CN1214633A - 稳定化的生长激素制剂和其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种制备稳定的生长激素液体制剂的方法,其中该制剂包含生长激素、缓冲液和稳定化有效量的至少一种选自下面的稳定剂:(i)聚乙二醇－聚丙二醇非离子表面活性剂,(ii)牛磺胆酸或其盐或衍生物,和(iii)甲基纤维素衍生物,其中该方法包括在生长激素不暴露于大于2×制剂中的缓冲液或稳定剂最终浓度的缓冲液或稳定剂浓度的条件下,将生长激素与缓冲液和稳定剂混合。
Description
发明领域
本发明涉及稳定化的生长激素(GH)制剂，尤其是通过掺入稳定化赋形剂而被稳定化的人生长激素(hGH)液体制剂。这些hGH的液体制剂具有改善的化学及物理稳定性。本发明尤其涉及制备这些稳定的GH制剂的方法。
发明的背景技术
人和动物的生长激素为在垂体前叶中发现的包含约191个氨基酸的蛋白质。GH主要的生物学作用是在幼年人和动物中促进体征形成，在成年生物中维持组织。受GH影响的器官包括骨骼、肌肉、结缔组织和内脏。生长激素通过与靶细胞膜上的特异性受体相互作用而起作用。
人生长激素(hGH)是一种参与调节正常人体生长的关键激素，并且还影响各种生理和代谢功能，其中包括线性骨生长，泌乳和细胞能量使用。幼儿hGH的缺乏导致身材矮小，并且这种疾病已通过外源施用hGH而得到治疗。
过去，努力集中在确定各个种类的生长激素的分子功能上。来自医学和兽医领域的商业兴趣已很强烈，并已克隆了hGH基因。目前正在哺乳动物和细菌细胞培养物系统中以生物合成来制备hGH和其衍生物甲硫氨酰-hGH(met-hGH)。
为了在商业上供应hGH的治疗用药物制剂，必须制备稳定的制剂。这些制剂必须能在适宜的贮藏期间保持活性；它们必须易于配制，并可被病人乐于接受施用。
业以各种方式配制了人GH。例如，美国专利号5,096,885公开了除开hGH，还包含甘氨酸、甘露糖醇、缓冲液和任选的一种非离子表面活性剂的稳定的药物学可接受的hGH制剂，其中hGH：甘氨酸的摩尔比为1∶50-200。国际专利公开号WO93/19776公开了可注射用的GH制剂，其包含柠檬酸盐作为缓冲物质，和任选的生长因子如胰岛素样生长因子或表皮生长因子，氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，甘露糖醇或其它糖醇，甘油和/或防腐剂如苯甲醇。国际专利公开号WO94/01398公开了包含hGH，缓冲液，非离子表面活性剂和任选的甘露糖醇、中性盐和/或防腐剂的GH制剂。
在欧洲专利公开号0131864(和相应的澳大利亚专利号579016)中，公开了一种分子量大于8500道尔顿的蛋白的水溶液，其中通过加入作为稳定剂的包含线性聚氧化烯链的表面活性物质而使这些蛋白被保护，在界面不被吸附从而防止变性及蛋白沉淀。
欧洲专利公开号0211601公开了一种促进生长的制剂，其包含生长促进激素和含聚氧乙烯-聚氧丙烯单元、平均分子量为约1,100-约40,000的嵌段共聚物的含水混合物，其中该制剂保留了生长促进激素的流动性及其在施用时的生物活性。随后的欧洲专利公开号0303746公开了在含水环境中生长促进激素的各种其它稳定剂，包括一些多元醇、氨基酸、在生理pH下具有带电侧基的氨基酸聚合物及胆碱盐。
hGH的药物制剂一般不稳定，尤其是在溶液中。物理不稳定性可能导致产生化学降解物，如脱去酰氨基或次硫酸盐形式的hGH，二聚体或高分子量聚集物(Becker等(1988)生物技术与应用生物化学10,326；Pearlman和Nguygen(1989)，在D.Marshak和D.Liu(编)，治疗用肽和蛋白质、制剂、递送和靶定，现代分子生物学通迅，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，pp23-30；Becker等(1987)生物技术与应用生物化学9,478)。
由于hGH在溶液中不稳定，hGH的药物制剂趋于以在使用前必须再配制的冷冻干燥形式存在。冷冻干燥通常被用在一些其中在溶液中的稳定性不够的贮藏条件下以维持多肽的生物活性和生物化学完整性，然而，避免冷冻干燥将是有利的，因为它是一个昂贵和耗时的生产步骤。通常在使用前通过加入药物学可接受的稀释剂，如注射用无菌水、无菌生理盐水或适宜的无菌生理上可接受的稀释剂来再配制hGH的冷冻干燥制剂。优选将hGH的再配制溶液贮藏在4℃下以将化学和物理降解反应减至最少，然而，在最长可达14天的贮藏期限中将产生一些降解。
以液体形式提供的hGH药物制剂，尤其是在长时间内保持hGH稳定性的药物制剂将是尤为有利的。如上所述，目前的液体制剂在贮藏时间上受在加工和贮藏中产生的化学和物理降解反应产物的限制。在Becker等(1987)(同上)中报道了与二聚体形成相关的问题，且以前避免hGH二聚体形成的努力没有成功。
本发明的一个目的是提供不导致形成不希望的聚集物或不导致降低生物活性或改变受体识别的化学变化的稳定的hGH液体制剂。另一个目的是提供可借助于用于皮下注射的无针头注射器递送，或可被制成用于肺部的烟雾剂的制剂。
发明概述
根据本发明，提供一种制备稳定的生长激素液体制剂的方法，其中该制剂包含生长激素、缓冲液和稳定化有效量的至少一种选自下面的稳定剂：(ⅰ)聚乙二醇-聚丙二醇非离子表面活性剂，(ⅱ)牛磺胆酸或其盐或衍生物，和(ⅲ)甲基纤维素衍生物，其中该方法包括在生长激素不暴露于大于2×制剂中的缓冲液或稳定剂最终浓度的缓冲液或稳定剂浓度的条件下，将生长激素与缓冲液和稳定剂混合。
本发明还涉及由上面概述的方法制备的稳定的生长激素液体制剂。
另一个方面，本发明还涉及一种稳定的生长激素液体制剂，该制剂包含生长激素、缓冲液和稳定化有效量的至少一种选自牛磺胆酸或其盐或衍生物和甲基纤维素衍生物的稳定剂。
除非本文另有说明，在本说明书中，词语“包含”或其变化形式如“包括”应理解为指包含所述的要素或要素组，但不排除任何其它的要素或要素组。
在一个尤其优选的实例中，本发明提供一种制备稳定的药物学可接受的人生长激素的液体制剂的方法，该制剂包含：(a)药物学有效量的hGH，(b)0.01-5.0％w/v的至少一种选自上面概述组中的稳定剂，和(c)药物学可接受的缓冲液。
优选地，该制剂包含0.05-2.0％w/v，较优选0.08-1.0％w/v的稳定剂。
特别优选的稳定剂为Pluronic多羟基化合物、牛磺胆酸及其盐和羟丙基甲基纤维素。
该稳定化的生长激素液体制剂优选还包含药物学可接受的缓冲液如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液，其浓度为2.5-50mM，较优选为10-20mM。
制剂的pH优选为5.0-7.5，较优选为5.0-6.8，更优选为5.2-6.5，最优选为5.4-5.8。
在制备稳定化的生长激素液体制剂中，在生长激素不暴露于大于2×制剂中的最终缓冲液浓度的缓冲液浓度的条件下，将生长激素与缓冲液混合，并接着在相应条件下，向混合物中加入稳定剂。
在尤其优选的稳定化的生长激素液体制剂的制备方法中，将生长激素的暴露限制在不大于各成分最终浓度的2倍的磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液和Pluronic多羟基化合物的浓度。
本发明还涉及一种治疗需要生长激素的人或动物患者的方法，该方法包括对所述患者施用药物学有效量的如上概述的稳定的生长激素液体制剂。
可通过使用烟雾剂装置或无针头注射器进行团块的注射或通过连续静脉内输注施用GH液体制剂。
在本文中，所涉及的“生长激素”包括所有种类的GH，包括人、牛、猪、绵羊和鲑鱼及其它，尤其是hGH，以及GH的生物活性衍生物。GH衍生物指氨基酸序列有改变的人和动物种类的GH，如小的氨基酸缺失或被其它氨基酸残基置换。还包括GH的截短形式和其衍生物，以及在蛋白的氨基或羧基末端加上了氨基酸的GH，如甲硫氨酰hGH。另一种类型的hGH修饰为通过向活性hGH氨基酸共价加成聚乙二醇而形成(Davis等，美国专利4,179,337)。发明详述
本发明提供的GH和稳定剂的液体制剂的制备方法产生一种在凝固温度之上和之下适宜于延长期限的贮藏、以及适宜于治疗施用的稳定的液体GH制剂。包含这种稳定剂的治疗制剂是稳定的，同时仍允许治疗施用该制剂。
根据本发明的一个优选具体实例，GH为hGH。(1)人生长激素组合物
术语“人生长激素”或“hGH”代表例如通过从天然来源，或通过重组细胞培养物系统产生的人生长激素。hGH的序列和其特征描述在例如《激素药物》，Gueriguigan等，USP会议，Rockville,MD(1982)中。如上所述，该术语还覆盖在hGH整个序列中有一个或多个氨基酸不同的人生长激素的生物活性等同物，尤其是包括met-hGH。该术语还包括hGH的取代、缺失和插入氨基酸的变异体或翻译后修饰物。用于本发明制剂的hGH通常通过前面讨论的重组方法来制备。
GH尤其是hGH的“药物学有效量”指在各种给药方案中产生治疗效果的量。本发明的组合物可被制备成包含至少约0.1mg/ml至约20mg/ml或更多量的GH，优选为约1mg/ml至约10mg/ml，尤其优选为约1mg/ml至约5mg/ml。(2)缓冲液和pH
缓冲液可为任何药物学可接受的缓冲剂，如磷酸盐、tris-HCl、柠檬酸盐等。优选的缓冲液为磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液。优选缓冲液浓度大于或等于2mM而小于50mM，最有利地为10-20mM。用缓冲液调节的由此用于制备该制剂的适宜的pH范围为约5-约7.5，最有利地为约5.6。制剂pH应小于7.5以降低GH的脱酰胺作用。(3)稳定剂
根据本发明，该制剂包含一种或多种用于增加GH稳定性的稳定剂。该稳定剂可为聚乙二醇-聚丙二醇非离子表面活性剂，如Pluronic多羟基化合物，如Pluronics F127,F68,L64,PE6800和PE6400，胆盐，如牛磺胆酸盐或其衍生物，或甲基纤维素衍生物，如羟丙基甲基纤维素(HPMC)。该制剂可包含单一稳定剂或其两种或多种的混合物。
加入的稳定剂的浓度将通过选择缓冲液和pH来确定，但有利的是在0.01％-5.0％(w/v)的范围，较优选0.05-2.0％，甚至更优选0.08-1.0％。当在一温度范围，包括凝固点上下经历延长的贮藏期时，或当该制剂经受界面应力时，使用稳定剂可增加制剂的稳定性。
随着浓度增加，稳定剂增加制剂对界面应力的稳定性。然而，增加的稳定剂浓度降低化学稳定性。根据本发明，将稳定剂浓度最佳化以获得对界面应力的高稳定性，同时增加的化学不稳定性最小。(4)稳定剂和hGH的优选制剂
在根据本发明制剂的制备中，向hGH液体制剂中加入一种或多种稳定剂。如上所述，在配制过程中，生长激素被暴露在不大于2倍缓冲液最终浓度的缓冲液浓度中，优选在调节最终体积之前的片刻向制剂中加入稳定剂。产生的制剂对变性具有增加的稳定性，并且对在加工和贮藏中可能遇到的不希望的反应不敏感。如本文所采用的，术语“加工”包括过滤、将hGH溶液装入小瓶中以及在生产制剂中涉及的其它操作。
可通过将hGH和具有所需纯度的稳定剂与生理上可接受的赋形剂、缓冲液或防腐剂混合来制备用于治疗给药的hGH的液体制剂(Remington药物科学，16th版，Osol,A.编(1980)。可接受的赋形剂为在采用的浓度和剂量下对病人无毒的那些，包括缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、pH和渗透压调节剂。
如果需要，生长激素的液体制剂还可包括一种或多种其它稳定化赋形剂。另外的稳定化赋形剂可包括例如氨基酸，如甘氨酸或丙氨酸，甘露糖醇或其它糖醇或甘油。此外，液体制剂可包括其它生长因子，如胰岛素样生长因子或表皮生长因子。
本发明的优选具体实例提供一种有效稳定hGH的方法。该优选制剂包含一种或多种选自Pluronic多羟基化合物、牛磺胆酸或其盐或其衍生物、和甲基纤维素衍生物的稳定剂。制剂优选包含基本上纯的hGH，不含在人中发现的污染肽或蛋白或感染性物质。该优选具体实例的制剂可另外包含药物学可接受的添加剂。这包括例如缓冲液、等渗和pH调节剂、螯合剂、防腐剂、抗氧化剂、助溶剂等，具体实例可包括柠檬酸盐、磷酸盐等。在制剂的预期应用可能损害无菌性时可加入防腐剂，在这种情况下，可采用药物学可接受的防腐剂，如苯甲醇或苯酚。
根据本发明制备的制剂提供的hGH的增加的稳定性使得可广泛使用可能比在不存在稳定剂时通常使用的那些更浓的hGH制剂。例如，稳定化的hGH液体制剂还降低在烟雾化或无针头注射hGH制剂中发生的hGH的表面诱导的变性的发生。可进行hGH制剂的进一步的最佳分配，其中本发明的hGH制剂被以1-50mg/小瓶，优选2-25mg/小瓶，较优选3-10mg/小瓶的量分配至小瓶中。hGH制剂增加的稳定性使得能在适宜温度如凝固点之下(最优选为-20℃)，或凝固点之上优选2-8℃，最优选为4℃时得以长期贮藏。
用于体内给药的hGH制剂必须是无菌的。通过用无菌过滤膜过滤可容易地达到这一点。
治疗用hGH液体制剂通常被放置在具有无菌入口的容器中，例如静脉溶液袋或具有可被皮下注射针头穿过的塞子的小瓶。
根据本发明的hGH液体制剂的给药途经与已知实践一致，例如通过静脉内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、关节内或病灶内注射或灌注，或通过连续静脉输注。
本发明进一步的特征从下面的实施例以及附图中将是显而易见的。
附图简要说明
图1表明在5mM磷酸盐缓冲液(pH6.0-7.5)中hGH(1.5mg/ml)的化学稳定性。
图2表明通过界面应力(旋涡搅拌)诱导的hGH(在10mM乙酸盐缓冲液，pH4.1-4.5中，或在5mM磷酸盐缓冲液，pH6.0-7.5中的2mg/ml溶液)的聚集对溶液pH的依赖性。
图3图示总结了各种稳定剂降低界面应力(旋涡搅拌)诱导的聚集化hGH沉淀的能力。
图4表明不同之处仅在于将hGH导入赋形剂中的方法的两个hGH(5mg/ml)制剂，和其中加入了0.005％w/v EDTA的第三个hGH制剂的稳定性。
实施例实施例1．筛选稳定剂的方法
稳定剂降低或预防由于界面应力导致的GH尤其是hGH的聚集的能力已使用快速聚集方法得到评价，并通过大小排阻层析(SEC)进行了分析。使用串联的两个TSK G3000SW柱(7.8mm内径×300mm,ToyoSodo，日本)进行hGH的层析。流动相由0.1M磷酸盐(pH7.0)缓冲液组成，并以0.9ml/分钟的流速泵入，通过在214nm的UV吸光度检测hGH的洗脱液，使用20μ1的样品体积。
快速聚集方法包括通过在加盖的聚丙烯试管(11mm内经×74mm)中以恒定速度旋涡搅拌hGH溶液15-60秒来导入高空气/水界面，室温下，将样品平衡30分钟以使沉淀发生，接着用0.2μm乙酸纤维素微离心滤纸过滤，用SEC分析滤液。没有处理的各样品的对照溶液包括在SEC分析中。
剩余的全部可溶性hGH的量(单体和高分子量物质的峰面积)用适宜的未处理对照溶液的整个峰面积(出于hGH)的百分数来表示。
表1表明各种稳定剂对在pH7.0由界面应力诱导的hGH聚集程度的影响。
表2表明各种稳定对在pH6.0由界面应力诱导的hGH聚集程度的影响。
表3表明各种稳定剂对在pH5.6由界面应力诱导的hGH聚集程度的影响。
表4表明等渗调节对在pH5.6在各种缓冲液中的hGH(1.5mg/ml)聚集程度的影响。
表5表明各种稳定剂对在pH5.6由冻-融诱导的hGH聚集程度的影响。
如所附表格所示，一些赋形剂对降低或预防由于界面应力诱导的hGH聚集非常有效。Pluronic多羟基化合物在浓度高于0.05％w/v时提供几乎是定量的保护，仅剩余单体hGH。牛磺胆酸在浓度高于0.02％w/v时，提供几乎是定量的保护，仅剩余单体hGH。在pH5.6时，脱氧牛磺胆酸盐不适宜作为稳定剂，因为它在不存在界面应力时导致hGH二聚化。
表1在pH7.0并存在赋形剂时，由表面应力诱导的hGH(1.5mg/ml)的聚集
表2在pH6.0并存在赋形剂时，由界面应力诱导的hGH(1.5mg/ml)的聚集
表3在pH5.6并存在赋形剂时，由界面应力诱导的hGH(1.5mg/ml)的聚集
*在存在脱氧牛磺胆酸盐，不存在界面应力时发生的二聚化作用
| 赋形剂 | 浓度(mM) (％w/v) | ％剩余的所有的可溶性hGH(n=2.SEC分析) | 剩余的hGH的种类 |
| 缓冲液 | 对照 | 7.0±1.15 | (平均值±sd,n=5) |
| Pluronic多羟基化合物Pluronic F-127 | 1.4 1.753.2 4.0 | 100,99.8100,100 | 在所有样品中仅存在单体 |
| 牛磺胆酸衍生物：牛磺胆酸盐脱氧牛磺胆酸盐 | 1.3 0.075 0.2775 4.00.4 0.022 0.1130 1.6 | 75.3,68.5100,100100,10013.7,15.0100,100100,100 | 在所有样品中仅存在单体在所有样品中仅存在单体 |
| 甲基纤维素衍生物：羟丙基甲基纤维素(HPMC) | 0.01 0.10.05 0.5 | 44.1,47.198.9,99.4 | 在所有样品中仅存在单体 |
| 赋形剂 | 浓度(mM) (％w/v) | ％剩余的所有可溶性hGH(n=2,SEC分析) | 剩余的hGH种类 |
| 缓冲液 | 对照 | 2.4±2.05 | (平均值±sd,n=6) |
| Pluronic多羟基化合物Pluronic F-127Pluronic F-68Pluronic L-64Pluronic PE-6800Pluronic PE-6400 | 0.01 0.010.04 0.050.08 0.10.4 0.51.6 2.00.01 0.010.06 0.050.12 0.10.6 0.50.03 0.010.17 0.050.35 0.11.7 0.50.12 0.10.6 0.52.4 2.00.35 0.11.7 0.5 | 3.34,1.1293.7,91.9100,100100,99.698.5,97.71.2,2.186.4,97.598.6,100100,99.71.1,1.493.7,79.4100,100100,98.498.7,99.299.6,99.6100,99.0100,100100,100 | 在所有样品中仅存在单体在所有样品中仅存在单体在所有样品中仅存在单体在所有样品中仅存在单体在所有样品中仅存在单体 |
| 牛磺胆酸衍生物：牛磺胆酸盐脱氧牛磺胆酸盐 | 1.3 0.076 0.3415 0.8425 1.40.4 0.022 0.106 0.3112 0.63 | 16.8,11.998.5,10097.8,99.398.7,99.19.2,4.922.6,22.087.2,88.399.5,100 | 在所有样品中仅存在单体约0.5％二聚体约4％二聚体 |
| 甲基纤维素衍生物：HPMC | 0.01 0.10.03 0.250.04 0.4 | 28.6,24.058.6,63.491.9,93.6 | 在所有样品中仅存在单体 |
| 赋形剂 | 浓度(mM) (％w/v) | ％剩余的所有可溶性hGH(n=2,SEC析) | 剩余的hGH的种类 |
| 缓冲液 | 对照 | 0.79,1.16 | (平均值±sd,n=2) |
| Pluronic多元醇：Pluronic F-127Pluronic F-68 | 0.04 0.050.08 0.10.4 0.50.06 0.050.12 0.010.6 0.5 | 69.6,53.899.5,99.799.5,98.869.9,66.899.3,98.199.8,100 | 存在2％二聚体0.7％二聚体仅存在单体在所有样品中仅存在单体 |
| 牛磺胆酸衍生物：牛磺胆酸盐脱氧牛磺胆酸 | 5 0.2710 0.5425 1.42 0.106 0.3212 0.63 | 99.7,99.2100,10099.4,10095.7,91.8*92.1,87.8*91.6,84.4* | 在所有样品中仅存在单体存在7％二聚体存在27％二聚体存在34％二聚体 |
| 甲基纤维素衍生物：HPMC | 0.01 0.10.03 0.250.04 0.4 | 5.8,2.134.8,36.788.8,88.4 | 在所有样品中仅存在单体 |
由于聚集作用被报道取决于磷酸盐浓度(Pearlnan和Nguyen,1992,J.Pharm.Pharmacol.44:178-185)，研究了在加入或不加入氯化钠(至等渗)的柠檬酸盐或磷酸盐(5或20mM)缓冲液中hGH(1.5mg/ml,pH5.6)的聚集特性。
按照如前所述的实验方法，仅改变处理时间(15秒)。表4在pH5.6在各种缓冲液体系中的hGH(1.5mg/ml)的聚集
a 单体加上高分子量种类b hGH溶解性不足。
| 缓冲液体系 | ％剩余的所有可溶性hGH未加入NaCl 加入NaCl | 存在的hGH的种类 | |
| 5 mM磷酸盐 | _b | 44.5,30.3 | 仅存在单体 |
| 5 mM柠檬酸盐 | 18.9,21.2 | 44.3,46.4 | 仅存在单体 |
| 20 mM磷酸盐 | 28.5,33.1 | 43.1,38.7 | 仅存在单体 |
| 20mM柠檬酸盐 | 24.6,33.2 | 55.5,50.0 | 仅存在单体 |
未发现hGH聚集取决于缓冲液的性质或缓冲液浓度。hGH聚集与离子强度(当用NaCl调节时)负相关。
研究了在存在赋形剂时，由冻-融诱导的hGH(在20mM等渗柠檬酸盐缓冲液pH5.6中为1.5mg/ml)聚集。在-20℃时，在存在各种赋形剂时，将hGH样品(100μl)冷冻24小时，接着室温下融化，并平衡30分钟以让沉淀产生。如前所述通过SEC进行过滤样品的分析。
表5在pH5.6并存在赋形剂时，由冻-融诱导的hGH(1.5mg/ml)的聚集
| 赋形剂 | 浓度(mM) (％w/v) | ％剩余的所有可溶性hGH(n=2,SEC分析) | 剩余的hGH的种类 |
| 缓冲液 | 对照 | 98.8,95.5 | 仅存在单体 |
| Pluronic多羟基化合物Pluronic F-127Pluronic F-68 | 0.08 0.10.12 0.1 | 95.9,97.5100,100 | 仅存在单体仅存在单体 |
| 牛磺胆酸衍生物：牛磺胆酸盐脱氧牛磺胆酸盐 | 5 0.272 0.1 | 97.9,10095.7,91.8 | 仅存在单体包含24％二聚体 |
| 甲基纤维素衍生物：HPMC | 0.03 0.25 | 97.2,97.3 | 仅存在单体 |
冻-融后的hGH聚集不广泛，但不随赋形剂的加入而增加。实施例2
图1为hGH(15mg/ml)在5mM磷酸盐缓冲液pH6.0-7.5(贮藏在40℃)的化学稳定性的代表性分布图。根据美国药典(USP1990)中描述的方法，使用Vydac C-4柱通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析降解的样品。根据美国药典预告(1990年11-12日)中描述的方法确定降解产物为脱酰胺hGH或氧化hGH。存在于降解样品中的天然hGH(图A)、脱酰胺hGH(图B)和氧化hGH(图C)的量用相对于pH6.0(○)、pH6.5(●)、pH7.0()和pH7.5()的整个峰面积(出于hGH)的(天然hGH或降解物)峰面积百分数来表示。
发现天然hGH的损失在6.0-7.5的pH范围中遵循一级动力学，在8-40℃的温度范围中遵循Arrhenius行为。发现40℃的一级速率常数在pH6.0时的2.4×10-2天-1至pH7.5时的7.4×10-2天-1的范围内。与公开的报道一致(Pearlman和Nguyen,1989，见上文)，脱酰胺作用和氧化作用是hGH降解的主要途径。脱酰胺hGH以大于氧化hGH形成的速率形成，在pH值为6.0或更低时化学稳定性增强。
图2表明使用如实施例1中描述的方法，通过界面应力诱导的在10mM乙酸盐缓冲液(pH4.1-4.5)或5mM磷酸盐缓冲液(pH6.6-7.5)中hGH(2mg/ml)的聚集和沉淀。单体hGH(由于单体的峰面积)或剩余的全部可溶性hGH(由于单体加上更高等级的聚集物的峰面积)的量用相对于适宜的未处理对照溶液的峰面积的百分数来表示。数据表示在旋涡搅拌30秒(○)或60秒(●)后剩余的可溶性单体hGH(图A)或全部可溶性hGH(图B)的量。
在pH5-6的区域，hGH的聚集作用和后来的沉淀作用最大。在pH4.1-6.0范围内，在界面应力后，仅单体hGH保留在溶液中。在pH7.0-7.5范围内，主要存在可溶性聚集物(二聚体和更高级聚集物)。
图3表明赋形剂(％w/v)对如图2所述通过以恒定速度旋涡搅拌60秒由界面应力诱导的hGH(在5mM磷酸盐缓冲液pH5.6中为1.5mg/ml)的聚集作用的影响。数据表示在存在Pluronic F-68(○)、Pluronic F-127(●)、牛磺胆酸钠()或HPMC()时，以相对于适宜的对照溶液中SEC分析的hGH峰面积的百分数表示的处理后仍保留的全部可溶性hGH(单体加上更高等级的聚集物)的百分数。
在不存在赋形剂时，小于1％的hGH仍保留在溶液中。加入Pluronic多羟基化合物、牛磺胆酸盐或HPMC导致剩余的可溶性hGH大量增加。尤其是Pluronics F-68和F-127和牛磺胆酸盐对hGH提供了几乎是定量的抗聚集保护。实施例3
图4表明配制方法对hGH制剂稳定性的影响。通过将纯化的hGH溶液浓缩至7-7.5mg/ml，并加入2倍浓度的包含所有赋形剂并且被调节至一定pH的溶液，所述pH使得不用进一步调节即可产生pH5.6的液体制剂，最后用水调节以获得5mg/ml的最终hGH浓度来配制制剂1。
通过缓冲液交换，通过交换至包含所需浓度的所有赋形剂(除开Pluronic F-68)的缓冲液中将纯化的hGH溶液浓缩至所需浓度来配制制剂2。接着加入足量的固体Pluronic F-68以产生所需浓度。随后检查pH，如果需要调节pH。
制剂1和2具有相同的成分：
hGH(生长激素) 5mg
柠檬酸-水合物 2.04mg/ml
柠檬酸三钠二水合物 2.85mg/ml
氯化钠 6.23mg/ml
氢氧化钠 0.388mg/ml
苯甲醇 0.9％
Pluronic F-68 0.08％
pH 5.6
如制剂2那样配制制剂3，其包含与制剂1和2相同的成分，并加有0.005％w/vEDTA。
40℃下，贮藏制剂1-3，并以40天的间隔通过大小排阻HPLC分析hGH含量。如图4所示在该40℃的加速稳定性试验中，尤其与制剂1相比，制剂2和3显示出更好的稳定性。
Claims (11)
1．一种制备稳定的生长激素液体制剂的方法，其中该制剂包含生长激素、缓冲液和稳定化有效量的至少一种选自下面的稳定剂：(ⅰ)聚乙二醇-聚丙二醇非离子表面活性剂，(ⅱ)牛磺胆酸或其盐或衍生物，和(ⅲ)甲基纤维素衍生物，其中该方法包括在生长激素不暴露于大于2×制剂中的缓冲液或稳定剂最终浓度的缓冲液或稳定剂浓度的条件下，将生长激素与缓冲液和稳定剂混合。
2．根据权利要求1的方法，其中生长激素为人生长激素。
3．根据权利要求1或2的方法，其中该制剂包含0.1-5.0％w/v，优选0.05-2.0％w/v，更优选0.08-1.0％w/v的稳定剂。
4．根据权利要求1-3任一项的方法，其中稳定剂选自Pluronic多羟基化合物、牛磺胆酸和其盐、及羟丙基甲基纤维素。
5．根据权利要求1-4任一项的方法，其中制剂包含0.08％w/v的Pluronic多羟基化合物作为稳定剂。
6．根据权利要求1-5任一项的方法，其中该制剂包含药物学可接受的缓冲液，优选磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液，其浓度为2.5-5.0mM，优选为10-20mM。
7．根据权利要求1-6任一项的方法，其中制剂的pH为5.0-7.5，优选为5.0-6.8，更优选为5.2-6.5，最优选为5.4-5.8。
8．根据权利要求1-7任一项的方法，其中稳定剂在调节最终体积之前的片刻被加入制剂中。
9．一种稳定的生长激素液体制剂，其由根据权利要求1-8任一项的方法制备。
10．一种稳定的生长激素液体制剂，其包含生长激素、缓冲液和稳定化有效量的至少一种选自牛磺胆酸或其盐或衍生物、及甲基纤维素衍生物的稳定剂。
11．一种治疗需要生长激素的人或动物患者的方法，其包括对所述患者施用药物学有效量的根据权利要求9或权利要求10的制剂。
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