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CN1209876A - 分离的酪氨酸酶衍生肽及其应用 - Google Patents

分离的酪氨酸酶衍生肽及其应用 Download PDF

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CN1209876A
CN1209876A CN97191765A CN97191765A CN1209876A CN 1209876 A CN1209876 A CN 1209876A CN 97191765 A CN97191765 A CN 97191765A CN 97191765 A CN97191765 A CN 97191765A CN 1209876 A CN1209876 A CN 1209876A
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伯恩纳德·莱特
文森特·布里夏尔
阿兰·范佩尔
蒂尔瑞·博恩-法勒尔
托马斯·沃尔费尔
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Ludwig Institute for Cancer Research Ltd
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Abstract

本发明涉及鉴别在异常细胞表面的人白细胞抗原分子和酪氨酸酶衍生肽的复合物的方法。这一观察的治疗和诊断应用是本发明的主题。

Description

分离的酪氨酸酶衍生肽及其应用
相关申请
本申请是现已授权的1994年4月26日申请的美国专利申请08/233,305的部分继续申请，08/233,305是1994年2月28日申请的08/203,054的部分继续申请，08/203,054是1993年6月23日申请的08/081,673(现为美国专利5,487,974)的部分继续申请，08/081,673是1993年4月28日申请的054,714的部分继续申请，054,714是1992年12月22日申请、现已放弃的994,928的部分继续申请。所有文献均引为参考文献。
发明领域
本发明涉及衍生自酪氨酸酶，并由HLA-A2及HLA-B44分子呈递的分离肽及其应用，另外本发明还涉及鉴别那些诊断具有细胞异常特征的疾病的个体的能力，这些异常细胞呈递这些肽与HLA-A2及HLA-B44的复合物，本发明还涉及被呈递的肽及其应用。
背景及现技术
哺乳动物免疫系统识别并与外来物或异物反应的过程是一种复杂过程。该系统的一重要方面是T细胞应答。该应答要求T细胞识别并与细胞表面分子-称作人白细胞抗原(HLA)或主要组织相容性复合物(MHCS)-和肽的复合物相互作用。这种肽衍生自较大分子，其由也呈递HLA/MHC分子的细胞加工，参见Male等，《免疫学进展》(J.P.Lipincott Company,1987)尤其第6-10章所述。T细胞与HLA/肽的复合物的相互作用是受限的，要求对某一HLA分子和一种肽的组合是特异性的T细胞。如果不存在特异性T细胞，即使存在其配体复合体也不产生T细胞应答。相似地，如果没有特异性复合物而只有T细胞，同样也不能产生应答。这种机制参与免疫系统对外来物的应答，自身免疫病理学及对细胞异常的应答中。近来有许多工作致力于将蛋白质加工成HLA结合肽的机制。可见于：Barinaga，科学257:880(1992)；Fremont等，科学25:919(1992)；Matsumura等，科学257:927(1992)；Latron等，科学257:964(1992)。
由T细胞识别细胞异常的机理也包含于癌症中。例如，在1992年5月22日申请，公布于1992年11月26日的PCT申请PCT/US92/04354中(引入本文作参考)，揭示了一个基因家族，其被加工成肽，进而在细胞表面表达，并能导致由特异性CTL对肿瘤细胞的溶解。据称这些基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，且衍生自其中的肽被称作“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。可参见Traversari et al.，免疫遗传学，35:145(1992)；van der Bruggen等，科学254:1643(1991)，对该基因家族的进一步报道。
在美国专利5,405,940及5,462,871(其内容并入本文作参考)中，教导了与HLA-A1分子结合的九肽。该参考文献指出：给定特定肽对特定的HLA分子的已知特异性，可以预期一种特定的肽只与一种HLA分子而不与其它分子结合。这是很重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果，尽管鉴别某一特定的肽作为某一特异性HLA分子的配体具有诊断和治疗作用，但是这些只与具有该特定的HLA表型的个体相关。在这一领域需进一步研究，是由于细胞异常不限于一种特定HLA表型，且定向治疗要求对异常细胞的表型的认识。
酪氨酸酶催化反应使酪氨酸转化为脱羟苯丙氨酸或“DOPA”，并呈现在黑素细胞中选择性表达(Muller et al.,EMBOJ7:2715(1988))。对该人类酶cDNA的早期报道可见于Kwon，美国专利4,898,814。稍晚由Bouchard等，J.Exp.Med.169:2029(1989)的报道介绍了一种稍有不同的序列。有大量的工作致力于识别这种酶的抑制剂，是由于其在色素沉着性疾病中具有一定影响。该专题文献的实例可包括Jinbow,WO9116302；Mishima et al.,U.S.Patent No.5,077,059，及Nazzaropor,U.S.Patent No.4,818,768。技术人员对其它教导相似物质的参考文献也是通晓的。
并入本文作参考的美国专利申请08/081,673,(申请日1993年6月23日)教导：酪氨酸酶可以以与外来抗原或TRAP分子相似的方式进行处理，即发现在某些细胞异常如黑素瘤中，酪氨酸酶被加工并且衍生自其中的肽与HLA分子在某些异常细胞表面形成复合物。这些复合物可被胞溶性T细胞(“CTL”)识别，CTL然后溶解呈递细胞。这令人惊奇的未预料到的现象的应用已被讨论。现已发现其它的肽也可作为由HLA-A2分子呈递的肿瘤排斥抗原。这些可参考1994年2月28日申请的08/203,054中所述(引入本文作参考)。
现已发现衍生自酪氨酸酶的其它肽是肿瘤排斥抗原，因为其由MHC分子HLA-B44呈递，并被胞溶性T细胞溶解。
附图简述
图1集中描述了细胞溶解研究，尤其
图1A显示了细胞系LB24-MEL的溶解；
图1B显示了细胞系SK29-MEL的溶解；
图1C显示了细胞系LB4.MEL的溶解；
图1D显示了细胞系SK23.MEL的溶解；
图1E显示了细胞系LE516.MEL的溶解；
图1F显示了丧失HLA-A2表达的细胞系SK29-MEL.1.22的溶解；
图1G显示了MZ2-MEL溶解的丧失；
图1H显示了在NK靶K562上的溶解研究；
图1I显示了在用HLA-A2基因转染后的图1F中的丧失变异体的溶解；
图1J显示了来自病人SK29的自体EBV转化的B细胞的溶解。
图2显示了CTL IVSB的TNF释放的研究。
图3描述了CTL210/9的TNF释放的研究。
图4描述了由胞溶性T细胞克隆CTL-IVSB而非胞溶性T细胞克隆CTL2/9对SEQ ID NO:2肽的识别。
图5显示了SEQ ID NO:2肽不被胞溶性T细胞克隆CTL 210/9识别。
图6显示了在各种细胞，包括那些在其表面呈递HLA-B44的细胞上进行TNF释放分析时得到的结果。
图7集中显示了利用本发明所述肽在三种不同细胞系进行的一系列铬释放分析。
图7A显示了使用SEQ ID NO:4肽所进行的实验。
图7B显示了使用SEQ ID NO:5肽的结果。
图7C阐述了使用SEQ ID NO:2所得结果。
在图7中，符号“○”用于代表细胞系T2，“□”用于代表不呈递HLA-A2的MZ2-MEL，且“○”用于代表已被转染成呈递HLA-A2的MZ2-MEL。实施例12详尽论述了这些试验。
图8A和8B显示了使用呈递MHC分子HLA-B44的细胞系及胞溶性T细胞克隆22/31(后文称作CTL 22/31)的研究工作。在图8A中，细胞系(“Rosi EBV”)与单克隆抗体W6/32预培养，而在图8B中未经预培养。
图9A和9B显示了当用CTL克隆22/3及IVSB作用于表达HLA-A2和/或HLA-B44 MHC分子的靶细胞时所获得的结果。
图10阐述了使用对HLA-B*4402细胞特异性的CTL克隆329B/5及对HLA-B*4403细胞系特异性的CTL22/31的溶解研究。
图11阐述了在涉及CTL 329B/5的分析中TNF释放的刺激作用的实验结果。其显示出CTL克隆329B/5对HLA-B*4402呈递细胞具有高度特异性。
优选实施方案详述
实施例1：
将研究者已使用多年的黑素瘤细胞系SK29-MEL(也称作SKMEL-29)和LB24-MEL用于以下实验。
含血单核细胞的样品取自患者SK29(AV)及LB24(这些病人也分别是SK29-MEL和LB24-MEL的来源)。将黑素瘤细胞系与含血单核细胞的样品相接触，观察混合物的黑素瘤细胞系的溶解，该溶解表示对由黑素瘤细胞呈递的肽和HLA分子的复合物具有特异性的胞溶性T细胞(“CTL”)存在于样品中。
所采用的溶解分析是参考Hem et al.,Int.J.Cancer 39:390-396(1987)中的一种铬释放分析(该文引入本文作参考)。但本文仍详述该分析法。黑素瘤靶细胞在体外生长，然后在补加10mM HEPES和30％FCS的DMEM中以107个细胞/ml重悬浮，并在37℃与200μCi/ml的Na(51Cr)O4温育45分钟。用补加10mM Hepes的DMEM将标记的细胞冲洗三次，然后将这些细胞在补加10mM Hepes及10％FCS的DMEM中重悬浮。之后将含103个细胞的100μl相同培养基加入，以双份重复进行分析实验。以100g离心板4分钟，在37℃在含5.5％CO2的气氛下温育4小时。
将板再离心，收集100μl上清液等份并计数。51Cr释放百分率用下列公式计算：
Figure A9719176500081
其中ER是观测到的实验51Cr释放，SR是经200μl培养基中温育103个标记细胞而测定的自发释放，MR是向靶细胞中加入100μl0.3％Triton X-100而得到的最大释放。
将那些呈高CTL活性的血单核细胞样品扩增并经有限稀释克隆，用相同方法再筛选。
使用相同方法测试K562靶细胞。当使用EBV转化的B细胞(EBV-B细胞)时，唯一的改变是用Hank’s培养基代替DMEM培养基。
这些实验导致来自SK29(AV)病人的CTL克隆“IVSB”及来自LB24病人的CTL克隆210/9的分离。
在图1A、B、G、I呈现了这些分析结果。具体地，可见两种CTLs溶解两种黑素瘤细胞系，而K562及EBV-B细胞系没有溶解。
实施例2
测试所述CTL对其它黑素瘤细胞系的作用以检测其它黑素瘤细胞系是否共有其靶。用实施例1所述的溶解方法研究LB4.MEL，SK23.MEL(也称作SK MEL-23)及LE516.MEL。图1C、D、E显示这些克隆不能溶解这些细胞系。
这些受试细胞系已知是HLA-A2型，结果提示CTL对肽和HLA-A2的复合物具有特异性。这一提示可通过测试已丧失HLA-A2表达的SK29-MEL的一种变异体来证实。图1F显示了这些结果。两组克隆都不能溶解丧失HLA的变异体。当这些变异体用SK29-MEL的HLA-A2基因转染后再测试时，可观测到发生溶解。这样可推断出呈递分子是HLA-A2。
实施例3
一旦鉴别出呈递HLA分子，则进行研究以鉴别后文称作“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，该分子是被呈递的肽的来源。
为进行此项工作，从SK29-MEL.1细胞系-其是SK29-MEL的亚克隆-中分离出总RNA。RNA遵循熟知的技术使用一种寡脱氧胸苷酸结合试剂盒进行分离。总RNA一经得到则利用标准方法将其转录成cDNA。然后将cDNA与EcoRI衔接子连接，并按照厂商指导克隆进pcDNA-I/Amp质粒的EcoRⅠ位点。再将重组质粒电穿孔进JM101E.coli(电穿孔条件：2500V,25μ法拉弟1脉冲)。
用氨苄青霉素(50μg/ml)筛选转染的细菌，然后分成每个库含200个克隆的700个库。每个库相当于大约100个不同的cDNA，且分析显示大约50％质粒含有插入片段。将每个库扩增至饱和，并经碱裂解，乙酸钾沉淀及苯酚抽提[参见Maniatis et.al，分子克隆实验手册(coldSpnng Harbor,N.Y.1987)]分离出质粒DNA。不使用铯梯度离心。
实施例4
将扩增的质粒转染入真核细胞。将COS-7细胞的样品在补加10％胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagles培养基(“DMEM”)中以15,000个细胞/孔种入组织培养平底微孔中。在37℃将细胞温育过夜，除去培养基然后用30μl/孔含10％Nu血清，400μg/ml DEAE葡聚糖，100μM氯喹，100ng pcDNA-I/Amp-A2质粒及1000ng前述cDNA文库的1个库的DNA的DMEM培养基替换。pcDNA-I/Amp-A2质粒含有来自SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃温育4小时后，除去培养基，用含10％DMSO的50μl PBS替换。2分钟后除去该培养基并换以200μl的补加10％FCS的DMEM。
经过培养基的变化之后，在37℃将COS细胞温育48小时。然后将培养基除去，以含10％浓集人血清的100μl的Iscove’s培养基加入每个所述的CTL克隆的2000个细胞。当使用210/9克隆时，用25U/ml的IL-2补加培养基。24小时后除去上清液，并参考如Traversari等，免疫遗传学35:145～152(1992)所述，在WEHI细胞上分析以检测TNF含量〔该文引入本文作参考〕。
在用IVSB测试的700个孔中，696个孔呈每ml TNF含量0.6～4pg，剩下的4孔中TNF含量在10～20pg/ml之间。用CTL210/9测试的同源孔呈相似的略高的值。图2、3示出了这些数据。
实施例5
选择经鉴定为高生产者的4个库中的3个库(编号为“123”,“181”及“384”)进行进一步试验。具体地，克隆细菌，且从每个库中测试570个细菌。从中提取质粒DNA，并将其以如上所述的相同方式转染进COS细胞的一新样品中，并重新测试该细胞对CTL 210/9及CTL IVSB的刺激作用。在123库中发现一阳性克隆(“p123.B2”)，在384库中也发现一个(“p384.C6)”。进行一对照试验。其中COS细胞经cDNA和HLA-A2基因转染及只经HLA-A2转染，可得到一确证：转染的细胞由CTL识别。TNF在CTL上清液中的释放可经在WEHI细胞上测试其加以测定。用MTT测定存活WEHI细胞的光密度，结果见表1：
                        表1
     cDNA(123.B2)+HLA-A2 DNA    无cDNA+HLA-A2第1轮            0.087                 0.502第2轮            0.108                 0.562
WEHI光密度值相当于经cDNA及HLA-A2转染的24pg/mlTNF，对照组为2.3pg/ml。
将得自阳性克隆的质粒提出，并用本领域技术人员熟知的技术测序。序列检索显示：该质粒插入片段与Bouchard.et al.,J.Exp.Med.169:2029(1989)中所述的人酪氨酸酶的cDNA几近相同。因此正常产生的分子(如酪氨酸酶)可作为肿瘤排斥抗原前体，并可加工成可在细胞表面呈递的肿瘤排斥抗原肽，从而与HLA-A2结合刺激由CTL克隆的溶解。该鉴定的分子的核酸序列见SEQ ID NO:1。
实施例6
由Chomez等在免疫遗传学，35:241(1992)报道的前期研究显示：含编码一抗原肽的序列的小基学因片段引起该肽的表达。该研究工作(引入本文作参考)提示克隆到如上所述并在SEQ ID NO:1中的人酪氨酸酶cDNA的小部分。使用如实施例1-5所述的方法，将各种cDNA片段与HLA-A2基因共转染进COS-7细胞，并进行TNF释放分析。这些实验导致鉴定了一个近400碱基对的片段，当其用于共转染实验中时激发从如上所述的胞溶性T细胞克隆CTL IVSB释放TNF，显示对HLA-A2呈递细胞的特异性。所用的约400碱基对片段相应于SEQ ID NO:1的第711-1152位碱基。该片段编码的氨基酸可推导出，然后将该序列与Hunt等在科学，255:1261(1992)，及Falk等在自然，351:290(1991)中所提供的资料相对比，(两篇文献均引入本文作参考)，这些参考文献讨论了HLA-A2呈递肽的共有序列。具体地，Hunt揭示了九肽，其中在第二位总是发现Leu或Ile,Leu是“主要残基”。第九位残基始终是带脂族烃侧链的残基，Val是该位的主要残基。Hunt揭示了在第二位的Leu的强信号及Met的中等信号，在第6位的Val,Leu,Ile或Thr中之一，及在第9位的Val或Leu，其中Val特别强。在对比的基础上，合成九肽然后进行测试以观察它们是否能敏化HLA-A2呈递细胞。为此要使用酪氨酸酶丧失变异体细胞系SK29-MEL1.218及T202LB。将各种浓度的受试肽与胞溶性T细胞克隆CTL IVSB或胞溶性T细胞克隆CTL210/9一起加入细胞系中。如上所述的早期研究已证实前一克隆可溶解呈递HLA-A2的表达酪氨酸酶的细胞，而后者不能。
将酪氨酸酶丧失变异体与或不与用于稳定空HLA-A2分子的抗HLA-A2抗体MA2.1在含51Cr的溶液中在37℃温育一小时。在试验中将细胞冲洗4次，然后与各种稀释度的肽(从100μM至0.01μM)温育。30分钟后以E/T为40/t的比率加入效应细胞，4小时后，收集100μl上清液并计数放射性。
图4显示了用九肽Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ IDNO:2)所得结果。
后文称作SEQ ID NO:2的该肽，相当于SEQ ID NO:1的酪氨酸酶cDNA序列的第1129-1155位残基。HLA-A2及该肽的复合物由CTL克隆IVSB识别。
在一平行实验中，显示衍生自LB24病人的CTL克隆CTL210/9不能识别HLA-A2与SEQ ID NO:2肽的复合物，尽管其可识别HLA-A2与酪氨酸酶衍生肽的复合物。因此，酪氨酸酶被加工成至少一种额外的肽，当该肽由HLA-A2分子呈递时被CTL克隆识别。
实施例7
在以下试验中使用一种不编码SEQ ID NO:2肽的第二种基因片段。该片段起自SEQ ID NO:1的碱基1，终于碱基1101(即EcoRⅠ-SphⅠ片段)。以如上所述相同方式测试上述胞溶性T细胞克隆CTL210/9对用该片段转染的COS-7细胞的作用。同时也测试了CTL IVSB。这些结果显示CTL 210/9可识别在用该片段转染的表达HLA-A2的细胞表面的抗原，而CTL IVSB不能。因此酪氨酸酶衍生了第二种肿瘤排斥抗原肽。
实施例8
为进一步阐明由CTL 210/9识别的肿瘤排斥抗原而进行下列实验。
将相当于SEQ ID NO:1的第451-1158位碱基的第二种片段与HLA-A2基因一起转染进COS细胞，并进行TNF释放分析。该序列可激发TNF从克隆CTL IVSB的释放(20pg/ml)，而不能激发从CTL210/9中释放TNF(3.8pg/ml)。这些结果证实：该两种CTL克隆识别不同的肽，且由LB24-CTL 210/9识别的肽必须由第1-451位碱基区域编码。
实施例9
分析由第1-451位cDNA片段编码的酪氨酸酶衍生肽的已知与HLA-A2结合的共有序列。合成相应于这些共有序列的肽，并测试它们对HLA-A2呈递细胞的敏化能力。为此要使用二种酪氨酸酶阴性黑素瘤细胞系(如NA8-MEL，及用HLA-A2转染的MZ2-MEL2.2)及Salter等在免疫遗传学，21:235-246(1985)中所述的细胞系T2。
将细胞用51Cr及HLA-A2特异性单克隆抗体MA2.1在37℃温育50分钟，随后进行冲洗(见Bodmer等，自然，342:443-446(1989)，其并入本文作参考)。将靶细胞与各种浓度的肽及LB24-CTL克隆210/5或210/9温育。温育4小时后测定铬释放百分率。
可发现肽Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu(SEQ ID NO:3)具有活性。
在进一步实验中，先前显示可识别SEQ ID NO:2的CTL-IVSB不能识别SEQ ID NO:3。结果可见如下表2-4中概括所示。
                       肽
              SEQ ID NO:2    SEQ ID NO:3CTL-IVSB               +               +CTL-210/5              -               +CTL-210/9              -               +用酪氨酸酶肽敏化的MZ2-2.2-A2由LB24-CTL210/5及210/9及SK29-CTLIVSB的溶解
效应细胞     肽         剂量 MZ222-A2+抗 -A2*
LB24-CIL210/5(44∶1) MLLAVLYCLL    10μM(LAUS 17-5)YMNGTMSQV     30M(MAINZ)       103     183        171        16111
LB24-CTL210/9(30∶1) MLLAVLYCLL    10μM(LAUS17-5)YMNGTMSQV     30M(MAINZ)       103     183        171        15111
SK29-CTLIVSB(40∶1) MLLAVLYCLL    10μM(LAUS 17-5)YMNGTMSQV     30μM(MAINZ)       103     13        11        1686862
*靶细胞用Cr51及单抗MA2.1(抗-HLA-A2)温育50分钟，后冲洗3次。
将其用不同浓度的肽温育30分钟。
将CTL细胞以所示比率(E∶T)加入
温育4小时后测定特异性Cr51释放百分率
                            表4由LB24-CTL210/5及210/9或SK29-CTL IVSB识别的酪氨酸酶肽的测试
                            (％Cr51特异性释放)
Figure A9719176500161
实施例10
使用CTL克隆22/31进行另外的实验。该克隆已显示可溶解来自自体黑素瘤细胞系MZ2-MEL的亚系MZ2-MEL.43，但不能溶解其它亚系，如MZ2-MEL3.0及MZ2-MEL61.2，也不能溶解自身EBV转化的B细胞或杀伤细胞系K562(见Van den Eynde et.al.,Int.J.Cancer44:634-640(1989)。由MZ2-MEL.43呈递的抗原称作抗原C。
在包括本申请的母申请的现有技术中，已发现酪氨酸酶基因编码由自体CTLS识别的在大部分表达HLA-A2的黑素瘤上的抗原。用PCR扩增测试该基因在MZ2-MEL细胞系亚系的表达，发现MZ2-MEL.43克隆是阳性的而其它MZ2-MEL克隆如MZ2-MEL.3.0是阴性的。酪氨酸酶基因的表达与抗原MZ2-C的相关性提示MZ2-C可能是衍生自酪氨酸酶并由MZ2-MEL表达的HLA分子呈递的肿瘤排斥抗原。该细胞系不表达HLA-A2，表明如果一种酪氨酸酶衍生肽被呈递为TRA，则第二种HLA分子参与其中。
进行研究以鉴别哪种HLA分子将抗原C呈递给CTL22/31。为确定这一点，将已知在细胞表面的HLA分子如HLA-A29,HLA-B37,HLA-B44.02及HLA-C克隆10的cDNA克隆从MZ2-MEL.43cDNA文库中分离出，然后克隆进表达载体pc DNA I/Amp中。然后用这些构建物之一或含HLA-A1的构建物加上编码酪氨酸酶的eDNA(SEQ ID NO:1)转染受体COS7细胞。共转染方法可参考上述方法。一天后加入CTL 22/31,24小时后，参考Traversari等如上所述，通过测试对WEHI-164-13的胞毒性而测定TNF的释放。图6示出只在HLA-B44和酪氨酸酶一起转染的细胞存在下CTL22/31才释放TNF。得出结论是HLA-B44呈递一种酪氨酸酶衍生的肿瘤排斥抗原。
实施例11
前述实验示出：SEQ ID NO:3的十聚体有效诱导HLA-A2呈递细胞的溶解。广泛接受的是MHC分子呈递九肽。为此进行实验，其中测试了两种九聚体，其是基于确定给出阳性结果的十肽。具体地，除去第一个或第十个氨基酸以产生两种肽。
Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu
                                  (SEQ ID NO:4)
Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu
                                  (SEQ ID NO:5)
将这些肽在浓度为10μM～1nM范围以前例所述测试十肽的相同方式进行检测。使用三种呈递细胞。如下表5概括所示，“T2”是一种突变的人细胞系“CEMX721.174T2”，见Salter在免疫遗传学，21:235(1985)所述。该细胞系呈递HLA-A2。“G2.2”是一种MZ2-MEL细胞系的变体。该变体已经用编码HLA-A2的基因转染。缩写“G2.2.5”代表一种不表达HLA-A2的变体。在与胞溶性T细胞克隆接触之前将所有细胞与单克隆抗体MA2.1温育。尽管产生机理还不十分知晓并且使用效应器CTL210/5及210/9，但该步骤可以稳定所谓的“空”MHC分子。结果见下表5。其示出在浓度为10μM，当与CTL克隆210/5一起应用时SEQ ID NO:4的九聚体溶解效率为2倍，当与CTL克隆210/9一起应用时，溶解效率为4倍，而SEQ ID NO:5的九聚体对诱导溶解无效。
表5
                          表5(续)
Figure A9719176500201
                        表5(续)
Figure A9719176500211
实施例12
在进一步实验中，使用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及SEQID NO:2的肽进行铬释放分析。靶细胞是已预先经HLA-A2转染的同种异体黑素瘤细胞即MZ2-MEL，及可呈递HLA-A2但具有一抗原加工缺陷(其可导致呈递外源肽能力增加)的细胞系T2(Cerundoloet cl.,Nature 345:449(1990))。将所有细胞用单克隆抗体MA2.1预处理50分钟。将细胞与不同浓度的选择的肽温育30分钟。然后将CTL克隆210/9及ISVB之一以效应器：靶细胞为60的比率加入。4小时后以前述方法测定铬释放。
结果见图7所示，即图7A-7C。SEQ ID NO:4肽使细胞对CTL210/9敏化，而SEQ ID NO:5不能。SEQ ID NO:2使细胞对CTLIVSB敏化，如前例阐述。
实施例13
接着进行实施例10中描述的实验之后的研究，以致力于阐明由HLA-B44呈递的抗原肽。为此将相应于酪氨酸酶cDNA序列的片段的cDNA序列与编码HLA-B44的基因一起共转染进COS-7细胞。方法基本上与前述实施例6相同。使用前述胞溶性T细胞克隆22/31检测TNF的释放。有二种片段即1-611碱基片段及427-1134碱基片段可诱导TNF释放。这提示呈递的肽处于重叠区域。根据该结果，测试较短的片段。相应于574-831及385-612位核苷酸的片段能诱导TNF释放。这些数据提示相应于574-612位核苷酸的片段编码相关的肽。结果是，合成由574-612位核苷酸编码的13个氨基酸的肽。然后将该肽用于实验以检测其是否诱导CTL22/31导致的溶解。下表6示出该13聚体可使两种表达HLA-B44的EBV转染细胞系对溶解敏化。
表610F94-tyros 13-mer zur EBV-1
    1     2     3     4
效应器 剂量肽13A.A.  Rosi-EBV  MZ2-EBV
    1  MZ2-G7L-22/31 SEIWRDIDFAHEA
    2
    3 60:1  30μM     83     71
    4    10     85     72
    5     3     77     66
    6  1     79     63
    7  300nM     60     33
    8  100     44     17
    9     30     21     4
    1O     1O     9     6
    11     3     10     6
    12
    13     0     10     6
    14
    15 spt.rel．     393     472
    16  max.rel.     1698     1792
    17 ％           23         26
相比之下，九聚体Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe A1a(SEQ IDNO:8)不被识别。下表7阐明了这些结果，其也见图8所示。
如Burrows et al.,J.Virlo 64:3974(1990)报道的与HLA-B44结合的另一种肽仅是：Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe(SEQ IDNO:9)。由前述数据提示第二位的G1u及第九位的Phe可能代表HLA-B44的锚残基。
                                  表710M94-popt tyros on B44
    1     2     3     4     5     6     7     9
效应器     剂量 +W SEWRDIDFA +W SEIWRDIDF +W EIWRDIDFA -W SEIWRDIDFA -W SEIWRDIDF -W EIWRDIDFA
    1 MZ2-CTL-22/31  1μM     91     93     7     98     99     11
    2  300nM     76     81     4     77     97      6
    3 45∶1  100     43     73     2     45     64      6
    4  30     17     37     0     15     21      6
    5  10      4     12     1      5      8      4
    6  3      3      4     1      0      7      2
    7  1      2      4      3
    8  0.3      1      1      2
实施例14
如前实施例5所述，分离自SK29-MEL的酪氨酸酶cDNA与已经鉴定的酪氨酸酶cDNA几乎相同。共有三个不同之处：其一是在相应于SEQ ID NO:7的N-末端丝氨酸的密码子内。具体地，SK29-MEL酪氨酸酶包括在第537-539位的ATG，在第575-577位的TCT，及在1207位的CAA。Kwon等与此不同，他们示出在第575-577位为TAT，而Bouchard等示出在所列位置为ATC,TAT及CGA。这种改变导致在N-末端的是酪氨酸而非丝氨酸。最终使用SEQ IDNO:10进行实验，即Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe。如Giebel等在Nucl.Acids Res.18:3103(1990)，及Johnston等在Nucl.Acds Res.20:143(1992)所述，该等位基因大约存在于50％高加索白人中。重要的是确定SEQ ID NO:10是否能敏化CTL。
将SEQ ID NO:10肽以前述实施例12及13的相同方式，用CTL22/31进行测试。发现所需的用于激发CTL22/31 50％最大溶解的SEQ ID NO:10量与SEQ ID NO:7所需量几近相同。图9A和9B示出其中一些数据，显示出当将CTL 22/31及CTL IVSB用于同时表达HLA-A2及HLA-B44的靶细胞时所得的结果。MZ2-MEL.43细胞系表达HLA-B44而不表达HLA-A2,SK29-MEL.1细胞系经测试对HLA-B44及HLA-A2都是阳性的。称作“MZ2-MEL.43+HLA-A2”的细胞系是一种用编码HLA-A*0201的DNA转染过的MZ2-MEL.43细胞。
这些结果的一令人感兴趣的特征是CTL 22/31不识别SK29-MEL.1刺激的细胞，而CTL IVSB能识别(却不识别MZ2-MEL.43)。该发现引出下列实验。
实施例15
还衍生了一个进一步的CTL克隆，即CTL克隆329B/5，尽管有某些之处不同于前述两种CTL克隆。
为衍生CTL克隆329B/5，将来自健康的HLA-B*4402阳性个体的外周单核细胞(自身巨噬细胞及树状细胞)的粘附细胞在补加10％胎牛血清(“FCS”)，IL-4(50U/ml)及GM-CSF(100ng/ml)的RPMI培养基中生长一周。然后将该细胞用前述SEQ ID NO:7肽(50μM)在β2微球蛋白存在条件下(2.5μg/ml)进行脉冲4小时。照射该粘附细胞，并将二百万个CD8+分选的T淋巴细胞加入至终体积为2ml的补加10％人血清，1000U/ml IL-6及5ng/ml IL-12的Iscove’s培养基中。在第7天和第14天，在补加10U/ml IL-2及5ng/mlIL-7的培养基中，用已用SEQ ID NO:7脉冲的粘附细胞刺激应答细胞。在第21天在含已用SEQ ID NO:8(1μM)脉冲的HLA-B44阳性的照射的LB33-MEL.A细胞(104个细胞/微孔)及作为饲养细胞的2×104个经照射的LG2-EBV淋巴母样细胞的微孔中以有限稀释法克隆应答淋巴细胞。
遵循相同步骤，每7天刺激一次微培养物。
5周后，将CTL克隆329B/5在24孔内培养，并每周用2×105个经照射的已用SEQ ID NO:7脉冲的LB33-MEL.A细胞及106个经照射的LG2-EBV细胞在补加IL-2(50U/ml)及IL-4(5U/ml)的培养基中刺激一次。
将CTL克隆329B/5用于后面的一些实验中。
实施例16
导致实施例14的结果的一可能原因是HLA亚型的不同。已知有两种主要的HLA-B44亚型，即HLA-B*4402及HLA-B*4403。黑素瘤细胞系SK29-MEL表达HLA-B*4402，而MZ2-MEL表达HLA-B*4403。
为检测该可能性，取自三个不同病人(LB17,LB33，及B12)的并经Epstein Barr病毒(EBV)转化的淋巴母样细胞系用于都已用SEQID NO:7脉冲的所有亚型，然后用前述方法测试对CTL 22/31溶解的敏感性。所用的还有实施例15所述的CTL克隆329B/5。
图10示出这些实验的结果。所有HLA-B*4403阳性细胞都被CTLS 22/31溶解得很完全，而当使用CTL 22/31时，在HLA-B*4402系上的溶解很少。结论是CTL能区分并受限于HLA亚型。
实施例17
还进行了另外的实验以检测可与HLA-B*4403复合然后刺激CTL的SEQID NO:7是否也能由HLA-B*4402细胞呈递。
Coulie等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7976-7980(1995)描述了肽Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe(SEQ ID NO:11)作为一种与HLA-B*4402分子复合的肽。SEQ ID NO:10肽与SEQ ID NO:11肽确实有效竞争，表明事实上它可与HLA-B*4402分子结合。
实施例18
将CTL克隆329B/5进行前述类型的溶解试验。测试二种HLA-B*4403阳性细胞系(MZ2-MEL.43和LG2-MEL)及三种HLA-B*4402阳性细胞系(SK29-MEL,LB494-MEL及LB33-MEL.B)的TNF释放分析。所有细胞系均表达酪氨酸酶。结果见图11。注意到HLA-B*4402黑素瘤细胞系的TNF释放刺激作用较高。
实施例19
SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:10都可与HLA-B44分子结合并诱发CTL溶解作用的事实提示N-末端不是与HLA-B44结合的关键残基。进行另外的研究以确定其它残基是否关键。
在这些实验中，合成肽，其中在SEQ ID NO:7的九个位置的氨基酸的-个被丙氨酸取代。然后将CIR-B4403细胞在抗MHC Ⅰ类抗体W6/32(30％v/v杂交瘤细胞培养基)存在条件下在37℃用铬标记-小时。然后冲洗。将标记的细胞(1000个/孔)在20℃用不同浓度的肽温育30分钟。然后以E∶T(效应器∶靶细胞)为10∶1的比率加入CTL22/31。4小时后测铬释放。
以下结果以相对抗原活性表示。这是由获得50％最大溶解所需的未取代肽的浓度除以产生50％最大溶解所需的变体肽的浓度而计算出的。对未取代肽SEQ ID NO:8而言，获得50％最大溶解的浓度为3nM。
该结果显示除1位外肽中每位氨基酸都是识别所需的。肽                                             相对抗原活性Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe (SEQ ID NO: 7)      1Ala                                                     1
Ala                                                 0
  Ala                                               0.066
      Ala                                           0
         Ala                                        0
            Ala                                     0
                Ala                                 0
                   Ala                              0.15
                      Ala                           0
前述实验证实酪氨酸酶作为肿瘤排斥抗原前体被加工，导致得到的肿瘤排斥抗原与在至少某些异常细胞上的分子形成复合物，所述异常细胞例如具有HLA-A2或HLA-B44表型的黑素瘤细胞。这些肿瘤排斥抗原可用式Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)表示，其中Xaa可以是任何氨基酸。Xaa是丝氨酸的一种抗原已在母申请中公开，因而不是本发明权利要求的一部分。本文揭示的是一些特殊抗原，其中Xaa是Tyr或Ala。复合物可由CTL识别并且呈递细胞溶解。该发现具有治疗及诊断意义是本发明的一个特征。在治疗方面可生产对呈递前述复合物的异常细胞具有特异性的CTL这一观察提示了各种治疗途径，其一可以将特异于该复合物的CTL给予具有所述表型的异常细胞的患者。本领域技术人员可在体外开发这种CTL。具体地，将细胞样品如血细胞与呈递复合物的细胞接触，并诱发特异性CTL增殖。靶细胞可以是如前述COS细胞类型的转染子。这些转染子在其表面呈递所述复合物，并且当与相应的CTL合并时可刺激其增殖。为使本领域技术人员能生产这些CTL，含相应基因的载体，即pc DNA-1/Amp 1(HLA-A2)及p123.B2(人酪氨酸酶)，已根据布达佩斯条约保藏在巴斯德研究所，保藏号分别为I1275及I1276。本文所用的COS细胞与其它合适的宿主细胞广泛可得。
称作过继转移的治疗方法(Greenberg,J.Immunol.136(5):1917(1986)；Reddel et al.,Science 257:238(7-10-92)；Lynch et al.,Eur.J.Immunol.21:1403-1410(1991),Kast et al.,Cell 59:603-614(11-17-89))，是将呈递所需复合物的细胞与CTL结合以导致特异于其的CTL增殖。然后将增殖的CTL给予细胞异常的病人，这些病人的特征在于某些异常细胞呈递特定的复合物。CTL然后溶解异常细胞，从而达到所需治疗目的。
以前的治疗假定至少某些患者的异常细胞呈递一种或多种HLA/酪氨酸酶衍生肽的复合物。这非常易于确定。如可用前述转染子鉴别CTL，且一且分离出可与患者异常细胞的样品用于检测在体外的溶解。如果观察到溶解，然后在这种治疗中应用特异性CTL可以缓解与异常细胞相关疾病病情。一种不太复杂的方法是使用标准分析检测异常细胞的HLA表型，用如PCR扩增检测酪氨酸酶的表达。许多不同的HLA分子呈递衍生自酪氨酸酶的TRA这一事实提高了适于本文所述治疗方法的患者数。
过继转移不是根据本发明治疗的唯一方式。CTL也可在体内用一系列方法激发。一种是如上所述使用表达复合物的非增殖细胞。用于该方法的细胞可以是那些正常表达复合物的细胞，如照射的黑素瘤细胞或用一种或二种呈递复合物所需的基因转染过的细胞。Chen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:110～114(January,1991)阐述了该方法，显示了在治疗方案中使用表达HPVE7肽的转染细胞。可以使用各种细胞类型。类似地可以使用携带一种或二种相应基因的载体。特别优选病毒或细菌载体。在这些系统中相应基因是由如痘苗病毒或细菌BCG携带的，并去“感染”宿主细胞。所得细胞呈递相应复合物，并可由随后增殖的自身CTL识别。通过将酪氨酸酶本身与一种促进掺入HLA-A2呈递细胞中的佐剂联合也可达到类似效果。然后将酶加工以产生HLA分子的肽配体。
前文叙述指出了“异常细胞”与“细胞异常”，这些术语使用其最宽释义，是指细胞呈至少一种区别于其特异性类型正常细胞的性能的任何情况。异常性能的实例包括形态及生化改变，如细胞异常包括肿瘤如黑素瘤、自身免疫缺陷等。
本发明还提供了一种鉴定针对CTL靶的前体的方法。当靶细胞是肿瘤时这些前体是指肿瘤排斥抗原，但必须指出的是当细胞异常不是肿瘤时，将该分子指作肿瘤排斥抗原则导致歧义。重要的是，本方法包含鉴定一种是前述类型的胞溶性T细胞的靶的细胞。一旦该细胞被鉴定，将总RNA转变为cDNA文库，然后将其转染进可呈递与相关HLA分子形成复合物的抗原的细胞样品中。将转染子与前述CTL接触，同样观察CTL所致的定向(溶解和/或TNF产生)。随后处理溶解的转染子以提取cDNA并测序，以该方式可鉴定异常情况下的前体如肿瘤排斥抗原前体。
本发明的其它方面将为本领域技术人员所熟知，在这不需要重复。
本文所用术语及表达法是用作阐述术语而非限制，且在应用这些术语及表达法时没有排斥其它等价特征的意图，可以确证，在本发明范围内可做适当修改。
序列表
(1)一般信息
(ⅰ)申请人：伯恩纳德·莱特，文森特·布里夏尔，阿兰·范佩尔，蒂尔瑞·博恩-法勒尔
(ⅱ)发明名称：分离的酪氨酸酶衍生肽及其应用
(ⅲ)序列数：13
(ⅳ)通讯地址：
    (A)收信人：Felfe & Lynch
    (B)街道：805 Third Avenue
    (C)城市：纽约市
    (D)州：纽约州
    (E)国家：美国
    (F)邮编：10022
(ⅴ)计算机可读形式
    (A)媒介类型：3.5英寸软盘，360kb存储
    (B)计算机：IBM PS/2
    (C)操作系统：PC-DOS
    (D)软件：Wordperfect
(ⅵ)本申请资料：
    (A)申请号：
    (B)申请日
    (C)分类
(ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：08/587,391
    (B)申请日：1996年1月17日
    (C)分类：514
(ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：08/233,305
    (B)申请日：1994年4月26日
    (C)分类：514
(ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：08/203,054
    (B)申请日：1994年2月28日
(ⅶ)在先申请资料：
    (A)申请号：08/081,673
(B)申请日：1993年6月23日(ⅶ)在先申请资料：
(A)申请号：08/054,714
(B)申请日：1993年4月28日(ⅶ)在先申请资料：
(A)申请号：07/994,928
(B)申请日：1992年12月22日(ⅷ)律师/代理人信息
(A)姓名：NormanD.Hanson
(B)注册号：30,946
(C)卷号：LUD 5341-PCT(ⅸ)电讯信息：
(A)电话：(212)688-9200
(B)电传：(212)838-3884
(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：1894bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1GGA AGA ATG CTC CTG GCT GTT TTG TAC TGC CTG CTG TGG AGT TTC CAG   48Gly Arg Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln
        -15                 -10                  -5ACC TCC GCT GGC CAT TTC CCT AGA GCC TGT GTC TCC TCT AAG AAC CTG   96Thr Ser Ala Gly His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu
     1               5                   10ATG GAG AAG GAA TGC TGT CCA CCG TGG AGC GGG GAC AGG AGT CCC TGT  144Met Gly Lys Glu Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys15                  20                  25                  30GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT TCC TGT CAG AAT ATC CTT CTG TCC AAT  192Gly Gln Leu Ser Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn
             35                  40                  45GCA CCA CTT GGG CCT CAA TTT CCC TTC ACA GGG GTG GAT GAC CGG GAG  240Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu
         50                  55                  60TCG TGG CCT TCC GTC TTT TAT AAT AGG ACC TGC CAG TGC TCT GGC AAC  288Ser Trp Pro Ser Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn
     65                  70                  75TTC ATG GGA TTC AAC TGT GGA AAC TGC AAG TTT GGC TTT TGG GGA CCA  336Phe Met Gly Phe Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro
 80                  85                  90AAC TGC ACA GAG AGA CGA CTC TTG GTG AGA AGA AAC ATC TTC GAT TTG  384Asn Cys Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu95                 100                 105                 110AGT GCC CCA GAG AAG GAC AAA TTT TTT GCC TAC CTC ACT TTA GCA AAG  432Ser Ala Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys
            115                 120                 125CAT ACC ATC AGC TCA GAC TAT GTC ATC CCC ATA GGG ACC TAT GGC CAA  480His Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln
        130                 135                 140ATG AAA AAT GGA TCA ACA CCC ATG TTT AAC GAC ATC AAT ATT TAT GAC  528Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp
    145                 150                 155CTC TTT GTC TGG ATG CAT TAT TAT GTG TCA ATG GAT GCA CTG CTT GGG  576Leu Phe Val Trp Ile His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly
160                 165                 170GGA TCT GAA ATC TGG AGA GAC ATT GAT TTT GCC CAT GAA GCA CCA GCT  624Gly Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala175                 180                 185                 190TTT CTG CCT TGG CAT AGA CTC TTC TTG TTG CGG TGG GAA CAA GAA ATC  672Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Gly Ile
            195                 200                 205CAG AAG CTG ACA GGA GAT GAA AAC TTC ACT ATT CCA TAT TGG GAC TGG  720Gln Lys Leu Thr Gly Asp Gly Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp
        210                 215                 220CGG GAT GCA GAA AAG TGT GAC ATT TGC ACA GAT GAG TAC ATG GGA GGT  768Arg Asp Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Gly Tyr Met Gly Gly
    225                 230                 235CAG CAC CCC ACA AAT CCT AAC TTA CTC AGC CCA GCA TCA TTC TTC TCC  816Gln His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser
240                 245                 250TCT TGG CAG ATT GTC TGT AGC CGA TTG GAG GAG TAC AAC AGC CAT CAG  864Ser Trp Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln255                 260                 265                 270TCT TTA TGC AAT GGA ACG CCC GAG GGA CCT TTA CGG CGT AAT CCT GGA  912Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly
            275                 280                 285AAC CAT GAC AAA TCC AGA ACC CCA AGG CTC CCC TCT TCA GCT GAT GTA  960Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val
        290                 295                 300GAA TTT TGC CTG AGT TTG ACC CAA TAT GAA TCT GGT TCC ATG GAT AAA 1008Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys
    305                 310                 315GCT GCC AAT TTC AGC TTT AGA AAT ACA CTG GAA GGA TTT GCT AGT CCA 1056Ala Ala Asn Phe Ser Phe Arg Ash Thr Leu Glu Gly Phe Als Ser Pro
320                 325                 330CTT ACT GGG ATA GCG GAT GCC TCT CAA AGC AGC ATG CAC AAT GCC TTG  1104Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu335                 340                 345                 350CAC ATC TAT ATG AAT GGA ACA ATG TCC CAG GTA CAG GGA TCT GCC AAC  1152His Ile Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Met Gln Gly Ser Ala Asn
            355                 360                 365GAT CCT ATC TTC CTT CTT CAC CAT GCA TTT GTT GAC AGT ATT TTT GAG  1200Asp Pro Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu
        370                 375                 380CAG TGG CTC CAA AGG CAC CGT CCT CTT CAA GAA GTT TAT CCA GAA GCC  1248Gln Trp Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala
    385                 390                 395AAT GCA CCC ATT GGA CAT AAC CGG GAA TCC TAC ATG GTT CCT TTT ATA  1296Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile
400                 405                 410CCA CTG TAC AGA AAT GGT GAT TTC TTT ATT TCA TCC AAA GAT CTG GGC  1344Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly415                 420                 425                 430TAT GAC TAT AGC TAT CTA CAA GAT TCA GAC CCA GAC TCT TTT CAA GAC  1392Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp
            435                 440                 445TAC ATT AAG TCC TAT TTG GAA CAA GCG AGT CGG ATC TGG TCA TGG CTC  1440Tyr Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp Leu
        450                 455                 460CTT GGG GCG GCG ATG GTA GGG GCC GTC CTC ACT GCC CTG CTG GCA GGG  1488Leu Gly Ala Ala Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly
    465                 470                 475CTT GTG AGC TTG CTG TGT CGT CAC AAG AGA AAG CAG CTT CCT GAA GAA  1536Leu Val Ser Leu Leu Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu Glu
480                 485                 490AAG CAG CCA CTC CTC ATG GAG AAA GAG GAT TAC CAC AGC TTG TAT CAG  1584Lys Gln Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln495                 500                 505                 510AGC CAT TTA1593Ser His Leu
    513TAAAAGGCTT AGGCAATAGA GTAGGGCCAA AAAGCCTGAC CTCACTCTAA CTCAAAGTAA  1653TGTCCAGGTT CCCAGAGAAT ATCTGCTGGT ATTTTTCTGT AAAGACCATT TGCAAAATTG  1713TAACCTAATA CAAAGTGTAG CCTTCTTCCA ACTCAGGTAG AACACACCTG TCTTTGTCTT  1773GCTGTTTTCA CTCAGCCCTT TTAACATTTT CCCCTAAGCC CATATGTCTA AGGAAAGGAT  1833GCTATTTGGT AATGAGGAAC TGTTATTTGT ATGTGAATTA AAGTGCTCTT ATTTTAAAAA  1893A                                                                  1894(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQIDNO:2Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val
             5(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu
             5                   10(2)SEQ ID NO:4的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu
             5(2)SEQ ID NO:5的信息：  (ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu
             5(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：13个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala
             5                   10(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala
             5                   10(2)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
             5(2)SEQ ID NO:9的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala
             5(2)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：10个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe
         5                       10(2)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
             5(2)SEQ ID NO:12的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe
             5(2)SEQ ID NO:13的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)拓朴结构：线性(ⅸ)特征：
(D)其它特征：Xaa可以是任何氨基酸(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
             5

Claims (17)

1、鉴定作为用特异于HLA-B44分子与式为Xaa Glu Ile Trp ArgAsp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)肽的复合物的治疗剂进行治疗的候选者的方法，其中Xaa可以是除丝氨酸外的任何氨基酸，该方法包括：
(ⅰ)将取自病人的异常细胞样品与特异于所述复合物的胞溶性T细胞接触，以及
(ⅱ)确定所述异常细胞样品的至少部分溶解，以作为所述治疗候选者的指征。
2、如权利要求1的方法，其中所述MHC分子是HLA-B*4402。
3、如权利要求1的方法，其中所述MHC分子是HLA-B*4403。
4、治疗细胞异常病人的方法，包括给予所述病人一定量的制剂，该制剂可诱发胞溶性T细胞对在其表面呈递HLA-B44分子与式为Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)的复合物的细胞的应答，其中Xaa可以是除丝氨酸外的任何氨基酸，所述的量足以诱发对在其表面呈递所述复合物的异常细胞的应答。
5、如权利要求4的方法，其中所述MHC分子HLA-B*4402。
6、如权利要求4的方法，其中所述MHC分子HLA-B*4403。
7、如权利要求4的方法，其中所述制剂包括编码人酪氨酸酶的载体。
8、如权利要求7的方法，其中所述制剂还包括编码HLA-B44分子的第二种载体。
9、如权利要求7的方法，其中所述载体也编码HLA-B44分子。
10、如权利要求4的方法，其中所述制剂是一种在其表面呈递所述复合物的非增殖性细胞样品。
11、治疗细胞异常的方法，包括给予患有特征在于在异常细胞表面呈递HLA-B44分子与式为Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQID NO:12)肽的复合物的细胞异常患者一定量的特异于所述复合物的胞溶性T细胞，所述的量足以溶解所述异常细胞，其中Xaa可以是除丝氨酸外的任何氨基酸。
12、如权利要求11的方法，其中所述胞溶性T细胞是自身的。
13、分离的特异于HLA-B44分子与式为Xaa Glu Ile Trp Arg AspIle Asp Phe(SEQ ID NO:12)肽的复合物的胞溶性T细胞，其中Xaa是除丝氨酸外的任何氨基酸。
14、鉴定在其表面呈递HLA-B44分子与式为Xaa Glu Ile Trp ArgAsp Ile Asp Phe(SEQ IN NO:12)肽的复合物的异常细胞的方法，其中Xaa是除丝氨酸外的任何氨基酸，该方法包括将异常细胞样品与特异于所述复合物的胞溶性T细胞接触，并检测所述异常细胞的溶解，以作为呈递所述复合物的细胞的指征。
15、式为Xaa Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO:12)的分离的肽，其中Xaa是除丝氨酸外的任何氨基酸。
16、如权利要求15的分离的肽，其中Xaa是Tyr。
17、如权利要求15的分离的肽，其中Xaa是Ala。
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