CN1285879A - 可特异性酶切断裂的多核苷酸底物和测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种试剂,该试剂包含携带淬灭的荧光部分(32,33)的可特异性酶切断裂的多核苷酸(30,31)底物,以及制备该试剂的方法。多核苷酸(30,31)包括的至少一个荧光部分(32)与另一荧光部分(33)充分靠近,从而基本上淬灭了荧光部分(32、33)的荧光,其中在通过断裂多核苷酸分开荧光部分后,荧光部分(32,33)很容易用荧光测定技术来检测。本发明还提供了一种生物学试验方法,其中将该试剂与可能含有待测试酶(36)的测试样品合并,其中酶(36)将断裂多核苷酸释放出荧光部分(32,33),并导致荧光强度增加。该试验方法可用于检测和鉴定微生物,灭菌保障、药物发现、酶试验、免疫试验和其它生物学试验。

Description

可特异性酶切断裂的多核苷酸底物和测试方法

                     技术领域

本发明涉及一种含有携带淬灭荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸底物的试剂，制备该试剂的方法以及采用该试剂的试验方法。

                     发明背景

核酸酶(DNA酶和RNA酶)是水解切割断裂多核苷酸(即核酸如DNA和RNA)的酶。这些酶存在于每个活细胞中，执行着核酸代谢、复制、重组、修复和修饰许多必要功能。核酸酶可以根据其底物特异性来区分：一些核酸酶切割DNA和RNA，其它的仅作用于一种核苷酸；一些是序列特异性的，其它的则不是；一些作用于单链核酸，其它的需要双链DNA才能起作用。它们可能在其它方面也具有选择性，例如它们所切割的键的位置；它们在细胞中的位置，即在细胞内还是细胞外；离子和pH的需求；以及对热处理的耐受能力。核酸酶在Linn,S.M.,Lloyd,R.S.,Roberts,R.J.,Nuclease(第2版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NY,1994中有进一步的说明。

抗生素抗性细菌菌株和食物引起的疾病是公众非常关注的。在保健、美容、食物和饮料工业中，微生物污染危险的控制是一个严重的健康和安全问题。细菌测试是控制微生物污染危险综合措施的一部分。通常通过细菌产生的酶来测试该细菌的存在。微生物产生核酸酶水解并断裂核酸的能力在很久以前就已认识到。该酶尤其可用来检测非增殖性细菌细胞，因为该酶每秒能催化多达数百万的底物分子发生断裂反应，从而能够检测少量的细菌细胞。细菌产生的某些核酸酶可广泛用来鉴定和特性分析某些种类的病原性。

测定核酸酶活性的已知方法包括UV吸收和电泳或层析分离经消化的DNA片段，然后进行荧光染色。已经发展了采用天然DNA、合成的底物以及DNA-结合性分子的其它方法：

(ⅰ)比色的DNA-结合性分子。在天然DNA与合适生长培养基的混合物中可加入甲苯胺蓝(TB)或甲基绿(MG)。这些染料与DNA形成了呈蓝色(TB)或绿色(MG)的复合物。DNA酶水解该复合物释放出染料，从而产生一个颜色不同(红色(TB)或无色(MG))的区域。

(ⅱ)荧光DNA-结合性分子。在天然DNA与生长培养基的混合物中可加入吖啶橙(AO)或其它合适的染料，例如Hoescht染料33258或从MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR获得的商标名为TOTO^TM或YOYO^TM的二聚花菁核酸。这些化合物在水溶液中有微弱的荧光，但是在与DNA结合后变成强荧光。DNA酶水解DNA导致荧光被完全除去，看上去细菌菌落周围是无荧光的光晕。

(ⅲ)产色素的合成性底物。该方法中采用两类合成底物来检测核酸酶活性。第一类是胸苷5′-单磷酸对硝基苯酯铵盐。在经芽孢杆菌类的纯化的胞外核酸酶水解后，它释放出对硝基苯酚，这表现为410nm的吸光度增加。第二类是5-溴-4-氯-吲哚基-胸苷-3′-磷酸，它在水解时释放出吲哚酚基团，该基团经自氧化作用产生蓝-绿靛蓝颜色。

(ⅳ)荧光原性(fluorogenic)合成性底物。它有两类。第一类是采用聚(脱氧(亚乙烯基)腺苷酸)(聚(脱氧腺苷酸)的衍生物)的荧光测定方法。该多核苷酸在完整时有微弱的荧光。然而，在DNA酶水解时，由于释放出有荧光的亚乙烯基单核苷酸，因此可以观察到荧光增强(激发波长Ex为320纳米(nm)，发射波长Em为410纳米)。该信号可以连续监测，并能与产生的单核苷酸数量相关联。已知另一种荧光测定方法是利用荧光“反淬灭(dequenching)”技术。可用荧光素5-异硫氰酸酯(Ex=490nm，Em=520nm)标记14-聚多核苷酸。在与未标记的互补链杂交后，由于DNA与荧光团之间的相互作用，50％的荧光被淬灭。用限制性内切核酸酶切断杂交的物质(即链分裂)使荧光强度因“反淬灭”而增加2倍。

DNA-结合分子通常并非是序列特异性的，其信号可能会受样品中存在的内源DNA的影响。在一些情况下，它们可能还会受表面活性剂、EDTA或细胞碎片存在的影响。产色素的合成底物通常需要较大的量(毫摩尔的量)，这可能会增加试验成本，在一些情况下会导致不溶解。同样，以吸收为基础的方法的灵敏度本身也比荧光为基础的方法低几个数量级。至于荧光原性底物，可获得的核酸酶试剂很少。另外，已经报道的方法要么性能一般，要么受限于特异性的酶，如外切核酸酶。

目前可行的最灵敏的检测技术之一是荧光检测方法。用荧光微量试验已经研究了则托摩尔(zeptomolar，10^-21M)量的酶分子。已经用荧光显微术检测到油分散液滴中的单个酶分子。用电泳方法在毛细管中操纵单个酶分子并用荧光分光术监测。见Xue，Q.,Yeung,E.S.,“单个酶分子的化学反应性的差别”，Nature，1995，373，681-683。已经发展了用β-半乳糖苷酶作为标记酶来检测大肠杆菌的试验。发现该荧光测定的灵敏度比比色方法提高250倍，检测时间减少5小时。见Van Poucke,S.O.,Neils,H.J.,“开发一种灵敏的化学发光测定试验来检测透化的大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶并与荧光测定以及比色测定进行比较”，Appl.Env.Microbiol.,1995，61，4505-4509。

               发明公开

简言之，本发明提供一种试剂，该试剂包含至少一个可特异性酶切断裂的多核苷酸底物，该底物携带的至少一个荧光部分(moiety)与至少一个其它毗邻的荧光部分紧密靠近，此毗邻的荧光部分相互淬灭荧光，在底物断裂时，该荧光部分很容易用荧光测定技术来检测。

该试剂可包含一种可特异性酶切断裂的多核苷酸底物：该底物包括一条自身互补的单链多核苷酸，它的3′和5′端各自携带了一个荧光部分；该底物也可包含两条互补杂交的多核苷酸链，每条链有3′和5′端，其中一个或两个3′/5′配对的每一端携带了一个荧光部分；或该底物包含单链多核苷酸，该单链多核苷酸沿其长度至少有两个悬垂的毗邻的荧光部分。

本发明还提供了一种生物试验方法，该方法包括下列步骤：合并(1)一种试剂和(2)一种测试样品，其中该试剂包含至少一种可特异性酶切断裂的多核苷酸底物，该底物携带的至少一个荧光部分与至少一个其它毗邻的荧光部分紧密靠近，所述毗邻的荧光部分相互淬灭荧光，但是在分开时很容易用荧光测定技术来检测；该测试样品可能含有受测试的特异性酶，其中受测试特异性酶的存在将导致多核苷酸断裂、荧光部分分开以及荧光强度升高。

本方法的另一个实施方案包括测定荧光强度升高的额外步骤。

荧光很容易通过常规技术，如辐射能照射、荧光显微镜、96孔板读数仪或流式细胞计数仪来进行观察。

本发明还提供了制备携带淬灭性荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸试剂的方法。该方法包括制备一种试剂，该试剂包含携带荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸，该荧光部分通过染料二聚化而相互淬灭，在分开时可用荧光测定技术来检测，所述方法包括下列步骤：

使一种或多种携带一个或多个荧光部分以及一个或多个反应性基团的荧光化合物与可特异性酶切断裂的多核苷酸合并，该多核苷酸选自以下：(1)自身互补的单链多核苷酸，它具有与一个或多个荧光化合物起反应性的一个或多个末端基团，(2)单链多核苷酸，在该多核苷酸中非末端的其它位置上有两个或多个部分具有与一个或多个荧光化合物反应的悬垂基团；和(3)互补的多核苷酸，每条链在一个或两个3′/5′配对的3′和/或5′端分别具有至少一个与一个或多个荧光化合物反应的反应性末端基团，这种合并在产生所述试剂的反应条件下发生。

在本文的描述中：

“染料二聚化”指两个染料基团之间形成非共价结合的复合物；

“染料堆积(stack)”指两个或多个染料基团之间形成非共价结合的复合物，两个复合的染料基团称为“二聚体”，三个复合的染料基团称为“三聚体”；

“可特异性酶切断裂的多核苷酸”指核苷酸的线状序列，该核苷酸包含易受特异性酶断裂的特异性键；

“荧光”指物质在吸收不同波长的光时发出的给定波长的光，其中光发射仅仅在光吸收期间发生；

“荧光量子产额”指发光物质发射的荧光光子数目与该物质吸收的总光子数之比。

“荧光原性(fluorogenic)底物”指基本上没有荧光的材料，其受酶作用时会产生一种有荧光的化合物；

“荧光团”、“染料部分”、或“染料基团”指，由于吸收当受不同波长(通常较短)的光受激发后，能发射给定波长的光的分子或该分子的一部分。

本发明为检测和鉴定微生物提供了比常规试验方法更好的优点。本发明提供了一种迅速和简便的方法，该方法采用具有荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸底物(在本文也称为荧光原性核酸酶底物)来测定胞外和胞内酶的活性和/或检测它的存在。该方法还可修改成依赖于序列或不依赖于序列的测试。本发明的方法和试剂提高了准确性，加快了检测，降低了检测和鉴定微生物的总体成本。在各实施方案中，本发明利用可测定的荧光差别来检测核酸酶。在较佳的实施方案中，本发明提供了荧光原性指示剂，该指示剂断裂时显示出的信号水平较高，与之相比淬灭时的信号水平则要低得多。这最好在可见光波长范围内进行，以最大程度地减小生长培养基背景荧光的干扰。

通过将发射波长从远紫外区(约350至400纳米)向红光移动(red-shift)至电磁光谱的500-600纳米区域，从而减少完整试剂背景信号水平的作用，本发明能更准确地、灵敏地测定在其它因素中核酸酶的存在。本发明的另一个优点是它是均相生物学试验方法，不需要显影剂。因此，不需要象诸如酶联免疫吸附试验(ELISA)和生物发光等试验方式那样进行耗时的分离步骤。用基础分离培养基就能检测并鉴定微生物。

可以看出，本发明的试验方法其特征在于更有效地利用了试剂、劳力、时间和装置。通过合理地设计和选择多核苷酸以及与其连接的荧光团，本发明还可能同时测定几种细菌和/或酶。本发明描述的试验方法可用来检测和鉴定微生物、灭菌保障、药物发现、临床试验、核酸杂交、测序和扩增。

                  附图简述

图1示意性地描述了荧光原性核酸酶底物被细菌产生的酶断裂的概念化机理，其中荧光原性核酸酶底物是自身互补的单链多核苷酸，该多核苷酸表现出分子内二聚化作用并淬灭了连接在多核苷酸3′和5′端的荧光部分，在多核苷酸断裂时，该荧光部分分开并容易被检测。

图2示意性地描述了荧光原性核酸酶底物被细菌产生的酶断裂的概念化机理，其中荧光原性核酸酶底物是具有悬垂荧光部分的单链多核苷酸，悬垂的荧光部分紧密靠近地足以通过染料堆积而相互淬灭，在多核苷酸断裂时，这些荧光部分分开并容易被检测。

图3示意性地描述了荧光原性核酸酶底物被细菌产生的酶断裂的概念化机理，其中荧光原性核酸酶底物包含两条互补的杂交的多核苷酸链，这两条链表现出发生分子间二聚化作用并淬灭分别标记在两个互补多核苷酸之3′端和5′端的两个荧光部分，这些荧光部分在多核苷酸断裂时分开并容易被检测。

图4是四甲基罗丹明-标记的25聚双链多核苷酸在与100毫摩尔pH 8.9的碳酸氢盐缓冲液配的微球菌核酸酶37℃培育前(线条b)后(线条a)相对的荧光强度。

图5是四甲基罗丹明-标记的24聚自身互补的单链寡核苷酸在与100毫摩尔pH8.9的碳酸氢盐缓冲液配的微球菌核酸酶37℃培育前(线条c)后(线条d)的吸收光谱图线。

                  详细描述

在本发明中，描述了一种提供包含核酸酶底物的试剂的新方法。该底物在接触受测试核酸酶时其淬灭的荧光部分得以分开，从而使可检测的荧光增加。

制备该核酸酶底物首先是指定一个待用的多核苷酸。这可通过选择多核苷酸内含的碱基或碱基对(A/T或G/C)来实现。可使诸荧光部分紧密靠近的任何构型均可采用。可用杂交来获得合适的构型。当多核苷酸互补碱基对相互吸引时，产生杂交。可能的构型例如包括3′和5′端连接了荧光染料部分的自身互补的单链多核苷酸，它会自身杂交(即折叠起来)，从而使多核苷酸各端连接的荧光部分紧密靠近。另一种构型包括两条相互互补的单链多核苷酸，它们各自具有3′和5′端，其中一个或两个3′/5′配对的末端各携带了一个荧光部分，当两条多核苷酸杂交形成双链多核苷酸时，各单链多核苷酸的一端或两端所连接的荧光部分相互紧密靠近。另一种方法涉及一条单链多核苷酸，其中在该多核苷酸链上悬垂了两个或多个荧光染料部分，这些染料部分以合适长度沿链间隔开但非常靠近，从而使得这些荧光部分有可能靠得很紧而淬灭荧光。

对于杂交的构型而言，杂交程度只需是以使连接的染料部分紧密靠近即可。通常，靠近到距离连接有荧光部分的3′/5′端大约5个碱基对发生杂交就足够了。该数目在很大程度上取决于以下因素，例如多核苷酸中的碱基对类型以及荧光部分的二聚化常数。

还可指定多核苷酸含有一个或多个能被测试的核酸酶切割断裂的键。策略上应使这些键位于多核苷酸中，这样断裂将会使荧光部分分开。对于形成双链多核苷酸的自身互补单链多核苷酸或两条相互互补的多核苷酸，可断裂的键通常应位于连接荧光部分的多核苷酸一端或两端附近。对于具有悬垂部分的单链多核苷酸，可断裂的键通常应位于染料部分之间。

另外，可在多核苷酸中荧光部分理想的具体位置上插入针对所选荧光部分的结合位点。这些位点可以在多核苷酸的末端(在多核苷酸发生杂交的情况下)，或在多核苷酸链上(即骨架上)(在悬垂的染料连接单链多核苷酸的情况下)。这些结合位点含有反应性基团，如脂肪族伯胺，它很容易与包含待连接到多核苷酸的荧光部分的荧光化合物反应。

一旦确定了多核苷酸，就可以用例如已知的人工或自动化DNA合成方法来合成该多核苷酸。然后使该多核苷酸与包含荧光部分的一种或多种化合物反应。荧光化合物通常还含有反应基团，能包含与多核苷酸上的反应性基团反应。该反应在合适的浓度、搅拌状况、pH、离子和温度条件下进行，从而使荧光部分连接到多核苷酸的所选部位上。具体需要的条件将分别根据多核苷酸中的反应性基团以及使用的荧光化合物而不同。用缓冲液(如碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液)控制pH。本发明所用的荧光部分具有二聚化或堆积而淬灭荧光的能力。

本发明还提供了一种生物学试验方法，该方法包括下列步骤：合并(1)一种试剂和(2)一种测试样品，该试剂包含至少一种可特异性酶切断裂的多核苷酸底物，该底物携带的至少一个荧光部分与至少另一个毗邻的荧光部分紧密靠近，所述这些毗邻的荧光部分相互淬灭荧光，但是在分开时很容易用荧光测定技术来检测；该测试样品可能含有受测定的特异性酶，其中受测特异性酶的存在将导致该多核苷酸断裂、荧光部分彼此分开以及荧光强度升高。

该方法的另一个实施方案包括测定荧光强度增加的额外步骤。这可通过辐射能照射、荧光显微镜、96孔板读数仪或流式细胞计数仪来进行。

图1示出了本发明的较佳实施方案。可以合成自身互补的多核苷酸10，即，该多核苷酸发生链内自身杂交。当荧光染料部分11和12连接在3′和5′端时，只观察到微弱的荧光，因为染料部分靠得非常近，从而导致相互淬灭。在用细菌14产生的核酸酶13处理时，多核苷酸10例如会在15、16和17位发生断裂，这样就破坏了自身杂交的结构，产生核苷酸片段18和解离的、自由发出荧光的非二聚化染料部分11′和12′。在该实施方案中，多核苷酸链必须足够长，以便允许多核苷酸折叠起来并使荧光染料部分相互紧密靠近。通常，大约15个碱基对就足够了。

图2显示了本发明的第二个较佳的实施方案。将多个荧光染料部分22连接到多核苷酸20上，该多核苷酸20含有易发生酶促切割断裂的不同位点24。染料部分22相互紧密靠近得足以使染料部分22的荧光淬灭。用细菌28产生的核酸酶26处理该偶联物(包含多核苷酸20和荧光染料部分22)来切割断裂多核苷酸20。断裂产生了核苷酸片段29，并使染料部分22′在基质中相互分开，因此它们可以自由地发出荧光并很容易被检测。在该实施方案中，较佳的是荧光部分22的间隔沿多核苷酸骨架小于碱基与碱基间测得的10纳米。该长度是根据已知的或估计的多核苷酸碱基长度通过间接方法测得的。图2所示的构型可用来测试多种类型的细菌或酶，其方法是使其具有一系列不同种类的成对或成组的荧光部分，每一类可用荧光测定技术与其它类区分开来，每对或每组的单个部分由易被不同细菌的酶切断裂的可断裂性键连接，或是在该键的相对侧。

图3显示了本发明还有一个较佳的实施方案。互补的杂交的多核苷酸30和31在其3′和5′端分别连接荧光荧光染料部分32和33。细菌38产生的核酸酶36在断裂位点34处断裂多核苷酸30和/或31，产生了核苷酸片段39和容易被检测的非二聚化的染料部分32′和33′。还有一个实施方案可以包括使染料部分与各互补多核苷酸的每个3′和5′端相连。图3所示的构型可用来同时测试两种类型的细菌或酶，其方法是用不同类型的荧光部分标记每个互补的3′/5′末端对，每一类可用荧光测定技术来与其它类区分，以及构建双链多核苷酸，使双链多核苷酸的每个末端附近具有易被不同种类的细菌酶断裂的可断裂位点。

荧光原性底物是一类在酶促水解时从基本上没有荧光变成有高度荧光的分子。它们可作为分子探针广泛地用于研究和测试病毒和细菌的酶(如蛋白酶、核酸酶、糖酶、磷酸酶和激酶)。底物的荧光很容易用常规的技术(例如辐射能照射、荧光显微镜、96孔板读数仪或流式细胞计数仪)来进行观察。

通过使多核苷酸与会发生二聚化或堆积的荧光染料(如荧光素和罗丹明)发生化学反应，就可制得用于本发明的携带荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸底物或荧光原性核酸酶底物。有用的多核苷酸可从商业上获得(例如购自GeneMedBiotechnologies，South San Francisco，CA)。为了制备本发明的试剂，将两个或多个荧光部分与该多核苷酸连接，使得荧光部分能够发生二聚化或堆积(例如通过牢固地杂交、靠近、链间杂交、链内杂交等)，从而相互淬灭(当荧光部分相同时称为“自身淬灭(self-quenching)”)荧光部分的荧光。

荧光染料淬灭可通过众多已知的机理(包括能量转移和染料二聚化)中任一机理而发生。在这些情况下，当荧光染料分子或部分被输入的能量(通常是受特定长度的光辐照)激发时，能量从该染料部分转移到另一部分上，而不是通过发出荧光而消散。能量转移(又称为 Frster型偶极-偶极相互作用)在荧光供体和受体之间发生，荧光受体可能会或可能不会发出荧光。能量转移通常在沿底物骨架距离约为10纳米的供体与受体之间发生。通过能量转移，供体部分的荧光被淬灭。另一方面，当两个或多个荧光部分相互紧密靠近得足以使它们的平面芳香族环相互作用形成基态(groundstate)复合物(如二聚体和三聚体)时，会发生染料二聚化或染料堆积。每个荧光部分作用于另一荧光部分，从而导致相互淬灭。处于二聚体或堆积状态的染料的吸收光谱与在能量转移配对中的同一染料的吸收光谱大不相同。染料二聚体吸收光谱显示，随着染料浓度的增加，主要吸收峰的吸光度有特征性的降低，而肩峰的吸光度特征性地升高。图5中描述了该现象。对于图5曲线中的染料分子，主要吸收峰出现在约560纳米处，而肩峰出现在约530纳米处。二聚化样品(c)表现出主要吸收峰和肩峰均为约0.03吸收单位(AU)的吸收峰，而未二聚化的样品(d)显示出主要吸收峰约为0.06AU，而肩峰变得平坦，约为0.028AU。二聚化样品中出现的该现象通常称为“频带分裂”。二聚化或堆积通过形成基态复合物(即通过物理性紧密靠近)产生，而能量转移相互作用则通过空间而产生。因此，通过能量转移机理相互作用的染料不会观察到染料二聚化作用所特有的光谱变化。

本发明所用的二聚化的或堆积的染料对或染料组的淬灭机理与荧光能量转移供体和受体的淬灭机理明显不同。当与多核苷酸结合且染料相互充分靠近时表现出二聚化或堆积特征的染料类型包括这样一些染料，它们具有一个基本上平的芳香族结构，因此在溶液中以足够高的染料浓度(例如10^-2至10^-4M)下能够形成均二聚体或异二聚体。显然，该现象对于许多应用来说是不希望的，但它用于本发明中却有益处。可通过增加单位体积内的染料量或使两个(或多个)染料部分物理性地一起紧密地局限于(例如)多核苷酸或其它小分子上来增加浓度。当染料部分紧密靠近时，这将导致局部浓度有效增加，无论总浓度如何，携带荧光部分的多核苷酸都将被淬灭。

荧光素和罗丹明家族的平面芳香族染料(如荧光素、四甲基罗丹明(TMR)、罗丹明B和X-罗丹明)是能在足够高的浓度下二聚化的典型染料。其它合适的荧光染料例如包括：花菁和硼-杂环染料如4，4-二氟-4-硼杂(borata)-3a-氮鎓-4a-氮杂-s-二氢化茚(indacene)(商标为BODIPY^TM，购自Molecular Probes，Inc.of Eugene，OR)。罗丹明家族的染料如四甲基罗丹明、X-罗丹明和罗丹明B在可见光波长范围(400-700纳米)内具有非常高的荧光量子产额(约为0.85)。出于这个原因，它们通常用来检测微量的物质。

本发明所用的染料部分另外还包含帮助荧光部分连接到多核苷酸上的反应性末端基团。这些末端基团可能包括琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺酯、硫代异氰酸酯、异氰酸酯和碘代乙酰亚胺。已经连接有这些反应性基团的染料分子例如可从MolecularProbes，Inc.(Eugene，OR)购得。

用于本发明的多核苷酸必须具有一个或多个可被特异性酶切的位点。当携带两个或多个荧光部分的荧光淬灭的多核苷酸发生断裂时，由于二聚化或堆积的荧光部分解离，荧光强度会增强。这样就容易检测荧光部分，从而表明存在特异性的酶，如果适用的话，还可表明存在产生该酶的细菌。由于谐振性二聚体或堆积结构的跃迁偶极子(transition dipole)之间相互作用，因此二聚体或堆积结构在多核苷酸完整时的荧光量子产额是相当低的。当多核苷酸被酶促断裂后，二聚体或堆积结构发生解离时，荧光部分分开，从而由于内在的高度荧光，将会观察到水溶液中有显著较高的荧光量子产额。通过这种方式，就可以确定荧光的增加和水解性酶的存在。根据这一结果，就可以设计一个不需要显影剂和分离步骤的均相酶试验，其中将携带荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸置于溶液中，加入酶分析物，这样分析物中的酶会断裂该多核苷酸，减少二聚化或堆积作用，同时伴有荧光增加。因此，酶活性与荧光强度的净增量直接相关。如果酶由代谢活跃的细胞分泌，则荧光强度可能与该细胞的代谢活性有关。

一个酶分子转变(turn over)数百万试剂分子的能力是扩增过程。当该酶来自活的细胞培养物时，这种扩增得到进一步的增强，因为随着细胞的生长，产生了更多的酶分子。这两个因素与荧光技术结合可提供一种迅速、灵敏和特异性检测细菌的前景良好的方法。

用来产生荧光原性核酸酶底物的典型多核苷酸必须具有受待测核酸酶攻击的化学键。例如，如下所述，已知微球菌核酸酶在磷酸二酯键处水解多核苷酸，因此具有此特征的任何多核苷酸都可作为微球菌底物。

用核苷酸类似物和DNA合成试剂对多核苷酸进行化学修饰。例如，可以通过自动化DNA合成仪(例如核酸合成和纯化系统(#ABI 3948型，Perkin-Elmer AppliedBiosystems，Foster City,CA))将含有脂肪族伯胺的亚磷酰胺导入多核苷酸链所需位置处。可以从商业途径购得末端修饰剂和氨基-修饰的-脱氧胸苷(dT)，以在多核苷酸的3′和/或5′端导入具有三碳、六碳或九碳连接部分的脂肪族胺。然后，使该胺与各种标记(如生物素、荧光染料或碱性磷酸酶)反应，形成多核苷酸偶联物。这些修饰的多核苷酸的常见应用包括：(ⅰ)无放射活性的杂交探针；(ⅱ)DNA的序列特异性断裂；(ⅲ)自动化DNA测序和(ⅳ)亲和层析。可加到多核苷酸末端上与待连接的染料部分反应的其它部分包括具有反应性H基团的那些部分(例如游离的巯基(SH)、羧基和羟基)。胺和硫醇是较佳的。

使荧光原性核酸酶底物(即试剂)与待测的特异性酶接触，实现酶促断裂。适用于本发明的目标酶包括通常归为核酸酶的所有酶，即水解核苷酸键的那些酶，例如包括耐热核酸酶或葡萄球菌核酸酶。

当酶在细胞内时，可利用增加携带该酶细菌外膜(OM)通透性的试剂，使酶与荧光原性核酸酶底物接触。乙二胺四乙酸(EDTA)常用于此目的，它能作用于革兰阴性肠细菌外膜屏障。在某些条件下，可破坏外膜，释放出胞内的酶。

对于迅速和灵敏的测试，重要的是要最大程度地增加信噪比，即使所需信号尽量大于不需要的背景信号(例如在细菌和生长培养基自体发荧光的情况下)。大多数传统的荧光原性底物在远紫外波长区(350-450纳米)内发光，而大多数细菌生长培养基在该区域内有明显的自身荧光。例如，典型的金黄色葡萄球菌培养基在360纳米下激发后在425纳米和475纳米下有两个明显的最大发射光。为了避免该问题，通常是采用高的底物浓度。这会导致试验成本较高，对生物的毒性较高，有时还会使底物沉淀。本发明克服了自身荧光干扰的难题，其方法是采用发射波长比背景荧光波长长得多的荧光染料(例如四甲基罗丹明：Ex=550纳米，Em=580纳米)将检测波长向红光移动(red-shift)至可见光谱。另外，本发明描述的内容可适用于也能将发射光向红光移动至更长波长处的其它染料。通常，有用的染料可能具有下列特征：消光系数高(＞80，000cm^-1M^-1)、光量子产额高(在水溶液中＞0.85)、光谱对溶剂和pH不敏感、可溶于水中、对光稳定、以及二聚化常数宜大于10^-3。

许多葡萄球菌菌株表现出DNA酶活性。组织学上曾经用于鉴定目的的一种酶是金黄色葡萄球菌(S.aureus)的胞外DNA酶。金黄色葡萄球菌核酸酶被大量分泌，对热稳定，其活性需要Ca²⁺，但不需要Mg²⁺。这些特征可在检测食物中葡萄球菌污染时用来区别金黄色葡萄球菌和其它葡萄球菌。链球菌属、沙雷菌属和芽孢杆菌属也产生胞外DNA酶。

用微球菌核酸酶(金黄色葡萄球菌的一种胞外酶)作为模型系统来证明本发明的用途。该酶酶切多核苷酸链的5′磷酸二酯键，在升高的温度下(＞60℃)保持稳定并有活性，通常用作金黄色葡萄球菌的指示物。在60℃下存在核酸酶活性是金黄色葡萄球菌的确认性试验。微球菌核酸酶发挥作用不需要辅因子-该特征能减少试验复杂性和成本。

总之，本发明提供了新的核酸酶试剂、采用该试剂的试验方法和制备该试剂的方法。该试剂包含携带了两个或多个荧光部分的合成的单链或双链多核苷酸，该荧光部分可以是染料分子(例如四甲基罗丹明)。核酸酶水解和断裂后的荧光增强在2至6倍之间，这取决于试剂的具体构型。这些试剂与“双级联”现象(每个酶分子能周转数百万个试剂分子，且随着细菌细胞呈指数型分裂和生长而释放出更多的酶分子)的结合提供了能迅速、灵敏、特异地检测细菌的前景良好的方法。本发明适用于(但不局限于)检测和鉴定微生物、灭菌保障、药物发现、酶试验和免疫试验。

下列实施例将进一步描述本发明的目的和优点，但是应理解这些实施例中引述的具体材料和用量以及其它条件和细节并没有构成对本发明的限制。

             发明实施例

              测试方法

荧光光谱

所有荧光测定在购自Spex Instruments of Edison，NJ的商品名为FLUOROLOG^TM的荧光分光光度计中进行。在一个典型的测定中，在石英比色杯中放置3毫升试验溶液，将比色杯置于荧光分光光度计的样品支座中。然后室温下以固定的激发波长下测定测试溶液的荧光发射光谱。荧光分光光度计的激发和发射缝隙宽度均定为0.5毫米。在相同的仪器条件下测定有核酸酶存在和没有核酸酶存在的试验溶液的荧光光谱。

               实施例1

在本实施例中，将两个四甲基罗丹明(TMR)染料部分与自身互补的24聚多核苷酸的3′端和5′端相连接。链内杂交使两染料部分相互紧密靠近并因此淬灭荧光。多个位点处的酶促切割导致该有序的结构被破坏。然后，染料分子脱二聚化，使荧光明显增强。图1示意性地描述了此原理。

自身互补的多核苷酸NH₂CH₂CH₂CH₂-5′-AAC AAA GGA TAA TTA TCC TTTGTT-3′-CH₂CH₂CH₂NH₂购自GeneMed Biotechnologies,Inc.(South San Francisco,CA)，通过DNA测序确认其化学结构。将大约270纳摩尔(nmol)的上述多核苷酸溶解在600微升去离子(D.I.)水中。使90纳摩尔(200微升)的该多核苷酸溶液与预先溶解在一滴二甲基亚砜(DMSO)中的4毫克四甲基罗丹明(TMR)琥珀酰亚胺酯(购自Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)在100毫摩尔(mM)pH 8.3碳酸氢钠缓冲液中室温反应。该混合物具有充足的体积来维持合适的pH-体积约为2毫升。在该酰胺化过程中，TMR部分的酯与连接于多核苷酸的胺部分反应。

将反应混合物从移液管导入含有表氯醇交联(碱性条件)的葡聚糖凝胶(一种堆积材料，以SEPHADEX^TM G25的商品名购自Pharmacia Biotech,Inc.)分子大小排阻层析柱(PD-10型，Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ)中，以便将标记的多核苷酸和未反应的染料分开反应混合物靠重力通过该柱。在C18反相柱(600E型HPLC，WatersCorp.,Milford,MA)上用高效液相色谱(HPLC)对DNA组分作进一步纯化。柱中的流动相是水配制的乙腈(ACN)和0.1M三乙胺乙酸(TAA)梯度，其中TEAA与ACN的体积比从92∶8起在30分钟内线性降低至8∶92。所得的偶联物具有上述多核苷酸结构，3′和5′端各个脂肪族胺连接部分上添加了TMR部分。

合并含有纯化的偶联物的各HPLC组分，干冰冷冻，然后室温真空干燥。然后将干的偶联物溶解在5毫升100mM pH 8.9碳酸钠缓冲液中。如图5所示，用分光光度计(MPC-3100型，Shimadzu Scientific Instruments,Columbia,MD)测得的吸收光谱显示出二聚化四甲基罗丹明具有特征性的频带分裂。在3毫升上述缓冲液中加入少量(约0.5毫克)微球菌核酸酶(购自Sigma,Chemical Co.,St.Louis,MO)。37℃培育混合物过夜，使携带荧光部分的多核苷酸的5′磷酸二酯键发生酶促水解。然后将溶液冷却至室温。然后用FLUOROLOG^TM荧光分光光度计在室温下测定荧光光谱。酶促切割导致当用520纳米的光激发时，580纳米下的荧光强度有相当的增强(从12000增强到28000)，560纳米下的吸收值从0.03吸收单位(AU)升高到0.06AU。

在另一个测试中，增加5′端脂肪族胺连接部分的长度，使两个染料部分之间发生更有效的堆积。从GeneMed获得具有较长脂肪族胺连接部分的下列多核苷酸，作标记，并在类似于本实施例前述的条件下测试。

H₂N-(CH₂-CH₂O)₆-(CH₂)₃-5′-AAC AAA GGA TTA TAA TCC TTT GTT-3′-CH₂CH₂CH₂-NH₂

H₂N-(CH₂CH₂O)₉-(CH₂)₃-5′-AAC AAA GGA TTA TAA TCC  TTT GTT-3′-CH₂CH₂CH₂-NH₂

每种情况下均观察到荧光增强两倍。

    实施例2

在本实施例中，将悬垂的四甲基罗丹明染料部分连接到多核苷酸序列的多个部位。由于紧密靠近，染料部分堆积在一起淬灭了荧光。在多处位点酶切该多核苷酸使偶联物分裂，释放出从二聚或堆积的状态变成单个部分的染料部分，同时导致荧光强度增加。图2中示意性地描述了这一原理。

设计多核苷酸链，使其在交替的碱基中含有总共4个氨基基团如下：5′-TTT TTTZ T Z T Z T Z TTT TTT-3′，其中Z是脱氧胸苷(dT)的胺修饰的C₆衍生物(目录号10-1039-90，Glen Research,Sterling,VA)。多核苷酸链由GeneMed Biotechnologies,Inc.合成。将约45纳摩尔的多核苷酸溶解在去离子水中，并在100mM pH 8.3碳酸氢钠缓冲液中室温下与预先溶解在一滴DMSO中的1毫克四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯反应。在实施例1的相同条件下纯化偶联物。用少量(约0.5毫克)100mM pH 8.9碳酸氢钠配的微球菌核酸酶37℃酶促水解过夜。在室温下用520纳米的激发波长测定荧光光谱，酶促水解后获得575纳米荧光强度大约增强2倍。

    实施例3(对比例)

在本实施例中，通过能量转移而不是染料二聚化来淬灭(一个染料部分)。

用从GeneMed Biotechnologies,Inc.获得的下列两个多核苷酸通过荧光能量转移来测定DNA酶活性：

A.5′TTA XTA AYT CCG TTT AA3′B.5′TTA ZTA AYT CCX TTT AA3′其中X是四氯荧光素(受体)，Y是荧光素(供体)，Z是脱氧胸苷(dT)的氨基修饰的C₆(允许连接另一个受体四甲基罗丹明(TMR)，该受体悬垂在Z上)。在A构型中，将两种不同的染料-供体和受体-X和Y插入多核苷酸序列中。与实施例2中所有染料部分均悬垂在多核苷酸上不同的是，在本实施例中供体和一个受体被插入多核苷酸骨架本身。构型B与A相似，只是第二个受体(TMR)悬垂在Z上。当多核苷酸完整时，供体和受体处于能量转移的相互距离内。荧光素的激发态能量被非辐射转移至四氯荧光素(和/或B情况下的四甲基罗丹明)，引起供体荧光被淬灭。受体荧光不淬灭。在酶促水解DNA后，供体和受体分开，能量转移变得无足轻重。在微球菌核酸酶水解后，490纳米激发的化合物A在530纳米的供体荧光增加大约30％。肉眼观察，荧光从橙蓝变成深蓝，表明能量转移效率降低。化合物B也观察到类似的结果。

    实施例4

在本实施例中，将四甲基罗丹明分别与两个互补多核苷酸的3′和5′端的脂肪族胺连接部分相连。链间杂交使得染料部分相互紧密接触并淬灭荧光。沿双链多核苷酸的多个位点的酶促切割使有序的结构分解，使二聚体变为单体而释放出染料部分，导致荧光明显增加。图3示意性地描述了该原理。

两个互补的25聚多核苷酸由GeneMed Biotechnologies,Inc.合成：

NH₂-(CH₂)₃-5’-AAC AAA GGA TTA TAG TGG GAA ATC A-3’

NH₂-(CH₂)₃-3’-TTG TTT CCT AAT ATC ACC CTT TAG T-5’

使各多核苷酸约22.5纳摩尔分开与100mM pH9.0碳酸钠缓冲液配的1毫克四甲基罗丹明(TMR)异硫氰酸酯23℃搅拌(振荡)反应过夜。在与多核苷酸混合前，先将染料溶解在一滴DMSO中。TMR部分的异硫氰酸酯和连接于多核苷酸的胺基团形成硫脲键。使每个反应混合物通过如实施例1所述的分子大小排阻柱(PD-10，Pharmacia Biotech，Inc.,Piscataway,NJ)，以将标记的物质与未反应的染料分子分开。采用下式，根据多核苷酸链中GC对含量百分数和杂交溶液(目录号F123A，PromegaCorp.,Madison,WI)的离子强度计算解链温度T_m：

T_m=81.5+16.6(log₁₀[Na⁺])+0.41(％GC)-(600/N)其中N是表示多核苷酸链中碱基数的整数。该公式预计此Tm非常适合长度为14至60-70核苷酸的多核苷酸。Promega杂交溶液的Na⁺浓度为0.39。根据该公式，计算出上述多核苷酸的T_m为63.8℃。在低于Tm 5-10℃下在短的多核苷酸之间形成的杂交物是可逆的，容易解链。因此，反应温度应至少比Tm低10℃。另外，为了制备稳定的杂交物，应用高浓度(0.1-1.0皮摩尔/毫升)的多核苷酸在严谨条件下进行短的多核苷酸杂交。在本实施例中，携带荧光染料的两条链是在45℃(低于Tm 19℃)、高严谨杂交溶液(Promega溶液)中进行杂交。偶联物溶液显示在575纳米(Ex=550纳米)处具有荧光强度，其在和100mM pH8.9碳酸氢盐缓冲液配的微球菌核酸酶(目录号N-3755，Sigma Chemical,Co.,St.Louis,MO)37℃培育过夜后的荧光强度，比核酸酶处理前高大约6倍。这在图4中有所描述。

本领域技术人员显然能在不脱离本发明的精神和范围内对本发明作各种改动和变化。应理解本发明并不局限于本文所述的描述性实施方案。

Claims (20)

1．一种试剂，它包含：

至少一种可特异性酶切断裂的多核苷酸底物，该底物携带的至少一个荧光部分与至少另一个毗邻的荧光部分紧密靠近，所述的这些毗邻荧光部分相互淬灭荧光，所述荧光部分在所述底物断裂时很容易被荧光测定技术检测到。

2．根据权利要求1所述的试剂，其中所述荧光部分包含荧光染料基团。

3．根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述荧光部分是相同的。

4．根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述多核苷酸底物包含大约24个碱基对。

5．根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述多核苷酸底物包含一个自身互补的单链多核苷酸，该多核苷酸的3′和5′端各携带了一个荧光部分。

6．根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述多核苷酸底物包含两条互补杂交的多核苷酸链，每条链具有3′和5′端，其中一个或两个3′/5′配对的每个末端携带一个荧光部分。

7．根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述多核苷酸底物包含一条单链多核苷酸，该多核苷酸在其长度上携带至少两个悬垂的毗邻的荧光部分。

8．根据权利要求7所述的试剂，其中所述毗邻的荧光部分相互隔开的距离小于沿多核苷酸骨架测得的碱基与碱基间10纳米。

9．根据权利要求1或2所述的试剂，其中所述可特异性酶切断裂的多核苷酸底物可被选自DNA酶和RNA酶的酶切割。

10．根据权利要求9所述的试剂，其中所述DNA酶是细菌DNA酶。

11．根据权利要求2所述的试剂，其中所述荧光染料基团包含两个或多个二聚化的或堆积的荧光染料基团。

12．根据权利要求2所述的试剂，其中每个所述染料基团包含一个平面部分。

13．根据权利要求2所述的试剂，其中每个所述染料基团选自荧光素、罗丹明、花菁和硼杂环染料基团。

14．根据权利要求13所述的试剂，其中每个所述罗丹明染料选自四甲基罗丹明、X-罗丹明和罗丹明B。

15．一种生物学试验方法，该方法包括下列步骤：

合并

(1)权利要求1或2所述的试剂，和

(2)一种可能含有待测的试特异性酶的测试样品，其中待测试的特异性酶的存在将导致多核苷酸断裂，荧光部分分开，以及荧光强度增加。

16．根据权利要求15所述的方法，该方法还包括测定荧光强度增加的步骤。

17．根据权利要求16所述的方法，其中荧光强度的增加用选自辐射能照射、荧光显微镜、96孔平板读数仪和流式细胞计数仪的手段来测定。

18．根据权利要求15所述的方法，其中所述酶来自细菌。

19．一种制备某试剂的方法，该试剂包含携带荧光部分的可特异性酶切断裂的多核苷酸，这些荧光部分通过染料二聚化相互淬灭，并在分开时可用荧光测定技术来检测，所述方法包括下列步骤：

合并携带一个或多个荧光部分以及一个或多个反应性基团的一种或多种荧光化合物与可特异性酶切断裂的多核苷酸，该多核苷酸选自下列：(1)自身互补的单链多核苷酸，它具有与一个或多个荧光化合物有反应性的一个或多个末端基团，(2)单链多核苷酸，在该多核苷酸中非末端的其它位置上有两个或多个部分具有与一个或多个荧光化合物反应的悬垂基团；和(3)互补的多核苷酸，每条链在一个或两个3′/5′配对的3′和/或5′端，分别具有至少一个与一个或多个荧光化合物反应的反应性末端基团，这种合并在产生所述试剂的反应条件下发生。

20．根据权利要求19所述的方法，其中携带所述荧光部分的所述化合物选自荧光素、罗丹明、花菁和硼杂环染料基团。

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