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CN1230184C - 以细菌的菌体成分为有效成分的癌免疫治疗用制剂 - Google Patents

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CN1230184C CNB998109967A CN99810996A CN1230184C CN 1230184 C CN1230184 C CN 1230184C CN B998109967 A CNB998109967 A CN B998109967A CN 99810996 A CN99810996 A CN 99810996A CN 1230184 C CN1230184 C CN 1230184C
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Abstract

提供一种水包油型乳剂及其制造方法，水包油型乳剂的特征是：将具有免疫强化作用的细菌的菌体成分作为有效成分，以含有油状物质、表面活性剂、以及稳定剂为基础，可以作为癌免疫治疗药来使用。

Description

以细菌的菌体成分为有效成分的癌免疫治疗用制剂
技术领域
本发明是关于将具有免疫活性作用的细菌的菌体成分作为有效成分，含有以油状物质、表面活性剂、以及稳定剂为基础的、能够作为癌免疫治疗法药物使用的水包油型乳剂以及它的制造方法。
背景技术
微生物死菌、细菌的细胞壁骨架(Cell Wall Skeleton，以下简称为CWS)、胞壁酰二肽(MDP)、脂多糖(LPS)、甘露聚糖、葡聚糖以及它们的衍生物等的细菌的菌体成分(根据情况包括通过重组DNA法来产生的物质)，具有免疫活性作用，例如已知在实验性肿瘤系以及人癌的免疫治疗法方面显示抗肿瘤活性。而且已知菌体成分经均质器等的分散·通过乳化机分散到油状物质中，进一步地在表面活性剂溶液中被制剂化成为水包油型乳剂的时候，上述由免疫活性作用产生的抗肿瘤效果及预防感染效果能够很好地发挥。(Cancer Res.，33，2187-2195(1973)、J.Net.Cancer Inst.，48，831-835(1972)、J.Bacteriol.，94，1736-1745(1967)、Gann，69，619-626(1978)、J.Bacteriol.，92，869-879(1966))。
可是上述水包油型乳剂由于在以下叙述的理由，商业化的生产有困难，最近尽管它的有用性被越来越高地评价(Proc.Japan Acad.，70，Ser.B205-209(1994)；Proc.Japan Acad.，74，Ser.B20550-55(1998))，可是有着不能稳定供给市场这样的问题。本发明克服了水包油型乳剂的商业化生产的各种阻碍，解决了上述问题。以下依次叙述存在的阻碍和克服它们的手段。
一般的，水包油型乳剂经时性的变化较大，最终导致油相、水相2相分离的结果。对此，以前为了乳剂的稳定性，采用①微粒化、②缩小分散溶剂与分散溶质的比重差、③添加高分子等物质使分散溶剂的粘度提高等的方法。可是因为只是延长变化所需要的时间，所以最终仍然会分离成油相、水相的2相。
特别是以菌体成分为有效成分的水包油型乳剂的时候，发现由于含有CWS致使乳剂不稳定，因为几天内就有不溶性凝聚物的生成，所以最终只能制备成临用时调制成水包油型乳剂，除此没有其它的方法。为了解决这个问题，进行了使用糖醇及糖类的冷冻干燥制剂的尝试(特公昭63-1291号)，在这个现有技术的制剂产品中，发现刚冷冻干燥完以及保存1个月左右的平均粒子直径、粒度分布的变化较大，能够达到实用化的稳定性的大幅度的改善仍然不能达到。
发明的概述
本发明者们进行深入研究的结果，发现：通过在以菌体成分为有效成分的水包油型乳剂中添加适宜的稳定剂，可以将该制剂稳定地冷冻干燥，能够提高保存稳定性。即本发明的水包油型乳剂的冷冻干燥制剂，通过水等的适当的分散溶剂进行再次分散时，能够保持同冷冻干燥前同等程度的平均粒径、粒径分布或者浊度(相对吸光度)。另外，即使将本发明的冷冻干燥制剂例如长期保存之后，同样地再分散到水等的适当的分散溶剂中时，也能够保持同冷冻干燥前同等程度的平均粒径、粒径分布或者浊度(相对吸光度)。
即，与本发明有关的第一个课题解决方法的要点如下所示。
(1)将含有细菌的菌体成分、油状物质、表面活性剂以及稳定剂，具有下述特征的水包油型乳剂进行冷冻干燥处理得到的稳定化冷冻干燥制剂：
(a)在油滴中含有细菌的菌体成分；
(b)油滴以单峰型的粒径分布在水溶液中分散；
(c)冷冻干燥前后的水溶液中的油滴的粒径分布以及浊度的变化不大。
(2)上述(1)记载的稳定化冷冻干燥制剂，其水溶液浊度的变化是冷冻干燥前浊度的50％以下。
(3)上述(1)或(2)记载的稳定化冷冻干燥制剂，细菌的菌体成分是BCG(Bacillus Calmette-Guerin，卡介苗)-CWS，油状物质是角鲨烷。
(4)从上述(1)到(3)的任何一个记载的稳定化冷冻干燥制剂，稳定剂是氨基酸或尿素。
(5)从上述(1)到(3)的任何一个记载的稳定化冷冻干燥制剂，稳定剂是甘氨酸。
(6)包括将含有细菌的菌体成分、油状物质、表面活性剂以及稳定剂的具有下述特征的水包油型乳剂进行冷冻干燥处理工艺的稳定化冷冻干燥制剂的制造万法：
(a)在油滴中含有细菌的菌体成分；
(b)油滴以单峰型的粒径分布在水溶液中分散；
(c)冷冻干燥前后的水溶液中的油滴的粒径分布以及浊度的变化不大。
(7)上述(6)记载的稳定化冷冻干燥制剂的制造方法，其水溶液浊度的变化是冷冻干燥前浊度的50％以下。
(8)上述(6)或(7)记载的稳定化冷冻干燥制剂的制造方法，细菌的菌体成分是BCG-CWS，油状物质是角鲨烷。
(9)从上述(6)到(8)的任何一个记载的稳定化冷冻干燥制剂制造方法，稳定剂是氨基酸或尿素。
(10)从上述(6)到(8)的任何一个记载的稳定化冷冻干燥制剂的制造方法，稳定剂是甘氨酸。
以菌体成分为有效成分的水包油型乳剂的商业上生产有困难的另一个障碍，是在保持它的免疫强化作用不变的同时、又要大量生产，这是极其困难的事情。
即，改良水包油型乳剂以往公知的临用时调制的制剂方法(J.Nat.Cancer Inst.48，831-835(1972)、J.Bacteriol，92，869-879(1966)、Gann，69，619-626(1978))，可以确立工业上的制造方法，首先在最初，为了解决由于使用的油状物质的量与水相相比极其少所导致的菌体成分向油状物质中均一地分散的困难性，尝试了使BCG-CWS的原粉末分散在等渗液中；然后加油状物质、进行分散，加表面活性剂使其进行乳化的水包油型乳剂的制造方法。对于这个初期研究制品，尽管粒度分布及在显微镜下的状态同已知的临用时调制的制剂相比几乎相同，可是生物活性(小鼠的抑制肿瘤增殖活性)却失活了。另外，除去了油状物质的制品，生物活性同样地失去。
如此地，以细菌的菌体成分为有效成分制剂的生物学上的有效性，与制剂内容及制造方法有关联，受其的影响较大。对此，即使将细菌的菌体成分的水溶液或水混悬液单独给予，也不能得到显示出免疫强化作用的抗肿瘤效果及预防感染效果，但细菌的菌体成分通过均质器等的分散机使其分散在油状物质中，进一步用表面活性剂使其乳化，被制剂化形成水包油型乳剂的时候，抗肿瘤效果及预防感染效果被发挥出来(Cancer Resarch，33，2187-2195(1973)、J.Nat.CancerInst.，48，831-835(1972)、J.Bacteriol.，94，1736-1745(1967)、Gann，69，619-626(1978)、J.Bacteriol.，92，869-879(1966))，由此也能够确证。
本发明者们发现：对于维持有效的免疫强化作用、并且以大规模制造上述水包油型乳剂来说，有必要将菌体成分用油状物质充分覆盖，为此使用有机溶剂作为分散辅助溶剂是适宜的。即，在本发明中，通过将具有免疫强化作用的菌体成分在油状物质和由有机溶剂组成的分散辅助溶剂的混合液中进行分散，可以克服因使用的油状物质的量少所至的分散步骤的困难性。如此，通过在分散步骤中使用由有机溶剂组成的辅助溶剂，使制造工艺中的全体容量的控制成为可能；另外将补助溶剂的容量达到最终制剂的容量程度，使在制造的全部过程之中，用一种分散乳化机器制造成为可能。据此，对于以菌体成分为有效成分的水包油型乳剂的制造，能够容易地按比例放大，为医药品的开发铺平了道路。另外，在以后详细叙述的那样，菌体成分能否被油状物质充分地覆盖，可以通过添加外源凝集素所致的凝聚反应的有无来确定。
即，与本发明有关的第二个课题解决方法的要点表示如下。
(1)含有以下的步骤为其特征的、细菌的菌体成分被油状物质覆盖，使用外源性凝集素的凝聚反应显示阴性的水包油型乳剂的制造方法：
(a)搅拌细菌的菌体成分、油状物质、以及由有机溶剂组成的分散辅助溶剂的混合液，分散细菌的菌体成分；
(b)通过除去分散辅助溶剂，使细菌的菌体成分被油状物质覆盖后的油滴形成后；
(c)加入含有表面活性剂的水溶液使其乳化。
(2)上述(1)记载的水包油型乳剂的制造方法，细菌的菌体成分是BCG-CWS或者红色诺卡氏菌的CWS。
(3)上述(1)记载的水包油型乳剂的制造方法，细菌的菌体成分是BCG-CWS，油状物质是角鲨烷。
(4)上述(1)、(2)、或(3)记载的水包油型乳剂的制造方法，分散辅助溶剂是乙醇或甲苯。
(5)上述(1)、(2)、(3)或(4)记载的水包油型乳剂的制造方法，油滴被良好地分散成约100μm以下的粒径。
通过上述的第二个问题的解决方法，既保持免疫强化作用、又使以细菌的菌体成分为有效成分的水包油型乳剂的大量生产成为了可能；但是在它的制造过程中，可见到无法忽略的量的菌体成分不能被乳化，以不溶性物质付着在乳化·分散机器等上。从菌体成分的有效利用方面来看，这是较严重的问题。
本发明者们，对用油状物质来充分覆盖的细菌的菌体成分，具体地说使用BCG-CWS进行乳化、制剂化的深入研究的结果，发现：在制备水包油型乳剂后，没有被乳化而残存在乳化·分散机器的器壁等上的不溶性物质，分散有菌体成分的油状物质具有强烈地附着在器壁等上的性质是其原因；另外，同时发现表面活性剂可以促进这种附着。为此，在使用的表面活性剂的浓度上想办法，而且将乳化步骤划分为粗乳化和正式乳化的2个阶段，可以使不被乳化的作为不溶物残存的菌体成分的量急剧减少，从而使研究成功。即发现：在最初的粗乳化中，使用象不促进菌体成分的附着那样的低浓度的表面活性剂缓慢地进行搅拌，使其乳化；然后，加入为了得到期望的适宜粒度分布所需要的最低限度的表面活性剂，调节全部溶液的表面活性剂的浓度，通过进行强烈地搅拌制成期望的乳化制剂，这样的2阶段乳化方法非常地有效。对于用这样的本发明的制造方法得到的水包油型乳剂，可以看到作为不溶物附着在器壁上残存的菌体成分几乎没有，使用的菌体成分几乎都包含在被乳化了的制剂中。即，可以见到水包油型乳剂中的菌体成分的含量，与乳化前的理论量显示几乎同样的值。
因此，与本发明有关的第三个问题解决办法的要点如下所示。
(1)包含以下步骤为其特征的、水包油型乳剂的制造方法：
(a)搅拌细菌的菌体成分、油状物质、以及分散辅助溶剂的混合液，分散细菌的菌体成分；
(b)除去分散辅助溶剂后；
(c)加入含有表面活性剂的水溶液，使其按下述的2个阶段进行乳化：
i)加入含有低浓度表面活性剂的水溶液，缓慢地搅拌进行粗乳化；
ii)为了得到适宜期望的粒度分布，调节粗乳化溶液的表面活性剂浓度，强烈地搅拌进行正式乳化。
(2)上述(1)记载的水包油型乳剂的制造方法，其特征是：在2个阶段乳化中，被用于粗乳化的低浓度的表面活性剂水溶液的表面活性剂的含量是油状物质的10％以下。
(3)上述(1)或者(2)记载的水包油型乳剂的制造方法，表面活性剂是聚山梨醇酯80(吐温80)。
(4)上述(1)、(2)、或者(3)记载的水包油型乳剂的制造方法，细菌的菌体成分是BCG-CWS或红色诺卡氏菌的CWS。
(5)上述(1)、(2)、(3)或者(4)记载的水包油型乳剂的制造方法，细菌的菌体成分是BCG-CWS，油状物质是角鲨烷。
以下详细说明本发明。
本发明的第1种形式，是将由具有免疫强化作用的菌体成分、油状物质、表面活性剂、稳定剂等组成的水包油型乳剂冷冻干燥处理得到的稳定的癌免疫治疗用制剂。
作为本发明中的具有免疫强化作用的菌体成分，可以举出微生物死菌及来源于微生物的CWS、胞壁酰二肽(MDP)、脂多糖(LPS)、甘露聚糖、葡聚糖以及它们的衍生物。作为微生物死菌的例子，可以举出人型结核菌的死菌等。作为CWS的来源微生物，可以举出分支杆菌属、诺卡氏菌属、棒杆菌属等。其中优选的可以举出是分支杆菌属牛型结核菌的BCG以及红色诺卡氏菌。这些的CWS，物理性地粉碎细菌后，经除去核酸、蛋白质、脱脂等的精制过程以不溶性残渣的形式得到，它的制法本身是公知的(J.Nat.Cancer Inst.，52，95-101(1974))。菌体成分的浓度在水包油型乳剂中优选的是0.1～10mg/ml。
作为在本发明中的油状物质，可以举出象记载在Immunology，27，311-329(1974)那样的矿物油、动植物油。作为矿物油可以举出液体石蜡、Bayol F、Drakeol-6VR等。作为植物油可以举出花生油、芝麻油、AD-65(花生油和アラセル和单硬脂酸铝的混合物)等。作为动物油，可以举出角鲨烷、角鲨烯那样的类萜衍生物等。其中作为优选者可以举出Drakeol-6VR、角鲨烷。
另外油状物质的浓度，对于水包油型乳剂在0.01～30％W/W的范围较为适宜，但优选0.01～10％W/W，更优选0.01～5.0％W/W。
作为在本发明中的表面活性剂，只要是在医药品制剂中能够使用的表面活性剂的话均可，没有特别地限制。例如可以举出磷脂类、非离子表面活性剂等。作为磷脂类可以举出磷脂酰胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、(神经)鞘磷脂、卵磷脂等。另外也可以使用氢化后的磷脂。作为非离子性表面活性剂可以举出聚乙二醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚氧乙烯硬化蓖麻油衍生物、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(聚山梨醇酯20)、同样的聚氧乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯(聚山梨醇酯40)、同样的聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯(聚山梨醇酯60)、同样的聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(聚山梨醇酯80)等的聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯类以及脱水山梨醇单月桂酸酯(司盘20)、脱水山梨醇单棕榈酸酯(司盘40)、脱水山梨醇单硬脂酸酯(司盘60)、脱水山梨醇单油酸酯(司盘80)等的脱水山梨醇脂肪酸酯类等。作为优选的表面活性剂，可以举出蛋黄磷脂酰胺、蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、聚山梨醇酯80。作为更优选者可以举出聚山梨醇酯80。
另外表面活性剂的浓度，对于水包油型乳剂在0.01～10％W/W的范围较为适宜，但优选0.01～5.0％W/W。这些表面活性剂不限制于一种，可以将数种类适宜地组合起来使用。
作为在本发明中的稳定剂，可以举出多糖类、氨基酸、蛋白质、尿素、氯化钠。作为多糖类可以举出葡聚糖、淀粉、麦芽糊精、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、褐藻酸钠等。作为氨基酸优选丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸等的中性氨基酸，作为更优选的中性氨基酸可以举出甘氨酸。作为蛋白质优选者可以举出白蛋白、明胶、胶原等。这些稳定剂不限制于一种，可以将数种类适宜地组合起来使用。
另外稳定剂的浓度，对于水包油型乳剂在0.1～20％W/W的范围较为适宜，但优选0.1～10％W/W。
为了将与本发明有关的冷冻干燥制剂再分散而使用的分散溶剂，是成为乳剂粒子的分散媒体的物质，可以举出注射用水(注射用蒸馏水)、生理盐水等，只要是可能用于注射的分散溶剂均可，没有特别地限制。
在本发明中，为了以冻干块的形式形成冷冻干燥品，根据需要可以添加赋形剂。另外赋形剂多同时兼有等渗剂的作用。作为赋形剂优选者可以举出糖类、氨基酸、尿素、氯化钠等。作为糖类可以举出单糖类、二糖类、糖醇类。作为单糖类可以举出葡萄糖、果糖等；作为二糖类可以举出麦芽糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等；作为糖醇可以举出甘露糖醇、山梨糖醇等。作为氨基酸可以举出甘氨酸、丙氨酸等。这些赋形剂不限制于一种，可以将数种类适宜地组合起来使用。
另外赋形剂的浓度，对于水包油型乳剂在0.1～30％W/W的范围较为适宜，但优选1～20％W/W。
其它的，根据需要在适当的阶段可以添加在医药品制剂中能够使用的抗氧剂、防腐剂、等渗剂、缓冲剂等。添加浓度对于水包油型乳剂大多数情况在10％W/W以下。
本发明的冷冻干燥制剂，优选对于冷冻干燥前以及再分散后的水包油型乳液中，显示单峰型的粒径分布、浊度(相对吸光度)变化不大者，更优选是冷冻干燥前的浊度的50％以下的变化者。另外平均粒径在0.1～20μm的范围，优选在1～10μm，更优选在1～5μm。
在本发明中，所谓“显示单峰型的粒径分布”是指乳化被充分地进行，每个油滴粒子物理性质保持稳定的意思，例如对于冷冻干燥前后，冷冻干燥后没有出现与冷冻干燥前的平均粒径偏差较大的情况，指示出同样的分布。另外相反地，所谓具有2相以上的峰的粒径分布，是指出现乳液的聚集、进而合并的状态，是不稳定的乳液状态的意思。
平均粒径、粒径分布、浊度可以使用例如静态光散射粒度分布测定装置(SALD3000，岛津制作所制造，以下同)进行测定。
本发明也提供上述冷冻干燥制剂的制造方法。它的制造方法，首先在冷冻干燥前制备由细菌的菌体成分、油状物质、表面活性剂、赋形剂、稳定剂等组成的水包油型乳剂。这些水包油型乳剂，例如在上述浓度的油状物质中，添加如同上述浓度的菌体成分，进一步地添加表面活性剂、赋形剂、稳定剂以及其它的添加剂的水溶液之后，通过例如Potter-Elvehjem型的匀浆器、高速搅拌机、超声波匀浆器、マイクロフルイダイザ-(商品名)、ナイマイザ-(商品名)、アルテイマイザ-(商品名)、マントン-ガウリン匀浆器型高压匀浆器等的分散、乳化机，实施乳化处理至达到具有上述平均粒径的水包油型乳剂。根据制造上的情况，制备出水包油型乳剂之后，可以添加赋形剂、稳定剂等的添加剂。
然后，将得到的水包油型乳剂经冷冻干燥处理，最后一般将小玻璃药瓶内部用氮气置换，进行封塞，得到冷冻干燥制剂。
本发明的冷冻干燥制剂，通过添加水等的适当的分散溶剂迅速地进行再分散，这样能够再制成具有与冷冻干燥前同等程度的平均粒径、粒径分布或者浊度的水包油型乳剂。分散溶剂的液量根据用途而不同，没有特定地限制，但可以是冷冻干燥前液量的0.5～2倍量的范围。
本发明的第二种形式，其特征是使用细菌的菌体成分、油状物质、以及由有机溶剂组成的分散辅助溶剂的混合液的水包油型乳剂的制造方法。
在本发明的制造方法中，首先将具有免疫强化作用的菌体成分、油状物质以及分散辅助溶剂的混合液经分散。乳化机进行处理；然后除去分散辅助溶剂。在除去后的残渣中，加入含有表面活性剂及稳定剂等的等渗液，经分散·乳化机进行处理，制造保持有所期望的免疫强化活性的水包油型乳剂。
在本发明中能够使用的细菌的菌体成分，特别是BCG-CWS及红色诺卡氏菌的CWS等，在水及有机溶剂等中是不溶的，在油状物质中也是不溶解的物质。特别是油状物质因为用量非常地少并且有粘性，所以将菌体成分直接、均一地常规性地进行分散是非常困难的。可是，通过使用在以后可以除去的有机溶剂作为分散辅助溶剂，与直接分散到油状物质时的情况相比，常规性地容易地得到均一的分散液之事成为可能。即，因为有机溶剂可以在以后除去，所以能够大量地使用，并且因为粘性降低，使用分散机器可以常规性地容易地制备均一的分散液。而且，通过除去该状态的有机溶剂，能够得到菌体成分均一地分散的油状物质。
如此，通过使用由有机溶剂组成的分散补助溶剂可以较好地被分散，并且可以稳定地得到用油状物质充分覆盖了的上述菌体成分。例如，对于没有使用分散辅助溶剂的以前的方法，使用波特型匀浆器时，因为油量少，故每次制备均一地并且恒常良好的分散液是困难的，与此相比，使用分散辅助溶剂，变得能够制备恒常良好的分散液。象这样，通过本发明的制造方法，可以说能够制备出将菌体成分用油充分地覆盖起来了的良好的分散液，解决了其在工业生产上的问题。
通过适宜地选择分散辅助溶剂，制备除去分散辅助溶剂之后的上述菌体成分的粒径较细、良好地被分散开的乳液之事成为可能，可以制备出用目视完全看不见粗粒子的乳液(用目视能够检出的粗粒子通常是具有约100μm以上的粒径的物质)。
菌体成分是否如所期望的那样被油状物质充分地覆盖，可以经使用在后面详细叙述的外源性凝集素的凝集反应来确认。
在本发明可以使用的分散辅助溶剂，可以举出在氮气流下、加热或者减压下等可以简单地除去的有机溶剂。作为优选的有机溶剂可以举出在ICH的残留溶剂指南中记载的2类、3类的溶剂。作为更优选的溶剂可以举出：例如甲苯等的芳香族烃化合物，例如环己烷等的脂肪族碳氢化合物，例如二氯甲烷、氯仿、三氯乙烯等的卤代烃化合物，例如乙醇、异丙醇等的低级醇，例如醋酸乙酯等的醋酸酯，例如乙醚等的醚类，例如丙酮等的酮溶剂。作为更加优选的溶剂可以举出乙醇、异丙醇等的低级醇，氯仿等的卤代碳氢化合物，甲苯等的芳香族碳氢化合物。作为最优选的溶剂可以举出乙醇、氯仿、以及甲苯。
为了除去溶剂的加热温度，可以根据溶剂的沸点、蒸汽压适宜选择。另外，如达到高温的话因为会发生菌体成分的失活，故希望采用不发生失活的100℃以下的温度。优选在80℃以下，更优选在70℃以下进行。
在这个制造方法中的所谓可以使用的水溶液，是在先前叙述过的能够成为乳液粒子的分散媒体的物质，可以举出生理盐水等的等渗液及注射用水(注射用蒸馏水)等，但只要是可以注射的分散溶剂的话均可，没有特别的限制。另外作为可以使水溶液成为等渗的等渗化剂，可以举出糖类、氨基酸、尿素、氯化钠等。作为单糖类有葡萄糖、果糖等；作为二糖类有麦芽糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等；作为糖醇有甘露糖醇、山梨糖醇等。作为氨基酸可以举出甘氨酸、丙氨酸等。这些等张剂不限制于一种，可以将数种类适宜地组合起来使用。另外等渗化剂的浓度，对于水包油型乳剂在0.1～30％W/W的范围较为适宜，但优选1～20％W/W。
其它的根据需要可以添加在医药品制剂中能够使用的抗氧剂、防腐剂、缓冲剂等。添加浓度对于水包油型乳剂大多在10％W/W以下。
本发明的第三种形式，是混合细菌的菌体成分、油状物质、以及分散辅助溶剂以分散菌体成分，除去分散辅助溶剂后，按2个阶段进行乳化为其特征的水包油型乳剂的制造方法。即，除去分散辅助溶剂后，在用油状物质充分覆盖后的菌体成分上，首先加入含有低浓度的表面活性剂的水溶液，用分散·乳化机器缓慢地搅拌进行粗乳化处理；然后为了得到所期望的粒度分布，进一步加入表面活性剂，调节全部溶液的表面活性剂浓度，通过用分散·乳化机强烈地搅拌，制造出所期望的水包油型乳剂。
通过这个2个阶段的乳化法，把使用着的细菌的菌体成分几乎能够定量化地转入水包油型乳剂中。
对于2个阶段乳化的最初的粗乳化工艺，表面活性剂浓度若达到油状物质的约10％以上时，因为有菌体成分向器具类等上的付着变得强烈坚固的倾向，所以在此被使用的表面活性剂的浓度希望是油状物质的约10％以下。表面活性剂的使用量，优选是油状物质的0.2～8％的范围，更优选是油状物质的1～8％的范围。因此，在粗乳化工艺中使用的所谓含有低浓度的表面活性剂的水溶液，是指表面活性剂的含量占使用的油状物质的约10％以下的值。但是，在粗乳化工艺中使用的表面活性剂的浓度，不能超过在正式乳化工艺中使用的浓度。
然后，在正式乳化工艺中使用的表面活性剂，为了得到所希望的粒度分布有必要使用必须的最低限度的量。因此，根据情况保持在粗乳化工艺时的用量；或者根据情况，以比在最初的粗乳化工艺中使用的表面活性剂浓度高的浓度调整全体溶液中的浓度。作为能够用于调整全体溶液中的表面活性剂浓度的表面活性剂溶液的浓度，可以用少量进行调整，例如，用聚山梨酸酯80时，可以用约5～约15％浓度的水溶液。另一方面，在正式乳化工艺中，全体溶液中的表面活性剂的量有必要调整到占油状物质的约10％以上，优选达到占油状物质的约10～约20％的范围的量，更优选达到占油状物质的约15～约20％的范围的量。象这样的所谓在正式乳化工艺中的表面活性剂浓度的调整，是指调整表面活性剂浓度到能够制备出具有所期望的粒度分布的乳液。
在正式乳化工艺之后，根据需要，进一步加入表面活性剂，可以调整到表面活性剂更高含量的溶液，此时通过乳化机进一步进行搅拌，可以形成粒度分布尖锐的物质。对于这些水溶液根据需要可以加入适宜的稳定剂及等渗剂。另外，这些表面活性剂不限于一种，可以将适宜的、数种物质组合起来使用。
乳化的搅拌条件，以缓慢的搅拌条件来说，例如可以举出使用IKA ULTRA-TURRAXT-25(轴传动S25KV-25F)的时候，用旋转速度5000～7000rpm进行乳化。另外作为强搅拌条件可以举出用10000～25000rpm转速进行乳化。作为乳化的温度，不希望高温，但考虑水分的蒸发等因素时，40～80℃左右是适当的。但是，使用的表面活性剂是结合了聚氧乙烯的物质时，希望设定到考虑了它的浊点的温度。
乳化的时间一边用粒度分布器测定制备的乳液的粒度分布，一边使其达到希望的粒度分布状态，能够适宜地选择。
将在本发明的第一种形式叙述的冷冻干燥制剂分散在溶剂中得到的水包油型乳剂、及用在第二种以及第三种形式叙述了的方法制造出的水包油型乳剂，当然必须是具有免疫强化作用。为此，在记述过的那样，有必要将细菌的菌体成分用油状物质充分地覆盖，但是否充分覆盖，可以通过利用外源性凝集素所致的菌体成分的凝集反应来进行检定。
这个检定法，是利用外源性凝集素同菌体成分的糖链(阿拉伯半聚乳糖)之间的相互作用，菌体成分被充分覆盖时，即糖链也同样地被充分覆盖住，如果糖链被充分覆盖住的话上述的相互作用就不会产生。即凝集反应显示为阴性的时候，证明主成分被充分地覆盖。另外，在菌体成分被用油状物质充分覆盖时，通过免疫强化作用所致的抗肿瘤效果及预防感染效果依然能够发挥是其特点，以对外源性凝集反应显示阴性作为指标可以判定有无生物活性。
在此说的所谓凝集反应，是指通过荧光显微镜、或相位差显微镜在目视上可以确认菌体成分的凝集。例如在BCG-CWS水包油型乳剂中显示的凝集反应，加入外源性凝集素时，显示在图15那样的乳液的凝集经目视上就能够确认。因此凝集反应是阳性时，即说产生象这样的凝集块。相反地是阴性时，不产生象这样的凝集块，可以说被用油状物质覆盖着的菌体成分几乎平均地分散着。
作为凝集反应的确认方法，可以举出将与本发明有关的乳剂和外源性凝集素(刀豆素A)溶液应该ピペッテイング进行混合，在25℃放置30分钟以上，用相位差显微镜等确认有无凝集反应。这个结果，例如对于象显示在图10、15那样地不含有油状物质、只是菌体成分的制剂品(无油：参照例2.3)及公知制备法的改良法(参照例2.2)的情况，产生凝集反应。另一方面，对于菌体成分被用油状物质充分覆盖着的乳剂的情况，如图12到14那样地凝集反应不产生(实施例2.2、3.1、3.2)。象这样地，用观察有无凝集反应，可以区分用油状物质覆盖的程度。
用本发明的方法制造出的水包油型乳剂，也包括再分散到分散溶剂中的第一种形式的冷冻干燥制剂，可以经注射等非口服的方式给药。给药形式根据治疗目的等而不同，没有特别地限制。作为通常能够使用的给药形式，可以举出例如皮下给药或皮内给药用注射剂。
给药量、给药次数根据给药对象的疾病、患者的症状、年龄、体重、性别等不同而不同，但非口服给药的时候，特别是对于以注射剂使用的时候，通常对于成人可以以每周1次或者4周1次来给药，每次相当于0.1～200μg的范围，优选以1～100μg的范围给药。
附图的简单说明
图1是显示经实施例1.1得到的水包油型乳剂的冷冻干燥前和冷冻干燥后立即进行再分散的物质的平均粒径以及粒径分布。
图2是显示经实施例1.2得到的水包油型乳剂的冷冻干燥前和冷冻干燥后立即进行再分散的物质的平均粒径以及粒径分布。
图3是显示经参照例1.1得到的水包油型乳剂的冷冻干燥前和冷冻干燥后立即进行再分散的物质的平均粒径以及粒径分布。
图4是显示在50℃保存的制剂进行再分散后的乳液的浊度(相对吸光度)的经时性变化(试验例1.2)。
图5是显示在25℃保存的制剂进行再分散后的乳液的浊度(相对吸光度)的经时性变化(试验例1.2)。
图6是显示在50℃保存的制剂进行再分散后的乳液的平均粒径以及粒径分布的经时性变化(试验例1.3)。
图7是显示在25℃保存的制剂进行再分散后的乳液的平均粒径以及粒径分布的经时性变化(试验例1.3)。
图8是显示在5℃保存的制剂进行再分散后的乳液的平均粒径以及粒径分布的经时性变化(试验例1.3)。
图9是显示对于参照例1.1制剂的平均粒径以及粒径分布的经时性变化。
图10是显示记载在参照例2.3的不含有油状物质的制剂品的外源性凝集素凝集反应试验的结果。
图11是显示记载在实施例2.1的乙醇溶剂分散改良法制剂品的外源性凝集素凝集反应试验的结果。
图12是显示记载在实施例2.2的制剂品的外源性凝集素凝集反应试验的结果。
图13显示实施例3.1的制剂品的凝集反应评价结果。
图14显示实施例3.2的制剂品的凝集反应评价结果。
图15显示记载在参照例2.2的公知制备法的改良法制剂品的外源性凝集素凝集反应试验的结果。
图16显示记载在参照例2.1的公知制备法制剂品的外源性凝集素凝集反应试验的结果。
实施发明的最佳方式
实施例
以下，举出实施例、参照例、试验例，进一步详细地说明本发明的三个形式，但本发明并不局限在这些当中。
实施例1.1
将菌体成分来源于分支杆菌属BCG菌的CWS(BCG-CWS)4mg，用Potter-Elvenjem型匀浆器分散在作为油状物质的角鲨烷20μL(0.5％W/W)中；然后添加0.2％W/W聚山梨醇酯80/300mM(2.3％W/W)甘氨酸水溶液4mL，经乳化作用得到具有免疫强化作用的水包油型乳剂。
将这个水包油型乳剂分别以每0.5mL注入到4mL的玻璃小药瓶内，进行冷冻干燥，得到本发明的冷冻干燥制剂。冷冻干燥使用共和式冷冻干燥机(G-1，共和真空公司制造)进行。
实施例1.2
使用尿素代替甘氨酸作为稳定剂，其它的与实施例1.1完全相同，得到水包油型乳液以及冷冻干燥制剂。
实施例1.3
用BCG-CWS1g作为菌体成分加到角鲨烷32g和甲苯300ml的混合溶液中，用震荡或者超声波于室温进行分散。然后于氮气流下在60℃加热除去甲苯。接着，添加0.02％W/W聚山梨醇酯80/4.5％甘氨酸水溶液1.8L，用高速搅拌机进行粗乳化，再追加200mL的10％W/W聚山梨酸酯80之后，进行正式乳化，得到水包油型乳液。
将这个水包油型乳液分别以每5mL注入到玻璃小药瓶内，进行冷冻干燥，得到本发明的冷冻干燥制剂。冷冻干燥使用共和式冷冻干燥机(G-1，共和真空公司制造)进行。
参照例1.1
使用属于现有技术(特公昭63-1291号)记载的糖醇甘露醇代替甘氨酸作为稳定剂，其它的与实施例1.1同样进行，得到水包油型乳液以及它的冷冻干燥制剂。
在实施例1.1、1.2以及参照例1.1中使用的组成成分以及它的量见表1。
表1
实施例1.1 实施例1.2 参照例1.1
  菌体成分 来源于分支杆菌属BCG菌的CWS(BCG-CWS)4mg 来源于分支杆菌属BCG菌的CWS(BCG-CWS)4mg 来源于分支杆菌属BCG菌的CWS(BCG-CWS)4mg
  油状成分 角鲨烷20μL(0.5％W/W) 角鲨烷20μL(0.5％W/W) 角鲨烷20μL(0.5％W/W)
  表面活性剂及稳定剂 0.2％W/W聚山梨醇酯80/300mM(2.3％W/W)甘氨酸水溶液4mL 0.2％W/W聚山梨醇酯80/300mM(2.3％W/W)尿素水溶液4mL 0.2％W/W聚山梨醇酯80/300mM(2.3％W/W)甘露醇水溶液4mL
在实施例1.1、1.2以及参照例1.1中得到的冷冻干燥前的水包油型乳液和冷冻干燥后立即再分散得到的水包油型乳液的吸光度、平均粒径、粒径分布，通过静态光散射粒度分布测定装置(SALD3000，岛津制作所公司制造，以下同)进行测定。冷冻干燥后的立即再分散水包油型乳液，是将冷冻干燥品通过注射用蒸馏水0.5ml进行再分散形成的物质。结果见表2。
表2
           平均粒径   粒度分布变化* 吸光度(相对值)
    冷冻干燥前   刚冷冻干燥后 刚冷冻干燥后/冷冻干燥前
实施例1.1     2.7μm   2.6μm   A 0.95
实施例1.2     2.1μm   2.5μm   A 0.90
参照例1.1     2.6μm   2.8μm   B 0.15
*：粒度分布变化评价判定  A＝粒度分布变化小；B＝粒度分布有变化
对于用甘氨酸为稳定剂的实施例1.1、用尿素的实施例1.2，象显示在图1以及图2那样地比较冷冻干燥前后时，平均粒径、粒径分布几乎没有变化，能够复原成冷冻干燥前的水包油型乳液。另外，吸光度也没有见到差异，浊度的变化几乎没有。
另一方面，对于使用记载在现有技术(特公昭63-1291号)的糖醇甘露醇作为稳定剂的参照例1.1，象显示在图3那样，单峰型的粒径分布完全消失，吸光度也出现差异。
试验例1.1  生物活性试验
对于记载在实施例以及参照例上的制剂经水再分散后形成的水包油型乳液，比较通过小鼠肿瘤转移模型所显示的生物活性，可以确认经冷冻干燥处理，与本发明有关的制剂的生物活性没有降低。
经8周龄的BALB/C小鼠20只的尾静脉给予2.5×104个/只的Colon26-M3.1肿瘤细胞，分成4组，每组5只。24小时后，第1组作为什么也不给的对照组。第2组是将不含BCG-CWS、其它的与实施例1.1相同的水包油型乳液100μL，用等量的0.2％聚山梨醇酯80/300mM甘氨酸水溶液进行稀释的样品，经尾静脉给予。第3组是将记载在实施例1.1的冷冻干燥处理前的水包油型乳液100μL，用等量的0.2％聚山梨醇酯80/300mM甘氨酸水溶液进行稀释的样品，经尾静脉给予。第4组是将实施例1.1的冷冻干燥制剂用注射用蒸馏水0.5mL再分散得到的水包油型乳液100μL，用等量的0.2％聚山梨醇酯80/300mM甘氨酸水溶液进行稀释的样品，经尾静脉给予。2周后开胸，摘出肺后，统计转移到肺上的肿瘤巢数，进行比较。结果见表3。
表3
    转移抑制率(％)(与对照组1相比)
第1组(对照组)     -
第2组(不含BDG-CWS的制剂)     0
第3组(实施例1.1：冷冻干燥前的乳剂)     52*
第4组(实施例1.1：冷冻干燥制剂)     51*
*：p＜0.01，通过与第1组进行比较的t-检验。
确认在冷冻干燥前后生物活性没有降低，能够显示出本发明的冷冻干燥制剂的有用性。
试验例1.2  稳定性试验1(比较实验)
在实施例1.1得到的本发明的冷冻干燥制剂以及参照例1.1得到的冷冻干燥制剂，在50℃以及25℃下保存2星期、1个月、2个月、以及3个月后再进行分散，测定得到的水包油型乳液的相对吸光度，调查经时性地浊度变化。结果见表4、表5以及图4、图5，本发明的冷冻干燥制剂无论在哪个温度，长期保存后的吸光度均显示与冷冻干燥前同样程度的值，表示出优异的稳定性。
表4
在50℃的长期保存结果(相对吸光度)
    冷冻干燥前     冷冻干燥后     50℃×2W     50℃×1M     50℃×2M     50℃×3M
实施例1.1     1.00     0.95     0.95     0.98     1.02     0.98
参照例1.1     1.00     0.37     0.26     0.27     -**     -**
表5
在25℃的长期保存结果(相对吸光度)
    冷冻干燥前     冷冻干燥后     25℃×2W     25℃×1M     25℃×2M     25℃×3M
实施例1.1     1.00     0.95     0.96     0.93     0.95     0.98
参照例1.1     1.00     0.37     0.21     0.21     -**     -**
**：因为在检出限以下，不能测定
试验例1.3  稳定性试验2(粒径分布变化测定实验)
在实施例1.1得到的本发明的冷冻干燥制剂，在5、25以及50℃下保存，在1个月或3个月后再进行分散，调查经时性地平均粒径、粒径分布的变化。结果见表6、以及图6、7、8。
表6
  保存温度                  平均粒径(μm)
    冻干前     刚冻干后     1M     3M
  5℃     2.7     2.6     2.2     2.3
  25℃     2.7     2.6     2.2     2.4
  50℃     2.7     2.6     2.4     2.6
本发明的冷冻干燥制剂即使在5、25、以及50℃任何一个温度下，它的平均粒径、粒径分布也没有出现显著性的变化，显示出优异的稳定性。
试验例1.4  稳定性试验3(粒径分布变化测定实验)
在参照例1.1得到的冷冻干燥制剂，在25以及50℃下保存，在1个月后再进行分散，调查平均粒径以及粒径分布的变化。结果见表7、以及图9。
表7
  保存温度              平均粒径(μm)
    冻干前     刚冻干后     1M
  25℃     2.6     2.8     1.9
  50℃     2.6     2.8     1.4
使用记载在现有技术(特公昭63-1291号)的糖醇甘露醇作为稳定剂时，25℃、50℃任何一个温度下，平均粒径以及粒径分布能够见到出现了显著性的变化。
试验例1.5  抗肿瘤活性评价
豚鼠肿瘤Line10肝细胞瘤细胞于strain2系统的豚鼠的腹腔内续代。采取腹腔移植后第11日的豚鼠腹水，混悬在象达到2×107细胞/ml的细胞浓度那样地HBSS中。
在实施例1.3得到的BCG-CWS冷冻干燥制剂以及赋形剂，在玻璃小药瓶中添加5ml的注射用蒸馏水，立即激烈地搅拌约30秒，进行复水。从玻璃小药瓶中分取1ml至陶瓷管内，再加1ml的1％W/W聚山梨醇酯80，成为等渗液。这个BCG-CWS制剂或赋形剂分别与0.8ml和0.4ml的Line10肿瘤细胞进行混合，在37℃孵化10分钟。
用理发推子剃掉土拨鼠侧腹部的毛，使用26G注射针和1ml注射器，将肿瘤细胞和BCG-CWS制剂混合液150μl移植到土拨鼠腹侧皮内，1组5只。在这个150μl中含有1×106细胞的肿瘤细胞和18.5μg的BCG-CWS原药。
通过对肿瘤移植35天后的肿瘤生长抑制活性，评价BCG-CWS的抗肿瘤效果。其结果，将HBSS以及赋形剂混合到肿瘤细胞混悬液中再接种后的组，在所有个体上均能够见到肿瘤的生长，但混合了BCG-CWS制剂的组，在5只中有3只动物出现肿瘤生长抑制。
表8  BCG-CWS的Line10肝细胞瘤肿瘤生长抑制活性
    处理     生长抑制个数/1组的个数
    HBSS赋形剂BCG-CWS     0/50/53/5
经本发明提供的冷冻干燥制剂，是在长时期内稳定的制剂，通过水等的适当的分散溶剂再分散，能够复原成维持着抗肿瘤活性的水包油型乳液制剂。本发明的冷冻干燥制剂能够在抗肿瘤效果及预防感染效果等、具有免疫强化作用的菌体成分的效能的范围内应用，可以提高患者自身的免疫力。其结果，可以作为对癌、感染症等的治疗有效的治疗药或预防药来使用。
实施例2.1(分散辅助溶剂：乙醇)
以BCG-CWS4mg作为菌体成分，加入到角鲨烷20μL(0.5％W/W)和乙醇4ml的混合液中，通过震荡或者超声波在室温进行分散。然后在氮气流下于60℃加热除去乙醇。接着添加0.2％W/W聚山梨醇酯80/5％甘露醇水溶液4mL，用Potter-Elvehjem型匀浆器进行约1000rpm/5分钟的乳化之后，在60℃、30分钟加热杀菌，得到水包油型乳液。
实施例2.2(分散辅助溶剂：甲苯)
使用甲苯代替在实施例2.1中作为分散辅助溶剂来使用的乙醇，其它的与实施例2.1同样地制备，得到所期望的水包油型乳液。
参照例2.1(公知制备法：Cancer Resarch，33，2187-2195(1973)等)
将菌体成分BCG-CWS4mg和角鲨烷20μL(0.5％W/W)加到Potter-Elvehjem型匀浆器中进行分散，然后添加0.2％W/W聚山梨醇酯80/5％甘露醇水溶液4ml，用同样的匀浆器进行乳化后，在60℃、30分钟加热杀菌，得到水包油型乳液。
参照例2.2(公知制备法的改良法)
将菌体成分BCG-CWS4mg和蒸馏水2ml加到Potter-Elvehjem型匀浆器中进行分散，制备原体分散液。在这个原体制备液2ml中加入10％甘露醇水溶液2ml，进行混合，加角鲨烷20μL(0.5％W/W)，用同样的匀浆器进行分散。再添加10％聚山梨醇酯80水溶液80μL，用同样的匀浆器进行乳化后，在60℃、30分钟加热灭菌，得到水包油型乳液。
参照例2.3(无油公知制备法)
将菌体成分BCG-CWS4mg和0.2％W/W聚山梨醇酯80/5％甘露醇水溶液4ml，加到Potter-Elvehjem型匀浆器中进行分散·乳化后，在60℃、30分钟加热灭菌，得到水包油型乳液。
试验例2.1  生物活性试验
对于记载在实施例2.1～2.2以及参照例2.1～2.3中的水包油型乳液，通过小鼠肿瘤转移模型比较生物活性，可以确定由于制剂方法的不同而致的生物活性的变化。
使用8周龄的BALB/C小鼠每5只为一组。由小鼠的尾静脉给予2.5×104个/只的Colon26-M3.1肿瘤细胞，给药24小时后，将实施例以及参照例的制剂品以BCG-CWS为100μg/200μL/小鼠的比例给药。2周后开胸，摘出肺后，统计转移到肺上的肿瘤巢数，与对照组的未处置小鼠进行比较。结果见表9。
表9
注)表中，--表示凝集反应为阴性；++表示凝集反应为阳性。
试验例2.2  油对菌体成分的覆盖试验
使用在实施例2.1、2.2或者参照例2.1、2.2、2.3中得到的制剂品(BCG-CWS浓度为1mg/ml)200μl，加入刀豆素A溶液(刀豆素A的浓度为1mg/ml∶0.2mM)50μl，在25℃保持30分钟以上。用相位差显微镜观察反应液，确认有无凝集反应。其结果见表9、图10～12、15、16。
如表9、图10～12、15、16中所示，用本发明的制造方法得到的制剂品，与用已知制备法得到的制剂品具有同等的生物活性。
实施例3.1
以BCG-CWS100mg作为菌体成分，加入到角鲨烷400mg和甲苯30ml的混合液中，通过震荡或者超声波2～5分钟进行分散。然后在氮气流下于50℃加热除去甲苯。接着添加0.02％W/W聚山梨醇酯80水溶液100mL，用IKA ULTRA-TURRAX T-25型匀浆器(S25KV-25F)以65℃7000rpm进行10分钟粗乳化。然后，添加10％W/W聚山梨醇酯80水溶液600μl，用IKA ULTRA-TURRAX T-25型匀浆器以65℃15000rpm进行5分钟正式乳化。正式乳化后，再添加10％W/W聚山梨醇酯80水溶液1200μl，用IKA ULTRA-TURRAX T-25型匀浆器以7000rpm乳化10秒，得到水包油型乳液。
实施例3.2
以BCG-CWS500mg作为菌体成分，加入到角鲨烷2g和甲苯50ml的混合液中，通过震荡或者超声波2～5分钟进行分散。然后在氮气流下于50℃加热除去甲苯。接着添加0.02％W/W聚山梨醇酯80水溶液500mL，用IKA ULTRA-TURRAX T-25型匀浆器(S25KV-25F)以65℃7000rpm进行10分钟粗乳化。然后，添加10％W/W聚山梨醇酯80水溶液3ml，用IKA ULTRA-TURRAX T-25型匀浆器以65℃15000rpm进行10分钟正式乳化。正式乳化后，再添加10％W/W聚山梨醇酯80水溶液6ml，用IKA ULTRA-TURRAX T-25型匀浆器以15000rpm乳化5分钟，得到水包油型乳液。
实施例3.3
以BCG-CWS500mg作为菌体成分，加入到角鲨烷20g和甲苯300ml的混合液中，通过震荡或者超声波15分钟进行分散。然后在氮气流下于60℃加热除去甲苯。接着添加0.02％聚山梨醇酯80/10％甘氨酸水溶液900mL，用匀浆器以7000rpm进行10分钟粗乳化；再添加10％W/W聚山梨醇酯80水溶液17ml后，以12000rpm进行10分钟正式乳化。正式乳化后，再添加10％W/W聚山梨醇酯80水溶液83ml，用匀浆器以3000rpm混合5分钟，得到水包油型乳液。
参照例3.1(一步乳化法，无分散溶剂)
将菌体成分BCG-CWS4mg和角鲨烷20μl加至Potter-Elvehjem型匀浆器中进行分散，然后添加0.2％W/W聚山梨醇酯80水溶液4ml，用同样的匀浆器进行乳化，得到水包油型乳液。
参照例3.2(一步乳化法，分散溶剂：甲苯)
以BCG-CWS100mg作为菌体成分，加入到含有角鲨烷400mg的甲苯30ml中，通过超声波进行分散。经氮气流除去甲苯后，添加0.2％W/W聚山梨醇酯80水溶液100mL，经乳化机(使用IKA T-25/S25KV25F轴)于15000rpm、70℃下进行乳化5分钟，得到水包油型乳液。
试验例3.1(BCG-CWS原药在制剂品中的掺入率)
将实施例3.1、参照例3.1、3.2的制剂品200μl放入试验管中，添加5％苯酚水溶液200μl，搅拌。再加入浓硫酸1ml，搅拌后，于室温放置30分钟以上，在490nm处测定吸光度。从得到的吸光度，根据预先制成的标准曲线计算出BCG-CWS原药的量。(生化学实验讲座4糖质的化学下P.370，Methods in Enzymology，8，93)其结果见下面的表10。
表10
    制剂制造方法     制剂中的原药量(对标示值％)
    参照例3.1     49
    参照例3.2     16
    实施例3.1     113
    实施例3.2     119
象在这个表中所示的那样，用本发明的制造法得到的制剂品的原药掺入率可以认为几乎是定量的。如此可知，通过本发明的制造方法，可以抑制制造过程中的不溶性物质的产生，减少原药的损失。
试验例3.2  BCG-CWS原药在制剂品中的掺入率
用记载在试验例3.1中的方法测定了实施例3.3的制剂品中的BCG-CWS原药的掺入率。其结果，制剂中的原药量(对标示值％)为109％。
试验例3.3  生物活性试验
对于记载在实施例3.1～3.2以及参照例3.1～3.2中的制剂经水再溶解后的水包油型乳液，通过小鼠肿瘤转移模型比较生物活性，可以确定由于制剂方法的不同而致的生物活性的变化。
使用8周龄的BALB/C小鼠每5只为一组。由小鼠的尾静脉给予2.5×104个/只的Colon26-M3.1肿瘤细胞，24小时后，将实施例以及参照例的制剂品以BCG-CWS为100μg/200μL/小鼠给药。2周后开胸，摘出肺后，统计转移到肺上的肿瘤巢数，进行比较时，本发明的制剂品任何一个都显示生物活性。
本发明的制造方法，是一种可以维持含有的菌体成分的有效的免疫强化作用，并且可用于大规模生产的制造方法。近年来正在重新评价并发展着的免疫强化治疗法，特别是使用BCG-CWS的单独治疗法具有着特别优异的效果；通过本发明的制造方法，有可能首次提供作为医药品维持着有效的免疫强化作用的制剂品。

Claims (24)

1.一种水包油型乳剂，其使用凝集素的凝聚反应显示阴性，并且选自卡介苗细胞壁骨架或者红色诺卡氏菌-细胞壁骨架的细菌的细胞壁骨架被油状物质覆盖，其中，细菌的细胞壁骨架的浓度在水包油型乳剂中是0.1～10mg/ml，油状物质的浓度在水包油型乳剂中是0.01～30％W/W，
乳剂通过以下的步骤制造：
(a)搅拌选自卡介苗细胞壁骨架或者红色诺卡氏菌-细胞壁骨架的细菌的细胞壁骨架、油状物质、以及分散辅助溶剂的混合液，在该混合液中分散细菌的菌体成分，所述分散辅助溶剂是在氮气流下可以简单地除去的有机溶剂；
(b)通过馏去分散辅助溶剂，形成细菌的细胞壁骨架被均一地分散的油状物质，或将细菌的细胞壁骨架用油状物质覆盖的粒径为100μm以下的油滴；然后
(c)加入含有表面活性剂的水溶液使其乳化，其中，表面活性剂的浓度在得到的水包油型乳剂中是0.01～10％W/W。
2、权利要求1记载的水包油型乳剂，其中，步骤(c)中使用的水溶液还含有氨基酸或尿素作为稳定剂，稳定剂的浓度在得到的水包油型乳剂中是0.1～20％W/W。
3、权利要求1记载的水包油型乳剂，其中，步骤(a)中使用的分散辅助溶剂包括芳香族烃、脂肪族烃、卤代烃、低级醇、醋酸酯、醚类或酮溶剂。
4.权利要求3记载的水包油型乳剂，其中分散辅助溶剂是乙醇或甲苯。
5.权利要求1-4中任意一项记载的水包油型乳剂，其中细菌的细胞壁骨架是卡介苗细胞壁骨架，油状物质是角鲨烷。
6.权利要求1记载的水包油型乳剂的制造方法，其包括下述步骤：
(a)搅拌选自卡介苗细胞壁骨架或红色诺卡氏菌-细胞壁骨架的细菌的细胞壁骨架、油状物质、以及分散辅助溶剂的混合液，在该混合液中分散细菌的细胞壁骨架；
(b)通过馏去分散辅助溶剂，形成细菌的细胞壁骨架均一分散的油状物质，或细菌的细胞壁骨架用油状物质覆盖的油滴；然后
(c)加入含有表面活性剂的水溶液使其乳化。
7.权利要求6记载的水包油型乳剂的制造方法，其中细菌的细胞壁骨架是卡介苗细胞壁骨架，油状物质是角鲨烷。
8.权利要求6记载的水包油型乳剂的制造方法，其中分散辅助溶剂是乙醇或甲苯。
9.权利要求7记载的水包油型乳剂的制造方法，其中分散辅助溶剂是乙醇或甲苯。
10.权利要求6记载的水包油型乳剂的制造方法，其中油滴被分散成100μm以下的粒径。
11.权利要求7记载的水包油型乳剂的制造方法，其中油滴被分散成100μm以下的粒径。
12.权利要求8记载的水包油型乳剂的制造方法，其中油滴被分散成100μm以下的粒径。
13.权利要求9记载的水包油型乳剂的制造方法，其中油滴被分散成100μm以下的粒径。
14.权利要求1记载的水包油型乳剂的制造方法，其包含以下步骤：
(a)搅拌细菌的细胞壁骨架、油状物质、以及分散辅助溶剂的混合液，在该混合液中分散细菌的细胞壁骨架；
(b)馏去分散辅助溶剂后；
(c)加入含有表面活性剂的水溶液，按下述的2个阶段进行乳化：
i)加入含有含量为油状物质的10％以下的低浓度表面活性剂的水溶液，缓慢地搅拌进行粗乳化；
ii)为了得到期望的粒度分布，适当地调整粗乳化溶液的表面活性剂浓度至油状物质的10～20％，强烈地搅拌进行正式乳化。
15.权利要求14记载的水包油型乳剂的制造方法，其中表面活性剂是聚山梨醇酯80。
16.权利要求14-15任意一项记载的水包油型乳剂的制造方法，其中细菌的细胞壁骨架是卡介苗细胞壁骨架，油状物质是角鲨烷。
17.将权利要求2记载的水包油型乳剂进行冷冻干燥处理得到的稳定化冷冻干燥制剂，其中，冷冻干燥前后的水溶液中的油滴的粒径分布的变化不大，并且该水溶液浊度的变化是冷冻干燥前浊度的50％以下。
18.权利要求17记载的稳定化冷冻干燥制剂，其中细菌的细胞壁骨架是卡介苗细胞壁骨架，油状物质是角鲨烷。
19.权利要求17或18记载的稳定化冷冻干燥制剂，其中氨基酸是甘氨酸。
20.权利要求17记载的稳定化冷冻干燥制剂的制造方法，包括将含有细菌的细胞壁骨架、油状物质、表面活性剂以及作为稳定剂的氨基酸或尿素的水包油型乳剂冷冻干燥处理步骤，其中所述乳剂的特征在于：
(a)在油滴中含有细菌的菌体成分；
(b)油滴以单峰型的粒径分布分散在水溶液中；
(c)冷冻干燥前后的水溶液中的油滴的粒径分布以及浊度的变化不大。
21.权利要求20记载的稳定化冷冻干燥制剂的制造方法，其中将制剂制成水溶液，该水溶液浊度的变化是冷冻干燥前浊度的50％以下。
22.权利要求20-21任意一项记载的稳定化冷冻干燥制剂的制造方法，其中氨基酸是甘氨酸。
23.一种油滴，其通过使用分散辅助溶剂可以得到，其中从卡介苗细胞壁骨架或者红色诺卡氏菌-细胞壁骨架中选择的细菌的细胞壁骨架被均一地分散，所述油滴具有100μm以下的粒径，所述分散辅助溶剂是在氮气流下可以简单地除去的有机溶剂。
24.一种组合物，由油状物质和均一地分散在该油状物质中的细菌的细胞壁骨架组成，其通过使用分散辅助溶剂可以得到，其中，所述分散辅助溶剂是在氮气流下可以简单地除去的有机溶剂，所述细菌的细胞壁骨架选自卡介苗细胞壁骨架或者红色诺卡氏菌-细胞壁骨架。
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