[go: up one dir, main page]

CN1284883A - 增强核酸接种的免疫应答的方法 - Google Patents

增强核酸接种的免疫应答的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1284883A
CN1284883A CN98813612A CN98813612A CN1284883A CN 1284883 A CN1284883 A CN 1284883A CN 98813612 A CN98813612 A CN 98813612A CN 98813612 A CN98813612 A CN 98813612A CN 1284883 A CN1284883 A CN 1284883A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
polypeptide
polynucleotide
nucleic acid
desired polypeptides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN98813612A
Other languages
English (en)
Inventor
W·L·J·达勒曼斯
M·P·范梅赫伦
C·布鲁克
M·弗里德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
SmithKline Beecham Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SmithKline Beecham Biologicals SA filed Critical SmithKline Beecham Biologicals SA
Publication of CN1284883A publication Critical patent/CN1284883A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • A61K9/1647—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
    • C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供一个通过同时给予目的多核苷酸和目的多肽,增强核酸接种的免疫应答的方法。

Description

增强核酸接种的免疫应答的方法
发明领域
本发明涉及一个通过同时给予目的多核苷酸和目的多肽来增强核酸接种的免疫应答的方法。
发明背景
Wolff及其同事(Wolff等，Science 247：1465-1468(1990))在1990年报道：编码报道基因的非复制型质粒DNA可以通过肌细胞内化，而不使用任何转染载体，并且在注射该质粒DNA后表达编码的蛋白。随后的关于“裸露的”(即没有促进转染的因子)质粒DNA的表达蛋白在肌内接种时有免疫原性的发现已经开创了一个全新的具有显著临床影响果的研究领域。
因此，用核酸接种(NAVAC)已经成为接种预防许多疾病的相对新的方法。该方法涉及在宿主细胞内体内产生多肽，而不是更传统的给予先在体外产生(或培养)的多肽(或减毒的、或灭活的微生物)的方法。NAVAC与更传统的疫苗的不同之处还在于给予的化合物包含核酸，即编码选定抗原的DNA或RNA。一注射这些核酸后，它们就被哺乳动物宿主的受体细胞吸收，随后表达由这些核酸编码的抗原。此后，在宿主中存在的外源抗原可以引发针对该抗原的特异性免疫应答。已经表明，NAVAC诱导体液(即抗体)介导的免疫，也诱导细胞介导的免疫，即T辅助细胞应答和细胞毒性淋巴细胞(参见例如Corr等，J.Exp Med.184：1555-1560(1996)；Doe等，Proc.Natl.Acad.Sci.93：8578-8583(1996))。
已经表明，在一定数量的动物模型中，诱导的免疫应答保护动物，以抵抗最初由其获得抗原的感染性生物随后的攻击(例如Ulmer等，Science 59：1745-1749(1993)；Sedegah等，Proc.Ntal.Acad.Sci.USA91：9866-9870(1994)；Manickan等，J.Immunol.155：259-265(1995))。已经表明，NAVAC在较大动物物种中效力低得多(当与给予佐剂化蛋白相比时)，并且不得不给予大量DNA，以达到和较小动物物种(例如小鼠)中获得的免疫水平相当的免疫水平(Gramzinski等，VaccineResearch 5：173-183(1996)；Lu等，J.Virol.70：3978-3991(1996)；Shiver等；Journal of Pharmaceutical Sciences 85：1317-1324(1996))。因此需要提高NAVAC的效力，例如通过开发新的传送和靶向机制、新的佐剂化技术、其他的给予途径等等。本发明的目的就是提供对DNA接种效力的另一种改进。
发明概述
在一方面，本发明提供一个方法：通过给予(ⅰ)编码目的基因的多核苷酸，该目的基因编码多肽，和(ⅱ)同时(即在同一个正在进行免疫应答期间)还给予所述多肽，增强核酸接种的免疫应答。给予多核苷酸和给予多肽最好是彼此发生在0～10天内。一个优选的实施方案是给予多核苷酸之前3～7天给予多肽。所述多肽在给予前可以进一步制备，使得它以提供缓释(例如囊化)这样一种方式呈递到免疫系统。在此情况下，所述多肽最好和所述多核苷酸同时(共同)给予。
在另一方面，本发明提供一个方法：通过给予编码目的基因的核苷酸(所述目的基因编码目的多肽)，也通过同时(即在同一机体正在进行免疫应答期间)给予所述多肽，增强多肽接种的免疫应答。
在其它相关方面，本发明涉及药用组合物、疫苗和制备这些组合物和疫苗的方法，所述组合物和疫苗包含编码目的基因的多核苷酸和相应的目的多肽，其中多核苷酸对多肽的比率由1000∶1至1∶1(w/w)。可选地，在给予所述多肽前可以对其制备，使得它以提供缓释这样一种方式呈递到免疫系统。
附图简述
图1(Ig 14 Post2)显示了强化注射后两周在免疫动物中的血清应答。与单独使用各个基质((DNA-F或FG蛋白)2x)获得的抗体相比，两种疫苗基质的组合极大地增加了RSV-FG特异性抗体的量。
图2(IgG同种型14 Post 2)显示了在不同的疫苗组别中的同种型分布。所有在初次注射中确实接受DNA疫苗的组别都有充足的IgG2a含量，这表示1型的T辅助细胞应答(Th1)，而蛋白组具有完全相反的倾向，即Th2型应答特有的IgG1同种型。
图3(淋巴组织增生)显示了用FG抗原体外再刺激时不同疫苗组中脾细胞的淋巴组织增生。
图4显示了在不同的疫苗组别中CTL的存在。
图5显示了在再次注射后14天抗-gp120 IgG的总效价。IgG效价在接受两种抗原形式(多核苷酸和多肽)的组别中大幅增加。多肽(蛋白)延迟4天后给予。
图6显示了抗-gp120 IgG效价的同种型分布。延迟输送蛋白保持了和在DNA组别中观察到的同样可观的IgG2a效价，这与只用蛋白的组别大不相同。
发明详述
本发明涉及一个通过在同时给予前混合两种不同化合物，增强哺乳动物(例如小鼠、兔、灵长类动物、人)对DNA疫苗的免疫应答的方法。第一种化合物包括诸如DNA或RNA的多核苷酸(核酸)，它编码选定的可以刺激保护性免疫的多肽。第二种化合物包括多肽，它最好是和本发明所述核酸编码的多肽相同的多肽(或基本相同，即具有相同的优势免疫表位)。所述增强涉及通过体液和细胞介导的免疫应答测定的免疫应答的总增加。即可检测到下述中的一个或多个增加：总的抗体效价(针对选择的多肽)；淋巴组织增生和CTL(细胞毒性T淋巴细胞)水平。而且，当将诸如编码目的基因的DNA的核酸与相应多肽混合并(同时)给予哺乳动物时，观察到协同效应。即不仅DNA疫苗能在蛋白(多肽)存在下诱导免疫应答，而且已经发现这种蛋白(多肽)的存在实际上增强了所述DNA疫苗的效力。因此，本发明的一个方面是包含多核苷酸和多肽用于增强免疫应答的组合物。可选地，所述多肽也可以佐剂化。
相反地，发现对于多肽疫苗而言，特定核酸(例如，编码完整或大部分所述多肽的DNA)的存在同样增加了免疫应答。即DNA/多肽混合物的相互作用增强了任一单个组分的效力。这种增强对于加入的多核苷酸是特异性的，因为不编码所述特定多肽的相似的多核苷酸不能增强免疫应答。本发明的一个令人惊奇的方面是这样一个事实：DNA组分和多肽组分在引引发免疫应答方面不相互竞争，相反，当同时给予DNA和蛋白时观察到协同效应。
本发明与“引发加强”(prime boost)方法(Barnett等，Vaccine 15：869-873(1997))的不同之处在于，在该方法中制备两种性质不同的疫苗制剂(一个是DNA，一个是蛋白)，并在不同的时间、并以特定的次序分别给予。即在“引发加强”方法中，给予DNA分子“引发(prime)”免疫系统，并在，在建立初次免疫应答之后随后某一时间(几周或几月后)，给予蛋白以加强那时已预先存在的免疫应答。
本发明的另一好处是在某些情况下，当具有强免疫应答倾向时(例如对初次接种高百分比的应答者、高水平抗体效价、CTL应答等)，组合两种化合物(DNA+蛋白)可以免除对免疫刺激剂的需要。
在本发明的另一个实施方案中包括制剂，其中核酸和蛋白质抗原共同给予(最好是同时)，但所述蛋白质抗原在缓释载体中囊化，该缓释载体在给予后几天释放蛋白质抗原。这种制剂与单独用核酸相比，增强了诱导的免疫应答的程度，而不使免疫应答发生偏向。核酸
按照本发明使用的多核苷酸物质包括编码具有有效治疗用途的多肽的DNA或RNA序列，例如预防或治疗疫苗。按照本发明所述方法，可表达的DNA和RNA都可以输送到细胞中，以在其中形成多肽翻译产物。如果所述核酸包含合适的控制序列，则它们将指导合成相对较大量的编码蛋白。最好是它们编码与感染性疾病相关的生物的抗原，所述感染性疾病由病毒(包括但不限于肝炎病毒(所有形式)、HSV、HIV、CMV、EBV、RSV、VZV、HPV、脊髓灰质炎病毒、流感病毒)、寄生虫(例如来自疟原虫属)和病原性细菌(包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风杆菌(M.leprae)、衣原体属(Chlamydia)、志贺氏菌属(Shigella)、布氏疏螺旋体(B.Burgdorferi)，产肠毒素大肠杆菌，伤寒沙门氏菌(S.Typhosa)、幽门螺杆菌(H.Pylori)、霍乱弧菌(V.cholerae)、百日咳杆菌(B.pertussis)等等)引起。其它诸如在癌细胞中发现的抗原(已知对肿瘤免疫应答的靶的实例是例如HPV诱导的宫颈癌的E7、乳腺癌和其它癌症的Her-2/neu、黑素瘤和其它癌的MAGE-3、酪氨酸酶、melanA/MART或gp100，即黑素细胞特异性分化抗原)也包含在本发明的范围内。
本发明的多核苷酸可以是线性片段形式，或者是整合到质粒或病毒DNA中的非线性片段形式。所述多核苷酸(或核酸)可以和其它促进转染的物质相结合，诸如脂质体制剂、带电脂质(阳离子或阴离子：例如LipofectinTM、TransfectamTM、DOTAPTM、cochleates)、聚阳离子(例如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺等)、病毒蛋白(例如组蛋白)、结合核酸的肽(例如凝聚剂)、dendrimer、PLPG微粒等。
当所述核酸是DNA时，适于用在各种哺乳动物系统中的启动子是众所周知的。例如，合适的启动子包括CMVIE、RSVLTR、SV40、Adeno MLP、金属硫蛋白等。
至尽尚未完全了解作为由NAVAC诱导免疫应答的基础的确切的细胞和免疫机制。NAVAC的标志是诱导细胞毒性应答，它是免疫应答的一部分，难于由蛋白(接种)方法诱导。为了诱导CTL应答，所述抗原必须在细胞中存在的MHC-I分子的范围内呈递。由于在NAVAC中蛋白是细胞内表达，所以很容易实现这种MHC-I呈递。因此，核酸接种特别适用于刺激细胞免疫，具体的说是对目的抗原的细胞毒性T细胞应答。蛋白
所述蛋白可以是任何具有有用治疗用途的多肽，例如作为预防或治疗的疫苗。如上所述，本发明不限于具体的多肽，然而，它最好应当是不能固有刺激强细胞介导的免疫应答的靶蛋白，诸如在细胞内病原体(例如但不限于结核菌、麻风杆菌、衣原体)中发现的多肽、某些肿瘤特异性抗原(例如在乳腺癌或结肠癌中发现的)和弱免疫原性病毒蛋白(例如来自疱疹病毒、EBV、CMV、HPV等的)。
请注意：重组蛋白和亚单位疫苗潜在的缺点是以下事实：糖蛋白抗原可能需要以特定构象存在(即同天然蛋白一致)来引发免疫保护性应答。当所述抗原由重组表达系统纯化时，有时难以保证其在构象上正确。然而，在体内引入编码抗原的基因和其随后的细胞内表达将保证使所述蛋白产物的合成、修饰和加工与天然病原蛋白很相似。因此，例如表达人病毒糖蛋白的基因将可能产生正确构象的所述抗原。因此，天然抗原表位将呈递到免疫系统，并可以例如导致产生对天然病毒糖蛋白特异性的中和抗体。DNA+蛋白
一般来说，DNA接种引发的主要是Th1辅助细胞型应答。相反，大多数可溶性非颗粒状抗原(即基于蛋白的)疫苗引发的主要是Th2应答。一旦“引发”，根据用于最初接种的组合物(即核酸或多肽)，免疫系统应答主要保持为Th1或Th2。完全意想不到的是，当同时给予DNA+蛋白的组合时，显示出更平衡的Th1+Th2应答。即两种应答都被引发，且多核苷酸/多肽的组合似乎协同作用。而且，细胞外蛋白的存在不妨碍诱导CTL。
基于所述多核苷酸/多肽免疫应答，本发明的另一优势是本方案提供了一个治疗潜伏病毒感染的方法。一些病毒(例如疱疹病毒群的某些成员等)可以建立潜伏感染，其中所述病毒以失活或部分活性的形式保持在细胞内。几乎没有治疗这种感染的方法。然而，通过诱导抗潜伏病毒蛋白的溶细胞免疫，可以最终靶向和消除潜伏感染的细胞。因此，通过给予多核苷酸/多肽组合物，由于可以建立更强的免疫应答，包括细胞溶解活性，其效果应强于纯NAVAC(即只有核苷酸)。
这个方法相关的用途是治疗慢性病原体感染。缓慢复制并直接从细胞扩散到细胞的病原体的实例有很多。这些感染是慢性的，在某些情况下持续几年或几十年。这些病原体的实例是慢病毒(例如维斯那慢病毒)、乙型肝炎病毒、瘙痒病因子和HIV。其它病原体的实例包括疟原虫属、分枝杆菌属、螺杆菌属、疏螺旋体属和弓形虫属的生物，以及上述提及的其它病原菌。
最后，这个方法也可以用于治疗恶性疾病。例如，通过接种来建立对肿瘤细胞所表达蛋白的强免疫应答，包括T细胞介导的组分，将可能导致这些细胞的消除。
如上文用法一样，“同时”给予是指同一个正在进行免疫应答。最好是同时给予两种组合物(DNA+蛋白二者同时给予)，然而，一种化合物可以在给予另一种(初次)化合物的几周时间内(最好是1-10天)给予，并仍可认为是“同时”，因为它们都在同一个正在进行的免疫应答期间起作用。一般认为当给予多肽时即刻有免疫应答，因为抗原一暴露给免疫系统，就将启动免疫应答。相反当给予核酸时，给予后3-7天观察到抗原表达峰值(体内)，因此认为当与蛋白接种的动力学比较时，抗原“延迟”暴露于免疫系统。不管在动力学上有这种不同，通过理解核酸和多肽在正在进行免疫应答的过程期间就功能而言都存在，可以认为共同给予它们是“同时”的。为了使两种抗原形式(即多肽本身和由给予的多核苷酸表达的多肽)实际上同时呈递到免疫系统，可以考虑含有多肽的制剂，所述多肽处于这样一种形式：即在给予后延迟由制剂中释放。这使得由多核苷酸表达多肽首先发生，随后通过延迟由制剂中释放多肽进行补充。
因此本发明的另一方面是DNA+蛋白二者的同时给予，其中所述蛋白(多肽)以缓释颗粒的形式存在或给予，该缓释颗粒预计使免疫系统短时间内无法感知抗原。最好是1-10天。
不管上述的“同时”给予的不同方式或可能性，它是本发明的关键：两种抗原性物质在正在进行的免疫应答的诱导阶段都存在。与此相比，引发加强的概念涉及两个独立的免疫应答：(ⅰ)用多核苷酸初次引发免疫系统，接着(ⅱ)在已经建立初次免疫应答之后许多周或多个月，用多肽再次引发或加强免疫系统。
因此DNA+蛋白复合物可以作为两个独立的事件给予，或者可以组合(混合)以容许一次给予。最好是混合所述DNA+蛋白。可以就在用之前混合，或者在生产(和配制)两种组分时混合，或在这二者之间的任何时候混合。
本发明的组合物和疫苗包含DNA+蛋白(多肽)，其比率由1000∶1(即1mg DNA/1μg蛋白)至1∶1至1∶100(w/w)。优选是在100∶1至1∶1的范围内。更优选是在20∶1至1∶1的范围内。一个优选的比率是5∶1。佐剂
当本发明的多核苷酸、多肽和多核苷酸+多肽混合物(复合物)佐剂化时，它们最好是在本发明的疫苗制剂中佐剂化。在New Trendsand Developments in Vaccines，Voller等(编辑)University Park Press，Baltimore，Maryland，1978中一般描述了疫苗的制备。在美国专利4，235，877中Fullerton描述了脂质体中的囊化。合适的佐剂包括诸如氢氧化铝凝胶(明矾)、磷酸铝或algammulin的铝盐，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性悬浮液，阳离子或阴离子衍生化的多糖或聚磷腈。
合适的佐剂系统包括例如单磷酰脂质A最好是3-脱氧酰化单磷酰脂质A(3D-MPL)与铝盐的组合物。增强系统包括单磷酰脂质A和皂苷衍生物的组合物，特别是在WO 94/00153中公开的QS-21和3D-MPL的组合物，或者是在WO 96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。在WO 95/17210中描述了特别有效的佐剂制剂，它包括在水包油乳浊液中的QS21、3D-MPL和维生素E，是一个优选的制剂。另外，所述DNA通过编码目的基因和CpG序列也可以用做佐剂。这种CpG序列或基元在本领域是已知的。制剂
给予本文所述的多核苷酸和蛋白的药学上可接受的盐包括在本发明范围内。这些盐可以用药学上可接受的无毒碱(包括有机碱和无机碱)制备。得自无机碱的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐等等。得自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺盐、碱性氨基酸等等。关于药用盐的有益论述参见S.M.Berge等，J Pharm Sci 66：1-19(1977)，其中公开的内容通过引用结合到本文中。
所述制剂中的蛋白组分可以以缓释颗粒的形式给予，该颗粒预计使免疫系统几天内无法感知抗原，然后释放抗原。这时当DNA已经引发了初次免疫应答后，则释放蛋白质抗原。在文献中已经论述了使用缓释制剂实现用蛋白质抗原的引发和加强免疫应答的概念，例如参见Coombes，A等(Vaccine，14：1429-1438(1996，))。多数公开的获得蛋白质抗原缓释制剂的尝试已经使用了由聚(丙交酯-co-乙交酯)组成的微粒，其中所述蛋白质抗原被包载(entrap)。已经用聚丙烯酸脂、胶乳、淀粉、纤维素和葡聚糖制备了其它制剂。可以用作延迟输送的载体(即用于缓释制剂)的另一种类型的载体是超分子生物载体(SMBV)。SMBV包含非液态亲水性核，诸如交联多糖或交联寡糖，以及可选的含有亲水亲油化合物的外层，诸如磷酸脂。参见例如美国专利5，151，264，PCT申请WO94/20078、WO94/23701和WO96/06638。
在本发明的一个优选的实施方案中，蛋白质抗原吸附到明矾上，然后用诸如聚(己内酯)或聚(丙交酯-共-乙交酯)的生物可降解聚合物包被明矾颗粒。与公开的用于囊化蛋白质抗原的方法不同，这类制剂提供一个围绕着所述抗原的聚合物密封层，阻止抗原在一天至几周的时间范围内释放。
用于注射(优选的输送途径)的多核苷酸和蛋白，可以以单位剂量形式，在安瓿或在多剂量容器中制备。所述多核苷酸和蛋白可以诸如以下述形式存在：悬浮液、溶液或在油性溶媒或最好是在水性溶媒中的乳浊液。或者，所述多核苷酸盐可以是冻干形式，用于在输送的时候与合适的溶媒(诸如灭菌的无热原水)重建。准备重建的液态及冻干形式都将含有试剂，最好是缓冲液，其量必须适于调节注射溶液的pH值。对于任何用法，特别是如果准备静脉内给予制剂，则应该控制溶质的总浓度，使得制备物等渗、低渗或微高渗。诸如糖的非离子物质最好用于调节张力，而蔗糖是特别优选的。这些形式中的任何一种还可以含有合适的配制剂，诸如淀粉或糖、葡萄糖或盐水。每单位剂量的组合物，无论是液态或固态，都可以含有由0.1％至99％的多核苷酸和蛋白物质。
单位剂量安瓿或多剂量容器(多核苷酸和多肽在使用前包装在其中)可以包括一种密封的容器，该容器封装了一定量的多核苷酸(和/或多肽)或含有多核苷酸(和/或多肽)的溶液，适于其药学有效剂量或多个有效剂量。所述多核苷酸和多肽作为一种无菌制剂包装，而密封容器目的是保持制剂的无菌性直至使用。DNA/蛋白复合物的给予剂量和给予途径
所述多核苷酸可以输送到动物体内的各种细胞(包括例如肌肉、皮肤、脑、肺、肝、脾脏细胞)或血液细胞中。多核苷酸/蛋白复合物的给予不限于一个特定的途径或位点。例如，所述途径可以是肌内、皮内、表皮(使用例如基因枪)、耳廓内、口服、阴道、鼻等等。所述途径最好是肌肉、皮内或表皮。
优选的靶组织是肌肉、皮肤和粘膜。皮肤和粘膜是正常遇到大多数感染性抗原的生理位点。与淋巴组织相关的皮肤含有象角质细胞、朗氏细胞和其它树突细胞的特化细胞，它们参与免疫应答的启动和进一步调节。
给予的剂量在很大程度上取决于被治疗者的病况和大小，以及治疗的频率和给予的途径。用于继续治疗的方式，包括剂量和频率，可以由初次应答和临床诊断来指导。例如对于鼻、喉、支气管组织或肺的粘膜，尽管诸如吸入气溶胶制剂的其它胃肠外途径可能在特定给予时需要，但注射到组织间质空间中的胃肠外途径是最好的一个优选途径。另外，可以用口服给予接种，抵抗诸如鼻、肺和鼻窦的粘膜表面的感染性疾病。在优选的方案中，将含有在水性溶媒中的所述多核苷酸/蛋白复合物的制剂注射到组织中，其量由每个位点10μl至每个位点约5ml。在该制剂中多核苷酸/蛋白复合物的浓度由约0.1μg/ml至约20mg/ml，优选范围为100-1000μg/ml
实施例
使用标准技术进行下文的实施例，除非其中另有详述，否则这些技术对于本领域那些技术人员而言是众所周知的常规技术。所述实施例意在说明本发明，但不限制本发明。实施例1．疫苗的制备
A．质粒DNA
使用本领域技术人员熟知的克隆技术，将RSV-F蛋白的编码序列(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.81：7683-7687(1984))(574个氨基酸)克隆到真核表达载体JA4304(Lu等，J.Virol 70：3978-399l(1996))中。概括的说，将RSV-F插入片段作为HindⅢ-EcoRⅤ片段克隆到线性化JA4304中的HindⅢ位点和平端化BgⅢ限制位点上。利用限制性消化分析重组质粒，并在插入位点对其测序。利用Qiagen柱(Maxi-Prep)，接着通过两次苯酚/氯仿萃取、乙醚提取和乙醇沉淀，纯化用于注射的质粒DNA。将该质粒DNA在无菌水中再悬浮，并贮存在-20℃。与此类似，使用来表达HSV gD蛋白的编码序列(McGeoch等，J.Gen.Virol 68：13-38(1987))包含在HindⅢ-Bam HⅠ-BgⅢ双限制片段中，将该限制片段克隆到JA4304 HindⅢ-BgⅢ中。B．蛋白
克隆RSVF和G蛋白的编码序列(Huang等，Virus Res.2：157-173(1985))，并制造嵌合F/G蛋白。很简单的说，是与A.BOLLEN(ULB/CRI，比利时)合作得到包含嵌合构成物的质粒pEE14-FG，该嵌合构成物包括F(1-526)和G(69-298)的氨基酸序列之间的融合物。此FG融合蛋白含有总共755个氨基酸。它起始于F的N-末端信号序列，并没有F糖蛋白的C-末端跨膜区(526-574)。然后，编码区的3＇末端与G糖蛋白的细胞外区融合，该细胞外区没有氨基末端区和羧基末端区。通过将来自pNIV2857(A.Bollen，ULB/CRI，比利时)的FG编码序列作为Asp7181(平端)5＇-HindⅢ(平端)3＇限制片段(2188 bp)插入到pEE14(Celltech)的SmaI位点上，产生pEE14-FG表达质粒。应当理解，有许多本领域已知的可以使用的表达质粒。
用20μg CsCl纯化两次的pEE14-FG质粒DNA，使用磷酸钙/甘油转染步骤转染衍生的CHO K1细胞。按照GS(谷氨酰胺合成酶)表达系统(Crocett等，Bio Techniques，8：662(1990))的步骤选择细胞克隆，并在25微摩尔浓度甲硫氨酸硫代氧胺(MSX)的存在下于不含谷氨酰胺，并补充10％透析的FBS(胎牛血清)的GMEM培养基中扩增。转染后，在24孔板上筛选39个MSX抗性克隆，检测它们上清液中的FG融合蛋白的分泌。用特异性的‘夹心’ELISA测定(即兔多克隆抗FG血清/FG抗原/mAb19)证明所有的转染体对F抗原表达阳性。单克隆抗体19识别构象性F1表位，并是中和性的。
在有限稀释分析中，在96孔板上使用每孔0.07个细胞，单细胞亚克隆3个最好的FG-生产克隆(n°7、13和37)。得到总共59个阳性亚克隆，通过蛋白质印迹和ELISA进一步特征鉴定16个最好的FG-生产者。接着，再扩增8个最好的FG-亚克隆，并在丁酸钠(2mM)或DMSO(1或2％)存在和不存在时估算它们的FG表达。扩增六个亚克隆，并制成细胞小管，储存在-80℃或液氮中。最后，选择3个最好的FG亚克隆。他们是CHOK1 FG°7.18、°13.1和°37.2。
用单克隆mAb19的蛋白质印迹分析(非还原条件)表明FG的主带在大约135 kDa。
在CHO-FG细胞培养基中加入丁酸钠，使FG的表达水平增加了3至12倍，这取决于亚克隆和细胞培养物的生长条件。具体而言，亚克隆CHO-FG13.1在丁酸盐存在下表达的FG蛋白高了8-10倍。
在冷室(4℃-7℃)中解冻冷冻细胞上清液。加入蛋白酶抑制剂(例如1/1000抑肽酶、0.5 mg/升亮抑肽酶、0.5 mM Pefabloc)。将解冻的上清液上柱，用Pharmacia SP Sepharose HPTM或高流速树脂装柱。用20 mM MES pH 6.5，1％thesit(缓冲液D)平衡SP Sepharose HPTM或高流速树脂柱。上样后，用缓冲液D洗涤该柱，直至在280 nm的吸光度回到基线。用含150 mM NaCl，接着用含300 mM NaCl，最后用含1M NaCl的缓冲液D连续洗脱该柱。
用含300mM NaCl的缓冲液D洗脱FG。如果需要，可以在FiltronOMEGA 30或50 kDa膜上浓缩洗脱物。洗脱物无论是否浓缩，都在PBS、1％Tween 80中平衡的Pharmacia Superdex 200TM 16/60柱中上柱并在PBS、1％Tween 80中洗脱。每次上样注入1-3 mg总蛋白(Lowry)。
如上所述，也制备了截短型的重组糖蛋白单纯疱疹病毒(HSV)2型(rgD2t)。这种蛋白和DNA编码序列在本领域是已知的，参见例如EP 139 417B、US5，656，457、WO 92/16231。
制备重组人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)包膜糖蛋白gp120。gp120的表达和DNA编码序列在本领域也是已知的，参见例如US5，653，985、US5，614，612、EP 290 261B。实施例2．小鼠的免疫
A．质粒DNA接种
就在注入前，以10μg/50μl无菌PBS的浓度重悬浮质粒DNA(编码RSV-F蛋白“DNA F”)。两次将50μl这种DNA疫苗注射到麻醉的小鼠的胫骨前肌中；首次注射后四周给予加强注射。在某些组别中，该DNA疫苗只在首次注射中给予。
B．蛋白质接种
FG蛋白疫苗。通过将纯化的FG在150mM NaCl、10mM PO4(pH7.4)中重悬浮，以2μg/50μl的剂量，制备嵌合F/G蛋白(“FG”)。以0.5％的浓度加入苯氧乙醇作为防腐剂。在初次注射前7天制备该蛋白疫苗，并储存在4℃。
C．混合的DNA/蛋白质接种
在首次注射前7天，将每剂量2μg的FG与26.95μl H2O和4.25μl1.5M NaCl、100mM PO4(pH 7.4)混合；另外，加入0.25μl苯氧乙醇作为防腐剂。此制备物储存在4℃。在就分别注射之前(初次或再次)，向此蛋白制备物中加入5.65μl编码F的DNA(相当于10μg)。
以下给出了免疫流程：
初次注射 再次(加强)注射
DNA F 10μgDNA F 10μg PBSDNA F 10μg
DNA F 10μgPBSFG 2μgDNA F 10μg+FG 2μg FG 2μgFG 2μgFG 2μgDNA F 10μg+FG 2μg
实施例3．对给予混合疫苗的血清应答
用混合的DNA/蛋白质疫苗组合物和相应的对照两次免疫小鼠，用以下方法分析它们的血清应答。3．a．方法：酶联免疫吸附测定(ELISA)
用50μl/孔的在PBS中稀释的1μg/ml FG抗原(该板的B至H行)，或用50μl的在PBS中稀释的5μ/ml纯化的山羊抗-小鼠免疫球蛋白抗血清(Boehringer)(行A-IgG标准曲线)，于4℃过夜包被MaxisorpNunc免疫板。于37℃用100μl/孔的PBS BSA 1％Tween 200.1％NBCS4％(饱和缓冲液)对板饱和1小时。然后，将以200ng/ml开始，在饱和缓冲液(每孔50μl)中连续的2倍稀释的IgG(小鼠多克隆抗血清，SIGMA)放入行A中，作为标准；将以1/50稀释度开始，再连续稀释2倍的血清样品用在行B至H；于37℃温育1.5小时。用PBS Tween20(0.1％)洗涤3次。然后，加入在饱和缓冲液中稀释5000倍的生物素酰化山羊抗-小鼠IgG抗血清(Amersham)(50μg/孔)，并于37℃温育1.5小时。如上洗涤3次，随后在30分钟内于37℃加入在饱和缓冲液(50μl/孔)中稀释1000倍的链霉抗生物素酰化辣根过氧化物酶复合物(Amersham)，之后洗涤板5次，并在室温下(于暗处)和50μl/孔的底物溶液(在50mM pH4.5柠檬酸盐缓冲液中的OPDA 0.4mg/ml和H2O2 0.03％)温育15分钟。通过加入H2SO4 2N(50μl/孔)终止反应。在波长492/620nm，在multiscan ELISA读板仪上读取呈色反应。使用SoftMaxPro软件，通过4参数数学方法计算抗体效价。
使用同样的方法，用小鼠单克隆(SIGMA)作为标准，使用同种型特异性生物素酰化山羊抗-小鼠IgGl、IgG2a和IgG2b抗血清(Amersham)，测定样品抗血清的特异性同种型分布。用总的IgG特异性免疫应答的百分比表示同种型分布。3．b．结果
图1(Ig 14 post 2)表示在加强注射后2周在免疫动物中的血清应答。与单独使用各个基质((DNAF或FG)2x)相比，组合两种疫苗基质得到的RSV-FG特异性抗体的量大大增加。混合两种疫苗化合物((DNAF+FG)2x)同在两次单独的注射中，通过用DNA首先引发，接着只用蛋白质(DNAF/FG)加强来给予它们的效果一样。混合的DNA/蛋白疫苗的总的IgG效价比单独两种物质各自效价的和还高，这表明了混合两种疫苗物质的协同作用。
图2(IgG 同种型 14 post 2)显示在不同疫苗组别中的同种型分布。所有的在初次注射中确实接受DNA疫苗的组别都具有高含量的IgG2a，这表示1型的T辅助细胞应答(Th1)，而蛋白质组具有完全相反的倾向，即Th2型应答特有的IgG1同种型。令人惊讶的是，混合的DNA+蛋白质组别也具有高水平的IgG2a同种型。这是意想不到的，因为认为蛋白的直接存在应该使系统导向Th2型应答，并因此影响DNA疫苗，即晚些时候抗原在体内产生。获得的抗体水平增加(图1)这一事实排除了以下可能性：(ⅰ)蛋白在此制剂中无免疫反应性和(ⅱ)观察到的应答只源自DNA疫苗。实施例4．对给予混合疫苗的淋巴组织增生反应
如下评估T辅助细胞活性的诱导和T辅助细胞类型的测定。
4．a．方法：体外检测由小鼠脾脏和淋巴结细胞产生的FG-特异性淋巴组织增生和细胞因子
体外刺激
在再次免疫后15天取出脾脏和髂骨淋巴结。混合属于相同组别的动物的脾脏和淋巴结，温和地在培养基1(RPMI 1640，含有2mM L谷氨酰胺+5×10-2mM 2-巯基乙醇+1mM丙酮酸钠+1x非必需MEM氨基酸+100IU/ml青霉素+100μg/ml链霉素)(5ml/脾细胞，1ml/淋巴结细胞)中研磨，并在RT下以1200rpm离心10分钟。然后在培养基1(3ml/脾脏细胞，1ml/淋巴结细胞)中重悬浮细胞沉淀，在multisizer计数器上对细胞悬浮液计数，并在培养基2(培养基1+1％热失活的正常小鼠血清)中将细胞悬浮液调节至2×106细胞/ml。在U形底96孔板的每个孔加入100μl这些细胞悬浮液。对于特异性的再刺激，使用100μl连续2倍稀释的纯化FG(在培养基2中稀释，范围由每孔1.5至0.023μg)。对照只给予100μl培养基。通过加入100μl终浓度为5μg/ml的ConA(Boehringer)，评估总的刺激。所有的刺激条件都同样进行三次。然后将板于37℃在5％CO2培养箱中分别培育48小时(ConA总刺激)或72小时(FG特异性再刺激)。此后从每个孔中吸取100μl上清液，并用新鲜培养基1(含有3H-胸苷，lμCi/孔(Amersham))替换。在收获前在5％CO2培养箱于37℃再培育18至24小时。当细胞在硝化纤维滤膜上裂解后，在β计数器中测定胸苷掺入。以每一再刺激条件下的cpm(三次的平均值)表示结果。检测细胞因子
如本文上述的同样方式处理脾细胞，除了它们在培养基3(培养基1+10％热失活的FCS)中调节为5.106细胞/ml。向24孔板的每个孔加入1ml这些细胞悬浮液。通过向细胞(培养基用作对照)加入5μg/ml(25μl/孔)的纯化FG抗原再刺激。板于37℃在5％CO2培养箱中培育72小时。吸取上清液，利用Elisa检测细胞因子的存在(IFNγ或IL-5)。分别用50μl/孔的1.5μ/ml大鼠单克隆抗小鼠INFg(Genzyme)或1μg/ml的大鼠单克隆抗小鼠IL5(Pharmingen)(均在0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.5)中稀释)，于4℃过夜包被Maxisorp Nunc免疫板。于37℃用100μl/孔的PBS BSA 1％Tween 20(0.1％)NBCS 4％(饱和缓冲液)对板饱和1小时。然后，将分别以2430 pg/ml或2000 pg/ml开始的在饱和缓冲液中连续2倍稀释的或者IFNg(Genzyme)或者IL5(Pharmingen)(每孔50μl)放入行A中，用作标准。将样品也连续2倍稀释并加入到该板的其它行中。于37℃温育板1.5小时。用PBS Tween20(0.1％)洗涤板3次。然后，于37℃温育在饱和缓冲液中稀释至浓度为0.5或1.0μg/ml(分别)的生物素酰化山羊抗-小鼠IFNg或IL5抗血清(分别为Genzyme和Pharmingen)(50μg/孔)1.5小时。如上洗涤3次，接着在30分钟内于37℃加入在饱和缓冲液中稀释10000倍的AMDEXTM(Amersham)(50μl/孔)，之后洗涤板5次，并在室温下(在暗处)和50μl/孔的TMB底物溶液(Biorad)温育10分钟。通过加入50μl/孔的H2SO4(O.4N)终止反应。在波长450/630nm，在多倍扫描ELISA读板仪上读取颜色强度。使用4参数法，用对应校准曲线的pg/ml IFNg或IL5表示结果。4．b．结果
图3(淋巴组织增生)显示不同疫苗组的脾细胞对用FG抗原体外再刺激的淋巴组织增生。与单价(DNA或蛋白)疫苗或DNA引发+蛋白质加强免疫相比，将两种疫苗化合物组合成一种组合物极大地增加了这种细胞应答。表1(IFNg和IL5)显示了来自增殖细胞的特定细胞因子(IFNγ和IL5)各自的分泌。不管混合疫苗组的淋巴组织增生有多强，Th2细胞因子IL5的分泌总是低。用来测定T辅助细胞应答的Th2型对Th1型的相对比率的INFg/IL-5比率(表2)，和这个组的同种型分布一致(参见图2)，这进一步证实了在混合疫苗组合物中的DNA影响了对Th1型免疫应答的诱导。实施例5．对给予混合疫苗的细胞毒性T细胞应答
如下测定细胞毒性T细胞(CTL)的诱导。
如在以前章节中所述制备脾脏细胞，并在25cm2含有10ml培养基3(参见实施例4)的烧瓶中培养2.107脾细胞(效应细胞)。以10/1(E/S)比率加入RSV感染的原初脾脏细胞(刺激细胞)，刺激这些效应细胞7天(于37℃，7％CO2)。通过于37℃用RSV(MOI 0.5)感染2.106溶血的正常脾脏细胞1.5小时，获得后述的这些刺激细胞。在准备细胞毒性实验时，如下制备EMT6同源靶细胞(由B.Rouse博士，Knoxville提供的H2d乳腺癌细胞)。通过离心收集3×106EMT6，用培养基1洗涤1次，并在200μl培养基1中重悬浮。用对照痘苗病毒(PSCll，阴性对照)或表达RSV-F(MOI 0.1)的重组痘苗病毒，于37℃感染细胞1小时(痘苗病毒得自A.Bollen博士，Brussels)。然后用培养基3将感染的细胞调节至1ml，并于37℃和7％CO2中过夜温育。
然后清洗感染的细胞，通过离心收集，并在50μl FCS中重悬浮。1小时内加入50μl、370MBq/ml的放射性标记的铬酸钠(DuPont)。随后在培养基1中三次清洗靶细胞，计数，并调节至终浓度为2×104靶细胞/ml。对于细胞毒性测定，在不同比率的再刺激效应细胞存在下(E/T比率为100/1-30/1-10/1-3/1-1/1)，在96孔微量培养板的孔中加入载有Cr51的EMT6靶细胞。所有样品以100μl/孔进行两次。然后以800rpm将含有效应细胞和靶细胞的微量培养板离心5分钟，于37℃与CO2下培育4小时。然后，在lumaplate(Packard)上转移50μl上液液，干燥过夜并计数。如下计算裂解的百分比：(cpm样品-cpm自发释放)/(cpm最大(triton3％裂解)-cpm自发释放)×100。结果
图4显示了在不同疫苗组中CTL的存在。正如所料，DNA接种诱导CTL，而非佐剂化的FG蛋白具有的CTL值和对照靶细胞的背景裂解一样。单独给予DNA疫苗确实引发CTL诱导，并进一步用或蛋白(单独)或DNA(单独)加强，基本上不增加这种应答。混合这两种疫苗化合物(DNA+蛋白)并没有影响DNA组分对CTL应答的诱导，因为可以检测出CTL。可以看出，DNA疫苗和非佐剂化蛋白疫苗混合为免疫应答提供额外的范围，即诱导CTL应答。实施例6．对给予混合疫苗的体液应答增加是由于存在编码目的多肽的特定多核苷酸
已经表明，在某些情况下当质粒DNA和异源多肽共同给予时，质粒DNA可以发挥佐剂作用(Sato等，Science 273：352-354(1996))。为了排除是由于质粒DNA的非特异性佐剂作用增强了观察到的在实施例3中描述的体液应答，进行以下的实验。如在实施例3中所述，用下列制备物免疫小鼠：10μg DNA-F、10μg DNA-F+2μg FG(混合抗原)、2μg FG或10μg pJA4304+2μg FG。这后面的一组和混合的抗原组类似，但不同之处在于具有和DNA-F同样的载体骨架的质粒DNA JA4304不表达F多肽。在再次注射后13天分析血清应答。
抗原 IgG平均值(μg/ml) 标准偏差
DNA-F 10μg 5.8 8.2
DNA-F 10μg+FG 2μg 60.8 20.5
FG 2μg 5.1 5.5
DNA-JA4304+FG 2μg 4.4 3.9
从这些结果可以清楚看到：混合两种特定抗原组合物(即多肽FG和DNA-F)，极大地增强了体液应答，并产生协同作用。这种增强取决于编码所述抗原的质粒的存在，因为相似的非编码质粒不能增强所述免疫应答。实施例7．短时延迟给予多肽抗原增强了相应的多核苷酸疫苗的体液应答
多肽抗原比多核苷酸疫苗更快呈递到免疫系统，因为细胞吸收多核苷酸后首先表达编码的多肽。短时延迟输送多肽抗原将这两种免疫原性组合物(实际上)同时呈递到免疫系统。
用下述免疫原两次注射小鼠：30μg DNA-gpl20、10μg gp120蛋白、30μg DNA-gp120接着4天后注射10μg gp120蛋白(延迟蛋白输送)。基本上如实施例3所述，用gp120来捕获抗-gp120特异性抗体，测定体液应答和同种型分布。
图5显示了再次注射后14天总的抗-gp120 IgG效价。在接受两种抗原形式(多核苷酸和多肽)的组别中(其中蛋白延迟4天后给予)IgG效价大幅增加。
图6显示了同种型分布。正如所见，延迟输送蛋白保持的IgG2a效价和由DNA组观察到的一样可观，这同只用蛋白的一组形成强烈对比。实施例8．制备缓释制剂
将20μg抗原gD2t吸附到500μg在H2O(终体积90μl)中的明矾(氢氧化铝)上。加入在乙醇中的聚(己内酯)二醇(平均Mn 2000，软化温度50℃)溶液(5mg/ml：于70℃)，使比率(聚己内酯∶明矾)为10∶1，使温度平衡在25℃。这导致聚己内酯凝聚在明矾颗粒上。产生的包被颗粒通过离心收集，并用水清洗。
对于体外释放动力学，用放射性碘标记的gD2t制备样品。使用Iodogen(Pierce)根据厂商说明书碘标记gD2t。在250mM磷酸钠中进行体外释放动力学。此介质使gD2t由明矾上瞬时释放。在此介质中于37℃温育聚己内酯包被的明矾8天，通过放射性测定检测释放到所述介质中的抗原。对于未包被的明矾，gD2t在10分钟内释放到介质中。对于聚己内酯包被的明矾，在前24小时中有轻微(5％-25％)的释放，接着在8天内缓慢释放。
至于体内研究，将聚己内酯包被的明矾以2μg蛋白对10μg DNA的比率和编码gD的DNA混合。实施例9．用缓释制剂增加对体液应答的诱导
为了让DNA和相应的蛋白质抗原二者同时给予，测试如上所述制备的缓释制剂。用下述抗原组合物(ALOH-PLC表示聚己内酯包被的含gD2t的明矾)注射小鼠：
组别 第0天 第4天
1 10μg DNA-gD
2 10μg DNA-gD 2μg gD/AlOH
3 2μg gD/AlOH
4 10μg DNA-gD+2μg gD/AlOH-PLC
5 2μg gD/AlOH-PLC
初次注射后13天测定体液应答，并列于下表
组别 平均效价(μg/ml) 标准偏差 GMT
1 5.7 3.8 4.4
2 17.3 19.3 11.1
3 1 1.1 0.7
4 16 8.3 13.9
5 0.9 0.5 0.9
由这些结果可以看出，组合的蛋白和DNA免疫导致较强的体液应答诱导。组2(给予DNA后4天给予蛋白)和组4(缓释制剂，同时注射DNA和配制的蛋白)的效价非常相似，这一事实强有力地表明发生了蛋白的缓释，并且在多核苷酸指导表达的时候存在相应的蛋白，极大地增强了由DNA疫苗诱导的体液应答的诱导。正如所见，通过在核酸接种后短时延迟输送多肽，可以实现将来自两种疫苗组合物的多肽实际上同时呈递到免疫系统。
如同每个具体并单独指明的独立出版物通过引用全部结合到本文中一样，将在本说明书中提及的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，通过引用结合到本文中。
虽然上文举例说明了本发明的优选实施方案，但应当理解，本发明不限于本文公开的明确的说明，并保留在下述权利要求范围内出现的所有修改的权利。
表1：            激活加强RSV 14 Post 2
    IgG     IgG1     IgG2a     IgG2b     增殖     IL5     INFg    CTL
    DNAF/PBSDNAF/DNAFPBS/FGFG 2XDNAF/FG(DNAF+FG)2X     1202120149     19131001005732     5177003967     29100041     1387127280786118374190     3003003003672195300     2406106939136032721553     1622651520
 μg/ml     ％     ％     ％     CPM    pg/ml    pg/ml ％Cr 51释放
表2：            RSV 14 Post 2
    INFg     IL5  INFg/IL5比率
    DNAF/PBSDNAF/DNAFPBS/FGFG 2XDNAF/FG(DNAF+FG)2X     2406106939136032721553     3003003003672195300     8.023.561.300.981.495.18
    pg/ml     pg/ml

Claims (24)

1．通过同时给予(ⅰ)编码目的多肽的多核苷酸；和(ⅱ)所述目的多肽，增强核酸接种的免疫应答的方法。
2．权利要求1的方法，其中所述核酸是DNA。
3．权利要求1的方法，其中所述核酸是RNA。
4．权利要求2的方法，其中所述DNA和蛋白混合。
5．权利要求1的方法，其中所述多肽在给予所述多核苷酸后0-10天给予。
6．权利要求5的方法，其中所述多肽在给予所述多核苷酸后3-7天内给予。
7．权利要求1的方法，其中所述多肽存在于缓释制剂中，并和所述多核苷酸同时给予。
8．通过同时给予(ⅰ)编码目的多肽的核酸；和(ⅱ)所述目的多肽，增强多肽接种的免疫应答的方法。
9．权利要求8的方法，其中所述核酸是DNA。
10．权利要求8的方法，其中所述核酸是RNA。
11．权利要求9的方法，其中所述DNA和蛋白混合。
12．权利要求8的方法，其中所述多肽存在于缓释制剂中，并和所述多核苷酸同时给予。
13．权利要求8的方法，其中所述免疫应答是Th1应答。
14．含有DNA+多肽的药用组合物，其中所述DNA编码目的多肽，并且其中DNA：多肽的比率由1000∶1至1∶1(w/w)。
15．权利要求14的药用组合物，其中所述多肽存在于缓释制剂中。
16．权利要求15的方法，其中所述多肽用含有聚(己内酯)或聚(丙交酯-co-乙交酯)的生物可降解聚合物包被。
17．制备按照权利要求14的药用制剂的方法，该方法包括：纯化编码目的多肽的多核苷酸；纯化目的多肽；和混合其组合物。
18．制备按照权利要求15的药用制剂的方法，该方法包括：纯化编码目的多肽的多核苷酸；纯化目的多肽；在缓释制剂中囊化所述目的多肽；和混合其组合物。
19．含有DNA+多肽的疫苗，其中所述DNA编码所述目的多肽，并且其中DNA：多肽的比率由1000∶1至1∶1(w/w)。
20．权利要求19的疫苗，其中所述多肽存在于缓释制剂中。
21．按照权利要求19的疫苗，它含有DNA+多肽和一种合适的佐剂。
22．按照权利要求20的疫苗，它含有DNA+存在于缓释制剂中的多肽以及一种合适的佐剂。
23．混合在一起的DNA+多肽在生产用于增强哺乳动物免疫应答的组合物中的用途。
24．混合在一起的DNA+多肽在生产用于增强哺乳动物免疫应答的组合物中的用途，其中所述多肽存在于缓释制剂中。
CN98813612A 1997-12-16 1998-12-11 增强核酸接种的免疫应答的方法 Pending CN1284883A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9726555.7A GB9726555D0 (en) 1997-12-16 1997-12-16 Vaccine
GB9726555.7 1997-12-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1284883A true CN1284883A (zh) 2001-02-21

Family

ID=10823687

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN98813612A Pending CN1284883A (zh) 1997-12-16 1998-12-11 增强核酸接种的免疫应答的方法

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6500432B1 (zh)
EP (1) EP1037662A1 (zh)
JP (1) JP2002508333A (zh)
KR (1) KR20010024731A (zh)
CN (1) CN1284883A (zh)
AR (1) AR017866A1 (zh)
AU (1) AU740729B2 (zh)
BR (1) BR9814285A (zh)
CA (1) CA2313005A1 (zh)
GB (1) GB9726555D0 (zh)
HU (1) HUP0100197A3 (zh)
IL (1) IL136345A0 (zh)
NO (1) NO20003087L (zh)
NZ (1) NZ504936A (zh)
PL (1) PL341212A1 (zh)
TR (1) TR200001737T2 (zh)
WO (1) WO1999030733A1 (zh)
ZA (1) ZA9811501B (zh)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1200115T3 (da) * 1999-07-22 2006-01-16 Aventis Pharma Inc Erythropoietinformuleringer af multidosistypen
WO2001012223A2 (en) 1999-08-19 2001-02-22 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
EP1964573B1 (en) * 1999-10-22 2014-11-26 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
FR2804026B1 (fr) * 2000-01-21 2004-06-11 Merial Sas Vaccination contre l'herpesvirose canine et vaccins
US7713942B2 (en) * 2001-04-04 2010-05-11 Nordic Vaccine Technology A/S Cage-like microparticle complexes comprising sterols and saponins for delivery of polynucleotides
CU23244A1 (es) * 2001-07-16 2007-10-17 Ct Ingenieria Genetica Biotech Formulacion vacunal potenciada por la combinacion de un adn con un antigeno
WO2003053464A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-03 Aventis Pasteur Limited Immunogenic compositions comprising an antigen and a purified m protein from respiratory syncytial virus
ATE538808T1 (de) * 2002-03-28 2012-01-15 Brenntag Biosector As Kombinierte dns/protein impfstoffzusammensetzungen
ATE348633T1 (de) * 2002-07-05 2007-01-15 Lipoxen Technologies Ltd Verfahren zur verstärkung einer immunantwort von nukleinsäureimpfungen
US20090110702A1 (en) * 2002-07-12 2009-04-30 The Johns Hopkins University Mesothelin Vaccines and Model Systems and Control of Tumors
US9200036B2 (en) 2002-07-12 2015-12-01 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
AU2003259109A1 (en) * 2002-07-12 2004-02-02 The Johns Hopkins University Mesothelin vaccines and model systems
AU2003292136A1 (en) * 2002-11-26 2004-06-18 Eurocine Ab Vaccines against viruses with cationic substances as adjuvants
US8080642B2 (en) * 2003-05-16 2011-12-20 Vical Incorporated Severe acute respiratory syndrome DNA compositions and methods of use
US20060024670A1 (en) * 2004-05-18 2006-02-02 Luke Catherine J Influenza virus vaccine composition and methods of use
TW200613554A (en) * 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
WO2006078979A2 (en) 2005-01-20 2006-07-27 Nature Technology Corp. Vectors and methods for genetic immunization
WO2006110344A1 (en) * 2005-04-07 2006-10-19 Wyeth Novel methods for inducing an immune response against human immunodefiency virus
FR2893254B1 (fr) 2005-11-14 2007-12-21 Biomerieux Sa Composition comprenant un vecteur synthetique colloidal bioresorbable et un vecteur viral et son utilisation prophylactique, therapeutique et diagnostique.
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US8652782B2 (en) 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US9598462B2 (en) 2012-01-26 2017-03-21 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
US8080645B2 (en) 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
EP2333091B1 (en) 2007-05-29 2017-06-21 Nature Technology Corporation Vectors and methods for genetic immunization
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
EP3058954B1 (en) 2007-08-27 2017-03-01 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Immunogenic compositions and methods
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
EP2535428B1 (en) 2007-10-01 2015-09-09 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Biological specimen collection and transport system and methods of use
US9650639B2 (en) 2008-05-19 2017-05-16 Advaxis, Inc. Dual delivery system for heterologous antigens
EP2853269B1 (en) 2008-05-19 2019-05-01 Advaxis, Inc. Dual delivery system for heterologous antigens comprising a recombinant Listeria strain attenuated by mutation of dal/dat and deletion of ActA comprising a nucleic acid molecule encoding an listeriolysin O - prostate specific anigen fusion protein
US9017660B2 (en) 2009-11-11 2015-04-28 Advaxis, Inc. Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of Her2/neu over-expressing tumors
US10016617B2 (en) 2009-11-11 2018-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination immuno therapy and radiotherapy for the treatment of Her-2-positive cancers
KR20180082633A (ko) 2010-05-14 2018-07-18 박스알타 인코퍼레이티드 Ｏｓｐａ 키메라 및 백신에서 그의 용도
AU2011276234B2 (en) 2010-07-06 2016-02-25 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Liposomes with lipids having an advantageous pKa- value for RNA delivery
EP3243526B1 (en) 2010-07-06 2019-11-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Delivery of rna to trigger multiple immune pathways
JP5940064B2 (ja) 2010-07-06 2016-06-29 ノバルティス アーゲー 低用量のｒｎａを用いた大型哺乳動物の免疫化
PT4226941T (pt) 2010-08-31 2024-11-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipossomas peguilados para entrega de arn codificador de imunogénio
EP2621527A4 (en) 2010-10-01 2015-12-09 Univ Pennsylvania USE OF LISTERIA VACCINE VECTORS TO REVERSE VACCINE IMMUNITY IN PATIENTS WITH PARASITIC INFECTIONS
EP3520813B1 (en) 2010-10-11 2023-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
CA2829960A1 (en) 2011-03-11 2012-09-20 John Rothman Listeria-based adjuvants
CA2841047A1 (en) 2011-07-06 2013-01-10 Novartis Ag Immunogenic compositions and uses thereof
EP2729165B1 (en) 2011-07-06 2017-11-08 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
CN103239734B (zh) * 2012-02-10 2016-02-24 北京艾棣维欣生物技术有限公司 用于预防和/或治疗呼吸道合胞病毒感染的疫苗
AU2013232291B8 (en) 2012-03-12 2016-07-21 Advaxis, Inc. Suppressor cell function inhibition following listeria vaccine treatment
AU2013293448A1 (en) 2012-07-27 2015-02-05 Baxalta GmbH Compositions comprising chimeric OspA molecules and methods of use thereof
KR20170052569A (ko) 2014-07-18 2017-05-12 어드박시스, 인크. 전립선암 치료용 pd-1 길항제 및 리스테리아 기반 백신의 병용
MA41644A (fr) 2015-03-03 2018-01-09 Advaxis Inc Compositions à base de listeria comprenant un système d'expression de minigènes codant pour des peptides, et leurs procédés d'utilisation
WO2016183292A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
CN110168093B (zh) * 2017-09-12 2023-08-15 中科蓝华(广州)生物医药技术有限公司 一种转染细胞内寄生虫的试剂盒及其应用
JP7284156B2 (ja) 2017-09-19 2023-05-30 アドバクシス， インコーポレイテッド 細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の凍結乾燥のための組成物および方法
CA3184128A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Kathleen Barnes Methods for diagnosing respiratory pathogens and predicting covid-19 related outcomes

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6168804B1 (en) * 1995-06-07 2001-01-02 University Of Alberta Method for eliciting Th1-specific immune response
JP2000505802A (ja) * 1996-02-12 2000-05-16 コブラ セラピューティクス リミテッド ワクチン接種の新規な方法、ならびにそのための、第１のエピトープをコードする核酸および第２のエピトープを含有するペプチドを含むワクチン
US6093400A (en) * 1996-08-09 2000-07-25 Cel Sci Corporation Modified HGP-30 peptides, conjugates, compositions and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
NO20003087L (no) 2000-08-08
US20030072768A1 (en) 2003-04-17
BR9814285A (pt) 2000-10-03
HUP0100197A3 (en) 2003-11-28
AU740729B2 (en) 2001-11-15
CA2313005A1 (en) 1999-06-24
NZ504936A (en) 2002-09-27
WO1999030733A1 (en) 1999-06-24
US6500432B1 (en) 2002-12-31
AU1967899A (en) 1999-07-05
HUP0100197A2 (hu) 2001-05-28
KR20010024731A (ko) 2001-03-26
AR017866A1 (es) 2001-10-24
NO20003087D0 (no) 2000-06-15
ZA9811501B (en) 2000-06-15
PL341212A1 (en) 2001-03-26
IL136345A0 (en) 2001-05-20
EP1037662A1 (en) 2000-09-27
JP2002508333A (ja) 2002-03-19
GB9726555D0 (en) 1998-02-11
TR200001737T2 (tr) 2000-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1284883A (zh) 增强核酸接种的免疫应答的方法
CN1122530C (zh) 疫苗
US12186390B2 (en) Vaccine delivery method
EP2184067B1 (en) Severe acute respiratory syndrome DNA vaccine compositions and methods of use
CZ246795A3 (en) Vaccine and process for preparing thereof
CN1997391A (zh) 以聚肌苷酸－聚胞苷酸为主的佐剂
CN101163500A (zh) 含有聚-γ-谷氨酸的用作佐剂的合成物
JP4638880B2 (ja) アルキルホスファチジルコリン配合ワクチン組成物
WO2022233629A1 (en) Sars-cov-2 subunit vaccine
CN1434864A (zh) 增强对单纯疱疹病毒疫苗的免疫应答的方法
EP2464379B1 (en) Vaccine having a peptide adjuvant for eliciting a specific immune response to treat influenza viral infection
US20240316183A1 (en) Sars-cov-2 subunit vaccine
EP1490100B1 (en) Combined dna/protein vaccine compositions
EP1594537B1 (en) Vaccination or immunization using a prime-boost regimen against brsv, bhv-1, bvdv, bpi-3
US20240316178A1 (en) Recombinant protein vaccines formulated with enantio-specific cationic lipid r-dotap and methods of use thereof
JP2016512841A (ja) 多価ワクチンによるｂ．トレハロシ感染に対するウシの干渉効果
JP2001253833A (ja) 生ワクチンの細胞性免疫活性を不活化ワクチンにも起こさせる方法、及びこれより得られる混合ワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication