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CN121358773A - 结合人ccr8的抗体及其用途 - Google Patents

结合人ccr8的抗体及其用途

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CN121358773A
CN121358773A CN202480039478.7A CN202480039478A CN121358773A CN 121358773 A CN121358773 A CN 121358773A CN 202480039478 A CN202480039478 A CN 202480039478A CN 121358773 A CN121358773 A CN 121358773A
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CN
China
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antibody
ccr8
seq
antigen
cells
Prior art date
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Pending
Application number
CN202480039478.7A
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English (en)
Inventor
李中道
陈黎
周艺
梁雨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Vigorous Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Nanjing Vigorous Biotechnology Co ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Vigorous Biotechnology Co ltd filed Critical Nanjing Vigorous Biotechnology Co ltd
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Abstract

涉及一种与CCR8特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合部分。还涉及编码该抗体或其抗原结合部分的核酸分子，用于表达该抗体或其抗原结合部分的表达载体、宿主细胞和方法，以及使用该抗体或其抗原结合部分、核酸分子、表达载体和/或宿主细胞的治疗方法。

Description

结合人CCR8的抗体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年6月12日提交的申请号为202310693601.4的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引入并入本文。
发明领域
本申请涉及一种与CCR8特异性结合的抗体或其抗原结合部分，以及该抗体或抗原结合部分在治疗癌症等疾病中的用途。
背景技术
趋化因子可以结合细胞上表达的趋化因子受体，通过其自身浓度分布而引导细胞的迁移。趋化因子受体与趋化因子的结合可引发信号通路，且受体会内化，并再次表达于移动细胞的前进面。趋化因子可以是在稳态下产生的，负责日常的免疫细胞迁移，也可以在炎症刺激下产生，将免疫细胞招募到感染位点或慢性炎症位点(Moser B et al.,(2004).Chemokines:multiple levels of leukocyte migration control.Trends Immunol.25(2):75-84；Zlotnik A et al.,(2012)The chemokine superfamily revisited.Immunity.36(5):705-716)。
T细胞可以按照细胞表面的趋化因子受体组合而划分为不同的亚组，如调控或抑制免疫系统、在维持自体耐受和免疫自稳方面的调节性T细胞(Treg)，识别并杀伤靶细胞的细胞毒性CD8+T细胞等。CCR8是主要表达于Treg的一种趋化因子受体，其配体为趋化因子CCL1和CCL18。其中主要配体CCL1主要由活化的单核细胞、巨噬细胞、和T淋巴细胞产生，也可由肿瘤细胞分泌，而第二配体CCL18可由肿瘤相关巨噬细胞分泌(Moser B et al.,(2022)Chemokine Receptor-Targeted Therapies:Special Case for CR8.Cancers 14(3):511)。通过趋化因子和趋化因子受体之间的相互作用，Treg迁移到炎症位点，引发CCR8信号通路，平衡免疫和耐受。
肿瘤微环境(TME)中富含各种趋化因子，且在多种肿瘤组织的肿瘤微环境(TME)中观察到大量的Treg浸润，其通过抑制抗肿瘤免疫反应来促进肿瘤的生长。CCR8的表达主要限制于这类肿瘤浸润Treg，而很少出现在外周血单核细胞的Treg中。已有报道表明，与居留在正常组织的Treg相比，CCR8仅在肿瘤Treg中上调。在临床前研究中发现，在小鼠肠癌、黑色素瘤、乳癌、和尿路上皮癌的模型中，肿瘤Treg高表达CCR8。靶向CCR8的抗体治疗可以通过例如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)等选择性地减少CCR8+肿瘤Treg细胞，引发抗肿瘤免疫反 应，显著抑制肿瘤的生长。此外，CCR8也表达于皮肤记忆T细胞，而这类细胞被认为是蕈样真菌病(MF)中的肿瘤细胞来源，消除CCR8+细胞可能可以抑制T细胞淋巴瘤的进展(Giustiniani J et al.,(2022)CCR8 is a new therapeutic target in cutaneous T-cell lymphomas.BloodAdv.6(11):3507-3512)。因而，居留于肿瘤的CCR8+Treg细胞、以及居留于皮肤的CCR8+T细胞可能是合适的癌症免疫疗法靶点，靶向CCR8具有癌症治疗的潜力。
然而，CCR8作为一种7次跨膜蛋白，很难在纯化后保持其天然构型。领域内已使用多种策略来制备用于动物免疫的抗原，包括合成部分胞外结构域，或用DNA分子进行免疫。然而，当使用无法呈现自然构型的肽作为抗原时，可能使得所产生的抗体无法识别天然靶标，而DNA免疫可能不足以引起较强的动物免疫。因而，针对该靶点的免疫充满了挑战，需要新的方法来加强动物免疫，生成更优的抗体。
对于本申请中任何文件的引用，并不等同于承认这些文件是本申请的现有技术。
发明内容
本申请的发明人，通过在动物免疫中组合使用含有CCR8编码序列的DNA质粒、编码CCR8的mRNA、和/或与过表达CCR8的细胞，筛选出了新的CCR8抗体。
本申请的CCR8抗体，与现有技术抗体如BMS-986340和GS-1811相比，具有i)相当或更好的CCR8结合力和结合特异性，ii)相当或更高的CCR8-CCL1阻断力，iii)相当或更高的对CCR8+细胞引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力，vi)相当或更高的内化活性，和/或v)相当或更好的体内抗肿瘤效果。
因而，在第一个方面，本申请涉及一种分离的单克隆抗体(例如，小鼠源、嵌合、或人源化抗体)、或其抗原结合部分，其能够与CCR8(例如，人、猴CCR8)特异结合，可以包含i)重链可变区，该重链可变区可以含有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中，VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3可以分别包含(1)SEQ ID NO:1、2和3；(2)SEQ ID NO:7、8和9；(3)SEQ ID NO:13、2、和14；或(4)SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列；和/或ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中，VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含(1)SEQ ID NO:4、5和6；(2)SEQ ID NO:10、11和12；(3)SEQ ID NO:15、16和17；或(4)SEQ ID NO:21、16和17所示的氨基酸序列。还提供上述抗体或抗原结合部分的变体，其与上述抗体或其抗原结合部分相比，在各CDR中包含最多约3个氨基酸替换(例如，1个、2个、或3个氨基酸残基替换)。在一些实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其能够与CCR8特异性结合，包含：i)重链可变区，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的氨基酸序列可以分别如(1)SEQ ID NO:1、2和3；(2)SEQ ID NO:7、8和9；(3)SEQ ID NO:13、2、和14；或(4)SEQ ID NO: 18、19和20所示；和/或ii)轻链可变区，其包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列可以分别如(1)SEQ ID NO:4、5和6；(2)SEQ ID NO:10、11和12；(3)SEQ ID NO:15、16和17；或(4)SEQ IDNO:21、16和17所示。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含(1)SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；(2)SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；(3)SEQ ID NO:13、2、14、15、16和17；或(4)SEQ ID NO:18、19、20、21、16和17所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列。还提供上述抗体或抗原结合部分的变体，其与上述抗体或其抗原结合部分相比，在各CDR中包含最多约3个氨基酸残基取代(例如，1个、2个、或3个氨基酸残基取代)。在一些实施方式中，本申请分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的氨基酸序列可以分别如(1)SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；(2)SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；(3)SEQ ID NO:13、2、14、15、16和17；或(4)SEQ ID NO:18、19、20、21、16和17所示。
本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区可以包含与SEQ ID NO:22、24、26、27、29、31、33、或35具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本申请抗体或其抗原结合部分的轻链可变区可以包含与SEQ ID NO:23、25、28、30、32、34、或36具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本申请抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区可以包含与SEQ ID NO:22、24、26、27、29、31、33、或35具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；和/或所述轻链可变区可以包含与SEQ ID NO:23、25、28、30、32、34、或36具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区可以包含如SEQ ID NO:22、24、26、27、29、31、33、或35所示的氨基酸序列；和所述轻链可变区可以包含与SEQ ID NO:23、25、28、30、32、34、或36所示的氨基酸序列。在另一些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:22、24、26、27、29、31、33、或35所示；和所述轻链可变区的氨基酸序列 如SEQ ID NO:23、25、28、30、32、34、或36所示。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NO:22和23；(2)SEQ ID NO:24和25；(3)SEQ ID NO:26和25；(4)SEQ ID NO:27和28；(5)SEQ ID NO:29和30；(6)SEQ ID NO:31和32；(7)SEQ ID NO:33和34；或(8)SEQ ID NO:35和36具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区可以分别包含(1)SEQ ID NO:22和23；(2)SEQ ID NO:24和25；(3)SEQ ID NO:26和25；(4)SEQ ID NO:27和28；(5)SEQ ID NO:29和30；(6)SEQ ID NO:31和32；(7)SEQ ID NO:33和34；或(8)SEQ ID NO:35和36所示的氨基酸序列。在另一些实施方式中，所述重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列可以分别如(1)SEQ ID NO:22和23；(2)SEQ ID NO:24和25；(3)SEQ ID NO:26和25；(4)SEQ ID NO:27和28；(5)SEQ ID NO:29和30；(6)SEQ ID NO:31和32；(7)SEQ ID NO:33和34；或(8)SEQ ID NO:35和36所示。
在一些实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6所示的氨基酸序列。该重链可变区可以包含与SEQ ID NO:22、24或26具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。该轻链可变区可以包含与SEQ ID NO:23或25具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NO:22和23；(2)SEQ ID NO:24和25；或(3)SEQ ID NO:26和25具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列。该重链可变区可以包含与SEQ ID NO:27或29具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。该轻链可变区可以包含与SEQ ID NO:28或30具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NO:27和28；或(2)SEQ ID NO:29和30具有至少80％、85％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以分别包含SEQ ID NO:13、2、14、15、16和17所示的氨基酸序列。该重链可变区可以包含与SEQ ID NO:31或33具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。该轻链可变区可以包含与SEQ ID NO:32或34具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，重链可变区和轻链可变区可以分别包含与(1)SEQ ID NO:31和32；或(2)SEQ ID NO:33和34具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
本申请还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其能够与CCR8特异结合，可以包含i)重链可变区，该重链可变区可以含有VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，和ii)轻链可变区，该轻链可变区可以含有VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3可以包含选定重链可变区和轻链可变区所含的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，选定重链可变区和轻链可变区可以分别包含(1)SEQ ID NO:22和23；(2)SEQ ID NO:24和25；(3)SEQ ID NO:26和25；(4)SEQ ID NO:27和28；(5)SEQ ID NO:29和30；(6)SEQ ID NO:31和32；(7)SEQ ID NO:33和34；或(8)SEQ ID NO:35和36所示的氨基酸序列。
本申请的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区和/或轻链恒定区，其中重链恒定区的N端与重链可变区的C端连接，轻链恒定区的N端与轻链可变区的C端连接。重链恒定区可以是IgG、IgD、IgA、IgM或IgE重链恒定区，优选为天然地或经改造后具有FcR和/或补体系统蛋白结合力的重链恒定区，或其功能片段，例如包含重链恒定区的铰链区、CH2和CD3的片段。在一个实施方式中，重链恒定区为IgG1重链恒定区，例如人IgG1重链恒定区，包含例如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。轻链恒定区可以为κ或λ轻链恒定区。在一些实施方式中，轻链恒定区可以为人κ轻链恒定区，包含例如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
本申请的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链，或由两条重链和两条轻链构成，其中各重链包含上述的重链恒定区序列、重链可变区序列和/或CDR序列，且各轻链包含上述的轻链恒定区序列、轻链可变区序列和/或CDR序列。在一些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以为Fab、F(ab')2片段、Fv、scFv或(scFv)2等。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以是例如鼠源、嵌合、或人源化的。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以拮抗型的。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以i)结合人CCR8，ii)结合猴CCR8，iii)阻断CCR8-CCL1结合/相互作用，vi)由CCR8+细胞内化，v)可引发对于CCR8+细胞的ADCC(当重链恒定区具有FcR结合力时)，和/或iv)具有体内抗肿瘤效果。
本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物，该抗体或其抗原结合部分与治疗剂例如细胞毒性分子或抗癌剂相连接。本申请还提供含有本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团，例如，第二抗体，该第二功能基团具有不同于本申请抗体或其结合部分的结合特异性。在另一方面，本申请的抗体或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)或基因改造T细胞受体(TCR)的一部分。本申请还提供含有上述CAR和/或TCR的免疫细胞，包括T细胞、NK细胞等。本申请的抗体或其抗原结合部分还可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒承载。
本申请还包括编码本申请抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、和/或CAR/TCR的核酸分子。本申请还可以提供一种表达载体和一种宿主细胞。表达载体可以包含本申请的核酸分子。宿主细胞可以包含本申请的表达载体，或在其基因组中整合有本申请的核酸分子。
本申请还提供使用本申请的宿主细胞来制备本申请抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、或CAR/TCR的方法，包括：(i)在宿主细胞中表达抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、或CAR/TCR，以及(ii)从宿主细胞或其培养物中分离抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、或CAR/TCR。
本申请还提供一种组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、双特异性分子、免疫细胞、溶瘤病毒、核酸分子、表达载体或宿主细胞。在一些实施方式中，该组合物为药物组合物，还包含药学上可接受的载体。在一些实施方式中，该组合物还包含PD-1抗体。
另一方面，本申请提供一种在受试者中治疗或缓解CCR8相关疾病的方法，包括向受试者施用治疗有效量的本申请药物组合物。CCR8相关疾病可以为肿瘤，包括实体瘤和血液瘤。实体瘤包括，但不限于，非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌、微卫星稳定的结直肠癌、和宫颈癌。血液癌可以为T细胞淋巴瘤，包括但不限于，皮肤T细胞淋巴瘤。在一些实施方式中，本申请的药物组合物可以与至少一种其他抗体一起施用，例如PD-1抗体等。在另一个实施方式中，本申请的药物组合物可以与细胞因子(例如IL-2和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。在另一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用，该化疗剂可以是细胞毒性剂。
本申请还提供一种在受试者中解除或缓解免疫抑制的方法，包括向受试者施用有效量的本申请药物组合物。在一些实施方式中，该方法用于解除或缓解肿瘤 微环境中的免疫抑制，包括向肿瘤位点施用有效量的本申请药物组合物。
本申请还提供一种在受试者中增强免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的本申请药物组合物。
本申请也涉及上述的组合物，特别是药物组合物，在制备一种用于治疗或缓解CCR8相关肿瘤、解除或缓解免疫抑制、或增强免疫应答的药物中的用途。
本申请的抗体或其抗原结合部分还可以用于例如体外抗原检测等。
再一方面，本申请提供一种用于制备CCR8抗体的方法，包括i)向动物体施用含有CCR8编码序列的DNA分子、编码CCR8的RNA分子、和/或能够过表达CCR8的细胞，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。
含有CCR8编码序列的DNA分子可以是含有CCR8编码序列且可以在动物体内表达CCR8蛋白的DNA分子。DNA分子可以是DNA载体，如慢病毒载体、质粒等。在一些实施方式中，该DNA分子可以是含有合适的启动子以及CCR8编码序列的载体。启动子可以是组成型启动子、或诱导性启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在一些实施方式中，DNA分子可以经例如基因枪而注射到动物体的例如皮下或腹腔。
编码CCR8的RNA分子可以是含有CCR编码序列且可以在动物体内表达(翻译)CCR8蛋白的RNA分子。在一些实施方式中，该RNA分子可以在动物体内表达人CCR8蛋白。RNA分子可以是mRNA分子。在一些实施方式中，RNA分子可以是环状RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子可以包含合适的启动子以及CCR8编码序列。启动子可以是组成型启动子、或诱导性启动子。在一些实施方式中，启动子可以是组成型启动子。RNA分子可以直接注射至动物体例如腹腔。RNA分子也可以经脂类分子(如胶束、脂质体、脂质纳米粒子(LNP))、病毒样颗粒(VLP)、聚合物分子(如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯亚胺(PEI)、多聚赖氨酸(PLL)、聚β氨基酯(PBAE)、聚合物纳米粒子)、外泌体等的辅助而注射至动物体。在一个实施方式中，RNA分子由LNP包裹。
能够过表达CCR8的细胞可以是在动物体内表达CCR8蛋白的细胞。该细胞可以是真核细胞。在一些实施方式中，该细胞可以注射至动物体例如腹腔。
在一些实施方式中，本申请的方法包括i)向动物体施用能够表达CCR8蛋白的RNA分子，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。该RNA分子可以在动物体内表达CCR8蛋白。在一些实施方式中，该RNA分子可以在动物体内表达人CCR8蛋白。
在本申请中引用或提及的所有文件(包括但不限于本文引用的所有文献、专利、公开的专利申请)(“本申请引用文件”)，在本申请引用文件中引用或提及的所有文件，以及本申请或任意本申请引用文件中提及的任何产品的制造商手册、说 明书、产品规格和产品页，均通过引用的方式并入本申请，且可能在实施本发明时采用。更具体而言，所有参考文件均通过引用的方式并入本申请，如同各文件通过引用的方式并入。在本文中提及的任何Genbank序列通过引用的方式并入本申请。
应当注意的是，在本申请中，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”等可以具有中国专利法所赋予的意义；而术语例如“基本由……组成”具有中国专利法所赋予的意义，例如允许没有明确表述的元素的存在，但将现有技术中存在的元素、或影响本发明的基本或新的特性的元素排除在外。
附图说明
以下以示例方式给出但不意在将本发明限制于所述具体实施方式的具体描述，可以结合附图更好地进行理解。
图1A和1B示出本申请嵌合抗体117G9F9、125C1E6、154G7C3(1A)、和224E9A3(1B)与表达人CCR8的HEK293细胞的结合力。
图2示出本申请嵌合抗体与表达猴CCR8的HEK293细胞的结合力。
图3示出本申请嵌合抗体对CCR8-CCL1结合/相互作用的阻断力。
图4示出本申请嵌合抗体对CCR8+细胞引发ADCC的活性。
图5A-5C示出本申请人源化抗体与表达人CCR8(5A)和猴CCR8(5B)的HEK293细胞、以及亲本HEK293细胞(5C)的结合力。
图6A和6B示出本申请中人源化的125C1E6抗体(6A)、154G7C3抗体、和117G9F9抗体(6B)对CCR8+细胞引发ADCC的活性。
图7A和7B示出本申请中人源化的125C1E6抗体(7A、7B)、154G7C3抗体、和117G9F9抗体(7B)对CCR8-CCL1结合/相互作用的阻断力。
图8示出本申请人源化抗体的细胞内化活性。
图9A-9C示出本申请人源化125C1E6抗体与阳性对照的表位竞争结合情况，其中在实验中先加入125C1E6抗体，后加入BMS-986340、GS-1811-mIgG2a或125C1E6(9A)，先加入BMS-986340，后加入125C1E6-VH3-VL1或BMS-986340(9B)，或者先加入GS-1811，后加入125C1E6(9C)。
具体实施方式
为更好理解本申请，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
术语“一个”或“一种”是指一个/种物品、或多于一个/种的物品。例如，“一个抗体”是指一个抗体、或多于一个的抗体。
术语“CCR8”是指CC趋化因子受体8，是G蛋白偶联受体(GPCR)家族的一员。该术语包括变体、同源物、直向同源物和平行同源物。例如，对人CCR8特异的抗 体可以在某些情况下与另一物种例如猴的CCR8蛋白交叉反应。在其他实施方式中，对人CCR8蛋白特异的抗体可以完全地对人CCR8蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应，或者可以与一些其他物种而非所有其他物种的CCR8蛋白交叉反应。
术语“人CCR8”是指具有人氨基酸序列的CCR8蛋白，例如具有GenBank索引号为AAI07160.1的氨基酸序列的CCR8蛋白(Strausberg,R.L.et al.,(2002)Generation and initial analysis ofmore than 15,000full-length human andmouse cDNA sequences Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26):16899-16903)。术语“猴CCR8”是指具有猴氨基酸序列的CCR8蛋白，例如具有GenBank索引号为AFR51945.1的氨基酸序列的CCR8蛋白(Wang,L.et al.,(2012),Submitted(26-JUL-2012)Department ofCellular Immunology and Pharmacology,Millennium Pharmaceuticals Inc.)。
本文中的术语“抗体”意在包括IgG、IgA、IgD、IgE和IgM全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的骨架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)的结合。抗体恒定区的“功能片段”是指恒定区中保留有某些所需功能的片段，例如重链恒定区中保留有FcR/补体系统组分结合活性的片段，如Fc片段。
本文中的术语，抗体的“抗原结合部分”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原(例如，CCR8蛋白)能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)dAb-VL，一种包含单可变结构域和重链恒定结构域的片段。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
本文所用的术语“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。例如，与CCR8蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合CCR8蛋白之外抗原的抗体。但是，特异结合人CCR8蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的CCR8蛋白具有交叉结合性。此外，分离的抗体基本不含其他细胞材料和/或化学物质。
术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
术语“小鼠源抗体”是指可变区骨架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗体。此外，如果抗体包含恒定区，其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。本申请的小鼠源抗体可以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机突变或点突变或通过体内体细胞突变而导入的突变。然而，术语“小鼠源抗体”不包括在小鼠骨架序列中插入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。
术语“嵌合抗体”是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。特别地，本申请中的嵌合抗体是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。
术语“人源化抗体”是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改，以增加其与人天然生成抗体的相似度的抗体。
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
在本文中，术语“特异地识别”、或“特异地结合”靶标例如人CCR8，是指一种抗体或抗原结合片段能够区分这种靶生物分子与一种或多种参照分子，且与靶生物分子的结合亲和力或结合活性比其他参照分子高出例如1倍、5倍、10倍等。特异性测定方法包括但不限于蛋白质印迹法、ELISA、RIA、ECL、IRMA测试以及肽扫描。
术语“基本不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0×10-6M以上，更优选1.0×10-5M以上，更优选1.0×10-4M以上、1.0×10-3M以上，更优选1.0×10-2M以上。
术语“EC50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
术语“IC50”，是指半抑制浓度，即对指定的生物过程抑制一半时所需的药物或抑制剂的浓度。
术语“抗体依赖的细胞毒性”、“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的免疫防御，其中免疫系统效应细胞主动地将细胞膜表面抗原与抗体，例如本申请的CCR8抗体，结合的靶细胞裂解。
术语“受试者”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳类和非哺乳类，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类、和 爬行类，尽管优选哺乳动物，例如非人灵长类、羊、狗、猫、牛和马。
术语“治疗有效量”是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状的本申请抗体量。治疗有效量与被治疗的疾病相关，其中本领域技术人员可以方便地判别出实际的有效量。
本文中的“序列同一性”是指在进行序列比对后，一条序列中与参照序列中核苷酸/氨基酸残基相同的核苷酸/氨基酸百分比，如果需要的话，在序列对比中引入空格来达到两条序列间最大的序列一致性百分比。本领域技术人员可以通过多种方法，例如使用计算机软件，来进行两两序列对比或多序列比对，以确定两条或多条核酸或氨基酸序列之间的序列一致性百分比，此类计算机软件为例如ClustalOmega、T-coffee、Kalign和MAFFT等。
CCR8抗体的制备难点在于，作为一种7次跨膜蛋白，该蛋白难以纯化后保持其天然构型。当使用无法呈现自然构型的肽作为抗原时，可能使得所产生的抗体无法识别天然靶标，而DNA免疫可能不足以引起较强的动物免疫。
本申请的发明人通过组合使用包含CCR8编码序列的DNA质粒、和过表达CCR8的细胞，或者通过施用编码CCR8的mRNA，筛选出了新的相比现有技术具有更优特性的CCR8抗体。本申请的发明人发现，对于多次跨膜蛋白而言，mRNA比DNA分子引起更高的抗体水平。
因而，在一个方面，本申请提供一种新的动物免疫方法、或通过动物免疫制备抗体的方法，包括使用编码CCR8蛋白的RNA分子(如mRNA分子)来免疫动物。
具体地，本申请提供一种用于制备CCR8抗体的方法，包括i)向动物体施用含有CCR8编码序列且可以在动物体内表达CCR8蛋白的DNA分子、含有CCR8编码序列且可以在动物体内表达(翻译)CCR8蛋白的RNA分子、和/或能够在动物体内过表达CCR8蛋白的细胞，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。
在一些实施方式中，本申请的方法包括i)向动物体施用含有CCR8编码序列且可以在动物体内表达CCR8蛋白的DNA分子、以及能够在动物体内过表达CCR8蛋白的细胞，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。
在一些实施方式中，本申请的方法包括i)向动物体施用能够在动物体内表达CCR8蛋白的RNA分子，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在一些实施方式中，该RNA分子可以在动物体内表达人CCR8蛋白。RNA分子可以是mRNA分子，如环状RNA分子。在一些实施方式中，RNA分子可以是包含合适的启动子以及CCR8编码序列的载体。启动子可以是组成型启动子或诱导性启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。RNA分子可以直接注射至动物体的例如腹腔。RNA 分子也可以经脂类分子(如胶束、脂质体、脂质纳米粒子(LNP))、病毒样颗粒(VLP)、聚合物分子(如聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙烯亚胺(PEI)、多聚赖氨酸(PLL)、聚β氨基酯(PBAE)、聚合物纳米粒子)、外泌体等的辅助而注射至动物体。在一个实施方式中，RNA分子由LNP包裹。
本申请的CCR8抗体，与现有技术中公开的抗体如BMS-986340和GS-1811相比，具有i)相当或更好的(人或猴)CCR8结合力和结合特异性，ii)相当或更高的CCR8-CCL1阻断力，iii)相当或更高的对CCR8+细胞引发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力，vi)相当或更高的内化活性，和/或v)相当或更好的体内抗肿瘤效果。
优选的本申请抗体是单克隆抗体。此外，抗体可以是例如小鼠源的、嵌合的、或人源化的单克隆抗体。
本申请的示例性抗体或其抗原结合部分是结构和化学特性在以下描述的那些。
本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区和轻链可变区序列列于表1和表2。重链可变区CDR和轻链可变区CDR通过Kabat编号系统确定，且由此确定的CDR列于表1中。本申请抗体或其抗原结合部分的重链可变区CDR和轻链可变区CDR还可通过Chothia、IMGT、AbM、或Contact编号系统确定。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以包含重链恒定区，例如天然的或改造的具有FcR结合力，特别是高FcR结合力的那些。在一些实施方式中，重链恒定区可以是IgG1恒定区，例如包含如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的人IgG1恒定区。轻链恒定区可以为κ恒定区，例如人κ恒定区，其可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
与人CCR8结合的其他CCR8抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本申请抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)“混合并配对”。优选地，当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时，特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。相似地，优选特定VH/VL配对中的VL序列由结构近似的VL序列取代。
因此，在一个实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)包含列于表1或表2中氨基酸序列的重链可变区；以及
(b)包含列于表1或表2中氨基酸序列的轻链可变区，或者另一CCR8抗体的VL，其中
该抗体特异结合人CCR8。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括：
(a)列于表1或表2中的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)列于表1或表2中的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，或者另一CCR8抗体的轻链可变区CDR，其中该抗体特异结合人CCR8。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包括CCR8抗体的重链可 变区CDR2以及其他结合人CCR8的抗体的CDR，例如重链可变区CDR1和/或CDR3，和/或另一CCR8抗体的轻链可变区CDR1、CDR2和/或CDR3。
此外，领域内公知的是，CDR3结构域，独立于CDR1和/或CDR2，可单独确定抗体对同种抗原的结合特异性，且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如Klimka et al.,British J.of Cancer 83(2):252-260(2000)；Beiboer et al.,J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Rader et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8910-8915(1998)；Barbas et al.,J.Am.Chem.Soc.116:2161-2162(1994)；Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:2529-2533(1995)；Ditzel et al.,J.Immunol.157:739-749(1996)。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包含CCR8抗体的重链可变区的CDR2以及至少CCR8抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，或另一CCR8抗体的重链和/或轻链可变区的CDR3，其中该抗体或其抗原结合部分能够特异结合人CCR8。优选这些抗体或其抗原结合部分(a)竞争结合CCR8；(b)保留功能特性；(c)结合相同表位；和/或(d)具有与本申请CCR8抗体或其抗原结合部分相似的结合亲和力。在另一实施方式中，抗体或其抗原结合部分还可以包含本申请CCR8抗体或其抗原结合部分的轻链可变区CDR2，或者另一CCR8抗体的轻链可变区CDR2，其中该抗体或其抗原结合部分特异结合人CCR8。在另一实施方式中，本申请的抗体可以包括本申请CCR8抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区CDR1，或另一CCR8抗体的重链和/或轻链可变区CDR1，其中该抗体或其抗原结合部分特异结合人CCR8。
在另一实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合部分包含与本申请CCR8抗体或其抗原结合部分存在一个或多个保守修饰的重链和/或轻链可变区序列或CDR1、CDR2和CDR3序列。本领域知道，一些保守序列修改不会使抗原结合性消失。参见，例如，Brummell et al.,(1993)Biochem 32:1180-8。
因此，在一个实施方式中，抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区和轻链可变区分别包含CDR1、CDR2和CDR3，其中：
(a)重链可变区CDR1包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(b)重链可变区CDR2包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(c)重链可变区CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；和/或
(d)轻链可变区CDR1、和/或CDR2、和/或CDR3包含表1列出的序列，和/或其保守修改；且
(e)该抗体或其抗原结合部分特异结合人CCR8。
本申请的抗体具有一个或多个以下功能特征，例如对人CCR8的高亲和力和高特异结合性，以及相应的增强的对于CCR8阳性细胞例如CCR8阳性肿瘤细胞引发ADCC的能力。
在多个实施方式中，抗体或其抗原结合部分可以是例如小鼠源、嵌合、或人 源化的。
本文所用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸替换、添加和删除。可以通过领域内已知的标准技术，例如点突变和PCR介导的突变，将修饰引入本申请抗体或其抗原结合部分中。保守氨基酸替换是氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基进行替换。具有相似侧链的氨基酸残基组在领域内已知。这些氨基酸残基组包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本申请抗体或其抗原结合部分的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以用同侧链组的其他氨基酸残基替换，且得到的抗体可以使用本文所述的功能检测对其进行保留功能(即，上述的功能)的测试。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以以具备本申请CCR8抗体或其抗原结合部分的一个或多个VH/VL序列的抗体作为起始材料，制备成基因修饰的抗体。抗体可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如，在一个或多个CDR区和/或一个或多个骨架区)的一个或多个残基来进行基因修饰，以改善结合亲和力和/或增加与某些物种天然产生的抗体的相似性。例如，或者抗体可以通过修饰恒定区中的残基进行基因修饰，例如改变抗体的效应功能。
在某些实施方式中，CDR区植入可以用来基因修饰抗体的可变区。抗体或其抗原结合部分主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶标抗原进行相互作用。出于这个原因，CDR内的氨基酸残基比起CDR外的序列在个体抗体之间更加地多样。因为CDR序列负责主要的抗体-抗原相互作用，可以通过构建含有特定天然抗体的CDR序列植入到不同特性的不同抗体的骨架序列的表达载体，来表达模拟特定天然抗体的特性的重组抗体。
因此，本申请的另一实施方式涉及分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和/或轻链可变区，重链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3，轻链可变区包含具有本申请上述序列的CDR1、CDR2和CDR3。尽管这些抗体包含本申请单克隆抗体的VH和VLCDR序列，它们可以含有不同的骨架序列。
这样的骨架序列可以从包括种系抗体基因序列的公开DNA数据库或公开参考文献中获得。例如，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Vbase人种系序列数据库中获得。作为另一实施方式，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中得到。
通过使用本领域公知的称为空格(gap)BLAST的序列相似性搜索方法之一(Altschul et al.,(1997))，将抗体蛋白序列与蛋白序列数据库进行比较。
用于本申请抗体或其抗原结合部分的优选骨架序列是结构上与本申请抗体或其抗原结合部分所用的骨架序列相似的那些。VH CDR1、CDR2、和CDR3序列可以植入到与得到该骨架序列的种系免疫球蛋白基因具有相同序列的骨架区中，或者CDR序列可以植入到包含有与种系序列相比具有一个或多个突变的骨架区中。例如，在一些情况下，将骨架区中的残基进行突变是有益的，以保持或增强抗体的抗原结合性。
另一类的可变区修饰是将VH和/或VLCDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基进行突变，从而改进目标抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和力)。可以进行点突变或PCR介导的突变来引入突变，且其对于抗体结合或其他功能特性的影响可以在本领域所知的体外或体内检测中进行评价。优选地，引入本领域所知的保守修饰。突变可以是氨基酸替换、添加或缺失，但优选为替换。此外，通常改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个的残基。
此外，在另一实施方式中，本申请提供分离的CCR8单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其包含：(a)VH CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)VH CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)VH CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)VL CDR1区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)VL CDR2区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)VL CDR3区，包含本申请的序列，或一个、两个、三个、四个或五个氨基酸替换、缺失或添加的氨基酸序列。
本申请的基因改造抗体包括在VH和/或VL的骨架残基中做出基因修饰以例如改变抗体特性的那些。骨架修饰包括对骨架区的、或者甚至一个或多个CDR区的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，从而减少抗体的可能导致的免疫原性。该方法也称为“去免疫化”，在美国专利申请20030153043中有更加详细的描述。
此外，作为骨架或CDR区内修饰之外的另一种选择，本申请的抗体可以基因改造成在Fc区包括基因修饰，通常来改变抗体的一个或多个功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗体依赖的细胞毒性。此外，本申请的抗体可以进行化学修饰(例如，可以向抗体附加一个或多个化学功能基团)，或者修饰成改变其糖基化，来改变抗体的一个或多个功能特性。
在一个实施方式中，CH1的铰链区进行修饰，改变，例如增加或减少铰链区的 半胱氨酸残基的数量。该方法在美国专利5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区的半胱氨酸残基，来例如促进重链轻链的组装或增加/降低抗体的稳定性。
在另一个实施方式中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以增加或降低抗体的生物半衰期。更加具体地，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3连接区，从而抗体相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合而言，具有减弱的SpA结合力。该方法在美国专利6,165,745中有更详细的描述。
在另一实施方式中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化，来例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的糖化修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来达成。例如，可以做出一个或多个氨基酸替换，以消除一个或多个可变区骨架糖基化位点，从而消除该位置的糖基化。这样的去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。参见，例如美国专利5,714,350和6,350,861。
此外，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如岩藻糖残基量减少的低岩藻糖基抗体，或者具有增加的平分型GlcNac结构的抗体。改变的糖基化形式被证明能增加抗体的ADCC活性。这样的糖化修饰可以通过例如在糖基化系统改变的宿主细胞中表达抗体而进行。具有改变的糖基化系统的细胞在领域中已知，包括但不限于，Slc35c1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、共表达β-1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II的细胞系。它们可以用作表达本申请重组抗体的宿主细胞，以制备具有改变的糖基化的抗体
本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化(PEG化)。抗体可以PEG化，例如来增加抗体的生物(例如，血清)半衰期。为使抗体PEG化，抗体或其片段通常与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的反应性酯或醛类衍生物，在使一个或多个PEG基团附于抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，PEG化通过与反应性PEG分子(或类似的有反应性的水溶性聚合物)的酰化反应或烷化反应进行。本文中所用的术语“聚乙二醇”包括任何形式的用于衍生其他蛋白的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方式中，需要PEG化的抗体是去糖基化的抗体。PEG化蛋白的方法在领域内已知，且可以应用到本申请的抗体。参见，例如EPO 154316和EP 0401384。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以用它们的多种物理特性进行表征，以检测和/或区别其分类。
例如，抗体或其抗原结合部分可以在轻链或重链可变区包含一个或多个糖基化位点。这些糖基化位点可能引起增加的抗体免疫原性，或由于改变的抗原结合而引起改变的抗体pK值。糖基化已知发生在含有N-X-S/T序列的基序中。在一些情况下，优选CCR8抗体或其抗原结合部分不包含可变区糖基化。这可以通过选择不 在可变区包含糖基化基序的抗体或通过突变糖基化区域的残基来实现。
在优选实施方式中，抗体或其抗原结合部分不包含天冬酰胺异构位点。天冬酰胺的脱酰胺可能出现在N-G或D-G序列，创建出异天冬氨酸残基，其向多肽链中引入扭结并降低其稳定性(异天冬氨酸效果)。
各抗体或其抗原结合部分将具有独特的等电点(pI)，基本落在6-9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI通常落在7-9.5的pH范围内，而IgG4抗体的pI基本落在6-8的pH范围内。推测pI在正常范围外的抗体可能在体内条件下具有一些展开结构且不稳定。因此，优选CCR8抗体的pI值落在正常范围内。这可以通过选择pI在正常范围内的抗体或通过突变不带电的表面残基来实现。
本申请的单克隆抗体可以使用Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495的体细胞杂交(杂交瘤)技术进行制备。制备单克隆抗体的其他方法包括单B细胞抗体制备技术以及噬菌体展示技术。嵌合或人源化抗体制备方法也在领域内熟知。
本申请的抗体或其抗原结合部分还可以使用例如重组DNA技术结合基因转染方法，在宿主细胞转染瘤中生成(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。在一个实施方式中，将由标准分子生物技术得到的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入一个或多个表达载体中，从而基因与转录和翻译调控序列可操作地连接。在该情况下，术语“可操作地连接”是指抗体基因连接到载体中，从而载体内的转录和翻译控制序列行使它们既定的调控抗体基因转录和翻译的功能。
术语“调控序列”包括控制抗体基因转录或翻译的启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括引导在哺乳动物细胞中的高水平蛋白表达的病毒元件，例如得自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒的启动子和/或增强子，如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)和多瘤病毒。或者，可以使用非病毒调控序列，例如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调控元件由不同来源的序列构成，例如SRα启动子系统，其包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病I型病毒的长末端重复。表达载体和表达控制序列选为与所使用的表达宿主细胞相容。
抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到同一或不同的表达载体中。在优选实施方式中，可变区通过插入到已经编码所需亚型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中而构建全长抗体基因，从而VH与载体中的CH可操作地连接，VL与载体中的CL可操作地连接。或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以克隆到载体中，从而信号肽在阅读框内连接到抗体链基因的氨基端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除抗体链基因和调控序列外，本申请的重组表达载体可以携带其他序列，例如调控载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起始点)和可选择标记物基因。 可选择标记物基因可用于选择已导入载体的宿主细胞。例如，通常可选择标记物基因赋予已导入载体的宿主细胞以药物抗性，例如G418、潮霉素、或氨甲喋呤抗性。优选的可选择标记物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr宿主细胞的氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。多个形式的术语“转染”包括多种常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖转染等。尽管在原核或真核宿主细胞中表达本申请抗体或其抗原结合部分在理论上是可行的，优选抗体在真核细胞中表达，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达，因为真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装并分泌适当折叠且有免疫活性的抗体。
优选的用于表达本申请重组抗体的哺乳动物宿主细胞包括Slc35C1基因剔除细胞系、FUT8剔除细胞系、变异CHO细胞系Lec13、大鼠融合瘤细胞系YB2/0、包含特异性地针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系、共表达β-1,4-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III和高尔基体α-甘露糖苷酶II、中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR可选择标记物一起施用的dhfr-CHO细胞)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过将宿主细胞培养足以使得宿主细胞中抗体表达、或优选地足以使得使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的一段时间，从而制备抗体。抗体或其抗原结合部分可以使用蛋白纯化方法从培养基中回收。
在另一方面，本申请提供编码本申请抗体或其抗原结合部分的重链/轻链可变区或CDR的核酸分子。核酸可以存在整细胞中，在细胞裂解液中，或处于部分纯化或基本纯的形式。当通过标准技术从其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞核酸或蛋白中纯化出来后，核酸是“分离的”或“基本纯的”。本申请的核酸可以为例如DNA或RNA，且可能包含或可能不包含内含子序列。在优选实施方式中，核酸是cDNA分子。
本申请的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于由杂交瘤(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于(例如使用噬菌体展示技术)从免疫球蛋白基因库获得的抗体，编码这类抗体的核酸可以从基因库中收集。
优选的本申请核酸分子包括编码CCR8单克隆抗体的VH和VL序列或CDR的那些。一旦获得了编码VH和VL的DNA片段，这些DNA片段可以进一步通过标准的重组DNA技术进行操作，例如将可变区基因转变为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码VH或VL的DNA片段与编码另一蛋白的另一DNA片段，例如抗体恒定区或柔性接头，可操作地连接。术语“可操作地连接”是指两个 DNA片段连接在一起，从而两个DNA片段编码的氨基酸序列都在阅读框内。
编码VH区的分离DNA可以通过可操作地连接VH编码DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子而转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是优选为IgG1恒定区。对于Fab片段重链基因，编码VH区的DNA可以可操作地与仅编码重链CH1恒定区的另一DNA分子连接。
编码VL区的分离DNA可以通过可操作地连接VL编码DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子而转变成全长轻链基因。人轻链恒定区基因的序列在领域内已知，且包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增而获得。在优选实施方式中，轻链恒定区可以是κ和λ恒定区。
为创建scFv基因，编码VH和VL的DNA片段可以可操作地与编码柔性接头的另一片段连接，从而VH和VL序列可以作为连续的单链蛋白进行表达，其中VH和VL区域通过该柔性接头连接。
本申请的抗体或其抗原结合部分可以与治疗剂偶联，形成免疫偶联物(immunoconjugate)，例如抗体-药物偶联物(ADC)。合适的治疗剂包括细胞毒性分子、烷化剂、DNA小沟结合分子、DNA嵌入剂、DNA交联剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、核输出抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓扑异构酶I或II的抑制剂、热激蛋白抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗生素和抗有丝分裂剂。在ADC中，抗体和治疗剂可以通过接头交联，该接头可切割，例如肽类接头、二硫类接头或腙类接头。更优选地，接头是肽类接头，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可以如美国专利7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公开WO 02/096910；WO 07/038,658；WO 07/051,081；WO 07/059,404；WO 08/083,312；和WO 08/103,693；美国专利公开20060024317；20060004081；和20060247295中描述般进行制备。在本申请中，由于CCR8抗体能够与CCR8+细胞，特别是CCR8+Treg细胞，特异性结合并内化，其可以与细胞毒性分子偶联，使得细胞毒性分子可以特定地对CCR8+Treg细胞造成损伤，达到杀伤CCR8+Treg细胞的目的。特别地，细胞毒性分子可以经抗体内化而进入CCR8+Treg细胞中。细胞毒性分子可以是任何对靶细胞产生损害的小分子化合物或蛋白分子，例如微管蛋白聚合抑制剂、DNA损伤剂等。
另一方面，本申请涉及包含与至少一个其他功能分子如另一种肽或蛋白(例如，另一抗体或受体配体)相连接的本申请抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，以生成与至少两个不同结合位点或靶向分子结合的双特异性分子。术语“双特异性分子”包括具有三种或更多种特异性的分子。
双特异性分子可以以多种形式和尺寸出现。在尺寸谱的一端，双特异性分子 保持传统抗体形式，除其具有两个结合臂且各臂具有不同特异性外，替代具有两个特异性相同的结合臂的情况。在另一极端的是双特异性分子，由两个经肽链连接的单链抗体片段(scFv)构成，称为Bs(scFv)2构建体。中间尺寸的双特异性分子包括由肽类接头连接的两个不同的F(ab)片段。这些和其他形式的双特异性分子可以通过基因改造、体细胞杂交或化学法进行制备。
本申请还提供包含CCR8单链抗体scFv的嵌合抗原受体，该scFv包含本申请中所述的重链和轻链CDR、或重链和轻链可变区。
CCR8嵌合抗原受体可以包含(a)含有CCR8 scFv的胞外抗原结合域；(b)跨膜结构域；和(c)胞内信号转导结构域。
本申请还提供一种免疫细胞，如T细胞或NK细胞，其包含有本申请的嵌合抗原受体。
溶瘤病毒偏好地侵染并杀灭癌细胞。本申请的抗体或其抗原结合部分可以与溶瘤病毒一起使用。此外，编码本申请抗体或其抗原结合部分的溶瘤病毒可以引入受试者体内。
在另一方面，本申请提供一种组合物，其包含本申请的抗体或其抗原结合部分、核酸分子、表达载体、宿主细胞、免疫偶联物、嵌合抗原受体、免疫细胞、双特异抗体、和/或溶瘤病毒。在一些实施方式中，组合物为药物组合物，还包含药学上可接受的载体。组合物可以任选地包含一种或多种其他药学上的有效成分，例如另一抗肿瘤抗体、或免疫增强抗体，或者非抗体类抗肿瘤剂、或免疫增强剂。本申请的组合物可以与例如另一抗癌剂、或另一免疫增强剂联合使用。
药学组合物可以包含任何数量的赋形剂。可以使用的赋形剂包括载体、表面活性剂、增稠或乳化剂、固体粘合剂、分散或混悬剂、增溶剂、染色剂、矫味剂、涂层、崩解剂、润滑剂、甜味剂、防腐剂、等渗剂及其组合。合适赋形剂的选择和使用在Gennaro,ed.,Remington:The Science and Practice ofPharmacy,20th Ed.(LippincottWilliams&Wilkins 2003)中有教导。
优选地，药物组合物适合于静脉内、肌内、皮下、肠道外、脊柱或表皮施用(例如通过注射或推注)。基于施用途径的不同，有效成分可以包在材料中，以保护其不受酸和可能使其失活的其他自然条件的影响。“肠道外施用”是指不同于肠道和局部外用的方式，通常通过注射进行，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、膜内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜上和胸骨内注射和推注。或者，本申请的抗体可以通过非肠道外路径施用，例如外用、表皮施用或粘膜施用，例如鼻内、经口、阴道、直肠、舌下、或局部外用。
药物组合物可以为无菌水溶液或分散液的形式。它们也可以配制在微乳剂、脂质体或其他适于高浓度药物的有序结构中。
与载体材料一起制备成单剂型的有效成分的量将随着治疗主体和特定施用模式而变，且基本上而言是产生疗效的组合物的量。以百分比计，该量为约0.01-约99％的与药学上可接受载体结合的有效成分。
给药方案经调整提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用快速灌注剂，可以随时间推移施用多个分剂量，或者剂量可以随治疗情况的危急程度成比例降低或提高。特别有利的是，以方便施用和剂量均匀的剂量单位型配置肠道外组合物。剂量单位型是指物理上分开的单位，适于治疗主体的单次给药；各单位包含计算出来与药学载体一起产生所需疗效的预定量的有效成分。或者，抗体可以以缓释剂施用，这种情况下所需的施用频率降低。
对于抗体的施用，剂量可以为约0.001-100mg/kg宿主体重。示例性的治疗方案涉及每周施用一次。
“治疗有效量”的本申请药物组合物引起疾病症状严重程度的降低、无症状期频率和持续时间的增加。例如，对于带瘤受试者的治疗，“治疗有效量”优选地，与未治疗受试者相比，将肿瘤生长抑制至少约20％、更优选抑制至少约40％，甚至更优选地抑制至少约60％，且更优选地抑制至少约80％。治疗有效量的治疗抗体可以减小肿瘤尺寸，或者减轻受试者的症状，受试者可以是人或另一哺乳动物。
药物组合物可以是缓释试剂，包括植入体、和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解、生物相容的聚合物，例如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯、和聚乳酸。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1978。
药学组合物可以经医学设备来给药，例如(1)无针皮下注射设备(例如，美国专利5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；和4,596,556)；(2)微量输液泵(美国专利4,487,603)；(3)经皮给药设备(美国专利4,486,194)；(4)推注设备(美国专利4,447,233和4,447,224)；和(5)渗透设备(美国专利4,439,196和4,475,196)。
在某些实施方式中，本申请的组合物中的组分可以经配制，以确保合适的体内分布。例如，为确保本申请的治疗抗体或其抗原结合部分穿越血脑屏障，抗体可以配制在脂质体中，其还可以额外地包含靶向功能基团，以增强对特定细胞或器官的选择性输送。参见，例如美国专利4,522,811；5,374,548；5,416,016；和5,399,331。
本申请还涉及体内基因疗法，其中将编码本申请抗体或其抗原结合部分、免疫偶联物、或双特异性分子等的核酸分子直接引入受试者中。例如，将编码本申请抗体或抗原结合部分的核酸序列经由带有或不带有合适递送载体例如腺相关病毒载体的核酸构建体经局部注射而引入目标细胞。其他可供选择的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、和乳头状瘤病毒载体。病毒载体的体内物理转移可以通过所需核酸构建体或包含所需核酸序列的其他合适递送载 体的局部注射、脂质体介导的转移、直接注射(裸露的DNA)、或微粒轰击(基因枪)而实现。
本申请的药物组合物具有多种体外和外内应用，涉及例如癌症的治疗，或者更笼统地讲，用于癌症等疾病患者的免疫增强。药物组合物可以施用至人受试者，以例如体内抑制肿瘤生长。
考虑到本申请药物组合物的抑制肿瘤细胞增殖和存活的能力，本申请提供抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，包括向该受试者施用本申请的药物组合物，从而在该受试者中肿瘤生长被抑制。可以由本申请组合物治疗的肿瘤的非限制性例子包括但不限于实体瘤和血液瘤。实体瘤包括，但不限于，非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌、微卫星稳定的结直肠癌、和宫颈癌等，不管是原发还是转移的。血液癌可以为T细胞淋巴瘤，包括但不限于，皮肤T细胞淋巴瘤。此外，难治的或复发的恶性肿瘤也可能可以用本申请的药物组合物进行治疗。
本申请提供本申请药物组合物与一种或多种其他抗体或非抗体类治疗剂一起施用的联合疗法，其能有效抑制受试者中的肿瘤生长。在一个实施方式中，本申请提供在受试者中抑制肿瘤生长的方法，包括向受试者施用本申请药物组合物以及一种或多种其他抗体，例如PD-1抗体。在某些实施方式中，受试者是人。在另一个方面，本申请提供癌症治疗方法，其中本申请的药物组合物与化疗剂一起施用，化疗剂可以是细胞毒性剂。其他可以与本申请药物组合物联合的疗法包括但不限于免疫原性剂施用、白介素2(IL-2)施用、放疗、手术或激素去除。
本申请的组合物还可以用于在受试者中解除或缓解免疫抑制。特别地，本申请还提供一种在受试者中解除或缓解免疫抑制的方法，包括向受试者施用有效量的本申请药物组合物。在一些实施方式中，该方法用于解除或缓解肿瘤微环境中的免疫抑制，包括向肿瘤位点施用有效量的本申请药物组合物。
本申请的组合物还可以用于增强免疫应答。具体地，本申请提供一种在受试者中增强免疫应答的方法，包括向受试者施用有效量的本申请药物组合物。
本文讨论的治疗剂的组合可以作为在药学可接受载体中的单一组合物同时施用，或者作为分开的组合物同时施用，其中各药剂处于药学可接受载体中。在另一个实施方式中，治疗剂的组合可以按序施用。
此外，如果进行多次联合疗法施用，且药剂按序施用，则在各时间点的按序施用的次序可以反转或保持相同，按序施用可以与同时施用或其任何组合相结合。
本申请的各方面和实施方式将参照附图和以下实施例进行讨论。其他方面和实施方式对于本领域技术人员是清楚的。在本文中描述的所有文献通过引用的方式全部并入本文。尽管本申请已经结合示例性实施方式进行了描述，很多等同修改和变化在给出本申请时对于本领域技术人员是清楚的。因而，本申请的示例性实施方式是示例性的，非限制性的。可以对所述实施方式做出多种变化，而不脱 离本申请的宗旨和范围。
实施例
以下实施例仅以示例的方式给出，不以任何方式限制本发明。
实施例1.产生抗人CCR8单克隆抗体(mAb)
为产生针对人CCR8的抗体，用多种抗原，包括编码人CCR8的DNA/mRNA、过量表达人CCR8的细胞系，免疫包括BALB/C、A/J或SJL在内的野生型雌性小鼠。具体地，将上述抗原单独或组合用于免疫。例如，将编码CCR8的DNA质粒(GenScript)和过表达人CCR8的CHO-K1细胞系(CHO-K1/hu-CCR8，Cat#:RD00915，GenScript)一起用于免疫。每两周通过Helios基因枪系统(Bio-Rad)将DNA质粒(6μg)包被的金子弹注射到小鼠皮下或腹腔三次，然后腹腔内(i.p)注射CHO-K1/hu-CCR8细胞(每只小鼠注射5×106个细胞)。或者，小鼠每两周注射三次20/40μg的mRNA LNP(TheraRNA)。
同时，为评估免疫动物的血清效价并筛选/鉴定CCR8特异性抗体，合成人和猴的CCR8编码基因，插入到pLVX-Puro载体中，进行慢病毒包装，并感染HEK293细胞，随后用嘌呤霉素进行筛选，分别制备出基于HEK293细胞系的人和猴CCR8过表达稳定细胞系，即HEK293/hu-CCR8细胞(Cat#:RD00953，GenScript)和HEK293/cyno CCR8细胞(Cat#:RD01063，GenScript)。
免疫小鼠经过血清效价评估后，选取具有最高人CCR8抗体滴度的小鼠，取其淋巴结和/或脾脏以分离淋巴结细胞和/或脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤。具体地，将分离的脾细胞和/或淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0以3：1的比例混合，然后通过电融合形成融合细胞。接着将融合后的细胞置于96孔板中，并在含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)的选择性培养基中孵育两周以产生杂交瘤。使用HEK293/hu-CCR8细胞，通过流式细胞术从每个杂交瘤孔的上清液中筛选抗人CCR8抗体。然后通过限制稀释对阳性杂交瘤进行亚克隆，以获得单个克隆。
使用流式细胞术来分析单克隆上清液中表达的抗体与过表达人/猴CCR8的HEK293细胞结合的能力。首先培养并收获过表达人/猴CCR8的HEK293细胞，即HEK293/hu-CCR8和HEK293/cyno CCR8，并与抗CCR8抗体单克隆上清孵育。然后用流式细胞仪(BD Canto II)分析样品，BMS-986340(根据WO2021194942A1的公开内容制备)和GS-1811(根据WO2021163064A2的公开内容制备)这两个抗体作为阳性对照抗体，未经工程化的亲本HEK293细胞用作FACS结合测定的阴性对照细胞。
初筛结果显示，由本申请中单克隆154G7C3和117G9F9产生的抗体只与表达人CCR8的细胞结合，125C1E6和224E9A3产生的抗体与表达人CCR8和猴CCR8的HEK293细胞均有结合性。对125C1E6、154G7C3、117G9F9和224E9A3这几个克隆进行测序，并选择独特的克隆用于后续研发。
实施例2.嵌合抗体的制备
将筛选并测序的小鼠源重链和轻链可变区的编码序列分别融合到人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区编码序列的N端，构建到表达质粒pTT5中信号肽的下游位置，进行分泌表达。其中，各重链和轻链可变区的氨基酸序列列于表1，人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37和38所示。
表1.本申请单克隆抗体的重链和轻链可变区以及CDR信息
人IgG1重链恒定区:
人κ轻链恒定区:
使用PEImax 40,000(Cat#:24765-1，Polysciences,Inc.)，将装载有各抗体的重链和轻链编码序列的质粒组合转染到CHO-3E7细胞中，用于抗CCR8抗体的瞬时表达。24小时后，通过添加TryptoneN-1补充剂来增强表达/分泌。在37℃、5％CO2条件下震荡培养6天后，收集上清液，并通过含有蛋白A琼脂糖凝胶层析柱纯化抗体。然后将纯化的抗体存储于PBS溶液中用于后续的分析验证。
实施例3.嵌合抗体的体外活性鉴定
流式细胞术检测抗体与过表达人CCR8的细胞的结合
为进一步研究本申请抗体对人CCR8的结合力和结合特异性，将于100μl培养基中的1×105个HEK293/hu-CCR8细胞与50μl本申请抗CCR8嵌合抗体于4℃在ELISA板中孵育1小时，其中各抗体在细胞/抗体混合液中呈3倍梯度稀释，起始终浓度为300nM，抗体BMS-986340和GS-1811用作阳性对照，hIgG1用作阴性对照。ELISA板PB清洗2次后，每孔加入荧光团(iFluor 647)标记的羊抗人IgG(H+L)(Jackson，109-605-088)，4℃孵育0.5小时。然后用流式细胞术对样品进行分析，并生成以平均荧光强度(荧光强度几何平均值)为纵坐标、抗体浓度为横坐标的抗体-抗原结合曲线。使用GraphPadPrism v6.02软件用原始数据绘图，并确定出EC50。
在这些抗CCR8嵌合抗体中，如图1A和1B所示，本申请的单克隆抗体，包括125C1E6、154G7C3、117G9F9和224E9A3，均与过表达人CCR8的细胞结合，与阳性对照BMS-986340和GS-1811相比，结合力相当。
流式细胞术检测抗体与过表达猴CCR8的细胞的结合
进一步测试抗CCR8嵌合抗体与猴CCR8的交叉反应性，使用与上述相同的方法步骤，除使用HEK293/cyno-CCR8细胞替代HEK293/hu-CCR8细胞外。
结果如图2所示，224E9A3抗体以与BMS-986340相当的高结合力与表达猴CCR8的细胞结合，而GS-1811在FACS检测中没有显示出与表达猴CCR8细胞的结合。
通过检测CCR8介导的钙流进行CCR8-CCL1阻断分析
配体CCL1与趋化因子受体CCR8的结合可以诱导CCR8介导的钙内流，因而可以通过测定细胞钙流量来确定抗CCR8抗体对CCL1-CCR8信号传导的阻断力。
简言之，将20μl 7.5×105/ml的CHO-K1/hu-CCR8细胞接种在384孔测定板中，并于37℃培养16小时。取10μl抗体添加到测定板中，使得各抗体在细胞/抗体混合液中呈5倍梯度稀释，起始终浓度为1μM，共8个浓度点，其中对于117G9F9而言，使其在细胞/抗体混合液中呈5倍梯度稀释，起始终浓度为0.4μM，共8个浓度点。并加入钙4检测试剂盒中的工作染料溶液(Cat#:R7446，Molecular Devices)，于37℃避光孵育1小时。BMS-986340和GS-1811作为阳性对照。加入35μl 10nM重组人CCL1(GenScript，Z02911)后，通过FLIPRTM TETRA系统(Molecular Devices)测量钙通量荧光信号，并通过GraphPadPrism分析数据以获得IC50值。
结果图3所示，根据IC50值，与阳性对照相比，本申请的抗CCR8抗体分子显示出更好的对于CCL1-CCR8信号传导的阻断活性。
抗CCR8抗体诱导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
使用基于报告基因的ADCC生物活性测定，来评估抗CCR8嵌合抗体引发ADCC的活性。
简言之，培养并收获CHO-K1/hu-CCR8靶细胞，以1×104/孔的细胞密度接种到96孔板中，其中细胞处于40μl培养基中。向96孔板加入20μl本申请抗体或阳性对照(BMS-986340和GS-1811)，使得各抗体在细胞/抗体混合液中呈10倍梯度稀释，起始终浓度为10μg/ml(约60nM)，共7个浓度点，并将孔板于37℃、5％CO2条件下孵育30分钟。接着，向96孔板加入40μl 1.5×106/ml作为效应细胞的GS-J2C/CD16A细胞(ADCC报告细胞系，Cat#:RD00830，GenScript)，于37℃、5％CO2孵育6小时。取出96孔板，用分析试剂盒分析ADCC报告细胞系的活化。发光数据由PheraStar(BMG)检测，用于ADCC报告基因激活信号分析，并通过GraphPadPrism 6.0进行分析。
测定结果如图4所示，与阳性对照相比，本申请的抗CCR8嵌合抗体均能以相当或更高的活性引发对于CCR8+细胞的ADCC。
实施例4.抗体的人源化
对于117G9F9、125C1E6和154G7C3的人源化，将这些小鼠源抗体分别与人Ig种系序列比对，以获得总体最佳匹配的序列。将获得的与小鼠源抗体具有高度同源性的人种系序列作为受体，并将小鼠源抗体的CDR移植到受体框架中。然后对新产生的抗体进行序列分析，以确定新构建序列中是否存在潜在的翻译后修饰的高风险位点，包括脱酰胺、异构化、氧化和可能影响抗体的结合活性和稳定性的不成对半胱氨酸残基。
参照实施例2中的方法步骤，合成编码人源化抗体的重链和轻链可变区的DNA序列，分别融合到人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区编码序列的N端，构建到表达质粒pTT5中信号肽的下游位置，进行分泌表达。其中，各重链和轻链可变区的氨基酸序列列于表2，人IgG1重链恒定区和人κ轻链恒定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:37和38所示。
表2.人源化抗体的序列信息
实施例5.人源化抗体的活性鉴定
流式细胞术检测人源化抗体与过表达人或猴CCR8的细胞的结合力
根据实施例3中的方法步骤，测试人源化抗体与过表达人或猴CCR8的细胞、以及HEK293亲本细胞的结合力和结合特异性。
图5A示出人源化抗体与过表达人CCR8的细胞的抗体-抗原结合曲线。可以看出，本申请的人源化抗体均对过表达人CCR8的细胞显示出较高的结合力。特别地，125C1E6-VH1.1-VL1和125C1E6-VH3-VL1的结合力比BMS-986340和GS-1811更高，具体表现为更高的跨度值和/或更小的EC50值。
图5B示出人源化抗体与过表达猴CCR8的细胞的抗体-抗原结合曲线。可以看到，125C1E6-VH1.1-VL1和125C1E6-VH3-VL1均以比BMS-986340高得多的结合力与表达猴CCR8的细胞结合，GS-1811则检测不到与猴CCR8的结合。
图5C示出人源化抗体与HEK293细胞的抗体-抗原结合曲线。两个阳性对照BMS-986340和GS-1811对亲本HEK293细胞表现出弱结合性，而125C1E6-VH1.1-VL1和125C1E6-VH3-VL1则不与HEK293细胞结合。
人源化抗体诱导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
参照实施例3中的方法步骤，评估人源化抗体引发ADCC的活性，其中人源化抗体和阳性对照在细胞/抗体混合液中均呈10倍梯度稀释，起始终浓度为10μg/ml。
结果如图6A和6B所示，所有人源化抗CCR8抗体针对CCR8+细胞引发ADCC的活性，与阳性对照相当。
通过检测CCR8介导的钙流进行CCR8-CCL1阻断分析
参照实施例3中的方法步骤，通过测定细胞钙流量来确定人源化抗体对CCL1-CCR8信号传导的阻断力，其中各抗体在细胞/抗体混合液中呈5倍梯度稀释，起始终浓度为1μM，共8个浓度点。
如图7A和7B所示，125C1E6-VH1.1-VL1、125C1E6-VH3-VL1以及154G7C3-VH1.1-VL2均显示出与阳性对照GS-1811相当或更好的体外CCR8-CCL1阻断活性。
通过IncuCyte活细胞分析系统进行抗体内化分析
通过Incucyte实时活细胞系统(Sartorius)分析抗体的内化情况。
简言之，将50μl 2×105/ml的CHO-K1/hu-CCR8细胞接种在96孔测定板中，并于37℃培养16小时。同时，在内化测定之前对抗体进行标记。具体地，将人源化抗体与Incucyte FabfluorpH染料分别用完全生长培养基(90％F12K培养基+10％胎牛血清)2倍梯度稀释，起始浓度4μg/ml，8个浓度点；之后将稀释后的人源化抗体与Incucyte Fabfluor pH染料以1:1体积比混合，在96孔圆形底板中于37℃避光孵育15分钟。向96孔测定板加入50μl标记的人源化抗体，在Incucyte S3细胞培养箱中37℃孵育24小时。通过测量CHO-K1/hu-CCR8细胞中的红色荧光来检测抗体内化率。BMS-986340和GS-1811作为阳性对照，人IgG1作为阴性对照。原始数据从Incucyte 2022B导出，并使用Incucyte2022B、Microsoft Office Excel 2016和GraphPad Prism 6进行分析，以每张荧光图的整体荧光强度(RCU×μm2)和抗体浓度作图。
如图8所示，人源化抗体125C1E6-VH1.1-VL1和125C1E6-VH3-VL1均显示出比阳性对照更高的内化活性。此外，人源化抗体154G7C3-VH1.1-VL2和117G9F9-VH2.1-VL1显示出与阳性对照相当的内化活性。
实施例6.抗原表位竞争结合测定
为确定人源化抗体是否与阳性对照结合相同或相似的表位，经FACS测定各抗 体竞争结合HEK293/hu-CCR8细胞的情况。
简言之，首先将终浓度为0.45nM的含有hIgG1-Fc(即SEQ ID NO:37)的125C1E6-VH3-VL1抗体与1×105个HEK293/hu-CCR8细胞4℃孵育0.2小时，溶液体积为100μl。随后加入50μl含小鼠Fc的抗体，包括BMS-986340-mIgG2a(将BMS-986340的重链恒定区替换为SEQ ID NO:39的小鼠IgG2a重链恒定区，轻链恒定区替换为SEQ ID NO:40)、GS-1811-mIgG2a(将GS-1811-mIgG2a的重链恒定区替换为SEQ ID NO:39，轻链恒定区替换为SEQ ID NO:40)、和125C1E6-mIgG2c(从杂交瘤上清液中纯化出来的)、或小鼠IgG1，各抗体在细胞/抗体混合液中呈3倍梯度稀释，起始终浓度为300nM，4℃孵育0.8小时。然后使用荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗人IgG(H+L)来检测与细胞表面结合的125C1E6-VH3-VL1。数据通过GraphPadPrism 6.0进行分析。结果显示在图9A中。
相似地，通过首先加入终浓度0.28nM的BMS-986340-mIgG2a，后加入竞争抗体125C1E6-VH3-VL1、BMS-986340或人IgG1；或首先加入终浓度0.28nM的GS-1811-mIgG2a，后加入125C1E6-VH3-VL1或人IgG1，来进一步确定几个抗体之间的抗原表位竞争，其他条件同上，各竞争抗体在细胞/抗体混合液中呈3倍梯度稀释，起始终浓度为300nM。使用荧光团(iFluor 647)标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)来检测与细胞表面结合的BMS-986340-mIgG2a或GS-1811-mIgG2a。结果分别示于图9B和图9C。
mIgG2a重链恒定区：
轻链恒定区：
如图9A所示，BMS-986340-mIgG2a和GS-1811-mIgG2a均可以与125C1E6-VH3-VL1竞争CCR8结合位点。图9B和图9C所示的结果与图8A保持一致。可见，125C1E6抗体所结合的抗原表位与两个阳性对照的CCR8表位存在重叠的情况。
尽管本申请已经结合一个或多个实施方式进行了描述，应当理解的是，本申请并不受限于这些实施方式。本申请中的描述意在涵盖所有变体形式以及等同物，均包含在所附权利要求的主旨和范围内。所有在本文中引用的文献通过引用的方 式全部并入本文。

Claims (29)

  1. 一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其能够与CCR8特异性结合，包含：
    i)重链可变区，其包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3，其中VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3分别包含(1)SEQ ID NO:1、2和3；(2)SEQ ID NO:7、8和9；(3)SEQ ID NO:13、2、和14；或(4)SEQ ID NO:18、19和20所示的氨基酸序列，或包含与上述氨基酸序列相比在各CDR具有1-3个氨基酸替换的氨基酸序列；和/或
    ii)轻链可变区，其包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含(1)SEQ ID NO:4、5和6；(2)SEQ ID NO:10、11和12；(3)SEQ ID NO:15、16和17；或(4)SEQ ID NO:21、16和17所示的氨基酸序列，或包含与上述氨基酸序列相比在各CDR具有1-3个氨基酸替换的氨基酸序列。
  2. 根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3分别包含(1)SEQ ID NO:1、2、3、4、5和6；(2)SEQ ID NO:7、8、9、10、11和12；(3)SEQ ID NO:13、2、14、15、16和17；或(4)SEQ ID NO:18、19、20、21、16和17所示的氨基酸序列。
  3. 根据权利要求1或2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区包含与SEQ ID NO:22、24、26、27、29、31、33、或35具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中轻链可变区包含与SEQ ID NO:23、25、28、30、32、34、或36具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和轻链可变区分别包含与(1)SEQ ID NO:22和23；(2)SEQ ID NO:24和25；(3)SEQ ID NO:26和25；(4)SEQ ID NO:27和28；(5)SEQ ID NO:29和30；(6)SEQ ID NO:31和32；(7)SEQ ID NO:33和34；或(8)SEQ ID NO:35和36具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
  7. 根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链恒定区为IgG1重链恒定区。
  8. 根据权利要求7所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中重链可变区为包含SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的人IgG1重链恒定区。
  9. 根据权利要求6所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中轻链恒定区为κ轻链恒定区。
  10. 根据权利要求9所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中轻链恒定区为包含SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的人κ轻链恒定区。
  11. 根据权利要求1-10中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其为鼠源、嵌合或人源化的。
  12. 根据权利要求1-11中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其i)能够与人CCR8结合，ii)能够阻断CCR8-CCL1结合/相互作用，iii)能够由CCR8+细胞内化，vi)能够引发对于CCR8+细胞的抗体依赖型细胞介导的细胞毒性，和/或v)具有体内抗肿瘤效果。
  13. 一种免疫偶联物，其包含i)权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，和ii)细胞毒性分子，其中i)与ii)经接头或直接连接。
  14. 一种双特异性分子，其包含i)权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分，和ii)第二功能基团，其中i)和ii)与不同抗原或同一抗原的不同表位结合，且i)和ii)相连接。
  15. 一种嵌合抗原受体，其包含i)胞外抗原结合域，ii)跨膜结构域，和iii)胞内信号转导结构域，其中胞外抗原结合域包含权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
  16. 一种免疫细胞，包含权利要求15所述的嵌合抗原受体。
  17. 一种溶瘤病毒，其表达权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。
  18. 一种核酸分子，其编码权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求13所述的免疫偶联物、权利要求14所述的双特异性分子或权利要求15所述的嵌合抗原受体。
  19. 一种表达载体，其包含权利要求18所述的核酸分子。
  20. 一种宿主细胞，其包含权利要求19所述的表达载体，或在其基因组内整合有权利要求18所述的核酸分子。
  21. 一种组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的抗体或其抗原结合部分、权利要求13所述的免疫偶联物、权利要求14所述的双特异性分子、权利要求15所述的嵌合抗原受体、权利要求16所述的免疫细胞、权利要求17所述的溶瘤病毒、权利要求18所述的核酸分子、权利要求19所述的表达载体或权利要求20所述的宿主细胞。
  22. 根据权利要求21所述的组合物，其为药物组合物，还包含药学上可接受的载体。
  23. 根据权利要求21或22所述的组合物，其还包含PD-1抗体。
  24. 权利要求21-23中任一项所述的组合物在制备一种用于治疗或缓解CCR8相关癌症的药物中的用途。
  25. 根据权利要求24所述的用途，其中CCR8相关癌症为实体瘤。
  26. 根据权利要求25所述的用途，其中实体瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、胃癌、微卫星稳定的结直肠癌或宫颈癌。
  27. 根据权利要求24所述的用途，其中CCR8相关癌症为T细胞淋巴瘤。
  28. 一种用于制备CCR8抗体的方法，包括i)向动物体施用能够表达CCR8蛋白的DNA分子、能够表达CCR8蛋白的RNA分子、和/或能够过表达CCR8蛋白的细胞，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。
  29. 根据权利要求28所述的方法，其中i)向动物体施用能够表达CCR8蛋白的RNA分子，ii)收集该动物体的淋巴结细胞和/或脾细胞，以及iii)使该淋巴结细胞和/或脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。
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