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CN120943884A - 使用紫外线信号实时监测滴度 - Google Patents

使用紫外线信号实时监测滴度

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CN120943884A
CN120943884A CN202510782081.3A CN202510782081A CN120943884A CN 120943884 A CN120943884 A CN 120943884A CN 202510782081 A CN202510782081 A CN 202510782081A CN 120943884 A CN120943884 A CN 120943884A
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CN
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protein
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于德强
刘晓明
马超
J·李
李正剑
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Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

本发明涉及使用紫外线信号实时监测滴度的方法，具体涉及控制、调节、增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，其包括在收获橇中蛋白质过滤期间实时监测该样品混合物的紫外线(UV)信号。

Description

使用紫外线信号实时监测滴度
本申请是申请日为2019年3月26日、中国申请号为201980022884.1、发明名称为“使用紫外线信号实时监测滴度”的发明申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及一种监测组合物中的生物分子例如蛋白质的浓度的方法。具体地，本公开涉及一种在蛋白质过滤期间使用实时紫外线信号监测、控制、调节或增加组合物中的蛋白质产率的方法。
背景技术
目前正在开发许多种治疗性蛋白质(例如，单克隆抗体(mAb))，并且许多公司的产品线中具有多种抗体。基本单元操作(诸如收获、蛋白A亲和色谱和另外精制步骤)用于纯化感兴趣的蛋白。
上游和回收操作的目的是细胞培养和回收过程中高生产力的治疗性蛋白，并且多种联机配置可用于监测生物处理操作。参见，Whitford W.,Julien C.Bioprocess Int.(5),S32–S45(2007)。最近已经实现了对细胞培养过程的实时监测和控制。已表明，CHO细胞培养物中非存活亚群的增加可以预测稳定期的出现，这表明了全自动细胞培养过程以及可靠且可重复地控制培养增殖期间的补料分批添加的的机会。Sitton G.,SriencF.J.Biotechnol.,135(2008),174-180。其他人在初级回收过程中利用了多个步骤来去除生物质并澄清用于下游柱色谱的进料流。Bink L.R.,Furey J.BioProcess Int.8(3)2010,44–49,57(2010)。
一些人通过解决上游步骤以增加下游产率来解决提高蛋白质产率的问题。例如，其他人试图通过使用蠕动泵和隔膜泵来降低磁悬浮无轴承离心泵对CHO细胞的机械应力。Blaschczok K.,等人Chemie Ingenieur Technik,(85),144-152(2013)。还有，其他人通过研究回收和早期下游处理(包括离心、深层过滤和蛋白A捕获色谱)期间产生单克隆抗体的细胞系的上清液中宿主细胞蛋白的动力学和命运，对蛋白质组学方法进行了评估。Hogwood,C.E.M.,等人Biotechnol.Bioeng.2013(110),240–251。但是，一些过程需要额外的步骤，如荧光标记，以鉴定纯化过程期间的蛋白质浓度和产率。Ignatova和Gierasch,Proc Natl Acad Sci U S A.；101(2):523-8(2004)。添加额外的杂质可能需要进行可影响产率的额外纯化步骤。
因此，仍然需要实时监测和控制回收过程，以增加回收产率和过程稳健性，快速评估上游性能，并促进分批处理过程中或在更关键的连续过程中的即时下游处理。
发明内容
本文公开了新的实时监测和控制过程和系统，其经设计和检查用于几种治疗性蛋白质的基于过滤的细胞培养物收获过程，例如深层过滤收获。本文所述的方法提供了相对于现有技术的若干优点。首先，收获橇的设计具有对关键工艺参数和质量属性进行实时监测和控制的能力。第二，它使用建模方法将澄清的原液的在线UV信号转化为靶产物的实时滴度。第三，使用这种收获橇和实时滴度可自动控制收获过程并改善过程产率、稳健性和一致性。最后，使用滴度信息来证明细胞培养性能并指导下游纯化的即时处理。
该新技术的核心是在收获过程期间应用实时监测UV信号，并将在线UV信号转化为实时靶蛋白质浓度。本文公开的模型可以应用于具有不同细胞特性和生产力水平的若干过程。使用此系统，可以以定量方式确定澄清的原液收集的开始和结束，这可以显著改善收获物的稳健性和蛋白质产率。
本文公开的方法提供了对收获橇在细胞培养物澄清过程中的应用的深入了解。本文公开的新收获过程改善了蛋白质产率，同时可扩展，可自动控制并且可适用于具有多种特性的多重产物。实时滴度信息可用于展示细胞培养性能并指导即时下游处理。
本文公开了一种实时监测包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中的靶蛋白质浓度(滴度)的方法，该方法包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，监测所述样品混合物的实时紫外线(UV)信号并且使用已建立的模型自动将所述UV信号转换为靶蛋白质滴度。
本文还公开了一种控制靶蛋白质的收集并且改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，该方法包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，监测所述样品混合物的实时紫外线(UV)信号。
在一些实施方案中，根据已建立的模型和自动控制，将所述UV信号连续转换为所述靶蛋白质的滴度。
在一些实施方案中，所述靶蛋白质的滴度为至少约0.01g/L、至少约0.02g/L、至少约0.03g/L、至少约0.04g/L、至少约0.05g/L、至少约0.06g/L、至少约0.07g/L、至少约0.08g/L、至少约0.09g/L、至少约0.1g/L、至少约0.2g/L、至少约0.3g/L、至少约0.4g/L、至少约0.5g/L、至少约0.6g/L、至少约0.7g/L、至少约0.8g/L、至少约0.9g/L、至少约1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约6.5g/L、至少约7g/L、至少约7.5g/L、至少约8g/L、至少约8.5g/L、至少约9g/L、至少约9.5g/L、至少约10g/L、至少约10.5g/L、至少约11g/L、至少约11.5g/L、至少约12g/L、至少约12.5g/L、至少约13g/L、至少约13.5g/L、至少约14g/L、至少约14.5g/L、至少约15g/L、至少约15.5g/L、至少约16g/L、至少约16.5g/L、至少约17g/L、至少约17.5g/L、至少约18g/L、至少约18.5g/L、至少约19g/L、至少约19.5g/L或至少约20g/L。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括当所述滴度为至少约0.05g/L、至少约0.06g/L、至少约0.07g/L、至少约0.08g/L、至少约0.09g/L、至少约0.1g/L、至少约0.2g/L、至少约0.3g/L、至少约0.4g/L、至少约0.5g/L、至少约0.6g/L、至少约0.7g/L、至少约0.8g/L、至少约0.9g/L、至少约1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约6.5g/L、至少约7g/L、至少约7.5g/L、至少约8g/L、至少约8.5g/L、至少约9g/L、至少约9.5g/L、至少约10g/L、至少约10.5g/L、至少约11g/L、至少约11.5g/L、至少约12g/L、至少约12.5g/L、至少约13g/L、至少约13.5g/L、至少约14g/L、至少约14.5g/L、至少约15g/L、至少约15.5g/L、至少约16g/L、至少约16.5g/L、至少约17g/L、至少约17.5g/L、至少约18g/L、至少约18.5g/L、至少约19g/L、至少约19.5g/L或至少约20g/L时开始收集所述靶蛋白质。
在一些实施方案中，收集的所述靶蛋白质的滴度在约0.05g/L和约20g/L之间、在约0.1g/L和约20g/L之间、在约0.2g/L和约20g/L之间、在约0.3g/L和约20g/L之间、在约0.4g/L和约20g/L之间、在约0.5g/L和约20g/L之间、在约0.6g/L和约20g/L之间、在约0.7g/L和大约20g/L之间、在约0.8g/L和约20g/L之间、在约0.9g/L和约20g/L之间、在约1g/L和约20g/L之间、在约0.05g/L和约15g/L之间、在约0.1g/L和约15g/L之间、在约0.2g/L和约15g/L之间、在约0.3g/L和约15g/L之间、在约0.4g/L与约15g/L之间、在约0.5g/L与约15g/L之间、在约0.6g/L和约15g/L之间、在约0.7g/L和约15g/L之间、在约0.8g/L和约15g/L之间、在约0.9g/L和约15g/L之间或在约1g/L和约15g/L之间、在约0.05g/L和约10g/L之间、在约0.1g/L和约10g/L之间、在约0.2g/L和约10g/L之间、在约0.3g/L和约10g/L之间、在约0.4g/L和约10g/L之间、在约0.5g/L和约10g/L之间、在约0.6g/L和约10g/L之间、在约0.7g/L和约10g/L之间、在约0.8g/L和约10g/L之间、在约0.9g/L和约10g/L之间或在约1g/L和约10g/L之间。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括当所述收集滴度低于约0.1或0.2g/L时停止所述靶蛋白质的收集。
在一些实施方案中，与在未实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，所述靶蛋白质产率增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
在一些实施方案中，所述靶蛋白质是从细胞密度为至少约1X 10 6个细胞/mL、至少约5X 106个细胞/mL、至少约1X 107个细胞/mL、至少约1.5X 107个细胞/mL、至少约2X 107个细胞/mL、至少约2.5X 107个细胞/mL、至少约3X 107个细胞/mL、至少约3.5X 107个细胞/mL、至少约4X 107个细胞/mL、至少约4.5X 107个细胞/mL或至少约5X 107个细胞/mL的培养基中收获的。
在一些实施方案中，所述蛋白质过滤是深层过滤。在一些实施方案中，所述深层过滤包括初级深层过滤器和/或次级深层过滤器。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在所述监测之前加载所述样品混合物。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在加载所述细胞培养物之前用水或缓冲液冲洗所述深层过滤器，并在加载所述细胞培养物之后追捕所述深层过滤器。在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其他缓冲液追捕所述样品混合物。在一些实施方案中，所述基于过滤的细胞培养物收获过程包括收获橇。在一些实施方案中，所述收获橇包括控制系统，其中当达到设定的滴度时，所述控制系统自动开始收集所述蛋白质。在一些实施方案中，所述收获橇包括控制系统，其中当达到设定的滴度时，所述控制系统自动开始收集所述蛋白质。在一些实施方案中，所述收获橇包括控制系统，其中当达到设定的滴度时，所述控制系统自动停止收集所述蛋白质。在一些实施方案中，所述控制系统调节液体通过所述收获橇的流速。在一些实施方案中，所述控制系统自动驱动泵，以上调通过所述收获橇的流速。在一些实施方案中，所述控制系统自动驱动泵，以下调通过所述收获橇的流速。在一些实施方案中，本文公开的方法不包括气体放空的步骤。在一些实施方案中，所述靶蛋白质滴度或所述蛋白产率不基于体积。
在一些实施方案中，本文公开一种增加、控制或调节包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，该方法包括(a)用水冲洗收获橇；(b)将所述样品加载到所述收获橇中；(c)将在所述收获橇中的蛋白质过滤期间的样品混合物的紫外线信号测量为实时蛋白质滴度；(d)基于紫外线度量和实时蛋白质滴度开始收集所述蛋白质；(e)用PBS追捕所述蛋白质；和(f)基于紫外线度量和实时蛋白质滴度停止收集所述蛋白质；其中所述UV信号与过滤期间的实时蛋白滴度相关。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量压力、浊度、温度、流速或其任何组合。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用压力传感器测量压力。在一些实施方案中，测量的压力范围为-10磅/平方英寸(psi)至50psi、-10psi至40psi、-9psi至40psi、-8psi至40psi、-7psi至30psi、-6psi至-20psi、-7psi至40psi、-8psi至40psi、-9psi至45psi、-10psi至-45psi或-7psi至-45psi。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量浊度。在一些实施方案中，测量的浊度的范围为0个吸光度单位(AU)至2个AU。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量温度。在一些实施方案中，测量的温度的范围为0℃至70℃、0℃至60℃、0℃至50℃、0℃至40℃、5℃至70℃、10℃至70℃、15℃至70℃、20℃至70℃、10℃至60℃、20℃至50℃、20℃至40℃、20℃至45℃、30℃至40℃、35℃至40℃、20℃至30℃、35℃至40℃、或25℃至45℃。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量流量。在一些实施方案中，测量的流量的范围为0L/min至20L/min、.0L/min至30L/min、0L/min至40L/min、0L/min至50L/min、0L/min至60L/min、0L/min至70L/min、0L/min至80L/min、0L/min至90L/min、0L/min至100L/min、0L/min至110L/min、0L/min至120L/min、0L/min至130L/min、0L/min至140L/min、0L/min至150L/min、0L/min至160L/min、0L/min至170L/min、0L/min至180L/min、0L/min至190L/min、0L/min至200L/min、0L/min至250L/min、或0L/min至300L/min。
在一些实施方案中，所述收获橇包含一个或多个过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器包括初级深层过滤器和次级深层过滤器。在一些实施方案中，所述样品混合物选自纯蛋白样品、澄清的原液蛋白质样品、细胞培养物样品及其任何组合。
在一些实施方案中，所述蛋白质是在包含哺乳动物细胞的培养物中产生的。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、Madin-Darby牛肾细胞(MDBK)或其任何组合。
在一些实施方案中，所述蛋白质包含抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体和抗IL8抗体。在一些实施方案中，所述蛋白质是阿巴西普或贝拉西普。
在一些实施方案中，本文公开一种用于实时监测和控制蛋白质产率的系统，其中所述系统包含传感器，该传感器测量包含靶蛋白质和杂质的样品混合物的实时UV信号。
在一些实施方案中，所述系统进一步包含测量压力、浊度、温度、流量、重量或其任意组合的传感器。
在一些实施方案中，一种设备包含传感器，所述传感器经配置以测量包含靶蛋白质和杂质的样品混合物的UV信号。在一些实施方案中，所述处理器经配置以控制所述靶蛋白质的收集。在一些实施方案中，所述处理器经配置以使用靶蛋白质滴度。在一些实施方案中，所述处理器经配置以使用已建立的模型来确定细胞培养物收获过程。在一些实施方案中，所述细胞培养物收获过程包括基于过滤的细胞培养物收获过程。在一些实施方案中，一种系统包含包含传感器的设备，所述传感器经配置以测量包含靶蛋白质和杂质的样品混合物的UV信号。
在一些实施方案中，公开的系统供在本文所述的方法中使用。
附图说明
图1A示出了示例性的收获橇的机械设计和收获橇的物理图。所有值均以英寸为单位列出。
图2示出了使用新的收获橇的细胞培养物收获过程的工艺流程图。各种方框显示了在线测量传感器、控制模块和物理仪器。
图3示出了本文所述的用于将UV信号建模成产物滴度的实验设计。
图4示出了旧的和新的收获方法之间的图形比较。与以前的方法相比，新方法消除了气体放空步骤。同时，可以基于在线UV读数和计算的滴度自动控制新方法中澄清原液收集的开始和结束。更具体地说，可以使用本文生成和测试的模型，通过在线UV传感器读数来计算收获过程期间的实时靶蛋白质浓度。因此，可以直接根据计算的在线靶蛋白质浓度确定原液收集的截止点。可以将计算算法集成到Delta VTM控制系统中，以实现澄清原液收集的自动截止点。
图5示出了使用GITR细胞培养物的连续稀释样品针对在线UV信号的离线滴度测量。
图6A和图6B示出了使用纯蛋白质(图6A)和澄清原液(图6B)针对小规模收获过程的在线UV信号的离线滴度测量值。测试收获过程期间的在线UV和离线滴度值。
图7A、图7B和图7C示出了使用抗GITR抗体细胞培养物(图7A)、阿巴西普细胞培养物(图7B)和抗CXCR4抗体细胞培养物(图7C)针对大规模收获过程的在线UV信号的离线滴度测量值。
图8A和图8B示出了离线滴度测量值针对在线UV值的线性拟合(图8A)；基于UV的预测的滴度针对实际滴度的线性拟合(图8B)。
图9A和图9B示出了离线滴度测量值针对在线UV值的非线性拟合(图9A)；基于UV的预测的滴度针对实际滴度的线性拟合(图9B)。
图10示出了研究的七种分子的模型预测的滴度和实际滴度之间的平均差异(HPLC分析)，所述七种分子包括Aba J、抗CD73抗体、抗GITR抗体、抗IL8抗体、抗CXCR4抗体、抗-OX40抗体和抗TIGIT抗体。
图11示出了在线UV示踪，通过UV信号建模获得的滴度示踪以及离线确定的滴度的比较。Y轴显示离线确定的滴度(g/L)或基于UV建模的滴度(g/L)，且X轴显示时间(min)。三角形线显示在线UV，正方形线显示基于UV建模的滴度(g/L)，且菱形线显示离线滴度(g/L)。
具体实施方式
提供了可以用于控制、调节或增加蛋白质产率的多种方法。方法包括在纯化步骤期间，例如在收获橇中进行蛋白质过滤期间，使用实时测量样品混合物的紫外线(UV)信号来控制、调节或增加蛋白质产率。该方法利用UV信号根据本文公开的式提供靶蛋白的滴度，其基于是从加载开始到加载结束还是在加载结束之后发生收集而有所不同。
本文还公开了与本文提供的方法有关的多种系统和设备。
a.术语
应注意的是，术语“一(a)”或“一(an)”实体是指一个或多个该实体；例如，“核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。这样，术语“一”(或“一”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
此外，在本文使用的“和/或”应被理解为两个指定的特征或组分中的每个与另一个在一起或不在一起的具体公开。因此，在本文中诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
类似地，除非上下文另外明确指出，否则词语“或”旨在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并提供用于描述。
应当理解，无论在本文何处用语言“包含”来描述方面，都还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”的方式描述的类似方面。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关的本领域普通技术人员通常理解的相同含义。例如，The Concise Dictionary of Biomedicineand Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary ofCell and Molecular Biology,第2版,1999,Academic Press；和the Oxford DictionaryOf Biochemistry And Molecular Biology,Revised,2000,Oxford University Press向技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其Système International de Unites(SI)接受的形式表示。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基至羧基的方向从左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，可以通过整体参考本说明书来获得本公开的各个方面。因此，通过参考整个说明书更完整地定义了下面紧接定义的术语。
术语“约”在本文中用来表示近似、大致、大约或在其区域中。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展所述数值的上下边界来修改该范围。因此，“约10-20”是指“约10至约20”。通常，术语“约”可以以高于或低于(更高或更低)例如10％的方差来修改数值，使其高于或低于所示值。
“建模”或“蛋白质建模”是指建立线性拟合以确定测试蛋白质的滴度(例如，以g/L计)的方法。在一个实施方案中，建模包括从开始收集到结束加载的方法(例如，上倾斜建模)。在另一个实施方案中，建模包括开始追捕以结束收集(例如，下倾斜建模)。在其他实施方案中，建模包括上倾斜建模和下倾斜建模二者。
“蛋白质产率”或“产率”是指在本文公开的过程之后回收的蛋白质的总量。蛋白质产率可以以克或以固定体积的终浓度(例如mg/ml)测量。产率百分比也可以以占起始蛋白质(例如原液酶)的量的百分比来度量。
本文所用的术语“控制蛋白质产率”可以指调节、测试或验证在本文所公开的过程期间收集的终产物(例如蛋白质)。在一些实施方案中，通过实时改变UV信号以影响关键的过程参数和质量属性并调节蛋白质产率来实现控制蛋白质产率。在一些实施方案中，控制蛋白质产率是指在本文公开的方法期间保持恒定的UV信号以便获得期望的蛋白质产率。
如本文所用，术语“调节蛋白质产率”是指改变、变化或更改在本文公开的过程期间收集的终产物(例如蛋白质)。调节蛋白质产率改变蛋白质终产物的产率，其可以被增加、减少或抑制。在一些实施方案中，该过程调节蛋白质产率，这导致蛋白质产率的增加。在一些实施方案中，通过实时改变UV信号以影响关键的过程参数和质量属性并调节蛋白质产率来实现调节蛋白质产率。
如本文所述的收获橇，包括用于实时澄清和蛋白质产率增加的多个传感器。收获橇或“橇”包括一个或多个压力传感器、一个或多个流量传感器、一个或多个紫外线(UV)传感器、一个或多个重量传感器、一个或多个浊度传感器和/或一个或多个温度传感器。
“滴度”是指溶液中物质的量或浓度。如本文所述，使用上倾斜建模和下倾斜建模来确定滴度。
如本文所用，术语“ug”和“uM”可分别与“μg”和“μM”互换使用。
在以下小节中进一步详细描述本文所述的各个方面。
b.方法和用途
本公开基于实时UV监视和控制关键过程参数和质量属性的能力。本方法允许使用建模方法将澄清原液的在线UV信号转化为靶产物的实时滴度。然后，本方法可用于自动控制收获过程并改善过程产率、稳健性和一致性。滴度信息还可用于证明细胞培养物的性能并指导下游纯化的即时处理。在一些实施方案中，本文公开了一种控制或调节包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，该方法包括在收获橇中的蛋白质过滤期间实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号。
在一个实施方案中，本公开包括一种实时监测包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中的靶蛋白质浓度(滴度)的方法，该方法包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号，并使用已建立的模型自动将UV信号转换为靶蛋白质滴度。在另一个实施方案中，本发明提供了一种控制靶蛋白质收集并改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白产率的方法，该方法包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号。
本文还公开了一种增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，该方法包括在基于过滤的细胞培养物收获过程(例如在收获橇中的蛋白质过滤)期间，实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号。
蛋白质收获/纯化包括从蛋白质与杂质如细胞、细胞培养基、DNA、RNA、其他蛋白质等的混合物中分离或纯化靶蛋白质的多个步骤。澄清细胞培养液可以是纯化靶蛋白所需的详细步骤顺序中的第一个下游单元操作。离心和/或过滤(例如深层过滤)的组合用于该操作。因此，可以监测实时蛋白质浓度的大规模过滤技术(例如深层过滤)的可用性可以提供改善和简化下游过程的能力。
大规模深层过滤系统在生物处理产业中是常见的。在一些实施方案中，深层过滤系统可以利用如图2所示的收获橇。收获前，用水或适当的缓冲液冲洗深层过滤器，以去除过滤器制造过程中的松散颗粒和可提取物。收获橇可包括一个过滤器或多个过滤器，例如初级深层过滤器和次级深层过滤器。可以从生物反应器获得包括靶蛋白质的细胞培养基，并且可以将其加载到(或泵送到)一个或多个过滤器上，例如初级过滤器和次级过滤器。然后，在加载的细胞培养基已经通过过滤系统(例如初级过滤器或次级过滤器)之后，可以测量实时UV信号。然后，可以在一个或多个罐中获得过滤的产物。收获完成后，再次冲洗过滤器以回收滞留在外壳中的有价值的产物。后续利用的冲洗可实现50％至90％的收获产率，并确保产物损失最小。因此，本发明的方法旨在将蛋白质收获的产率提高至少1％、至少2％、至少3％、至少提高4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％或至少25％。
在一些实施方案中，UV信号提供从加载开始到加载结束和/或加载结束之后直至过滤结束的靶蛋白质的滴度。在一些实施方案中，可以根据式(I)计算从加载开始到加载结束的靶蛋白质的滴度：
模型预测的滴度＝a+b*(在线UV信号)。(I)
在一些实施方案中，可以根据式(I)计算从加载开始到加载结束的靶蛋白的滴度，其包含常数(a)和(b)。
在一些实施方案中，(a)为0和-1.0之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.1和-0.9之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.2和-0.8之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.3和-0.7之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.4和-0.6之间的值。
在一些实施方案中，(a)为-0.2和-0.5之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.25和-0.45之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.30和-0.40之间的值。
在一些实施方案中，(a)为-0.5和-0.9之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.55和-0.85之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.60和-0.80之间的值。在一些实施方案中，(a)为-0.65和-0.75之间的值。
在一些实施方案中，(a)为约-0.1。在一些实施方案中，(a)为约-0.15。在一些实施方案中，(a)为约-0.2。在一些实施方案中，(a)为约-0.25。在一些实施方案中，(a)为约-0.3。在一些实施方案中，(a)为约-0.35。在一些实施方案中，(a)为约-0.4。在一些实施方案中，(a)为约-0.45。在一些实施方案中，(a)为约-0.5。在一些实施方案中，(a)为约-0.55。在一些实施方案中，(a)为约-0.6。在一些实施方案中，(a)为约-0.65。在一些实施方案中，(a)为约-0.7。在一些实施方案中，(a)为约-0.75。在一些实施方案中，(a)为约-0.8。在一些实施方案中，(a)为约-0.85。在一些实施方案中，(a)为约-0.9。在一些实施方案中，(a)为约-0.95。在一些实施方案中，(a)为约-1.0。
在一些实施方案中，(a)为-0.35。在一些实施方案中，(a)为-0.69。在一个实施方案中，细胞类型是DG44，且(a)为-0.35。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(a)是-0.69。
在一些实施方案中，(b)为1.0和5.0之间的值。在一些实施方案中，(b)为1.5和4.5之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.0和4.0之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.5和3.5之间的值。
在一些实施方案中，(b)为2.0和3.6之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.1和3.5之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.2和3.4之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.3和3.3之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.4和3.2之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.5和3.1之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.6和3.0之间的值。在一些实施方案中，(b)为2.7和2.9之间的值。
在一些实施方案中，(b)为3.3和4.8之间的值。在一些实施方案中，(b)为3.4和4.7之间的值。在一些实施方案中，(b)为3.5和4.6之间的值。在一些实施方案中，(b)为3.6和4.5之间的值。在一些实施方案中，(b)为3.7和4.4之间的值。在一些实施方案中，(b)为3.8和4.3之间的值。在一些实施方案中，(b)为3.9和4.2之间的值。在一些实施方案中，(b)为4.0和4.1之间的值。
在一些实施方案中，(b)为约2.0。在一些实施方案中，(b)为约2.1。在一些实施方案中，(b)为约2.2。在一些实施方案中，(b)为约2.3。在一些实施方案中，(b)为约2.4。在一些实施方案中，(b)为约2.5。在一些实施方案中，(b)为约2.6。在一些实施方案中，(b)为约2.7。在一些实施方案中，(b)为约2.8。在一些实施方案中，(b)为约2.9。在一些实施方案中，(b)为约3.0。在一些实施方案中，(b)为约3.1。在一些实施方案中，(b)为约3.2。在一些实施方案中，(b)为约3.3。在一些实施方案中，(b)为约3.4。在一些实施方案中，(b)为约3.5。在一些实施方案中，(b)为约3.6。在一些实施方案中，(b)为约3.7。在一些实施方案中，(b)为约3.8。在一些实施方案中，(b)为约3.9。在一些实施方案中，(b)为约4.0。在一些实施方案中，(b)为约4.1。在一些实施方案中，(b)为约4.2。在一些实施方案中，(b)为约4.3。在一些实施方案中，(b)为约4.4。在一些实施方案中，(b)为约4.5。在一些实施方案中，(b)为约4.6。在一些实施方案中，(b)为约4.7。在一些实施方案中，(b)为约4.8。在一些实施方案中，(b)为约4.9。在一些实施方案中，(b)为约5.0。
在一些实施方案中，(b)为2.88。在一些实施方案中，(b)为4.06。在一个实施方案中，细胞类型是DG44，且(b)为2.88。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(b)为4.06。在一些实施方案中，(a)为-0.35，且(b)为2.88。在一些实施方案中，(a)为-0.69，且(b)为4.06。在一个实施方案中，细胞类型为DG44，且(a)为-0.35，且(b)为2.88。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(a)为-0.69，且(b)为4.06。
在其他实施方案中，可以根据式(II)计算在加载结束后直至过滤结束的靶蛋白的滴度：
模型预测的滴度＝A+B*exp(C*在线UV信号)。(II)
在一些实施方案中，可以根据式(II)计算从加载开始到加载结束的靶蛋白的滴度，式(II)包含常数(A)、(B)和(C)。
在一些实施方案中，(A)为-2.5和1.0之间的值。在一些实施方案中，(A)为-2.0和0.5之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.5和0.0之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.0和-0.5之间的值。
在一些实施方案中，(A)为-1.5和-0.4之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.4和-0.5之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.3和-0.6之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.2和-0.7之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.1和-0.8之间的值。在一些实施方案中，(A)为-1.0和-0.9之间的值。
在一些实施方案中，(A)为-1.0和1.0之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.9和0.9之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.8和0.8之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.7和0.7之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.6和0.6之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.5和0.5之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.4和0.4之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.3和0.3之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.2和0.2之间的值。在一些实施方案中，(A)为-0.1和0.1之间的值。
在一些实施方案中，(A)为约-2.0。在一些实施方案中，(A)为约-1.9。在一些实施方案中，(A)为约-1.8。在一些实施方案中，(A)为约-1.7。在一些实施方案中，(A)为约-1.6。在一些实施方案中，(A)为约-1.5。在一些实施方案中，(A)为约-1.4。在一些实施方案中，(A)为约-1.3。在一些实施方案中，(A)为约-1.2。在一些实施方案中，(A)约为-1.1。在一些实施方案中，(A)为约-1.0。在一些实施方案中，(A)为约-0.9。在一些实施方案中，(A)为约-0.8。在一些实施方案中，(A)为约-0.7。在一些实施方案中，(A)为约-0.6。在一些实施方案中，(A)为约-0.5。在一些实施方案中，(A)为约-0.4。在一些实施方案中，(A)为约-0.3。在一些实施方案中，(A)为约-0.2。在一些实施方案中，(A)为约-0.1。在一些实施方案中，(A)为约0.1。在一些实施方案中，(A)为约0.2。在一些实施方案中，(A)为约0.3。在一些实施方案中，(A)为约0.4。在一些实施方案中，(A)为约0.5。在一些实施方案中，(A)为约0.6。在一些实施方案中，(A)为约0.7。在一些实施方案中，(A)为约0.8。在一些实施方案中，(A)为约0.9。在一些实施方案中，(A)为约1.0。
在一些实施方案中，(A)为-0.95。在一些实施方案中，(A)为0.02。在一个实施方案中，细胞类型是DG44，且(A)为-0.95。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(A)为0.02。
在一些实施方案中，(B)为-1.5和2.5之间的值。在一些实施方案中，(B)为-1.0和2.0之间的值。在一些实施方案中，(B)为-0.5和1.5之间的值。在一些实施方案中，(B)是0和1.0之间的值。
在一些实施方案中，(B)为-0.5和-0.4之间的值。在一些实施方案中，(B)为-0.4和-0.3之间的值。在一些实施方案中，(B)为-0.3和-0.2之间的值。在一些实施方案中，(B)为-0.2和-0.1之间的值。在一些实施方案中，(B)为-0.1和0.0之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.0和0.1之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.1和0.2之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.2和0.3之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.3和0.4之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.4和0.5之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.5和0.6之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.6和0.7之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.7和0.8之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.8和0.9之间的值。在一些实施方案中，(B)为0.9和1.0之间的值。在一些实施方案中，(B)是1.0和1.1之间的值。在一些实施方案中，(B)是1.1和1.2之间的值。在一些实施方案中，(B)为1.2和1.3之间的值。在一些实施方案中，(B)为1.3和1.4之间的值。在一些实施方案中，(B)为1.4和1.5之间的值。
在一些实施方案中，(B)为约-1.5。在一些实施方案中，(B)为约-1.4。在一些实施方案中，(B)为约-1.3。在一些实施方案中，(B)为约-1.2。在一些实施方案中，(B)约为-1.1。在一些实施方案中，(B)为约-1.0。在一些实施方案中，(B)为约-0.9。在一些实施方案中，(B)为约-0.8。在一些实施方案中，(B)为约-0.7。在一些实施方案中，(B)为约-0.6。在一些实施方案中，(B)为约-0.5。在一些实施方案中，(B)为约-0.4。在一些实施方案中，(B)为约-0.3。在一些实施方案中，(B)为约-0.2。在一些实施方案中，(B)为约-0.1。在一些实施方案中，(B)为约0.1。在一些实施方案中，(B)为约0.2。在一些实施方案中，(B)为约0.3。在一些实施方案中，(B)为约0.4。在一些实施方案中，(B)为约0.5。在一些实施方案中，(B)为约0.6。在一些实施方案中，(B)为约0.7。在一些实施方案中，(B)为约0.8。在一些实施方案中，(B)为约0.9。在一些实施方案中，(B)为约1.0。在一些实施方案中，(B)为约1.1。在一些实施方案中，(B)为约1.2。在一些实施方案中，(B)为约1.3。在一些实施方案中，(B)为约1.4。在一些实施方案中，(B)为约1.5。在一些实施方案中，(B)为约1.6。在一些实施方案中，(B)为约1.7。在一些实施方案中，(B)为约1.8。在一些实施方案中，(B)为约1.9。在一些实施方案中，(B)为约2.0。
在一些实施方案中，(B)为0.86。在一些实施方案中，(B)为0.13。在一个实施方案中，细胞类型是DG44，且(B)是0.86。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(B)是0.13。
在一些实施方案中，(C)是0和4.0之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.5和3.5之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.0和3.0之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.5和2.5之间的值。
在一些实施方案中，(C)为0.0和0.1之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.1和0.2之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.2和0.3之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.3和0.4之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.4和0.5之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.5和0.6之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.6和0.7之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.7和0.8之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.8和0.9之间的值。在一些实施方案中，(C)为0.9和1.0之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.0和1.1之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.1和1.2之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.2和1.3之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.3和1.4之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.4和1.5之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.5和1.6之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.6和1.7之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.7和1.8之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.8和1.9之间的值。在一些实施方案中，(C)为1.9和2.0之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.0和2.1之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.1和2.2之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.2和2.3之间的值。在一些实施方案中，(C)是2.3和2.4之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.4和2.5之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.5和2.6之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.6和2.7之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.7和2.8之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.8和2.9之间的值。在一些实施方案中，(C)为2.9和3.0之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.0和3.1之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.1和3.2之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.2和3.3之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.3和3.4之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.4和3.5之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.5和3.6之间的值。在一些实施方案中，(C)是3.6和3.7之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.7和3.8之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.8和3.9之间的值。在一些实施方案中，(C)为3.9和4.0之间的值。
在一些实施方案中，(C)为1.21。在一些实施方案中，(C)为2.41。在一个实施方案中，细胞类型是DG44，且(C)为1.21。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(C)为2.41。
在一些实施方案中，A＝-0.95，B＝0.86，且C＝1.21。在一些实施方案中，A＝0.02，B＝0.13，且C＝2.41。在一个实施方案中，细胞类型为DG44，且(A)为-0.95，(B)为0.86，且(C)为1.21。在一个实施方案中，细胞类型是CHOZN，且(A)为0.02，(B)为0.13，且(C)为2.41。
在一些实施方案中，本文公开了一种增加、控制或调节包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，该方法包括(a)用水冲洗收获橇；(b)将样品加载到收获橇上；(c)在收获橇中的蛋白质过滤期间将样品混合物的紫外线信号测量为实时测定蛋白质滴度；(d)根据紫外线度量和实时蛋白质滴度开始蛋白质的收集；(e)用PBS追捕蛋白质；和(f)基于紫外线度量和实时蛋白质滴度停止蛋白质的收集；其中，UV信号与过滤期间的实时蛋白滴度相关。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括水(例如，RODI)冲洗。在一些实施方案中，该方法包括加载蛋白质样品并基于在线滴度开始收集。在一些实施方案中，所述方法包括PBS追捕和基于在线滴度的最终收集。与其他方法相比，本文公开的方法不包括气体放空步骤。
在一些实施方案中，基于在线UV读数和计算的滴度自动控制样品收集的开始和结束。在一个特定的实施方案中，在收获过程期间的实时靶蛋白质浓度是通过使用建模通过在线UV传感器读数来计算的。在一些实施方案中，直接基于计算的在线靶蛋白质浓度来确定原液收集的截止点。在一些实施方案中，将计算算法整合至Delta VTM控制系统中以实现蛋白质收集的自动截止点。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括建模步骤。在一些实施方案中，建模包括使用系列稀释样品针对在线UV信号的离线滴度测量，以建立UV信号和滴度之间的线性相关性。在一些实施方案中，用于建模的样品是纯化的蛋白质。在一些实施方案中，用于建模的样品是包含污染物的原液蛋白质。在一些实施方案中，然后将建模用于控制、调节、增加和/或改善蛋白质产率。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括控制、调节或提高靶蛋白质的产量，该靶蛋白质的滴度为至少约0.01g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.02g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.03g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.04g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.05g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.06g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.07g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.08g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.09g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.1g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.2g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.3g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.4g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.6g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.7g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.8g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约0.9g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约1g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约1.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约2g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约2.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约3g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约3.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约4g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约4.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约5.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约6g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约6.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约7g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约7.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约8g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约8.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约9g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约9.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约10g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约10.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约11g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约11.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约12g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约12.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约13g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约13.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约14g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约14.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约15g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约15.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约16g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约16.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约17g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约17.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约18g/L，至少约18.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约19g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约19.5g/L。在一些实施方案中，滴度为至少约20g/L。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括靶蛋白质的收集，这取决于靶蛋白质的滴度。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.05g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.06g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.07g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.08g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.09g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.1g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.2g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.3g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.4g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.6g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.7g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.8g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约0.9g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约1g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约1.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约2g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约2.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约3g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约3.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约4g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约4.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约5.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约6g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约6.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约7g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约7.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约8g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约8.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约9g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约9.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约10g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约10.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约11g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约11.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约12g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约12.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约13g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约13.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约14g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约14.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约15g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约15.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约16g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约16.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约17g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约17.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约18g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约18.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约19g/L时，开始收集靶蛋白。在一些实施方案中，当滴度为至少约19.5g/L时，开始收集靶蛋白质。在一些实施方案中，当滴度为至少约20g/L时，开始收集靶蛋白质。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括靶蛋白质的收集，其中靶蛋白质的滴度在一定范围内。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.05g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.1g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.2g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.3g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.4g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.5g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.6g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.7g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.8g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.9g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约1g/L和约20g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.05g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.1g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.2g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.3g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.4g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.5g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.6g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.7g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.8g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.9g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约1g/L和约15g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.05g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.1g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.2g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.3g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.4g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.5g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.6g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.7g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.8g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约0.9g/L和约10g/L之间。在一些实施方案中，收集的靶蛋白的滴度在约1g/L和约10g/L之间。
在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括当收集滴度低于约0.5g/L时，停止收集靶蛋白质。
在一些实施方案中，通过本文公开的方法增加了靶蛋白质的产率。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约1％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约2％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约3％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约4％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约5％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约6％。在一些实施方案中，与蛋白质产量相比，靶蛋白质产率增加至少约7％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产量增加至少约8％。在一些实施方案中，与蛋白质产量相比，目标蛋白质产量增加了至少约9％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约10％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约11％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约12％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产量增加了至少约13％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约14％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约15％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约16％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约17％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产量增加至少约18％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加至少约19％。在一些实施方案中，与未实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，靶蛋白质产率增加或至少约20％。
在一些实施方案中，测量样品混合物的紫外线(UV)信号，其为0至2AU。在其他实施方案中，测量样品混合物的UV信号，其为约0.1AU、约0.2AU、约0.3AU、约0.4AU、约0.5AU、约0.6AU、约0.7AU、约0.8AU、约0.9AU、约1.0AU、约1.1AU、约1.2AU、约1.3AU、约1.4AU、约1.5AU、约1.6AU、约1.7AU、约1.8AU、约1.9AU或约2.0AU。
在本文公开的一些实施方案中，所述方法包含蛋白质过滤。在一些实施方案中，该方法包括一个或多个过滤器。在一些实施方案中，蛋白质过滤是深层过滤。在一些实施方案中，深层过滤包括初级深层过滤器和次级深层过滤器。在一些实施方案中，深层过滤包括初级深层过滤器。
在一些实施方案中，该方法包括在监测之前加载样品混合物。
在一些实施方案中，该方法包括在加载细胞培养物之前用缓冲液冲洗深层过滤器，并在加载细胞培养物之后追捕深层过滤器。在一些实施方案中，该方法包括用磷酸盐缓冲盐水(PBS)追捕样品混合物。在一些实施方案中，该方法包括包含控制系统的收获橇，其中当滴度高于0.5g/L时，控制系统自动开始收集蛋白质。在一些实施方案中，该方法包括包含控制系统的收获橇，其中当滴度低于0.5g/L时，该控制系统自动停止蛋白质的收集。
在一些实施方案中，该方法包括控制系统，该控制系统调节液体通过收获橇的流速。在一些实施方案中，该方法包括控制系统，该控制系统自动驱动泵以上调通过收获橇的流速。在一些实施方案中，该方法包括控制系统，该控制系统自动驱动泵以下调通过收获橇的流速。在一些实施方案中，该方法不包括气体放空的步骤。
在一些实施方案中，该方法包括不基于体积的收集蛋白质产率的步骤。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括测量压力、浊度、温度、流速或其任何组合。
在一些实施方案中，该方法包括使用压力传感器测量压力。在一些实施方案中，测量的压力的范围为-10磅/平方英寸(psi)至50psi、-10psi至40psi、-9psi至40psi、-8psi至40psi、-7psi至30psi、-6psi至-20psi、-7psi至40psi、-8psi至40psi、-9psi至45psi、-10psi至-45psi或-7psi至-45psi。在其他实施方案中，可以测量压力至少一次、两次、三次、四次或五次，例如在初级过滤器之前，初级过滤器之后并且次级过滤器之前，次级过滤器之后、排水之后或其任何组合测量。
在一些实施方案中，该方法包括测量浊度。在一些实施方案中，测量的浊度的范围为0个吸光度单位(AU)至2个AU。在其他实施方案中，测量的浊度为约0.1个AU、约0.2个AU、约0.3个AU、约0.4个AU、约0.5个AU、约0.6个AU、约0.7个AU、约0.8个AU、约0.9个AU、约1.0个AU、约1.1个AU、约1.2个AU、约1.3个AU、约1.4个AU、约1.5个AU、约1.6个AU、约1.7个AU、约1.8个AU、约1.9个AU或约2.0个AU。在一些实施方案中，测量浊度至少一次、两次、三次、四次或五次，例如在初级过滤器之后、次级过滤器之后、或初级过滤器之后以及次级过滤器之后测量。参见图2。
在一些实施方案中，该方法包括测量温度。在一些实施方案中，测量的温度的范围为0℃至70℃、0℃至60℃、0℃至50℃、0℃至40℃、5℃至70℃、10℃至70℃、15℃至70℃、20℃至70℃、10℃至60℃、20℃至50℃、20℃至40℃、20℃至45℃、30℃至40℃、35℃至40℃、20℃至30℃、35℃至40℃、或25℃至45℃。在其他实施方案中，可以在过滤过程期间的任何时间测量温度，例如测量至少一次、两次、三次、四次或五次，例如在初级过滤器之后、次级过滤器之后、或初级过滤器之后和次级过滤器之后测量。参见图2。
在一些实施方案中，该方法包括测量流量。在一些实施方案中，测量的流量的范围为0L/min至20L/min、.0L/min至30L/min、0L/min至40L/min、0L/min至50L/min、0L/min至60L/min、0L/min至70L/min、0L/min至80L/min、0L/min至90L/min、0L/min至100L/min、0L/min至110L/min、0L/min至120L/min、0L/min至130L/min、0L/min至140L/min、0L/min至150L/min、0L/min至160L/min、0L/min至170L/min、0L/min至180L/min、0L/min至190L/min、0L/min至200L/min、0L/min至250L/min或0L/min至300L/min。在其他实施方案中，在过滤过程期间的任何时间测量流量：在初级过滤器之前、初级过滤器之后、次级过滤器之前、次级过滤器之后或其任何组合。
在一些实施方案中，来自水源/生物反应器/PBS源的液体被重力泵驱动至初级深层过滤器。
在一些实施方案中，可以采用例如Delta VTM的系统通过在线流量传感器读数来计算流量累加体积。在一些实施方案中，流量累加体积用于确定水冲洗的结束。在一些实施方案中，四个压力传感器被放置在初级深层过滤器、次级深层过滤器、预过滤器和无菌过滤器之前。压力-流量控制回路可基于初级深层过滤器之前的实时压力值工作。如果压力值超过某个阈值，则Delta VTM自动驱动泵以下调流量。在一些实施方案中，两个浊度传感器被放置在初级和次级深层过滤器之后，作为滤液质量的指示器。在一些实施方案中，将一个UV传感器放置在次级深层过滤器之后，该UV传感器的值用于计算在线靶蛋白质浓度并控制澄清原液收集的截止点。监测实时上游源的重量和下游接收容器的重量，并还将其显示在DeltaVTM上。在一些实施方案中，重量是0到550kg的监测器，测量精度为0.01kg。
在一些实施方案中，从源分离蛋白质。在一些实施方案中，样品混合物选自纯蛋白样品、澄清原液蛋白样品、细胞培养物样品及其任何组合。在一些实施方案中，源选自培养的细胞。
在一些实施方案中，细胞是原核生物。在细菌系统中，取决于表达的蛋白质分子的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量这种蛋白质时，为了生成蛋白质分子的药物组合物，可能需要指导表达高水平的易于纯化的蛋白质产物的载体。
在其他实施方案中，细胞是真核细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、Madin-Darby牛肾细胞(MDBK)及其任何组合。在一些实施方案中，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
在其他实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。此类哺乳动物细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、BW、LM、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。
在一些实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，CHO细胞是CHO-DG44、CHOZN、CHO/dhfr-、CHOK1SV GS-KO或CHO-S。在一些实施方案中，CHO细胞是CHO-DG4。在一些实施方案中，CHO细胞是CHOZN。
本文公开的其他合适的CHO细胞系包括CHO-K(例如CHO K1)、CHO pro3-、CHO P12、CHO-K1/SF、DUXB11、CHO DUKX；PA-DUKX；CHO pro5；DUK-BII或其衍生物。
在一些实施方案中，从细胞密度为至少约1x106个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约5x106个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约1x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约1.5x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约2x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约2.5x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约3x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约3.5x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约4x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约4.5x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。在一些实施方案中，从细胞密度为至少约5x107个细胞/mL的培养基中收获靶蛋白质。
在一些实施方案中，蛋白质的来源是原液蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质的来源是包含蛋白质和非蛋白质组分的组合物。非蛋白质组分可以包括DNA和其他污染物。
在一些实施方案中，蛋白质的来源来自动物。在一些实施方案中，动物是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴或人)。在一些实施方案中，来源是来自人的组织或细胞。在某些实施方案中，此类术语是指非人类动物(例如，非人类动物如猪、马、牛、猫或狗)。在一些实施方案中，此类术语是指宠物或农场动物。在特定的实施方案中，此类术语是指人。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法纯化的蛋白是融合蛋白。“融合体”或“融合”蛋白包含在框内连接至第二氨基酸序列的第一氨基酸序列，第一氨基酸序列在自然界中并非天然与第二氨基酸序列连接。通常存在于分离蛋白质中的氨基酸序列可以在融合多肽中集合在一起，或者可以将通常存在于同一蛋白中的氨基酸序列以新的排列方式放置在融合多肽中。融合蛋白例如通过化学合成或通过产生并翻译以期望的关系编码肽区域的多核苷酸而产生。融合蛋白可进一步包含通过共价键、非肽键或非共价键与第一氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。转录/翻译后，制成单一蛋白质。这样，可以将多种蛋白质或其片段并入单一多肽中。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，两个多肽之间的可操作连接将两个多肽在框内融合在一起以产生单一多肽融合蛋白。在一个特定的方面，融合蛋白进一步包含可以包含接头序列的第三多肽，如下面进一步详细讨论的。
在一些实施方案中，通过本文所述的方法纯化的蛋白质是抗体。抗体可以包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、异缀合物抗体、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fvs(scFv)、骆驼化抗体、亲和抗体(affybodies)、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如抗抗Id抗体)以及上述任一种的抗原结合片段。在某些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。抗体可以是任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如IgG2a或IgG2b)的免疫球蛋白分子。在某些实施方案中，本文所述的抗体是IgG抗体或其类(例如，人IgG1或IgG4)或其亚类。在一个具体的实施方案中，该抗体是人源化单克隆抗体。在另一个具体的实施方案中，该抗体是人单克隆抗体，优选是免疫球蛋白。在某些实施方案中，本文所述的抗体是IgG1或IgG4抗体。
在一些实施方案中，本文所述的蛋白质是“抗原结合域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”和类似术语，其是指抗体分子的包含对抗原分子赋予针对抗原特异性的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))的一部分。抗原结合区可以源自任何动物物种，诸如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人类。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗LAG3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗NKG2a抗体、抗ICOS抗体、抗CD137抗体、抗-KIR抗体、抗TGFβ抗体、抗IL-10抗体、抗B7-H4抗体、抗Fas配体抗体、抗间皮素抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IL8抗体或其任何组合。在一些实施方案中，该蛋白质是阿巴西普NGP。在其他实施方案中，该蛋白质是贝拉西普NGP。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗GITR(糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因)抗体。在一些实施方案中，抗GITR抗体具有6C8的CDR序列，例如，具有6C8的CDR的人源化抗体，例如，如在WO2006/105021中所述的；和包含在WO2011/028683中描述的抗GITR抗体的CDR的抗体；包含在JP2008278814中描述的抗GITR抗体的CDR的抗体，包含在WO2015/031667、WO2015/187835、WO2015/184099、WO2016/054638、WO2016/057841、WO2016/057846、WO 2018/013818中描述的抗GITR抗体的CDR的抗体，或本文描述或提及的其他抗GITR抗体，以上全部以其整体并入本文中。
在其他实施方案中，该蛋白质是抗LAG3抗体。淋巴细胞激活基因3，也称为LAG-3，是一种在人类中由LAG3基因编码的蛋白质。LAG3是1990年发现的，是一种对T细胞功能具有多种生物学作用的细胞表面分子。它是一种免疫检查点受体，因此是制药公司寻求开发针对癌症和自身免疫性病症的新疗法的多种药物开发计划的目标。它也以可溶形式单独开发为抗癌药。抗LAG3抗体的实例包括但不限于WO 2017/087901 A2、WO 2016/028672 A1、WO2017/106129 A1、WO 2017/198741 A1、US 2017/0097333 A1、US 2017/0290914 A1和US2017/0267759 A1中的抗体，以上全部以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗CXCR4抗体。CXCR4是与G1偶联的7次跨膜蛋白。CXCR4在造血来源的细胞上广泛表达，并且是与人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的与CD4+的主要共受体。参见Feng,Y.,Broeder,C.C.,Kennedy,P.E.,and Berger,E.A.(1996)Science272,872-877。抗CXCR4抗体的实例包括但不限于WO 2009/140124 A1、US 2014/0286936A1、WO 2010/125162 A1、WO 2012/047339 A2、WO 2013/013025 A2、WO 2015/069874 A1、WO2008/142303 A2、WO 2011/121040 A1、WO 2011/154580 A1、WO 2013/071068 A2和WO2012/175576 A1中的抗体，以上全部以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗CD73(胞外-5'-核苷酸酶)抗体。在一些实施方案中，抗CD73抗体抑制腺苷的形成。AMP降解为腺苷导致在肿瘤微环境中免疫抑制和促血管生成的小生境的产生，从而促进癌症的发作和发展。抗CD73抗体的实例包括但不限于WO2017/100670 A1、WO 2018/013611A1、WO 2017/152085 A1和WO 2016/075176 A1中的抗体，以上全部以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗TIGIT(具有Ig和ITIM域的T细胞免疫受体)抗体。TIGIT是免疫球蛋白蛋白质PVR(脊髓灰质炎病毒受体)家族的成员。TIGIT在包括滤泡B辅助性T细胞(TFH)在内的几类T细胞上表达。该蛋白已显示出以高亲和力与PVR结合；这种结合被认为有助于TFH和树突状细胞之间的相互作用，以调节T细胞依赖性B细胞应答。抗TIGIT抗体的实例包括但不限于WO 2016/028656 A1、WO 2017/030823 A2、WO 2017/053748A2、WO 2018/033798 A1、WO 2017/059095 A1和WO 2016/011264 A1中的抗体，以上全部以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗OX40(即，CD134)抗体。OX40是肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的细胞因子。OX40在T细胞抗原呈递细胞(APC)相互作用中起作用，并介导活化的T细胞与内皮细胞的粘附。抗OX40抗体的实例包括但不限于WO 2018/031490 A2、WO2015/153513 A1、WO 2017/021912 A1、WO 2017/050729 A1、WO 2017/096182 A1、WO 2017/134292 A1、WO 2013/038191 A2、WO 2017/096281 A1、WO 2013/028231 A1、WO 2016/057667 A1、WO 2014/148895 A1、WO 2016/200836 A1、WO 2016/100929 A1、WO 2015/153514 A1、WO 2016/002820 A1和WO 2016/200835 A1，其全部以其整体并入本文中。
在一些实施方案中，该蛋白质是抗IL8抗体。IL-8是一种趋化因子，其可吸引中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞，但不吸引单核细胞。它也参与中性粒细胞活化。响应于炎症刺激，它从几种细胞类型中被释放出来。
在一些实施方案中，该蛋白质是阿巴西普(以出售)。阿巴西普(在本文中也简称为Aba)是一种用于通过干扰T细胞的免疫活性来治疗自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎)的药物。阿巴西普是一种融合蛋白，由与CTLA-4的胞外域融合的免疫球蛋白IgG1的Fc区组成。为了激活T细胞并产生免疫应答，抗原呈递细胞必须向T细胞呈递两个信号。这些信号之一是与抗原结合的主要组织相容性复合物(MHC)，另一个信号是CD80或CD86分子(也称为B7-1和B7-2)。
在一些实施方案中，该蛋白质是贝拉西普(商品名)。贝拉西普是一种融合蛋白，由与CTLA-4的胞外域相连的人IgG1免疫球蛋白的Fc片段组成，贝拉西普是调节T细胞共刺激的重要分子，可选择性地阻断T细胞活化过程。它旨在提供延长的移植和移植存活期，同时限制标准免疫抑制方案(如钙神经素抑制剂)产生的毒性。它与阿巴西普仅2个氨基酸不同。
c.系统
在一些实施方案中，本文公开了一种用于控制、调节、增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中的蛋白质产率的系统，该系统包括在收获橇中进行的蛋白过滤期间实时监测样品混合物的紫外线(UV)信号。
本文公开的系统包括一个或多个传感器。在一些实施方案中，传感器包括压力传感器、UV传感器、浊度传感器、温度传感器、流量传感器及其任何组合。
在一些实施方案中，收获橇经设计以将所有传感器集成到一个小车中，所述传感器包括压力(4)、UV(1)、浊度(2)、温度(2)和流量传感器(1)。在一些实施方案中，该系统包括三个PMAT(压力监测器警报发送器)控制器。在一些实施方案中，PMAT控制器构建在小车上，以容纳总共十个不同的传感器。在一些实施方案中，重力泵(例如，重力泵)用于将液体驱动至深层过滤器，并安装在橇车上。在一些实施方案中，该系统是可移动的、可锁定的和/或可电子停止的。
本文还提供了可以在以上方法中使用的系统(例如，设备，例如，收获橇)。在一个实施方案中，一种系统或设备包括图1A和/或图1B中的实施方案。在一个实施方案中，一种系统或设备包括图2的实施方案。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于控制、调节、增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的设备。该设备可以包括一个或多个传感器。传感器可以包括压力传感器、UV传感器、浊度传感器、温度传感器、流量传感器及其任意组合。
在一些实施方案中，该设备经设计以将所有传感器集成到该设备中，所述传感器包括压力(4)、UV(1)、浊度(2)、温度(2)和流量传感器(1)。在一些实施方案中，该设备包括三个PMAT(压力监测器警报发送器)控制器。在一些实施方案中，PMAT控制器构建在设备中，以容纳总共十个不同的传感器。在一些实施方案中，重力泵(例如，重力泵)用于将液体驱动至深层过滤器，并安装在该设备中。在一些实施方案中，该设备是可移动的、可锁定的和/或可电子停止的。该设备还可以包括被配置为控制靶蛋白质的收集的处理器。处理器还可被配置成改变设备的条件，例如温度、压力、浊度或流量。处理器也可以被配置为控制靶蛋白质的收集。在一些实施方案中，处理器可以使用已建立的模型来确定培养物收获过程。细胞培养物收获过程可以包括基于过滤的细胞培养物收获过程。处理器可以被配置为使用靶蛋白质滴度。所述设备可以并入到用于控制、调节、增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中的蛋白质产率的系统中。
d.过程
在一个实施方案中，系统或设备包括图2的实施方案，其证实了使用这种收获橇的过程流程。通过重力泵驱动来自水源/生物反应器/PBS源的液体进入深层过滤器。将流量传感器放置在泵后。Delta VTM通过在线流量传感器读数计算流量累加体积。流量累加体积用于确定水冲洗的结束。在初级深层过滤器、次级深层过滤器、预过滤器和无菌过滤器前放置四个压力传感器。压力-流量控制回路基于初级深层过滤器之前的实时压力值工作。在初级和次级深层过滤器之后放置两个浊度传感器，作为滤液质量的指示器。将一个UV传感器放置在次级深层过滤器之后，用于计算在线靶蛋白质浓度并控制澄清原液收集的截止点。实时监测上游源重量和下游接收容器的重量，还将其显示在Delta VTM上。
通过示例而非限制的方式提供以下实施例。
实施例
实施例1：收获橇设计
为了控制、调节、增加或改善样品中的蛋白质产率，利用了收获橇。图1显示了收获橇的示意图。该收获橇被设计成将所有传感器(包括压力(4)、紫外线(1)、浊度(2)、温度(2)和流量传感器(1))集成到一个小车中。参见图2。三个PMAT控制器被构建在小车上，以容纳总共十个不同的传感器。用于将液体驱动至深层过滤器的重力泵也安装在橇车上。该收获橇被设计为可移动的、可锁定的和可紧急停止的。
表1：用于设计橇的仪器
表2：收获过程中使用的仪器和材料
收获所使用的传感器具有不同的功能。压力传感器监测过程期间的压力。级联控制进水泵，当压力过高时降低进水泵的流速。UV传感器监测在过程期间深层过滤后的UV信号；该UV信号转换为蛋白质浓度以控制原液收集的开始和结束。UV是在280nm处的测量值。
重量传感器监测过程期间的上游生物反应器的重量和下游接收器的重量；控制加载和追捕步骤。生物反应器称重传感器值(load cell value)和接收器称重传感器值已集成到收获橇控制系统中。浊度传感器在880nm处测量浊度，监测在过程期间的深层过滤前后的浊度。如果深层过滤器淤塞，则可观察到浊度突破。温度传感器监测过程期间的温度。本文的收获过程在环境(室温)温度下进行。
收获橇过程用于从细胞培养物中纯化感兴趣的蛋白质。通过重力泵驱动来自水源/生物反应器/PBS源的液体至初级深层过滤器。已经证实，与蠕动泵P3P相比，重力泵在CHO细胞培养物中引起的细胞死亡更少。将流量传感器放置在泵后。Delta VTM通过在线流量传感器读数计算流量累加体积。流量累加体积用于确定水冲洗的结束。在初级深层过滤器、次级深层过滤器、预过滤器和无菌过滤器P4P前放置四个压力传感器。压力-流量控制回路基于初级深层过滤器之前的实时压力值工作。如果压力值超过某个阈值，则Delta VTM将自动驱动泵以下调泵速。在初级和次级深层过滤器之后放置两个浊度传感器，作为滤液质量的指示器。将一个UV传感器(其值用于计算在线靶蛋白质浓度并控制澄清的原液收集的截止点)放置在次级深层过滤器之后。监测实时上游源的重量和下游接收容器的重量，还将其显示在Delta VTM上。
对于本文公开的每个实施例，收获橇使用每个传感器来检测以下范围和精度下的值。
表3.
传感器 作用 测量范围 测量精度
压力 监测并控制 -7至30psi 小于0.9psi
流量 监测并控制 0至20L/min 小于0.18L/min
UV 监测并控制 0至2AU 0.02AU
重量 监测并控制 0至550kg 0.01kg
浊度 监测 0至2AU 0.02AU
温度 监测 0至70℃ 0.2℃
实施例2：将UV信号转化为蛋白质浓度
与先前的方法相比，本文公开的方法去除了气体放空步骤。同时，根据在线UV读数和计算的滴度，自动控制澄清原液收集的开始和结束。参见图3。更具体地说，使用生成的模型通过在线UV传感器读数计算收获过程期间的实时靶蛋白质浓度。因此，根据计算的在线靶蛋白质浓度直接确定原液收集的截止点。计算算法已集成到Delta VTM控制系统中，以获得澄清原液收集的自动截止点。
在该收获橇中使用的在线UV传感器具有0-2个AU的输出吸光度。调整此UV传感器的路径长度，以适应0-2个AU范围内的0-6g/L的总靶蛋白质浓度。其他UV传感器或Flow VPE(C技术)可用于更高浓度的测定。
为了将过程中的在线UV信号转化为靶蛋白质浓度，采取了一系列连续步骤，如图4所示。
在第一步中，确定了使用D12 GITR细胞培养物的系列稀释样品针对在线UV信号进行的离线滴度测量。细胞培养物样品中的几种组分，包括靶蛋白质、HCP(宿主细胞蛋白)和培养基色素，能够影响UV吸收信号。为了模拟现实生活中的收获过程(其中UV传感器测量所有这些组分的总吸光度)，将细胞培养物样品(D12 GITR细胞培养物)而非纯蛋白质，进行了连续稀释，并用于UV传感器路径长度调整。
如图5所示，调节UV传感器的路径长度以覆盖在收获过程期间可以观察到的大范围的靶蛋白质浓度。由于接近2个AU(最大输出)的UV读数精度较低，因此将路径长度调低，使得在5g/L的滴度下UV读数约为1.6。观察到良好的线性，R2为0.97。因此，细胞培养物样品的系列稀释提供UV读数和滴度之间的强相关性。
实施例3：使用纯蛋白质和澄清的原液进行小规模测试
使用2L的滴度为5.2g/L的纯蛋白质(eTau)进行小规模测试。深层过滤器基于60L/m2的加载能力(每个初级过滤器)按比例缩小。在收获过程期间收获次级深层过滤器之后的离线样品。将离线滴度读数与在线UV传感器值作图，以了解收获过程期间纯蛋白浓度与在线UV信号之间的关系。
使用2L的滴度为5g/L的澄清的原液(去除细胞的eTau细胞培养物)进行第二次小规模收获试验。深层过滤器基于60L/m2的加载能力(每个初级过滤器)按比例缩小。在收获过程期间收集次级深层过滤器之后的离线样品。将离线滴度读数与在线UV传感器值作图，以了解收获过程期间靶蛋白浓度(在培养物组分的混合物种)与在线UV信号之间的关系。
在图6A和图6B中绘制了测试收获过程期间的在线UV和离线滴度值。从原液收集开始到加载结束，收集“上倾斜”数据系列；而从追捕开始到原液收集结束收集“下倾斜”数据系列。如图6A和图6B所示，对于数据的上倾斜和下倾斜部分，这两个过程均观察到良好的线性。因此，当测量其他样品(例如，图6A中的纯蛋白和图6B中的澄清的原液蛋白质)时，细胞培养物样品的系列稀释可提供UV读数与滴度之间的强相关性。
然而，对于上倾斜部分和下倾斜部分，斜率是不同的，这表明对于收获过程中的不同阶段可能需要不同的模型。
实施例4：使用三个大规模细胞培养过程建立模型
三种不同的细胞系用于模型建立。这些细胞系包含具有不同特征(细胞密度、生存力、滴度、背景噪音等)的不同的、大规模的细胞培养过程(Aba NGP、GITR和Next GenCXCR4)。使用该收获橇收获细胞系以产生用于模型建立的数据。深层过滤器是根据60-65L/m2的加载能力(每个初级过滤器)按比例变化的。在收获过程期间收获次级深层过滤器之后的离线样品。离线滴度读数和相应的在线UV传感器值已输入JMP软件以生成模型。UV和滴度值绘制在图7A、图7B和图7C中。对于数据的上倾斜部分，仍然观察到良好的线性。但是，对于下倾斜部分，观察到弯曲。
在加载细胞培养材料期间，细胞、靶蛋白质、背景噪音蛋白全部占据深层滤膜空间。当开始PBS追捕时，靶蛋白质被洗出。随着PBS追捕的进行，松散结合到深层滤膜上的背景噪音蛋白(如HCP)开始与靶蛋白质一起被洗出。同时，HCP从细胞碎片中释放出来也导致背景噪音百分比P5P的增加。这可能是澄清的原液样品和细胞培养样品之间的UV谱不同的原因。换句话说，对于复杂的含细胞物质，随着PBS追捕的进行，靶蛋白质对总UV信号的贡献越来越小，而背景噪音则越来越高。
基于这些结果，建立了两个单独的模型以使用在线UV信号预测靶蛋白质浓度：一个是线性模型以拟合来自上倾斜部分的数据(开始收集到结束加载)，另一个是非线性模型以拟合来自下倾斜部分的数据(从开始追捕到结束收集)。
A.上倾斜部分的模型拟合。
对于数据的上倾斜部分，模型中总共包括22个样品。离线滴度值相对于在线UV值作图(图8)。将线性拟合应用于数据。线性拟合的R2值为0.98。使用该模型，计算预测的滴度值，并将其与实际的滴度值进行比较。如图8A和图8B所示，拟合斜率非常接近1，且R2为0.98。
为了预测从开始收集到结束加载的靶蛋白质浓度，生成了线性模型：模型预测的滴度＝a+b*(在线UV信号)。模型常数a和b取决于滴度水平。如果滴度为约3.5g/L或更小，则a＝-0.35，b＝2.88；如果滴度为约3.5g/L或更高，则a＝-0.69，b＝4.06。
B.下倾斜部分的模型拟合
对于数据的下倾斜部分，模型中总共包括41个样品。将离线滴度值相对于在线UV值作图，如图10所示。将非线性拟合应用于数据。对于CHOZN和DG44细胞系，非线性拟合的RMSE值分别为0.26和0.04。使用该模型计算预测的滴度值，并将其与实际的滴度值进行比较(图9A和图9B)。拟合斜率接近1，且R2为0.97和0.99。图9A和图9B。
为了预测从开始追捕到结束收集的靶蛋白质浓度，生成了非线性模型：模型预测的滴度＝A+B*exp(C*在线UV信号)。模型常数A、B和C取决于滴度水平。如果滴度为约3.5g/L或更小，则A＝-0.95，B＝0.86，C＝1.21；如果滴度为约3.5g/L或更高，则A＝0.02，B＝0.13，C＝2.41。
实施例5：四个大规模细胞培养过程的测试模型
收获了四个大规模(500L)的细胞培养过程(CD73、OX40、TIGIT和IL8)。深层过滤器基于小规模的初步数据进行了按比例放大。在收获过程期间收集次级深层过滤器之后的离线样品，以进行实际的滴度测量。在线UV传感器值已输入JMP软件。使用该模型，基于在线UV传感器值计算预测的滴度值，并将其与离线滴度测量值进行比较。
表4：本报告中测试的分子的细胞培养过程特性
注意：此处的存活力计算如下：存活力(％)＝收获日的VCD/峰值VCD*100％。
表5.对七种研究的分子的模型拟合评估
使用四种不同的大规模(500L)细胞培养物收获过程测试以上产生的模型，其中起始滴度为0-0.1g/L，结束滴度为0.1-0.2g/L。该模型可测试低至基于0.01个Au的UV信号的0.01g/L。使用JMP软件将模型预测的滴度值与实际滴度值进行比较。每个过程的模型拟合RMSE值如图10所示。
计算模型预测的滴度值与实际的滴度值之间的差异。图11显示了每个测试的过程的差异。总体平均差异的范围为0.07-0.36g/L，表明这些模型可以可靠地应用于具有多种特性的不同过程，如表2所示。
A.使用在线传感器控制收获过程并改善收获产率
表6：使用新收获橇的研究的七种分子的产率改善
使用以下等式计算收获过程的产率：
产率＝(澄清的原液的滴度(g/L)*澄清的原液的体积(L))*100％
生物反应器中收获当天滴度(g/L)*收获当天生物反应器体积(L)
如表6所示，使用新的收获橇的产率比使用旧方法的产率高2-5％。
在这项研究中，设计了一种实时监测和控制的收获橇，并检查几种治疗性蛋白质的深层过滤收获。
多个在线传感器被构建到该收获橇中，并且它们的实时读数被集成到Delta VTM系统中，以获得对关键过程参数的自动监测和控制。在一系列实验步骤中生成了将收获过程的不同阶段期间的在线UV信号转换为实时靶蛋白质浓度的模型，这些实验步骤包括：调整UV传感器路径长度、纯蛋白质测试和复杂细胞培养物样品测试。然后，已成功使用具有大量过程特性的数个大规模收获过程对该模型进行了测试，这些特性包括背景噪音水平、产物水平、总细胞密度和存活力。
利用本研究中产生的这种新型收获橇和统计模型，以定量方式监测和控制细胞培养物的澄清过程，其显著改善了收获稳健性和蛋白质产率。在线滴度信息本身是细胞培养性能的重要指标，并且可用于下游处理中蛋白A色谱的即时加载测定。
实施例6：在蛋白质收获期间实时监测新蛋白质的过程
选择新的靶蛋白以使用该收获橇使其澄清。首先，如图2所示，将收获橇上的所有传感器串联连接，以监测收获过程期间的压力、流量、UV、浊度和温度。第二，水源与重力泵连接。将总流量和流速输入Delta VTM，以控测深层过滤器冲洗步骤。达到总流量后，将生物反应器源与重力泵连接，以开始将细胞培养物加载到深层过滤器中。第三，将上倾斜部分的UV预测模型常数输入到Delta VTM中；且将收集开始截止阈值输入到Delta VTM中。在加载期间在线UV信号转化为靶蛋白质浓度。达到阈值后，将接收容器与无菌过滤器连接以收集澄清的原液。第四，排空生物反应器后，将PBS源与重力泵连接以开始追捕步骤。基于细胞系类型，将下倾斜部分的UV预测模型常数输入到Delta VTM中；且将收集结束截止阈值输入到Delta VTM中。在追捕期间，将在线UV信号会转换为靶蛋白质浓度。一旦达到阈值，就将接收容器从过程流中断开。在整个收获过程期间，监测压力、浊度和温度，以指示失控的问题。
实施例7：通过离线滴度分析从在线UV信号确认在线预测的滴度
收获过程开始于深层过滤器的注射用水(WFI)冲洗。将UV传感器连接到次级深层过滤器的出口。一旦过滤稳定后，从出口处便会看到清澈的流动；此该点，紫外线传感器归零。在将期望量的WFI冲洗通过过滤器后，将细胞培养基与过滤器入口连接以开始加载。沿加载过程监测培养基的在线UV踪迹。沿着加载过程，取出滤液样品，并通过滴度测定离线分析。图11显示通过根据UV信号建模获得滴度踪迹。通过建模获得的滴度踪迹与离线滴度测定结果很好地匹配，因此可用于开始和结束收集，以改善过程稳健性和产率。
除非另有说明，否则本公开的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域技术范围内。此类技术在文献中进行了充分的解释。参见，例如，Sambrook等人,ed.(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual(2nd ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人,ed.(1992)Molecular Cloning:ALaboratory Manual,(Cold Springs HarborLaboratory,NY)；D.N.Glover ed.,(1985)DNA Cloning,Volumes I and II；Gait,ed.(1984)Oligonucleotide Synthesis；Mullis等人U.S.Pat.No.4,683,195；Hames和Higgins,eds.(1984)Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins,eds.(1984)Transcription And Translation；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(AlanR.Liss,Inc.)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1986)；Perbal(1984)APractical Guide To Molecular Cloning；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Miller和Calos eds.(1987)Gene Transfer Vectors ForMammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；Wu等人,eds.,Methods InEnzymology,Vols.154and 155；Mayer和Walker,eds.(1987)Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell,eds.,(1986)Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV；Manipulating the MouseEmbryo,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1986)；)；Crooks,Antisense drug Technology:Principles,strategies and applications,2ndEd.CRC Press(2007)以及Ausubel等人(1989)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons,Baltimore,Md.)。
在一些实施方案中，本文公开了一种用于控制、调节、增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中的蛋白产率的设备。该设备可以包括一个或多个传感器。传感器可以包括压力传感器、UV传感器、浊度传感器、温度传感器、流量传感器及其任何组合。
在一些实施方案中，该设备被设计为将所有传感器集成到该设备中，所述传感器包括压力(4)、UV(1)、浊度(2)、温度(2)和流量传感器(1)。在一些实施方案中，该设备包括三个PMAT(压力监测器警报发送器)控制器。在一些实施方案中，PMAT控制器被构建在该设备中，以容纳总共十个不同的传感器。在一些实施方案中，重力泵(例如，重力泵)用于将液体驱动至深层过滤器，并安装在该设备中。在一些实施方案中，系统是可移动的、可锁定的和/或可电子停止的。该设备还可以包括被配置为控制靶蛋白质的收集的处理器。处理器还可被配置成改变设备的条件，例如温度、压力、浊度或流量。处理器也可以配置为控制靶蛋白质的收集。在一些实施方案中，处理器可以使用已建立的模型来确定培养物收获过程。细胞培养物收获过程可以包括基于过滤的细胞培养物收获过程。处理器可以被配置为使用靶蛋白质滴度。该设备可以被并入到用于控制、调节、增加或改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中的蛋白质产率的系统中。
上文引用的所有参考文献，以及本文引用的所有参考文献和氨基酸或核苷酸序列(例如，GenBank编号和/或Uniprot编号)，均通过提述以其整体并入本文。
本公开涉及下述实施方案。
1.一种实时监测包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中靶蛋白质浓度(滴度)的方法，其包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号并且使用已建立的模型将所述UV信号自动转换成靶蛋白质滴度。
2.一种控制靶蛋白质收集并且改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，其包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中根据已建立的模型和自动控制，将所述UV信号连续转换成所述靶蛋白质的滴度。
4.根据实施方案3所述的方法，其中所述靶蛋白质的滴度为至少约0.01g/L、至少约0.02g/L、至少约0.03g/L、至少约0.04g/L、至少约0.05g/L、至少约0.06g/L、至少约0.07g/L、至少约0.08g/L、至少约0.09g/L、至少约0.1g/L、至少约0.2g/L、至少约0.3g/L、至少约0.4g/L、至少约0.5g/L、至少约0.6g/L、至少约0.7g/L、至少约0.8g/L、至少约0.9g/L、至少约1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约6.5g/L、至少约7g/L、至少约7.5g/L、至少约8g/L、至少约8.5g/L、至少约9g/L、至少约9.5g/L、至少约10g/L、至少约10.5g/L、至少约11g/L、至少约11.5g/L、至少约12g/L、至少约12.5g/L、至少约13g/L、至少约13.5g/L、至少约14g/L、至少约14.5g/L、至少约15g/L、至少约15.5g/L、至少约16g/L、至少约16.5g/L、至少约17g/L、至少约17.5g/L、至少约18g/L、至少约18.5g/L、至少约19g/L、至少约19.5g/L、或至少约20g/L。
5.根据实施方案3或实施方案4所述的方法，其进一步包括当所述滴度为至少约0.05g/L、至少约0.06g/L、至少约0.07g/L、至少约0.08g/L、至少约0.09g/L、至少约0.1g/L、至少约0.2g/L、至少约0.3g/L、至少约0.4g/L、至少约0.5g/L、至少约0.6g/L、至少约0.7g/L、至少约0.8g/L、至少约0.9g/L、至少约1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约6.5g/L、至少约7g/L、至少约7.5g/L、至少约8g/L、至少约8.5g/L、至少约9g/L、至少约9.5g/L、至少约10g/L、至少约10.5g/L、至少约11g/L、至少约11.5g/L、至少约12g/L、至少约12.5g/L、至少约13g/L、至少约13.5g/L、至少约14g/L、至少约14.5g/L、至少约15g/L、至少约15.5g/L、至少约16g/L、至少约16.5g/L、至少约17g/L、至少约17.5g/L、至少约18g/L、至少约18.5g/L、至少约19g/L、至少约19.5g/L或至少约20g/L时，开始收集所述靶蛋白质。
6.根据实施方案5所述的方法，其中收集的所述靶蛋白质的滴度在约0.05g/L和约20g/L之间、在约0.1g/L和约20g/L之间、在约0.2g/L和约20g/L之间、在约0.3g/L和约20g/L之间、在约0.4g/L和约20g/L之间、在约0.5g/L和约20g/L之间、在约0.6g/L和约20g/L之间、在约0.7g/L和约20g/L之间、在约0.8g/L和约20g/L之间、在约0.9g/L和约20g/L之间、在约1g/L和约20g/L之间、在约0.05g/L和约15g/L之间、在约0.1g/L和约15g/L之间、在约0.2g/L和约15g/L之间、在约0.3g/L和约15g/L之间、在约0.4g/L与约15g/L之间、在约0.5g/L与约15g/L之间、在约0.6g/L和约15g/L之间、在约0.7g/L和约15g/L之间、在约0.8g/L和约15g/L之间、在约0.9g/L和约15g/L之间或在约1g/L和约15g/L之间、在约0.05g/L和约10g/L之间、在约0.1g/L和约10g/L之间、在约0.2g/L和约10g/L之间、在约0.3g/L和约10g/L之间、在约0.4g/L和约10g/L之间、在约0.5g/L和约10g/L之间、在约0.6g/L和约10g/L之间、在约0.7g/L和约10g/L之间、在约0.8g/L和约10g/L之间、在约0.9g/L和约10g/L之间或在约1g/L和约10g/L之间。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其进一步包括当所述收集滴度低于约0.1或0.2g/L时停止所述靶蛋白质的收集。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的方法，其中与在未实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，所述靶蛋白质产率增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白质是从细胞密度为至少约1X 10 6个细胞/mL、至少约5X 106个细胞/mL、至少约1X 107个细胞/mL、至少约1.5X107个细胞/mL、至少约2X 107个细胞/mL、至少约2.5X 107个细胞/mL、至少约3X 107个细胞/mL、至少约3.5X 107个细胞/mL、至少约4X 107个细胞/mL、至少约4.5X 107个细胞/mL或至少约5X 107个细胞/mL的培养基中收获的。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述蛋白质过滤是深层过滤。
11.根据实施方案10所述的方法，其中所述深层过滤包括初级深层过滤器和/或次级深层过滤器。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其进一步包括在所述监测之前加载所述样品混合物。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其进一步包括在加载所述细胞培养物之前用水或缓冲液冲洗所述深层过滤器，并在加载所述细胞培养物之后追捕所述深层过滤器。
14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其进一步包括用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或其他缓冲液追捕所述样品混合物。
15.根据实施方案1至14中任一项所述的方法，其中所述基于过滤的细胞培养物收获过程包括收获橇。
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述收获橇包括控制系统，其中当达到设定滴度时，所述控制系统自动开始收集所述蛋白质。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述收获橇包括控制系统，其中当达到设定滴度时，所述控制系统自动停止收集所述蛋白质。
18.根据实施方案16或17所述的方法，其中所述控制系统调节液体通过所述收获橇的流速。
19.根据实施方案18所述的方法，其中所述控制系统自动驱动泵以上调通过所述收获橇的流速。
20.根据实施方案18所述的方法，其中所述控制系统自动驱动泵以下调通过所述收获橇的流速。
21.根据实施方案1至20中任一项所述的方法，其中所述方法不包括气体放空的步骤。
22.根据实施方案1至21中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白质滴度或所述蛋白质产率不基于体积。
23.一种增加、控制或调节包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，其包括
a)用水冲洗收获橇；
b)将所述样品加载到所述收获橇中；
c)将在所述收获橇中蛋白质过滤期间的样品混合物的紫外线(UV)信号测量为实时蛋白质滴度；
d)基于UV测量值和实时蛋白质滴度开始收集所述蛋白质；
e)用PBS追捕所述蛋白质；和
f)基于所述UV测量值和所述实时蛋白质滴度停止收集所述蛋白质；
其中在所述过滤期间，所述UV信号与实时蛋白滴度相关。
24.根据实施方案1至23中任一项所述的方法，其进一步包括测量压力、浊度、温度、流速或其任何组合。
25.根据实施方案24所述的方法，其进一步包括使用压力传感器测量压力。
26.根据实施方案25所述的方法，其中测量的压力的范围为-10磅/平方英寸(psi)至50psi、-10psi至40psi、-9psi至40psi、-8psi至40psi、-7psi至30psi、-6psi至-20psi、-7psi至40psi、-8psi至40psi、-9psi至45psi、-10psi至-45psi或-7psi至-45psi。
27.根据实施方案24所述的方法，其进一步包括测量浊度。
28.根据实施方案27所述的方法，其中测量的浊度的范围为0个吸光度单位(AU)至2个AU。
29.根据实施方案24所述的方法，其进一步包括测量温度。
30.根据实施方案29所述的方法，其中测量的温度的范围为0℃至70℃、0℃至60℃、0℃至50℃、0℃至40℃、5℃至70℃、10℃至70℃、15℃至70℃、20℃至70℃、10℃至60℃、20℃至50℃、20℃至40℃、20℃至45℃、30℃至40℃、35℃至40℃、20℃至30℃、35℃至40℃或25℃至45℃。
31.根据实施方案25所述的方法，其进一步包括测量流量。
32.根据实施方案31所述的方法，其中测量的流量的范围为0L/min至20L/min、0L/min至30L/min、0L/min至40L/min、0L/min至50L/min、0L/min至60L/min、0L/min至70L/min、0L/min至80L/min、0L/min至90L/min、0L/min至100L/min、0L/min至110L/min、0L/min至120L/min、0L/min至130L/min、0L/min至140L/min、0L/min至150L/min、0L/min至160L/min、0L/min至170L/min、0L/min至180L/min、0L/min至190L/min、0L/min至200L/min、0L/min至250L/min、或0L/min至300L/min。
33.根据实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述收获橇包含一个或多个过滤器。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述过滤器包括初级深层过滤器和次级深层过滤器。
35.根据实施方案1至34中任一项所述的方法，其中所述样品混合物选自纯蛋白样品、澄清的原液蛋白样品、细胞培养物样品及其任何组合。
36.根据实施方案1至35中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是在包含哺乳动物细胞的培养物中产生的。
37.根据实施方案36所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、Madin-Darby牛肾细胞(MDBK)或其任何组合。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
39.根据实施方案38所述的方法，其中所述CHO细胞选自CHO-DG44细胞、CHOZN细胞、CHO/dhfr-细胞、CHOK1SV GS-KO细胞、CHO-S细胞。
40.根据实施方案38所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO-DG44，并且其中所述靶蛋白质浓度是使用模型预测的滴度产生的，其中所述模型预测的滴度包含常数(a)和(b)。
41.根据实施方案38至40中任一项所述的方法，其中(a)为-0.35，并且(b)为2.88。
42.根据实施方案38至41中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO-DG44，并且其中所述靶蛋白质浓度是使用模型预测的滴度产生的，其中所述模型预测的滴度包含常数(A)、(B)和(C)。
43.根据实施方案42所述的方法，其中(A)为-0.95，(B)为0.86，并且(C)为1.21。
44.根据实施方案38所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHOZN，并且其中所述靶蛋白质浓度是使用模型预测的滴度产生的，其中所述模型预测的滴度包含常数(a)和(b)。
45.根据实施方案44所述的方法，其中(a)为-0.69，并且(b)为4.06。
46.根据实施方案38、44和45中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHOZN，并且其中所述靶蛋白质浓度是使用模型预测的滴度产生的，其中所述模型预测的滴度包含常数(A)、(B)和(C)。
47.根据实施方案46所述的方法，其中(A)为0.02，(B)为0.13，并且(C)为2.41。
48.根据实施方案1至47中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含抗体或融合蛋白。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述蛋白质是抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗LAG3抗体和抗IL8抗体。
50.根据实施方案48所述的方法，其中所述蛋白质是阿巴西普或贝拉西普。
51.一种用于实时监测和控制蛋白质产率的系统，其中所述系统包含测量包含靶蛋白质和杂质的样品混合物的实时UV信号的传感器。
52.根据实施方案51所述的系统，其中所述系统进一步包含测量压力、浊度、温度、流量、重量或其任意组合的传感器。
53.根据实施方案51或52所述的系统，其供在根据实施方案1至50中任一项的方法中使用。
54.一种设备，其包含传感器，所述传感器经配置以测量包含靶蛋白质和杂质的样品混合物的UV信号。
55.根据实施方案54所述的设备，其进一步包含处理器，所述处理器经配置以控制所述靶蛋白质的收集。
56.根据实施方案54和55中任一项所述的设备，其中所述处理器经配置以使用靶蛋白质滴度。
57.根据实施方案54至56中任一项所述的设备，其中所述处理器经配置以使用已建立的模型来测定细胞培养物收获过程。
58.根据实施方案54至57中任一项所述的设备，其中所述细胞培养物收获过程包括基于过滤的细胞培养物收获过程。
59.根据实施方案51至53中任一项所述的系统，其中所述系统包含根据实施方案54至58中任一项所述的设备。

Claims (10)

1.一种实时监测包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中靶蛋白质浓度(滴度)的方法，其包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号并且使用已建立的模型将所述UV信号自动转换成靶蛋白质滴度。
2.一种控制靶蛋白质收集并且改善包含靶蛋白质和杂质的样品混合物中蛋白质产率的方法，其包括在基于过滤的细胞培养物收获过程期间，实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中根据已建立的模型和自动控制，将所述UV信号连续转换成所述靶蛋白质的滴度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述靶蛋白质的滴度为至少约0.01g/L、至少约0.02g/L、至少约0.03g/L、至少约0.04g/L、至少约0.05g/L、至少约0.06g/L、至少约0.07g/L、至少约0.08g/L、至少约0.09g/L、至少约0.1g/L、至少约0.2g/L、至少约0.3g/L、至少约0.4g/L、至少约0.5g/L、至少约0.6g/L、至少约0.7g/L、至少约0.8g/L、至少约0.9g/L、至少约1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约6.5g/L、至少约7g/L、至少约7.5g/L、至少约8g/L、至少约8.5g/L、至少约9g/L、至少约9.5g/L、至少约10g/L、至少约10.5g/L、至少约11g/L、至少约11.5g/L、至少约12g/L、至少约12.5g/L、至少约13g/L、至少约13.5g/L、至少约14g/L、至少约14.5g/L、至少约15g/L、至少约15.5g/L、至少约16g/L、至少约16.5g/L、至少约17g/L、至少约17.5g/L、至少约18g/L、至少约18.5g/L、至少约19g/L、至少约19.5g/L、或至少约20g/L。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的方法，其进一步包括当所述滴度为至少约0.05g/L、至少约0.06g/L、至少约0.07g/L、至少约0.08g/L、至少约0.09g/L、至少约0.1g/L、至少约0.2g/L、至少约0.3g/L、至少约0.4g/L、至少约0.5g/L、至少约0.6g/L、至少约0.7g/L、至少约0.8g/L、至少约0.9g/L、至少约1g/L、至少约1.5g/L、至少约2g/L、至少约2.5g/L、至少约3g/L、至少约3.5g/L、至少约4g/L、至少约4.5g/L、至少约5g/L、至少约5.5g/L、至少约6g/L、至少约6.5g/L、至少约7g/L、至少约7.5g/L、至少约8g/L、至少约8.5g/L、至少约9g/L、至少约9.5g/L、至少约10g/L、至少约10.5g/L、至少约11g/L、至少约11.5g/L、至少约12g/L、至少约12.5g/L、至少约13g/L、至少约13.5g/L、至少约14g/L、至少约14.5g/L、至少约15g/L、至少约15.5g/L、至少约16g/L、至少约16.5g/L、至少约17g/L、至少约17.5g/L、至少约18g/L、至少约18.5g/L、至少约19g/L、至少约19.5g/L或至少约20g/L时，开始收集所述靶蛋白质。
6.根据权利要求5所述的方法，其中收集的所述靶蛋白质的滴度在约0.05g/L和约20g/L之间、在约0.1g/L和约20g/L之间、在约0.2g/L和约20g/L之间、在约0.3g/L和约20g/L之间、在约0.4g/L和约20g/L之间、在约0.5g/L和约20g/L之间、在约0.6g/L和约20g/L之间、在约0.7g/L和约20g/L之间、在约0.8g/L和约20g/L之间、在约0.9g/L和约20g/L之间、在约1g/L和约20g/L之间、在约0.05g/L和约15g/L之间、在约0.1g/L和约15g/L之间、在约0.2g/L和约15g/L之间、在约0.3g/L和约15g/L之间、在约0.4g/L与约15g/L之间、在约0.5g/L与约15g/L之间、在约0.6g/L和约15g/L之间、在约0.7g/L和约15g/L之间、在约0.8g/L和约15g/L之间、在约0.9g/L和约15g/L之间或在约1g/L和约15g/L之间、在约0.05g/L和约10g/L之间、在约0.1g/L和约10g/L之间、在约0.2g/L和约10g/L之间、在约0.3g/L和约10g/L之间、在约0.4g/L和约10g/L之间、在约0.5g/L和约10g/L之间、在约0.6g/L和约10g/L之间、在约0.7g/L和约10g/L之间、在约0.8g/L和约10g/L之间、在约0.9g/L和约10g/L之间或在约1g/L和约10g/L之间。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其进一步包括当所述收集滴度低于约0.1或0.2g/L时停止所述靶蛋白质的收集。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中与在未实时监测所述样品混合物的紫外线(UV)信号情况下的蛋白质产率相比，所述靶蛋白质产率增加至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白质是从细胞密度为至少约1X 10 6个细胞/mL、至少约5X 106个细胞/mL、至少约1X 107个细胞/mL、至少约1.5X 107个细胞/mL、至少约2X 107个细胞/mL、至少约2.5X 107个细胞/mL、至少约3X 107个细胞/mL、至少约3.5X 107个细胞/mL、至少约4X 107个细胞/mL、至少约4.5X 107个细胞/mL或至少约5X107个细胞/mL的培养基中收获的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述蛋白质过滤是深层过滤。
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