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CN120927976A - 检测抗dlat自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用 - Google Patents

检测抗dlat自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用

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Publication number
CN120927976A
CN120927976A CN202511123467.XA CN202511123467A CN120927976A CN 120927976 A CN120927976 A CN 120927976A CN 202511123467 A CN202511123467 A CN 202511123467A CN 120927976 A CN120927976 A CN 120927976A
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CN
China
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dlat
autoantibody
detecting
amino acid
immune
Prior art date
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Pending
Application number
CN202511123467.XA
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English (en)
Inventor
邵凯
李科
马晓天
付清松
张凤仪
侯颖
赵冰
戴廷军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Original Assignee
Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Qilu Hospital of Shandong University Qingdao filed Critical Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Priority to CN202511123467.XA priority Critical patent/CN120927976A/zh
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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用。本发明通过实验证实DLAT可作为免疫介导的坏死性肌病相关自身抗体的识别抗原，DLAT为免疫介导的坏死性肌病的自身抗体的靶点，抗DLAT自身抗体与皮肌炎中的相关抗原反应性为0％，与免疫介导的坏死性肌病的其他抗原HMGCR、SRP的反应性为0％，抗DLAT自身抗体是免疫介导的坏死性肌病的新型生物标志物，能够实现免疫介导的坏死性肌病的辅助检测和/或诊断。

Description

检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导 的坏死性肌病的产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用。
背景技术
特发性炎症性肌病(idiopathic inflammatorymyopathy，IIM)是一组自身免疫介导的结缔组织病，通常以肌肉慢性炎症为特征，如肌无力、肌肉耐力低下和肌痛等。根据临床和组织病理学表现，IIM主要分为皮肌炎(dermatomyositis，DM)、多发性肌炎(polymyositis，PM)、抗合成酶综合征(anti-synthetase syndrome，ASSD)、免疫介导的坏死性肌病(immune-mediatednecrotizingmyopathy，IMNM)、包涵体肌炎(inclusionbodymyositis，IBM)及青少年特发性炎性肌病(juvenile idiopathicinflammatorymyopathy，JIIM)等临床亚型。自身免疫被认为在肌炎的发病机制中起关键作用，在超过50％的IIM患者中已检测到自身抗体。研究表明，这些自身抗体识别的是细胞核和细胞质的成分，传统上被分为两类，即肌炎相关自身抗体(MAAs)和肌炎特异性自身抗体(MSAs)，MAAs包括抗PM-Scl100(EX0SC9)、PM-Scl75(EXOSC10)、KU70(XRCC6)、RO-52、cN1A(NT5C1A)、Th/To，Fibrillarin以及NOR90(UBTF)抗体；MSAs包括抗NXP-2(MORC3)、SAE1、SAE2、SRP54、Jo-1(HARS)、PL-7(TARS)、PL-12(AARS/ALARS)、EJ(GARS)、OJ(IARS)、OJcomplex、KS(NARS)、Ha/tyrS(YARS)、Mi-2α(CHD3)、Mi-2β(CHD4)、TIF1γ(TRIM33)、MDA-5(IFIH1)、HMGCR以及ZO(FARSA，FARSB))抗体。
免疫介导的坏死性肌病是一种罕见的疾病，于2004年首次被描述。免疫介导的坏死性肌病与其他自身免疫性肌病相比，免疫介导的坏死性肌病更容易出现严重的肌无力和肌肉不可逆性损伤，临床预后差。2016年ENMC专家组提出将免疫介导的坏死性肌病分为抗SRP型、抗HMGCR型和抗体阴性型(血清中未检测到MSAs的IMNM患者为抗体阴性型IMNM患者)，新的分类诊断标准突出了自身抗体的重要性，抗体阳性IMNM的诊断不再依赖肌肉活检病理结果，此外，肌肉活组织检查是侵入性方法，对患者来说不友好。因此，开发新型的、特异性好的生物标志物对免疫介导的坏死性肌病的诊断及预测预后具有极高的价值。
DLAT属于丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex，PDC)E2亚单位。该复合体由三个酶组成，包括丙酮酸脱氢酶组分(pyruvate dehydrogenase，PDHA1；E1)、二氢硫辛酰胺转乙酰基酶(dihydrolipoyl acetyltransferase，DLAT；E2)和二氢硫辛酰胺脱氢酶(pyruvate dehydrogenase phosphatase，PDP1；E3)以及一些辅助因子组成。有文献报道，抗DLAT自身抗体是原发性胆汁性胆管炎较为特异的抗体，在90％以上的原发性胆汁性胆管炎患者体内可以检测出抗DLAT自身抗体，也有报道认为抗DLAT自身抗体与其它一些结缔组织病(SLE，SSc)有关。目前，针对抗DLAT自身抗体在免疫介导的坏死性肌病中的存在情况未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用，丰富免疫介导的坏死性肌病的自身抗体谱，区分免疫介导的坏死性肌病和其他特发性炎症性肌病，特异性检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病，提高免疫介导的坏死性肌病检测和/或诊断的准确性。
本发明提供了检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用。
本发明提供了检测抗DLAT自身抗体的试剂在区分免疫介导的坏死性肌病和其他特发性炎症性肌病的产品中的应用；所述其他特发性炎症性肌病包括皮肌炎。
优选的，所述检测抗DLAT自身抗体的试剂包括多肽和/或能够表达所述多肽的生物材料；所述生物材料包括载体、细胞或组织；
所述多肽为能与抗DLAT自身抗体结合的具有免疫原性的多肽。
优选的，所述载体包括pTriEx系列载体、pCDNA3系列载体、pET系列载体或pBac系列载体；
所述细胞包括HEK293细胞、Hela细胞和CHO细胞中的一种或多种；
所述组织包括哺乳动物组织。
优选的，所述多肽包括DLAT蛋白；所述DLAT蛋白的氨基酸序列包括a)、～c)中的任意一种：
a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性≥70％且＜100％，并且具有与抗DLAT自身抗体结合功能的氨基酸序列；
c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变，并且具有与抗DLAT自身抗体结合功能的氨基酸序列。
优选的，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：
Ⅰ)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Ⅱ)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同一性≥70％且＜100％，并且可表达与抗DLAT自身抗体结合的氨基酸的核苷酸序列；
Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列经修饰或突变，并且可表达与抗DLAT自身抗体结合的氨基酸的核苷酸序列。
本发明还提供了一种检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的试剂盒，包括检测抗DLAT自身抗体的试剂和标记抗体。
优选的，所述检测抗DLAT自身抗体的试剂包括多肽和/或能够表达所述多肽的生物材料；所述生物材料包括载体、细胞或组织；所述多肽为能与抗DLAT自身抗体结合的具有免疫原性的多肽；
所述标记抗体包括辣根过氧化物酶标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、生物素标记的抗体、FITC标记的抗体和Alexa Fluor染料标记的抗体。
优选的，所述试剂盒还包括固相载体和/或缓冲液。
优选的，所述固相载体包括聚乙烯板、膜、载玻片、磁珠、色谱层析填料、微流控通道或聚丙烯酰胺凝胶。
有益效果：
本发明提供了检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用。本发明通过实验证实DLAT可作为免疫介导的坏死性肌病相关自身抗体的识别抗原，DLAT为免疫介导的坏死性肌病的自身抗体的靶点，抗DLAT自身抗体与皮肌炎中的相关抗原反应性为0％，与免疫介导的坏死性肌病的其他抗原HMGCR、SRP的反应性为0％，抗DLAT自身抗体是免疫介导的坏死性肌病的新型生物标志物，能够实现免疫介导的坏死性肌病的检测和/或诊断。
进一步的，本发明以检测抗DLAT自身抗体的试剂为主要成分，建立检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的试剂盒，能够定性或定量分析抗DLAT自身抗体，操作简便，检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病，提高免疫介导的坏死性肌病检测和/或诊断的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为293T细胞爬片血清染色的6种信号模式的荧光图；
图2为Hep2细胞爬片血清染色的7种信号模式的荧光图；
图3为Westernblotting鉴定抗体阴性型IMNM患者样品中存在某一类自身抗体的结果；
图4为IP捕获可与患者样品特异性抗体结合的抗原的结果；
图5为CBA法验证抗体阴性型IMNM患者样品及健康受试者样品的结果；
图6为Westernblotting验证抗体阴性型IMNM患者样品捕获的抗原中含有DLAT蛋白的结果。
具体实施方式
本发明提供了检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用。
本发明提供了检测抗DLAT自身抗体的试剂在区分免疫介导的坏死性肌病和其他特发性炎症性肌病的产品中的应用；所述其他特发性炎症性肌病包括皮肌炎。
作为一种实施方式，本发明所述产品包括试剂盒。
作为一种实施方式，本发明所述检测抗DLAT自身抗体的试剂包括多肽和/或能够表达所述多肽的生物材料；所述生物材料包括载体、细胞或组织；所述多肽为能与抗DLAT自身抗体结合的具有免疫原性的多肽。
作为一种实施方式，本发明将编码所述多肽的基因插入出发载体，将获得的重组载体转入表达系统中表达，纯化后获得表达所述多肽的载体。
作为一种实施方式，本发明所述载体包括pTriEx系列载体、pCDNA3系列载体、pET系列载体或pBac系列载体。作为一种实施方式，本发明所述表达系统优选包括原核表达系统，酵母表达系统，杆状病毒表达系统或哺乳动物细胞表达系统。作为一种实施方式，本发明所述纯化包括亲和层析、分子筛层析、离子交换层析或疏水层析。本发明对所述纯化的具体方式没有严格要求，常规选择即可。作为一种实施方式，本发明所述组织包括哺乳动物组织。作为一种实施方式，本发明所述哺乳动物包括人、羊、马、牛灵长类动物和鼠中的一种或多种。作为一种实施方式，本发明所述组织包括肌肉组织。作为一种实施方式，本发明所述细胞包括HEK293、Hela、293T细胞和CHO细胞中的一种或多种。
作为一种实施方式，本发明所述多肽包括DLAT蛋白；所述DLAT蛋白的氨基酸序列包括a)～c)中的任意一种：a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；b)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性≥70％且＜100％，并且具有与抗DLAT自身抗体结合功能的氨基酸序列；c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变，并且具有与抗DLAT自身抗体结合功能的氨基酸序列。作为一种实施方式，本发明所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性≥70％且＜100％可以为与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
作为一种实施方式，本发明所述修饰包括糖基化修饰、磷酸化修饰、乙酰化修饰、甲基化修饰和泛素化修饰中的一种或多种。作为一种实施方式，本发明所述突变包括取代、缺失或添加至少一个氨基酸。
作为一种实施方式，本发明多肽还包括标签蛋白，连接在所述DLAT蛋白的N端或C端。作为一种实施方式，本发明标签蛋白包括His标签、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、flag标签、myc标签和strep标签中的一种或多种。本发明所述标签蛋白具有促进所述多肽纯化、固定化、沉淀或鉴定的作用。
作为一种实施方式，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：Ⅰ)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；Ⅱ)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同一性≥70％且＜100％，并且可表达与抗DLAT自身抗体结合的氨基酸的核苷酸序列；Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列经修饰或突变，并且可表达与抗DLAT自身抗体结合的氨基酸的核苷酸序列。作为一种实施方式，本发明所述与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同一性≥70％且＜100％可以为与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列同一性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
本发明SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列信息具体如下：
SEQ ID NO:1：MWRVCARRAQNVAPWAGLEARWTALQEVPGTPRVTSR SGPAPARRNSVTTGYGGVRALCGWTPSSGATPRNRLLLQLLGSPGRRYYSLPPHQKVPLPSLSPTMQAGTIARWEKKEGDKINEGDLIAEVETDKATVGFESLEECYMAKILVAEGTRDVPIGAIICITVGKPEDIEAFKNYTLDSSAAPTPQAAPAPTPAATASPPTPSAQAPGSSYPPHMQVLLPALSPTMTMGTVQRWEKKVGEKLSEGDLLAEIETDKATIGFEVQEEGYLAKILVPEGTRDVPLGTPLCIIVEKEADISAFADYRPTEVTDLKPQVPPPTPPPVAAVPPTPQPLAPTPSAPCPATPAGPKGRVFVSPLAKKLAVEKGIDLTQVKGTGPDGRITKKDIDSFVPSKVAPAPAAVVPPTGPGMAPVPTGVFTDIPISNIRRVIAQRLMQSKQTIPHYYLSIDVNMGEVLLVRKELNKILEGRSKISVNDFIIKASALACLKVPEANSSWMDTVIRQNHVVDVSVAVSTPAGLITPIVFNAHIKGVETIANDVVSLATKAREGKLQPHEFQGGTFTISNLGMFGIKNFSAIINPPQACILAIGASEDKLVPADNEKGFDVASMMSVTLSCDHRVVDGAVGAQWLAEFRKYLEKPITMLL。
SEQ ID NO:2：5'-atgtggcgcgtctgtgcgcgacgggctcagaatgtagccccatgggcgggactcgaggctcggtggacggccttgcaggaggtacccggaactccacgagtgacctcgcgatctggcccggctcccgctcgtcgcaacagcgtgactacagggtatggcggggtccgggcactgtgcggctggacccccagttctggggccacgccgcggaaccgcttactgctgcagcttttggggtcgcccggccgccgctattacagtcttcccccgcatcagaaggttccattgccttctctttcccccacaatgcaggcaggcaccatagcccgttgggaaaaaaaagagggggacaaaatcaatgaaggtgacctaattgcagaggttgaaactgataaagccactgttggatttgagagcctggaggagtgttatatggcaaagatacttgttgctgaaggtaccagggatgttcccatcggagcgatcatctgtatcacagttggcaagcctgaggatattgaggcctttaaaaattatacactggattcctcagcagcacctaccccacaagcggccccagcaccaacccctgctgccactgcttcgccacctacaccttctgctcaggctcctggtagctcatatccccctcacatgcaggtacttcttcctgccctctctcccaccatgaccatgggcacagttcagagatgggaaaaaaaagtgggtgagaagctaagtgaaggagacttactggcagagatagaaactgacaaagccactataggttttgaagtacaggaagaaggttatctggcaaaaatcctggtccctgaaggcacaagagatgtccctctaggaaccccactctgtatcattgtagaaaaagaggcagatatatcagcatttgctgactataggccaaccgaagtaacagatttaaaaccacaagtgccaccacctaccccacccccggtggccgctgttcctccaactccccagcctttagctcctacaccttcagcaccctgcccagctactcctgctggaccaaagggaagggtgtttgttagccctcttgcaaagaagttggcagtagagaaagggattgatcttacacaagtaaaagggacaggaccagatggtagaatcaccaagaaggatatcgactcttttgtgcctagtaaagttgctcctgctccggcagctgttgtgcctcccacaggtcctggaatggcaccagttcctacaggtgtcttcacagatatcccaatcagcaacattcgtcgggttattgcacagcgattaatgcaatcaaagcaaaccatacctcattattacctttctatcgatgtaaatatgggagaagttttgttggtacggaaagaacttaataagatattagaagggagaagcaaaatttctgtcaatgacttcatcataaaagcttcagctttggcatgtttaaaagttcccgaagcaaattcttcttggatggacacagttataagacaaaatcatgttgttgatgtcagtgttgcggtcagtactcctgcaggactcatcacacctattgtgtttaatgcacatataaaaggagtggaaaccattgctaatgatgttgtttctttagcaaccaaagcaagagagggtaaactacagccacatgaattccagggtggcacttttacgatctccaatttaggaatgtttggaattaagaatttctctgctattattaacccacctcaagcatgtattttggcaattggtgcttcagaggataaactggtccctgcagataatgaaaaagggtttgatgtggctagcatgatgtctgttacactcagttgtgatcaccgggtggtggatggagcagttggagcccagtggcttgctgagtttagaaagtaccttgaaaaacctatcactatgttgttgtaa-3'。
本发明使用抗体阴性型IMNM患者和健康人血清孵育293T及Hep2细胞爬片，发现相比健康人血清，抗体阴性型IMNM患者血清中可能存在某种特异性抗体，通过免疫沉淀法及质谱鉴定方式筛选出患者血清上的信号为识别DLAT抗原的自身抗体。进一步收集更多肌炎患者血清和健康人血清，作为对照样本，使用过表达DLAT的细胞爬片通过免疫荧光染色分析，结果发现抗DLAT自身抗体可用来区分免疫介导的坏死性肌病与其他炎症性肌病，DLAT可作为免疫介导的坏死性肌病自身抗体的识别抗原之一，检测抗DLAT自身抗体的试剂能够实现免疫介导的坏死性肌病的辅助诊断。
本发明还提供了一种检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的试剂盒，包括检测抗DLAT自身抗体的试剂和标记抗体。
作为一种实施方式，本发明所述检测抗DLAT自身抗体的试剂包括多肽和/或能够表达所述多肽的生物材料；所述生物材料包括载体、细胞或组织；所述多肽为能与抗DLAT自身抗体结合的具有免疫原性的多肽。关于多肽、载体、细胞和组织的相关描述已在前文记载，在此不做赘述。
作为一种实施方式，本发明所述标记抗体包括辣根过氧化物酶标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、生物素标记的抗体、FITC标记的抗体和AlexaFluor染料标记的抗体。作为一种实施方式，本发明所述试剂盒还包括固相载体和/或缓冲液。作为一种实施方式，本发明所述固相载体包括聚乙烯板、膜、载玻片、磁珠、色谱层析填料、微流控通道或聚丙烯酰胺凝胶。作为一种实施方式，本发明所述膜包括尼龙膜、硝酸纤维素膜或PVDF膜。本发明对所述缓冲液的具体类型没有严格要求，根据试剂盒的具体的检测方法选择对应的缓冲液即可。
本发明以检测抗DLAT自身抗体的试剂为主要成分，建立检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的试剂盒，能够定性或定量分析抗DLAT自身抗体，从而检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病，尤其具有辅助诊断作用。利用本发明所述试剂盒进行检测时，对采用的检测方式没有严格要求，采用本发明熟知的方式即可，例如基于细胞的免疫荧光法(CBA)、基于组织的免疫荧光法(TBA)、酶联免疫法(ELISA)、免疫胶体金法、免疫印迹、免疫斑点、膜条法、化学发光、放射免疫法、液相芯片法、侧向层析法或流式细胞检测技术。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例所研究的样品为来自山东省齐鲁医院的一组良好表征的特发性炎性肌病患者(17例抗体阴性型IMNM患者)的血清样品和50例正常人获得的血清。17例抗体阴性型IMNM患者的样本均检测以下自身抗体：抗NXP-2(MORC3)、SAE1、SAE2、SRP54、Jo-1(HARS)、PL-7(TARS)、PL-12(AARS/ALARS)、EJ(GARS)、OJ(IARS)、OJ complex、KS(NARS)、Ha/tyrS(YARS)、cN1A(NT5C1A)、PM-Scl100(EX0SC9)、PM-Scl75(EXOSC10)、KU70(XRCC6)、RO-52、Th/To、Fibrillarin、NOR90(UBTF)、Mi-2α(CHD3)、Mi-2β(CHD4)、TIF1γ(TRIM33)、MDA-5(IFIH1)、HMGCR、ZO(FARSA、FARSB)、PM-Scl100(EX0SC9)、PM-Scl75(EXOSC10)、KU70(XRCC6)、cN1A(NT5C1A)、Th/To、Fibrillarin以及NOR90(UBTF)抗体。
本发明实施例中抗体阴性型IMNM患者1、患者2、患者3及患者7的临床特征如下：
患者1：女，发病年龄41岁；无他汀及激素用药史；无皮疹(Heliotrope皮疹或Gottron丘疹)；不对称性肌力异常(最弱肌力评分1)，累及颈部肌肉和吞咽功能，未累及眼睑；患者昏迷需卧床插管维持；无关节痛/雷诺氏综合征/特发性肺纤维化/肿瘤；心脏异常，多发性房性早搏，心律不齐；无肌电图及磁共振检查数据；肌肉活检可见肌纤维坏死，未见肌肉及束周萎缩，未见肌内膜水肿，HE染色无炎症细胞浸润，免疫组化染色未见MHC1，MHC2在肌细胞膜表达，毛细血管壁有MAC沉积。抗RO-52抗体为阳性，其余自身抗体均为阴性，临床诊断为IMNM。
患者2：男，发病年龄55岁；无他汀及激素用药史；不对称性肌力异常(最弱肌力评分4+)，轻微累及上臂近端肌肉(评分4+)、髂腰肌、股四头肌和股二头肌，轻微累及吞咽功能；有关节痛及雷诺氏综合征，无特发性肺纤维化及肿瘤；心脏功能无异常；肌电图显示肌源性受累电生理改变，无神经源受累改变，磁共振显示肌群受累；肌肉活检可见肌纤维坏死，未见肌肉及束周萎缩，未见肌内膜水肿；HE染色无炎症细胞浸润，免疫组化染色未见MHC1，MHC2在肌细胞膜表达，未见CD8+细胞浸润，无MAC。抗RO-52抗体为阳性，其余自身抗体均为阴性，临床诊断为IMNM。
患者3，女，发病年龄46岁；无他汀及激素用药史；无皮疹(Heliotrope皮疹或Gottron丘疹)；对称性髂腰肌及肩三角肌肌力异常(最弱肌力评分3)，未累及四肢肌肉，颈部肌肉及颜面部肌肉(评分5)及吞咽功能，未累及眼睑肌肉；无肌无力/关节痛/雷诺氏综合征/特发性肺纤维化/肿瘤；心脏功能无异常；肌电图检测显示肌源性受累电生理改变，广泛损害近端尤著，无神经源受累改变，磁共振显示大腿后群脂肪变及后群部分肌肉轻微筋膜水肿；肌肉活检未见肌纤维坏死，未见肌肉及束周萎缩，未见肌内膜水肿；HE染色无炎症细胞浸润，免疫组化染色未见MHC1，MHC2在肌细胞膜表达，未见CD8+细胞浸润，无MAC。上述抗体检测均为阴性，临床诊断为自身抗体阴性的IMNM。
患者7：女，发病年龄67岁；无他汀用药史，曾有激素及丙球治疗，血浆置换治疗；无皮疹(Heliotrope皮疹或Gottron丘疹)；对称性肌力异常(最弱肌力评分2)，累及颈部肌肉及四肢近端肌肉(评分3-0，下肢尤甚)，颜面部肌肉(评分4)及吞咽功能；无关节痛/雷诺氏综合征/特发性肺纤维化，发病后四个月查出乙状结肠恶性肿瘤；心脏异常，有房颤；肌电图检测显示肌源性合并神经源性受累电生理改变，磁共振显示受累肌群弥漫萎缩并存在炎症；肌肉活检未见肌纤维坏死，未见肌肉及束周萎缩，未见肌内膜水肿；HE染色无炎症细胞浸润，免疫组化染色可见MHC1在肌细胞膜弥散表达，未见CD8+细胞浸润，毛细血管壁存在少量MAC；上述抗体检测均为阴性，临床诊断为自身抗体阴性的IMNM。
实施例1
细胞间接免疫荧光法筛选抗体阴性型IMNM患者样品及健康受试者样品
1.293T及Hep2细胞爬片的制备
使用10％FBS-DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养皿底铺有6cm×6cm爬片的293T细胞及Hep2细胞，待细胞密度达到30％～40％时，使用2％多聚甲醛固定，1×PBS冲洗后干燥，保存于-20℃冰箱备用。
2.血清染色
分别以17例抗体阴性型IMNM患者的血清和50例正常人血清为待测样品，用Hank's缓冲液按照1：50的体积比稀释，室温分别孵育至293T细胞爬片及Hep2细胞爬片上1h，Hank's缓冲液洗涤三次，孵育Hank's缓冲液1：200稀释的FITC标记的抗人IgG二抗1h，Hank's缓冲液洗涤三次，显微镜下观察。
根据293T细胞爬片上的信号形式分为6种模式，对应的染色结果如图1所示；其中，图1中从左到右依次为模式一(核内少量粗颗粒)、模式二(胞浆粗颗粒)、模式三(胞浆细颗粒)、模式四(核内多颗粒)、模式五(胞核强信号)和模式六(胞体隐约弥散着色，根据在正常血清大量存在的情况，认为是阴性)。待测样本在293T细胞上的染色结果如表1所示。
根据Hep2细胞爬片血清染色的信号形式分为7种模式，对应的染色结果如图2所示；其中，图2中从左到右依次为模式一(核内少量粗颗粒)、模式二(胞浆细颗粒)、模式三(胞浆明显弥散着色)、模式四(核内多颗粒)、模式五(胞核强信号)、模式六(胞核隐约弥散着色，根据在正常血清大量存在的情况，认为是阴性)和模式七(较为分散的胞浆粗颗粒着色)。待测样本在Hep2细胞上的染色结果如表2所示。
表1待测样品在293T细胞上的染色结果
注：正常人中有1例受试者的血清样品未拍到结果。
表2待测样品在Hep2细胞上的染色结果
注：正常人中有11例受试者的血清样品未拍到结果。
根据表1和表2可以看出，表现为模式二样显色的抗体阴性型IMNM患者人数较多，6例抗体阴性型IMNM的患者血清样品在293T细胞上的染色为模式二，5例抗体阴性型IMNM的患者血清样品在Hep2细胞上染色结果均为模式二；并且，表2中5例抗体阴性型IMNM患者血清样品在293T细胞上的染色为模式二。因此，在293T细胞和Hep2细胞上显示出模式二样抗体阴性型IMNM患者样品中可能存在某种特异性抗体。
实施例2
Western blotting确定在抗体阴性型IMNM患者血清样品中模式二信号代表特异的一类抗体
1.293T细胞及Hep2细胞总蛋白的提取以及蛋白含量的测定
(1)使用10％FBS-DMEM高糖培养基，于37℃，5％CO2细胞培养箱中分别培养293T细胞及Hep2细胞，待细胞长满时将培养液倒掉，用4℃预冷的PBS洗涤两次，每皿加入500μL细胞裂解液(150mMNaCl，1mM EDTA，100mM pH值7.5为的Tris-HCl，0.5％脱氧胆酸钠，1％TritonX-100，0.1％SDS，5％甘油)，冰上静置10min；
(2)用细胞刮刀将细胞刮下来转移至1.5mL离心管，置于冰上，10％功率超声1min(宁波新芝：JY92-IIN)，12000rpm，4℃离心20min，收集上清，加入蛋白酶抑制剂进行分装，于-20℃保存备用；
(3)用BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)测定蛋白浓度。
2.Westernblotting检测
(1)凝胶配制：使用梯度凝胶生成系统(中科泰瑞)配制8～15％梯度胶，待胶凝固后可使用；
(2)上样、电泳及转膜：取步骤1制备好的Hep2细胞及293T细胞蛋白进行上样，每孔上样量为20μg，电泳结束后进行湿法转膜，转膜条件为300mA，90min；转膜完成后使用5％的脱脂奶粉室温封闭1h，将膜条裁剪成10组，备用；
(3)抗体孵育及显色：分别使用TBST对实施例1确定的在293T细胞和Hep2细胞上显示出模式二样自身抗体阴性型IMNM患者血清、2例健康受试者血清、2例RO52自身抗体阳性血清进行600倍稀释，将稀释后的血清作为一抗，4℃过夜孵育至各膜条；次日，TBST洗3次，每次5min；加入HRP标记的羊抗人二抗(厂家：Jackson货号：109-035-098，稀释比例1：5000)，室温孵育1h；TBST洗3次，每次5min；加入ECL化学发光液显色拍照，结果如图3所示；其中图3中泳道1上样样品为293T细胞裂解蛋白；泳道2上样样品为Hep2细胞裂解蛋白，marker购自于thermo公司，货号26616。
根据图3可以看出，阳性对照RO52抗体阳性血清样品在52KD左右有明显条带。与阳性对照组及健康受试者的血清样品条带相比较，患者1、患者2及患者3的样品在70KD位置有明显条带，患者4、患者5及患者6的样品在70KD位置未见条带，患者1、患者2、患者3的样品的强条带位置一致，提示这3名患者的样品中可能有相同的自身抗体。
实施例3
使用免疫沉淀方法(IP)捕获抗体阴性型IMNM患者血清样品中自身抗体所识别的抗原
本实施例中使用的血清为患者1、患者2、患者3及3例健康受试者血清，具体操作步骤如下：
(1)取6皿293T细胞和Hep2细胞，弃上清，加入2％多聚甲醛室温固定10min，1×Hank's洗两次；
(2)血清孵育：用1×Hank's将血清稀释200倍(即25μL血清+5mL 1×Hank's)后分别加入到步骤(1)的细胞中，4℃过夜孵育，次日弃上清；
(3)加入500μLRIPA裂解液(150mM NaCl，1mM EDTA，100mM Tris，1％TritonX-100，0.1％SDS；pH值为7.5)，冰上裂解细胞10min，将细胞用细胞刮刀刮下收集，加入蛋白酶抑制剂，6000rpm离心5min，收集上清；
(4)沉淀中再加入500μL RIPA裂解液(150mM NaCl，1mM EDTA，100mM Tris，1％Triton X-100，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸钠；pH值为7.5)，冰上裂解10min，1％功率超声1min，12000rpm离心5min，收集上清，与步骤(3)收集的上清混合在一起，测定蛋白浓度；
(5)磁珠处理(Bimake ProteinA/G磁珠)：每个反应取50μL磁珠，用磁珠结合/洗涤buffer(50mM Tris，150mMNaCl，0.1％TritonX-100)洗两次，每次5min，加入1％BSA封闭2h；
(6)弃掉封闭BSA，加入步骤(4)收集的混合上清(即抗原抗体复合物)，4℃旋转过夜孵育；
(7)洗脱：弃掉上清，用磁珠结合/洗涤buffer洗三次，每次5min；加入100μLpH值为2.5的甘氨酸，室温旋转20min后置于70℃金属浴煮10min，收集洗脱液，用3MNaOH中和，即为IP洗脱样；
(8)SDS-PAGE：使用梯度凝胶生成系统配制8～15％梯度胶，将上述获得的IP洗脱样每个取20μL，加入loadingbuffer后上样；
(9)银染：使用THERMO PierceTM Silver Stain Kit进行银染，观察目的条带，结果如图4所示；其中，A为为患者及健康受试者样品从293T细胞裂解液中捕获到的抗原蛋白；B为患者及健康受试者样品从Hep2细胞裂解液中捕获到的抗原蛋白。根据图4可以看出，患者1、患者2和患者3血清样品在293T细胞裂解液中捕获抗原蛋白，与3例健康受试者血清样品相比，患者1及患者2的血清捕获到的蛋白在70KD位置上有明显的蛋白条带，位置与Westernblotting结果基本吻合，患者3样品未能观察到明显条带。患者1、患者2和患者3血清样品血清在Hep2细胞裂解液中捕获抗原蛋白的结果与在293T细胞裂解液中捕获抗原蛋白的结果一致。
实施例4
质谱分析
使用清洁刀片切下实施例3患者1，患者2及健康受试者1，健康受试者2样品IP凝胶的70KD位置条带，委托北京诺禾致源进行质谱分析。根据以下原则挑选目的蛋白：(1)对protein标签页中两个实验样品的丰度值进行排序，挑选在两个实验组样品中丰度同时较高的蛋白；(2)从丰度高的蛋白开始，挑选实验组与对照组丰度值差别大的蛋白。对照组有值的，先算出实验组及对照组各自均值，再计算实验组对照组之间的比值；对照组没有值的，将这个表中最低值的量级给对照组，再计算实验组对照组之间的比值。在大多数蛋白两组间比值接近1时，选择比值大于10或100的蛋白；(3)选择分子量接近70KD的，或者是70KD某个整数倍的，或者可能构成的复合物分子量接近70KD，肌炎抗体优先选择酶类蛋白。
结果：通过上述分析，挑选出DLAT蛋白，DLAT又叫PDC-E2，PDCE2，质谱结果中丰度最高，是线粒体呼吸链的丙酮酸脱氢酶复合物的一个亚基，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例5
CBA法确定抗体阴性型IMNM患者血清样品中含有抗DLAT抗体
1.重组载体的构建
委托上海生工将DLAT蛋白编码基因的CDS段及根据质谱结果挑选的其余4种基因合成并克隆到pcDNA3.4质粒载体，得到5种真核细胞过表达载体；
2.细胞转染
(1)293T细胞培养：DMEM高糖培养基与FBS按9：1的体积比配制成10％FBS-DMEM高糖培养基，待细胞铺满时按1：5～1：6的比例传代，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中过夜培养；
(2)待细胞密度为30％～40％时，将pcDNA3.4-DLAT重组载体及另外4种重组载体转入细胞中。
3.爬片固定
(1)洗涤：将生长48h的细胞用PBS洗涤2次；
(2)固定：加入丙酮固定5min；
(3)洗涤：丙酮固定后的爬片用PBS洗涤2次，干燥后备用。
4.受试者血清染色
(1)爬片洗涤：使用PBST洗涤步骤3获得的细胞爬片；
(2)样品孵育：将患者1、患者2、患者3及3例健康受试者血清分别按照1：10的体积比稀释后加至爬片上，室温孵育1h；
(3)洗涤：PBST洗3次，每次5min；
(4)二抗孵育：加入FITC标记的二抗，室温孵育60min；
(5)洗涤：PBST洗3次，每次5min；
(6)显微镜下观察结果，拍照，结果如图5所示。
根据图5可以看出，患者1、患者2和患者3的血清样品与过表达DLAT抗原的细胞反应，产生粗颗粒或斑块状信号；健康受试者1、健康受试者2及健康受试者3的样品不与过表达DLAT抗原的细胞产生反应(由于患者1～3血清样品及健康受试者1～3血清样品均不与过表达另外四种抗原的细胞产生反应，结果未展示)。因此，患者1、患者2和患者3的血清样品中存在的新型自身抗体为识别DLAT抗原的自身抗体。
实施例6
1.肌炎患者血清中抗DLAT自身抗体与IMNM的关联性
为了研究抗DLAT抗体是IMNM血清特异性的，使用实施例5制备的过表达DLAT的细胞爬片通过免疫荧光染色分析来自17例DM患者的血清、9例IMNM自身抗体阳性血清(5例抗HMGCR阳性、4例抗SRP抗体阳性)、19例银屑病、14例ANCA相关性血管炎、73例类风湿性关节炎、47例结缔组织病、63例系统性红斑狼疮、16例抗SAA抗体阳性自身免疫性疾病、3例抗磷脂抗体综合征、2例系统性硬化症、3例自身免疫性肝炎、96例抗体阴性型IMNM患者血清及100例健康受试者血清。结果如表3所示。
表3不同样品中抗DLAT自身抗体的检出率
根据表3可以看出，DM患者的血清都未显示与DLAT的反应性。在独立的IMNM血清队列中确认了针对DLAT的自身抗体在IMNM血清中的相对高的频率，其中15.63％的血清与DLAT反应(其中强阳性样本5例，中阳性样本8例，弱阳性样本2例)，即抗DLAT抗体阳性的患者在抗体阴性型INNM患者中的占比为15.63％。在IMNM自身抗体阳性血清(抗HMGCR、抗SRP抗体阳性)队列中，未显示与DLAT的反应性。除类风湿性关节炎队列1例患者外，其余疾病队列均未显示与DLAT的反应性。100例健康受试者的血清也都未包含抗DLAT自身抗体。据文献报道，抗HMGCR型IMNM患者在INNM患者中的占比为26％，抗SRP型IMNM患者在INNM患者中的占比为39％(AllenbachY,Mammen A L,Benveniste O,et al.224th ENMC InternationalWorkshop:Clinico-sero-pathological classification of immune-mediatednecrotizing myopathies Zandvoort,The Netherlands,14–16October 2016[J].Neuromuscular disorders,2018,28(1):87-99.)，抗DLAT抗体也以较高的频率即15.63％在抗体阴性型IMNM患者检出。
2.抗DLAT自身抗体的灵敏度及特异性分析
ROC曲线是分析临床医学和流行病学研究中常用于评价诊断准确性及确定临界值点的方法，由于步骤1检测DLAT抗体采用的间接免疫荧光法为定性方法，因此判定人体液中是否存在抗DLAT自身抗体与是否IMNM的相关性数据分析结果见表4和表5。
表4抗DLAT抗体的的临床评价检测结果
表5抗DLAT抗体的的临床评价检测结果的各指标分析
根据表4和表5的内容可以看出，抗DLAT抗体用于诊断IMNM时特异度为99.72％，灵敏度为14.29％，抗DLAT抗体阳性时诊断IMNM可靠度较高。因此，抗DLAT自身抗体可用来诊断IMNM，区分IMNM与其他炎症性肌病，抗DLAT自身抗体的存在是IMNM的新型生物标志物。
实施例7
使用Hep2蛋白进行Western blotting验证患者样品中含有DLAT抗体
为了验证实施例6筛选出的DLAT自身抗体阳性患者样品中存在DLAT自身抗体且DLAT自身抗体可从细胞裂解液中捕获到DLAT抗原，参考实施例3的步骤，取实施例3患者1、患者2和患者3血清样品，随机挑选实施例6筛选出的5例患者血清样品的1例(患者7)及随机挑选的2例健康受试者血清样品(健康受试者4和健康受试者5)，从Hep2细胞裂解液中捕获抗原蛋白，进行Westernblotting验证，验证步骤如下：
(1)凝胶配制：使用梯度凝胶生成系统(中科泰瑞)配制8～15％梯度胶，待胶凝固后可使用；
(2)上样、电泳及转膜：取实施例3患者1、患者2和患者3样品从Hep2细胞裂解液中捕获到的抗原蛋白、取实施例6筛选出的患者7及健康受试者4～5的血清样品从Hep2细胞裂解液中捕获到的抗原蛋白(参考实施例3的步骤制备)，进行上样，电泳结束后进行湿法转膜，转膜条件为300mA，90min；转膜完成后使用5％的脱脂奶粉室温封闭1h，备用；
(3)抗体孵育及显色：使用TBST将商业化DLAT抗体(sc-271534，Santa Cruz)按照1：1000的比例稀释后作为一抗，4℃过夜孵育；次日，TBST洗3次，每次5min；加入HRP标记羊抗鼠IgG二抗(厂家：Jackson货号：115-035-166，稀释比例1：5000)，室温孵育1h；TBST洗3次，每次5min；加入ECL化学发光液显色拍照。结果如图6所示。
根据图6可以看出，本发明所描述的4例抗DLAT抗体阳性患者样品的IP洗脱样品可检测到DLAT信号；2例健康受试者样品的IP洗脱样中未见DLAT信号。
根据上述内容可以看出，抗DLAT自身抗体可在IMNM患者样本中检出，抗DLAT自身抗体是IMNM的新型生物标志物，对IMNM具有辅助诊断作用。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.检测抗DLAT自身抗体的试剂在制备检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的产品中的应用。
2.检测抗DLAT自身抗体的试剂在区分免疫介导的坏死性肌病和其他特发性炎症性肌病的产品中的应用；所述其他特发性炎症性肌病包括皮肌炎。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测抗DLAT自身抗体的试剂包括多肽和/或能够表达所述多肽的生物材料；所述生物材料包括载体、细胞或组织；
所述多肽为能与抗DLAT自身抗体结合的具有免疫原性的多肽。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体包括pTriEx系列载体、pCDNA3系列载体、pET系列载体或pBac系列载体；
所述细胞包括HEK293细胞、Hela细胞和CHO细胞中的一种或多种；
所述组织包括哺乳动物组织。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述多肽包括DLAT蛋白；所述DLAT蛋白的氨基酸序列包括a)～c)中的任意一种：
a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列同一性≥70％且＜100％，并且具有与抗DLAT自身抗体结合功能的氨基酸序列；
c)a)或b)中的氨基酸序列经修饰或突变，并且具有与抗DLAT自身抗体结合功能的氨基酸序列。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列包括Ⅰ)～Ⅲ)中的任意一种：
Ⅰ)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
Ⅱ)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列同一性≥70％且＜100％，并且可表达与抗DLAT自身抗体结合的氨基酸的核苷酸序列；
Ⅲ)Ⅰ)或Ⅱ)中的核苷酸序列经修饰或突变，并且可表达与抗DLAT自身抗体结合的氨基酸的核苷酸序列。
7.一种检测和/或诊断免疫介导的坏死性肌病的试剂盒，其特征在于，包括检测抗DLAT自身抗体的试剂和标记抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述检测抗DLAT自身抗体的试剂包括多肽和/或能够表达所述多肽的生物材料；所述生物材料包括载体、细胞或组织；所述多肽为能与抗DLAT自身抗体结合的具有免疫原性的多肽；
所述标记抗体包括辣根过氧化物酶标记抗体、碱性磷酸酶标记抗体、生物素标记的抗体、FITC标记的抗体和Alexa Fluor染料标记的抗体。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括固相载体和/或缓冲液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体包括聚乙烯板、膜、载玻片、磁珠、色谱层析填料、微流控通道或聚丙烯酰胺凝胶。
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