CN1281336A - 使用病毒来治疗赘生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够复制并因而杀死在IFN介导的抗病毒应答缺陷的赘生细胞的病毒,以及它们在治疗瘤性疾病包括癌症和大肿瘤中的使用。在这点上,RNA和DNA病毒都有用。本发明还涉及用于癌症治疗的这种病毒的选择、设计、纯化和使用。
Description
发明领域
本发明涉及能够在干扰素(IFN)介导的抗病毒应答缺陷的的瘤细胞中复制并导致瘤赘生细胞死亡的病毒。在这点上，RNA和DNA病毒都有用。本发明还涉及使用这些病毒来治疗赘生性疾病包括癌症和大肿瘤。
发明背景
赘生性疾病包括癌症是造成人类死亡的主要原因之一。在美国每年诊断的新癌症病例超过一百三十万，并且550，000例死亡。在癌症扩散到身体的继发部位之前尽早检测到癌症，将大大提高宿主的存活机会。但是癌症的早期检测并不总是可能的，而且即使可能，治疗也不令人满意，特别在高恶性癌症时。癌症治疗包括化疗和放疗在晚期效果不佳，特别是当瘤生长很快和／或形成较高肿瘤负荷时。(见Hillard Stanley，Cancer Treat，Vol．1，Jan／Feb 1977，p．29-36，Tannock，Cancer Research，42，4921-4926，Dec．1982)。
与暴露于多种病毒有关的肿瘤消退已有报道。已经介绍的病毒多数对人来说是致病性的，包括流行性腮腺炎和麻疹。其他特殊病毒对特定类型的癌症细胞的影响也已有介绍。Smith等，(1956)Cancer，9，1211(腺病毒对宫颈癌的影响)；Holzaepfel等，(1957)Cancer，10，557(腺病毒对上皮细胞瘤的影响)；Taylor等，(1970)J．Natl．Cancer Inst．，44，515(牛肠道病毒-1对内瘤的影响)；Shingu等，(1991)J．General Virology，72，2031(牛肠道病毒MZ-468对F-647a白血病细胞的影响)；Suskind等，(1957)PSEBM，94，309(柯萨奇B3病毒对HeLa肿瘤细胞的影响)；Rukavishnikova等，(1976)Acta Virol．，20，387(流感A株对腹水瘤的影响)。
最早的文献介绍了在用活的减毒病毒疫苗进行免疫接种以对抗天花或狂犬病的病人中的部分肿瘤消退。见Depace，N．G．(1992)Ginecologia，9，82-88；Salmon，P．＆ Baix(1992)Compt．Rend．Soc．Biol．，86，819-820。肿瘤的部分消退和白血病的消退也在天然存在的麻疹感染中被注意到。见Pasquinucci，G．(1971)Lancet，1，36；Gross，S．(1971)Lancet，1，397-398；Bluming，A．Z．和Ziegler，J．L．(1971)Lancet 2，105-106。在一个有意用活的腮腺炎病毒对90例癌症病人进行感染的研究中，79例中发现部分的肿瘤消退。见Asada(1994)Cancer，34，1907-1928。这些病毒的副作用是暂时的，主要考虑的是用这些人类病原体进行感染的严重后遗症。
★ ★ ★
病毒分类如下[见Murphy A和Kinsbury DW，1990，见《病毒学》第2版(Ed．Fields，B．N．)，Raven Press，New York，pp9-35]：分类特征 病毒科名称单股RNA，正链， 微核糖核酸病毒科，嵌杯样病毒科
非分段，
非包膜单股RNA，正链， 披盖病毒科，黄病毒科
非分段， 日冕形病毒科
包膜单股RNA，负链， 弹状病毒科，Filoviridae
非分段， 副粘病毒科
包膜单股RNA，负链， 正粘病毒科
分段，包膜单股RNA，正负链， 布尼安病毒科，
分段，包膜 嵌沙样病毒科双股RNA，正链， 呼肠孤病毒科，Birnaviridae
分段，
非包膜单股RNA，复制过程中含DNA步骤 逆转录病毒科
正链，
非分段，
包膜DNA病毒单／双股DNA，非包膜 嗜肝DNA病毒科单股DNA，非包膜 细小病毒科双股DNA，非包膜 乳多空病毒科，腺病毒科双股DNA，包膜 疱疹病毒科，痘病毒科
虹色病毒科
疱疹病毒科(或疱疹病毒)包括甲型疱疹病毒亚科(包括水痘病毒属和单纯疱疹病毒属)、乙型疱疹病毒亚科和丙型疱疹病毒亚科。
新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科(或副粘病毒)的一个成员。NDV的天然宿主是鸡和其他鸟类。NDV通常与动物宿主细胞表面上的特定分子结合，与细胞表面融合，并将其遗传物质注入宿主。NDV是一种杀细胞型病毒。一旦进入细胞，病毒基因将指导宿主细胞产生多个病毒拷贝，导致宿主细胞死亡，释放NDV拷贝，后者感染其他细胞。不像某些病毒，已知NDV不会导致任何严重的人类疾病。不像其他种类的病毒(例如HTLV-1、乙型肝炎病毒)，已知副粘病毒不是致癌性的。
已有报道在少数接触NDV的病人中肿瘤暂时消退，见Csatary，L．K．(1971)Lancet，2，825。Csatary在其养鸡场中的鸡流行新城疫时发现了一种胃肠道癌症的消退。在一个相似的趣闻报道中，Cassel，w．A．和Garrett，R．E．(1965)Cancer，18，863-868注意到，在一个病人中，在将NDV注射到宫颈瘤后，已经扩散到淋巴结的原发性宫颈癌消退。因为杀肿瘤活性的机制被认为是免疫性的，没有进行工作来确定这种病毒的直接肿瘤细胞毒活性。相反，工作集中在NDV的免疫调节影响上。见诸如，Murray，D．R．，Cassel，w．A．，Torbin，A．H．，Olkowski，Z．L．＆ Moore，M．E．(1977)Cancer 40，680；Cassel，W．A．，Murray，D．R．，＆ Phillips，H．S．(1983)Cancer 52，856；Bohle，W．，Schlag，PJ．，Liebrich，W．，Hogenberger，P．，Manasterski，M．，Miller，P．，和Schirrmacher，V．(1990)Cancer，66，1517-1523。
用于肿瘤消退的特殊病毒的选择过去是基于上述引文中的偶然发现或试验和错误。直到最近，合理的、以机制为基础的将病毒用于癌症治疗的方法才使用DNA病毒发展起来。这种类型的方法的例子可见于仅在特殊组织来源的肿瘤中复制(Rodriguez，R．et al，1997Cancer Res．，57：2559-2563)或缺乏某些关键调节蛋白(Bischoff，JR．et al，1996 Science，274：373-376)的重组腺病毒载体的发展中。另一个最近的方法是使用一种复制不完全的重组腺病毒载体来在某些肿瘤细胞中重建丧失的关键蛋白功能(Zhang，WW，et al，1994Cancer gene therapy，1：5-13)。最后，单纯疱疹病毒也被遗传改造来优先在快速分裂的细胞中复制，后者是肿瘤的特征(Mineta，T．，et al，1994 Cancer Res．，54：3963-3966)。
美国申请系列号08／260，536在此全文引入作为参考，它公开了在癌症治疗中NDV或其他副粘病毒的使用。病毒IFN转基因的表达
一种使用病毒疗法来治疗癌症的常规方法是使用病毒载体来向肿瘤实体传递特定的基因。
重组腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒和逆转录病毒都已被修饰来单独表达一种干扰素基因或与其他细胞因子基因组合表达。
在Zhang et al．(1996)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93：4513-4518中，一种表达人干扰素共有(即合成的)基因的重组腺病毒被用来在裸鼠中治疗人乳腺癌(和其他)的异种移植物。作者得出了以下结论：“…一种使用低病原性病毒的病毒溶癌作用的组合，而它自身对IFN和IFN基因治疗的作用有抗性，可能是治疗多种不同肿瘤尤其是乳腺癌的有效方法。”与涉及干扰素敏感病毒的本发明相反，Zhang等人(1996)介绍了在肿瘤治疗中使用干扰素抗性的腺病毒。
在Zhang等((1996)Cancer Gene Ther．，3：31-38)中，表达共有IFN的腺伴随病毒被用来在体外转导人肿瘤细胞，接着注射进裸鼠。转导的肿瘤既不形成肿瘤，也不比非转导的对照生长缓慢。而且，在将一种转导的人肿瘤细胞注射进另一个肿瘤实体中时，非转导肿瘤的大小减小。
在Peplinski等((1996)Ann．Surg．Oncol．，3：15-23)中在一个小鼠乳腺癌模型中检测了γ-干扰素(以及其它细胞因子，单独或组合表达)。小鼠用重组痘苗病毒修饰的肿瘤细胞免疫。当再用肿瘤细胞攻击时，用病毒修饰的细胞免疫的小鼠在无病生存时间上有统计学意义上的提高。
Gastl等((1992)Cancer Res．，52：6229-6236)使用表达γ-干扰素的逆转录病毒载体在体外转导肾癌细胞。这些细胞显示能产生较高数量的对免疫系统的功能非常重要的多种蛋白。
Restifo等((1992)J．Exp．Med．，175：1423-1431)使用表达γ-干扰素的逆转录病毒载体转导一种鼠肉瘤细胞系，使肿瘤细胞能更有效地将病毒抗原呈递给CD8+T细胞。
Howard等((1994)Ann．NY Acad．Sci．，716：167-187)使用表达γ-干扰素的逆转录病毒载体转导鼠和人的黑素瘤细胞。这些细胞被观察到能提高对免疫功能重要的蛋白的表达。这些细胞与未转导的亲本细胞系相比在小鼠中也具有较低的致瘤性，并在体内产生一种肿瘤特异性的CTL应答的激活。使用治疗剂量的干扰素作为癌症病毒疗法的佐剂
因为已知干扰素的免疫增强活性，因此几项研究检测了干扰素蛋白与其它癌症病毒疗法组合的应用。在Kirchner等((1995)World J．Urol．，13：171-173)中，208位病人用自体的、NDV修饰的、和致死性照射的肾细胞癌瘤细胞免疫，并用低剂量的IL-2或IFNα共同处理。作者指出，这种治疗方案在局部发展的肾细胞癌的病人中相对天然进程能产生很大的改善。剂量为大约3．3×103至2．2×105PFU／kg。这是一种局部疗法，与系统性方法相对，其目的是诱导一种抗肿瘤免疫应答。
Tanaka等((1994)J．Immunother．Emphasis Tumor Immuno1．，16：283-293)将IFNα和一种重组痘苗病毒一起给药来作为小鼠中的癌症痘苗治疗模型。该研究显示，接受IFN的小鼠与未接受的小鼠相比，存活性有统计学意义上的提高。作者将IFN的作用归因于这些动物中CD8阳性T细胞的诱导。
Arroyo等((1990)Cancer Immunol．，31：305-311)使用小鼠结肠癌模型来检测IFNα和／或IL-2协同疗法对痘苗病毒结肠溶癌(VCO)性癌症治疗的影响。他们发现在这种小鼠模型中VCO+IL-2+IFN三联疗法最为有效。这种方法依赖于免疫作为抗肿瘤活性的机制。
在这些研究中，IFN被用来提高癌细胞被免疫系统识别的能力。
★ ★ ★
发明目的本发明的一个目的是提供用于疾病包括癌症治疗的病毒。本发明的一个进一步的目的是提供用于赘生性疾病包括癌症治疗的病毒。本发明的一个进一步的目的是提供一种方法，通过这种方法可以选择和／或筛选用于赘生性疾病治疗的候选病毒。本发明的一个进一步的目的是为增强病毒在赘生性疾病治疗中的治疗用途而对其进行遗传改造提供指导。本发明的一个进一步的目的是提供一种方法，在目标是评价候选靶细胞对病毒杀伤的敏感性时，通过该方法来筛选用于病毒治疗的潜在靶细胞。本发明的另一个进一步的目的是在病毒治疗的管理中提供指导。本发明的一个目的是提供一种治疗大型肿瘤的方法。本发明的一个进一步的目的是提供纯化的病毒和获得纯化病毒的方法。
发明简述
本发明涉及在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒给药于哺乳动物，所说的病毒选自RNA病毒和腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、虹色病毒和疱疹病毒的DNA病毒。
本发明还涉及在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括系统地将干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒给药于哺乳动物。
本发明还涉及一种在哺乳动物中治疗赘生物包括癌的方法，包括将治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒给药于哺乳动物，所说的病毒选自RNA病毒和腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、虹色病毒和疱疹病毒的DNA病毒科。
本发明还涉及在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的克隆痘苗病毒给药于哺乳动物，所说的痘苗病毒在一种或多种参与阻断干扰素的抗病毒活性的基因中具有一个或多个突变，所说的基因选自K3L、E3L和B18R基因。
本发明还涉及一种在哺乳动物中治疗赘生物包括癌的方法，包括将治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的、克隆痘苗病毒给药于哺乳动物，所说的痘苗病毒在一种或多种参与阻断干扰素的抗病毒活性的基因中具有一个或多个突变，所说的基因选自K3L、E3L和B18R基因。
本发明还涉及在哺乳动物中用病毒感染大小至少为1cm的赘生物的方法，包括将选自(1)RNA病毒、(2)嗜肝DNA病毒、(3)细小病毒、(4)乳多空病毒、(5)疱疹病毒、(6)痘病毒和(7)虹色病毒的克隆病毒给药于哺乳动物。
本发明还涉及一种在哺乳动物中治疗赘生物包括癌的方法，包括将治疗有效量的选自(1)RNA病毒、(2)嗜肝DNA病毒、(3)细小病毒、(4)乳多空病毒、(5)疱疹病毒、(6)痘病毒和(7)虹色病毒的克隆病毒给药于哺乳动物，其中赘生物的大小至少为1厘米。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗肿瘤的方法，包括将治疗有效量的对该肿瘤有杀细胞能力的RNA病毒给药于哺乳动物，其中哺乳动物具有至少占全部体重1．5％的肿瘤负荷。
本发明还涉及筛选新取自病人的肿瘤细胞或组织来确定细胞或组织对一种病毒杀伤作用的敏感性的方法，包括将细胞或组织用于一种使用干扰素敏感病毒的差别细胞毒试验。
本发明还涉及鉴别在哺乳动物中具有抗瘤活性的病毒的方法，包括a)使用待测病毒感染Ⅰ)IFN介导的抗病毒活性有缺陷的细胞和Ⅱ)IFN介导的抗病毒活性完全的细胞，和b)确定相对于IFN介导的抗病毒活性完全的细胞，待测病毒是否能优先杀死IFN介导的抗病毒活性缺陷的细胞。
本发明还涉及制备用于抗瘤治疗的病毒的方法，包括a)通过消除或删除一种病毒机制以使IFN的抗病毒作用失活来修饰现存的病毒，并且可以可选地b)产生能导致比所说的现存的病毒毒性低的减毒突变。
本发明还涉及在用病毒处理的哺乳动物中控制病毒复制的方法，包括给予一种抗病毒化合物，所说的病毒选自RNA病毒和腺病毒、痘病毒、虹色病毒、细小病毒、嗜肝DNA病毒、水痘疱疹病毒、乙型疱疹病毒和丙型疱疹病毒。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗或感染赘生物的方法，包括将来自哺乳动物的样品(例如血清、肿瘤细胞、肿瘤组织、肿瘤切片)进行免疫分析，来检测病毒受体存在的数量，以确定赘生物是否允许病毒结合并导致细胞裂解，以及确定受体是否存在，该方法包括将一种干扰素敏感的、复制活性的、克隆的、能与受体结合的病毒给药于哺乳动物。
本发明还涉及在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括系统地将脱敏剂量的一种干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒给药于哺乳动物。
本发明还涉及在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒经过一个至少4分钟的过程给药于哺乳动物。
本发明还涉及在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括用选自新城疫病毒毒株MK107、新城疫病毒毒株NJ Roakin、Sindbis病毒和水疱性口炎病毒的复制活性的克隆病毒进行给药。本发明包括：Ⅰ)通过超离但不沉淀纯化的副粘病毒；ⅱ)纯化至每毫克蛋白至少2×109 PFU水平的副粘病毒；ⅲ)纯化至每毫克蛋白至少1×1010 PFU水平的副粘病毒；ⅳ)纯化至每毫克蛋白至少6×1010 PFU水平的副粘病毒；ⅴ)纯化至每毫克蛋白至少2×109 PFU水平的RNA病毒；ⅵ)纯化至每毫克蛋白至少1×1010 PFU水平的RNA病毒；ⅶ)纯化至每毫克蛋白至少6×1010 PFU水平的RNA病毒；ⅷ)一种杀细胞性DNA病毒，它对干扰素敏感，并被纯化至每毫克蛋白至少2×109 PFU水平；ⅸ)一种复制活性的痘苗病毒，它a)在K3L、E3L和B18R基因中的一个或多个中具有一个或多个突变，和b)在编码胸苷激酶、核糖核苷酸还原酶、痘苗生长因子、胸苷酸激酶、DNA连接酶、dUTP酶的基因的一个或多个中具有减毒突变；ⅹ)在选自K3L、E3L和B18R的两个或更多基因中具有一个或多个突变的一种复制活性痘苗病毒；ⅹⅰ)在(2’-5’)A类似物的表达中具有一个修饰，从而导致疱疹病毒具有更高干扰素敏感性的一种疱疹病毒；以及ⅹⅱ)在ω3中有一个减毒突变，从而使所说的病毒变成干扰素敏感的一种呼肠孤病毒。
本发明还包括以下方法：
Ⅰ)一种纯化RNA病毒的方法，包括a)制备一种克隆病毒；并b)通过超离但不沉淀来纯化所说的克隆病毒；或c)通过切向流过滤并接着进行或不进行凝胶渗透色谱来纯化所说的克隆病毒；以及
ⅱ)一种纯化副粘病毒的方法，包括通过超离但不沉淀来纯化病毒，或通过切向流过滤并接着进行或不进行凝胶渗透色谱来纯化病毒。
本发明还涉及在哺乳动物中治疗疾病的方法，其中疾病细胞在干扰素介导的抗病毒应答中有缺陷，包括向哺乳动物给予治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒。
附图简述
图1显示抗β干扰素抗体在NHEK(正常人上皮角质细胞)中对病毒抗原表达和感染滴度的影响。
图2显示β干扰素在不同细胞(正常人皮肤成纤维细胞CCD922-sk和两种类型的头和颈癌细胞(KB和Hep2细胞))中对病毒抗原表达的影响。
图3A显示干扰素在CCD922-sk细胞中对病毒抗原表达的影响。
图3B显示干扰素在KB细胞中对病毒抗原表达的影响。
图4显示携带人ES-2卵巢癌细胞并用盐水或NDV毒株PPMK107处理的无胸腺小鼠的生存曲线。
图5显示多种人肿瘤和正常细胞系的干扰素应答。
发明详述
本发明涉及一种新机制的发现，通过这种机制，病毒复制选择性地杀死干扰素(IFN)介导的抗病毒应答缺陷的赘生细胞。本发明还提供选择、设计、纯化和使用病毒来治疗赘生疾病包括癌症和大型肿瘤的方法。本发明的病毒选择性地在赘生细胞中复制并杀死细胞，其基础在于这些细胞中IFN介导的抗病毒应答选择性的缺陷。给予适当剂量的病毒将导致赘生细胞死亡，而正常细胞由于拥有完整的IFN介导的抗病毒应答，能限制病毒的复制，并且不会被杀死。
本发明的主题包括使用副粘病毒例如NDV和其它病毒，来用于疾病包括赘生性疾病例如癌症的治疗。本发明还介绍其它适用于治疗赘生性疾病的其它病毒的筛选和遗传操作。本发明另一个实施方案涉及鉴别能作为病毒疗法候选者的肿瘤组织的方法。最后，本发明还介绍了高纯病毒的制备。使用干扰素敏感的病毒包括NDV治疗赘生性疾病的原理证明NDV对肿瘤细胞的选择性杀伤
新城疫病毒对多种人肿瘤细胞能产生选择性细胞毒作用，而对正常的人细胞的影响则明显低。在一个差别性细胞毒试验中，来自内瘤、黑素瘤、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞和非小细胞肺癌、成蚀质细胞瘤的人癌细胞被发现对NDV的敏感性比多种正常人细胞(肾上皮细胞、成纤维细胞、角质细胞、黑素细胞和内皮细胞(见实施例1))高大约3-4个数量级。差别细胞毒试验还可用于来自病人细胞或肿瘤组织的新鲜分离物。
如实施例1中的介绍，一种体外试验被用来确定NDV的杀瘤活性。该试验测量了在5天期间杀死50％的待测细胞培养物所需的病毒数量。实施例2和实施例3显示了体内实验的结果，其中病毒通过肿瘤内途径(实施例2)或静脉途径(实施例3)给药于携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠。这些结果证明，NDV能在用于检测潜在化疗试剂的标准动物模型中导致多种人肿瘤类型的消退。
NDV特异性地在肿瘤中复制，该证据通过对病毒抗原的免疫组化染色被证明(实施例2)。在肿瘤内病毒注射30分钟内，肿瘤组织的病毒抗原为阴性。但在处理后的2天后，在肿瘤中可观察到大量的病毒抗原的免疫染色，这说明病毒在肿瘤中复制。重要的是，病毒复制对肿瘤组织有特异性，因为相邻的结缔组织和皮肤的病毒抗原为阴性。
重要的是，NDV的有效复制对病毒杀死感染细胞是关键，如使用UV失活的非克隆病毒的研究中所证实的(Lorence，R．，et al，1994J Natl Cancer Inst，86：1228-1233)。
NDV还可在肿瘤内和静脉给药后导致大肿瘤的消退(实施例4至9)。在无胸腺小鼠中用NDV治疗大的皮内A375人黑素瘤异种移植物(在最大径向≥10mm；肿瘤体积≥300mm3)，将导致高速的肿瘤消退(实施例4至8)。在无胸腺小鼠中用NDV经静脉治疗大的皮下HAT1080人纤维肉瘤异种移植物(最大径向≥10mm)，在6只小鼠的5只中导致完全的或部分的肿瘤消退(实施例9)。细胞因子中的I型干扰素是病毒感染的重要负性调节剂
I型干扰素包括IFNα和IFNβ，IFNα最初发现于造血来源的细胞，而IFNβ最初发现于成纤维细胞和上皮细胞。[Joklik，W．K．1990．Interferons．pp383-410．《病毒学》，第二版，B．N．Fields，D．M．Knipe等编辑，Raven PressLd．，New York；和Sreevalsan，T．1995．Biological Therapy with Interferon-αand β：PreclinicalStudies．pp347-364．《癌症生物治疗》第二版，V．T．DeVita，Jr．，S．Hellman和S．A．Rosenberg，J．B．编辑．Lippincott Company，Philadelphia]。两种类型的IFN都通过明显相同的作用机制起作用，包括降解病毒复制的双链RNA中间产物和抑制通过由双链RNA激活的一种蛋白激酶活性的细胞翻译(Joklik，W．K．1990．Interferons．pp383-410．《病毒学》，第二版，B．N．Fields，D．M．Knipe等编辑，Raven Press Ld．，New York，及其参考文献)。数种病毒(流感、EBV、SV40、腺病毒、痘苗病毒)已经进化了多种机制，通过这些机制，IFN系统的一个或多个系统被失活，从而使病毒有效复制(Katze，M．G．1995．Trends in Microbiol．3：75-78)。多种肿瘤细胞缺少通过IFN依赖的机制限制病毒感染的能力
人宫颈癌细胞(Hela)与非转化的成纤维对照细胞系相比，在用IFN处理后，对水疱性口炎病毒复制的抑制的敏感性要低300多倍(Maheshwari R．K．，1983．Biochem．Biophys．Res．Comm．17：161-168)。本发明发现，致瘤性人头和颈癌细胞(KB)与正常人皮肤成纤维细胞(CCD922-sk)的共培养物的感染将导致病毒最初在两种细胞类型中复制，接着在正常细胞中感染被限制，与此相对，病毒在肿瘤细胞中继续复制并杀死肿瘤细胞(实施例10)。而且，虽然IFN正被正常细胞分泌到培养基中，但肿瘤细胞不能对正被产生来建立抗病毒状态浓度的IFN产生应答。IFN在肿瘤细胞相对正常细胞被NDV杀伤的不同敏感性中的作用的进一步证据由两个独立的实验获得，其中正常成纤维细胞(CCD922-sk)或正常上皮角质细胞(NHEK)显示在存在针对IFN的中和抗体时变得对NDV的感染更敏感(实施例11和12)。最后，在存在IFN时正常成纤维细胞(CCD922-sk)和人肿瘤细胞(KB)的平行感染显示，正常细胞比肿瘤细胞对加入的IFN的抗病毒作用至少敏感100倍(实施例13和14)。对不同肿瘤细胞系(总数为9)的相似检测显示了在一种细胞系对NDV杀伤作用的相对敏感性与细胞系不能显示干扰素介导抗病毒应答(实施例26)之间的明显相关性。干扰素和细胞生长
干扰素有多个种类，包括α-IFN、β-IFN、ω-IFN和γ-IFN的天然和重组形式以及合成的共有序列形式(例如Zhang等(1996)CancerGene Therapy，3：31-38的介绍)。除了导致其被发现的抗病毒活性，目前已知IFN在细胞生长和分化的正常调节中起重要作用。IFN被视为生长的负调节因子，数种参与IFN活性的功能和调节的关键蛋白已显示是在正常细胞中作为肿瘤抑制蛋白起作用(Tanaka et al．1994Cell 77：829-839)。而且，几种已知拮抗IFN的抗病毒作用的其它蛋白已显示在不适当表达时具有致癌能力。(见下文，Barber，GN，1994．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91：4278-4282)。来自多种人癌的细胞已显示在编码IFN的基因中有删除(James，CD，et al．1991，Cancer Res．51：1684-1688)，并且在人宫颈癌(Pitricoin，E．etal，1994 Mol．Cell．Bio．，14：1477-1486)、慢性淋巴性白血病(Xu，B．et al，1994，Blood，84：1942-1949)和恶性黑素瘤细胞(Linge，C．，et al．1995，Cancer Res．，55：4099-4104)中已观察到IFN功能的丧失。
IFN诱导的蛋白激酶(p68)已显示是细胞和病毒蛋白合成的重要调节物。一种将p68激酶的表达或活性与细胞的分化状态联系起来的相关性已经出现。这样，分化较低的细胞例如那些出现于多种癌症中的细胞缺少p68功能(Haines，G．K．，et al．，1993 Virchows ArchB Cell Pathol．63：289-95)。缺少p68活性的细胞通常对病毒介导的杀伤敏感，因为p68激酶是IFN诱导的抗病毒状态的重要的效应器。p68的抗病毒活性可通过与一种名为p58的细胞蛋白直接作用来拮抗。当在NIH3T3细胞中克隆和过量表达时，p58导致细胞显示转化表型和贴壁不依赖生长(Barber GN et al．，1994 Proc Natl Acad SciUSA 91：4278-4282)。并且多种人白血病细胞系已显示过量表达p58蛋白(Korth MJ，et al．，1996 Gene 170：181-188)。未分化细胞对病毒杀伤的敏感性可通过诱导更多的分化表型来逆转(Kalvakolanu，DVR and Sen，G．C．1993 Proc Natl Acad Sci USA 90：3167-3171)。
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定义干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞
用于此处，“干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞”是指这样一种细胞，它能对低水平(例如10单位／ml)的外源干扰素产生应答，即与不存在干扰素时相比，能显著减少(至少10倍，更优选至少100倍，更优选至少1000倍，最优选至少10000倍)一种干扰素敏感的病毒的复制。病毒复制的程度可通过测量病毒的数量(例如感染性病毒、病毒抗原、病毒核酸)来测定。CCD922正常成纤维细胞是干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞。干扰素介导的抗病毒应答缺陷的细胞
用于此处，“干扰素介导的抗病毒应答缺陷的细胞”一词是指不能满足上面列出的干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞的标准的细胞，也就是说，与不存在干扰素时相比，它们不能通过显著减少一种干扰素敏感的病毒的复制来对低水平(例如10单位／ml)的外源干扰素产生应答。KB口腔癌细胞是干扰素(IFN)介导的抗病毒应答缺陷的病毒。克隆
“克隆”病毒一词的使用在这里定义为来源于一个单一的感染性病毒颗粒的病毒，以及单个分子克隆具有明显的核酸序列同源性的病毒。例如，序列的同源性至少是，来自病毒群体的8个克隆的序列在300个以上的连续核苷酸上同源性大于95％，更优选大于97％，更优选大于99％，最优选为100％。杀细胞性
用于此处，“杀细胞性”病毒一词指一种能感染细胞并导致细胞死亡的病毒。脱敏剂量
用于此处，术语“脱敏剂量”指减低病毒给药后副作用所需的病毒的数量。差别细胞毒试验
用于此处，使用一种病毒来筛选肿瘤细胞或组织的“差别细胞毒试验”这一术语是指(a)肿瘤细胞和一种或多种对照细胞或组织的病毒感染；(b)感染1日或多日后每种样品的细胞存活或死亡的测定(例如，如实施例1中的详细介绍，通过使用一种细胞存活的染料指示剂)；并(c)根据结果，与对照相比，估计样品的敏感性(例如，如实施例1中的详细介绍，通过测定IC50)。感染赘生物
用于此处，“感染赘生物”一词是指病毒核酸进入赘生细胞或组织。干扰素敏感性
用于此处，术语“干扰素敏感性”病毒(如NDV)是指存在干扰素时与没有干扰素时相比，复制明显降低(至少降低100倍，优选至少降低1000倍，更优选至少降低10000倍)的病毒。这可通过测量在存在或不存在低水平的外源干扰素(例如10单位／ml)时从干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞获得的病毒数量(例如感染性病毒、病毒抗原、病毒核酸)来测定。赘生物和赘生性疾病
用于此处，“赘生物”是指组织的新生长，包括肿瘤、良性生长物(例如湿疣、乳头瘤)和恶性生长物(例如癌症)。用于此处，“赘生性疾病”是指表现为存在赘生物的疾病。复制活性
用于此处，“复制活性”病毒是指一种能在赘生性细胞中产生感染性子代的病毒。基本上无污染的卵蛋白
“基本上无污染的卵蛋白”一词是指病毒纯度，其中在由一个本领域的技术人员进行的Western印迹中检测不到卵清蛋白，方法为(1)使用每孔1．7×109 PFU病毒(宽度为3．3cm)在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(1mm厚)上电泳；(2)将病毒蛋白从凝胶上转移到硝酸纤维素膜上，并(3)使用兔抗卵清蛋白[兔IgG是4mg／ml抗体浓度(获自Cappel，Inc)的1∶200稀释物组分或相当的多克隆抗体]对卵清蛋白进行免疫染色。治疗有效量
用于此处，“治疗有效量”一词在治疗赘生性疾病时是指产生所需效果的病毒的数量，例如抑制赘生物生长、肿瘤消退、改善的临床状况或存活提高。
本发明的化合物
不同类型的病毒被用来选择性杀死赘生细胞。天然或遗传工程改造的病毒可用作一种抗赘生物试剂。这些病毒Ⅰ)感染赘生细胞，从而导致其死亡；ⅱ)在赘生性细胞中有复制活性；(ⅲ)通过干扰素的抗病毒作用使杀伤正常细胞受到限制。
在本发明的一个优选实施方案中，具有上述三个特征[(Ⅰ)它们感染赘生细胞，从而导致赘生细胞死亡；ⅱ)它们在赘生性细胞中有复制活性；(ⅲ)它们通过干扰素的抗病毒作用使杀伤正常细胞受到限制]的病毒也能诱导干扰素。
在本发明的另一个优选实施方案中，具有上述三个特征的病毒也可导致人的赘生物消退，和／或因为已经存在的免疫而在靶人群中不被中和。
在另一个优选实施方案中，具有上述三个特征的病毒对肿瘤细胞具有杀细胞活性。
副粘病毒(用于此处“副粘病毒”是指副粘病毒科的一个成员)可根据本发明用来治疗赘生物，包括大的肿瘤或具有高肿瘤负荷的宿主。副粘病毒可包括三个属：(1)副粘病毒属、(2)麻疹样病毒属(麻疹病毒属)以及呼吸道合胞病毒属(肺病毒属)。这些病毒含有一个RNA基因组。使用杀细胞性的副粘病毒科的病毒，尤其是副粘病毒例如新城疫病毒(“NDV”)和其它禽类副粘病毒例如禽类副粘病毒2型，是应用本发明的一个优选方法。根据本发明，这些病毒的减毒株在治疗赘生物时特别有用。
根据本发明，NDV是尤其优选的病毒。根据它们对鸡和鸡胚的作用，NDV被分为三个不同的组。“低毒性”毒株是指轻型毒株，在最小致死剂量(MLD)时杀死鸡胚需要90至150小时；“中等毒性”毒株是指中等毒力株，在MLD时杀死鸡胚需要60至90小时；“高毒性”毒株是指强毒株，在MLD时杀死鸡胚需要40至60小时。见诸如Hanson和Brandly，1995(Science，122：156-157)，和Dardiri等，1961(Am．J．Vet．Res．，918-920)。所有三个组都是有用的，优选的是NDV的中等毒性株，例如毒株MK107、毒株NJ Roakin和毒株Connecticut-70726。(见实施例21-23)。见诸如Schloer和Hanson，1968(J．Virol．，2：40-47)中的其它中等毒性株的名单。
为了特定的目的，需要获得一种克隆病毒来保证或增加一种特定病毒株的遗传同源性，并去除缺陷的干扰颗粒。通过克隆来去除缺陷性的干扰颗粒可允许最后产物的纯度提高，这可用每感染颗粒的病毒颗粒数来评估(例如每PFU的颗粒数)。
克隆病毒可按照技术人员可用的任何方法来制备。例如，空斑纯化被常规用来获得克隆病毒。见诸如Maassab et al．，In：Plotkinand Mortimer，eds．Vaccines，Philadelphia：W．B．Saunders Co．，1994，pages 78-801。三重空斑纯化尤为理想，其中在纯化的每一轮选择一个具有所需特征的一个空斑，例如优选的大小、形状、表现、或亲本株的代表特征。制备克隆病毒的另一个方法是本领域的技术人员可以使用的重组DNA技术。获得一种克隆病毒的另一个方法是使用有限稀释的技术(例如通过增加病毒样品的稀释来获得在每个含有易感细胞单层培养的孔中平均只有一个或更少的感染性病毒颗粒)。
在本发明的一个优选实施方案中，纯化的病毒被用来治疗赘生性疾病。纯化卵来源的病毒的一个优选方法如下所列(在这些方法中，病毒在任何步骤都不被沉淀)：纯化方法Aa)制备一种克隆病毒(例如空斑纯化)b)用克隆的病毒接种卵c)温育卵d)冷却卵e)从卵中收获尿囊液f)从尿囊液中去除细胞残渣g)超离尿囊液，但不沉淀(例如使用一种不连续的蔗糖梯度)
在本发明的另一个实施方案中，在去除细胞残渣(从尿囊液中)后和超离之前，增加了额外的步骤，包括：●冷冻然后融化尿囊液●从病毒悬液中去除污染物(例如通过离心的方法)
在本发明的另一个实施方案中，超离通过一种连续的流式超离来完成。
本发明的一个实施方案涉及一种纯化复制活性的RNA病毒的方法，包括以下步骤：
a)制备一种克隆病毒，并
b)通过超离但不沉淀来纯化所说的克隆病毒。
本发明的另一个实施方案涉及一种纯化副粘病毒(例如NDV)的方法，包括通过超离但不离心来纯化病毒。
可选地，超离之前额外的纯化步骤包括：
a)通过空斑纯化来制备一种克隆病毒，
b)用克隆病毒接种卵，
c)温育卵
d)冷却卵
e)从卵中收获尿囊液，并
f)从尿囊液中去除细胞残渣。
本发明的另一个实施方案涉及一种从卵或细胞培养物中纯化复制活性的克隆病毒的方法，包括超离，但不含病毒被沉淀的步骤。
本发明的另一个实施方案涉及一种纯化副粘病毒(例如NDV)的方法，包括通过顺序切向流过滤(TFF)来纯化病毒。
可选地，病毒可另外通过凝胶渗透色谱进行纯化，其中每个步骤都在稳定缓冲液中进行(实施例15)：
a)空斑纯化来制备一种克隆病毒，
b)用克隆病毒接种卵，
c)温育卵
d)冷却卵
e)从卵中收获尿囊液，并用缓冲液稀释尿囊液，
f)通过TFF从尿囊液中去除细胞残渣。
g)通过TFF纯化病毒，并
e)通过凝胶渗透色谱纯化病毒。
可选地，从凝胶渗透步骤获得的病毒可用TFF进行浓缩。
本发明的另一个实施方案涉及一种从卵或细胞培养物中纯化复制活性的克隆病毒的方法，包括用顺序切向流过滤(TFF)纯化病毒的步骤，可选地，接着用凝胶渗透色谱纯化病毒，可选地，接着用TFF浓缩病毒。克隆病毒：
使用这些方法可将一种克隆病毒[包括副粘病毒(如NDV)]纯化到至少2×109 PFU／mg蛋白，优选至少3×109 PFU／mg蛋白，更优选至少5×109 PFU／mg蛋白，更优选至少1．0×1010 PFU／mg蛋白，更优选至少2．0×1010 PFU／mg蛋白，更优选至少3×1010 PFU／mg蛋白，更优选至少4×1010 PFU／mg蛋白，更优选至少5×1010 PFU／mg蛋白，最优选至少6×1010 PFU／mg蛋白。
使用这些方法可将一种克隆病毒[包括副粘病毒(如NDV)]纯化到这样的水平，其中每PFU的病毒颗粒数小于10，更优选小于5，更优选小于3，更优选小于2，最优选小于1．2(每PFU的病毒颗粒数越低，表明纯度越高)。RNA病毒
在另一个实施方案中，这些方法能纯化(达到上面克隆病毒中所述的水平)一种RNA病毒[包括(a)一种杀细胞型RNA病毒；(b)一种单链RNA、非分段、非包膜病毒；(c)一种单链RNA、分段、包膜病毒；(d)一种双链RNA、分段、非包膜病毒；(e)一种单链RNA、非分段、包膜病毒(例如副粘病毒(例如NDV)和例如逆转录病毒)。DNA病毒
在另一个实施方案中，这些方法能纯化(达到上面克隆病毒中所述的水平)一种干扰素敏感的杀细胞型病毒，它可选自(a)包膜、双链DNA病毒(包括痘病毒)；(b)非包膜、单链DNA病毒；和(c)非包膜、双链DNA病毒。卵来源病毒
在另一个实施方案中，这些方法可将卵来源的病毒纯化至基本上无污染的卵蛋白的水平。在用于人治疗的病毒制备物中优选限制卵蛋白的数量，因为主要的卵蛋白如卵清蛋白是过敏原。
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在治疗赘生性疾病包括癌症中有用的病毒示于表1。可根据需要筛选这些病毒的天然存在的突变体(特定的毒株或分离株)，使其产生相对于亲本株的改变的IFN产生。
表1用于癌症治疗的天然存在的病毒
| 病毒类型 | 病毒科 | 病毒例子 |
| RNA、负链 | 副粘病毒科 | 新城疫病毒 |
| 禽副粘病毒2型 | ||
| 腮腺炎病毒 | ||
| 人副流感病毒 | ||
| 弹状病毒科 | 水疱性口炎病毒 | |
| RNA、正链 | 披盖病毒科 | 辛德毕斯病毒 |
| 黄病毒科 | 黄热病毒(减毒) | |
| 微核糖核酸病毒科 | 鼻病毒 | |
| 牛肠道病毒 | ||
| 埃可病毒 | ||
| 日冕形病毒科 | 禽传染性支气管炎病毒 | |
| 人日冕形病毒 |
在本发明的另一个实施方案中，候选病毒，不管是天然存在的还是遗传工程改建的，都被检测了在治疗赘生物中提供治疗应用的能力。在一个实施方案中，候选病毒杀死50％的干扰素(IFN)介导的抗病毒应答缺陷的细胞如KB头和颈癌细胞所需的数量，与杀死50％的相似量的干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞如正常皮肤成纤维细胞所需的病毒数量，进行了比较。杀死的数量可用任何方法包括台盼蓝排除或MTT试验(见实施例1)进行测量。相对于杀死干扰素(IFN)介导的抗病毒应答完全的细胞所需的数量，杀死干扰素(IFN)介导的抗病毒应答缺陷的细胞所需的病毒数量明显减少(例如至少5倍)，这就说明待测病毒显示了在治疗赘生物中应用所需的活性。其它NDV病毒和辛德毕斯病毒是这样的能显示肿瘤选择性杀伤的天然病毒(见实施例21-23和25)。
理解参与建立抗病毒状态的因子就能设计一种筛选可能对病毒治疗应答的肿瘤的试验。总的来说，在获自活检样品的病人来源的肿瘤组织中筛选p68激酶、p58或其它参与抗病毒状态或细胞分化的因子的表达。其它因子包括但不限于干扰素应答因子I(IRF-1)、干扰素刺激基因因子-3(ISGF-3)、c-Myc、cMyb和IFN受体。对于c-Myc、cMyb或p58，高水平表达说明肿瘤组织或细胞是病毒疗法的治疗候选物。对于p68、IRF-1、ISGF-3和IFN受体，低水平表达说明肿瘤组织或细胞是病毒疗法的治疗候选物。
在本发明的另一个实施方案中，将获自病人活检样品的原代肿瘤组织或细胞进行培养扩增，并检测其对合适的病毒治疗的杀伤的敏感性。在一个实施方案中，按照上面对筛选候选病毒所介绍的方法，将杀死50％肿瘤组织培养物所需的病毒数量与杀死50％正常细胞培养物所需的数量进行比较。肿瘤细胞比正常细胞对病毒试剂杀伤的敏感性提高10倍或更高，就说明肿瘤细胞对病毒疗法的杀细胞作用特别敏感。在本发明的一个进一步的实施方案中，靶肿瘤细胞应答于内源或外源提供的IFN的能力通过在存在IFN(α或β型，使用如10单位／ml，见实施例27)的情况下进行上述筛选来测定。
理解病毒粘附或进入所需的细胞受体，可以为具有高受体表达并因而对干扰素敏感病毒的敏感性较高的肿瘤进行另外的筛选。这是一种对可能对病毒疗法应答的病人进行的额外水平的筛选。对于用一种干扰素敏感的病毒进行治疗来说，病人的肿瘤优选既对干扰素有抗性，又高表达病毒的细胞受体。总的来说，病人来源的血清、肿瘤细胞、组织或组织切片通过免疫试验或免疫染色来筛选血清或肿瘤细胞或肿瘤组织表面存在的病毒受体的数量。例如辛德毕斯病毒利用高亲和性的层粘连蛋白受体来感染哺乳动物细胞(Wang，et al．，1992，JVirol．，66，4992-5001)。已知这种相同的受体在多种不同类型的转移性癌症中高数量表达。PANC-1肾细胞系和结肠腺癌细胞系SW620已知表达高水平的高亲和性层粘连蛋白受体mRNA(Campo et al．，1992，Am J Pathol 141：107301983；Yow et al．，(1988)Proc．Natl．AcadSci 85，6394-6398)，并且对辛德毕斯病毒高度敏感(实施例25)。相反，直肠腺癌细胞系SW1423已知表达非常低水平的高亲和性层粘连蛋白受体mRNA(Yow et al．，(1988)Proc．Natl Acad Sci，85，6394-6398)，并且比SW620细胞对PPSINDBIS的杀伤作用敏感超过4个数量级。
对已经存在的NDV或其它病毒包括RNA和DNA病毒进行筛选或遗传工程改造，来获得在正常细胞中有改变的IFN应答(例如，优选为IFN应答增强)。除了诱导强IFN应答的能力，其它病毒特征也进行筛选或遗传导入病毒中。本发明包括具有改变的受体特异性的(例如辛德毕斯病毒PPSINDBIS-Ar339，见实施例25)或低神经毒的(例如NDV病毒PPNJROAKIN，见实施例24)病毒。本发明的病毒优选具有直接通过细胞接触进行扩散的能力。
这里介绍的本发明包括广泛种类的(见表1)能以与NDV显示的类似方式用于治疗赘生物的病毒。此外，由于存在使IFN应答在正常细胞中失活的机制，天然不能作为使用候选的病毒可以非必要地进行遗传改造来克服上述限制。如果不进行修饰，具有使干扰素应答失活的机制的病毒将比这种机制被去掉的病毒对正常细胞有更高的毒性。本发明提供(1)一种更容易操作的载体的建立；和(2)一套治疗性病毒的制备。操作包括加入IFN基因来使病毒表达一种表达IFN的转基因或其它IFN应答途径的激活剂。其它改变包括遗传表达药物前体激活酶如疱疹病毒胸苷激酶或胞嘧啶脱氨酶(B1aese RM et al．，1994，Eur．J．Cancer 30A：1190-1193)和表达合适的标记抗原以通过免疫系统靶向肿瘤细胞。一种另外的改变包括遗传工程表达受体的配体来通过这些受体靶向细胞[例如，表达其它病毒的受体来靶向其它病毒感染的细胞(见Mebastsion et al．，1997，Cell 90：841-847；和Schnell MJ et al．，1997，Cell 90：849-857)]。
数种新城疫病毒株被证明能选择性杀死肿瘤细胞。在使用一种第二种中等毒性的新城疫病毒的差别细胞毒试验中，肿瘤细胞被发现比正常细胞对病毒的杀伤作用敏感3个数量级(实施例21)。此外，当第三种新城疫病毒株用于差别细胞毒试验时，肿瘤细胞被发现比正常细胞对病毒的杀伤作用敏感80至5000倍。在经肿瘤内注射进携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠后，这两种中等毒性的新城疫病毒也都能引起肿瘤消退。(实施例23)。
在独立的实验中，三种不同新城疫病毒株的安全性在无胸腺和免疫活性小鼠的脑内接种后进行了研究。该研究的结果显示，所有三种病毒株在具有完整免疫系统的小鼠中都能很好地耐受。脑内接种到无胸腺小鼠的脑中显示，一种病毒的耐受明显优于其它两种(实施例24)。这些结果证明，在单一一个病毒科内，病毒特征可以有重要的差别，并可以治疗性开发使之更安全或更有效。
用溶癌性病毒治疗后提高其效果和降低其毒性的方法可以通过使用干扰素敏感的病毒来完成，这种病毒需要在肿瘤细胞上优势表达的特殊的细胞表面受体。辛德毕斯病毒提供了这种类型的限制的一个例子。辛德毕斯病毒使用高亲和性的层粘连蛋白受体来感染哺乳动物细胞(Wang，et al．，1992，J Virol．，66，4992-5001)。当在一个差别细胞毒试验中，正常和肿瘤细胞用辛德毕斯病毒进行感染时，具有致瘤性和表达高亲和性层粘连蛋白受体的细胞被发现比其它细胞对这种病毒的杀伤作用有更高的敏感性(实施例25)。正常的角质细胞表达高亲和性的层粘连蛋白受体(Hand et al．，(1985)Cancer Res．，45，2713-2719)，但在此试验中能抵抗辛德毕斯病毒的杀伤。
当VSV在存在外源干扰素的情况下被用来感染非致瘤性人WISH细胞和致瘤性HT1080或KB细胞时。水疱性口炎病毒(VSV)提供了溶癌性病毒的肿瘤选择性杀伤的证据，即肿瘤细胞在干扰素应答中的一种遗传缺陷使这些细胞对干扰素敏感的复制活性病毒的杀伤作用敏感。
下面是这样一些病毒的名单，当被修饰去除了天然存在的抗干扰素活性时，它们可用于病毒癌症治疗(见表2)。已经将内源的抗干扰素活性破坏或降低的修饰病毒(除了抗干扰素修饰，还优选但不是必须减毒，见表3)对癌症治疗非常有用。此名单包括但不限于下面介绍的病毒。因为同一类型病毒之间的相似性，下面列出的每种病毒的确定机制也以相同或功能类似的机制的形式存在于该病毒类型的其它成员。括号内是更广泛的病毒的种类。通过任何方法包括天然存在的突变以及遗传工程删除或点突变而功能性丧失了抗干扰素活性的病毒如下面所列都可用于本发明的方法中。
使用超过一种机制的病毒可以可选地修饰来在一个、一些或所有活性中含有突变。一些介绍的活性的突变可在普通科学通讯中获得。
比野生型病毒的生长速率慢的天然存在的或遗传工程病毒的分离株特别优选，因为较慢的生长速率能使一种在干扰素应答中有活性的细胞或细胞群体在病毒复制能杀死细胞或细胞群体前建立有效的抗病毒状态。
本发明还包括使病毒抗干扰素活性失活来作为病毒特征的特异性改变，从而使一种感染细胞的干扰素应答增强，但仍允许病毒在赘生性细胞中复制。
表2显示了通过遗传工程改造去除了抗干扰素活性的已有病毒。
表3列出了通过遗传工程改造进行了毒性减毒的病毒。
表2通过遗传工程改造去除了抗IFN活性的多种病毒
| 病毒种类 | 病毒科 | 病毒 | 抗IFN活性 | 参考文献 |
| RNA | 呼肠孤病毒科 | 呼肠孤病毒 | σ3 | Imani F和Jacobs B(1988)Proc NatlAcad Sci USA 85：7887-7891． |
| DNA | 痘病毒科 | 痘苗病毒 | K3L | Beattie E et al．(1991)Virology 183：419 |
| E3L | Beattie E et al．(1996)Virus Genes12：89-94． | |||
| B18R | Symons JA et al．(1995)Cell 81：551-560 | |||
| 腺病毒科 | 不同亚型 | VA1转录子 | Mathews MB和Shenk T(1991)J Virol 64：5657-5662． | |
| 甲型疱疹病毒 | HSV-1 | γ34．5基因产物 | Chou J et al．(1996)Proc Natl Acad Sci USA92：10516-10520． |
表3所选病毒中的已知减毒突变
赘生物治疗
| 病毒种类 | 病毒科 | 病毒 | 减毒 | 参考文献 |
| RNA | 呼肠孤病毒科 | 呼肠孤病毒 | σ1 | Spriggs DR和FieldsBN(1982)Nature 297：68-70． |
| 轮状病毒 | 牛株(WC3) | C1ark HF(1988)JInfect Dis 158：570-587 | ||
| DNA | 痘病毒科 | 痘苗病毒 | 痘苗生长因子 | Buller RML etal(1988)Virology164∶182． |
| 胸苷激酶 | Buller RML et al(1985)Nature 317：813-815． | |||
| 胸苷酸激酶 | Hughes SJ et al(1991)J Biol Chem 266：20103-20109． | |||
| DNA连接酶 | Kerr SM et a1(1991)EMBO J 10：4343-4350． | |||
| 核糖核苷酸还原酶 | Child SJ et al(1990)Virology 174：625-629 | |||
| dUTP酶 | Perkus ME et al(1991)Virology 180：406-410． | |||
| 腺病毒科 | 各种亚型 | Ad-4，Ad-7，Ad-21 | Takafugi ET et al(1979)J Infect Dis14D：48-53 | |
| 甲型疱疹病毒 | HSV-1 | 胸苷激酶 | Field HJ和Wildy P(1978)J Hyg 81：267-277． | |
| 核糖核苷酸还原酶 | Goldstein DJ和WellerSK(1988)Virology166：41-51． | |||
| γ34．5基因产物 | Chou J et al(1995)Proc Natl Acad Sci USA92：10516-10520． | |||
| b’a’c’反向重复 | Meignier B et al(1988)J Infect Dis162：313-322． |
本发明涉及赘生物的病毒治疗，特别是在有癌症的动物中。在一个优选实施方案中，本发明涉及最大径向为1厘米(cm)或以上的肿瘤的治疗。用于此处，“1cm肿瘤”是指至少在一个方向上肿瘤的长度是1cm。这种肿瘤比预期的对病毒疗法更敏感，如果不是比大小较小的肿瘤更敏感，至少也同样敏感。在本发明的一个更优选的方面，大于1cm的肿瘤得到了治疗，例如2cm或更大的肿瘤，从约2cm至5cm，以及大于5cm的肿瘤。
本发明也被用于治疗带有高肿瘤负荷的宿主。用于此处，术语“肿瘤负荷”是指机体中肿瘤的总数量，以机体重量的百分比表示。带有肿瘤负荷的宿主例如从机体总重量约1％至约2％的病毒治疗令人惊奇的有效，例如产生肿瘤消退和总的肿瘤负荷的减少。这是尤其没有料到的，因为一种约2％机体总重量的肿瘤负荷(例如一个60kg人的1kg肿瘤)基本上是生命能忍受的最大肿瘤质量。见诸如Cotran et a1．，In Robbins Pathological Basis of Diseases，4th Edition，WBSaunders，1989，page 252。在实施例中，一个小鼠宿主中体积达到397mm3的黑素瘤癌症(例如A375)应答于用新城疫病毒(例如三重空斑纯化的病毒)的治疗，显示完全的消退。假定1000mm3的组织相当于1克，一个具有397mm3的肿瘤占一个20克小鼠的机体总重量的约2％。
如下文实施例4至9所示，用大小至少为1cm的肿瘤达到了肿瘤消退，而在不处理时，对照动物在荷载肿瘤的几周内开始死亡。因此，尽管将在两周内死亡，这样的患病动物得到了成功的治疗。因此，根据本发明，一个接近其肿瘤负荷极限的动物可以用病毒疗法进行治疗。同时，本发明可用于治疗对传统疗法如化疗如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶和放射疗法不应答的病人。
经过腹膜途径给药后NDV治疗癌症的效果也进行了检测。使用卵巢癌的腹水预防模型，在携带ES-2人卵巢瘤的小鼠中腹膜注射NDV能产生比用盐水处理的小鼠提高的存活(实施例16)。当ES-2细胞用于一个最初用腹水形式处理一次的卵巢癌肿瘤模型时，腹水产量在病毒处理的动物中比在盐水对照中明显减少(实施例17)。
在本发明的另一个实施方案中，病毒给药导致1)肿瘤相关的症状缓解例如但不限于腹水产生率降低、疼痛减轻以及阻塞性疾病缓解，和2)生命延长。
23个病人经静脉途径接受了空斑纯化的NDV分离株(实施例20)。治疗应答包括可触肿瘤的消退、在47％的病人中疾病稳定、以及疼痛的减少。给药和制剂
在本发明的一个实施方案中，肿瘤细胞或组织在体外进行筛选，以确定那些携带对病毒敏感的肿瘤的病人。从病人中取出的肿瘤细胞(通过诸如对实体瘤用细针吸取或对卵巢腹水瘤用穿刺术的方法)在体外进行生长并接种病毒。在本发明的这个实施方案中，如果病毒对其肿瘤细胞有高活性，就选择这些病人进行治疗。
在本发明的一个优选实施方案中，病毒给药的数量导致肿瘤或多种肿瘤的消退。用于此处，“消退”一词是指肿瘤退缩，例如大小、质量或体积。肿瘤大小的退缩可通过多种方法来证明，包括物理检测、胸片或其它X-射线、超声图谱、CT扫描、MRI、或放射性核苷酸扫描方法。
根据本发明，不同类型的赘生物包括癌症都是可以治疗的。本发明的病毒可用于治疗多种癌症、包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠腺癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、膀胱癌、Wilm’s瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、黑素瘤、滑膜肉瘤、成神经细胞瘤、淋巴瘤、白血病、脑癌包括成蚀质细胞瘤、神经内分泌癌、肾癌、头和颈癌、胃癌、食管癌、阴道癌、内瘤、皮肤癌、甲状腺胰腺癌和间皮瘤。本发明的病毒也可用于治疗多种良性肿瘤，包括但不限于湿疣、乳头瘤、脑膜瘤和腺瘤。
将治疗有效量的病毒给予一个带有赘生物的宿主。本领域的技术人员应当理解，病毒给药的剂量依赖于所选的病毒、赘生物的类型、赘生细胞生长或恶变的程度、赘生物的生物位置或在机体中的位置、病毒的株、给药途径、给药方案、给药模式、与任何其它将给予哺乳动物的药物或治疗例如放射、化疗、外科手术治疗的一致性而各不相同。这些参数通过在动物模型中确定最大耐受剂量进行优化，并根据相对的机体表面积或机体质量换算成人剂量。还应当理解，在特定场合，可以给予超过一个剂量的病毒。这种多剂量病毒之间的最佳间隔可以凭经验并在本领域的技术范围内确定。NDV的通常给药量在约3×106至约5×1012 PFU病毒之间。对于局部给药(例如直接注射进肿瘤)，通常使用总量为3×106至5×1010 PFU的病毒。对于系统给药，使用约1×108至4×1011 PFU每平方米机体表面积的病毒。对于静脉给药，使用每周一次、每周两次和每周三次的给药计划。根据本发明，一种病毒，可以可选地与化疗试剂一起，通过各种途径进行给药，例如肠道、肠道外、口、鼻、直肠、鞘内、静脉(例如使用导管)、皮下、肿瘤内(例如直接注射进其组织或注射进扩散到其中的血管中)、肿瘤外周、局部地、舌下、颊、表面、肌肉内、通过吸入、经皮、阴道、动脉内、颅内、皮内、硬膜外、系统地、表面、腹膜内、胸膜内等等。对于肺肿瘤，可以使用支气管途径(例如支气管给药)。在合适时也可以使用内窥镜对胃肠道肿瘤进行注射以及对直肠肿瘤进行栓剂治疗。
用NDV进行的小鼠毒性研究表明，静脉病毒给药后的急性毒性作用可能是由细胞因子介导的反应引起的。在初始的诱导事件后，针对重复刺激的细胞因子应答已知能脱敏或下调(Takahashi et al．，(1991)Cancer Res．51，2366-2372)。用脱敏剂量的病毒经静脉注射的小鼠在第二次给药时能够比在第一次注射只接受载剂注射的小鼠耐受多大约10倍的病毒(实施例18)。
病毒经静脉途径给药的速率能明显影响其毒性。两组无胸腺小鼠用相同剂量的NDV进行处理，其中一组给药慢(4分钟给药0．2ml)，一组给药快(30秒内给药0．2ml)。比较每组的最大体重丧失表明，在接受慢注射的组中比快注射组中的体重丧失少50％。(实施例19)。
在一个临床分组试验中，病人在一周内接受三次空斑纯化的NDV分离物注射(实施例20)。在这些条件下，一次初始剂量的脱敏作用减轻了与第二次和第三次剂量相关的毒性。这些数据与用动物研究获得的数据一起示于实施例18。一个与在癌症治疗中使用溶癌病毒相关的考虑是在治疗过程中体液免疫应答可能产生潜在的抑制作用。在临床研究中，显示稳定病情一个月后的病人适合进行第二个治疗过程，后者接着在存在针对NDV的中和抗体的情况下给药。但是，在第二个剂量过程后的第7天仍能在病人的尿中发现感染性的病毒，这证明高剂量的病毒给药能克服中和性抗体的影响，并在病人体内建立感染。
在本发明的一个优选实施方案中，在后续高剂量给药之前给予一次脱敏剂量。为进行脱敏，使用1×108至2．4×1010 PFU／m2的病毒剂量。脱敏后，另外使用3×108至4×1012 PFU／m2的病毒剂量。剂量之间的时间间隔，包括脱敏剂量和下一个剂量的时间间隔，为1至14天，优选为1至7天。脱敏剂量可通过各种途径进行给药，例如静脉、肠道、肠道外、口、鼻、直肠、鞘内、静脉、皮下、肿瘤内、肿瘤外周、局部、舌下、颊、表面、肌肉内、通过吸入、经皮、阴道、动脉内、颅内、皮内、硬膜、系统性地、表面、腹膜、胸膜、内镜、支气管内等。随后的剂量可用与脱敏剂量相同的途径进行给药或通过其它途径，例如静脉内、肠道、肠道外、口、鼻、直肠、鞘内、静脉内、皮下、肿瘤内、肿瘤外周、局部、舌下、颊、表面、肌肉内、通过吸入、经皮、阴道、动脉内、颅内、皮内、硬膜、系统性地、表面、腹膜、胸膜、内镜、支气管内等。
可选地，可以以顺序或同时进行的方式使用一种以上的给药途径。同时或顺序给药的途径包括但不限于静脉内、肠道、肠道外、口、鼻、直肠、鞘内、静脉内、皮下、肿瘤内、肿瘤外周、局部、舌下、颊、表面、肌肉内、通过吸入、经皮、阴道、动脉内、颅内、皮内、硬膜、系统性地、表面、腹膜、胸膜、内镜、支气管内等。一个例子可以是一个经静脉给药的脱敏剂量接着一个腹膜剂量。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒通过缓慢扩散进行给药，包括使用静脉泵或在4分钟至24小时的时间内缓慢注射。
病毒以及可选的一种或更多的化疗试剂，可以通过单次注射、通过多次注射或连续地注射进行给药。病毒可以在化疗试剂(包括但不限于：白消安、环磷酰胺、氨甲蝶呤、阿糖胞苷、博来霉素、顺铂、阿霉素、美法仑、乐疾灵、硫酸长春碱、5-氟尿嘧啶、紫杉酚和视黄酸)给药之前、同时或之后进行给药。根据本发明，病毒疗法可以可选地与其它疗法包括外科手术、放射、化疗(见诸如Current MedicalDiagnosis and Treatment，Ed．Tierney et al．，Appleton ＆ Lange，1997，特别是78-94页)和生物疗法组合使用。病毒可以在生物试剂例如(1)其它溶癌试剂[例如但不限于：其中一个基因在一个前列腺细胞特异性应答元件的转录控制之下的腺病毒(见Rodriques，R．etal．，1997，Cancer Res，57：2559-2563)；不能编码能结合p53的E1b多肽的腺病毒(见Bischoff，J．R．et al．，1996，Science 274：373-376)；不能表达一种功能性γ34．5基因产物的单纯疱疹病毒(见Mineta，T．et al．，1995，Nature Medicine，1：938-943)]；(2)细胞因子(例如但不限于：集落刺激因子如GM-CSF、肿瘤坏死因子和白介素如IL-1、IL-2、IL-6和IL-10)；(3)病毒载体[例如但不限于编码p53的腺病毒(见Zhang，WW et al，1994，Cancer Gene Therapy，1∶5-13)]；以及(4)癌症疫苗的给药之前、同时、或之后进行给药。在本发明的一个实施方案中，疗法包括用抗原性不同的病毒进行系列治疗，这些病毒是细胞毒性和通过IFN机制而肿瘤选择性的。该实施方案可允许病毒疗法持续一个较长时期而不受免疫干扰。
另一个实施方案涉及在NDV(或其它病毒)给药之前、同时或之后，用IFN(例如IFNα、IFNβ或IFNγ)处理病人。IFN选自Ⅰ型(α、β、ω)和Ⅱ型(γ)以及其重组物和类似物，如诸如Sreevalsoun，T．，1995(《癌症生物治疗》第2版，编者：V．T．DeVita，Jr．，S．Hellman，and S．A．Rosenberg，J．B．Lippincott Company，Philadelphia，pp347-364)中所讨论的。正常细胞对IFN预处理应答，对病毒感染的IFN应答的增强使这些细胞具有更高的安全性。在IFN信号途径中有缺陷的肿瘤细胞保留了对病毒杀伤作用的敏感性。这将允许使用更高剂量的病毒疗法。IFN根据标准的临床指南进行给药，其中剂量和方式已知对治疗病毒感染有效。在本发明的另一个实施方案中，已知能影响IFN应答途径的其它药物也可选择性地用来增加肿瘤细胞的敏感性，或增加正常细胞对病毒感染的杀细胞作用的抗性。这类药物包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂、西咪替丁和线粒体抑制剂。缺氧和体温过高已知也能调节干扰素应答。
在本发明的另一个实施方案中，免疫抑制剂如环孢菌素A、硫唑嘌呤和leflunomide、各种皮质甾类制备物、和抗CD40配体抗体(Foy，T．M．，et al．，1993，J．Exp．Med．178：1567-1575)与病毒一起给药。此外，免疫刺激剂如脂肽也可与病毒一起给药。
一种独立的机制是应答于病毒感染而产生的干扰素的数量可通过使用核苷(Machida，H．，1979．Microbiol．Immunol．23：643-650)、核苷前体或能提高细胞中一种或多种核苷浓度的药物来提高，这也可以可选地用作病毒疗法的一种辅助。
某些嘌呤核苷类似物如2-氯脱氧腺嘌呤和2’-去氧助间型霉素能在体内减少干扰素的产生。这种化合物可用来进一步影响肿瘤细胞与正常细胞对干扰素敏感性的差别，并且可以可选地用作病毒疗法的一种辅助。
在一个方面，有效量的病毒可被分成较小剂量单位，并在同一时间注射进同一肿瘤的不同位置。对于连续给药，所需的试剂可通过植入的微型泵进行给药，或将其浸渗进入所需的聚合物，然后植入所需的位置(例如直接进入肿瘤)来延缓或延迟释放。
本发明的病毒被配制成药物制备物的形式，即通过将其与至少一种赋形剂或辅助剂以及在需要时与一种或多种其他活性化合物一起组成一种合适的药剂形式。这种制备物可作人用和兽用。合适的赋形剂包括诸如适合于肠道或肠道外给药的有机或无机物质如水、盐水、组织培养基、缓冲液、赖氨酸、柠檬酸、甘油三乙酸和其他脂肪酸甘油、明胶、大豆卵磷脂、碳水化合物如甘露糖、蔗糖、乳糖或淀粉、硬脂酸镁、滑石、纤维素或蛋白载剂、或一种上述化合物的组合物如甘露糖／赖氨酸或甘露糖／赖氨酸／蔗糖。制备物为无菌的，并含有添加剂如防腐剂或稳定剂。为进行肠道外给药，如系统性或局部注射，病毒制备物可配制成诸如含水悬液或乳剂。
本发明还涉及一种在哺乳动物中治疗疾病的方法，其中疾病细胞在干扰素介导的抗病毒应答中有缺陷，该方法包括将治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒给予哺乳动物。例如，用多种病毒如乙肝病毒感染的、不能进行干扰素应答的细胞对本发明的病毒易感。有证据表明人免疫缺陷型病毒(HIV)能使干扰素应答失活。本发明的干扰素敏感病毒可用于治疗慢性病毒感染如由乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、Epstein-Barr病毒、人乳头瘤病毒和疱疹病毒引起的疾病。
在这里，除非另外说明，本发明的病毒疗法的细节和条件与美国申请系列号08／260，536一致，后一公开在此全文引入作为参考。所有上面引用的申请、专利和发表物以及其图表均在此引入作为参考。
★ ★ ★
下面的实施例是说明性的而不是对本发明的方法和组合物进行限制。对本领域的技术人员来说非常明显，对临床治疗中通常遇到的各种条件和参数进行的其他适当修改和适用都包含在本发明的精神和范围内。
实施例1PPMK107(NDV毒株MK107的三重空斑纯化分离物)相对于正常人细胞
对多种人癌细胞具有选择性细胞毒活性
人肿瘤细胞和正常细胞在24孔组织培养皿中生长至约80％连汇。移去生长培养基，加入PPMK107的10倍梯度稀释物，范围为106空斑形成单位(PFU)／孔至10-1 PFU／孔。每个皿中都包括没有加入病毒的对照孔。病毒在一个旋转平台上在37℃吸收90分钟。在温育期结束时，移去病毒稀释物，代之以1ml生长培养基。然后将皿在37℃在5％CO2中温育5天，然后定量评估细胞致病变效应(CPEO的数量。细胞毒通过使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(Cell Titer 96，catalog#G4000，Progema Corporation，Madison WI 53711)进行测量，MTT比色法在570 nm处进行监测，能监测线粒体酶的活性(Mosman T．，1983，J．Immunol．Methods 65：55)。病毒处理的孔中的存活以未处理对照孔的百分数来表示。数据用PFU／孔对以对照的百分数形式表示的存活性来作图。IC50通过能产生50％活细胞数量减少的PFU／孔的病毒数量来计算。
结果示于表4、5和6。PPMMK107对多种人癌细胞具有高度细胞毒活性，39个恶性细胞系中有30个的IC50值小于1O00，而与此相对，正常人细胞类型不敏感。大多数人癌细胞具有的IC50比多数正常人细胞类型要低2至3个数量级。
表4．细胞毒试验结果概述
| 肿瘤类型 | 细胞系 | IC50(PFU/孔) |
| 纤维肉瘤 | HT1080 | 2 |
| 黑素瘤 | SKMEL2SKMEL3SKMEL5A375MALME-3MHT144 | 8243777828 |
| 乳腺癌 | SKBR3MDA-MB-468ZR75-1 | 104478 |
| 卵巢癌 | SW626PA-1E3-2SKOV-3OVCAR3 | 44132434 |
| 肺癌(大细胞、低通过性)成蚀质细胞癌 | H-1299U87MGU373MGU138A172 | 262576538207 |
| 膀胱癌 | HT1197UM-UC-3HT1376 | 354422 |
| 成神经细胞瘤宫颈癌前列腺癌 | IMR32HeLaDU-145PC3 | 414313.1×103 |
| 结肠癌 | SW620HT29 | 55＞1.0×106 |
| 头和颈癌 | KBA253FaDuHep-2 | 42.7×1032.9×1031.5×104 |
| 神经上皮细胞瘤小细胞癌，肺 | SK-N-MCDMS-114DMS-153 | 20481.1×105 |
| 小细胞癌，前列腺白血病(AML) | NCI-H345NCI-H660K562 | 1.2×1051.0×1055.4×104 |
表5．使用正常人细胞的细胞毒试验结果概述
| 细胞类型 | 细胞 | IC50(PFU／孔) |
| 角质细胞 | NHEK | 9．0×106 |
| 成纤维细胞 | CCD-922NHDF | 1．4×1068．1×103 |
| 内皮细胞 | HPABC | 5．2×104 |
| 肾细胞 | RPTBC | 2．7×104 |
| 黑素细胞 | NHEM | 5．1×104 |
| 星形细胞 | NHA | 3．8×103 |
表6．使用快速增殖的正常细胞的细胞毒试验结果概述
| 细胞类型 | 增殖速率 | IC50(PFU／孔) | |
| 体内 | 体外 | ||
| 骨髓细胞CD34+增殖至50％ | 中等至高 | 高 | 6．2×103 |
| 乳腺上皮细胞 | 很低1 | 高1 | 30 |
| 1所检测的人乳腺上皮细胞(HEMC)在用牛垂体抽提物和人表皮生长因子刺激后有很高的增殖速率。与此截然不同的是，正常乳腺上皮细胞在成年癌症妇妇女增殖程度几乎总是很低。 | |||
实施例2将PPMK107用于在无胸腺小鼠中进行人肿瘤异种移植物(＜10mm并且
＞5mm)的肿瘤内治疗
无胸腺小鼠用1千万人肿瘤细胞进行皮内注射。当肿瘤大小达到5至10mm的范围时，给予单一剂量的PPMK107(剂量为3x108PFU)或盐水。在用PPMK107处理的小鼠中几乎所有的肿瘤类型都显示完全或50％至100％的部分消退率(见表7)。一个例外是使用U87MG的实验(实验I)：虽然在用PPMK107处理的9个肿瘤中只有一个完全消退，另两个病毒处理的肿瘤显示32％和20％的消退，另两个病毒处理的肿瘤显示比所有8个用盐水对照处理的肿瘤生长慢。在盐水对照处理的肿瘤中基本上没有肿瘤消退：在所有这些实验中(表7中列出的A至I)，73个对照肿瘤只有一个显示消退。这些结果表明，不同的肿瘤类型显示对PPMK107的肿瘤内治疗产生应答。
为检测病毒在肿瘤中的复制，使用皮下HT1080纤维肉瘤模型对病毒抗原进行免疫组化染色(使用针对NDV的P蛋白的单克隆抗体)。在肿瘤内注射3x108PFU的PPMK107后的30分钟内，肿瘤组织中的病毒抗原为阴性。但在处理2天后，在肿瘤中可观察到大量的病毒抗原的免疫染色，这说明病毒在肿瘤中复制。重要的是，病毒特异性地在肿瘤组织中复制，因为相邻的结缔组织和皮肤的病毒抗原为阴性。
实施例3将PPMK107用于在无胸腺小鼠中进行人肿瘤异种移植物(＜8．5mm并
且＞5．5mm)的静脉治疗
无胸腺小鼠用1千万人HT1080纤维肉瘤细胞进行皮内注射。当肿瘤大小达到5至8mm时，静脉注射PPMK107或盐水。如表8所示，在最高病毒剂量水平(1×109 PFU)时，在所有7只小鼠中都观察到肿瘤的完全消退。单次注射3×108和6×107产生超过90％的消退率。而单次IV注射3×108仅产生55％的肿瘤消退，在此剂量水平的三次IV注射产生100％的应答率。用IV盐水处理的小鼠没有显示肿瘤消退的证据。这些结果表明，皮下的HT1080肿瘤对PPMK107的IV处理应答强烈。
| 表7.在无胸腺小鼠中用PPMK107肿瘤内治疗皮下 | ||||||
| 的人肿瘤异源移植物(＜10mm和＞5mm) | ||||||
| 完全 | 完全+ | |||||
| 肿瘤 | 肿瘤类型 | Expt# | 剂量 | N | 消退 | 部分消退 |
| HT1080 | 纤维肉瘤 | A | 3.00E+08 | 12 | 11 | 11 |
| B | 3.00E+08 | 9 | 8 | 8 | ||
| C | 3.00E+08 | 8 | 8 | 8 | ||
| PA-1 | 卵巢癌 | D | 3.00E+08 | 9 | 9 | 9 |
| KB | 口腔癌 | E | 3.00E+08 | 12 | 7 | 10 |
| SKMEL5 | 黑素瘤 | F | 3.00E+08 | 8 | 5 | 7 |
| A375 | 黑素瘤 | G | 3.00E+08 | 8 | 5 | 7 |
| H | 3.00E+08 | 8 | 1 | 4 | ||
| U87MG | 成蚀质细胞瘤 | I | 3.00E+08 | 9 | 1 | 1 |
| 表8.在无胸腺小鼠中用PPMK107静脉治疗皮下的人HT1080纤维肉瘤 | ||||||
| 异体移植物(＜8.5mm和＞5.5mm) | ||||||
| 完全 | 完全+ | ％ | ||||
| 剂量 | 计划 | N | 消退 | 部分消退 | 消退 | |
| 1.00E+09 | 一次注射 | 7 | 7 | 7 | 100％ | |
| 3.00E+08 | 一次注射 | 10 | 9 | 10 | 100％ | |
| 6.00E+07 | 一次注射 | 11 | 10 | 10 | 91％ | |
| 2.00E+07 | 一次注射 | 11 | 5 | 6 | 55％ | |
| 2.00E+07 | 三次注射 | 7 | 5 | 7 | 100％ | |
| 隔天一次 | ||||||
| 盐水 | 一次注射 | 10 | 0 | 0 | 0％ | |
| 盐水 | 三次注射 | 6 | 0 | 0 | 0％ | |
| 隔天一次 | ||||||
实施例4在无胸腺小鼠中用PPMK107经肿瘤内治疗大型A375黑素瘤异种移植物
的首次实验
无胸腺小鼠用1千万A375人黑素瘤细胞进行皮内注射。10天后，不同大小的肿瘤用单次PPMK107(剂量为3×108、9×108和1．5×109 PFU)或盐水注射进行处理。就那些最大径向为10至11mm的肿瘤来说，应答于这些剂量的PPMK107处理，所有9个肿瘤都完全消退，而就那些最大径向为8至9．5mm的肿瘤来说，应答于病毒治疗，24个肿瘤中有1 2个完全消退(P＜0．008，表9，部分A)。在用盐水处理的任何小鼠中都没有观察到肿瘤消退。
将这些相同的肿瘤按肿瘤体积分类也表明，在较大肿瘤体积的肿瘤中，完全消退的百分数高。应答于这些剂量的PPMK107，在体积＞300mm3(范围为304-397mm3)的17个肿瘤中有14个发生了完全消退，而在＜300mm3(范围为144至295；p＜0．023；表9，部分B)的16个肿瘤中有7个完全消退。
这些结果表明，肿瘤至少在长度为1cm或体积为300mm3时用PPMK107肿瘤内治疗至少与较小肿瘤同样敏感或更敏感。
实施例5在无胸腺小鼠中用PPMK107经肿瘤内治疗大型A375黑素瘤异种移植物
的第二次实验
如实施例14中，肿瘤在肿瘤细胞接种10天后建立。治疗包括不同剂量的PPMK107(3×106 PFU、3×103 PFU、3×108 PFU和1．5×109 PFU)或盐水。就最大径向为10至11．5mm的肿瘤来说，在用这些剂量的PPMK107处理的所有28个肿瘤中产生了完全或部分(至少50％)的消退，与此相对，在任何盐水处理的小鼠中没有发生消退(表10，部分A)。
当这些相同的肿瘤按肿瘤体积进行分类时，所有26个大于300mm3(范围为309-525mm3)的肿瘤应答于PPMK107都完全或部分消退(至少50％)，与此相对，用盐水处理的小鼠都没有发生消退(表10，部分B)。
这些结果证明，长度至少为1cm或体积至少为300mm3的肿瘤对PPMK107肿瘤内治疗敏感。
实施例6在无胸腺小鼠中用PPMK107经肿瘤内治疗大型A375黑素瘤异种移植物
的第三次实验
如实施例4，肿瘤在肿瘤细胞接种19天后建立。肿瘤内治疗包括不同剂量的PPMK107(3×108、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102 PFU)或盐水。就最大径向为12．5至14mm的肿瘤(体积范围：632至787mm3；平均体积为698mm3)来说，3只用3x108 PFU处理的小鼠中有2只产生了至少50％的消退，与此相对，在用盐水处理的小鼠中没有发生消退(表11)。在使用相同剂量的PPMK107(3×108 PFU)处理最大径向为10至12mm的肿瘤(体积范围：320至600mm3；平均体积：411mm3)的肿瘤时，8只小鼠有7只显示至少25％的消退(p＜0．001，至少25％消退，与不显示消退的用盐水处理的小鼠比较，表11)。在肿瘤长度为10至12mm的小鼠中，在用3×106 PFU、3×105 PFU、3×104 PFU、3×103 PFU处理时也观察到至少25％的消退，但用3×102 PFU或盐水处理却没有观察到(表11)。
这些结果证明，长度至少为1cm或体积至少为300mm3的肿瘤对PPMK107肿瘤内治疗敏感。
实施例7在无胸腺小鼠中用PPMK107经肿瘤内治疗大型A375黑素瘤异种移植物
的第四次实验
最大径向为10至12mm的肿瘤按实施例4在肿瘤细胞接种后13天建立。肿瘤内治疗包括单次注射3×108 PFU的PPMK107或盐水。用PPMK107处理的这些肿瘤的体积范围为295至600mm3(平均肿瘤体积为437mm3)。每个处理组中的小鼠组在第0、2、3、4、7和14天处死，分析肿瘤的组织学。就那些至少观察了4天的小鼠来说，12只用PPMK107处理的小鼠有11只显示至少25％的消退，而与此相对，盐水组中8只没有一只显示(P＜0．0001，表12)消退。在PPMK107处理2天后，已经有两个肿瘤显示消退的迹象，但程度少于25％。
实施例8在无胸腺小鼠中用PPMK107经肿瘤内治疗大型A375黑素瘤异种移植物
的第五次实验
最大径向为10至12mm的肿瘤按实施例4在肿瘤细胞接种后20天建立。肿瘤内治疗包括单次注射3×108 PFU的PPMK107或盐水。用PPMK107处理的这些肿瘤的体积范围为361至756mm3(平均肿瘤体积为551mm3)。10只用PPMK107处理的小鼠有9只显示至少25％的消退，而与此相对，10只盐水组中没有一只显示消退(P＜0．0001，表13)。
实施例9使用PPMK107经静脉治疗大型HT1080纤维肉瘤异种移植物的第一次实
验
无胸腺小鼠用1千万HT1080人纤维肉瘤细胞进行皮下注射。6天后，肿瘤用单次PPMK107(剂量为1．5×109 PFU)或盐水注射进行处理。就那些最大径向为10至11mm的肿瘤来说，应答于一个剂量的PPMK107静脉内注射，6个肿瘤中有5个完全或部分消退，而与此相对，盐水处理的肿瘤没有一个消退(表14，P＜0．025)。这些结果证明，长度至少为1cm的肿瘤对PPMK107的静脉治疗敏感。
表14
实施例10
从正常细胞但不从肿瘤细胞中特异性清除PPMK107感染
为检测NDV毒株PPMK107的肿瘤特异性杀伤的机制，根据下面的标准选择代表性的肿瘤细胞：a)能够形成肿瘤，如在无胸腺小鼠中形成异种移植物；b)在给予PPMK107后，肿瘤异种移植物在体内被特异性地杀伤；c)肿瘤细胞在体外显示能被PPMK107杀伤，其杀伤的病毒浓度比杀伤有抗性的正常细胞的浓度低几个数量级；并且d)在混合培养时，肿瘤细胞必须容易与正常细胞区别。异源移植肿瘤包括KB头和颈癌细胞在应答于单独的PPMK107肿瘤内注射时，能显示83％的完全或部分消退，并且其在体外被PPMK107杀伤要比正常的原代成纤维细胞(CCD922-sk)敏感4个数量级，并且在混合培养时能容易地与CCD922-sk细胞区别。
因此，KB和CCD922-sk细胞的共培养物用0．0005的感染复数(m．o．i．，每个细胞加入的病毒比例)进行感染，感染持续5天，然后对病毒抗原(NDV P蛋白)进行免疫组化染色。正常细胞的感染在第2天达到高峰，用单层细胞的光学检查测定出很少或没有明显的细胞死亡。在感染后的第3天，正常细胞中的病毒表达数量明显减少，而肿瘤细胞的感染仍非常明显。正常细胞中的病毒抗原的数量在第4天和第5天基本上消失，而在肿瘤细胞中的感染通过肿瘤细胞群体迅速增加，导致共培养物中的肿瘤细胞大多数被破坏。
因此，正常细胞能被感染并且能容易地清除感染，其方式与IFN的抗病毒作用一致。尽管存在正常细胞分泌进培养基中的生理效应浓度的IFN，但肿瘤细胞不能应答而建立抗病毒状态，并被不受影响的病毒生长杀死。
实施例11
证明干扰素是在正常CCD922-sk细胞中清除病毒的重要组分
对干扰素介导CCD922-sk细胞清除PPMK107感染的能力这一假说进行了检验。将针对人干扰素α或人干扰素β的多克隆中和抗体单独或组合，每天加入到以0．0005的感染复数用PPMK107感染的CCD922-sk细胞的培养物中，感染持续3天。细胞中存在的病毒抗原的数量随中和抗体的浓度增高而增加，其中抗干扰素β抗体的作用比抗干扰素α抗体明显，这与成纤维细胞主要产生β型干扰素的报道相一致。
加入针对干扰素的中和抗体能使正常的非敏感细胞对PPMK107感染更易感支持了这样一种假说，即正常和肿瘤细胞被PPMK107杀伤的敏感性之间的关键差异在于正常细胞而不是肿瘤细胞能建立干扰素介导的抗病毒应答。
实施例12
证明干扰素β是其他正常细胞清除病毒的重要组分
在本实验中，确定了已知对PPMK107的杀伤作用有很高抗性的另一种正常细胞(NHEK，正常人上皮细胞)能通过向感染细胞的培养物加入如多克隆的抗干扰素β抗体变得更加敏感。NHEK(正常人上皮角质细胞)以0．0005或0．05的感染复数进行感染，并每天加入抗体，持续5天。
在低感染复数(0．0005)的感染培养物中，在感染后5天中抗体依赖的病毒抗原表达增加非常明显，但在实验的早期不那么明显。在以0．05的感染复数的PPMK107感染的培养物中加入抗体能导致病毒抗原在感染后第4和第5天明显增加。在感染后第2和第3天，加入中和性抗体产生病毒抗原的较少积累(图1)。
来自高感染复数样品的培养上清也通过在人HT1080纤维肉瘤肿瘤细胞上进行空斑实验滴定了存在的感染性病毒的数量：这是本实验室的一种标准实验系统。该分析的结果证明，在感染后第5天，在抗体处理的培养物中，相对于模拟处理的对照，感染性病毒的数量提高了19倍(图1)。
这些结果说明，正常细胞不被PPMK107杀伤的一般保护机制是通过一种干扰素相关的机制。
实施例13
干扰素β对PPMK107在肿瘤和正常细胞中感染的影响的比较
对外源加入的干扰素β对正常细胞(CCD922-sk)和对PPMK107高度敏感(KB)或中等敏感(HEp2)的肿瘤细胞的影响进行了比较。三种细胞的独立培养物在以0．0005的感染复数进行感染的1天前和2天后，用20、200或2000单位／ml的干扰素β进行处理。
在感染后第3天，正常细胞中存在的低水平的病毒抗原表达在使用所有剂量的干扰素时都被消除。相反，在高度敏感的KB肿瘤细胞中加入浓度为2或200单位／ml的干扰素能将病毒抗原表达的相对水平降低2倍，在1000单位／ml的干扰素时完全抑制。中等敏感的HEp2细胞在所有使用的干扰素剂量时能应答于外源干扰素清除病毒抗原的表达(图2)。
KB和CCD922-sk细胞对外源加入的干扰素β的抗病毒作用的敏感性的图谱与这些细胞被PPMK107杀伤的敏感性成反比。HEp-2细胞应答于干扰素作用的能力表明，这些细胞能有效地利用本实验中所用的干扰素浓度。类似地，KB细胞对高剂量的干扰素应答说明，不能建立干扰素介导的抗病毒应答不是由于干扰素途径中的绝对缺陷造成的，而仅是相对于正常细胞来说不敏感。
实施例14
低浓度的干扰素β对PPMK107感染正常和肿瘤细胞的影响
在本实验中正常细胞(CCD922-sk)和肿瘤细胞(KB)在用PPMK107以0．05的感染复数感染的前1天和感染后的第2天用低浓度的干扰素B(0．2、2和20单位／ml)处理。
在这些条件下，正常细胞显示剂量依赖的病毒抗原数量的减少，而在肿瘤细胞中相应水平的病毒抗原不受外源干扰素加入的影响(图3)。
实施例15
PPMK107的纯化方法A
PPMK107通过三重空斑纯化从中等毒性的新城疫病毒毒株Mass-MK107中获得。将大约1000PFU(空斑形成单位)活的PPMK107接种到每只10日龄的受精鸡蛋的尿囊腔内。在36℃温育46小时，将鸡蛋冷却，然后收集尿囊液。在1750xg离心30分钟除去细胞和细胞残渣。然后将澄清的尿囊液(含有病毒的上清)铺于20％／55％的不连续蔗糖梯度，在约100，000xg离心30分钟。从20％／55％界面收获纯化病毒，并对盐水进行透析以除去蔗糖。方法B
在本发明的另一个优选实施方案中，澄清的尿囊液在-70℃冷冻。融化后，将液体维持在1℃至4℃过夜，然后通过离心(1750xg离心30分钟)从病毒悬液中除去污染物质。此物质用不连续蔗糖梯度按上述方法超离进行进一步的加工。方法C
在另一个优选实施方案中，在不连续的蔗糖梯度上超离通过连续的流式超离的方法来完成。方法D
在另一个优选实施方案中，收集的尿囊液用含有5％甘露糖和1．0％的L-赖氨酸、pH8．0的缓冲液(ML缓冲液)稀释，并澄清，使用标示孔径为0．45u的滤膜用切向流过滤(TFF)置换ML缓冲液。收集含有ML缓冲液中的澄清病毒的渗透物，并在ML缓冲液中使用标示截止大小为300，000道尔顿的滤膜通过TFF纯化病毒。收集在此步骤中以存留物形式存在的ML缓冲液中的浓缩、纯化病毒，并在上样于用ML缓冲液平衡的Sephacryl S500(Pharmacia)凝胶渗透柱之前再次用ML缓冲液稀释。收集含有纯化的病毒的级份，混合，并可在ML缓冲液中使用标示截止大小为300，000道尔顿的滤膜通过TFF进行再次浓缩。结果*克隆病毒
通过空斑纯化制备PPMK107后，在病毒群体中发现有8个单独的分子克隆具有在NDV的融合蛋白基因中的超过300个连续核苷酸上有相同的序列(例如同源性为100％)。PPMK107是一种具有高度遗传均一性的克隆病毒。*PFU／mg蛋白
一种测定纯度的定量方法是通过测定PFU／mg蛋白。较高的值表示高水平的纯度。使用方法A可以获得至少4．8x1010的PFU／mg值(见表15)。使用方法C可以获得至少2．0×1010的PFU／mg值。对于一种NDV的中等毒性株，还没有见到这种纯度测量的文献中的值。NDV的一种中等毒性株的最好估计是病毒制备物(NDV MassMK107，lot RU2，按Faaberg KS和Peeples，ME，1988，J Virol 62：586；Bratt，MA和Rubin，H．1967，Virology 33：598-608的介绍制备)。该RU2 lot被发现具有1．3x109PFU／mg的蛋白。用方法A获得的纯度值比Peeples方法所获得的要好大约40倍(见表15)。*颗粒／PFU比
另一种测量纯度的定量方法是通过测定颗粒／PFU比。较低值表明高水平的纯度。颗粒计算可用标准方法用电子显微镜来进行。不管使用方法A或方法B，都可以达到接近1的颗粒／PFU值(表15)。
表15．病毒纯度
| 病毒制备方法 | 病毒 | 编号 | PFU／毫克蛋白 | 颗粒／PFU |
| 优选方法A | PPMK107 | L2 | 4．8×1010 | 0．80 |
| L4L5L6L7 | 6．9×10106．6×10107．7×10106．1×1010 | NTaNT0．55NT | ||
| 优选方法B | PPMK107 | D004D005D010 | 2．0×10104．5×10104．4×1010 | 0．320．52 |
| 优选方法C | PPMK107 | RD2RD3 | 5．6×10105．0×1010 | NTNT |
| aNT：未检测 |
使用方法A和C制备的病毒可允许NDV纯化到基本上不含污染的卵蛋白的水平。对于使用方法A制备的PPMK107 lot7制备物，在Western印迹中没有检测到卵清蛋白，Western印迹使用(1)每孔使用1．7×109 PFU纯化病毒(宽度为3．3 cm)在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(1mm厚)上电泳；(2)硝酸纤维素膜用于转移，以及(3)兔抗卵清蛋白(Cappel的兔IgG级份，4mg／ml抗体浓度的1∶200稀释物)。对于使用方法D制备、并用SDS-PAGE接着用银染进行分析的PPMK107制备物，没有观察到相当于卵清蛋白的带。
实施例16使用PPMK107来在无胸腺小鼠中防止因ES-2卵巢癌腹水而死亡
在本实验中，所有的无胸腺小鼠(雌性，NCR nu／nu，8周龄)都给予一次106的ES-2细胞的腹膜内注射。7天后，在腹水形成之前，将它们用盐水或PPMK107(1×109 PFU)经腹膜内处理。如图4所示，与用盐水处理相比，用PPMK107处理的动物中，存活有明显的提高。在处理后7天，盐水处理组的小鼠多数已形成腹水，并在38天后，这些动物全部死亡。与此明显不同，92％的用PPMK107处理的小鼠在38天后仍然存活，并且25％的这些动物长期存活(存活＞120天)。
实施例17
当腹水存在时在无胸腺小鼠中用PPMK107治疗ES-2卵巢癌
在本实验中，所有的无胸腺小鼠(雌性，NCR nu／nu，8周龄)都给予一次106的ES-2细胞的腹膜内注射。14天后，当多数小鼠已形成腹水时，将没有形成腹水的小鼠排除，将有腹水的小鼠随机分成7个腹膜内处理组(PPMK107-在第0天处理一次；PPMK107-在第一周处理两次；PPMK107-每周处理一次；PPMK107-每周处理两次；盐水-在第0天处理一次；盐水一在第一周处理两次；盐水-每周处理两次)。每次病毒处理使用1×109 PFU／小鼠的剂量。所有小鼠在第一次处理和任何额外处理前都抽出腹水。第0天指第一次处理当天。
对每只小鼠的腹水程度进行测量并记录如下：
| 腹水指数 | 腹水程度 |
| 1．0 | 动物表现正常-很少或没有腹水存在 |
| 2．0 | 腹部轻微肿胀；动物有正常功能 |
| 3．0 | 腹部肿胀；动物移动缓慢，身体呈弓形，行走摇晃 |
| 4．0 | 腹部完全肿胀；动物濒死 |
| 5．0 | 腹水形成后死亡 |
如表16中所示，在最初处理后的第7天和第10天，所有盐水处理的动物比PPMK107处理的动物具有发展程度更高的腹水。在最初处理后第7天，每个盐水组具有的平均腹水指数超过3．5，而所有的PPMK处理组具有的平均腹水指数为3．0或更低。与此类似，在最初处理后第10天，每个盐水组具有的平均腹水指数高于4．5，而所有的PPMK107处理组具有的平均腹水指数至少为4．1或更低。这些结果表明，与盐水对照相比，病毒处理动物中的腹水产生明显降低。
表16．当腹水已经存在时，在无胸腺小鼠中用PPMK107治疗ES-2卵巢癌
| 处理 | 小鼠数目 | 平均腹水指数，第7天 | 平均腹水指数，第10天 |
| 盐水×1 | 12 | 4.3 | 4.7 |
| 盐水×2 | 12 | 3.7 | 4.6 |
| 盐水×2每周 | 12 | 4.3 | 4.8 |
| PPMK107×1 | 17 | 3.0 | 4.1 |
| PPMK107×2 | 17 | 2.3 | 3.6 |
| PPMK107×1每周 | 17 | 2.6 | 2.6 |
| PPMK107×2每周 | 17 | 2.2 | 3.6 |
实施例18
使用脱敏剂量的PPMK107来降低PPMK107随后剂量的致死性
C57BL／6小鼠(7周龄)在第0天用盐水或脱敏剂量的PPMK107(3x108PFU／小鼠)进行静脉注射。2天后，将每组小鼠进一步分组，来用盐水或PPMK107(剂量为1×109、2．5×109、5×109和1×lO10PFU／小鼠)进行静脉给药。如表17所示，当盐水用于预处理小鼠时，在随后用2．5×109、5×109和1×1010PFU给药的小鼠中记录到了死亡。5×109PFU和1×1010PFU的剂量对用盐水预处理的小鼠有100％的致死性。相反，在第0天给予了一个脱敏剂量的PPMK107接着在2天后注射高达1×1010PFU水平的PPMK107的任何小鼠组中都没有观察到死亡。这些数据表明，PPMK107可以用来防止使用这种相同药剂随后给药的致死性．而且，当使用这种病毒作为脱敏试剂时，PPMK107的最大耐受剂量可以提高适当的数量级。
表17．使用脱敏剂量的PPMK107来降低PPMK107随后剂量的致死性
| 组 | 在第0天注射 | 第2天给药 | 小鼠数 | 死亡数 | 致死率％ |
| 1 | 盐水 | 盐水 | 8 | 0 | 0 |
| 2 | 盐水 | PPMK107，1．0E+09 | 8 | 0 | 0 |
| 3 | 盐水 | PPMK107，2．5E+09 | 8 | 3 | 38 |
| 4 | 盐水 | PPMK107，5．0E+09 | 8 | 8 | 100 |
| 5 | 盐水 | PPMK107．1．0E+10 | 8 | 8 | 100 |
| 6 | PPMK107，3E+08 | 盐水 | 8 | 0 | 0 |
| 7 | PPMK107．3E+08 | PPMK107，1．0E+09 | 8 | 0 | 0 |
| 8 | PPMK107，3E+08 | PPMK107，2．5E+09 | 8 | 0 | 0 |
| 9 | PPMK107，3E+08 | PPMK107，5．0E+09 | 8 | 0 | 0 |
| 10 | PPMK107，3E+08 | PPMK107．1．0E+10 | 8 | 0 | 0 |
实施例19
较慢的静脉注射速率降低PPMK107的毒性
用氯胺酮／噻拉嗪混合物将22只无胸腺小鼠(8周龄)麻醉，并置入一个夹子来在注射过程中帮助阻止其活动，这样就可以进行缓慢或快速注射PPMK107。对于慢注射组，0．2 mL在盐水中的4×109 PFUPPMK107经静脉在4分钟内注射，每10至15秒注射0．01ml。快注射组接受相同的剂量和体积，但在30秒的时间内给药。如表18所示，在4分钟内接受PPMK107给药的动物的最大体重损失(在给药后第2天记录)是在30秒内接受相同IV剂量的动物的一半。这些结果表明，PPMK107在较慢的速率进行注射时，对于静脉给药来说，具有较低的毒性并且更安全。
表18．较慢的IV注射PPMK107导致毒性降低
| 组 | 给药时间长度 | 小鼠数目 | 最大体重丧失百分数 |
| 4E+09快速注射 | 30秒 | 12％ | |
| 4E+09慢注射 | 4分钟 | 6％ |
实施例20
在晚期癌症病人的治疗中使用PPMK107
PPMK107已在美国通过静脉途径进行了Ⅰ期临床试验。23名不再适合于治疗的晚期实体瘤病人用PPMK107进行了治疗。这些病人中有17名接受了单一剂量进行最初的疗程。其他6名病人接受每周3次剂量，进行一周的最初疗程。每月追踪一次每名病人的肿瘤大小。具有至少稳定病情的病人(在没有任何新的病灶的情况下，所有可测量的肿瘤的产物总量的增加少于25％，减少少于50％)适合于每月进行额外的疗程。可触肿瘤的消退
一名68岁的患有结肠癌的老年妇女在其广泛的转移瘤中有一个可触摸的腹部瘤。在用PPMK107进行单次IV治疗后，该病人在两周的疗程后，她的这个单独的腹腔壁肿瘤有91％的消退(表19)。在给药1天后该肿瘤的测量值(3．75×3cm)与4×3cm的基础测量值相似。但在给药7天后，该肿瘤的大小减少至2×2cm，并且在PPMK107给药14天后继续减少至大小1．5×1．5cm。在进行PPMK107治疗前，该肿瘤在PPMK107给药前的2周内肿瘤体积快速增加了1065％。该病人由于其他部位的肿瘤继续增长而在研究过程中去世。
表19．病人#123(患有迁移性结肠癌的68岁的老年妇女)中可触的
腹腔壁肿瘤在一次120亿PFU／m2的IVPPMK107剂量后的大小
癌症的稳定
| 日期 | 给药后的时间 | 肿瘤大小(L×W，cm)3 | 肿瘤体积(0 ．5×L×W×W，cm3) | 肿瘤体积减小的％ |
| 7／23／98 | 0天 | 4×3 | 18． | - |
| 7／24／98 | 1天 | 3 ．75×3 | 16 ．9 | 6％ |
| 7／30／98 | 7天 | 2×2 | 4 ．0 | 78％ |
| 8／6／98 | 14天 | 1 ．5×1 ．5 | 1 ．7 | 91％ |
8名病人在以前用常规癌症疗法治疗时，肿瘤都在发展，他们在给予了PPMK107后都获得了益处，他们正在发展的癌症被稳定下来。这些病情稳定的病人代表了不同类型的癌症，包括肾癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌。在3个月的PPMK107治疗后，一名患有晚期和广泛扩散的肾癌的67岁的老人目前已经病情稳定，没有任何新的生长的迹象，没有肿瘤大小增加的迹象。PPMK107的剂量越高，病情稳定益处的比例也越高：6名病人中有2名(33％的病人)在头两个单一剂量水平(59和120亿PFU／m2)获得病情稳定，在最高单一剂量(240亿PFU／m2)时，5名病人有4名(80％的病人)获得了病情稳定(表20)。
表20．用PPMK107治疗晚期癌症病人
疼痛药物的减少
| 剂量水平(十亿PFU／m2) | 用此剂量水平治疗的病人数目 | 病情稳定的病人数目 | 病情稳定的病人％ | 至少在一个月内病情稳定的癌症种类及病情稳定的时间 |
| 5．9 | 6 | 2 | 33％ | 肾癌-持续3个月肺癌-持续2个月 |
| 12 | 6 | 2 | 33％ | 胰腺癌-持续2个月卵巢癌-持续1个月 |
| 24 | 5 | 4 | 80％ | 乳腺癌-持续1个月乳腺癌-持续1个月肺癌-持续1个月胰腺癌-持续1个月 |
| 总数 | 17 | 8 | 47％ | 上面标出 |
一名病人在单一剂量为59亿PFU／m2剂量水平时用PPMK107治疗获得了益处，其形式为癌症疼痛的症状得到了缓解，这可由麻醉疼痛药物的减少看出。脱敏
首次剂量(为59亿PFU／m2)的明显脱敏作用可以在同一周内的后续给药(也为59亿PFU／m2)上观察到。一般来说，报道的第二次和第三次给药的副作用非常少。例如，在此多剂量疗程中(一周三次，进行一周)，尽管接受了用对乙酰氨基酚和布洛芬进行的预防性抗热处理，前4名病人在第一次给药时仍然发烧。这些病人在接受第二次和第三次给药时多数没有发烧，即使在没有接受抗热药物时也是如此。这说明，在每周三次的治疗计划中，第一次给药能减少第二次和第三次给药的毒性。通过血清中的中和抗体的给药
使用此Ⅰ期临床研究的剂量范围(≥59亿PFU／m2)，有明显的证据表明，在病人已经产生中和抗体的情况下，也能将病毒有效传递给病人。一名患有胰腺癌的72岁老年妇女在接受120亿PFU／m2单一剂量水平后，从PPM107治疗开始的2个月中病情稳定。在第一次给药1个月后，当病人已开始在其血清内产生中和性抗体时，进行第二个疗程的给药(包括一次单一的PPMK107 IV剂量)。在此第二个疗程的7天后，她的尿中为PPMK107阳性，滴度至少为40 PFU／mL。这个结果表明，该病人血清中的抗PPMK107中和抗体不能完全抑制病毒的第二个疗程。
实施例21
新城疫病毒PPNJROAKIN的细胞毒试验结果概述
人肿瘤细胞和正常细胞在24孔组织培养皿中生长至约80％连汇。移去生长培养基，将PPNJROAKIN(空斑纯化的中等毒性的新城疫病毒株New Jersey Roakin-1946的克隆)经10倍稀释后加入，范围为107空斑形成单位(PFU)／孔至1 PFU／孔。每个皿中都包括没有加入病毒的对照孔。病毒在一个旋转平台上在37℃吸收90分钟。在温育期结束时，移去病毒稀释物，代之以1 ml生长培养基。然后将皿在37℃在5％CO2中温育5天。细胞毒通过使用MTT(2-[4、5-二-甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(Cell Titer 96，catalog#G4000，Progema Corporation，Madison WI 53711)进行测量，MTT比色法在570 nm处进行监测，能监测线粒体酶的活性(Mosman T．，1983，J．Immunol．Methods 65：55)。病毒处理的孔中的存活以未处理对照孔的百分数来表示。数据用PFU／孔对以对照的百分数形式表示的存活性来作图。IC50通过能产生50％活细胞数量减少的PFU／孔的病毒数量来计算。
表21．PPNJROAKIN的细胞毒试验结果概述
| 细胞类型 | 细胞系 | IC50(PFU／孔) |
| 纤维肉瘤 | HT1080 | 13．8 |
| 头和颈癌 | KB | 2．4 |
| 正常成纤维细胞 | CCD922sk | 1．2×104 |
这些结果(表21)表明，PPNJR0AKIN证明了相对于正常的皮肤成纤维细胞，至少对两种不同的人肿瘤细胞(HT1080和KB)具有肿瘤选择性杀伤作用。两种肿瘤细胞系的IC50值比正常细胞低800至5000倍。
实施例22
新城疫病毒PPCONN70726的细胞毒试验结果概述
人肿瘤细胞和正常细胞在24孔组织培养皿中生长至约80％连汇。移去生长培养基，将PPCONN70726(空斑纯化的中等毒性的新城疫病毒株Connecticut的克隆)经10倍稀释后加入，范围为107空斑形成单位(PFU)／孔至1 PFU／孔。每个皿中都包括没有加入病毒的对照孔。病毒在一个旋转平台上在37℃吸收90分钟。在温育期结束时，移去病毒稀释物，代之以1ml生长培养基。然后将皿在37℃在5％CO2中温育5天。细胞毒通过使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(Cell Titer 96，catalog#G4000，ProgemaCorporation，Madison WI 53711)进行测量，MTT比色法在570 nm处进行监测，能监测线粒体酶的活性(Mosman T．，1983，J．Immunol．Methods 65：55)。病毒处理的孔中的存活以未处理对照孔的百分数来表示。数据用PFU／孔对以对照的百分数形式表示的存活性来作图。IC50通过能产生50％活细胞数量减少的PFU／孔的病毒数量来计算。
表22．PPCONN70726的细胞毒试验结果概述
| 细胞类型 | 细胞系 | IC50(PFU／孔) |
| 头和颈癌 | KB | 18．1 |
| 成蚀质细胞瘤 | U87MG | 12．7 |
| 成蚀质细胞瘤 | U373MG | 879 |
| 正常成纤维细胞 | CCD922sk | 7．3×104 |
这些结果(表22)表明，PPCONN70726证明了相对于正常的皮肤成纤维细胞，至少对三种不同的人肿瘤细胞(KB、U87MG和U373MG)具有肿瘤选择性杀伤作用。两种肿瘤细胞系的IC50值比正常细胞低800至5000倍。
实施例23使用PPMK107、PPNJROAKIN或PPCONN70726在无胸腺小鼠中肿瘤内治
疗HT1080纤维肉瘤异种移植物
在本实验中，无胸腺小鼠(雌性、NCR nu／nu，5至6周龄)接受一次107HT1080肿瘤细胞的皮下注射。4天后，当肿瘤大小达到6至8．5mm时，小鼠用盐水、PPMK107(1x108。CFU)、PPNJROAKIN(1x108CFU)或PPCONN7026(1x108CFU)进行肿瘤内处理．如表23所示，用这三种病毒(PPMK107、PPNJROAKIN或PPCONN70726)处理的小鼠中观察到了肿瘤消退。在PPMK107处理后，12只小鼠有4只肿瘤完全消退，有6只部分消退。在PPNJROAKIN处理后，12只小鼠有1只小鼠肿瘤完全消退，2只小鼠部分消退。在PPCONN70726处理后，12只小鼠有3只肿瘤完全消退，2只部分消退。在盐水处理的任何动物中，都没有观察到肿瘤消退。这些结果显示三种中等毒性的NDV毒株都能引起肿瘤消退。表23．在用剂量均为1×108PFU的三种病毒(PPMK107、PPNJKOAKIN和PPCONN70726中的一种处理后，无胸腺小鼠中的HT纤维肉瘤肿瘤的
消退)
| 消退 | ||||
| 处理 | 小鼠数目 | 部分(PR) | 完全(CR) | PR+CR(％) |
| PPMK107 | 12 | 6 | 4 | 10(83％) |
| PPNJROAKIN | 12 | 2 | 1 | 3(25％) |
| PPCONN70726 | 12 | 2 | 3 | 5(42％) |
| 盐水 | 11 | 0 | 0 | 0(0％) |
实施例24PPMK107、PPNJROAKIN、PPCONN70726在脑内注射进免疫缺陷的无胸腺
小鼠(nu／nu)和免疫活性的杂合小鼠(nu／+)后的作用
56只无胸腺小鼠(nu／nu)和56只免疫活性的杂合小鼠(nu／+)用盐水、PPMK107、PPNJROAKIN或PPCONN70726进行立体定位的脑内注射。每种类型的另外8只小鼠用作未处理的对照。病毒使用两个剂量水平(2×104或3．5×106 PFU／鼠)中的一个。如表24所示，在39天内，所有用三种病毒以两个剂量水平处理的杂合nu／+小鼠都存活，一个例外是一只用低剂量水平的PPCONN70726处理的小鼠非神经症状死亡。用PPMK107或PPCONN70726处理的无胸腺nu／nu动物的存活明显少于杂合小鼠。这在3．5×106 PFU／鼠的最高PPMK107或PPCONN70726病毒剂量时尤其如此，其中在每个病毒组中只有13％(8只中的1只)的无胸腺动物存活至39天。相反，在用相同剂量水平(3．5×106 PFU／鼠)的PPNJROAKIN处理的无胸腺小鼠中有75％的存活。这些数据表明，PPNJROAKIN比其他两种病毒株能更好地在无胸腺小鼠的脑中耐受。
表24．脑内注射PPMK107、PPCONN7072和PPNJROAKIN后小鼠的存活
*在此处理组中的一个非存活小鼠是因非神经症状死亡
| 脑内注射 | 小鼠数目 | 在第39天的存活％ | |
| nu／+ | 未处理 | 8 | 100 |
| nu／+ | 盐水 | 8 | 100 |
| nu／+ | PPMK107，2E+04 | 8 | 100 |
| nu／+ | PPMK107，3．5E+06 | 8 | 100 |
| nu／+ | PPCONN70726，2E+04 | 8 | 88* |
| nu／+ | PPCONN70726，3．5E+06 | 8 | 100 |
| nu／+ | PPNJROAKIN，2E+04 | 8 | 100 |
| nu／+ | PPNJROAKIN，3．5E+06 | 8 | 100 |
| nu／nu | 未处理 | 8 | 100 |
| nu／nu | 盐水 | 8 | 100 |
| nu／nu | PPMK107，2E+04 | 8 | 75 |
| nu／nu | PPMK107，3．5E+06 | 8 | 13 |
| nu／nu | PPCONN70726，2E+04 | 8 | 75 |
| nu／nu | PPCONN70726，3．5E+06 | 8 | 13 |
| nu／nu | PPNJROAKIN，2E+04 | 8 | 100 |
| nu／nu | PPNJROAKIN，3．5E+06 | 8 | 75 |
实施例25
辛德毕斯病毒PPSINDBIS-Ar339的细胞毒试验结果概述
人肿瘤细胞和正常细胞在24孔组织培养皿中生长至约80％连汇。移去生长培养基，将PPSINDBIS-Ar339(空斑纯化的辛德毕斯病毒克隆)经10倍稀释后加入，范围为107空斑形成单位(PFU)／孔至1PFU／孔。每个皿中都包括没有加入病毒的对照孔。病毒在一个旋转平台上在37℃吸收90分钟。在温育期结束时，移去病毒稀释物，代之以1 ml生长培养基。然后将皿在37℃在5％CO2中温育5天。细胞毒通过使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(CellTiter 96，catalog#G4000，Progema Corporation，Madison WI53711)进行测量，MTT比色法在570 nm处进行监测，能监测线粒体酶的活性(Mosman T．，1983，J．Immunol．Methods 65：55)。病毒处理的孔中的存活以未处理对照孔的百分数来表示。数据用PFU／孔对以对照的百分数形式表示的存活性来作图。IC50通过能产生50％活细胞数量减少的PFU／孔的病毒数量来计算。
表25．“PPSINDBIS-Ar339的细胞毒试验结果概述
| 细胞类型 | 细胞系 | IC50(PFU/孔) |
| 胰腺癌 | Panc-1* | 69 |
| 结肠直肠癌 | SW620* | 13 |
| 结肠直肠癌 | SW1463 | 1.8×105 |
| 非小细胞 | ||
| 肺癌 | A427 | ＞1×106 |
| 非小细胞 | A549 | 5.2×104 |
| 肺癌 | ||
| 肾癌 | A498 | 2.4×104 |
| 肾癌 | Caki-l | 3.4×104 |
| 纤维肉瘤 | HT1080 | 7.4×105 |
| 正常角质细胞正常 | NHEK | 2.0×105 |
| 成纤维(细胞) | CCD922sk | 1.6×105 |
“已知能过量表达高亲和性层粘连蛋白受体mRNA的细胞
辛德毕斯病毒在哺乳动物细胞上的细胞受体是高亲和性层粘连蛋白受体，后者主要表达于上皮细胞系的细胞，但经常在多种迁移性癌细胞如Panc-1胰腺癌细胞系和SW620结肠腺癌细胞系中过量表达(Campo et al．，(1992)Am．J．Pathol．141，1073-1083；Yow etal．，(1988)Proc．Natl．Acad．Sci．，85，6394-6398)。相反，直肠腺癌细胞系SW1423已知表达非常低水平的高亲和性层粘连蛋白受体mRNA(Yow et al．，(1988)Proc Natl Acad Sci，85，6394-6398)，并且对PPSINDBIS-Ar339的杀伤作用的抗性比SW620细胞要高4个数量级。这些结果(表25)证明，致瘤性和表达高水平的高亲和性层粘连蛋白受体的细胞对辛德毕斯克隆PPSINDBIS-Ar339的杀伤作用比其他肿瘤或正常细胞更加敏感。
实施例26
在存在干扰素时VSV对致瘤性和非致瘤性细胞的杀伤作用
在96孔板中，致瘤性的KB和HT1080细胞(3×104细胞每孔)和非致瘤性的WISH细胞(2．5×104细胞／孔)在存在系列稀释的干扰素α(范围为2800至22单位／ml)的情况下接种，并在37℃温育24小时。然后用水疱性口炎病毒(VSV，Indiana株)以10的感染复数感染细胞。对照包括没有干扰素的细胞和没有干扰素或病毒的细胞。将细胞在37℃温育24小时。细胞毒通过使用MTT(2-[4、5-二甲基噻唑-2-基]-2、5-二苯基溴化四唑)比色法(Cell Titer 96，catalog#G4000，Progema Corporation，Madison WI 53711)进行测量，MTT比色法在570 nm处进行监测，能监测线粒体酶的活性(Mosman T．，1983，J．Immunol．Methods 65：55)。病毒处理的孔中的存活以没有接受病毒的对照孔的活性百分数来表示。
表26．VSV在用外源干扰素处理的细胞中的杀细胞活性的比较
| 存活细胞百分比 | |||
| WISH | HT1080 | KB | |
| 100U／ml IFN | 50 | 6 | 0 |
| 1000U／ml IFN | 95 | 20 | 12 |
这些结果(表26)证明，VSV能够选择性地杀伤在干扰素应答中有缺陷的肿瘤细胞(见实施例27)。WISH细胞(人羊膜细胞)是一个成熟的用于干扰素生物试验的细胞系，因为它们能有效地应答干扰素。
实施例27
对PPMK107的杀伤作用敏感或抗性的细胞中的干扰素应答
将单独的细胞系在96孔板中生长至接近连汇，并用5至5000 U／ml的INFαA处理24小时。然后用PPMK107以1．0的感染复数感染培养物，并继续培养另外24小时。在化学固定后，病毒表达的数量使用一种可溶性指示剂染料通过免疫组化的方法进行定量。病毒生长的数量用相对于未用干扰素处理的对照细胞的P抗原表达的百分数来表示(图5)。在此试验中，干扰素应答细胞显示应答于干扰素至少有50％的病毒抗原减少。图5中对PPMK107敏感的细胞用实线表示，较低敏感的细胞用虚线表示。
本实验的结果显示，在细胞系对外源干扰素的抗病毒作用的抗性与细胞对PPMK107杀伤作用的相对敏感性(用图说明中细胞系名称附近的括号内显示的IC50表示，见图5)之间有很高的相关性。例如，在用5U／ml的干扰素预处理后，对干扰素不应答的7个细胞系中有6个(86％)对PPMK107的杀伤作用敏感，当用500U／ml干扰素预处理时，所有的非应答细胞系(4个中的4个)都对PPMK107的杀伤作用敏感。上述数据也提供了一个筛选试验的例子，这种筛选试验可用来鉴定可能对PPMK107或其他干扰素敏感病毒的杀伤作用敏感的候选细胞。例如，在用外源干扰素预处理后能表达明显(例如比对照多50％)的病毒抗原的感染细胞，将被认为是干扰素缺陷的，并因而对病毒的溶癌作用敏感。
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上述内容是用来说明本发明而不是为了限制。在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以进行多种改变和修饰。
Claims (127)
1．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的克隆RNA病毒给药于所说的哺乳动物。
2．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种复制活性的克隆RNA病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的病毒对干扰素敏感。
3．一种在哺乳动物中治疗赘生物的方法，包括将一种治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆RNA病毒给药于所说的哺乳动物。
4．权利要求1的方法，其中所说的RNA病毒在存在干扰素时比在没有干扰素时复制至少要低100倍。
5．权利要求1的方法，其中所说的RNA病毒在存在干扰素时比在没有干扰素时复制至少要低1000倍。
6．权利要求1的方法，其中所说的给药步骤是系统性的。
7．权利要求1的方法，其中所说的赘生物是一种癌。
8．权利要求1的方法，其中所说的哺乳动物是人。
9．权利要求1的方法，其中所说的克隆病毒是一种空斑纯化的病毒。
10．权利要求1的方法，其中所说的克隆病毒来源于重组克隆。
11．权利要求1的方法，其中所说的RNA病毒是一种副粘病毒。
12．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至至少为2x109PFU／毫克蛋白的水平。
13．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至至少为1×1010 PFU／毫克蛋白的水平。
14．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至至少为6×1010 PFU／毫克蛋白的水平。
15．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至这样一种水平，即颗粒／PFU比不大于5。
16．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至这样一种水平，即颗粒／PFU比不大于3。
17．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至这样一种水平，即颗粒／PFU比不大于1．2。
18．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒是禽副粘病毒2型。
19．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒是NDV。
20．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒是腮腺炎病毒。
21．权利要求11的方法，其中所说的副粘病毒是人副流感病毒。
22．权利要求1的一种方法，其中所说的RNA病毒选自弹状病毒、披盖病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、微核糖核酸病毒和日冕形病毒。
23．权利要求22的方法，其中所说的披盖病毒是辛德毕斯病毒。
24．权利要求22的方法，其中所说的呼肠孤病毒在ω3有一个修饰。
25．权利要求22的方法，其中所说的呼肠孤病毒在ω1有一个减毒突变。
26．权利要求22的方法，其中所说的呼肠孤病毒是一种减毒的轮状病毒。
27．权利要求26的方法，其中所说的轮状病毒是轮状病毒WC3。
28．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的克隆痘苗病毒给药于所说的哺乳动物，其中痘苗病毒在选自K3L、E3L和B18R的基因的一个或多个中有一个或多个突变。
29．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种复制活性的克隆痘苗病毒给药于所说的哺乳动物，其中痘苗病毒在选自K3L、E3L和B18R的基因的一个或多个中有一个或多个突变，其中所说的病毒对干扰素敏感。
30．一种在哺乳动物中治疗赘生物的方法，包括将一种治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆痘苗病毒给药于所说的哺乳动物，其中痘苗病毒在选自K3L、E3L和B18R的基因的一个或多个中有一个或多个突变。
31．权利要求30的方法，其中所说的哺乳动物是人。
32．权利要求30的方法，其中所说的痘苗病毒是一种在选自编码痘苗生长因子、胸苷激酶、胸苷酸激酶、DNA连接酶、核糖核苷酸还原酶和dUTP酶的基因的一种基因中具有一种减毒突变的痘苗病毒。
33．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的克隆DNA病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的DNA病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒和虹色病毒。
34．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种复制活性的克隆DNA病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的DNA病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒和虹色病毒，其中所说病毒对干扰素敏感。
35．一种在哺乳动物中治疗赘生物的方法，包括将一种治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆DNA病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的DNA病毒选自腺病毒、细小病毒、乳多空病毒和虹色病毒。
36．权利要求33的方法，其中所说的哺乳动物是人。
37．权利要求33的方法，其中所说的腺病毒在VA1转录物中有一个修饰，使所说的腺病毒变得对干扰素敏感。
38．权利要求37的方法，其中所说的腺病毒选自疫苗株Ad-4、Ad-7和Ad-21。
39．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的克隆的疱疹病毒给药于所说的哺乳动物。
40．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种复制活性的克隆的疱疹病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的病毒对干扰素敏感。
41．一种在哺乳动物中治疗赘生物的方法，包括将一种治疗有效量的干扰素敏感的、复制活性的克隆疱疹病毒给药于所说的哺乳动物。
42．权利要求41的方法，其中所说的疱疹病毒是乙型疱疹病毒亚科或丙型疱疹病毒亚科的一个成员。
43．权利要求41的方法，其中所说的疱疹病毒是甲型疱疹病毒亚科的一个成员，但不是HSV-1。
44．权利要求41的方法，其中所说的哺乳动物是人。
45．权利要求41的方法，其中所说的疱疹病毒是甲型疱疹病毒亚科的一个成员，它的(2’-5’)An类似物的表达减少。
46．权利要求45的方法，其中所说的疱疹病毒在选自编码胸苷激酶、核糖核苷酸还原酶的基因中有一个减毒突变，或在b’a’c’反向重复位点中有一个删除。
47．权利要求45的方法，其中所说的疱疹病毒在γ34．5基因中有一个修饰。
48．权利要求41的方法，其中所说的疱疹病毒在γ34．5基因中有一个修饰，并在编码胸苷激酶的基因中有一个减毒突变，或在b’a’c’反向重复位点或功能类似位点中有一个删除。
49．权利要求41的一种方法，其中所说的疱疹病毒是在选自编码胸苷激酶、核糖核苷酸还原酶的一个基因中有一个减毒突变或在b’a’c’反向重复位点中有一个删除的疱疹病毒。
50．权利要求1的方法，其中所说的赘生物是一种选自肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌和脑癌的癌症。
51．权利要求1的方法，其中所说的赘生物是一种实体瘤。
52．权利要求50的方法，其中所说的脑癌是一种成蚀质细胞瘤。
53．权利要求1的方法，其中所说的病毒含有一个编码干扰素的基因，使病毒表达干扰素。
54．权利要求1的方法，其中所说的病毒含有一个编码一种药物前体活化酶的基因。
55．权利要求1的方法，进一步包括在所说的病毒给药前、给药过程中、给药后给予IFN。
56．权利要求55的方法，其中所说的干扰素选自α-IFN、β-IFN、ω-IFN、γ-IFN和IFN的合成的共有形式。
57．权利要求1的方法，进一步包括在所说的病毒给药前、给药过程中，给药后，给予一种酪氨酸激酶抑制剂。
58．权利要求1的方法，进一步包括给予一种选自嘌呤核苷类似物、酪氨酸激酶抑制剂、西咪替丁和线粒体抑制剂的化合物。
59．权利要求1的方法，进一步包括在所说的病毒给药前、给药过程中、给药后，给予一种化疗试剂。
60．权利要求1的方法，进一步包括在所说的病毒给药前、给药过程中、给药后，给予一种细胞因子。
61．权利要求1的方法，进一步包括在所说的病毒给药前、给药过程中、给药后，给予一种免疫抑制剂。
62．权利要求1的方法，进一步包括给予病毒复制控制数量的一种选自IFN、三氮唑核苷、无环鸟苷和更昔洛韦的化合物。
63．权利要求1的方法，其中所说的给药是经静脉或肿瘤内。
64．一种在哺乳动物中用病毒感染大小至少为1厘米的赘生物的方法，包括将选自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)细小病毒；(4)乳多空病毒；(5)疱疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹色病毒的克隆病毒给药于所说的哺乳动物。
65．一种在哺乳动物中治疗赘生物的方法，包括将治疗有效量的选自(1)RNA病毒；(2)嗜肝DNA病毒；(3)细小病毒；(4)乳多空病毒；(5)疱疹病毒；(6)痘病毒；和(7)虹色病毒的克隆病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的赘生物大小至少为1厘米。
66．权利要求64的方法，其中所说赘生物至少体积为300mm3。
67．权利要求64的方法，其中所说的RNA病毒是一种副粘病毒。
68．权利要求67的方法，其中所说的副粘病毒是NDV。
69．权利要求64的方法，其中所说的哺乳动物是人。
70．权利要求64的方法，其中给药是经静脉或肿瘤内。
71．权利要求64的方法，其中所说的副粘病毒被纯化至至少为2×109 PFU／毫克蛋白的水平。
72．权利要求68的方法，其中所说的NDV是中等毒性的。
73．权利要求65的方法，其中所说的赘生物是癌性的。
74．一种在哺乳动物中治疗肿瘤的方法，包括将一种治疗有效量的对所说肿瘤有杀细胞作用的RNA病毒给药于所说的哺乳动物，其中所说的哺乳动物携带的肿瘤负荷至少占所说哺乳动物机体总重量的1．5％。
75．权利要求74的方法，其中所说的肿瘤不对化疗应答。
76．一种筛选从病人中新取出的肿瘤细胞或组织的方法，该方法用来确定所说细胞或组织对一种病毒杀伤作用的敏感性，包括将组织样品进行使用干扰素敏感病毒的差别细胞毒试验。
77．权利要求76的方法，进一步包括在所说的细胞或组织中筛选选自p68蛋白激酶、C-Myc、C-Myb、ISGF-3、IRF-1、IFN受体和p58的蛋白或编码蛋白的mRNA的步骤。
78．一种鉴定在哺乳动物中具有抗赘生物活性的病毒的方法，包括：
a)使用所说的待测病毒感染Ⅰ)在干扰素介导的抗病毒活性中缺陷的细胞，和ⅱ)在干扰素介导的抗病毒活性中有活性的细胞，并，
b)确定相对于干扰素介导的抗病毒活性完全的细胞所说的待测病毒是否能优先杀伤干扰素介导的抗病毒活性缺陷的细胞。
79．权利要求78的方法，其中所说的干扰素介导的抗病毒活性缺陷的细胞是KB头和颈癌细胞。
80．权利要求78的方法，其中所说的干扰素介导的抗病毒活性完全的细胞是人皮肤成纤维细胞。
81．一种制备用于抗赘生物疗法的病毒的方法，包括：
a)通过消除或去除一种使IFN的抗病毒活性失活的病毒机制来修饰一种现存的病毒，并且可选地
b)制造一种减毒突变。
82．一种在用选自RNA病毒、腺病毒、痘病毒、虹色病毒、细小病毒、嗜肝DNA病毒、水痘疱疹病毒、乙型疱疹病毒和丙型疱疹病毒的病毒处理的哺乳动物中控制病毒复制的方法，包括给予一种抗病毒化合物。
83．权利要求82的方法，其中所说的抗病毒化合物是干扰素。
84．权利要求82的方法，其中所说的抗病毒化合物选自三氮唑核苷、无环鸟苷和更昔洛韦。
85．权利要求82的方法，其中所说的抗病毒化合物是针对所说病毒的一种中和抗体。
86．一种通过超离心但不沉淀而纯化的副粘病毒。
87．一种纯化至至少为2×109 PFU／毫克蛋白水平的副粘病毒。
88．权利要求87的副粘病毒，其中所说的副粘病毒生长于卵，并且基本上没有污染的卵蛋白。
89．权利要求87的副粘病毒，其中所说的副粘病毒具有不大于5的颗粒／PFU比。
90．权利要求87的副粘病毒，其中所说的副粘病毒具有不大于3的颗粒／PFU比。
91．权利要求87的副粘病毒，其中所说的副粘病毒具有不大于1．2的颗粒／PFU比。
92．一种被纯化至至少为1×1010 PFU／毫克蛋白水平的副粘病毒。
93．一种被纯化至至少为6×1010 PFU／毫克蛋白水平的副粘病毒。
94．权利要求87的副粘病毒，其中所说的病毒是杀细胞性的。
95．权利要求87的副粘病毒，其中所说的副粘病毒是新城疫病毒。
96．权利要求95的NDV，其中所说的NDV是杀细胞性的。
97．权利要求95的NDV，其中所说的NDV是中等毒性的。
98．一种被纯化至至少为2×109 PFU／毫克蛋白水平的RNA病毒。
99．权利要求98的RNA病毒，其中所说的病毒是复制活性的。
100．一种复制活性的杀细胞性病毒，它对干扰素敏感，并被纯化至至少为2×109 PFU／毫克蛋白的水平。
101．权利要求100的杀细胞性病毒，其中所说的病毒是克隆的。
102．一种杀细胞性DNA病毒，它对干扰素敏感，并被纯化至至少为2×109 PFU／毫克蛋白的水平。
103．权利要求102的杀细胞性DNA病毒，其中所说的病毒是一种痘病毒。
104．权利要求103的痘病毒，其中所说的痘病毒是一种在选自K3L、E3L和B18R的一个或多个基因中有一个或多个突变的痘苗病毒。
105．一种复制活性的痘苗病毒，它具有a)在K3L、E3L和B18R的一个或多个基因中有一个或多个突变，和b)在编码胸苷激酶、核糖核苷酸还原酶、痘苗生长因子、胸苷酸激酶、DNA连接酶和dUTP酶的一种或多种基因中有一种减毒突变。
106．一种复制活性的痘苗病毒，它在选自K3L、E3L和B18R的两个或更多基因中有一个或多个突变。
107．一种在(2’-5’)A类似物的表达中有一个修饰的疱疹病毒。
108．一种在ω3有突变并被纯化至至少为2×109 PFU／毫克蛋白水平的呼肠孤病毒。
109．一种在ω1和ω3有突变的呼肠孤病毒。
110．一种纯化RNA病毒的方法，包括以下步骤：
a)制备一种克隆病毒，并
b)通过超离心但不沉淀来纯化所说的克隆病毒。
111．权利要求110的方法，其中所说的RNA病毒是复制活性的。
112．一种纯化副粘病毒的方法，包括通过超离心但不沉淀纯化所说的病毒。
113．权利要求112的方法，其中所说的纯化步骤在所说的超离心前另外包括：
a)用空斑纯化来制备一种克隆病毒，
b)用所说的克隆病毒接种卵，
c)温育所说的卵，
d)冷却所说的卵，
e)从所说的卵中收集尿囊液，并
f)从所说的尿囊液中除去细胞残渣。
114．权利要求112的方法，其中所说副粘病毒是NDV。
115．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括将一种干扰素敏感的、复制活性的RNA病毒给予所说的哺乳动物。
116．权利要求1的方法，其中所说的病毒选自新城疫病毒毒株MK107、新城疫病毒毒株NJ Roakin、辛德毕斯病毒和水疱性口炎病毒。
117．一种在哺乳动物中用病毒感染赘生物的方法，包括用一种选自新城疫病毒毒株MK107、新城疫病毒毒株NJ Roakin、辛德毕斯病毒和水疱性口炎病毒的克隆病毒给药。
118．权利要求1或权利要求28或权利要求33的方法，其中所说的病毒给药多于一次剂量。
119．权利要求118的方法，其中第一次剂量是一种脱敏剂量。
120．权利要求119的方法，其中所说的第一次剂量经静脉给药，并且随后的一次剂量也经静脉给药。
121．权利要求119的方法，其中所说的第一次剂量经静脉给药，并且随后的一次剂量经腹膜内给药。
122．权利要求119的方法，其中所说的第一次剂量经静脉给药，并且随后的一次剂量经动脉内给药。
123．一种在哺乳动物中治疗赘生物的方法，包括将从所说的哺乳动物中取得的样品进行免疫试验以检测存在的病毒受体的数量，如果所说的受体存在，就给予所说的哺乳动物一种干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒，后者能结合所说的受体。
124．权利要求123的方法，其中所说的病毒是辛德毕斯病毒，并且所说的受体是高亲和性层粘连蛋白受体。
125．权利要求1或权利要求28或权利要求33的方法，其中所说的病毒经过最少为4分钟的过程进行给药。
126．一种治疗肿瘤腹水的方法，包括给予一种干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒。
127．一种在哺乳动物中减轻疼痛的方法，包括给予一种干扰素敏感的、复制活性的克隆病毒。
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