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CN1250729C - 利用大肠杆菌OmpF胞外生产靶蛋白的方法 - Google Patents

利用大肠杆菌OmpF胞外生产靶蛋白的方法 Download PDF

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CN1250729C CNB028027388A CN02802738A CN1250729C CN 1250729 C CN1250729 C CN 1250729C CN B028027388 A CNB028027388 A CN B028027388A CN 02802738 A CN02802738 A CN 02802738A CN 1250729 C CN1250729 C CN 1250729C
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Abstract

本发明提供包含编码大肠杆菌OmpF蛋白基因的表达载体、转化有该表达载体的大肠杆菌以及采用该微生物胞外生产靶蛋白的方法。本发明的重组表达载体含有氨苄青霉素抗性基因、OmpF启动子以及OmpF基因。根据本发明，靶蛋白可以通过比常规方法更简单的方法进行胞外生产，其意义在于：由于采用OmpF启动子进行组成型表达，因此OmpF融合蛋白的分泌性生产与细胞生长同时开始，并且随着细胞浓度增加，蛋白分泌性生产的量也持续增加。所以，通过细胞的高密度培养可大量生产靶蛋白。

Description

利用大肠杆菌OmpF胞外生产靶蛋白的方法
发明背景
发明领域
本发明涉及利用大肠杆菌(Escherichia coli)(E.coli)外膜蛋白F(OmpF)胞外生产所需蛋白的方法，更具体而言，本发明涉及含有编码OmpF和所需蛋白的基因的表达载体、用此表达载体转化的大肠杆菌以及采用该大肠杆菌胞外生产所需蛋白的方法。
现有技术描述
众所周知，利用大肠杆菌胞外生产所需的外源蛋白是一种非常有效的方法，其优点在于：分泌的外源蛋白免受大肠杆菌蛋白水解酶的水解，分泌过程指导外源蛋白进行适当折叠从而抑制不溶性包含体的形成，以及在分泌过程中从外源蛋白中去除N-端分泌信号肽从而保持氨基酸序列与天然存在的序列一致。该方法还允许通过高密度培养和连续培养来大量生产外源蛋白。此外，该方法使得外源蛋白纯化较易，这是因为细菌蛋白极少会分泌到培养基中。
由于胞外生产具有如上所述的若干优点，因此，对胞外生产系统的各种各样的研究一直在积极进行以便在大肠杆菌中生产所需的外源蛋白。迄今为止所开发的胞外生产系统划分成如下三类：第一类胞外生产的方法是将分泌信号肽序列和所需的外源蛋白进行重组。例如，Toksoy等采用分泌信号序列和麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白在细胞表面上生产TaqI蛋白，Lo等在大肠杆菌的细胞表面上生产枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的β-1，4-内切葡聚糖酶，以及Nagahari等通过重组OmpF分泌信号肽和来自OmpF N-端的8个氨基酸在大肠杆菌的细胞表面上生产β-内啡肽。此外，Yamamoto等试图通过利用OmpF分泌信号序列在胞外生产harvey鼠肉瘤病毒的p21蛋白。然而，其结果是p21未在细胞表面上产生而是积累在包含体中(参见：ToksoyE.等，Biotechnology Techniques，13：803-808，1999；Lo A.C.等，Appl.Environ.Microbiol.，54：2287-2292，1988；Nagahari等，EMBO J.，4：3589-3592，1985；和Yamamoto等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，35：615-621，1991)。第二类胞外生产的方法是将大肠杆菌的分泌蛋白和所需蛋白进行重组。例如，Baneyx等将OmpA-TEM-β-内酰胺酶融合蛋白与大肠杆菌的TolAIII膜蛋白一起在细胞表面上生产，Robbens等利用kil基因来生产白介素-2，van der Wal等利用脂蛋白BRP(细菌素释放蛋白)在细胞表面上生产β-内酰胺酶，以及Aristidou等利用BRP通过向培养基中加入甘氨酸来增加胞外生产的产量(参见：Baneyx F.和Eugene W.M.，Protein Expr.Purif.，14：13-22，1998；RobbensJ.等，Protein Expr.Purif.，6：481-486，1995；van der Wal F.J.等，Appl.Environ.Microbiol.，64：392-398，1998；和Aristidou A.A.等，Biotechnol.Lett.，15：331-336，1993)。第三类胞外生产的方法是借助于无外膜大肠杆菌，即大肠杆菌的L-型菌株，这是一种仅有细胞内膜而没有细胞外膜和周质的突变株。在L-型菌株培养物中，胞外生产外源蛋白比前述方法更为简单，因为表达蛋白仅通过细胞内膜运输就可分泌到培养基中。例如，Kujau等利用一种L-型突变株RV308菌株在细胞表面生产微型抗体(miniAb)(参见：Kajau M.J.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，49：51-58，1998)。
如上所述，已开发出多种方法可在大肠杆菌的细胞表面上生产所需的外源蛋白。但是，大多数这些现有技术经证明尚不令人满意，原因在于一些外源蛋白被细菌蛋白酶部分降解，从而使得纯化工艺复杂化，并使高密度细胞培养成为不可能。此外，利用大肠杆菌的L-型菌株进行胞外生产有缺点，即由于对环境压力的抵抗力较弱以及生命周期较短，该菌株不适用于高密度培养。
在这种情况下，非常有必要来探索和开发一种替代方法，用于在大肠杆菌的细胞表面上胞外生产所需的外源蛋白。
发明概述
本发明人已努力开发出一种新型方法，用于在大肠杆菌的细胞表面胞外生产所需的外源蛋白，同时发现：融合蛋白可被有效分泌到转化有表达载体的重组大肠杆菌的培养基中，该表达载体包含编码大肠杆菌的外膜蛋白F(OmpF)和所需蛋白的基因，并且外源蛋白可以简单的方式通过从融合蛋白中除去OmpF而被纯化。
所以，本发明的主要目的是提供一种含有编码大肠杆菌的OmpF和所需外源蛋白的基因的表达载体。
本发明的其他目的是提供一种转化有该表达载体的微生物。
本发明的另一目的是提供一种通过培养被转化的微生物来胞外生产所需蛋白的方法。
附图简述
本发明的上述目的和特征从下列描述结合附图将变得一目了然，其中：
图1表示重组表达载体pTrcEBG的基因图谱。
图2表示表达载体pOmpF6的基因图谱。
图3表示重组表达载体pSKOmpFKm的基因图谱。
图4表示重组表达载体pEDOmpF3的基因图谱。
图5表示重组表达载体pTrcOmpF4的基因图谱。
图6表示重组表达载体pOmpF6βE的构建示意图以及基因图谱。
发明详述
本发明的表达载体含有氨苄青霉素抗性基因、OmpF启动子以及OmpF基因。
采用表达载体胞外生产所需蛋白的方法包括下列步骤：将编码被蛋白水解酶识别和切割的寡聚肽的基因和编码所需蛋白的基因导入到表达载体pOmpF6中以构建胞外生产所需蛋白的重组表达载体；用该重组表达载体转化缺乏OmpF基因的宿主微生物以获得转化的微生物；培养转化的微生物以便从培养物中生产OmpF-融合蛋白；以及用蛋白水解酶处理融合蛋白以获得所需的蛋白。可用的蛋白水解酶包括因子Xa、肠激酶(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)、genenase(His-Tyr或Tyr-His)、IgA蛋白酶(Pro/Ser-Arg/Thr-Pro-Pro-Thr/Ser/Ala-Pro)、内含肽(intein)、凝血酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及枯草杆菌蛋白酶或纤溶酶，其中优选因子Xa。可用的所需蛋白包括可与OmpF融合的肽、酶和抗体，其中优选β-内啡肽。埃希氏菌属(Escheria sp.)或沙门氏菌属(Samonella sp.)是优选的宿主微生物，但不限于此两种菌属。
本发明进一步描述在如下。
本发明人培养了六种大肠杆菌菌株(BL21(DE3)、HB101、JM101、MC4100、XL1-Blue和W3110)，通过SDS-PAGE分析了从各个培养物中分离的外膜蛋白，发现OmpF蛋白在BL21(DE3)菌株中是过表达的。本发明人构建了表达载体pOmpF6，其由大肠杆菌的OmpF基因、OmpF启动子和氨苄青霉素抗性基因组成。以BL21(DE3)的基因组DNA为模板，使用特异引物，通过PCR方法克隆了OmpF基因和OmpF启动子。大肠杆菌BL101菌株用该表达载体转化，转化子命名为E.coliBL101/pOmpF6(大肠杆菌BL101/pOmpF6)，并于2001年6月1日保藏于国际保藏单位韩国典型培养物保藏中心(KCTC，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)，保藏号KCTC1026BP。
然后，本发明人构建了重组表达载体pOmpF6βE作为一个例子来说明利用表达载体pOmpF6胞外生产融合蛋白的方法。重组表达载体含有编码β-内啡肽的cDNA、编码OmpF蛋白的基因、OmpF启动子、编码被因子Xa识别和切割的寡聚肽的基因以及氨苄青霉素抗性基因，所述寡聚肽插入在OmpF蛋白和β-内啡肽之间。本发明人用该重组表达载体pOmpF6βE转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株(NovagenCo.，U.S.A.)，培养该重组大肠杆菌菌株以在细胞表面上生产OmpF-β-内啡肽融合蛋白，并从培养基中回收融合蛋白。回收的融合蛋白首先通过阴离子交换层析纯化，然后利用因子Xa从融合蛋白中去除OmpF蛋白以回收β-内啡肽蛋白。
由于融合蛋白被大肠杆菌的蛋白水解酶降解，因此在常规细胞表面展示系统中进行高密度细胞培养实际上是不可能的。根据本发明，根据本发明，所需蛋白可以通过比常规方法更简单的方法进行胞外生产方法如下：利用OmpF启动子进行组成型表达，OmpF融合蛋白的分泌性生产与细胞生长同时开始，并且随着细胞浓度增加，蛋白分泌性生产的量也持续增加。所以，通过高密度细胞培养可大量生产所需蛋白。
下列实施例对本发明进行了进一步阐述，这些实施例不应被看做是对本发明范围的限制。
实施例1：筛选过表达OmpF的大肠杆菌菌株
挑选了六株通常用于生产重组蛋白的大肠杆菌菌株，从中纯化出外膜蛋白，并通过SDS-PAGE相互之间进行比较。如所选的六株大肠杆菌菌株为大肠杆菌BL21(DE3)[F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)携带T7 RNA聚合酶基因的原噬菌体](Novagen Co.，U.S.A.)、HB101[F-hsd20(rk-，mk-)recA13 ara-14 proA2 lacY1 galK2rpsL20(str)xyll-5 mtl-1 supE44 λ-](New England Biolabs，U.S.A.)、JM101[supE thi-1 Δ(lac-proAB)[F′traD36 proAB lacIqZ ΔM15]](Stratagene Co.，U.S.A)、MC4100[F- araD139 Δ(argF- lac)U169rpsL150(strr)relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR](Stratagene Co.，U.S.A.)、XL1-Blue[SupE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1lacF(proAB+lacIq lac ZM15 Tn10(tetr))](Stratagene Co.，U.S.A.)和W3110[衍生自K-12，λ-，F-，原氧型的](KCTC 2223)。各个大肠杆菌菌株在50ml的LB培养基(胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 5g/L)中，37℃培养。
从各个培养物中收集细菌细胞，并通过下列步骤将外膜蛋白分级分离：首先在4℃下以3500×g将3ml培养物离心5分钟以收集细菌细胞。收集的细菌细胞用1ml的Na2HPO4(pH7.2)缓冲液洗涤，4℃下以3500×g再次离心5分钟，然后悬浮于0.5ml的Na2HPO4(pH7.2)缓冲液中。细菌细胞悬浮液用超声波处理，接着在室温下以10,000×g离心2分钟以去除细胞碎片。上清液在室温下以10,000×g离心30分钟，将沉淀悬浮于0.5ml含有0.5％(w/v)十二烷基肌氨酸钠的10MNa2HPO4(pH7.2)缓冲液中，从而获得含有外膜蛋白的组分。
将该组分在37℃下温育30分钟，并在4℃下以10,000×g离心30分钟。将沉淀用10mM Na2HPO4(pH7.2)缓冲液洗涤并悬浮于50μl的PBS(0.247M NaCl、0.041M Na2HPO4、0.047M KH2PO4、0.005M KCl、pH7.4)中，从而获得用于蛋白分析的外膜蛋白级分样品(参见：Puenete，J.L.等；Gene，156：1-9，1995)。各个级分样品用SDS-PAGE分析，结果表明大肠杆菌BL21(DE3)菌株生产大量的OmpF蛋白。
实施例2：制备缺乏OmpF基因的大肠杆菌
利用噬菌体的red操纵子(exo-beta-gam)将大肠杆菌BL21(DE3)的OmpF基因删除，方法如下：首先，以噬菌体DNA为模板以及引物1和引物2的引物对进行PCR，引物1：5′-CGCGCCATGGATATTAATACTGAAACTGAGATCAAGC-3′(SEQ IDNO.1)和引物2：5′-CGGGATCCTCATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3′(SEQ ID NO.2)。在1.2％琼脂糖凝胶上通过电泳将扩增的PCR产物分离出来，获得2.2kb的DNA片段。该DNA片段用NcoI和BamHI限制性酶消化。含有trc启动子的表达质粒pTrc99A(Pharmacia BiotechCo.，U.S.A.)也用NcoI和BamHI限制性酶消化，并连接到用同样限制性酶消化的PCR产物上从而构建重组表达载体pTrcEBG。然后，用表达载体pTrcEBG转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，并将转化子在含有50μg/L氨苄青霉素的LB平板上进行筛选(参见：图1)。图1表示重组表达载体pTrcEBG的基因图谱。用重组表达载体pTrcEBG转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，并将转化子在含有50μg/L氨苄青霉素的LB平板上进行筛选。将转化子在500ml的LB培养基中培养直到O.D.600达到0.3，然后向培养基中加入IPTG(终浓度1mM)以诱导表达exo-beta-gam基因。培养1小时后，离心收集细菌细胞，并用250ml的去离子蒸馏水洗涤。离心后将收集的细胞悬浮于10ml的10％(w/v)甘油中并储存于-80℃下。
另一方面，以大肠杆菌BL21(DE3)菌株的基因组DNA为模板以及引物3和引物4的引物对进行PCR以获得2,160bp的DNA片段，引物3：5′-CGGAATTCTGGATTATACCGACGCAG-3′(SEQ ID NO.3)和引物4：5′-GCGGATCCTTAGAACTGGTAAACGATAC-3′(SEQ IDNO.4)。该DNA片段用EcoRI和BamHI限制性酶消化并插入到pBluescript SK(-)(Stratagene Cloning Systems，U.S.A.)中以构建表达载体pOmpF6。接着，用该表达载体转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，并将转化子在含有50μg/L氨苄青霉素的LB平板上进行筛选(参见：图2)。图2表示表达载体pOmpF6的基因图谱。此外，以表达载体pACY117(New England Biolabs，U.S.A.)为模板以及引物5和引物6的引物对进行PCR以获得940bp的DNA片段，引物5：5′-CGCTGCAGTTAGAAAAACTCATCGAGCATC-3′(SEQ ID NO.5)和引物6：5′-GCCTGCAGGCCACGTTGTGTCCTCAAA-3′(SEQ IDNO.6)。将该DNA片段用PstI限制性酶消化，并连接到PstI-消化的质粒pOmpF6中以构建重组表达载体pSKOmpFKm。然后，用重组表达载体pSKOmpFKm转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，从而获得含有卡那霉素抗性基因的重组表达载体pSKOpFKm(参见：图3)。图3表示重组表达载体pSKOmpFKm的基因图谱。正如图3所示，重组表达载体pSKOmpFKm含有OmpF基因和启动子，它们衍生自大肠杆菌BL21(DE3)菌株，并将卡那霉素抗性基因插在OmpF启动子和OmpF基因的5′-末端之间，通过此插入，OmpF基因不表达。以重组表达载体pSKOmpFKm作为模板以及引物3和引物4进行PCR以获得含有OmpF基因、其启动子及插入它们当中的卡那霉素抗性基因的DNA片段。将此DNA片段导入到转化有pTrcEBG的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上筛选转化子。为了从转化子中除去表达载体pTrcEBG，将转化子在LB培养基中传代培养2天共5次，然后在含有卡那霉素的LB平板上涂布和温育以筛选在此平板上不生长的转化子。将筛选到的大肠杆菌菌株的基因组DNA纯化以确认卡那霉素抗性基因是否插入在OmpF启动子和OmpF基因之间，方法如下：以纯化的基因组DNA为模板以及引物3和引物8的引物对进行PCR，引物8：5′-GATCGGAATTGATTTGAGTTTCC-3′(SEQ ID NO.8)，并将扩增的DNA片段进行测序。然后，以纯化的基因组DNA为模板以及引物7和引物9的引物对进行PCR，引物7：5′-CCACAGCAACGGTGTCGTCTG-3′(SEQ ID NO.7)和引物9：5′-ATCTTTATCTTTGTAGCACTTTCAC-3′(SEQ ID NO.9)，并将扩增的DNA片段进行测序。两个DNA片段的测序结果表明卡那霉素抗性基因位于OmpF启动子和OmpF基因之间。该转化菌株命名为“E.coliBL101”。
实施例3：开发OmpF基因的表达系统
为了在实施例2中所制备的E.coli BL101重组菌株中表达OmpF蛋白，分别构建了三种重组表达载体。
第一种是采用强诱导型表达启动子T7启动子来构建OmpF基因的表达载体。利用大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA作模板以及引物4和引物10进行PCR，引物10：5′-GCGAATTCATATGATGAAGCGCAATATTCTG-3′(SEQ ID NO.10)。将扩增的PCR产物用NdeI和BamHI消化，并克隆到表达载体pET21c(Novagen，U.S.A.)中以构建重组表达载体pEDOmpF3。用pEDOmpF3转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，由此获得了重组表达载体pEDOmpF3(参见：图4)。图4表示重组表达载体pEDOmpF3的基因图谱。
第二种是采用诱导型表达启动子Trc启动子来构建OmpF基因的表达载体。利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株的基因组DNA作模板以及引物4和引物11进行PCR，引物11：5′-GCGAATTCCATGGTGAAGCGCAATATTCTGGCAG-3′(SEQ IDNO.10)。将扩增的PCR产物用NdeI和BamHI消化，并克隆到表达载体pTrc99A中以构建重组表达载体pTrcOmpF4。用pTrcOmpF4转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，由此获得了重组表达载体pTrcOmpF4(参见：图5)。图5表示重组表达载体pTrcOmpF4的基因图谱。
第三种是将实施例2中构建的含有OmpF启动子的表达载体pOmpF6用作OmpF基因的表达载体。
将上述三种重组表达载体(pEDOmpF3、pTrcOmpF4和pOmpF6)转化实施例2中制备的E.coli BL101菌株。将转化的重组菌株在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上进行筛选。为了挑选最有效的在细胞表面上生产OmpF蛋白的分泌系统，将各个转化的重组大肠杆菌在37℃下培养在50ml的R/2培养基{(NH4)2HPO4 2g/L、KH2PO46.75g/L、柠檬酸0.85g/L、MgSO4.7H2O 0.7g/L、5M HCl/L、FeSO4.7H2O10g/L、ZnSO4.7H2O 2.25g/L、CuSO4.5H2O 1g/L、MnSO4.5H2O 0.5g/L、Na2B4O7.10H2O 0.23g/L、CaCl2.2H2O 2g/L、(NH4)6MO7O24 0.1g/L、葡萄糖10g/L}中。
当含有pEDOmpF3和pTrcOmpF4的转化子的培养物O.D.600达到0.7时，加入IPTG(异丙基-β-硫代半乳糖苷)至终浓度1M以诱导OmpF基因的表达。E.coli BL21(DE3)和E.coli BL101也在同样条件下培养作为对照组。采用实施例1中所述的方法，从各个菌株的培养物中制备外膜蛋白组分，并通过SDS-PAGE分析以比较OmpF蛋白的表达水平。转化有pOmpF6载体的E.coli BL101在外膜中产生和积累OmpF蛋白，其表达水平与亲本菌株E.coli BL21(DE3)的表达水平相近。上述结果清楚地表明，OmpF启动子对于表达OmpF-融合蛋白是最优选的。
本发明人将转化有重组表达载体pOmpF6的E.coli BL101命名为“大肠杆菌BL101/pOmpF6”，并于2001年6月1日保藏在国际保藏单位韩国典型培养物保藏中心(KCTC，#52 Oun-dong，Yusong-ku，Taejon 305-333，Republic of Korea)，保藏号KCTC 1026BP。
实施例4：构建OmpF-β-内啡肽表达载体
β-内啡肽蛋白由31个氨基酸组成，编码β-内啡肽的基因由93个核苷酸组成(参见：Takahashi H.等，FEBS Lett.，135：97-102，1981)。
为了制备编码β-内啡肽的基因，分别合成了引物12：5′-ACCGCCATACCTTCCCTCGATGAACTGGTAAACGATA-3′(SEQ IDNO.12)，引物13：5′-GGAAGGTATGGCGGTTTCATGACCAGCGAAAAAAGCCAGAC-3′(SEQ ID NO.13)，引物14：5′-CGCGTTTTTAAACAGGGTCACCAGCGGGGTCTGGCTTTTTTCGC-3′(SEQ ID NO.14)，引物15：5′-CCCTGTTTAAAAACGCGATCATCAAAAACGCGTATAAAAAAG-3′(SEQ ID NO.15)和引物16：5′-GCGGATCCCTATTATTCGCCTTTTTTATACGCGTTTTTG-3′(SEQ IDNO.16)，并将它们用于PCR。以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA作为模板以及引物10和引物12作为引物也进行PCR。将通过上述PCR扩增获得的两个DNA片段与引物10和引物16混合，并再次进行PCR从而获得所需的PCR片段，该PCR片段含有编码被因子Xa识别和切割的四个氨基酸的基因和与OmpF基因融合的β-内啡肽基因。将该PCR片段用BglII和XbaI消化并连接到表达载体pOmpF6中，构建成重组表达载体pOmpF6βE。用pOmpF6βE转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，由此获得重组表达载体pOmpF6βE(图6)。图6表示重组表达载体pOmpF6βE的构建示意图和基因图谱。重组表达载体pOmpF6βE中与OmpF基因融合的β-内啡肽基因的核苷酸序列为5′-TATGGCGGTTTCATGACCAGCGAAAAAAGCCAGACCCCGCTGGTGACCCTGTTTAAAAACGCGATCATCAAAAACGCGTATAAAAAAGGCGAATAA-3′(SEQ ID NO.18)，其表达的多肽为Tyr Gly Gly Phe MetAla Ser Glu Lys Ser Gln Ala Pro Leu Val Ala Leu Phe Lys Asn Ala Ile IleLys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu终止(SEQ ID NO.17)。
用重组表达载体pOmpF6βE转化大肠杆菌BL101菌株，并将转化子在含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB平板上进行筛选。
实施例5：胞外生产OmpF-β-内啡肽融合蛋白
将实施例4中制备的大肠杆菌转化子接种到1.8L的R/2培养基中，并在37℃下进行补料分批培养。底物由700g/L葡萄糖和20g/LMgSO4.7H2O组成，当培养基的pH升高到6.88以上时，以10ml/分钟的速度将此底物流加到培养基中以维持葡萄糖浓度为0.7g/L，通过空气和氧自动供给以维持溶氧为40％(v/v)。培养17.5小时后，600nm处测定培养物的光密度为150.5，细胞干重为54.1g/L。为了测定融合蛋白的量，定期收集培养基，离心，并通过电泳分析上清液，结果显示培养基中有40kDa的OmpF-β-内啡肽融合蛋白积累，并且随着培养时间的延长，OmpF-β-内啡肽融合蛋白的积累量也增加。OmpF-β-内啡肽融合蛋白的终浓度为4.64g/L，这相当于培养基中总蛋白的45％。
实施例6：纯化胞外生产的β-内啡肽
将实施例5培养基中积累的OmpF-β-内啡肽融合蛋白进行纯化：首先，将50ml培养基离心以除去细菌细胞。然后，通过阴离子交换层析从上清液中纯化OmpF-β-内啡肽融合蛋白，所用阴离子交换树脂为Q2-柱(BIO-RAD Co.，U.S.A.)，流动相为50mM Tris-HCl(pH7.0)缓冲液，流速为1ml/分钟。OmpF-β-内啡肽融合蛋白用从0到1M NaCl的线性梯度洗脱。NaCl浓度为0.45M处洗脱的OmpF-β-内啡肽融合蛋白的总量为89.1mg。通过透析将NaCl从OmpF-β-内啡肽融合蛋白中除去。为了从OmpF-β-内啡肽融合蛋白中除去OmpF蛋白，将因子Xa和OmpF-β-内啡肽融合蛋白以1∶200(w/w)的比例混合，并在23℃下温育12小时。然后，通过反相HPLC纯化β-内啡肽融合蛋白，所用HPLC柱为Microsorb-MV C18柱(4.6×250mm，Varian，U.S.A.)，流动相为0.1％(v/v)TFA(三氟乙酸)溶液，流速为1ml/分钟。蛋白洗脱液在280nm处用紫外检测器监测(参见：表1)。
表1：β-内啡肽的纯化
  纯化步骤   体积(mL)   总蛋白(mg)   融合蛋白(mg)  β-内啡肽(mg)   回收率(％)   纯度(％)
  培养基   50   515   232   20.3   100   3.9
  阴离子交换树脂   63   118.8   89.1   7.8   38.4   5.9
  RP-HPLC   12   2.8   -   2.8   13.8   ＞99
如上表1中所示，通过HPLC技术纯化了2.8mg β-内啡肽。进一步，纯化的β-内啡肽的N-端测序结果表明其氨基酸序列为Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys，这对应于β-内啡肽的N-端的氨基酸。
如上文所清楚地说明和演示，本发明提供了含有编码OmpF和所需蛋白的基因的表达载体、转化有该表达载体的大肠杆菌以及利用该微生物胞外生产所需蛋白的方法。本发明的重组表达载体含有氨苄青霉素抗性基因、OmpF启动子以及OmpF基因。根据本发明，靶蛋白可以下列方式通过比常规方法更简单的方法进行胞外生产，其意义在于：由于采用OmpF启动子进行组成型表达，因此OmpF融合蛋白的分泌性生产与细胞生长同时开始，并且随着细胞浓度增加，蛋白分泌性生产的量也持续增加。所以，通过细胞高密度培养可大量生产所需蛋白。
正如特定实施方案所展示和描述的那样，对于熟悉本领域技术的人员来说显然可以对本发明做出某些改变和修饰，而并不超出在此所阐述的本发明的实质或范围。
           有关保藏的微生物或其它生物材料的说明
                     (PCT细则13之二)
  A.下列标注是关于本说明书第 4页第 23-27行和第 10页第 9-12行中所指的已保藏的微生物或其它生物材料
  B.保藏物的识别                另外的保藏物在另外的纸页上标明□
  保藏单位的名称韩国典型微生物保藏中心(KCTC)
  保藏单位的地址(包括邮编和国别)韩国典型微生物保藏中心(KCTC)#52，Oun-dong，Yusong-ku大田广域市305-333，韩国
  保藏日                        保藏编号2001年6月1日                  KCTC 1026BP
  C.其它说明(如不适用，则为空  此项信息接续在另附的纸页上  □白)
  D.所做说明针对的指定国(如果所做的说明并不是针对所有指定国的话)
  E.说明的另外附送(如不适用，则为空白)
  下列说明将随后提交给国际局(请具体指出所述说明的一般性质，例如，“保藏编号”)
  仅供受理局使用
  □此页随国际申请一同收到
  签字官员：
  仅供国际局使用
  □此页由国际局于 日收到
  签字官员：
表PCT/RO/134(1998年7月)
                              序列表
<110>韩国科学技术院
     (Korea Advanced Institute Science and Technology)
<120>利用大肠杆菌OmpF胞外生产靶蛋白的方法
     (A Method for Extracellular Producing Target Proteins Employing OmpF in E.coli)
<130>SCT030927-47
<160>18
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cgcgccatgg atattaatac tgaaactgag atcaagc                           37
<210>2
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
cgggatcctc atcgccattg ctccccaaat ac                                        32
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
cggaattctg gattataccg acgcag                                               26
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
gcggatcctt agaactggta aacgatac                                             28
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
cgctgcagtt agaaaaactc atcgagcatc                                           30
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
gcctgcaggc cacgttgtgt cctcaaa                                              27
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
ccacagcaac ggtgtcgtct g                                                    21
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
gatcggaatt gatttgagtt tcc                                                  23
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
atctttatct ttgtagcact ttcac                                                25
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
gcgaattcat atgatgaagc gcaatattct g                                         31
<210>11
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
gcgaattcca tggtgaagcg caatattctg gcag                                      34
<210>12
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
accgccatac cttccctcga tgaactggta aacgata                                   37
<210>13
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
ggaaggtatg gcggtttcat gaccagcgaa aaaagccaga c                              41
<210>14
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
cgcgttttta aacagggtca ccagcggggt ctggcttttt tcgc                            44
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
ccctgtttaa aaacgcgatc atcaaaaacg cgtataaaaa ag                              42
<210>16
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
gcggatccct attattcgcc ttttttatac gcgtttttg                                  39
<210>17
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>融合蛋白
<400>17
Tyr Gly Gly Phe Met Thr Ser Glu Lys Ser Gln Thr Pro Leu Val Thr
 1             5                10                 15
Leu Phe Lys Asn Ala Ile Ile Lys Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Glu
           20                 25                30
<210>18
<211>96
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合蛋白cDNA
<400>18
tatggcggtt tcatgaccag cgaaaaaagc cagaccccgc tggtgaccct gtttaaaaac    60
gcgatcatca aaaacgcgta taaaaaaggc gaataa                              96

Claims (8)

1.一种表达载体pOmpF6，其包括氨苄青霉素抗性基因、OmpF启动子以及OmpF基因，其基因图谱如图2表示。
2.以权利要求1所述的表达载体pOmpF6转化的大肠杆菌(Escherichia coli)BL101/pOmpF6，其保藏号为KCTC 1026BP。
3.一种利用如权利要求1所述的表达载体pOmpF6胞外生产所需蛋白的方法，其包括下列步骤：
(i)将编码被蛋白水解酶识别和切割的寡聚肽的基因和编码所需蛋白的基因导入到表达载体pOmpF6中以构建胞外生产所需蛋白的重组表达载体；
(ii)用重组表达载体转化缺乏OmpF基因的宿主微生物以获得转化的微生物；
(iii)培养转化的微生物以便从培养物中生产OmpF-融合的蛋白；以及
(iv)用蛋白水解酶处理融合蛋白并获得所需蛋白。
4.权利要求3所述的方法，其中蛋白水解酶是因子Xa、肠激酶、genenase、IgA蛋白酶、内含肽、凝血酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶或血纤酶。
5.权利要求3所述的方法，其中所需蛋白为可与OmpF融合的肽、酶或抗体。
6.权利要求3所述的方法，其中所需蛋白为β-内啡肽。
7.权利要求3所述的方法，其中重组表达载体为图6所示的pOmpF6βE。
8.权利要求3所述的方法，其中宿主微生物为埃希氏菌属(Escherichia sp.)或沙门氏菌属(Samonella sp.)。
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