CN1210568C

CN1210568C - Bt晶体蛋白CrylAc放射免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法

Info

Publication number: CN1210568C
Application number: CN 02148811
Authority: CN
Inventors: 潘家荣; 张维; 张�杰; 乔艳红; 宋平; 李锦波; 林敏�; 黄大昉
Original assignee: INSTITUTE FOR APPLICATION OF ATOMIC ENERGY CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: INSTITUTE FOR APPLICATION OF ATOMIC ENERGY CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2005-07-13
Anticipated expiration: 2022-11-18
Also published as: CN1501082A

Abstract

本发明提供了一种Bt晶体蛋白Cry 1Ac放射免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法。本发明用戊二醛、Aerosol 604和四氧化三铁制备磁性微粒，并与Bt晶体蛋白Cry 1Ac抗体连接，在磁场下Bt晶体蛋白Cry 1Ac与Bt晶体蛋白Cry 1Ac抗体特异反应加快，测样时间缩短到40分钟。本发明还用磁性微粒连接IgG制备免疫分离剂，在磁场的作用下，抗原抗体复合物自动沉淀，不需离心即可分离。

Description

Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测试剂盒及其制备方法和检测方法

技术领域：

本发明涉及Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测试剂盒及其制备方法，本发明还涉及一种Bt晶体蛋白放射免疫检测方法。

背景技术：

转Bt基因植物具有很好的抗虫性，所以Bt基因被广泛地转入棉花、玉米等农作物中。Bt晶体蛋白是转Bt基因生物的Bt基因表达产物，是鉴定抗虫性的重要指标，其快速、准确测定，为育种、转基因植物的虫害管理和基因标识提供技术支撑。

现有技术所用的酶联免疫检测Bt晶体蛋白方法存在如下的缺陷：1、检测结果不稳定，因酶促反应易受反应条件的影响，；2、反应时间长，测样时间长达24小时以上(包括包被时间)；3、操作步骤多，较为繁琐。

放射免疫法检测Bt晶体蛋白，虽测定结果稳定，但传统放射免疫法需离心分离抗原-抗体复合物，操作繁琐，且检测时间最短也需3小时。现有的较新技术放射免疫法抗原抗体反应是在固相界面进行，不需离心，但是反应时间比传统放射免疫方法还长。

因此，现有技术的检测Bt晶体蛋白方法均不能达到快速、简便的要求。

发明内容：

本发明的目的是建立一种快速、简便的Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测方法，并提供一种快速、简便的Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测试剂盒。

本发明提供了一种用于检测Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测试剂盒，该盒包括有磁性微粒联接的Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体和磁性微粒联接的羊抗兔IgG。

所述检测试剂盒中还包括本领域技术人员进行Bt晶体蛋白放射免疫检测所用的其它常规试剂，如Bt晶体蛋白Cry1Ac标准溶液、¹²⁵I Bt晶体蛋白Cry1AC、质量控制样品及蛋白提取液等。

上述用于检测Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测试剂盒的制备方法如下：

1、制备超顺磁微粒，并与Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体联接，提供磁性微粒联接的Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体；

2、制备磁性联接羊抗兔IgG，形成磁性微粒联接的羊抗兔IgG；

所述磁性微粒联接的Bt晶体蛋白的制备方法是：

将Aerosol 604的戊二醛溶液与Fe₃O₄水溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100mm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与Bt晶体蛋白Cry1Ac抗血清混合、再经离心得到磁性微粒联接的Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体；

所述磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备方法是：

将Aerosol 604的戊二醛溶液与铁粉溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100nm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与羊抗兔IgG混合、再经离心得到磁性微粒联接的羊抗兔IgG。

其中磁性微粒联接的Bt晶体蛋白和磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备中，所述碱性为pH10-12。所述将混合液调制为碱性后，进行氮气脱氧后振荡，使反应均匀、完全。

上述检测试剂盒中其它成分均为本领域公知的Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测所用的其它常规试剂，可以外购或按文献配制，详见实施例。

将所述检测试剂盒中所有成分按一定量装入盒中，即可。

用本发明的检测试剂盒进行Bt晶体蛋白放射免疫检测的方法是，在若干放射免疫管中分别加入待测样品、Bt晶体蛋白Cry1Ac标准溶液和质量控制样品，然后对每一放射免疫管分别进行如下操作：

1.加入上述磁性微粒联接的Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体；

2.加入¹²⁵I-Bt晶体蛋白Cry1Ac，混匀；

3.将放射免疫管放置在磁分离器的管架上，连接磁分离器底部磁铁25分钟，再移走磁铁；

4.加入上述磁性微粒联接的羊抗兔IgG，振荡摇匀。再连接磁分离器底部磁铁5分钟；

5.倒出溶液，加缓冲液冲洗一次后测沉淀放射性计数(cpm)；

6.计算各管的结合率，作标准曲线，根据标准算出待测样品的含量。

在外加磁场的作用下，所制备的超顺磁颗粒吸附抗体，可加速与抗原的免疫反应，反应时间30分钟可达到平衡。

免疫反应平衡后，在反应容器底部放置磁铁，磁二抗(磁性联接羊抗兔IgG)可与抗原-抗体复合物(Bt晶体蛋白Cry1Ac抗原与Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体复合物)结合并自动沉淀，不用离心即可进行分离。

本发明在现有的放射免疫检测技术的基础上进行改进，所建立的检测方法和检测试剂盒可提高抗原抗体反应速率，减少测样时间，测定时间小于40分钟(达到免疫反应平衡时间30分钟)。本发明操作简便，抗原-抗体复合物为液-液反应，且分离时无需离心；制样简单：蛋白只需粗提，不用离心分离。种子样品不用去酚和脱脂。

具体实施方式：

实施例1

1、Bt晶体蛋白Cry1Ac的提取、纯化

培养基：

液体LB(参见金冬雁等翻译，原著J.萨姆布鲁克，1992。分子克隆实验指南第二版，科学出版社)：Tryptone 1％，Yeast extract 0.5％，NaCl 1％，pH7.0，15磅，20min。

液体Z氏(参见左雅慧等，1999，几种Bt培养基的筛选和晶体蛋白纯化方法初探，植物保护，25(3)，31-31)：蛋白胨1％，酵母粉0.2％，可溶性淀粉0.3％，葡萄糖0.2％，K₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 1％，CaCO₃ 0.2％，pH7.0，15磅，20min。

活化菌株：

挑取单菌落(HD-73)于LB液体培养基中，37℃，200rpm，摇瓶培养20-24小时。

提取步骤：

按1％的接菌量将活化的菌液转接Z氏液体培养基中，37℃摇瓶培养36-48小时。离心，5000rpm，5min，收集所有菌体，Na₂CO₃裂解4-6hrs，0℃；aAc沉淀4hrs，0℃；离心，12000rpm，10min，4℃；收集沉淀，加适量Na₂CO₃溶解沉淀，0℃；DS-PAGE电泳定量检测，获得Bt Cry蛋白(130KD)

Trypsin酶解Bt Cry蛋白：

取1mlBt Cry蛋白液，按蛋白∶Trypsin＝50∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解8小时得到酶解产物(Bt Cry蛋白的毒素部分60KD)。

Bt Cry蛋白的活性检测：

Bt Cry蛋白对小菜蛾、棉铃虫均有较高的杀虫活性。

2、抗血清制备

把Bt蛋白配制成0.6mg/ml溶液，加等量福氏完全试剂乳化，在新西兰白兔背部皮内多点注射，每两周加强免疫一次，免疫剂量减半，二个月后静脉取血，用放射免疫法测定抗血清。当抗血清滴度达到1∶5000以上时，可全部取血，取血清，离心进行纯化。(所得抗血清滴度1∶10000)

3、标准配置

取纯品Bt晶体蛋白Cry1Ac，用缓冲液配成标准系列0，5ng/ml，10ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，500ng/ml，1000ng/ml。

4、超顺磁微粒的研制与抗体联接

(1)用戊二醛将Aerosol 604配成1％。溶液。

(2)用少量蒸馏水溶解一定量Fe₃O₄粉末，加入100ml上述溶液中。混合液置入一个带盖的溶液中，滴加10N NaOH至pH11。

(3)用氮气使其脱氧后，将容器盖紧，并将其放到振荡器中。

(4)在室温下振荡24小时，每隔一定时间用10N NaOH调节pH，使维持pH11。

(5)将混合物对水充分透析。

(6)以2000×g离心30分钟，使微粒沉淀。

(7)将微粒悬在蒸馏水中。

(8)加入戊二醛，使微粒活化1小时。

(9)离心，弃上清，加入抗血清(Tris-HCl缓冲液稀释)，在室温下作用8小时。

(10)离心，弃上清，用PBS洗涤，用BSA液封团未被联接的区域。

(11)去除BSA液，洗涤。在4℃下保存。

5、磁分离剂研制

制备方法同4相似，只是把3％的铁液代替Fe₃O₄溶液，用羊抗兔IgG代替抗血清。

6、Bt晶体蛋白Cry1Ac的¹²⁵I标记

将185MbqNa¹²⁵I与100μl的Bt晶体蛋白Cry1Ac溶液(30μ)，用氯胺T法标记，经凝胶层析分离，收集125I-蛋白峰。用0.1M，pH7.4PBS稀释至200μl中含有2000cpm。

7、组装

(1)抗体最适量的确定：选取结合率为50-60％时的抗体浓度为实用浓度；

(2)标准调制：按表I顺序加样(从左至右)，用对数纸作结合率-浓度曲线，求相关系数。

当相关系数小于0.9990时，调整标准浓度。

表1加样顺序 (单位：μl)

试管号	名称	零标准	标准品	样品	抗血清	¹²⁵I-PRL	磁场下37℃，30分钟	ISR	磁场下5分钟
试管号	名称	零标准	标准品	样品	抗血清	¹²⁵I-PRL		ISR		1-2	NSB	200			100	1000
3-4	S₀	100			100	100		1000		1-2	NSB	200			100	1000
3-4	S₀	100			100	100		1000		5-16	S₁-S₆		100	100	100	1000
17-22	QC		100		100	100				5-16	S₁-S₆		100	100	100	1000

(3)把抗体、¹²⁵I标记抗原、分离剂、标准和质控(由纯品配制，浓度分别为10ng/ml，400ng/ml和1000ng/ml)，放置包装盒内。

实施例2试剂盒组成

1.Bt晶体蛋白Cry1Ac标准溶液(0.05M磷酸缓冲液pH7.4)系列，浓度分别为1000ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、1ng/ml和0ng/ml，共7瓶，各1ml。

2.磁性微粒联接的Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体溶液(Tris-HCl缓冲液)一瓶，10ml。兰色。

Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体的制备参见文献(李振甲韩春生王建勋主编，实用放射免疫学。科学技术出版社pp21-40)。

磁性微粒联接的Bt晶体蛋白Cry1Ac抗体的制备：Aerosol 604的1％戊二醛溶液与Fe₃O₄水溶液混合，并调制为一定的pH后，经氮气脱氧后振荡24小时(保持pH)，对水透析、离心，得到100nm微粒。微粒经过戊二醛活化后离心，沉淀物与Bt晶体蛋白Cry1Ac抗血清(Tris-HCl缓冲液)混合，在室温下作用8小时。经离心、磷酸缓冲液洗涤、牛血清白蛋白封闭即得。

3.¹²⁵I Bt晶体蛋白Cry1AC一瓶，10ml，红色，每100μl放射性活度约20000cpm。制备方法参见文献(李振甲韩春生王建勋主编，实用放射免疫学。科学技术出版社pp41-59。

4.磁分离剂(磁性微粒联接的羊抗兔IgG)一瓶，100ml，黑色。其主要成分为磁性微粒联接的羊抗兔IgG。

羊抗兔IgG：购自北京欣经科生物技术有限公司，产品号：10227。

磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备：Aerosol 604的1％戊二醛溶液与铁粉溶液混合，并调制为一定的pH后，经氮气脱氧后振荡24小时(保持pH)，对水透析、离心，得到100nm微粒。微粒经过戊二醛活化后离心，沉淀物与羊抗兔IgG(Tris-HCl缓冲液)混合，在室温下作用8小时。经离心、磷酸缓冲液洗涤即得。

5.质量控制样品，低、中、高浓度各1瓶，各1ml。

由Bt晶体蛋白Cry1Ac阳性和阴性质量控制标准样品(Agdia公司，阳性质量控制样品LPC05200(货号)及阴性质量控制样品LNC05200)配制。

6.蛋白提取液一瓶，200ml(1L蒸馏水中含有无水碳酸钠2.66g、氯化钠2.92g和Vc1g，自行配制，用于测样时样品的蛋白粗提)

实施例3测样过程

1.样品采集和蛋白粗提

取籽粒或新鲜叶片1g，加入蛋白提取液(1L蒸馏水中含有无水碳酸钠2.66g、氯化钠2.92g和Vc1g)2ml，研磨成匀浆，转移到小试管中，稍微甩一下，静止5分钟。吸取上清液待测。

2.操作程序

1)在塑料试管上编号，包括非特异管(NSB)、零结合管(S₀)、标准管(S₁-S₆)、质控管(Qc1，2，3)，样本管(U)，以上试管必须双管标号。

2)向NSB管加入200μl零标准品，S₀管加入100μl零标准品，向其它试管加入100μl相对应的标准、质控或样本。

3)向除了NSB管之外的所有试管中加入100μl微粒联接抗血清。

4)向所有试管中加入100μl ¹²⁵I-Bt晶体蛋白Cry1Ac，混匀，任取三管测放射性计数，取其平均值作为总放射性计数(T)。

5)把所有试管置于磁分离器的上层管架上，连上磁分离器底部磁铁，37℃放置25分钟。移走底部磁铁。

6)向所有试管中加入1.0ml磁分离剂，振荡摇匀。再连上磁分离器底部磁铁，5分钟。

7)倒出溶液，加缓冲液冲洗一次。测沉淀放射性计数(cpm)。

3.结果计算

1)计算每对试管(T、NSB、B₀、B)的平均计数，净计数＝平均cpm-本底计数

2)非特异结合率和最大结合率分别为：NSB/T×100，(B₀-NSB)/T×100

3)各标准管、样本管结合率为：B/B₀％＝(B-NSB/B₀-NSB)×100，其中B＝标准管(或样本管)双管计数的均值，B₀＝零标准(S₀)双管计数的均值，NSB＝非特异双管计数的均值。

4)以上各标准碘的B/B₀％为纵坐标，以标准点浓度为横坐标，在Logit-Log双坐标纸上作标准曲线。

5)根据待测样本的结合率，从标准曲线上查出相应的样品Bt蛋白含量。

表2不同免疫反应时间下的测定效果

免疫反应时间	3小时	1小时	40分钟	30分钟	20分钟
免疫反应时间	3小时	1小时	40分钟	30分钟	20分钟	(B₀-NSB)/T×100	46.7％	46.4％	47.1％	46.9％	33.2％
QC1(10ng/ml)测定值	11.2	11.3	10.5	11.4	15.8	(B₀-NSB)/T×100	46.7％	46.4％	47.1％	46.9％	33.2％
QC1(10ng/ml)测定值	11.2	11.3	10.5	11.4	15.8	QC2(400ng/ml)测定值	430.4	433.4	434.1	435.6	344.4

QC3(1000ng/ml)测定值

1004.3

1130.9

959.7

1040.4

823.2

注：1.免疫反应时间在30分钟时，结合率、质控测定值在允许范围内。

2.分离无需离心。

3.分析灵敏度为0.5ppb(0.5ng/ml)。

4.反应温度为37℃。

实施例4与酶联免疫法相比较进行Bt晶体蛋白Cry1Ac测定

分别用本发明的方法与现有酶联免疫方法测定了玉米和棉花样品中Bt晶体蛋白Cry1Ac含量，并进行了比较。

实验目的：检查本发明方法及试剂盒的检测结果的准确性；

测定方法：

1、样品的提取，同实施例3测样过程1.样品采集和蛋白粗提；

2、酶联免疫法的测定依照Bt晶体蛋白Cry1Ac试剂盒(Agdia公司，货号PSA05200/0096)说明书进行；

3、本发明方法的测定步骤同本发明实施例3中的2.操作顺序；

结果见下表。

表3玉米和棉花Bt晶体蛋白Cry1Ac测定结果

	普通玉米		转Bt玉米		普通棉花		转Bt棉花
	普通玉米		转Bt玉米		普通棉花		转Bt棉花		叶片	籽粒	叶片	籽粒	叶片	籽粒	叶片	籽粒
	酶联免疫	-	-	15ng/ml	67ng/ml	-	-	34ng/ml	叶片	籽粒	叶片	籽粒	叶片	籽粒	叶片	籽粒	102ng/ml
本方法	酶联免疫	-	-	15ng/ml	67ng/ml	-	-	34ng/ml	-	-	13ng/ml	75ng/ml	-	-	28ng/ml	96ng/ml	102ng/ml

从表中数据可看出：阴性样品用本发明方法测定的结果为阴性，阳性样品用本发明方法测定的结果为阳性，并且两种方法测定样品含量的数据无显著性差异。

结论：本发明方法测定结果与酶联免疫法相符。

Claims

1、一种用于检测苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测试剂盒，该盒包括有磁性微粒联接的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗体、磁性微粒联接的羊抗兔IgG、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac标准溶液、¹²⁵I苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1AC。

2、根据权利要求1所述的检测试剂盒的制备方法，其中所述磁性微粒联接的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗体的制备方法是：

将Aerosol 604的戊二醛溶液与Fe₃O₄水溶液混合，将混合液调制为碱性，离心得到100nm微粒；将所得微粒经过戊二醛活化后再离心，将所得沉淀物与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗血清混合、再经离心得到磁性微粒联接的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗体；

所述磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备方法是：

3、根据权利要求2所述的检测试剂盒的制备方法，其中磁性微粒联接的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗体和磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备中，所述碱性为pH10-12。

4、根据权利要求2所述的检测试剂盒的制备方法，其中磁性微粒联接的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗体和磁性微粒联接的羊抗兔IgG的制备中，将混合液调制为碱性后，进行氮气脱氧后振荡。

5、一种苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测方法，其步骤是，在若干放射免疫管中分别加入待测样品、苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac标准溶液和质量控制样品，然后对每一放射免疫管分别进行如下操作：

1)加入磁性微粒联接的苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac抗体；

2)加入¹²⁵I-苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry1Ac，混匀；

3)将放射免疫管放置在磁分离器的管架上，连接磁分离器底部磁铁25分钟，再移走磁铁；

4)加入磁性微粒联接的羊抗兔IgG，振荡摇匀，再连接磁分离器底部磁铁5分钟；

5)倒出溶液，加缓冲液冲洗一次后测沉淀放射性计数；

6)计算各管的结合率，作标准曲线，根据标准算出待测样品的含量。