平上的基因、蛋白表达分析已成为生命科学研究的一个重大挑战。这一重大科学目标的实现亟需适合其需求的相关平台技术的突破和发展。因此，发展芯片技术、构建新型芯片技术平台，提高检测灵敏度和目标分子特异性识别能力，实现单细胞水平上的基因、蛋白表达分析，是当前研究者们不懈努力的一个方向。
发明内容
本发明旨在提出和构建一种新型生物芯片，将微流控芯片与基于高通量并行分析方法的阵列芯片原理结合起来，成为基于微流控串行分析技术的一种新型芯片平台技术，以提高检测灵敏度和目标分子特异性识别能力，实现单细胞水平上的基因、蛋白表达谱分析。
本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。一维生物芯片，包括聚二甲基硅氧烷片基和玻片片基，在阳模板上用聚二甲基硅氧烷浇注的一维生物芯片PDMS片基中的微通道的两端分别与储液池相通，微通道上设置了若干个互相连通的小室，小室内放置表面可以修饰各种相同或不相同生物分子的微颗粒。小室内放置的可以修饰各种生物分子的微颗粒可以是硅颗粒，也可以是聚苯乙烯类有机物聚合的颗粒。一维生物芯片用于基因、蛋白表达的分析方法包括微颗粒中的硅颗粒用碱活化或氨基化、羧基化处理，微颗粒在修饰前用生物素与亲和素或亲和素与戊二醛或单一的戊二醛或溴化氰进行预处理，然后加入各种已知的生物分子，以及将修饰了不同生物分子的微颗粒逐个移入微通道的小室后，用洁净的玻片粘合封装。
(1)、蛋白的表达分析为：按待分析蛋白要求，选取已知的一维蛋白芯片，取微量的待分析的目标分子置于芯片一侧储液池中，以平均20mm/min的压力驱动或300v/cm的电驱动方式，使样品流经微通道进入小室，经30～10分钟后，用二次水冲洗储液池和微通道中的多余样品溶液，然后以同样条件的压力驱动或电驱动方式将待分析目标分子的一抗兔抗单或多克隆抗体与荧光标记的二抗山羊抗兔IgG，以1∶100比例的抗体稀释液稀释后依次由储液池进入微通道与小室中的微颗粒作用，20分钟后用二次水洗净储液池和微通道，反应后的芯片用荧光成像检测；
(2)、基因的表达分析为：按待分析基因要求，选取已知的一维基因芯片，取微量待分析的靶DNA的TM杂交缓冲液置于芯片的一侧储值池中，以平均20mm/min的压力驱动方式使样品溶液流经微通道进入小室，20分钟后用二次水冲洗储液池和微通道，洗去多余样品溶液，以同样条件的压力驱动方式将荧光标记的报告探针的Mg2+浓度为200mM的10mM TM杂交缓冲液流经微通道，与小室中的靶DNA杂交，20分钟后用二次水洗净储液池和微通道，反应后的芯片用荧光成像检测。
下面结合附图进一步详述本发明。
附图说明
图1为一维生物芯片的结构示意图；
图2为CNE2细胞中p53蛋白的表达结果；
图3为不同细胞中p53蛋白的表达结果；
图4为一维生物芯片检测p53蛋白的校正曲线；
图5为一维生物芯片用于基因表达谱的研究。
首先制作一维生物芯片的掩膜和阳模板，然后在阳模板上采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注的方式制作成一维生物芯片的PDMS片基。一维生物芯片PDMS片基上的微管道网络设计区别于传统的微流控芯片，在于微分离通道上设置了多个小室，不同的小室放置表面修饰了不同生物分子的微颗粒，修饰的生物分子可以是不同的抗体，也可以是不同的分子探针(如分子信标，三明治探针等)，分别构成一维蛋白质芯片和一维基因芯片。采用显微操纵方式将修饰了生物分子的微颗粒放置到微通道的小室里，首先，用一套进口的拉针、烧针和磨针系统制作微吸管，然后将微吸管装在固定在倒置显微镜上的显微操纵系统上，在显微条件下，将微颗粒逐个移入微通道的小室，每个小室对应某种已知的、特定的修饰微颗粒，不同的芯片可以进行不同的编码，识别和捕获样品溶液中的多种目标分子。
芯片最后的封装是将放置了修饰颗粒的PDMS片基与玻片片基进行粘合。将待分析目标分子和试剂溶液进入芯片微通道可采用压力驱动或电驱动两种方式，当样品流经设置了多个小室的微通道时，微颗粒可以特异性地识别和捕获多种目标分子，在一维生物芯片中，这些目标分子是无须进行电泳分离的，因此也无须考虑电泳分离条件的一系列优化问题。反应后的芯片用荧光成像系统进行检测。
如图1所示的一维生物芯片的结构，1、6是直径为1～2mm的圆形储液池，一端作样品池，另一端作废液池，微通道2由多个小室3构成，小室宽为80μm，微通道深均为60μm，卡口4宽20μm。小室中放置的微颗粒5为微米级硅颗粒或有机聚合物颗粒(如聚苯乙烯颗粒)，直径约40μm，颗粒表面用实验室方法修饰上特定的生物分子，如抗体，分子探针等。
微颗粒修饰生物分子的方法如下：
微颗粒表面修饰分子信标探针(Molecular beacon，简称MB)或三明治探针(Sandwichprobe)：
二氧化硅颗粒：取直径40μm二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入500μl0.01M NaOH活化20min，用二次水清洗3次；活化后的颗粒，加入80μl 0.1～1.0mg/mlbiotin-BSA，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12～48h，然后用二次水清洗3次，这样颗粒上结合了biotin分子；加入80μl 0.1～1.0mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，用二次水清洗3次，streptavidin(或avidin)因与颗粒上的biotin分子作用而结合到了颗粒表面；加入50μl 0.1～1.0M的连接了biotin的MB或三明治探针，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，MB或三明治探针通过biotin与streptavidin(或avidin)的作用修饰到颗粒表面；用TM缓冲液清洗3次，之后悬浮于TM中备用(4℃)。
氨基化二氧化硅颗粒：取直径40μm氨基化二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入80μl 0.1～1.0mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡4～24h，用二次水清洗3次；加入100μl 4％戊二醛，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，用二次水清洗3次，这样通过戊二醛交联的方法将streptavidin(或avidin)结合到了颗粒表面；加入50μl 0.1～1.0M的连接了biotin的MB或三明治探针，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，MB或三明治探针通过biotin与streptavidin(或avidin)的作用修饰到颗粒表面；用TM缓冲液清洗3次，之后悬浮于TM中备用(4℃)。
有机聚合物颗粒：取直径40μm聚苯乙烯颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入80μl0.1～1.0mg/ml biotin-BSA，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12～48h，然后用二次水清洗3次，这样颗粒上结合了biotin分子；加入80μl 0.1～1.0mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，用二次水清洗3次，streptavidin(或avidin)因与颗粒上的biotin分子作用而结合到了颗粒表面；加入50μl 0.1～1.0μM的连接了biotin的MB或三明治探针，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，MB或三明治探针通过biotin与streptavidin(或avidin)的作用修饰到颗粒表面；用TM缓冲液清洗3次，之后悬浮于TM中备用(4℃)。
微颗粒表面修饰单克隆抗体：
二氧化硅颗粒：取直径40μm二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入200μl 2MNa2CO3溶液，活化15～30min，再加入100μl 1g/ml CNBr乙腈溶液，继续反应30min。将反应后的颗粒用冰水充分洗涤3次，10mM PBS缓冲液充分洗涤3次。往Ep管中加入100μl4～100μg/ml鼠抗单克隆抗体，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡24～48h，这样通过CNBr交联的方法将鼠抗单克隆抗体修饰到了颗粒表面。将反应后的颗粒用10mM PBS缓冲液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS缓冲液，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡6～24h，将颗粒表面的多余活性位点进行封闭。取出，于4℃保存备用。
氨基化二氧化硅颗粒：取直径40μm氨基化二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入100μl 4％戊二醛，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡1～4h，用二次水清洗3次；加入100μl 4～100μg/ml鼠抗单克隆抗体，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡6～24h，这样通过戊二醛交联的方法将鼠抗单克隆抗体修饰到了颗粒表面。将反应后的颗粒用10mM PBS缓冲液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS缓冲液，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡6～24h，将颗粒表面的多余活性位点进行封闭。取出，于4℃保存备用。
有机聚合物颗粒：取直径40μm聚苯乙烯颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入100μl4～100μg/ml鼠抗单克隆抗体，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12～48h，这样鼠抗单克隆抗体就修饰到了颗粒表面。用10mM PBS缓冲液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS缓冲液，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡6～24h，将颗粒表面的多余活性位点进行封闭。取出，于4℃保存备用。
本发明将微流控芯片与基于高通量并行分析方法的阵列芯片原理结合起来，发展成基于微流控串行分析技术的一种新型芯片平台技术，这种芯片设计的特点，兼具有微流控技术与阵列分析的优点，如试样用量极微，自动化程度高，不易污染，高通量等。化学与生物修饰过程中运用了生物纳米技术和分子探针技术，目的是拓展芯片中的化学、生物信号放大技术和信号传感技术，大大提高检测灵敏度和目标分子特异性识别能力，为在“芯片实验室”上实现单细胞水平上的基因、蛋白表达谱分析，为肿瘤研究和药物筛选提供一个强有力的研究手段。
具体实施方式
实施例1(一维生物芯片的构造及其在细胞蛋白表达谱的研究应用)
有机聚合物颗粒表面修饰单克隆抗体：取直径40μm聚苯乙烯颗粒约10mg置于0.5mlEp管中，加入100μl 20μg/ml鼠抗单克隆抗体，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡24h。用10mM PBS缓冲液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS缓冲液，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12h。取出，于4℃保存备用。
在已经制作好的阳模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注一维生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分钟左右，待固化后取出，将PDMS片基从阳模板上剥离下来。将PDMS片基置于Leica倒置显微镜下，在显微条件下，采用显微操纵方式将上述表面修饰一系列相关表达蛋白的鼠抗单克隆抗体的直径为40μm聚苯乙稀颗粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，每个小室对应已知的、特定的修饰微颗粒，用以识别和捕获样品溶液中的多种目标分子。将放置了鼠抗单克隆抗体修饰颗粒的PDMS片基与非常洁净的玻片片基进行粘合完成芯片的封装。
取3μl从肿瘤细胞中抽提出来的蛋白质样品溶液，置于样品池中，在压力驱动下以平均20mm/min的流速从芯片的微通道中流过，与微颗粒发生作用，20分钟后用二次水冲洗样品池和微通道，洗去多余的样品溶液。然后同样以压力驱动方式分别将目标分子的兔抗多克隆抗体(一抗，Santa Cruz产品，浓缩液按1∶100用抗体稀释液稀释，一次消耗仅需3μl)、Cy3标记的山羊抗兔IgG(二抗，Sigma试剂，浓缩液按1∶100用抗体稀释液稀释，一次消耗仅需3μl)依次引入微通道中与微颗粒发生作用，试剂每次在微通道中停留20分钟，然后用二次水洗去。最终在微颗粒表面特异性地结合上Cy3荧光标记物。通过荧光成像检测，可以获得肿瘤细胞中一系列相关蛋白的表达谱信息。
实施例2(一维生物芯片检测肿瘤细胞CNE2中p53蛋白的表达)：
氨基化二氧化硅颗粒表面修饰单克隆抗体：取直径40μm氨基化二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入100μl 4％戊二醛，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡2h，用二次水清洗3次；加入100μl 20μg/ml鼠抗P53单克隆抗体，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12h。将反应后的颗粒用10mM PBS缓冲液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS缓冲液，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12h。取出，于4℃保存备用。
在已经制作好的阳模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注一维生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分钟左右，待固化后取出，将PDMS片基从阳模板上剥离下来。将PDMS片基置于Leica倒置显微镜下，在显微条件下，采用显微操纵方式将直径为40μm左右表面修饰鼠抗P53的氨基化二氧化硅颗粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，再将放置了鼠抗p53修饰颗粒的PDMS片基与非常洁净的玻片片基进行粘合完成芯片的封装。
在显微条件下，用微吸管移取50个CNE2细胞到样品池中，加入0.1％SDS溶液将细胞溶膜裂解。样品以电驱动方式引入微通道中，与微颗粒发生作用，电压控制在约300v/cm，进样时间10分钟。然后用二次水冲洗储液池和微通道，洗去多余的样品溶液。样品池换上3μl兔抗p53多克隆抗体(一抗，Santa Cruz产品，浓缩液按1∶100用抗体稀释液稀释)，在300v/cm电压控制下一抗进入微通道中与微颗粒发生作用，10分钟后用二次水冲洗干净储液池和微通道。最后样品池换上3μl FITC标记的羊抗兔IgG(二抗，Santa Cruz产品，浓缩液按1∶100用抗体稀释液稀释)，在300v/cm电压控制下二抗进入微通道中与微颗粒发生作用，10分钟后用二次水冲洗干净储液池和微通道。这样在微颗粒表面最终特异性地结合上FITC荧光标记物。另用一块芯片做对照实验，除了不加样品外，其余步骤同上一致。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜增强型CCD(ICCD)成像系统下，对微颗粒成像，可获得高灵敏的荧光图像，如图2所示。结果表明，加样后用一维生物芯片灵敏地检测出了CNE2细胞的p53蛋白，芯片中的鼠抗p53修饰颗粒因特异性地识别CNE2细胞的p53蛋白而发出荧光，检测的细胞个数为50个，而未加样的一维生物芯片检测结果呈阴性，此结果与传统的western blotting的实验结果一致。
实施例3(一维生物芯片检测几种细胞中p53蛋白的表达)
二氧化硅颗粒表面修饰单克隆抗体：取直径40μm二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入200μl 2M Na2CO3溶液，活化15～30min，再加入100μl 1g/ml CNBr乙腈溶液，继续反应30min。将反应后的颗粒用冰水充分洗涤3次，10mM PBS缓冲液充分洗涤3次。往Ep管中加入100μl 20μg/ml鼠抗P53单克隆抗体，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡24h。将反应后的颗粒用10mM PBS缓冲液清洗3次，加入含0.1％～3％BSA的10mM PBS缓冲液，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡12h。取出，于4℃保存备用。
在已经制作好的阳模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注一维生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分钟左右，待固化后取出，将PDMS片基从阳模板上剥离下来。将PDMS片基置于Leica倒置显微镜下，在显微条件下，采用显微操纵方式将直径为40μm左右表面修饰鼠抗p53单克隆抗体的二氧硅颗粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，再将放置了鼠抗p53修饰颗粒的PDMS片基与非常洁净的玻片片基进行粘合完成芯片的封装。
对4种培养的细胞CNE2、A549、敲除了p53基因的CHO(以CHO-p53表示)以及正常成纤维细胞(Fibroblast)分别进行蛋白质的抽提，分别取3μl从4种细胞中抽提出来的蛋白质样品溶液，各置于4块芯片的样品池中，在压力驱动下以平均20mm/min的流速从芯片的微通道中流过，与微颗粒发生作用，20分钟后用二次水冲洗样品池和微通道，洗去多余的样品溶液。然后同样以压力驱动方式分别将兔抗p53多克隆抗体(一抗，SantaCruz产品，浓缩液按1∶100用抗体稀释液稀释，一次消耗3μl)、Cy3标记的山羊抗兔IgG(二抗，Sigma试剂，浓缩液按1∶100用抗体稀释液稀释，一次消耗3μl)依次引入微通道中与微颗粒发生作用，试剂每次在微通道中停留20分钟，然后用二次水洗去。最终在微颗粒表面特异性地结合上Cy3荧光标记物。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜CCD成像系统下，对微颗粒成像，并用荧光图像分析软件进行分析，可获得如图3所示的不同细胞中p53蛋白的表达情况。从图3可以看出，敲除了p53基因的CHO细胞，p53蛋白的表达呈阴性，结果与理论相符，而正常成纤维细胞(Fibroblast)和肿瘤细胞CNE2、A549均有p53蛋白的表达。这些结果与传统的western blotting的实验结果一致。
配制一系列不同浓度的p53蛋白的标准溶液(浓度单位是nM)：0.1；0.5；1.0；5.0；10；50；100。按同上的方法将不同浓度的p53蛋白的标准溶液用压力驱动的方式分别引入芯片中进行检测，可获得如图4所示的一维生物芯片检测p53蛋白的校正曲线。图4表明，实施例3在0.1～10nM的p53蛋白的检测范围内具有很大的响应斜率，灵敏度高。以3倍信噪比作为信号检出限，检测下限达到了0.05nM。
实施例4(一维生物芯片应用于基因表达谱研究)
二氧化硅颗粒表面修饰三明治探针(Sandwich probe)：取直径40μm二氧化硅颗粒约10mg置于0.5ml Ep管中，加入500μl 0.01M NaOH活化20min，用二次水清洗3次；活化后的颗粒，加入80μl 1mg/ml biotin-BSA，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡24h，然后用二次水清洗3次；加入80μl 1mg/ml streptavidin(或avidin)，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡2h，用二次水清洗3次；加入50μl 1μM的连接了biotin的三明治探针，置于低温摇床(4℃，＞300rpm)摇荡2h，用TM缓冲液清洗3次，之后悬浮于TM中备用(4℃)。
在已经制作好的阳模板上用聚二甲基硅氧烷(PDMS)浇注一维生物芯片的PDMS片基，置于75℃烘箱40分钟左右，待固化后取出，将PDMS片基从阳模板上剥离下来。将PDMS片基置于Leica倒置显微镜下，在显微条件下，采用显微操纵方式将直径为40μm左右的二氧化硅颗粒放置到PDMS片基的微通道的小室里，二氧化硅颗粒为三种不同修饰颗粒，表面修饰三明治DNA捕获探针分别是：p53(5’-ACACGCACCTCAAAGCAAT-Biotin-3’)、p21(5’-CCATCAATGACCAC-biotin-3’)和nm23(5’-ATGAAGGTACGCTC-biotin-3’)。将放置了修饰颗粒的PDMS片基与非常洁净的玻片片基进行粘合完成芯片的封装。
取3μl样品溶液置于样品池中，样品溶液是含0.1nM p53(5’-GCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGG-3’)、p21(5’-GTGGTCATTGATGGGGAG ACGTGCCTGT-3’)和nm23(5’-GAGCGTACCTTCATTGCGATCAAACCAG-3’)靶DNA的TM杂交缓冲液(10mM)，杂交缓冲液中Mg2+浓度为200mM。在压力驱动下样品溶液以平均20mm/min的流速从芯片的微通道中流过，与微颗粒上的DNA捕获探针进行杂交，20分钟后用二次水冲洗样品池和微通道，洗去多余的样品溶液。样品池换上3μl四甲基罗丹明(TAMRA)标记的0.1nM p53、p21和nm23荧光报告探针：p53(5’-(TAMRA)-AACCAGGACAGGCACAA-3’)、p21(5’-TAMRA-ACAGGCACGTCTCC-3’)和nm23(5’-TAMRA-CTGGTTTGATCGCA-3’)(10mM的TM杂交缓冲液，Mg2+浓度为200mM)，在压力驱动下进入微通道中与微颗粒上结合的靶DNA进行杂交，20分钟后用二次水冲洗干净储液池和微通道。这样在微颗粒表面最终特异性地结合上TAMRA荧光标记物。另用一块芯片做对照实验，除了不加样品外，其余步骤同上一致。将反应后的芯片置于荧光倒置显微镜ICCD成像系统下，对微颗粒成像，并用荧光图像分析软件进行分析，可获得如图5所示的三种基因的表达结果。结果表明，用一维生物芯片灵敏地检测出了三种目标DNA，芯片中三种修饰颗粒上的DNA捕获探针和荧光报告探针因特异性地识别p53、p21和nm23靶DNA使修饰颗粒发出荧光，与各自的浓度对应，荧光强度基本一致。在本实施例中获得的检测下限达到了0.01nM。
Claims (4)
1、一种一维生物芯片，包括聚二甲基硅氧烷片基和玻片片基，其特征在于阳模板上用聚二甲基硅氧烷浇注的一维生物芯片聚二甲基硅氧烷片基中的微通道(2)的两端分别与储液池(1)、(6)相通，微通道(2)上设置了若干个互相连通的小室(3)，小室(3)内放置表面可以修饰各种相同或不相同生物分子的微颗粒(5)。
2、按权利要求1所述的一种一维生物芯片，其特征在于小室(3)内放置的可以修饰各种生物分子的微颗粒(5)是硅颗粒，或聚苯乙烯类有机聚合物颗粒。
3、一种如权利要求1所述的一维生物芯片在蛋白表达分析中的应用，即一维生物芯片用于蛋白表达的分析方法，包括微颗粒中的硅颗粒用碱活化或氨基化、羧基化处理，微颗粒在修饰前用生物素与亲和素或亲和素与戊二醛或单一的戊二醛或溴化氰进行预处理，然后加入各种已知的生物分子，以及将修饰了不同生物分子的微颗粒逐个移入微通道的小室后，用洁净的玻片粘合封装，其特征在于：蛋白的表达分析为：按待分析蛋白要求，选取微颗粒表面修饰单克隆抗体的一维蛋白芯片，取微量的待分析的目标分子置于芯片一侧储液池(1)或(6)中，以平均20mm/min的压力驱动或300v/cm的电驱动方式，使样品流经微通道(2)进入小室(3)，经10～30分钟后，用二次水冲洗储液池和微通道中的多余样品溶液，然后以同样条件的压力驱动或电驱动方式将待分析目标分子的一抗兔抗多克隆抗体与荧光标记的二抗山羊抗兔IgG，以1∶100比例的抗体稀释液稀释后依次由储液池进入微通道与小室中的微颗粒作用，20分钟后用二次水洗净储液池和微通道，反应后的芯片用荧光成像检测。
4、一种如权利要求1所述的一维生物芯片在基因表达分析中的应用，即一维生物芯片用于基因表达的分析方法，包括微颗粒中的硅颗粒用碱活化或氨基化、羧基化处理，微颗粒在修饰前用生物素与亲和素或亲和素与戊二醛或单一的戊二醛或溴化氰进行预处理，然后加入各种已知的生物分子，以及将修饰了不同生物分子的微颗粒逐个移入微通道的小室后，用洁净的玻片粘合封装，其特征在于：基因的表达分析为：按待分析基因要求，选取微颗粒表面修饰分子信标探针或三明治探针的一维基因芯片，取微量待分析的靶DNA的TM杂交缓冲液置于芯片的一侧储液池(1)或(6)中，以平均20mm/min的压力驱动方式使样品溶液流经微通道(2)，进入小室(3)，20分钟后用二次水冲洗储液池和微通道，洗去多余样品溶液，以同样条件的压力驱动方式将荧光标记的报告探针的Mg2+浓度为200mM的10mM TM杂交缓冲液流经微通道，与小室中的靶DNA杂交，20分钟后用二次水洗净储液池和微通道，将反应后的芯片用荧光成像检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410046790 CN1286987C (zh) | 2004-09-23 | 2004-09-23 | 一维生物芯片及其在基因、蛋白表达分析中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200410046790 CN1286987C (zh) | 2004-09-23 | 2004-09-23 | 一维生物芯片及其在基因、蛋白表达分析中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1635146A CN1635146A (zh) | 2005-07-06 |
| CN1286987C true CN1286987C (zh) | 2006-11-29 |
Family
ID=34846007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200410046790 Expired - Fee Related CN1286987C (zh) | 2004-09-23 | 2004-09-23 | 一维生物芯片及其在基因、蛋白表达分析中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1286987C (zh) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101004423B (zh) * | 2006-01-19 | 2011-12-28 | 博奥生物有限公司 | 流体样品分析用卡盒系统 |
| US8492098B2 (en) | 2006-02-21 | 2013-07-23 | The Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of reaction components that affect a reaction |
| US11237171B2 (en) | 2006-02-21 | 2022-02-01 | Trustees Of Tufts College | Methods and arrays for target analyte detection and determination of target analyte concentration in solution |
| EP2201374B1 (en) | 2007-08-30 | 2015-10-07 | Trustees Of Tufts College | Methods for determining the concentration of an analyte in solution. |
| CN101245311B (zh) * | 2008-02-26 | 2012-07-04 | 武汉大学 | 一种三维高通量药物筛选芯片及其制备方法 |
| CN101709261B (zh) * | 2009-12-11 | 2013-06-19 | 香港城市大学深圳研究院 | 一种微流控微珠阵列芯片及其在病毒分析中的应用 |
| US9678068B2 (en) | 2010-03-01 | 2017-06-13 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules using dual detection methods |
| CN103026232B (zh) * | 2010-03-01 | 2015-02-04 | 匡特里克斯公司 | 扩大用于检测分子或颗粒的测定法中的动态范围的方法和系统 |
| US8236574B2 (en) | 2010-03-01 | 2012-08-07 | Quanterix Corporation | Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects |
| US8415171B2 (en) | 2010-03-01 | 2013-04-09 | Quanterix Corporation | Methods and systems for extending dynamic range in assays for the detection of molecules or particles |
| CN101936992B (zh) * | 2010-09-17 | 2013-02-27 | 湖南大学 | 快速检测大肠杆菌的方法及所用到的微流控芯片及其制备工艺 |
| US9952237B2 (en) | 2011-01-28 | 2018-04-24 | Quanterix Corporation | Systems, devices, and methods for ultra-sensitive detection of molecules or particles |
| WO2012142301A2 (en) | 2011-04-12 | 2012-10-18 | Quanterix Corporation | Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury |
| WO2014113502A1 (en) | 2013-01-15 | 2014-07-24 | Quanterix Corporation | Detection of dna or rna using single molecule arrays and other techniques |
| CN103087899B (zh) * | 2013-01-17 | 2014-08-20 | 湖南大学 | 一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片及其制备和癌细胞的分离方法 |
| CN103614283B (zh) * | 2013-11-21 | 2014-12-10 | 西安交通大学 | 一种用于细胞三维富集的微流控芯片 |
| CN103642672B (zh) * | 2013-11-21 | 2014-11-05 | 西安交通大学 | 一种用于细胞高效分离的生物芯片 |
| CN103642671B (zh) * | 2013-11-21 | 2014-11-05 | 西安交通大学 | 一种用于细胞富集与提取的微流体生物芯片 |
| CN106215985B (zh) * | 2016-07-26 | 2018-08-21 | 西安交通大学 | 一种用于流体快速混合及检测的微流控芯片 |
| CN107607475B (zh) | 2017-09-06 | 2020-05-26 | 京东方科技集团股份有限公司 | 微全分析系统及方法 |
| CN110333207A (zh) * | 2019-06-25 | 2019-10-15 | 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 | CREB在Ang-2调节VEGFR2表达中分析方法 |
| CN115078316A (zh) * | 2021-03-12 | 2022-09-20 | 中国科学院化学研究所 | 一种基于一维纳米光子平台的生物检测及光学成像方法 |
-
2004
- 2004-09-23 CN CN 200410046790 patent/CN1286987C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1635146A (zh) | 2005-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1286987C (zh) | 一维生物芯片及其在基因、蛋白表达分析中的应用 | |
| Yang et al. | Microfluidics for biomedical analysis | |
| Verpoorte | Focusbeads and chips: New recipes for analysis | |
| Choi et al. | Microfluidic-based biosensors toward point-of-care detection of nucleic acids and proteins | |
| Patabadige et al. | Micro total analysis systems: fundamental advances and applications | |
| US8124015B2 (en) | Multiplexed, microfluidic molecular assay device and assay method | |
| Diercks et al. | A microfluidic device for multiplexed protein detection in nano-liter volumes | |
| RU2527686C2 (ru) | Устройство для анализов и способ выполнения биологических анализов | |
| US8586348B2 (en) | Lateral flow microfluidic assaying device and related method | |
| CN102713640B (zh) | 鞘流装置和方法 | |
| US9201069B2 (en) | Microfluidic devices and methods including porous polymer monoliths | |
| JP2003514221A (ja) | 生体材料とのハイブリダイゼーションのためのバイオチャネルアッセイ | |
| CN101587123A (zh) | 带有一维自组装磁珠链电极的诊断霍乱专用微流控芯片 | |
| CN100575929C (zh) | 利用一维微流控生物芯片检测细胞中基因突变的方法 | |
| US20100047766A1 (en) | Analyte manipulation and detection | |
| WO2015077441A2 (en) | Antibody and aptamer ensemble for cell isolation and enrichment | |
| Zeng et al. | Quantitative microfluidic biomolecular analysis for systems biology and medicine | |
| Srinivas et al. | Oil-isolated hydrogel microstructures for sensitive bioassays on-chip | |
| Ebrahimi et al. | Molecular separation by using active and passive microfluidic chip designs: a comprehensive review | |
| US20180257069A1 (en) | Dynamic microfluidic devices and use thereof | |
| CN203474775U (zh) | 用于分选的微流控芯片及微流控芯片装置 | |
| Abdulla et al. | Application of microfluidics in single-cell manipulation, omics and drug development | |
| Tarhan et al. | Specific transport of target molecules by motor proteins in microfluidic channels | |
| CN216149778U (zh) | 一种微流控芯片 | |
| US20160341694A1 (en) | Method and apparatus to concentrate and detect an analyte in a sample |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20061129 Termination date: 20100923 |