CN1229135A

CN1229135A - 利用家蚕生物反应器生产植酸酶的方法

Info

Publication number: CN1229135A
Application number: CN 99103564
Authority: CN
Inventors: 何家禄; 姚斌
Original assignee: Sericultural Research Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Sericultural Research Institute Chinese Academy Of Agricultural Sciences; Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 1999-04-02
Filing date: 1999-04-02
Publication date: 1999-09-22
Anticipated expiration: 2019-04-02
Also published as: CN1089368C

Abstract

本发明提供了一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达、生产植酸酶的方法,包括:将植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组;用重组病毒载体感染昆虫宿主;培养被感染的昆虫宿主使其进行植酸酶表达;收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液。通过这种方法可以大量、廉价地生产植酸酶,用做饲料添加剂。

Description

利用家蚕生物反应器生产植酸酶的方法

植物中50-70％磷以植酸磷(肌醇六磷酸)的形式存在(Lolas M.Et al.Food Sci.42：1094-1097，1977；Nelson T.S.Poultry Sci.47：862-871，1967).，不能直接被单胃动物和人所利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the FeedIndustry，Lyons T.P.ed.Alltech Technical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，造成磷源浪费、饲料成本增加，同时，植酸磷不能被动物利用而直接排出体外，还会造成土壤及水域的磷污染。另外，植酸还能与动物所必须的微量元素及蛋白质螯合，使这些营养元素不能有效利用，导致了植物性饲料(或食品)营养价值的降低(Sharma C.B.et al.，Phytochemistry.17：201-204，1978)。广泛存在于微生物中的植酸酶(Phytase，肌醇六磷酸酶)将植酸水解为肌醇和磷酸。植酸酶喂饲效果已有确证，可使饲料中磷的利用率提高60％，粪便磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此饲料中加入植酸酶，可减少无机磷酸盐加入量，对提高畜牧业生产效益和降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

虽然植酸酶具有良好的饲喂效果(Ware J.H.et al.，US Patent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 101：1289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.47：1842-1848，1968)，但到目前为止它还没有在饲料工业上得到广泛应用，其根本原因在于，在天然微生物中植酸酶的表达量太低，从而难以大量获得廉价的植酸酶产品，不能满足饲料工业发展的要求(Han Y.W.，Animal Feed Sci.Technol.，24：345-350，1989).随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因，可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的(Conneely O.M.，Biotechnology in the Feed Industry，T.P.Lyons(Ed)，AlltechTechnical Publications.Nicholasville，K Y.57-66，1992)。

几种微生物来源的植酸酶基因已得到了分离，如酵母Saccaromycescerevisiae(Bajwa W.，Nucleic Acids Res.12：7721-7739，1984)、Aspergillusniger(MacRae W.D.，Gene，71：339-348，1988；姚斌，农业生物技术学报，Vol.6，No.1，1-6，1998)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(van Loon，Patent NO.EP 06843 13A2，1995)、A.niger(ficuum)(van Hartimgsveldt et al.，Gene，127：87-94，1993；Ehrlich K.C.，Biocem.Biophys.Res.Comm.195：53-57，1993)、A.niger var.awamori(Piddington C.S.Gene，133：55-62，1993)等。

植酸酶基因表达的研究主要集中在来源于A.niger(ficuum)的植酸酶基因phyA和phyB上。如1993年在A.niger ALK02268中表达了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表达量比原菌株提高了几倍，约为329U/mL(Piddington C.S.，Gene，127：87-94，1993)。同年，将来源于Aficumm NRRL3135的phy基因导回原菌株，使phyA基因的拷贝数增加到15个以上，从而使植酸酶的表达量提高到7600U/mL(Van Hartingsveldt W.et al.，Gene，127：87-94，1993：Van Gorcom R.F.M.et al，Pantent No.US 5436156，1995)。Moore E.等在A.oryzae中表达来源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和来源于A.niger 762的phyB基因，其结果也是使表达量分别提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.et al.，J.Ind.Microbiol，14：396-402，1995)。另外，也曾有人尝试了在Trichoderma中表达植酸酶基因phyA和phyB(Nevalainen H.K.M.et al.，Pantent No.Wo 94/03612，1994)并尝试了用基因工程的方法改造植酸酶基因使其具有更好的耐温性并在黑曲霉中表达(Van Loon A.PatentNo.EP 0684313A2，1995)。以上的这些表达研究，从总体上看，其表达水平还较低，但却证实了利用基因工程手段来提高植酸酶的表达、生产量这一途径的有效性。

本发明的目的是提供一种利用杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统高效表达、生产植酸酶的方法以期达到植酸酶的大量、廉价生产，在饲料及食品中广泛应用。

本发明涉及一种利用重组杆状病毒(Baculovirus)在昆虫体内表达、生产植酸酶的方法，包括：将植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行植酸酶表达。

杆状病毒包括BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyxmandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraeayamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothisvirescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等。

杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的干扰素以来(Smith，Mol.Cell Biol.，3：2156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22：355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21：223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23：104-108，1997)等多种。利用此系统来生产植酸酶的优点在于：1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达毫克级/虫的水平，因而可大大降低植酸酶的生产成本并使植酸酶大规模生产成为可能；2.这一表述系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的植酸酶具有正常的生物学活性提供了保证。3.用此系统生产的植酸酶无需纯化，只需将表达植酸酶的幼虫初步加工后直接做为饲料添加剂，大大降低了生产成本。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。

采用杆状病毒表达系统，应用昆虫幼虫及蛹作为生物反应器大规模生产高效的植酸酶，在单胃动物的饲料或食品中应用，这一发明为国内外首次。本发明中优化的杆状病毒表达系统为家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统，通过基因重组，将植酸酶基因重组进家蚕杆状病毒BmNPV，获得重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)，使携带植酸酶基因的rBmNPV(phyA2)在不同发育阶段的家蚕(幼虫、蛹等)中繁殖，应用家蚕作为宿主的生物反应器生产植酸酶。同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等也可按同样的方法表达生产植酸酶。

用基因重组技术，将来源于各种微生物(如黑曲霉、烟曲霉、酵母等真菌，大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌等细菌)、植物(玉米、大豆、水稻等)的植酸酶基因构建到各种杆状病毒运载载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上，使植酸酶基因在多角体启动子、p10启动子或别的病毒和真核生物的强启动子的控制之下，通过体内或体外(in vivo/vitro)重组，将植酸酶基因整合到杆状病毒的基因组上，得到重组病毒。重组病毒可通过经口食下或采用各种手段透过表皮感染1-5龄(最优时间为四或五龄)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1-2天的早期嫩蛹)，表达生产植酸酶。本发明中最优化的方案是将来源于黑曲酶(Aspergillus niger 963，CGMCC0332)植酸酶基因phyA2(中国专利，公开号：CN1184156A)插入到运载载体BacPAK6上，再通过体内重组将植酸酶基因转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-BacPAK6的基因组上，替代基因组上的lacZ基因，通过蓝白空斑筛选技术，获得携带phyA2的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，可大量繁殖rBmNPV(phyA2)。当rBmNPV(phyA2)在蚕体内复制时，phyA2在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下表达，产生植酸酶PHYA2。在感染3-6天(最佳为5天)后收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液(或整体匀浆)，杀灭感染性病原后，将其与载体(如麸皮、粕、石粉等)拌和，烘干、粉碎后便得到植酸酶制剂，可做为饲料添加剂添加到单胃动物饲料中。在酸性胃液中，植酸酶水解植酸，将植酸磷降解为肌醇和磷酸。本发明生产的植酸酶经过分离、纯化后，还可添加到食品中，促进食品中营养成分的吸收，提高食品的营养价值。

从黑曲酶中克隆出的植酸酶基因phyA2，曾在酵母系统中实现了高表达(姚斌等，中国专利，公开号：CN1184156A)。我们进一步将该基因重组进家蚕杆状病毒，获得重组病毒rBmNPV(phyA2)，rBmNPV(phhyA2)感染家蚕幼虫和蛹体后，植酸酶基因得到高表达，每毫升体液可产生1毫克以上的植酸酶。一条蚕(或蛹)产物的酶活力约为50万单位(U)。

本项发明中植酸酶的生产成本与利用酵母系统生产植酸酶(姚斌等，中国专利，公开号：CN1184156A)相当。缫丝厂的下脚蚕蛹一直是饲料的蛋白源，因此加入用本研究生产的植酸酶，同时也给饲料加入了蛋白，增加了饲料营养价值，且无需投资建厂，无三废，电力和水资源等能源消耗极少。除可用于工业化生产的配合饲料外，还可直接为农民使用于各种单胃畜禽动物(如猪、鸡等)饲料中，因此符合我国国情，极有应用推广价值。由于家蚕已经我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以此种植酸酶经部分纯化后，可作为食品添加剂，提高食品的营养价值。总体而言，本项发明可以大幅度降低植酸酶的生产成本，能产生良好的经济、生态和社会效益。附图说明：图1.重组运载载体pBacPAK8 phyA2的构建程序图2.重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)的Southern blotting分析

1.未经酶切的rBmNPV(phyA2)；2.家蚕杆状病毒亲本株Bm-BacPAK6(gal⁺)；3.经SmaI酶切的rBmNPV(phyA2)；4.经EcoRI酶切的rBmNPV(phyA2)；5.经BamHI酶切的rBmNPV(phyA2)；图3.在家蚕幼虫和蚕蛹中表达的植酸酶的蛋白凝胶电泳

1.表达标准分子量；2.家蚕重组病毒感染蚕蛹；3.家蚕重组病毒感染家蚕幼虫；4.家蚕杆状病毒亲本株感染家蚕幼虫；5.未经感染的家蚕幼虫；图4.家蚕重组杆状病毒感染家蚕幼虫后植酸酶的积累与感染后时间的关系图5.家蚕重组杆状病毒感染家蚕幼虫后表达的植酸酶的温度特性图6.家蚕重组杆状病毒感染家蚕幼虫后表达的植酸酶的PH值特性图7.家蚕重组杆状病毒感染家蚕幼虫后表达的植酸酶的动力学特性

三.实验：

1.菌株、病毒株与载体大肠杆菌菌株E.coli TG1和DH_5a购自Promega公司；携带植酸酶基因的大肠杆菌载体pYY-01(中国专利，公开号：CN1184156A)由中国农业科学院饲料所保存、运转质粒pBacPAK8购自Clontech公司，家蚕细胞株BmN、家蚕核多角体病毒亲本株Bm-BacPAK6(gal⁺)由美国加州大学Susumu Maeda博士惠赠。家蚕品种为JY1，由中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室保存。

2.酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶为Boehringer公司产品。

3.生化试剂 IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖(LMP)、Nick Translation试剂盒、T₄ DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、家蚕细胞培养基TC-100、胎牛血清及其它试剂购于GIBCOBRL公司；

4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。家蚕细胞株BmN培养液为TC-100。

实验一

携带植酸酶基因的载体pYY-01的DNA的制备

将含有pYY-01质粒的大肠杆菌划线接种于含100g/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基上，37℃培养16小时，挑取单个菌落转接于3ml含100g/ml Amp的LB培养基中，37℃振荡培养16小时(200转/分钟)，吸取1ml已活化的大肠杆菌加到100ml含100ug/mlAmp的LB培养基中，37℃继续振荡培养16小时(200转/分钟)，冰浴15分钟，离心(5000rpm×5min)收集菌体，菌体悬浮于3ml溶液I[50mM葡萄糖、10mM EDTA、25mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mg溶菌酶]中，冰上放置20分钟，加入6ml溶液II(0.2N NaOH、0.1％SDS)，缓慢倒转数次使混匀，冰上放置10分钟，再加入4.5ml溶液III[3M NaAc(pH4.8)]，小心混匀，冰上放置30分钟，离心(12000rpm×20min)，收集上清液转入另一管中，加入2.5倍体积的95％乙醇，-20℃放置2小时后，离心(12000rpm×15min)，收集沉淀质粒DNA，冷冻干燥后沉淀用1ml TE[10mMTris-HCl，1mM EDTA(pH 8.0)]溶解，加入10l RNA酶(10mg/ml)，37℃放置15～30分钟，上Sepharose 2B柱纯化质粒DNA，收集第一峰，用酚、氯仿各抽提一次，取上清液，加入1/10体积的3M NaAc(pH 6.5)，并加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，离心(12000rpm×15min)沉淀质粒DNA，用75％乙醇洗沉淀一次，真空干燥，DNA溶于200l TE中，-20℃保存备用。

实验二

运载质粒pBacPAK8 DNA的制备

含有运载质粒pBacPAK8的大肠杆菌在LB培养基中培养过夜后提取质粒DNA，方法同实验一。

实验三

家蚕核多角体病毒亲本株的繁殖扩增及病毒DNA的制备

按TC-100产品说明配制1×TC-100，用2N NaOH调至pH6.22，过滤除菌后的培养液补加10％胎牛血清，以此为培养液，27±1℃培养家蚕细胞BmN。在T-100培养液中培养约50ml的家蚕细胞(细胞个数约为10⁷-10⁸)，用家蚕核多角体病毒亲本株Bm-BacPAK6感染对数生长期的细胞，感染复数为1，27±1℃培养，3-4天后收集病毒感染液，离心(3000rpm×20min)，除去沉淀，上清液离心(25000rpm×60min)，除去上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g、KCl 14.1g，pH 7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml的离心管中，加入Proteinase K至终浓度为50g/ml，50℃保温2小时，再加35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续50℃保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，添加1/10体积的3M NaAc，加2倍体积无水乙醇，-20℃放2小时，5000rpm离心10min，沉淀病毒DNA，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥，溶解在50l TE中，放置4℃保存备用。

实验四

病毒亲本株Bm-BacPAK6的DNA的线性化

取20l病毒DNA(约为1～2g)，2l限制性内切酶Cvn I，3 110×酶切缓冲液，用无菌水补至体积30l，37℃保温3-4小时，电泳检查表明酶切作用完全后，将酶切反应混合物放置65℃×10min，使酶完全失活，然后于4℃保存备用。

实验五

重组运载载体pBacPAK8phyA2的构建(图1)1.植酸酶基因phyA2的DNA片段的制备

取备用的质粒pYY-01 DNA 30-50g，10×内切酶EcoRI的缓冲液10l，100unit的EcoRI，无菌双蒸馏水补至总体积100l，37℃反应2小时，加样至1％的低融点琼脂糖凝胶上，在4℃条件下50V电泳60分钟，在紫外灯下切取含phyA2 DNA片段的凝胶，加1/10体积的3M NaCl，68℃加热10分钟溶解凝胶，37℃下苯酚抽提，离心(12000rpm×5min)，上清液再用苯酚、氯仿∶异戊醇(24∶1)依次抽提一次，加1/10体积的3M NaAc(pH6.5)，再加2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，离心(12000rpm×15min)，沉淀用75％乙醇洗一次，真空干燥，加25l TE溶解，-20℃保存备用。2.运载质粒pBacPAK8的酶切

取运载质粒DNA 2g，10×内切酶EcoR I的缓冲液2l，4U的EcoR I，无菌双蒸馏水补至总体积20l，37℃反应1小时，取5l加样至1％的琼脂糖凝胶上，电压100V电泳20分钟，紫外灯下检查酶切反应结果，酶切完全后，65℃水浴10分钟将酶失活，保存备用。3.phyA2基因与运载质粒pBacPAK8的连接

取步骤1中制备的phyA2基因片段6l，步骤2中制备的运载质粒pBacPAK8 DNA 1l，5×T₄ DNA连接缓冲液2l，T₄连接酶1l，无菌双蒸馏水补至总体积10l，12～14℃连接反应过夜。4.大肠杆菌感受态细胞的制备

用灭菌的牙签挑选大肠杆菌TG1单菌落，接种于3ml的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取100l过夜培养物接种到3ml LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5小时，使O.D值在0.6左右，离心(5000rpm×5min)收集菌体，将菌体悬浮于预冷的800l 100mM CaCl₂中，然后冰浴30分钟，离心(5000rpm×5min)弃上清液，再加入200l 100mM CaCl₂，轻轻击打管壁，使沉淀悬浮并混合均匀，冰上放4～24小时用于转化。5.大肠杆菌的遗传转化

取步骤三中制备的连接混合物5l，加到200l感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，37℃热击5分钟，迅速置于冰上1～2分钟，加入已温育至37℃的LB培养基500l，37℃培养1小时，取100-150l涂布于含50g/mlAmp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。6.携带重组运载质粒的阳性克隆子的鉴定

从转化的LB平板上挑取单个菌落，按实施例二中的方法制备质粒DNA，应用Bam HI和EcoR I双酶切下插入的phyA2基因，电泳后出现约1.3Kb的DNA条带的质粒为重组运载质粒，携带重组运载质粒的克隆子为阳性克隆子。制备的重组运载载体pBacPAK8 phyA2的DNA于-20℃保存备用。

实验六

重组家蚕杆状病毒的构建1.重组杆状病毒rBmNPV(phyA2)的构建

1g线性化的家蚕杆状病毒亲本株Bm-BacPAK6 DNA和2g的重组运载质粒pBacPAK8phyA2 DNA混合，再加入30l的Lipofectin，用无菌双蒸馏水补足到60l，轻轻混合均匀，静置15分钟，加到含有1×10⁶的BmN细胞的25cm²玻瓶中进行共转染，然后除去瓶中含有胎牛血清的1×TC-100培养液，用不含胎牛血清1×TC-100培养液洗3次，后加入3ml不含胎牛血清的1×TC-100培养液，将此混合物逐滴加入另一个培养瓶中，27℃培养4小时后补加3ml无胎牛血清的1×TC-100培养液和600l的胎牛血清，27℃培养4～5天，收集上清液用于重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)的筛选纯化；2.重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)筛选和纯化

家蚕核多角体病毒亲本株上携带LacZ基因，在侵染昆虫细胞后此基因的表达产物能将底物X-gal分解而使被侵染的细胞所形成的空斑呈兰色，外源基因整合到病毒基因组后将取代此基因，从而使空斑呈白色。利用这一标记可筛选到重组病毒。接种适量细胞(以可铺平平皿底部面积80％为宜)于60或35mm平皿中，待细胞贴壁后，吸去培养液，将上一步骤中得到的转染上清液按10^-3、10^-4、10^-5的不同稀释度进行稀释，吸取1ml加入到贴壁细胞中，使其分布均匀，27℃感染1小时，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶溶化，冷到40℃左右，然后与40℃预热的2×TC-100(含20％的胎牛血清)混合均匀，再添加X-gal使其终浓度达到150g，将此混合物滴加到平皿中(60mm平皿约加4ml，35mm平皿约加1ml)，待凝固后，27℃倒置培养4～7天，显微镜观察，将具有白色特征的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2-3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)。3.重组病毒rBmNPV(phyA2)在家蚕细胞中的扩增

将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)感染正常生长的BmN细胞，培养4天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV(phyA2)。

实验七

在分子水平上验证植酸酶基因在重组病毒基因组中的整合

取5μg重组病毒基因组DNA，分别用EcoRI、BamHI、SmaI全酶解，酶解产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中的DNA转移到尼龙膜上进行Southren blotting分析。杂交所用探针为用BamHI从重组质粒pYY-1上切下的长约1.0Kb的植酸酶基因片断。探针酶切后电泳回收，用随机引物标记Kit标记探针。结果(图2)表明，重组病毒DNA用EcoRI、BamHI、SmaI酶解后分别出现1、2、1条特异性杂交带，这证明植酸酶基因已正确整合到病毒基因组中。

实验八

应用家蚕作为宿主生产植酸酶

桑叶饲养家蚕到五龄，将蚕体表面用75％的乙醇消毒，用微量注射器分别吸取重组病毒，按每头注射10⁶pfu病毒量(约5l上清液)在腹节倒数第2和第3节间膜处穿刺接种重组病毒，24-25℃按常规桑叶饲养家蚕，并隔天添食氯霉素，饲养4-5天后，从蚕体中制备植酸酶。取化蛹后1-2天的嫩蛹，75％乙醇表皮消毒，用微量注射器分别吸取重组病毒，按每头注射10⁶pfu病毒量(约5l上清液)在腹节间膜处穿刺接种重组病毒，为防止细菌感染，在重组病毒液中加入10-20U/蛹的庆大霉素，24-25℃培养4-5天，从中制备表达的植酸酶。

植酸酶制备的具体方法如下：收集幼虫和蛹的体液，或直接将蚕幼虫体和蛹体匀浆，然后经离心(10000rpm×10min)，去除沉淀和脂肪层，上清液中即含有表达的植酸酶。上清液与载体麸皮按1∶1(V/W)混合后，50℃通风干燥，制成植酸酶制剂。

蚕幼虫体和蛹体感染重组病毒4-5天后，植酸酶表达量达最大值，这时幼虫和蛹中的表达量分别高达1.427mg/ml血淋巴和1.902mg/ml血淋巴。表达的植酸酶可通过蛋白凝胶电泳来证实，电泳结果(图3)显示，用重组家蚕杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹后，在65KD处出现一条特异性的植酸酶条带，这证明植酸酶基因已得到了高效表达。

实验九

应用家蚕作为宿主生产的植酸酶的酶活性测定和酶的生理生化性质分析

对感染后的幼虫和蛹血淋巴中的植酸酶进行活性测定，测定方法为：0.2mL的酶稀释液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸钠，37℃保温30min，加入1mL 10％TCA终止酶活反应，然后加入2mL硫酸亚铁-钼酸铵显色液，700nm测定无机磷含量。对照为先在0.2mL的酶稀释液中加入1mTCA使酶灭活，再加入同体积的底物保温。一个酶活性单位(U)定义为：在一定条件下，每分钟释放出1μmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。结果表明，植酸酶的表达量在重组病毒感染后48小时开始表达，到120小时时达到高峰(图4)，这时植酸酶的表达量在幼虫和蛹中分别达到4.667×10⁵U/ml血淋巴和5.985×10⁵U/ml血淋巴。这一表达量较原始的植酸酶基因来源菌株Aspergillus niger963高3000倍。

取含植酸酶的血淋巴液进行适当稀释后，在不同pH值条件下(pH3.5以下用HCl-Gly缓冲液；pH3.5-5.5用HAc-NaAc缓冲液；pH5.5以上用Tris-HCl缓冲液)37℃测定酶活性，发现它的最适pH值为2.5和5.7(图5)，这与原始的来源于A.niger的植酸酶(中国专利，公开号：CN1184156A)相比，第一最适pH5.7没有变化，但第二最适pH由原来的1.8移到2.5，这可能与植酸酶在不同的表达体系中形成的蛋白高级结构有所不同导致的。在pH5.7、不同的温度下对表达的植酸酶的活性进行测定的结果(图6)表明，它的最适温度为55℃，这与原始的植酸酶相同。在37℃、pH5.7及不同的植酸钠底物浓度的条件下测定表达的植酸酶的酶动力学性质，结果(图7)表明，表达的植酸酶的Km值为0.7695nM。

Claims

1.一种利用重组杆状病毒在昆虫体内表达、生产植酸酶的方法，包括：将植酸酶基因与杆状病毒载体进行重组；用重组病毒载体感染昆虫宿主；培养被感染的昆虫宿主使其进行植酸酶表达；收集含植酸酶的昆虫体。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杆状病毒是BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、或TnNPV。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆虫宿主是家蚕、野蚕、蓖麻蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、斜纹夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉铃虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫、或舞毒蛾。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的昆虫是家蚕，所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杆状病毒运载载体是AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIV VI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，或pUAC-5。

6.按照权利要求1所述的方法法，其特征在于，所述的重组病毒是通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体的。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的蛹体为1-2天的早期嫩蛹。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植酸酶是来源于黑曲酶的植酸酶基因phyA2；所述的运载载体是BacPAK6；所述的重组是指将植酸酶基因转移到家蚕杆状病毒亲本株Bm-BacPAK6的基因组上，替代基因组上的lacZ基因，然后通过蓝白空斑筛选技术，获得携带phyA2的重组家蚕杆状病毒rBmNPV(phyA2)；所述的感染是将得到的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞系或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹；在感染3-6天后收集含植酸酶的家蚕幼虫或蛹的体液。

9.一种被含有植酸酶基因的重组杆状病毒载体感染并表达植酸酶的昆虫。

10.按照权利要求9所述的昆虫，其特征在于，所述的昆虫是家蚕。

11.一种饲料添加剂，其特征在于，它含有权利要求9或10所述的昆虫体。