CN1244698C

CN1244698C - 一种重组sars病毒基因在多形汉逊酵母中的表达及用途

Info

Publication number: CN1244698C
Application number: CNB031411584A
Authority: CN
Inventors: 邱并生; 宋厚辉; 李勇
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2006-03-08
Anticipated expiration: 2023-06-12
Also published as: CN1475571A

Abstract

本发明属于蛋白质表达基因工程领域，具体地说是利用汉逊酵母作为细胞工厂表达外源基因的产物，由于SARS病毒与汉逊酵母在进化关系上亲缘较远，SARS病毒S、S1、S2和主要抗原表位基因在蛋白翻译过程中其密码子用法与汉逊酵母差别很大，从而导致翻译异常停顿。在SARS病毒S、S1、S2基因和主要抗原表位基因表达产物的产业化生产过程中，本发明按照汉逊酵母高表达基因的密码子用法重新设计SARS病毒S、S1、S2基因和主要抗原表位基因。高表达产物可作为疫苗用于预防SARS病毒引起的非典型性肺炎。本发明设计的基因也可用于与粘膜免疫的霍乱毒素B亚单位基因(专利申请号：03110441.X)在汉逊酵母中融合表达，表达产物可作为口服疫苗。

Description

一种重组SARS病毒基因在多形汉逊酵母中的表达及用途

技术领域

本发明属于蛋白质表达基因工程领域，具体地讲是涉及利用SARS病毒重组S、S1、S2和主要抗原表位基因和利用含有这些基因的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)作为细胞工厂进行高效表达以及利用其表达产物在用于研制预防SARS病毒的疫苗中的应用。

背景技术

SARS病毒是一种新出现的冠状病毒，引起人类的严重急性呼吸系统综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)，为非典型性肺炎的元凶。该病毒基因组为单股正链RNA。该RNA全长约30Kb，是所有RNA病毒中最大的，且具有感染性。SARS病毒的发病机制尚不清楚，其自然宿主范围较广，能在空气、粪便中长时间存活，主要经呼吸道系统传播。慢性感染时可能发生过敏性反应；急性感染之后，还可能发生持续性感染。目前尚无有效的疫苗可以预防。与其它冠状病毒一样，SARS病毒为典型的囊膜病毒，在其囊膜外面暴露有许多糖基化的纤突(Spike)蛋白，即S蛋白。S蛋白由S基因编码，它是由两个接近同样大小的蛋白S1和S2组成，直接与宿主细胞受体结合，通过S1和S2的构象变化，引起细胞融合，并诱导产生中和抗体和细胞免疫。在其他冠状病毒中，S蛋白是病毒中和抗原的主要部位，含有许多抗原表位，并诱导产生中和性抗体和融膜反应。这提示我们可以利用S基因进行SARS病毒疫苗的设计。

发明人利用DNAStar、VectorNTI等软件及其附带的在线分析工具，对美国、加拿大、香港、北京、广州等地的SARS病毒分离株从核苷酸序列到蛋白结构进行了预测和分析。发现目前所有SARS病毒分离株Spike蛋白的差异仅纯在S1上，S2高度保守，而且目前所有SARS病毒分离株蛋白的差异仅纯在S1上，S2高度保守，而且目前所有SARS病毒分离株的S2基因全部一致。S基因全长3768bp，编码1255个氨基酸(AA)。其中1-16AA为信号肽，66-609AA为S1蛋白区，641-1247AA为S2蛋白区。在S2蛋白中，潜在的糖基化位点主要集中在787-1221AA区域，非常类似副粘病毒的融合蛋白(Fusion)。在S2蛋白的1148-1236AA位置，存在一个特殊的Coiled coil结构(1149-1188AA)和亮氨酸拉链(1148-1182AA)及富含Cys的结构(1217-1236AA)，发明人推测该区域可能在SARS病毒与宿主细胞融合时起着非常关键的作用。为此，发明人根据汉逊酵母高表达基因密码子用法表(专利申请号：03110441.X)设计了一系列不同长度的S基因，以在汉逊酵母(Hansenula polymorpha)中高效表达，根据这些基因片段产生的抗体对SARS病毒的阻断效果，确定非典型性肺炎治疗性和预防性疫苗研制的最佳方案。

发明内容

多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)属于甲醇酵母，又称作Pichiaaugusta。它的最适生长温度高，生长速率快，利于大规模发酵生产，可以高效表达许多在其它系统中难以高效表达的基因。由于多形汉逊酵母能够按一定的基因剂量比分步整合多个基因，重组菌可按最佳的比例表达所需的基因，这在其它甲醇酵母中未见报道。此外，多形汉逊酵母具有遗传操作简单、外源基因拷贝数高、外源蛋白产量高、易于工业化生产等优点，是一个优于大肠杆菌和其它酵母(如巴斯德毕赤酵母和啤酒酵母等)的外源基因表达系统，已得到广泛关注。尤其是在分泌型表达中，外源蛋白通过分泌途径可完成蛋白水解成熟、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后加工过程，使所表达的蛋白更接近具有生物学活性的天然蛋白形式，又避免了啤酒酵母中的过糖基化现象。但是，SARS病毒与酵母在进化关系上亲缘较远，在蛋白翻译过程中其密码子用法与汉逊酵母差别很大，从而导致翻译异常停顿。至今尚未见到利用汉逊酵母系统表达SARS病毒任何基因的报道。我们利用多形汉逊酵母AS 2.2412(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC提供)表达SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因时，按照多形汉逊酵母高表达基因的密码子用法重新设计了这些编码基因，而使其表达量大大得到了提高。

本发明是基于这样一种发现而完成的。因此，本发明的目的在于提供一种重组SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因和利用含有该基因的多形汉逊酵母作为细胞工厂进行高效表达，以及利用这些表达产物在制备SARS病毒基因工程疫苗中的应用。本发明的多形汉逊酵母重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的核苷酸序列分别对应于SEQ ID NO：1-11所示的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：12-22所示的氨基酸序列。为达，本发明的技术路线是利用多形汉逊酵母高表达基因密码子用法表(如图1所示，中国专利申请号：03110441.X)。根据Genbank上报道的SARS病毒编码的S基因(登录号：AY278554，CUHK-W1株)的核苷酸序列(如图2所示，全长3768bp)，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示(全长1255氨基酸)。根据Vector NTI 8.0软件及其附带的SMART(SimpleModular Architecture Research Tool)等在线程序进行结构域组成、蛋白二级结构、跨膜螺旋、糖基化位点、抗原表位分析。根据分析结果，发明人将SARS病毒S基因的编码蛋白分成S(1-1255AA)、S1(17-640AA)、S1-1(66-609AA)、S1-2(17-232AA)、S1-3(258-572AA)、S2(641-1247AA)、S2-1(641-856AA)、S2-2(883-1197AA)、S2-3(1149-1183AA)、S2-4(1149-1236AA)、S2-5(787-1188AA)共11个区域。按照汉逊酵母高表达基因的密码子用法将S(1-1255AA)、S1(17-640AA)、S1-1(66-609AA)、S1-2(17-232AA)、S1-3(258-572AA)、S2(641-1247AA)、S2-1(641-856AA)、S2-2(883-1197AA)、S2-3(1149-1183AA)、S2-4(1149-1236AA)、S2-5(787-1188AA)区域对应的氨基酸序列转变成核苷酸序列，即得到按照汉逊酵母高表达基因密码子用法设计的编码基因，分别对应于如：SEQ IDNO：1-11所示的核苷酸序列。这些基因(SEQ ID NO：1-11)与SARS病毒相应的编码基因编码的氨基酸同源性为100％，其编码的氨基酸序列分别如(SEQ ID NO：12-22)所示，至于核苷酸序列同源性至少在75％。考虑到汉逊酵母高表达基因对个别同义密码子偏好的摆动以及SARS不同分离株在S1基因编码蛋白上的差异，美国、加拿大、香港、北京、广州等地的SARS病毒分离株的S1基因编码的蛋白共有5个氨基酸差异，而S2基因完全一致。因此，优化的编码重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的核苷酸序列，除SEQ IDNO：1-11所示的核苷酸序列外，由于核苷酸序列突变的缺失、增加仍产生编码相同功能的蛋白的核苷酸序列，应当指出，这些序列分别对应于上述SEQ ID NO：1-11所示的核苷酸序具有至少75％的同源性。以上所述的这些具有至少75％的同源性的核苷酸序列也涉及本发明所要达到的目的之一。由本发明得到的按照汉逊酵母高表达基因密码子用法设计的SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因，克服了在汉逊酵母表达系统中的不适应性，从而使这些基因在汉逊酵母中高效表达。在汉逊酵母中表达的SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因更安全可靠，与哺乳动物细胞表达产物相比，无潜在的致瘤性。经纯化后可直接在临床上用于预防SARS病毒引起的“非典型性肺炎”，或者与霍乱毒素B亚单位的编码基因(中国专利申请号：03110441.X)融合表达，通过粘膜免疫提高疫苗效果。

本发明的另一个目的在于提供一种利用汉逊酵母高表达基因密码子用法制备SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白的方法，该方法涉及以下步骤：

1.按照多形汉逊酵母高表达基因的密码子用法(图1)，优化设计SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因；

2.通过基因合成仪，人工合成新设计的编码基因；

3.利用中国专利(申请号：03110441.X)中的多形汉逊酵母表达载体pHMOXZ-A(胞内表达)、pHFMDHZ-A(胞内表达)、pHMOXZα-A(分泌型表达)、pHFMDHZα-A(分泌型表达)或者其它任何能在汉逊酵母中整合表达的真核表达载体，构建含有已优化的SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的重组表达载体；

4.多形汉逊酵母重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白的诱导表达；

5.表达产物鉴定和生物学活性鉴定.

按照上述方法步骤获得汉逊酵母(Hansenula polymorpha)高效表达含有SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的重组子，制备SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白是本技术领域的技术人员能够实现的。

迄今为止，国内外有关SARS病毒S、S1、S2基因及其主要抗原表位基因在汉逊酵母中的表达还未见报道。本发明优化设计的SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因在汉逊酵母中的表达无论表达生物量以及提取制备步骤都优于其它表达体系，使重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白的产业化生产和应用成为现实。

附图说明

图1：汉逊酵母高表达基因和低表达基因同义密码子用法比较。高：表示高表达基因；低：表示低表达基因。N为Codon W程序对高、低表达基因进行分类时，每个氨基酸的密码子数目。RSCU(Relative synonymouscodon usage，相对同义密码子用法)，RSCU反映的是一个基因中各个同义密码子的使用情况，其数值等于某个密码子在基因中的实际观测值与各密码子以相同的频率出现时的期望值之间的比值；引入RSCU值可以使不同氨基酸组成的数据库之间进行密码子用法比较。^*＠表示高表达基因对应的优越密码子，其中^*为经卡方检验后差异极显著；^＠为经卡方检验后差异显著。为本发明中优化设计S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因时选用的密码子

图2：Genbank上报道的SARS病毒的编码的S基因(登录号：AY278554，CUHK-W1株)的核苷酸序列

具体实施方式

以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的设计

1.将图1所述的多形汉逊酵母高表达基因密码子用法表(中国专利申请号：03110441.X)嵌入DNAStar程序

2.根据Genbank上报道的SARS病毒S基因(登录号：AY278554，CUHK-W1株)编码氨基酸对应的位置，通过DNAStar程序将S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码对应的氨基酸序列S(1-1255AA)、S1(17-640AA)、S1-1(66-609AA)、S1-2(17-232AA)、S1-3(258-572AA)、S2(641-1247AA)、S2-1(641-856AA)、S2-2(883-1197AA)、S2-3(1149-1183AA)、S2-4(1149-1236AA)、S2-5(787-1188AA)；即SEQ ID NO：12-22分别转变成相应的核苷酸序列，即得到按照汉逊酵母高表达基因的密码子用法设计的编码基因，分别如SEQ ID NO：1-11所示。

3.通过基因合成仪，人工合成新设计的编码基因

实施例2

重组表达载体的构建、转化和筛选

1.重组表达载体的构建：利用多形汉逊酵母表达载体pHMOXZ-A(胞内表达)、pHFMDHZ-A(胞内表达)、pHMOXZα-A(分泌型表达)、pHFMDHZα-A(分泌型表达)或者其它任何能在汉逊酵母中整合表达的真核表达载体，构建含有已优化的SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的重组表达载体。上述任何一种重组表达载体都可在多形汉逊酵母中高效表达。

2.重组表达载体的转化和筛选：采用电穿孔转化法转化多形汉逊酵母。挑多形汉逊酵母NCYC495单克隆于5mlYPD液体培养基中，37℃过夜培养

3.取2ml菌液加入200ml预温的YPD中，37℃培养至OD600＝1.2-1.5之间(约6h)

4.室温6000rpm离心5min，弃上清

5.用500mlTED(100mM Tris-HCl；50mM EDTA；25mM DTT；pH＝8.0)悬浮细胞

6. 37℃摇床，200rpm摇15min

7. 4℃离心6000rpm×5min，弃上清

8.用200ml预冷的270mM的蔗糖轻轻悬浮细胞

9. 4℃离心6000rpm×5min，弃上清

10.用100ml预冷的270mM的蔗糖轻轻悬浮细胞

11. 4℃离心6000rpm×5min，弃上清

12.用1ml预冷的270mM的蔗糖轻轻悬浮细胞，分装成60ul/管，液氮或者-80℃以下冰箱保存备用。

13.在60ul的感受态细胞中加5ul质粒DNA(约100-500ng)，轻轻混匀后加入2mm孔径的电击杯中

14.电击参数：50uF，100Ω，1.5KV

15.电击后立即加940ul的YPDTM(1％酵母提取物；1％蛋白胨；2％葡萄糖；1mM Tris-HCl；1mM MgCl₂)，吸至2-5ml的小管中，37℃摇床，200rpm摇1h

16.取100ul涂含有Zeocin抗生素(终浓度100ug/ml)的YPD平板，37℃培养2天后，平板上出现大、中、小三种形态的菌落，挑克隆PCR鉴定重组子，用Southern杂交鉴定拷贝数

17.转化子在涂有Zeocin抗生素的YPD(1％酵母提取物、1％蛋白胨、2％葡萄糖)平板上生长筛选。若采用其他能在汉逊酵母中整合表达的载体，可参照该载体的使用手册。提取大菌落酵母的DNA利用PCR方法检测是否有重组子插入。挑取经PCR鉴定正确的克隆进行发酵

实施例3

发酵和诱导表达

将含有多拷贝基因的阳性重组子酵母克隆在YPD培养基中37℃培养12小时后，按照1∶20的比例接种新鲜的YPD发酵培养基中(含1.5％甘油)，维持发酵温度30-37℃，pH3-5，溶氧量20％，空气流速5-10L/min。24小时后当O₂压力急剧升高时(提示培养基中的甘油已经消耗完毕)，开始加料(含50％甘油的YPD)，严格控制加料速度，使发酵液中甘油的终浓度维持在0.05％-0.4％之间。发酵24-48小时后，即可收获。对于胞内表达的发酵液，4℃12000rpm×2min离心收获菌体；对于分泌型表达的发酵液，4℃离心收获上清。进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。此外，除用甘油诱导发酵外，多形汉逊酵母表达系统也可以用1％的甲醇和1％葡萄糖诱导发酵。

实施例4

表达产物的生物学活性鉴定

将S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5各基因的表达产物纯化后，免疫小鼠，分离血清。在P3以上级别实验室进行病毒阻断试验。在感染SARS病毒的Vero细胞中，能阻断或者抑制病毒复制的血清对应的疫苗为有效疫苗。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种多形汉逊酵母表达严重症急性呼吸系统综合症(SARS)病毒重组S、S1、S2基因和主要抗原表位基因及其用途

<141>2003-05-20

<160>22

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>3768

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>根据多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)高表达基因密码子用法设计

<400>1

atgttcatct tcttgttgtt cttgaccttg acctccggtt ccgacttgga cagatgtacc 60

accttcgacg acgtccaagc tccaaactac acccaacaca cctcctccat gagaggtgtc 120

tactacccag acgagatctt cagatccgac accttgtact tgacccaaga cttgttcttg 180

ccattctact ccaacgtcac cggtttccac accatcaacc acaccttcga caacccagtc 240

atcccattca aggacggtat ctacttcgct gctaccgaga agtccaacgt cgtcagaggt 300

tgggtcttcg gttccaccat gaacaacaag tcccaatccg tcatcatcat caacaactcc 360

accaacgtcg tcatcagagc ttgtaacttc gagttgtgtg acaacccatt cttcgctgtc 420

tccaagccaa tgggtaccca aacccacacc atgatcttcg acaacgcttt caactgtacc 480

ttcgagtaca tctccgacgc tttctccttg gacgtctccg agaagtccgg taacttcaag 540

cacttgagag agttcgtctt caagaacaag gacggtttct tgtacgtcta caagggttac 600

caaccaatcg acgtcgtcag agacttgcca tccggtttca acaccttgaa gccaatcttc 660

aagttgccat tgggtatcaa catcaccaac ttcagagcta tcttgaccgc tttctcccca 720

gctcaagaca cctggggtac ctccgctgct gcttacttcg tcggttactt gaagccaacc 780

accttcatgt tgaagtacga cgagaacggt accatcaccg acgctgtcga ctgttcccaa 840

aacccattgg ctgagttgaa gtgttccgtc aagtccttcg agatcgacaa gggtatctac 900

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gagagaaaga agatctccaa ctgtgtcgct gactactccg tcttgtacaa ctccaccttc 1080

ttctccacct tcaagtgtta cggtgtctcc gctaccaagt tgaacgactt gtgtttctcc 1140

aacgtctacg ctgactcctt cgtcgtcaag ggtgacgacg tcagacaaat cgctccaggt 1200

caaaccggtg tcatcgctga ctacaactac aagttgccag acgacttcat gggttgtgtc 1260

ttggcttgga acaccagaaa catcgacgct acctccaccg gtaactacaa ctacaagtac 1320

agatacttga gacacggtaa gttgagacca ttcgagagag acatctccaa cgtcccattc 1380

tccccagacg gtaagccatg taccccacca gctttgaact gttactggcc attgaacgac 1440

tacggtttct acaccaccac cggtatcggt taccaaccat acagagtcgt cgtcttgtcc 1500

ttcgagttgt tgaacgctcc agctaccgtc tgtggtccaa agttgtccac cgacttgatc 1560

aagaaccaat gtgtcaactt caacttcaac ggtttgaccg gtaccggtgt cttgacccca 1620

tcctccaaga gattccaacc attccaacaa ttcggtagag acgtctccga cttcaccgac 1680

tccgtcagag acccaaagac ctccgagatc ttggacatct ccccatgttc cttcggtggt 1740

gtctccgtca tcaccccagg taccaacgct tcctccgagg tcgctgtctt gtaccaagac 1800

gtcaactgta ccgacgtctc caccgctatc cacgctgacc aattgacccc agcttggaga 1860

atctactcca ccggtaacaa cgtcttccaa acccaagctg gttgtttgat cggtgctgag 1920

cacgtcgaca cctcctacga gtgtgacatc ccaatcggtg ctggtatctg tgcttcctac 1980

cacaccgtct ccttgttgag atccacctcc caaaagtcca tcgtcgctta caccatgtcc 2040

ttgggtgctg actcctccat cgcttactcc aacaacacca tcgctatccc aaccaacttc 2100

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gctatgcaaa tggcttacag attcaacggt atcggtgtca cccaaaacgt cttgtacgag 2700

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ttgaacacct tggtcaagca attgtcctcc aacttcggtg ctatctcctc cgtcttgaac 2880

gacatcttgt ccagattgga caaggtcgag gctgaggtcc aaatcgacag attgatcacc 2940

ggtagattgc aatccttgca aacctacgtc acccaacaat tgatcagagc tgctgagatc 3000

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agagtcgact tctgtggtaa gggttaccac ttgatgtcct tcccacaagc tgctccacac 3120

ggtgtcgtct tcttgcacgt cacctacgtc ccatcccaag agagaaactt caccaccgct 3180

ccagctatct gtcacgaggg taaggcttac ttcccaagag agggtgtctt cgtcttcaac 3240

ggtacctcct ggttcatcac ccaaagaaac ttcttctccc cacaaatcat caccaccgac 3300

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gacccattgc aaccagagtt ggactccttc aaggaggagt tggacaagta cttcaagaac 3420

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atccaaaagg agatcgacag attgaacgag gtcgctaaga acttgaacga gtccttgatc 3540

gacttgcaag agttgggtaa gtacgagcaa tacatcaagt ggccatggta cgtctggttg 3600

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<210>2

<211>1872

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>2

gacagatgta ccaccttcga cgacgtccaa gctccaaact acacccaaca cacctcctcc 60

atgagaggtg tctactaccc agacgagatt ttcagatccg acaccttgta cttgacccaa 120

gacttgttct tgccattcta ctccaacgtc accggtttcc acaccatcaa ccacaccttc 180

gacaacccag tcatcccatt caaggacggt atctacttcg ctgctaccga gaagtccaac 240

gtcgtcagag gttgggtctt cggttccacc atgaacaaca agtcccaatc cgtcatcatc 300

atcaacaact ccaccaacgt cgtcatcaga gcttgtaact tcgagttgtg tgacaaccca 360

ttcttcgctg tctccaagcc aatgggtacc caaacccaca ccatgatctt cgacaacgct 420

ttcaactgta ccttcgagta catctccgac gctttctcct tggacgtctc cgagaagtcc 480

ggtaacttca agcacttgag agagttcgtc ttcaagaaca aggacggttt cttgtacgtc 540

tacaagggtt accaaccaat cgacgtcgtc agagacttgc catccggttt caacaccttg 600

aagccaatct tcaagttgcc attgggtatc aacatcacca acttcagagc tatcttgacc 660

gctttctccc cagctcaaga cacctggggt acctccgctg ctgcttactt cgtcggttac 720

ttgaagccaa ccaccttcat gttgaagtac gacgagaacg gtaccatcac cgacgctgtc 780

gactgttccc aaaacccatt ggctgagttg aagtgttccg tcaagtcctt cgagatcgac 840

aagggtatct accaaacctc caacttcaga gtcgtcccat ccggtgacgt cgtcagattc 900

ccaaacatca ccaacttgtg tccattgggt gaggtcttca acgctaccaa gttcccatcc 960

gtctacgctt gggagagaaa gaagatctcc aactgtgtcg ctgactactc cgtcttgtac 1020

aactccacct tcttctccac cttcaagtgt tacggtgtct ccgctaccaa gttgaacgac 1080

ttgtgtttct ccaacgtcta cgctgactcc ttcgtcgtca agggtgacga cgtcagacaa 1140

atcgctccag gtccaaccgg tgtcatcgct gactacaact acaagttgcc agacgacttc 1200

atgggttgtg tcttggcttg gaacaccaga aacatcgacg ctacctccac cggtaactac 1260

aactacaagt acagatactt gagacacggt aagttgagac cattcgagag agacatctcc 1320

aacgtcccat tctccccaga cggtaagcca tgtaccccac cagctttgaa ctgttactgg 1380

ccattgaacg actacggttt ctacaccacc accggtatcg gttaccaacc atacagagtc 1440

gtcgtcttgt ccttcgagtt gttgaacgct ccagctaccg tctgtggtcc aaagttgtcc 1500

accgacttga tcaagaacca atgtgtcaac ttcaacttca acggtttgac cggtaccggt 1560

gtcttgaccc catcctccaa gagattccaa ccattccaac aattcggtag agacgtctcc 1620

gacttcaccg actccgtcag agacccaaag acctccgaga ttttggacat ctccccatgt 1680

tccttcggtg gtgtctccgt catcacccca ggtaccaacg cttcctccga ggtcgctgtc 1740

ttgtaccaag acgtcaactg taccgacgtc tccaccgcta tccacgctga ccaattgacc 1800

ccagcttgga gaatctactc caccggtaac aacgtcttcc aaacccaagc tggttgtttg 1860

atcggtgctg ag 1872

<210>3

<211>1632

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>3

gtcaccggtt tccacaccat caaccacacc ttcgacaacc cagtcatccc attcaaggac 60

ggtatctact tcgctgctac cgagaagtcc aacgtcgtca gaggttgggt cttcggttcc 120

accatgaaca acaagtccca atccgtcatc atcatcaaca actccaccaa cgtcgtcatc 180

agagcttgta acttcgagtt gtgtgacaac ccattcttcg ctgtctccaa gccaatgggt 240

acccaaaccc acaccatgat cttcgacaac gctttcaact gtaccttcga gtacatctcc 300

gacgctttct ccttggacgt ctccgagaag tccggtaact tcaagcactt gagagagttc 360

gtcttcaaga acaaggacgg tttcttgtac gtctacaagg gttaccaacc aatcgacgtc 420

gtcagagact tgccatccgg tttcaacacc ttgaagccaa tcttcaagtt gccattgggt 480

atcaacatca ccaacttcag agctatcttg accgctttct ccccagctca agacacctgg 540

ggtacctccg ctgctgctta cttcgtcggt tacttgaagc caaccacctt catgttgaag 600

tacgacgaga acggtaccat caccgacgct gtcgactgtt cccaaaaccc attggctgag 660

ttgaagtgtt ccgtcaagtc cttcgagatc gacaagggta tctaccaaac ctccaacttc 720

agagtcgtcc catccggtga cgtcgtcaga ttcccaaaca tcaccaactt gtgtccattg 780

ggtgaggtct tcaacgctac caagttccca tccgtctacg cttgggagag aaagaagatc 840

tccaactgtg tcgctgacta ctccgtcttg tacaactcca ccttcttctc caccttcaag 900

tgttacggtg tctccgctac caagttgaac gacttgtgtt tctccaacgt ctacgctgac 960

tccttcgtcg tcaagggtga cgacgtcaga caaatcgctc caggtccaac cggtgtcatc 1020

gctgactaca actacaagtt gccagacgac ttcatgggtt gtgtcttggc ttggaacacc 1080

agaaacatcg acgctacctc caccggtaac tacaactaca agtacagata cttgagacac 1140

ggtaagttga gaccattcga gagagacatc tccaacgtcc cattctcccc agacggtaag 1200

ccatgtaccc caccagcttt gaactgttac tggccattga acgactacgg tttctacacc 1260

accaccggta tcggttacca accatacaga gtcgtcgtct tgtccttcga gttgttgaac 1320

gctccagcta ccgtctgtgg tccaaagttg tccaccgact tgatcaagaa ccaatgtgtc 1380

aacttcaact tcaacggttt gaccggtacc ggtgtcttga ccccatcctc caagagattc 1440

caaccattcc aacaattcgg tagagacgtc tccgacttca ccgactccgt cagagaccca 1500

aagacctccg agattttgga catctcccca tgttccttcg gtggtgtctc cgtcatcacc 1560

ccaggtacca acgcttcctc cgaggtcgct gtcttgtacc aagacgtcaa ctgtaccgac 1620

gtctccaccg ct 1632

<210>4

<211>648

<212>DNA

<213>Artificial Seauence

<220>

<400>4

gacagatgta ccaccttcga cgacgtccaa gctccaaact acacccaaca cacctcctcc 60

atgagaggtg tctactaccc agacgagatt ttcagatccg acaccttgta cttgacccaa 120

gacttgttct tgccattcta ctccaacgtc accggtttcc acaccatcaa ccacaccttc 180

gacaacccag tcatcccatt caaggacggt atctacttcg ctgctaccga gaagtccaac 240

gtcgtcagag gttgggtctt cggttccacc atgaacaaca agtcccaatc cgtcatcatc 300

atcaacaact ccaccaacgt cgtcatcaga gcttgtaact tcgagttgtg tgacaaccca 360

ttcttcgctg tctccaagcc aatgggtacc caaacccaca ccatgatctt cgacaacgct 420

ttcaactgta ccttcgagta catctccgac gctttctcct tggacgtctc cgagaagtcc 480

ggtaacttca agcacttgag agagttcgtc ttcaagaaca aggacggttt cttgtacgtc 540

tacaagggtt accaaccaat cgacgtcgtc agagacttgc catccggttt caacaccttg 600

aagccaatct tcaagttgcc attgggtatc aacatcacca acttcaga 648

<210>5

<211>945

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>5

aagccaacca ccttcatgtt gaagtacgac gagaacggta ccatcaccga cgctgtcgac 60

tgttcccaaa acccattggc tgagttgaag tgttccgtca agtccttcga gatcgacaag 120

ggtatctacc aaacctccaa cttcagagtc gtcccatccg gtgacgtcgt cagattccca 180

aacatcacca acttgtgtcc attgggtgag gtcttcaacg ctaccaagtt cccatccgtc 240

tacgcttggg agagaaagaa gatctccaac tgtgtcgctg actactccgt cttgtacaac 300

tccaccttct tctccacctt caagtgttac ggtgtctccg ctaccaagtt gaacgacttg 360

tgtttctcca acgtctacgc tgactccttc gtcgtcaagg gtgacgacgt cagacaaatc 420

gctccaggtc caaccggtgt catcgctgac tacaactaca agttgccaga cgacttcatg 480

ggttgtgtct tggcttggaa caccagaaac atcgacgcta cctccaccgg taactacaac 540

tacaagtaca gatacttgag acacggtaag ttgagaccat tcgagagaga catctccaac 600

gtcccattct ccccagacgg taagccatgt accccaccag ctttgaactg ttactggcca 660

ttgaacgact acggtttcta caccaccacc ggtatcggtt accaaccata cagagtcgtc 720

gtcttgtcct tcgagttgtt gaacgctcca gctaccgtct gtggtccaaa gttgtccacc 780

gacttgatca agaaccaatg tgtcaacttc aacttcaacg gtttgaccgg taccggtgtc 840

ttgaccccat cctccaagag attccaacca ttccaacaat tcggtagaga cgtctccgac 900

ttcaccgact ccgtcagaga cccaaagacc tccgagattt tggac 945

<210>6

<211>1821

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>6

cacgtcgaca cctcctacga gtgtgacatc ccaatcggtg ctggtatctg tgcttcctac 60

cacaccgtct ccttgttgag atccacctcc caaaagtcca tcgtcgctta caccatgtcc 120

ttgggtgctg actcctccat cgcttactcc aacaacacca tcgctatccc aaccaacttc 180

tccatctcca tcaccaccga ggtcatgcca gtctccatgg ctaagacctc cgtcgactgt 240

aacatgtaca tctgtggtga ctccaccgag tgtgctaact tgttgttgca atacggttcc 300

ttctgtaccc aattgaacag agctttgtcc ggtatcgctg ctgagcaaga cagaaacacc 360

agagaggtct tcgctcaagt caagcaaatg tacaagaccc caaccttgaa gtacttcggt 420

ggtttcaact tctcccaaat cttgccagac ccattgaagc caaccaagag atccttcatc 480

gaggacttgt tgttcaacaa ggtcaccttg gctgacgctg gtttcatgaa gcaatacggt 540

gagtgtttgg gtgacatcaa cgctagagac ttgatctgtg ctcaaaagtt caacggtttg 600

accgtcttgc caccattgtt gaccgacgac atgatcgctg cttacaccgc tgctttggtc 660

tccggtaccg ctaccgctgg ttggaccttc ggtgctggtg ctgctttgca aatcccattc 720

gctatgcaaa tggcttacag attcaacggt atcggtgtca cccaaaacgt cttgtacgag 780

aaccaaaagc aaatcgctaa ccaattcaac aaggctatct cccaaatcca agagtccttg 840

accaccacct ccaccgcttt gggtaagttg caagacgtcg tcaaccaaaa cgctcaagct 900

ttgaacacct tggtcaagca attgtcctcc aacttcggtg ctatctcctc cgtcttgaac 960

gacatcttgt ccagattgga caaggtcgag gctgaggtcc aaatcgacag attgatcacc 1020

ggtagattgc aatccttgca aacctacgtc acccaacaat tgatcagagc tgctgagatc 1080

agagcttccg ctaacttggc tgctaccaag atgtccgagt gtgtcttggg tcaatccaag 1140

agagtcgact tctgtggtaa gggttaccac ttgatgtcct tcccacaagc tgctccacac 1200

ggtgtcgtct tcttgcacgt cacctacgtc ccatcccaag agagaaactt caccaccgct 1260

ccagctatct gtcacgaggg taaggcttac ttcccaagag agggtgtctt cgtcttcaac 1320

ggtacctcct ggttcatcac ccaaagaaac ttcttctccc cacaaatcat caccaccgac 1380

aacaccttcg tctccggtaa ctgtgacgtc gtcatcggta tcatcaacaa caccgtctac 1440

gacccattgc aaccagagtt ggactccttc aaggaggagt tggacaagta cttcaagaac 1500

cacacctccc cagacgtcga cttgggtgac atctccggta tcaacgcttc cgtcgtcaac 1560

atccaaaagg agatcgacag attgaacgag gtcgctaaga acttgaacga gtccttgatc 1620

gacttgcaag agttgggtaa gtacgagcaa tacatcaagt ggccatggta cgtctggttg 1680

ggtttcatcg ctggtttgat cgctatcgtc atggtcacca tcttgttgtg ttgtatgacc 1740

tcctgttgtt cctgtttgaa gggtgcttgt tcctgtggtt cctgttgtaa gttcgacgag 1800

gacgactccg agccagtctt g 1821

<210>7

<211>648

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>7

cacgtcgaca cctcctacga gtgtgacatc ccaatcggtg ctggtatctg tgcttcctac 60

cacaccgtct ccttgttgag atccacctcc caaaagtcca tcgtcgctta caccatgtcc 120

ttgggtgctg actcctccat cgcttactcc aacaacacca tcgctatccc aaccaacttc 180

tccatctcca tcaccaccga ggtcatgcca gtctccatgg ctaagacctc cgtcgactgt 240

aacatgtaca tctgtggtga ctccaccgag tgtgctaact tgttgttgca atacggttcc 300

ttctgtaccc aattgaacag agctttgtcc ggtatcgctg ctgagcaaga cagaaacacc 360

agagaggtct tcgctcaagt caagcaaatg tacaagaccc caaccttgaa gtacttcggt 420

ggtttcaact tctcccaaat cttgccagac ccattgaagc caaccaagag atccttcatc 480

gaggacttgt tgttcaacaa ggtcaccttg gctgacgctg gtttcatgaa gcaatacggt 540

gagtgtttgg gtgacatcaa cgctagagac ttgatctgtg ctcaaaagtt caacggtttg 600

accgtcttgc caccattgtt gaccgacgac atgatcgctg cttacacc 648

<210>8

<211>945

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>8

caaatggctt acagattcaa cggtatcggt gtcacccaaa acgtcttgta cgagaaccaa 60

aagcaaatcg ctaaccaatt caacaaggct atctcccaaa tccaagagtc cttgaccacc 120

acctccaccg ctttgggtaa gttgcaagac gtcgtcaacc aaaacgctca agctttgaac 180

accttggtca agcaattgtc ctccaacttc ggtgctatct cctccgtctt gaacgacatc 240

ttgtccagat tggacaaggt cgaggctgag gtccaaatcg acagattgat caccggtaga 300

ttgcaatcct tgcaaaccta cgtcacccaa caattgatca gagctgctga gatcagagct 360

tccgctaact tggctgctac caagatgtcc gagtgtgtct tgggtcaatc caagagagtc 420

gacttctgtg gtaagggtta ccacttgatg tccttcccac aagctgctcc acacggtgtc 480

gtcttcttgc acgtcaccta cgtcccatcc caagagagaa acttcaccac cgctccagct 540

atctgtcacg agggtaaggc ttacttccca agagagggtg tcttcgtctt caacggtacc 600

tcctggttca tcacccaaag aaacttcttc tccccacaaa tcatcaccac cgacaacacc 660

ttcgtctccg gtaactgtga cgtcgtcatc ggtatcatca acaacaccgt ctacgaccca 720

ttgcaaccag agttggactc cttcaaggag gagttggaca agtacttcaa gaaccacacc 780

tccccagacg tcgacttggg tgacatctcc ggtatcaacg cttccgtcgt caacatccaa 840

aaggagatcg acagattgaa cgaggtcgct aagaacttga acgagtcctt gatcgacttg 900

caagagttgg gtaagtacga gcaatacatc aagtggccat ggtac 945

<210>9

<211>120

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>9

ggtgacatct ccggtatcaa cgcttccgtc gtcaacatcc aaaaggagat cgacagattg 60

aacgaggtcg ctaagaactt gaacgagtcc ttgatcgact tgcaagagtt gggtaagtac 120

<210>10

<211>264

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<223> 根据多形汉逊酵母(Hansenula Polymorpha)高表达基因密码子用法设计

<400>10

ggtgacatct ccggtatcaa cgcttccgtc gtcaacatcc aaaaggagat cgacagattg 60

aacgaggtcg ctaagaactt gaacgagtcc ttgatcgact tgcaagagtt gggtaagtac 120

gagcaataca tcaagtggcc atggtacgtc tggttgggtt tcatcgctgg tttgatcgct 180

atcgtcatgg tcaccatctt gttgtgttgt atgacctcct gttgttcctg tttgaagggt 240

gcttgttcct gtggttcctg ttgt 264

<210>11

<211>1206

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<220>

<400>11

atcttgccag acccattgaa gccaaccaag agatccttca tcgaggactt gttgttcaac 60

aaggtcacct tggctgacgc tggtttcatg aagcaatacg gtgagtgttt gggtgacatc 120

aacgctagag acttgatctg tgctcaaaag ttcaacggtt tgaccgtctt gccaccattg 180

ttgaccgacg acatgatcgc tgcttacacc gctgctttgg tctccggtac cgctaccgct 240

ggttggacct tcggtgctgg tgctgctttg caaatcccat tcgctatgca aatggcttac 300

agattcaacg gtatcggtgt cacccaaaac gtcttgtacg agaaccaaaa gcaaatcgct 360

aaccaattca acaaggctat ctcccaaatc caagagtcct tgaccaccac ctccaccgct 420

ttgggtaagt tgcaagacgt cgtcaaccaa aacgctcaag ctttgaacac cttggtcaag 480

caattgtcct ccaacttcgg tgctatctcc tccgtcttga acgacatctt gtccagattg 540

gacaaggtcg aggctgaggt ccaaatcgac agattgatca ccggtagatt gcaatccttg 600

caaacctacg tcacccaaca attgatcaga gctgctgaga tcagagcttc cgctaacttg 660

gctgctacca agatgtccga gtgtgtcttg ggtcaatcca agagagtcga cttctgtggt 720

aagggttacc acttgatgtc cttcccacaa gctgctccac acggtgtcgt cttcttgcac 780

gtcacctacg tcccatccca agagagaaac ttcaccaccg ctccagctat ctgtcacgag 840

ggtaaggctt acttcccaag agagggtgtc ttcgtcttca acggtacctc ctggttcatc 900

acccaaagaa acttcttctc cccacaaatc atcaccaccg acaacacctt cgtctccggt 960

aactgtgacg tcgtcatcgg tatcatcaac aacaccgtct acgacccatt gcaaccagag 1020

ttggactcct tcaaggagga gttggacaag tacttcaaga accacacctc cccagacgtc 1080

gacttgggtg acatctccgg tatcaacgct tccgtcgtca acatccaaaa ggagatcgac 1140

agattgaacg aggtcgctaa gaacttgaac gagtccttga tcgacttgca agagttgggt 1200

aagtac 1206

<210>12

<211>1255

<212>PRT

<213>Coronavirus

<400>12

Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu

1 5 10 15

Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln

20 25 30

His Thr Ser Ser Met Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Glu Ile Phe Arg

35 40 45

Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Tyr Ser

50 55 60

Asn Val Thr Gly Phe His Thr Ile Asn His Thr Phe Asp Asn Pro Val

65 70 75 80

Ile Pro Phe Lys Asp Gly Ile Tyr Phe Ala Ala Thr Glu Lys Ser Asn

85 90 95

Val Val Arg Gly Trp Val Phe Gly Ser Thr Met Asn Asn Lys Ser Gln

100 105 110

Ser Val Ile Ile Ile Asn Asn Ser Thr Asn Val Val Ile Arg Ala Cys

115 120 125

Asn Phe Glu Leu Cys Asp Asn Pro Phe Phe Ala Val Ser Lys Pro Met

130 135 140

Gly Thr Gln Thr His Thr Met Ile Phe Asp Asn Ala Phe Asn Cys Thr

145 150 155 160

Phe Glu Tyr Ile Ser Asp Ala Phe Ser Leu Asp Val Ser Glu Lys Ser

165 170 175

Gly Asn Phe Lys His Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Lys Asp Gly

180 185 190

Phe Leu Tyr Val Tyr Lys Gly Tyr Gln Pro Ile Asp Val Val Arg Asp

195 200 205

Leu Pro Ser Gly Phe Asn Thr Leu Lys Pro Ile Phe Lys Leu Pro Leu

210 215 220

Gly Ile Asn Ile Thr Asn Phe Arg Ala Ile Leu Thr Ala Phe Ser Pro

225 230 235 240

Ala Gln Asp Thr Trp Gly Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Phe Val Gly Tyr

245 250 255

Leu Lys Pro Thr Thr Phe Met Leu Lys Tyr Asp Glu Asn Gly Thr Ile

260 265 270

Thr Asp Ala Val Asp Cys Ser Gln Asn Pro Leu Ala Glu Leu Lys Cys

275 280 285

Ser Val Lys Ser Phe Glu Ile Asp Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn

290 295 300

Phe Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr

305 310 315 320

Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser

325 330 335

Val Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr

340 345 350

Ser Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly

355 360 365

Val Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala

370 375 380

Asp Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly

385 390 395 400

Gln Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe

405 410 415

Met Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser

420 425 430

Thr Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu

435 440 445

Arg Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly

450 455 460

Lys Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp

465 470 475 480

Tyr Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

485 490 495

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

500 505 510

Pro Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe Asn

515 520 525

Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Pro Ser Ser Lys Arg

530 535 540

Phe Gln Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Val Ser Asp Phe Thr Asp

545 550 555 560

Ser Val Arg Asp Pro Lys Thr Ser Glu Ile Leu Asp Ile Ser Pro Cys

565 570 575

Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Ala Ser Ser

580 585 590

Glu Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Asp Val Ser Thr

595 600 605

Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Ala Trp Arg Ile Tyr Ser Thr

610 615 620

Gly Asn Asn Val Phe Gln Thr Gln Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu

625 630 635 640

His Val Asp Thr Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile

645 650 655

Cys Ala Ser Tyr His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln Lys

660 665 670

Ser Ile Val Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Asp Ser Ser Ile Ala

675 680 685

Tyr Ser Asn Asn Thr Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Ser Ile Ser Ile

690 695 700

Thr Thr Glu Val Met Pro Val Ser Met Ala Lys Thr Ser Val Asp Cys

705 710 715 720

Asn Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ala Asn Leu Leu Leu

725 730 735

Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Ser Gly Ile

740 745 750

Ala Ala Glu Gln Asp Arg Asn Thr Arg Glu Val Phe Ala Gln Val Lys

755 760 765

Gln Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys Tyr Phe Gly Gly Phe Asn Phe

770 775 780

Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Leu Lys Pro Thr Lys Arg Ser Phe Ile

785 790 795 800

Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met

805 810 815

Lys Gln Tyr Gly Glu Cys Leu Gly Asp Ile Asn Ala Arg Asp Leu Ile

820 825 830

Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr

835 840 845

Asp Asp Met Ile Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Leu Val Ser Gly Thr Ala

850 855 860

Thr Ala Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe

865 870 875 880

Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn

885 890 895

Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Gln Ile Ala Asn Gln Phe Asn Lys Ala

900 905 910

Ile Ser Gln Ile Gln Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ser Thr Ala Leu Gly

915 920 925

Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu

930 935 940

Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn

945 950 955 960

Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp

965 970 975

Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln

980 985 990

Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala

995 1000 1005

Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp

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<212>PRT

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<211>216

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<213>Coronavirus

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<212>PRT

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<212>PRT

<213>Coronavirus

<400>22

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Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Met Lys Gln

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Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly

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Lys Tyr

Claims

1.来源于多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)表达的重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因，它们的核苷酸序列分别由对应于SEQ ID NO：1-11所示的核苷酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S基因，它的核苷酸序列由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S1基因，它核苷酸序列由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S1-1基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列组成。

5.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S1-2基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S1-3基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列组成。

7.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S2基因，它的核苷酸序列由SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S2-1基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：7所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列组成。

9.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S2-2基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：8所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列组成。

10.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S2-3基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列组成。

11.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S2-4基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列组成。

12.根据权利要求1所述的基因，其中多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)表达的重组SARS病毒S2-5基因，它的核苷酸序列由SEQ IDNO：11所示的核苷酸序列组成，其编码的蛋白的氨基酸序列由如SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列组成。

13.一种制备权利要求1所述的基因编码的蛋白的方法，包括以下步骤：

a)按照多形汉逊酵母高表达基因密码子用法优化设计SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因；

b)通过基因合成仪，人工合成新设计的S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因，它们的核苷酸序列分别由对应于SEQ ID NO：1-11所示的核苷酸序列组成；

c)利用多形汉逊酵母表达载体或者其它任何能在汉逊酵母中整合表达的真核表达载体，构建含有已优化的SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因的重组表达载体；

d)多形汉逊酵母重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因编码蛋白的诱导表达；

e)表达产物鉴定和生物学活性鉴定。

14.根据权利要求1-12所述的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)表达的重组SARS病毒S、S1、S1-1、S1-2、S1-3、S2、S2-1、S2-2、S2-3、S2-4、S2-5基因，任选其中之一基因在制备SARS病毒病治疗性药物和预防性疫苗中的应用。