CN1262644C

CN1262644C - 一种腈水合酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1262644C
Application number: CNB2004100425760A
Authority: CN
Inventors: 史悦; 于慧敏; 沈忠耀; 孙旭东
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2004-05-24
Filing date: 2004-05-24
Publication date: 2006-07-05
Anticipated expiration: 2024-05-24
Also published as: CN1584024A

Abstract

本发明公开了一种腈水合酶及其编码基因与应用，其目的是提供一种腈水合酶及其编码基因与该腈水合酶的表达方法。本发明所提供的腈水合酶，由具有序列表中SEQID №：3的氨基酸残基序列的α亚基和具有SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的β亚基组成。本发明腈水合酶的编码基因能够在重组大肠杆菌中高效表达，所得的腈水合酶活性和稳定性高，从而为进行腈水合酶基因的定点突变和定向进化改造以及丙烯酰胺的生物转化奠定了良好基础，将在丙烯酰胺的生产中起到重要作用。

Description

一种腈水合酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一种腈水合酶及其编码基因与应用，特别涉及一种腈水合酶及其编码基因与该腈水合酶的表达方法。

背景技术

利用丙烯酰胺合成的各种类型的聚丙烯酰胺，在三次采油、水处理、造纸、采矿、冶金、洗煤和制造高吸水性树脂等工业生产中具有非常广泛的应用。

研究发现，在红球菌(Rhodococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、诺卡氏菌(Nocardia)、芽孢杆菌(Bacillus)等多种微生物体内都含有以腈水合酶为代表的腈类代谢酶系，它们是微生物氮代谢网络中的重要组成部分，这些酶可将毒性很强且难以降解的腈类催化变成为酰胺或羧酸加以利用。从红球菌中克隆得到的腈水合酶由具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的α亚基和具有SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的β亚基组成；它的激活子具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列。

由于腈代谢酶系作为生物催化剂具有反应条件温和、产率高、副产物少、产物的自聚损失小、环境污染小、成本低，符合绿色化工的发展理念等化学方法无法比拟的优越性，近年来广泛地应用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。也使丙烯酰胺的生产技术经历了重大的变革，从传统的化学法发展为工艺简化，操作条件和环境污染情况极大改善的微生物法。有关酶自身的结构和生理特性，如光活性、热不稳定性、区域选择性、立体选择性等以及各种因素如pH值、胞内组分、螯合剂、巯基化合物和氨基化合物等对酶活性影响的研究也日益深入。

虽然目前微生物法生产丙烯酰胺工艺存在着诸多的优点，全世界每年通过腈水合酶生产的丙烯酰胺已经超过300,000吨，但是其中普遍存在野生菌种的酶活稳定性差、对底物和产物的耐受性不高、以及间歇化生产，产品质量不够稳定等问题。此外，在生产过程中，产物丙烯酰胺向丙烯酸的进一步转化，也降低了丙烯酰胺的产率和纯度。这些问题极大地影响着微生物法生产丙烯酰胺这种绿色工艺的发展。

随着分子生物学的迅猛发展，人们认识到基因工程技术是解决上述难题的有效手段之一。利用基因重组技术，构造具有腈水合酶活性的新型基因工程菌株，有望可以在不同程度上解决实际生产问题，比如提高酶的表达水平、增强酶的热稳定性以及对底物和产物的耐受性、阻断副反应的发生，与后续新工艺配合降低酶的生产和分离成本等等。

从90年代初基因工程技术开始应用于丙烯酰胺生产以来，国内外学者一方面不断探索腈水合酶的各种物理化学特性，另一方面一直致力于不同菌株中腈水合酶基因(也包括腈水解酶基因和酰胺酶基因)的克隆、序列特性、基因表达调控的深入研究，从分子水平上揭示了酶反应和调控的机理，并在此基础上通过各种基因工程手段，改变基因的序列、构型，以期增强酶的特性、功能，提高酶的催化活性和稳定性。这对于最终实现丙烯酰胺的绿色工艺具有重要意义。由于基因工程菌表达腈水合酶有很多野生菌不可替代的优点，比如三种基因(腈水解酶基因、腈水合酶基因和酰胺酶基因)可以单独克隆表达，不会使酰胺在产生的同时又有一部分被降解，也不会因产酸降低了发酵液的pH值，而抑制腈水合酶的活性；另外基因工程菌的基因背景清晰，有利于基因表达调控机理的深入研究，同时它的适应性强、发酵周期短、有利于实现大规模培养和工业化生产，有着更加广阔的应用前景。因此，关于重组腈水合酶的研究已经越来越引起人们的重视。

但是，研究表明，在以大肠杆菌作为宿主的腈水合酶基因表达体系中，由于基因在新的机制下启动和调控受到一定的限制，表达出的蛋白又易聚集而形成包含体，所以蛋白的过量表达和活性表达遇到了相当大的困难，在过去十多年中进展缓慢。Ikehata 0.等在大肠杆菌表达红球菌的腈水合酶，结果检测不到酶的活性，用8M脲处理菌液，再经过透析，可获得0.282U/L菌液的活性(1U＝1μmol丙烯酰胺/min)(Eur.J.Biochem.，1989，181(3)：563-570)，Kobayashi M.等在大肠杆菌中表达玫瑰色红球菌J1的腈水合酶，表达水平仍然极低(Biochim.Biophys.Acta.，1997，1129(1)：23-33)，2001年，Sylvain P.等在大肠杆菌表达红球菌的腈水合酶，得到的酶活只有2.8U/mg干菌，大约为他们采用的野生菌株活性的10％(FEMS Microbiol.Letters，2001，204(1)：155-161)。腈水合酶一直以来无法得到高活性的重组表达，制约了酶反应和调控机理的研究以及利用基因突变的方法提高酶在应用中的各种物化性能的研究。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种腈水合酶及其编码基因。

本发明所提供的腈水合酶，名称为mNHBA，由具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的α亚基和具有SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的β亚基组成。

序列表中SEQ ID №：3是由203个氨基酸残基组成的α亚基，其氮端第1位氨基酸残基为甲硫氨酸。

序列表中序列2的氨基酸残基序列是由229个氨基酸残基组成的β亚基。

所述腈水合酶的激活子具有序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列，该激活子可以提高腈水合酶的表达活性。

序列表中SEQ ID №：4由104个氨基酸残基组成。

一种腈水合酶编码基因，具有下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：5的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：6的DNA序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸；

4)与序列表中SEQ ID №：5或SEQ ID №：6限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

其中，序列表中SEQ ID №：5来源于诺卡氏菌(Nocardia sp.)，由1714个碱基组成，名称为NHBA，自5’端第268到第957位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第971到第1582位碱基编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基。

为了提高表达活性，腈水合酶编码基因(SEQ ID №：5)经过修饰后连接有具有序列表中SEQ ID №：7的DNA序列的激活子序列，得到具有序列表中SEQ ID №：8的DNA序列。

序列表中SEQ ID №：7由315个碱基组成，编码序列表中SEQ ID №：4所示的激活子。序列表中SEQ ID №：8由1626个碱基组成，自5’端第1到第690位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第704到第1315位碱基编码腈水合酶α亚基，自5’端第1312到第1626位碱基编码激活子。

序列表中SEQ ID №：6由SEQ ID №：5的自5’端第971位碱基定点突变得到，SEQID №：6由1714个碱基组成，名称为mNHBA，自5’端第268到第957位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第971到第1582位碱基编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基。

为了提高表达活性，腈水合酶编码基因(SEQ ID №：6)经过修饰后连接有具有序列表中SEQ ID №：7的DNA序列的激活子序列，得到具有序列表中SEQ ID №：9的DNA序列。

序列表中SEQ ID №：9由1626个碱基组成，自5’端第1到第690位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第704到第1315位碱基编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基，自5’端第1312到第1626位碱基编码激活子。

含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种表达腈水合酶的方法。

本发明所提供的表达腈水合酶的方法，是将含有上述腈水合酶编码基因的重组表达载体导入表达宿主，表达得到腈水合酶。

其中，所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌、乳酸杆菌等，优选为大肠杆菌，尤其优选为E.coli BL21(DE3)。

本方法中，用于插入上述腈水合酶编码基因的表达载体可为在上述宿主中表达的载体，如可在大肠杆菌中表达的pET、pUC，可在毕赤酵母菌中表达的pPIC9K。含有上述腈水合酶编码基因的重组表达载体可按照常规方法构建。

实验表明，本发明腈水合酶的编码基因能够在重组大肠杆菌中高效表达，所得的腈水合酶活性和稳定性高，从而为进行腈水合酶基因的定点突变和定向进化改造以及丙烯酰胺的生物转化奠定了良好基础，将在丙烯酰胺的生产中起到重要作用。

附图说明

图1为基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)全细胞的SDS-PAGE电泳图谱

图2为基因工程菌E.coli XL1-Blue(pUC18-NHase^M)全细胞的SDS-PAGE电泳图谱

具体实施方式

实施例1、腈水合酶结构基因NHBA的克隆

(1)进行诺卡氏菌(Nocardia sp.)的培养并提取菌体的染色体DNA

从9mm培养皿上用无菌的接种环挑取诺卡氏菌单菌落接种于装有50mL液体发酵培养基的500ml三角瓶中。该发酵培养基的组成为：葡萄糖10g/L；酵母膏5g/L；脲2.5g/L；Na₂HPO₄0.5g/L；Na₂HPO₄0.5g/L；MgCl₂·6H₂O 0.5g/L；谷氨酸钠0.25g/L；CoCl₂60ppm；pH7.0。在温度为28℃、转速为200rpm的摇床中培养72小时。10000rpm×5min离心收集菌体，10ml无菌水重悬，10000rpm×5min离心收集菌体，用40mg/ml溶菌酶对所得细胞进行过夜处理，用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification Kit提取和纯化染色体DNA，备用。

(2)运用PCR技术从染色体DNA上扩增目的腈水合酶酶基因片段

设计并合成腈水合酶酶基因的上游与下游引物。所涉及到的四种核苷酸分别为：三磷酸脱氧腺嘌呤核苷酸(记为A)、三磷酸脱氧鸟嘌呤三磷酸(记为G)、三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸(记为C)、三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(记为T)，所合成的引物一，由21个核苷酸残基组成，依次为：5’-磷酸-C-A-G-A-A-T-T-C-A-C-G-T-C-C-C-C-G-T-A-G-T-磷酸-3’；所合成的引物二，由20个核苷酸残基组成，依次为：5’-磷酸-A-A-G-G-A-T-C-C-G-A-A-A-G-C-G-C-G-A-T-G-磷酸-3’。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。引物合成后，用无菌水溶解至浓度为50μmol/L，备用。运用PCR技术从染色体DNA上扩增目的腈水合酶基因DNA片段，所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由宝生物工程(大连)有限公司购得。在一已灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入18uL无菌水、5μL的扩增缓冲液、5μL的四种脱氧核苷酸、1μL的引物一、1μL的引物二、8μL的步骤(1)制备的染色体DNA溶液、0.5μL的EX Taq DNA聚合酶，用无菌水补足至总体积为50μL；将离心管置于变温系统中，升温至94℃，保持5分钟，接着按升温至94℃并保持1分钟、降温至50℃并保持1.5分钟、升温至72℃并保持3分钟的变化顺序循环30次，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。

(3)将上一步扩增得到的腈水合酶基因DNA片段和质粒pUC18分别采用限制性核酸内切酶进行切割。

质粒pUC18以及限制性核酸内切酶及相应缓冲液由宝生物工程(大连)有限公司购得。取10μl第(2)步所得PCR产物和4μl pUC18质粒DNA分别进行酶切，酶切反应体系的组成分别为：

PCR产物 10μl pUC18质粒DNA 4μl

EcoRI(10U/μl) 1μl EcoRI(10U/μl) 1μl

BamHI(10U/μl) 1μl BamHI(10U/μl) 1μl

缓冲液(10×Buffer K) 2μl 缓冲液(10×Buffer K) 2μl

无菌水 6μl 无菌水 12μl

总体积 20μl 总体积 20μl

在37℃下反应4小时，采用常规0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到长度为2600bp左右的酶切后pUC18质粒DNA片段和1.7kb左右的酶切后PCR产物。

(4)将步骤(3)得到的PCR产物和pUC18质粒DNA酶切片段进行连接

所用T4DNA连接酶及相应缓冲液由Promega公司购得。连接样品组成为：

腈水合酶基因DNA片段 6μl

pUC18酶切片段(50ng/μl) 2.5μl

连接缓冲液 1μl

T4连接酶(3U/μl) 0.5μl

总体积 10μl

连接样品在16℃下反应8小时。

(5)制备大肠杆菌的感受态细胞(氯化钙法)

采用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，所用大肠杆菌TOP-10F’由Invitrogen公司购得。从菌体的固体平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中。该培养基为LB培养基。在37℃下于200转/分的摇床上培养细菌10小时，接着取0.5mL培养液接种于50mL LB液体培养基中，在37℃下于200转/分的摇床上培养至培养液在600nm处的吸光值为0.4；将培养液转入预冷的已灭菌离心管中，冰浴冷却10分钟后，于4℃的离心机上以4000转/分离心10分钟；倒出上清液，在无菌条件下将管倒置1分钟，以使残留的上清液流尽；向沉淀中加10毫升用冰预冷的0.1mmol/L CaCl₂溶液，冰浴放置10分钟；在4℃的离心机上以4000转/分离心10分钟，弃上清；用2mL冰预冷过的0.1mmol/L CaCl₂溶液再次重悬沉淀，在冰上放置片刻即得到感受态细胞。

(6)腈水合酶基因DNA片段的基因克隆

腈水合酶基因DNA片段的基因克隆所用试剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(简称IPTG)及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(简称X-gal)由宝生物工程(大连)有限公司购得。取200μL感受态大肠杆菌TOP-10F’细胞，加入5μL步骤(4)所得连接反应物，在冰上放置30分钟，立即将管转移至42℃的循环水浴中，放置90秒，立即将管转移至冰浴中，放置2分钟，每管加入0.8mL的LB液体培养基，在37℃下放置45分钟，室温下以4000转/分的速度离心2分钟，弃上清，留约100μL，摇匀后涂布于含40μg/mL IPTG、40μg/mL X-gal和15g/L琼脂粉的LB固体培养基上，筛选无α-互补能力的白色菌落，挑取菌落接入LB培养基，按照常规方法提取质粒DNA。

(7)将步骤(6)收获的质粒DNA进行酶切验证，以EcoRI和BamHI切开，再将酶切的产物进行0.7％的琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条1.7kb的条带和一条2.6kb的条带，其长度分别为第(2)步得到的PCR产物的长度和步骤(3)得到的线性化pUC18质粒DNA的长度。说明重组质粒pUC18-NHBA构建成功。

(8)将重组质粒进行DNA测序，测序结果表明所得基因NHBA具有序列表中序列5所示的多核苷酸序列，序列表中SEQ ID №：5由1714个碱基组成，自5’端第268到第957位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第971到第1582位碱基编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基。

实施例2、携带激活子序列的腈水合酶基因NHBAx的克隆

(1)进行诺卡氏菌(Nocardia sp.)培养并提取菌体的染色体DNA，该方法同实施例1(1)。

(2)运用PCR技术从染色体DNA上扩增携带激活子序列的腈水合酶酶基因片段

设计并合成携带激活子序列的腈水合酶酶基因的上游与下游引物。所涉及到的四种核苷酸分别为：三磷酸脱氧腺嘌呤核苷酸(记为A)、三磷酸脱氧鸟嘌呤三磷酸(记为G)、三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸(记为C)、三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(记为T)，所合成的引物三，由29个核苷酸残基组成，依次为：5’-磷酸-A-A-T-G-G-A-T-C-C-A-T-G-G-A-T-G-G-T-A-T-C-C-A-C-G-A-C-A-C-磷酸-3’；所合成的引物四，由28个核苷酸残基组成，依次为：5’-磷酸-C-G-G-A-A-T-T-C-T-C-A-G-T-C-G-A-T-G-A-T-G-G-C-C-A-T-C-G-磷酸-3’。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。引物合成后，用无菌水溶解至浓度为50μmol/L，备用。运用PCR技术从染色体DNA上扩增目的腈水合酶基因DNA片段，所用聚合酶及相应扩增缓冲液、四种脱氧核苷酸溶液均由宝生物工程(大连)有限公司购得。在一已灭菌的0.2mL PCR薄壁管中，依次加入18μL无菌水、5μL的扩增缓冲液、5μL的四种脱氧核苷酸、1μL的引物三、1μL的引物四、8μL的步骤(1)制备的染色体DNA溶液、0.5μL的EX Taq DNA聚合酶，用无菌水补足至总体积为50μL；将离心管置于变温系统中，升温至94℃，保持5分钟，接着按升温至94℃并保持1分钟、降温至61℃并保持1.5分钟、升温至72℃并保持2分钟的变化顺序循环25次，最后于72℃保持10分钟，结束扩增反应。

(3)将上一步扩增得到的携带激活子序列的腈水合酶基因DNA片段和质粒pET32a分别采用限制性核酸内切酶进行切割。

质粒pET32a以及限制性核酸内切酶及相应缓冲液由宝生物工程(大连)有限公司购得。取10μl第(2)步所得PCR产物和6μl pET32a质粒DNA分别进行酶切，酶切反应体系的组成分别为：

PCR产物 10μl pUC18质粒DNA 6μl

EcoRI(10U/μl) 1μl EcoRI(10U/μl) 1μl

BamHI(10U/ul) 1μl BamHI(10U/μl) 1μl

缓冲液(10×Buffer K) 2μl 缓冲液(10×Buffer K) 2μl

无菌水 6μl 无菌水 10μl

总体积 20μl 总体积 20μl

在37℃下反应4小时，采用常规0.7％琼脂糖凝胶电泳，得到长度为5900bp左右的酶切后pET32a质粒DNA片段和1.6kb左右的酶切后PCR产物。

(4)将步骤(3)得到的PCR产物和pUC18质粒DNA酶切片段进行连接

腈水合酶基因DNA片段 5μl

pET32a酶切片段(20ng/μl) 3.5μl

连接缓冲液 1μl

T4连接酶(3U/μl) 0.5μl

总体积 10μl

连接样品在16℃下反应8小时。

(5)按照实施例1(5)的方法制备大肠杆菌的感受态细胞。

(6)携带激活子序列的腈水合酶基因的克隆

所用试剂氨苄青霉素钠由北京鼎国生物技术有限责任公司购得。取200μL感受态大肠杆菌TOP-10F’细胞，加入5μL步骤(4)所得连接反应物，在冰上放置30分钟，立即将管转移至42℃的循环水浴中，放置90秒，立即将管转移至冰浴中，放置2分钟，每管加入0.8mL的LB液体培养基，在37℃下放置45分钟，室温下以4000转/分的速度离心2分钟，弃上清，留约100μL，摇匀后涂布于含100μg/mL氨苄青霉素钠和20g/L琼脂粉的LB固体培养基上，37℃温育12小时后，挑取菌落接入LB培养基，按照常规方法提取质粒DNA。

(7)将(6)收获的质粒DNA进行酶切验证，以EcoRI和BamHI切开，再将酶切的产物进行0.7％的琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条1.6kb的条带和一条5.9kb的条带，其长度分别为第(2)步得到的PCR产物的长度和第(3)步得到的线性化pET32a质粒DNA的长度。说明重组质粒pET32a-NHBAX构建成功。

(8)将重组质粒进行DNA测序，测序结果表明所得基因NHBAX具有序列表中序列8所示的多核苷酸序列，序列表中SEQ ID №：8由1626个碱基组成，自5’端第1到第690位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第704到第1315位碱基编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基，自5’端第1312到第1626位碱基编码激活子。

实施例3.腈水合酶的表达

1、重组质粒和重组菌株的构建

将实施例1和实施例2中分别构建的重组质粒pUC18-NHBA和pET32a-NHBAX按照氯化钙法转化宿主细胞E.coli BL21(DE3)，分别得到基因工程菌E.coli JM105(pUC18-NHBA)和E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)。

2、基因工程菌中腈水合酶的诱导表达

(1)基因工程菌表达腈水合酶的培养和诱导条件

将步骤1中获得的基因工程菌分别接种于LB液体培养基中(LB培养基的组成为：酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH7.0)，37℃ 200rpm摇床培养过夜。转接30mL菌液至含50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基的300mL摇瓶中，同时加入0.5mmol/L的IPTG、10μL CoCl₂进行诱导，30℃下继续培育约15h，离心收集菌体。将收集的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，表明基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)在野生诺卡氏菌腈水合酶的β和α亚基的相应位置均出现了条带，β亚基的条带明显，α亚基的条带较弱(如图1所示，图中，泳道1为基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)全细胞的SDS-PAGE电泳，泳道2为蛋白质分子量marker，泳道3为野生诺卡氏菌样品全细胞的SDS-PAGE电泳)；而基因工程菌E.coli JM105(pUC18-NHBA)的SDS-PAGE电泳图谱上，两条带都很弱。

(2)基因工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺

将步骤(1)中诱导表达的基因工程菌液分别离心，收集菌体。用0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)在50mL三角瓶中重悬，加入终浓度为0.5％丙烯腈液体，28℃，200rpm摇床准确反应10min。并加入1ml盐酸中止反应，利用GC-9AM气相色谱仪检测反应产物来测定基因工程菌催化丙烯腈生成丙烯酰胺的活性，结果表明腈水合酶NHBA的活性为0，NHBAX的活性为0.04-0.06U/mg干菌(1U指1分钟内酶可反应生成1μmol丙烯酰胺)。

实施例4、腈水合酶基因mNHBA的克隆及表达

(1)设计并合成能在腈水合酶α亚基上发生突变的上游与下游引物

所涉及到的四种核苷酸分别为：三磷酸脱氧腺嘌呤核苷酸(记为A)、三磷酸脱氧鸟嘌呤三磷酸(记为G)、三磷酸脱氧胞嘧啶核苷酸(记为C)、三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸(记为T)，所合成的引物五，由24个核苷酸残基组成，依次为：5’-磷酸-A-T-G-A-G-C-G-A-G-C-A-C-G-T-C-A-A-T-A-A-G-T-A-C-磷酸-3’；所合成的引物六，由24个核苷酸残基组成，依次为：3’-磷酸-T-A-G-A-G-A-C-G-C-A-C-T-T-T-C-C-T-T-A-T-G-C-T-Ap-磷酸-5’。其中，引物六的5’末端的碱基A进行磷酸化。引物由北京赛百盛生物工程公司合成。引物合成后，用无菌水溶解至浓度为50μmol/L，备用。

(2)按照试剂盒的方法进行腈水合酶基因定点突变的操作。

采用的定点突变试剂盒ExSite^TM PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit购自Stratagene公司。以实施例3中构建的菌株E.coli JM105(pUC18-NHase)为突变的模板，利用步骤(1)设计合成的引物，严格按照突变试剂盒的操作说明进行PCR反应、酶切、连接、转化，得到基因工程菌E.coli XL1-Blue(pUC18-NHase^M)，并进行测序，结果得到具有序列表中序列6所示的多核苷酸序列的mNHBA，序列6的自5’端第268到第957位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第971到第1582位碱基编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基。

(3)将基因工程菌E.coli XL1-Blue(pUC18-NHase^M)在100μg/mL氨苄青霉素钠和20g/L琼脂粉的LB固体培养基上，37℃温育12小时后，挑取菌落接入LB培养基，在与实施例3同样的条件下培养和诱导，结果表明表达的腈水合酶活性比突变前有了明显的增加，其活性为51U/mg。将收集的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，结果如图2所示，表明基因工程菌E.coli XL1-Blue(pUC18-NHase^M)在基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)表达量极低的α亚基相应的位置上出现了较明显的条带。图2中，泳道1为蛋白质分子量marker，泳道2为野生诺卡氏菌样品，泳道3为E.coli XL1-Blue(pUC18-NHase^M)，泳道4为基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)。

实施例5、携带激活子序列的腈水合酶基因mNHBAX克隆及表达

(1)携带激活子序列的腈水合酶基因mNHBAX克隆

采用的定点突变试剂盒ExSite^TM PCR-Based Site-Directed Mutagenesis Kit购自Stratagene公司。以实施例2中构建的菌株E.coli BL21(DE3)(pET32a-NHBAX)为突变的模板，利用实施例4步骤(1)设计合成的引物，严格按照突变试剂盒的操作说明进行PCR反应、酶切、连接、转化，得到基因工程菌E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAX^M)，并进行测序，测序结果表明所得基因mAHBAX具有序列表中序列9所示的多核苷酸序列，序列表中SEQ ID №：9由1626个碱基组成，自5’端第1到第690位碱基编码腈水合酶的β亚基；自5’端第704到第1315位碱基编码具有序列表中序列3的氨基酸残基序列的腈水合酶α亚基，自5’端第1312到第1626位碱基编码激活子。

(2)携带激活子序列的腈水合酶基因mNHBAX的表达

将基因工程菌E.coli XL1-Blue(pUC18-NHBAX^M)在100μg/mL氨苄青霉素钠和20g/L琼脂粉的LB固体培养基上，37℃温育12小时后，挑取菌落接入LB培养基，在与实施例3同样的条件下培养和诱导，结果表明表达的腈水合酶活性比突变前有了明显的增加，其活性为8U/mg。

序列表

<160>9

<210>1

<211>203

<212>PRT

<213>诺卡氏菌(Nocardia sp.)

<400>1

Val Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys

1 5 10 15

Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala

202 5 30

Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly

35 40 45

Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys

50 55 60

Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr

85 90 95

His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val

100 105 110

Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg

115 120 125

Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp

130 135 140

Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile

145 150 155 160

Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser

165 170 175

Glu Asp Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val

180 185 190

Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val

195 200

<210>2

<211>229

<212>PRT

<213>诺卡氏菌(Nocardia sp.)

<400>2

Met Asp Gly Ile His Asp Thr Gly Gly Met Thr Gly Tyr Gly Pro Val

1 5 10 15

Pro Tyr Gln Lys Asp Glu Pro Phe Phe His Tyr Glu Trp Glu Gly Arg

20 25 30

Thr Leu Ser Ile Leu Thr Trp Met His Leu Lys Gly Met Ser Trp Trp

35 40 45

Asp Lys Ser Arg Phe Phe Arg Glu Ser Met Gly Asn Glu Asn Tyr Val

50 55 60

Asn Glu Ile Arg Asn Ser Tyr Tyr Thr His Trp Leu Ser Ala Ala Glu

65 70 75 80

Arg Ile Leu Val Ala Asp Lys Ile Ile Thr Glu Glu Glu Arg Lys His

85 90 95

Arg Val Gln Glu Ile Leu Glu Gly Arg Tyr Thr Asp Arg Asn Pro Ser

100 105 110

Arg Lys Phe Asp Pro Ala Glu Ile Glu Lys Ala Ile Glu Arg Leu His

115 120 125

Glu Pro His Ser Leu Ala Leu Pro Gly Ala Glu Pro Ser Phe Ser Leu

130 135 140

Gly Asp Lys Val Lys Val Lys Asn Met Asn Pro Leu Gly His Thr Arg

145 150 155 160

Cys Pro Lys Tyr Val Arg Asn Lys Ile Gly Glu Ile Val Thr Ser His

165 170 175

Gly Cys Gln Ile Tyr Pro Glu Ser Ser Ser Ala Gly Leu Gly Asp Asp

180 185 190

Pro Arg Pro Leu Tyr Thr Val Ala Phe Ser Ala Gln Glu Leu Trp Gly

195 200 205

Asp Asp Gly Asn Gly Lys Asp Val Val Cys Val Asp Leu Trp Glu Pro

210 215 220

Tyr Leu Ile Ser Ala

225

<210>3

<211>203

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Met Ser Glu His Val Asn Lys Tyr Thr Glu Tyr Glu Ala Arg Thr Lys

1 5 10 15

Ala Ile Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Arg Gly Leu Ile Thr Pro Ala Ala

20 25 30

Val Asp Arg Val Val Ser Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Gly Pro Met Gly

35 40 45

Gly Ala Lys Val Val Ala Lys Ser Trp Val Asp Pro Glu Tyr Arg Lys

50 55 60

Trp Leu Glu Glu Asp Ala Thr Ala Ala Met Ala Ser Leu Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Glu Gln Ala His Gln Ile Ser Ala Val Phe Asn Asp Ser Gln Thr

85 90 95

His His Val Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val

100 105 110

Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Met Glu Tyr Arg Ser Arg

115 120 125

Val Val Ala Asp Pro Arg Gly Val Leu Lys Arg Asp Phe Gly Phe Asp

130 135 140

Ile Pro Asp Glu Val Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ser Glu Ile

145 150 155 160

Arg Tyr Ile Val Ile Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser

165 170 175

Glu Asp Glu Leu Thr Lys Leu Val Ser Arg Asp Ser Met Ile Gly Val

180 185 190

Ser Asn Ala Leu Thr Pro Gln Glu Val Ile Val

195 200

<210>4

<211>104

<212>PRT

<213>诺卡氏菌(Nocardia sp.)

<400>4

Met Ser Glu Asp Thr Leu Thr Asp Arg Leu Pro Ala Thr Gly Thr Ala

1 5 10 15

Ala Pro Pro Arg Asp Asn Gly Glu Leu Val Phe Thr Glu Pro Trp Glu

20 25 30

Ala Thr Ala Phe Gly Val Ala Ile Ala Leu Ser Asp Gln Lys Ser Tyr

35 40 45

Glu Trp Glu Phe Phe Arg Gln Arg Leu Ile His Ser Ile Ala Glu Ala

50 55 60

Asn Gly Cys Glu Ala Tyr Tyr Glu Ser Trp Thr Lys Ala Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ser Val Val Asp Ser Gly Leu Ile Ser Glu Asp Glu Ile Arg Glu Arg

85 90 95

Met Glu Ser Met Ala Ile Ile Asp

100

<210>5

<211>1714

<212>DNA

<213>诺卡氏菌(Nocardia sp.)

<400>5

cagaattcac gtccccgtag tgtgcgggga gagcgcccga ccgcagggat ggtatccatg 60

cgccccttct cttttcgaac gagaaccggc cgctacagcc gacccggaga cactgtgacg 120

ccgttcaacg attgttgtgc tgtgaaggat tcactcaagc caactgatat cgccattccg 180

ttgccggaac atttgacacc ttctccctac gagtagaagc cagctggacc cctctttgag 240

cccagctccg atgaaaggaa tgaggaaatg gatggtatcc acgacacagg cggcatgacc 300

ggatacggac cggtccccta tcagaaggac gagcccttct tccactacga gtgggagggt 360

cggaccctgt cgattctgac ctggatgcat ctcaagggca tgtcgtggtg ggacaagtcg 420

cggttcttcc gggagtcgat ggggaacgaa aactacgtca acgagattcg caactcgtac 480

tacacccact ggctgagtgc ggcagaacgt atcctcgtcg ccgacaagat catcaccgaa 540

gaagagcgaa agcaccgtgt gcaggagatc ctcgagggtc ggtacacgga caggaacccg 600

tcgcggaagt tcgatccggc cgagatcgag aaggcgatcg aacggcttca cgagccccac 660

tccctagcac ttccaggagc ggagccgagt ttctccctcg gtgacaaggt caaagtgaag 720

aatatgaacc cgctgggaca cacacggtgc ccgaaatatg tgcggaacaa gatcggggaa 780

atcgtcacct cccacggctg ccagatctat cccgagagca gctccgccgg cctcggcgac 840

gatccccgcc cgctctacac ggtcgcgttt tccgcccagg aactgtgggg cgacgacgga 900

aacgggaaag acgtagtgtg cgtcgatctc tgggaaccgt acctgatctc tgcgtgaaag 960

gaatacgata gtgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc 1020

aatcgaaact ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt 1080

ttcgtactac gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg cgaagtcctg 1140

ggtggaccct gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt 1200

gggctatgcc ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca 1260

tcacgtggtg gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc 1320

cgcctggtac aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct 1380

caagcgcgat ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag 1440

ctccgaaatc cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga 1500

ggacgagctg gcgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac 1560

accccaggaa gtgatcgtat gagtgaagac acactcactg atcggctccc ggcgactggg 1620

accgccgcac cgccccgcga caatggcgag cttgtattca ccgagccttg ggaagcaacg 1680

gcatacgggg tcgccatcgc gctttcggat cctt 1714

<210>6

<211>1714

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cagaattcac gtccccgtag tgtgcgggga gagcgcccga ccgcagggat ggtatccatg 60

cgccccttct cttttcgaac gagaaccggc cgctacagcc gacccggaga cactgtgacg 120

ccgttcaacg attgttgtgc tgtgaaggat tcactcaagc caactgatat cgccattccg 180

ttgccggaac atttgacacc ttctccctac gagtagaagc cagctggacc cctctttgag 240

cccagctccg atgaaaggaa tgaggaaatg gatggtatcc acgacacagg cggcatgacc 300

ggatacggac cggtccccta tcagaaggac gagcccttct tccactacga gtgggagggt 360

cggaccctgt cgattctgac ctggatgcat ctcaagggca tgtcgtggtg ggacaagtcg 420

cggttcttcc gggagtcgat ggggaacgaa aactacgtca acgagattcg caactcgtac 480

tacacccact ggctgagtgc ggcagaacgt atcctcgtcg ccgacaagat catcaccgaa 540

gaagagcgaa agcaccgtgt gcaggagatc ctcgagggtc ggtacacgga caggaacccg 600

tcgcggaagt tcgatccggc cgagatcgag aaggcgatcg aacggcttca cgagccccac 660

tccctagcac ttccaggagc ggagccgagt ttctccctcg gtgacaaggt caaagtgaag 720

aatatgaacc cgctgggaca cacacggtgc ccgaaatatg tgcggaacaa gatcggggaa 780

atcgtcacct cccacggctg ccagatctat cccgagagca gctccgccgg cctcggcgac 840

gatccccgcc cgctctacac ggtcgcgttt tccgcccagg aactgtgggg cgacgacgga 900

aacgggaaag acgtagtgtg cgtcgatctc tgggaaccgt acctgatctc tgcgtgaaag 960

gaatacgata atgagcgagc acgtcaataa gtacacggag tacgaggcac gtaccaaggc 1020

aatcgaaact ttgctgtacg agcgagggct catcacgccc gccgcggtcg accgagtcgt 1080

ttcgtactac gagaacgaga tcggcccgat gggcggtgcc aaggtcgtgg cgaagtcctg 1140

ggtggaccct gagtaccgca agtggctcga agaggacgcg acggccgcga tggcgtcatt 1200

gggctatgcc ggtgagcagg cacaccaaat ttcggcggtc ttcaacgact cccaaacgca 1260

tcacgtggtg gtgtgcactc tgtgttcgtg ctatccgtgg ccggtgcttg gtctcccgcc 1320

cgcctggtac aagagcatgg agtaccggtc ccgagtggta gcggaccctc gtggagtgct 1380

caagcgcgat ttcggtttcg acatccccga tgaggtggag gtcagggttt gggacagcag 1440

ctccgaaatc cgctacatcg tcatcccgga acggccggcc ggcaccgacg gttggtccga 1500

ggacgagctg gcgaagctgg tgagccggga ctcgatgatc ggtgtcagta atgcgctcac 1560

accccaggaa gtgatcgtat gagtgaagac acactcactg atcggctccc ggcgactggg 1620

accgccgcac cgccccgcga caatggcgag cttgtattca ccgagccttg ggaagcaacg 1680

gcatacgggg tcgccatcgc gctttcggat cctt 1714

<210>7

<211>315

<212>DNA

<213>诺卡氏菌(Nocardia sp.)

<400>7

atgagtgaag acacactcac tgatcggctc ccggcgactg ggaccgccgc accgccccgc 60

gacaatggcg agcttgtatt caccgagcct tgggaagcaa cggcatacgg ggtcgccatc 120

gcgctttcgg atcagaagtc gtacgaatgg gagttcttcc gacagcgtct cattcactcc 180

atcgctgagg ccaacggttg cgaggcatac tacgagagct ggacaaaggc gctcgaggcc 240

agcgtggtcg actcggggct gatcagcgaa gatgagatcc gcgagcgcat ggaatcgatg 300

gccatcatcg actga 315

<210>8

<211>1626

<212>DNA

<213>诺卡氏菌(Nocardia sp.)

<400>8

atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60

gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcgattct gacctggatg 120

catctcaagg gcatgtcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180

gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240

cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaggag 300

atcctcgagg gtcggtacac ggacaggaac ccgtcgcgga agttcgatcc ggccgagatc 360

gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cacttccagg agcggagccg 420

agtttctccc tcggtgacaa ggtcaaagtg aagaatatga acccgctggg acacacacgg 480

tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctcccacgg ctgccagatc 540

tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcccc gcccgctcta cacggtcgcg 600

ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660

ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga aaggaatacg ataatgagcg agcacgtcaa 720

taagtacacg gagtacgagg cacgtaccaa ggcaatcgaa actttgctgt acgagcgagg 780

gctcatcacg cccgccgcgg tcgaccgagt cgtttcgtac tacgagaacg agatcggccc 840

gatgggcggt gccaaggtcg tggcgaagtc ctgggtggac cctgagtacc gcaagtggct 900

cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960

aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc 1020

gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080

gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140

cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200

ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggacgag ctggcgaagc tggtgagccg 1260

ggactcgatg atcggtgtca gtaatgcgct cacaccccag gaagtgatcg tatgagtgaa 1320

gacacactca ctgatcggct cccggcgact gggaccgccg caccgccccg cgacaatggc 1380

gagcttgtat tcaccgagcc ttgggaagca acggcatacg gggtcgccat cgcgctttcg 1440

gatcagaagt cgtacgaatg ggagttcttc cgacagcgtc tcattcactc catcgctgag 1500

gccaacggtt gcgaggcata ctacgagagc tggacaaagg cgctcgaggc cagcgtggtc 1560

gactcggggc tgatcagcga agatgagatc cgcgagcgca tggaatcgat ggccatcatc 1620

gactga 1626

<210>9

<211>1626

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

atggatggta tccacgacac aggcggcatg accggatacg gaccggtccc ctatcagaag 60

gacgagccct tcttccacta cgagtgggag ggtcggaccc tgtcgattct gacctggatg 120

catctcaagg gcatgtcgtg gtgggacaag tcgcggttct tccgggagtc gatggggaac 180

gaaaactacg tcaacgagat tcgcaactcg tactacaccc actggctgag tgcggcagaa 240

cgtatcctcg tcgccgacaa gatcatcacc gaagaagagc gaaagcaccg tgtgcaggag 300

atcctcgagg gtcggtacac ggacaggaac ccgtcgcgga agttcgatcc ggccgagatc 360

gagaaggcga tcgaacggct tcacgagccc cactccctag cacttccagg agcggagccg 420

agtttctccc tcggtgacaa ggtcaaagtg aagaatatga acccgctggg acacacacgg 480

tgcccgaaat atgtgcggaa caagatcggg gaaatcgtca cctcccacgg ctgccagatc 540

tatcccgaga gcagctccgc cggcctcggc gacgatcccc gcccgctcta cacggtcgcg 600

ttttccgccc aggaactgtg gggcgacgac ggaaacggga aagacgtagt gtgcgtcgat 660

ctctgggaac cgtacctgat ctctgcgtga aaggaatacg ataatgagcg agcacgtcaa 720

taagtacacg gagtacgagg cacgtaccaa ggcaatcgaa actttgctgt acgagcgagg 780

gctcatcacg cccgccgcgg tcgaccgagt cgtttcgtac tacgagaacg agatcggccc 840

gatgggcggt gccaaggtcg tggcgaagtc ctgggtggac cctgagtacc gcaagtggct 900

cgaagaggac gcgacggccg cgatggcgtc attgggctat gccggtgagc aggcacacca 960

aatttcggcg gtcttcaacg actcccaaac gcatcacgtg gtggtgtgca ctctgtgttc 1020

gtgctatccg tggccggtgc ttggtctccc gcccgcctgg tacaagagca tggagtaccg 1080

gtcccgagtg gtagcggacc ctcgtggagt gctcaagcgc gatttcggtt tcgacatccc 1140

cgatgaggtg gaggtcaggg tttgggacag cagctccgaa atccgctaca tcgtcatccc 1200

ggaacggccg gccggcaccg acggttggtc cgaggacgag ctggcgaagc tggtgagccg 1260

ggactcgatg atcggtgtca gtaatgcgct cacaccccag gaagtgatcg tatgagtgaa 1320

gacacactca ctgatcggct cccggcgact gggaccgccg caccgccccg cgacaatggc 1380

gagcttgtat tcaccgagcc ttgggaagca acggcatacg gggtcgccat cgcgctttcg 1440

gatcagaagt cgtacgaatg ggagttcttc cgacagcgtc tcattcactc catcgctgag 1500

gccaacggtt gcgaggcata ctacgagagc tggacaaagg cgctcgaggc cagcgtggtc 1560

gactcggggc tgatcagcga agatgagatc cgcgagcgca tggaatcgat ggccatcatc 1620

gactga 1626

Claims

1、一种腈水合酶，由具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的α亚基和具有SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的β亚基组成。

2、根据权利要求1所述的腈水合酶，其特征在于：所述腈水合酶还连接有激活子，所述激活子是序列表中的SEQ ID №：4的氨基酸残基序列。

3、权利要求1所述腈水合酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：6的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述腈水合酶编码基因是序列表中SEQ ID №：6所示的DNA序列。

5、根据权利要求3或4所述的基因，其特征在于：所述腈水合酶编码基因还连接有激活子的编码序列，所述激活子的编码序列是序列表中SEQ ID №：7的DNA序列。

6、含有权利要求3所述基因的表达载体和转基因细胞系。

7、一种表达权利要求1所述腈水合酶的方法，是将含有腈水合酶编码基因的重组表达载体导入表达宿主，表达得到腈水合酶；所述腈水合酶编码基因，具有下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：6的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2和SEQ ID №：3蛋白质序列的多核苷酸。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、枯草杆菌或乳酸杆菌。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述宿主为大肠杆菌。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述宿主为E.coli BL21(DE3)。

11、权利要求1所述的腈水合酶在丙烯酰胺生产中的应用。