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CN120897933A - 使用细胞穿透性抗体的组合物和方法 - Google Patents

使用细胞穿透性抗体的组合物和方法

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CN120897933A
CN120897933A CN202380084765.5A CN202380084765A CN120897933A CN 120897933 A CN120897933 A CN 120897933A CN 202380084765 A CN202380084765 A CN 202380084765A CN 120897933 A CN120897933 A CN 120897933A
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CN
China
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nucleic acid
seq
cell
cells
sequence
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Application number
CN202380084765.5A
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詹姆斯·汉森
周江兵
陈晓勇
谢英
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Yale University
Original Assignee
Yale University
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Publication date
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Abstract

提供了将核酸货物送入细胞的组合物及其使用方法。组合物通常包括(a)4H2单克隆抗体或其具有抗原结合能力、细胞穿透性的片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或双特异性抗体片段；或其人源化形式或其变体；以及(b)核酸货物，包括例如编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。元件(a)和(b)通常非共价连接形成复合物。还提供了用于增加受试者细胞中免疫受体(如cGAS和TLR7)活化的组合物和方法。这些方法通常包括向受试者施用有效量的4H2抗体。受试者可以是健康的，也可以患有疾病或病症，如癌症或感染。

Description

使用细胞穿透性抗体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2022年10月11日提交的第68/379,121号美国临时申请和2022年10月11日提交的第68/379,123号美国临时申请的权益和优先权，其中每项申请的内容均明确地全部并入本文。
参考序列表
序列表以文本文件的形式提交，文件名为“YU8475PCT.xml”，创建于202310月11日，大小为27,711字节，根据37C.F.R.§1.52(e)(5)，特此以引用方式并入本文作为参考。
技术领域
本发明总体涉及细胞内递送核酸领域，其应用包括但不限于体外、离体和体内基因治疗和基因编辑和/或增强免疫应答，特别是通过免疫受体的调节，其应用包括但不限于治疗癌症和感染以及改进疫苗接种。
背景技术
基因治疗
基因治疗包括一系列应用，从癌症等遗传或获得性疾病的基因替换和敲除，到疫苗接种。病毒载体和合成脂质体已成为当今许多应用的优选载体，但两者都有局限性和风险，包括生产复杂性、有限的包装能力以及不利的免疫学特性，这些都限制了基因治疗的应用，限制了预防性基因治疗的潜力(Seow和Wood，Mol Ther.17(5):767-777(2009)。
已观察到核苷酸在细胞和组织中的体内吸收和分布(Huang等，FEBS Lett.，558(1-3):69-73(2004))。此外，例如，Nyce等的研究表明，反义寡脱氧核苷酸(ODN)吸入后会与内源性表面活性剂(肺细胞产生的脂质)结合，并被肺细胞吸收，而不需要附加的载体脂质(Nyce,等.，Nature，385:721-725(1997))，小核酸被T24膀胱癌组织培养细胞吸收(Ma等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，8:415-426(1998))，仍然需要改进的核酸转染技术，特别是用于体内应用。2003年发现的AAV9仍是人们常用的病毒载体(Robbins，“基因治疗先驱称该领域已落后--递送技术令人尴尬”，Stat，2019年11月)。
因此，本发明的目的是提供改进核酸向细胞递送的组合物及其使用方法。
调节免疫应答
GMP-AMP(cGAMP)合成酶(cGAS)是胞质DNA传感器，通过产生第二信使cGAMP激活先天性免疫应答。反过来，cGAMP又会激活适配体STING(Chen等，Nat Immunol(2016)17(10):1142-9.10.1038/ni.3558)。cGAS-STING通路不仅能介导抵御多种含DNA病原体(如微生物DNA)感染的保护性免疫防御，还能检测肿瘤衍生的DNA并产生内在抗肿瘤免疫。STING通路及其在免疫调节和癌症发展中的作用已在以下文章中进行了综述，例如，Corrales,等.,Cell Res(2017)27(1):96-108.10.1038/cr.2016；Corrales,等.,J Clin Invest(2016)126(7):2404-11.10.1172/JCI86892；Rivera Vargas,等、Eur J Cancer(2017)75:86-97.10.1016/j.ejca.2016.1；Qiao,等.,Curr Opin Immunol(2017)45:16-20.10.1016/j.coi.2016.12.005；He,等.,Cancer Lett(2017)402:203-12.10.1016/j.canlet.2017.05.026。
例如，在肿瘤微环境中，T细胞、内皮细胞和成纤维细胞在体内外STING激动剂的刺激下会产生I型IFN(Corrales等，Cell Rep(2015)11(7)：1018-30.10.1016/j.celrep.2015.04.031)。相比之下，大多数研究表明，肿瘤细胞能抑制STING通路的激活，可能导致癌变过程中的免疫逃避(He，等.，Cancer Lett(2017)402:203-12.10.1016/j.canlet.2017.05.026；Xia，等.，Cancer Res(2016)76(22):6747-59.10.1158/0008-5472.CAN-16-1404)。例如，有证据表明STING通路的激活与诱导自发的抗肿瘤T细胞反应相关，该反应涉及I型IFN基因的表达(Chen，等，Nat Immunol(2016)17(10):1142-9.10.1038/ni.3558；Barber,等.,Nat Rev Immunol(2015)15(12):760-70.10.1038/nri3921；Woo,等.,Immunity(2014)41(5):830-42.10.1016/j.immuni.2014.10.017).此外，宿主STING通路对于树突细胞(DC)介导的肿瘤-Ag特异性CD8+T细胞有效交叉启动是必需的(Woo等，Immunity(2014)41(5)：830-42.10.1016/j.immuni.2014.10.017；Deng等，Immunity(2014)41(5)：843-52.10.1016/j.immuni.2014.10.019)。基于这些结果，人们已开始探索用药物直接刺激STING通路来治疗癌症。
除癌症外，人们还建议开发STING激动剂用于多种不同的治疗目的，包括用作疫苗佐剂以及用于慢性病毒或细菌感染。
随着临床应用范围的不断扩大，用于调节cGAS-STING通路和其它免疫应答受体信号通路的修饰组合物和方法也越来越受欢迎。
因此，本发明公开的另一个目的是提供改进的组合物及其使用方法，以提高免疫受体如cGAS和模式识别受体(PPRs)(包括toll样受体(如TLR7))的活性。
发明内容
本发明提供了将核酸货物送入细胞的组合物及其使用方法。组合物通常包括(a)4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段；单价、二价或多价单链可变片段(scFv)；或双特异性抗体片段；或其人源化形式或其变体；以及(b)核酸货物，其包括例如编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。元件(a)和(b)通常非共价连接形成复合物。示例性4H2抗体及其片段和融合蛋白包括那些具有(i)SEQ ID NO:1的CDR(可选SEQ ID NO:2-4)与SEQ ID NO:5的CDR(可选SEQ ID NO:6-8)组合；(ii)选自SEQ ID NO:1(可选SEQ ID NO:2-4)的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQ ID NO：5(可选SEQ ID NO:5-8)的第一、第二和第三轻链CDR的组合；(iii)(i)或(ii)的人源化形式；(iv)具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链和具有与SEQ ID NO:1至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；(v)(iv)的人源化形式。
在某些实施方案中，抗体或片段或融合蛋白可以是双特异性的，例如，可以包括靶向细胞类型、组织或器官的结合序列。
核酸货物可以由DNA、RNA、修饰核酸(包括但不限于PNA)或其组合组成。4H2与鸟苷结合。因此，货物通常包括一个或多个鸟嘌呤核碱基，优选一个或多个鸟嘌呤核苷。核酸货物通常是功能性货物，如功能性核酸(如抑制性RNA)、mRNA或载体，例如表达载体。核酸货物，包括载体，可以包括编码与表达控制序列可操作连接的目的多肽的核酸序列。载体可以例如是质粒等。货物通常不是随机剪切或片段化的基因组DNA。
在某些实施方案中，货物包括或由编码Cas内切酶、gRNA或其组合的核酸组成。在一些实施方案中，货物包括或由编码嵌合抗原受体多肽的核酸组成。在一些实施方案中，货物是功能性核酸，如反义分子、siRNA、微小RNA(miRNA)、核酸适配体、核酶、RNAi或外部引导序列，或编码其核酸构建体。
货物可以包括或由多个单个核酸分子或多个2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的核酸分子组成。在某些实施方案中，货物的核酸分子包括或由长度在约1到约25,000个核碱基之间的核酸分子组成。货物可以是单链核酸、双链核酸或其组合。
还提供了包括复合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，复合物被包封在聚合物纳米颗粒中。靶向部分、细胞穿透肽或其组合可以与纳米颗粒关联、连接、缀合或以其它方式直接或间接地附接于纳米颗粒上。
此外，还提供了通过使细胞与有效量的单独或包裹在纳米颗粒中的复合物接触，将核酸货物递送入细胞的方法。接触可发生在体外、离体或体内。在某些实施方案中，将有效量的离体处理的细胞施用给有需要的受试者，例如，以有效量治疗疾病或病症的一种或多种症状。
在一些实施方案中，接触发生在对有需要的受试者施用后的体内。受试者可能患有疾病或病症，如遗传性疾病或癌症。可以通过注射或输液等方式向受试者施用有效量的组合物，以减轻受试者疾病或病症的一种或多种症状。
还提供了组合物和方法的应用，包括但不限于基因治疗和CAR T细胞制造/形成/治疗。
还提供了增强有需要的受试者细胞中cGAS和/或其它免疫受体(如模式识别受体，如TLR7)活化的组合物和方法。这些方法通常包括向受试者施用有效量的4H2抗体。示例性的4H2抗体形式包括但不限于完整的单克隆抗体及其细胞穿透性片段，如单价、二价或多价单链可变片段(scFv)、双特异性抗体片段(diabody)等。抗体可以是其人源化形式、其嵌合形式或其变体。
示例性4H2抗体及其片段和融合蛋白包括，例如具有以下各项的那些(i)SEQ IDNO:1(可选SEQ ID NO:2-4)的CDR与SEQ ID NO:5(可选SEQ ID NO:6-8)的CDR组合；(ii)选自SEQ ID NO:1(可选SEQ ID NO:2-4)的第一、第二和第三重链CDR与选自SEQ ID NO：5(可选SEQ ID NO:5-8)的第一、第二和第三轻链CDR的组合；(iii)(i)或(ii)的人源化形式；(iv)具有与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少85％序列同一性的氨基酸序列的重链与具有与SEQ ID NO:1至少85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；(v)(iv)的人源化形式。
在某些实施方案中，受试者患有癌症或感染。在某些实施方案中，受试者没有癌症。因此，还提供了治疗受试者癌症和感染的方法。在某些实施方案中，受试者是健康的受试者。
在某些实施方案中，组合物和/或方法包括向受试者施用附加药物。在一些实施方案中，附加的药剂是核酸货物、免疫刺激性核酸、一种或多种疫苗成分、诱导、增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂及其组合。
在一个具体实施方案中，治疗癌症或感染的方法包括向有需要的受试者施用有效量的4H2抗体与诱导、增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂的组合。
免疫检查点调节剂通常能诱导针对癌症或感染的免疫应答。例如，免疫检查点调节剂可以减少免疫抑制通路，如PD-1通路。因此，调节剂可以是PD-1拮抗剂、PD-1配体拮抗剂或CTLA4拮抗剂。在某些实施方案中，免疫检查点调节剂会增加免疫激活途径。免疫检查点调节剂可以是小分子、抗体、CAR-T细胞或溶瘤病毒。
在另一个具体实施方案中，治疗癌症或感染的方法包括向有需要的受试者施用有效量的4H2单克隆抗体和免疫刺激核酸的组合。在某些实施方案中，免疫刺激性核酸是STING激动剂。
在另一个具体实施方案中，给受试者接种疫苗的方法包括给受试者施用4H2抗体和一种或多种疫苗成分。例如，一种或多种疫苗成分可包括抗原、编码抗原的核酸、佐剂、编码佐剂的核酸或其组合。抗原可以源自例如细菌或病毒。
在某些实施方案中，与单独施用其中一种而不施用另一种相比，对受试者施用4H2和附加药物的组合可导致免疫应答的增加和/或一种或多种癌症或感染症状的减轻。
在某些实施方案中，在施用附加药物前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18或24小时，1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3或4周，或其任何组合，对受试者施用4H2抗体。在其它实施方案中，在施用4H2抗体前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18或24小时，1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3或4周，或其任何组合，向受试者施用附加药物。
任何方法都可以进一步使用治疗剂或干预措施，如化疗药、抗感染药、手术、放疗或其组合。
核酸货物或核苷酸、核苷或核碱基可通过4H2抗体增加cGAS和/或另一种模式识别受体(如TLR7)的细胞穿透和/或激活。因此，所公开的任何组合物和方法都可以还包括核酸货物或核苷酸、核苷或核碱基货物。在某些实施方案中，核酸货物或核苷酸、核苷或核碱基货物是附加药物。在某些实施方案中，核酸货物或核苷酸、核苷或核碱基货物不是附加药物(即与附加药物进一步组合施用)。在优选的实施方案中，核酸货物或核苷酸、核苷或核碱基货物与4H2抗体形成复合物。在优选的实施方案中，核酸货物或核苷酸、核苷或核碱基货物(含有鸟嘌呤或鸟苷)，并与4H2抗体形成复合物。核酸货物可由DNA、RNA、PNA、磷酸二酰胺吗啉寡聚体(PMO)或其它修饰的核酸、核酸类似物或修饰的核苷酸、核苷或核碱基类似物或其组合组成。
附图说明
图1A-1C显示4H2是对DP敏感的细胞穿透性抗GUO自身抗体。图1A是用0-1mg/mL4H2处理Cal12T细胞24小时的裂解物图像，用肌动蛋白一抗作上样对照，用抗小鼠二抗检测肌动蛋白一抗和4H2(均为小鼠)，通过免疫印迹(western blot)进行分析。4H2 HC和LC以其预期的分子量(MW)运行，表明抗体在穿透细胞24小时后没有明显降解。图1B显示了用对照培养基、IgG对照或4H2处理24小时的Cal12T细胞裂解物进行总ERK1/2和pERK1/2免疫印迹分析的图像。IgG对照对总ERK1/2和pERK1/2没有影响，而4H2会降低pERK1/2，但不会降低总ERK1/2。图1C是点阵图，显示了ImageJ对有无DP处理的Cal12T细胞(细胞穿透)中4H2荧光的定量分析。
图2A-2D显示4H2以GUO响应的方式穿透胶质瘤细胞，并穿过BBB(血脑屏障)的Transwell模型。图2A-2C是细胞培养基中添加ADE或GUO对细胞穿透GSC效率的影响图，通过ImageJ对DX1或4H2荧光信号进行定量评估。ADE增强了DX1的穿透力(图2A)，但对4H2没有影响(图2B)。GUO能明显增强4H2的细胞穿透力(图2C)。图2D是显示使用hCMEC/D3脑微血管内皮细胞(BECs)和正常人星形胶质细胞(NHA)的BBB Transwell模型的结果图，该模型用于评估4H2从顶端腔室到基底外侧腔室的跨屏障转运。结果显示4H2可穿透该屏障，且核苷转运抑制剂DP抑制了4H2的转运。
图3A-3B显示4H2定位于原位脑肿瘤并延长GBM模型的存活时间。图3A是用IgG对照(N＝4)或4H2(N＝5)治疗GSC衍生的原位GBM肿瘤小鼠的Kaplan-Meier生存图。与接受IgG对照组治疗的小鼠相比，4H2可使小鼠的中位生存期提高66％(**P<0.01，log-rank检验)，接受4H2治疗组的小鼠在研究结束时的生存率为40％，而接受IgG对照组治疗的小鼠在研究结束时的生存率为0％。图3B是用IgG对照组(6只)、4H2组(6只)、抗PD1组(6只)、抗PD1+IgG对照组(7只)或抗PD1+4H2组(7只)治疗GL261衍生的原位GBM肿瘤小鼠的Kaplan-Meier生存图。与IgG对照组相比，4H2可使中位生存期提高32％(*P＝0.03，log-rank检验)；与抗PD1+IgG对照组相比，4H2与抗PD1联用可使中位生存期提高50％(*P＝0.02，log-rank检验)。单用4H2或4H2+抗-PD1分别使研究结束时的存活率为33％和29％，而所有其它组的存活率均为0％。
图4A是用ImageJ对TUNEL染色进行定量的柱状图，显示与IgG对照组相比，用4H2治疗的小鼠TUNEL信号相对增加了4.5±0.6倍(**P<0.01)。图4B是柱状图，显示了小鼠接受IgG对照或4H2治疗后，根据GBM脑肿瘤切片的抗-CD8免疫染色，每个高倍视野(HPF)中的相对CD8细胞计数。4H2使肿瘤中的CD8含量增加了约53％，4H2治疗小鼠的相对计数为1.53±0.15，而IgG对照组治疗小鼠的相对计数为1.00±0.04(*P<0.03)。这些数据证明了4H2介导的T细胞浸润GBM肿瘤的刺激作用。图4C和4D显示，在免疫缺陷的原位GBM模型中，4H2并未改善存活率。图4C和图4D显示4H2不能提高免疫缺陷原位GBM模型的存活率。显示用每周一次(图4C)或两次(图4D)的IgG对照(分别为N＝4和6)或4H2(分别为N＝4和6)循环治疗患有PPQ原位GBM脑肿瘤的无胸腺裸鼠的Kaplan-Meier存活图。在这种免疫缺陷模型中，与IgG对照组相比，4H2对中位生存期没有明显影响，这表明功能性免疫系统对4H2影响生存期的重要性。
图5A-5D是显示4H2与cGAS结合的免疫印迹(western blot)图像。使用蛋白G珠从IgG对照或4H2处理过的胶质瘤干细胞(GSC)中分离抗体含量和结合蛋白。对输入和蛋白G下拉(pulldown)的western blot进行了G蛋白Ras和cGAS的探测。未观察到IgG对照或4H2与Ras结合(图5A)，但4H2与cGAS有明显的结合，其结合信号大于IgG对照检测到的背景信号(图5B)。纯化的cGAS±核酸与IgG对照或4H2培养，然后用蛋白G拉下抗体和结合蛋白。核酸的存在减少了4H2与cGAS的结合，但并不影响IgG对照与cGAS的非特异性结合(图5C)。抗IgG的western blot证实了下拉样本中的IgG对照和4H2含量相等(图5D)。图5E和5G是westernblot的图像，图5F是柱状图，显示4H2以核酸依赖的方式与cGAS相互作用。纯化的重组cGAS与对照IgG或4H2+/-核酸酶(苯佐酶(benzonase))孵育。然后在蛋白G珠上分离抗体和结合蛋白，用western blot显现cGAS下拉，并用ImageJ定量。在没有核酸酶的情况下，4H2与cGAS的相互作用表现为cGAS pulldown比IgG对照组增加约6倍(***P<0.001)，而加入核酸酶则消除了这种相互作用。
图6A-6D显示4H2能增强cGAS的活性。图6A是显示4H2会导致cGAS活性的剂量依赖性增加的折线图。cGAS活性是通过在IgG对照或4H2存在下，测量ATP和GTP产生的cGAMP的相对产量来检测的。图6B是免疫印迹图像，显示4H2在GSC中诱导NF-kB的核转位。经IgG对照或4H2处理的GSC的细胞质和核内容物被分离，并以NF-kB和Lamin B1为上样对照进行Westernblot探测分析。用对照组或cGAS siRNA转染的GSC用IgG对照组或4H2处理。图6C是证实成功敲除的cGAS western blot图像。图6D是显示集落形成试验结果的折线图，表明4H2对GSC的cGAS依赖性毒性。图6E是显示4H2诱导NF-κB的核转位的柱状图。经IgG对照或4H2处理的PPQ细胞的细胞质和核内容物通过免疫印迹(western blot)分析，检测NF-κB，Lamin B1为上样对照。用ImageJ对NF-κB的核相对含量进行定量。4H2使核NF-κB的相对含量增加了2.2±0.2倍(*P<0.05)。图6F是显示了用对照或cGAS siRNA转染并用IgG对照组或4H2处理的Cal12T肺癌细胞(D)中通过集落形成试验测定的存活率柱状图，证明了4H2的cGAS依赖性毒性。(*P<0.05).
图7A-7B显示了4H2结合DNA和RNA。图7A是通过1％琼脂糖EMSA评估4H2与环状和线性化pcDNA3质粒DNA结合情况的图像。4H2而不是IgG对照使两种形式的DNA都发生与结合一致的位移。图7B是通过1％琼脂糖EMSA评估4H2与总DNA和mRNA结合情况的图像。4H2而非IgG对照会使两种形式的RNA发生与结合一致的移动。
图8A-8B是显示4H2向胶质瘤细胞递送DNA和mRNA的柱状图。将与DX1或4H2复合物的pGL4.13(luc2/SV40)加入U87胶质瘤细胞中，24小时后检测荧光素酶活性(图8A)。将与DX1或4H2复合或包封在MC3-LNP脂质纳米颗粒中的Luc mRNA加入U87胶质瘤细胞中，24小时后检测荧光素酶活性(图8B)。
图9A-9B显示了4H2在中枢神经系统(CNS)中介导局部基因治疗的图像。将4H2/CremRNA注入Ai9 Cre报告小鼠的大脑，24小时后通过RFP荧光评估Cre重组酶的活性。在注射轨迹的局部区域可观察到RFP信号(图9A)。眼内注射4H2/Cre mRNA处理Ai9 Cre报告小鼠二十四小时后评估RFP信号。视网膜中可观察到的RFP信号证明了4H2介导的视网膜基因治疗(图9B)。
图10A-10B是显示4H2在体内递送mRNA的图像。携带H358侧腹肿瘤的裸鼠接受DX1或4H2与Luc mRNA混合物(w/w＝3)的单次瘤内注射。6、24和72小时后，通过IVIS评估Luc的表达。4H2/Luc mRNA成功介导了Luc的表达，而在注射了DX1/Luc mRNA的肿瘤中检测到的信号极少(图10A)。C57/BL6小鼠肌肉注射4H2/Luc mRNA(左股四头肌w/w＝3，右股四头肌w/w＝1)。6小时和24小时后，用IVIS评估Luc的表达。4H2/Luc mRNA成功介导了Luc的表达(图10B)。
图11A-11B是一系列具有代表性的IVIS图像(图11A)和相应的柱状图(图11B)，显示了未经处理小鼠和仅用4H2、4H2+NF2 DNA或4H2+NF2 mRNA处理的小鼠在表达荧光素酶的HEI 193xenograph模型中的发光情况。
图12A是4H2-CD5双特异性抗体的设计示意图。图12B和12C是一系列有代表性的FACS图(图12B)和相应的柱状图(图12C)，显示了从携带MC38肿瘤的Ai9小鼠模型中分离出来的DeRed肿瘤细胞的表达情况。
图13A和13B是用IgG对照或4H2处理胶质瘤干细胞样细胞(GSC)的细胞裂解物并检测TLR7的western blot图像和相应图表(由ImageJ确定)。图13C是western blot的图像。蛋白G珠从用IgG对照或4H2处理的GSC切割液中拉下抗体和结合蛋白，然后进行TLR7免疫印迹分析。印迹代表两个独立实验。
具体实施方式
I.定义
本文所用术语“单链Fv”或“scFv”是指单链可变片段，包括单条多肽链中的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，单链可变区和重链可变区通过连接臂连接，使scFv形成抗原结合所需的结构(即单条多肽链的VH和VL相互结合形成Fv)。VL和VH区域可以源自亲本抗体，也可以通过化学合成或重组合成。
本文所用术语“可变区”被设计为将免疫球蛋白的此类结构域与抗体广泛共有的结构域(如抗体的Fc结构域)区分开来。可变区包括“超变区”，其残基负责抗原结合。超变区包括源自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常在轻链可变区中约为残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，重链可变区中约为残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院，Bethesda,MD.(1991))和/或源自“超变环”的残基(即轻链可变区中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，以及重链可变区中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196:901-917)。
本文所用术语“框架区”或“FR”残基是指除本文定义的超变区残基以外的可变区残基。
本文所用术语“抗体”是指结合靶抗原的天然抗体或合成抗体。该术语包括多克隆抗体和单克隆抗体。除了完整的免疫球蛋白分子外，“抗体”一词还包括结合蛋白、片段、这些免疫球蛋白分子的聚合物，以及结合靶抗原的人或人源化的免疫球蛋白分子。
本文所用术语“细胞穿透性抗体”是指可被转运到活的哺乳动物细胞的细胞质中的免疫球蛋白、其片段、其变体或基于其的融合蛋白。本文所用术语“细胞穿透性抗鸟苷抗体”是指被转运到活的哺乳动物细胞的细胞质中并与鸟苷结合的抗体或其抗原结合片段或分子。在某些实施方案中，抗体无需借助载体或缀合物即可被转运到细胞的细胞质中。在其它实施方案中，抗体与细胞穿透部分(如细胞穿透肽)缀合。
除了完整的免疫球蛋白分子外，术语“抗体”还包括免疫球蛋白分子的片段、结合蛋白和聚合物，含有源自一个以上物种、类别或亚类免疫球蛋白序列的嵌合抗体，例如人抗体或人源化抗体，以及至少含有特异性结合DNA的免疫球蛋白特异型的重组蛋白。可以使用本文所述的体外检测方法或类似方法检测抗体的预期活性，然后根据已知的临床检测方法检测其体内治疗活性。
本文所用术语“变体”是指与参照多肽或多核苷酸不同，但保留基本特性的多肽或多核苷酸。多肽的典型变体在氨基酸序列上不同于另一种参考多肽。通常来说，差异是有限的，因此参照多肽和变体的序列总体上非常相似，在许多区域甚至完全相同。变体多肽和参照多肽的氨基酸序列可能因一种或多种修饰(如取代、添加和/或缺失)而不同。取代或插入的氨基酸残基可能是也可能不是遗传密码编码的氨基酸残基。多肽的变体可以是天然存在的，如等位基因变体，也可以是未知天然存在的变体。
可以对本公开的多肽结构进行修饰和改变，但仍可获得与多肽具有相似特征的分子(如保守的氨基酸取代)。例如，某些氨基酸可以取代序列中的其它氨基酸，而不会明显丧失活性。由于多肽的相互作用能力和性质决定了多肽的生物功能活性，因此可以在多肽序列中进行某些氨基酸序列置换，但仍可获得具有类似特性的多肽。
在进行这种改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸的指数在赋予多肽相互作用的生物功能方面的重要性在本领域中已广为人知。众所周知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其它氨基酸取代，但仍能产生具有相似生物活性的多肽。根据疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被分配了亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天门冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
通常认为，氨基酸的相对亲水性决定了所得多肽的二级结构，而二级结构又反过来决定了多肽与其它分子(如酶、底物、受体、抗体、抗原和辅助因子)的相互作用。众所周知，氨基酸可以被另一具有相似亲水指数的氨基酸取代，但仍然可以获得功能等同的多肽。在这种变化中，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，±1以内的氨基酸特别优选，±0.5以内的氨基酸更加特别优选。
基于氨基酸的亲水性，特别是在由此产生的生物功能等效多肽或肽用于免疫学实施例的情况下，可以进行同类氨基酸的取代。以下是分配给氨基酸残基的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酸(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，氨基酸可以被另一具有相似亲水值的氨基酸取代，但仍然可以获得生物等效的，特别是免疫等效的多肽。在这种变化中，亲水值在±2以内的氨基酸的取代是优选的，亲水值在±1以内的氨基酸是特别优选的，亲水值在±0.5以内的氨基酸甚至是更加特别优选的。
如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到上述各种特性的示例性取代对于本领域技术人员来说是众所周知的，其中包括(原始残基：示例性取代)：(Ala：Gly，Ser)，(Arg：Lys)，(Asn：Gln，His)，(Asp：Glu，Cys，Ser)，(Gln：Asn)，(Glu：Asp)，(Gly：Ala)，(His：Asn，Gln)，(Ile：Leu：Leu，Val)、(Leu：Ile，Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu，Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Tip：Tyr)、(Tyr：Trp，Phe)和(Val：Ile，Leu)。因此，本公开的实施方案考虑了上述多肽的功能或生物等效物。特别是，多肽的实施方案可以包括与目的多肽具有约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的变体。
本文所用术语“序列同一性百分比(％)”是指在比对序列并根据需要引入空位以达到最大序列一致性百分比后，候选序列中与参比核酸序列中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比。用于确定序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术人员掌握的各种方法实现，例如，使用公开的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法，可通过已知方法确定。
本文所用术语“特异性结合”是指抗体与其同源抗原(如鸟苷)结合，而与其它抗原无明显结合。在这种条件下，要使抗体与靶标特异性结合，就必须选择对靶标具有特异性的抗体。可以使用多种免疫测定方法来选择对特定蛋白具有特异性免疫应答的抗体。例如，固相ELISA免疫测定法通常用于选择对蛋白有特异性免疫应答的单克隆抗体。参见例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPublications,New York，其中描述了可用于确定特异性免疫应答的免疫测定模式和条件。优选地，抗体与抗原“特异性结合”，其与第二分子的亲和常数(Ka)大于约105mol-1(例如106mol-1、107mol-1、108mol-1、109mol-1、1010mol-1、1011mol-1和1012mol-1或更高)。
本文所用术语“单克隆抗体”或“MAb”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即除了可能存在于抗体分子的一小部分中的天然突变外，抗体群体中的单个抗体是相同的。
本文所用术语“受试者”是指作为施用对象的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。因此，受试者可以是人类。该术语并不表示特定的年龄或性别。
本文所用术语“有效量”是指所用组合物的用量足以改善疾病或病症的一种或多种病因或症状。这种改善只要求减少或改变，而不一定需要消除。精确的用量会因各种因素而变化，例如受试者相关变量(如年龄、免疫系统健康状况等)、所治疗的疾病或病症，以及施用途径和所施用药剂的药代动力学。
如本文所用术语“药学上可接受的”是指在生物学上或其它方面不产生不良影响的材料，即这种材料可以给受试者服用，而不会引起任何不良的生物学效应，或以有害的方式与包括该材料的药物组合物中的任何其它成分相互作用。
本文所用术语“载体”或“赋形剂”是指制剂中的有机或无机成分、天然或合成的非活性成分，一种或多种活性成分与之结合。载体或赋形剂的选择自然是为了最大限度地减少活性成分的降解，并最大限度地减少对受试者的任何不良副作用，这也是本领域技术人员所熟知的。
本文所用术语“治疗”是指对患者进行医疗管理，目的是治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状态或病症的治疗，也包括因果治疗，即针对消除相关疾病、病理状态或病症的病因的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即旨在缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即旨在尽量减少或部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症发展的治疗；以及支持性治疗，即用于补充旨在改善相关疾病、病理状态或病症的另一种特定疗法的治疗。
本文所用术语“靶向部分”是可以将微粒或分子导向选定细胞或组织类型的受体位点的组分，可以作为附接分子，或用于偶联或附接另一种分子。本文所用的“引导”是指使分子优先附接于选定的细胞或组织类型。如下文所述，这可用于引导细胞材料、分子或药物。
本文所用术语“抑制”或“减少”是指降低活性、反应、状况、疾病或其它生物参数。这可以包括但不限于完全消除活性、反应、状况或疾病。这也可以包括，例如，与天然水平或对照水平相比，活性、反应、状况或疾病降低10％。因此，与天然水平或对照水平相比，减少量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于两者之间的任何减少量。
本文所用术语“融合蛋白”是指通过在一个多肽的氨基末端和另一个多肽的羧基末端之间形成的肽键将两个或两个以上的多肽连接在一起而形成的多肽。融合蛋白可以通过组成多肽的化学偶联形成，也可以通过编码单个连续融合蛋白的核酸序列表达为单个多肽。单链融合蛋白是具有单个连续多肽骨架的融合蛋白。融合蛋白可采用分子生物学中的常规技术制备，将两个基因在框内连接成单个核酸序列，然后在适当的宿主细胞中表达该核酸，在此条件下产生融合蛋白。
除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的叙述只是作为一种简略方法，用于单独提及属于该范围内的每个单独的数值，每个单独的数值都被纳入说明书中，如同在本文中单独叙述一样。
使用术语“约”是为了描述在约为+/-10％范围内高于或低于所述值的值；在其它实施例中，所述值的范围可在约为+/-5％范围内高于或低于所述值；在其它实施例中，所述值的范围可在约为+/-2％范围内高于或低于所述值；在其它实施例中，所述值的范围可在约为+/-1％范围内高于或低于所述值。前述范围旨在通过上下文说明，并不意味着进一步的限制。
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序执行。此处提供的任何及所有示例或示例性语言(例如“如”)的使用仅仅是为了更好地阐明本发明的实施例，并不构成对本发明实施例范围的限制，除非另有权利要求。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元件对于本发明的实施是必不可少的。
所公开的材料、组合物和组分可用于所公开的方法和组合物，可与之结合使用，可用于所公开的方法和组合物的制备，或者是所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些材料和其它材料，而且可以理解的是，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的各种单独和集体组合和排列的具体参考，但每种组合和排列在本文中都是具体考虑和描述的。例如，如果公开并讨论了配体，并讨论了可对包括该配体在内的多种分子进行的多种修饰，那么，除非明确指出相反的情况，否则配体的每一种组合和排列方式以及可能进行的修饰都是具体考虑的。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F，并公开了组合分子A-D的实例，那么即使没有单独列出每种分子，每种分子也是单独和集体地被考虑到的。因此，在本示例中，A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F组合中的每一种都是特别考虑到的，并应视为从A、B和C；D、E和F的公开中所公开；以及示例组合A-D。同样，其中的任何子集或组合也是特别考虑和公开的。因此，举例来说，A-E、B-F和C-E的子组都是特别考虑到的，并应视为已公开的A、B和C；D、E和F；以及示例组合A-D。此外，上述考虑和公开的每种材料、组合物、组分等也可以具体和独立地包括或不包括在此类材料的任何组、亚组、列表、集合等中。
这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开组合物的方法中的步骤。因此，如果可以执行各种附加步骤，那么可以理解的是，这些附加步骤中的每一个都可以用所公开方法的任何具体实施例或实施例组合来执行，而且每一个这样的组合都是特别考虑到的，并应视为已公开。
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任何合适的顺序执行。使用本文提供的任何及所有示例或示例性语言(例如“如”)，只是为了更好地阐明本发明的实施例，并不构成对本发明实施例范围的限制，除非另有声明。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元件对于本发明的实施是必不可少的。
II.组合物
研究发现，4H2抗体有助于将核酸递送穿过质膜进入细胞质。因此，提供了使用4H2增强核酸构建体递送的组合物和方法。通常，将有效量的4H2抗体与需要递送到细胞中的核酸接触。通常情况下，接触需要足够长的时间，以便4H2和核酸货物形成非共价复合物。复合物与细胞接触足够长的时间，核酸货物才能被递送入细胞。与细胞在没有抗体的情况下与核酸货物接触相比，核酸货物可能以更大的数量、更高的质量(例如，更完整、更有功能等)或更快的速度或其组合积聚。由于抗体作为递送手段，递送系统通常是非病毒的。
从系统性红斑狼疮(SLE)的小鼠模型中分离出了多种细胞穿透性抗DNA自身抗体。虽然这些抗体大多能穿透活细胞核，但抗GUO自身抗体4H2却因其细胞质定位而与众不同。4H2结合GUO的表位与G蛋白的结合位点一致，这与人类系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中抗GUO自身抗体结合的报道相吻合(Colburn等，Journal of Rheumatology 30(5)，993-97(2003))：993-97(2003))。此外，4H2还能穿透并降低培养细胞中的cAMP浓度，这与干扰G蛋白信号传导是一致的(Colburn&Green，Clin Chim Acta 370:9-16(2006))。以下结果表明，4H2的细胞质穿透与核苷转运有关，4H2与核酸结合并介导核酸转运，与cGAS结合并增强其活性，从而对肿瘤细胞产生cGAS依赖性毒性。结果还表明，如4H2诱导TLR7所示，4H2能引起TLR7活化(TLR7的切割形式才具有活性)。此外，pulldown分析表明，4H2与TLR7的切割形式结合。因此，还提供了调节cGAS和其它模式识别受体(如TLR7)的组合物和方法。
A.4H2抗体
虽然本文通常称为“4H2”、“4H2抗体(4H2 antibody)”或“4H2抗体(4H2antibodies)”，但可以理解的是，除非另有说明(如，实验示例)本文公开的短语“4H2”、“4H2抗体(4H2 antibody)”或“4H2抗体(4H2antibodies)”不仅包括整个免疫球蛋白，还包括片段和结合蛋白，包括抗原结合片段、变体和融合蛋白，如scFv、di-scFv、tri-scFv和其它单链可变片段、嵌合形式和人源化形式及其它细胞穿透、核酸转运分子，并明确提供用于本文公开的组合物和方法。抗体在本文中也被称为细胞穿透蛋白和结合蛋白。
在优选的实施方案中，4H2抗体无需借助载体或缀合物即可被转运到细胞的细胞质中。
组合物和方法中可使用的抗体包括任何类别的全免疫球蛋白(即完整抗体)、其片段以及至少含有抗体的抗原结合可变区的合成蛋白。不同抗体的可变区在序列上存在差异，可用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，抗体可变区的变异性通常并不是均匀分布的。它通常集中在轻链和重链可变区中被称为互补决定区(CDR)或超变区的三个区段。可变区中保守程度较高的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括四个FR区域，大部分采用β-折叠构象，由三个CDR连接，形成连接β-折叠构象的环，在某些情况下还构成β-折叠构象的一部分。每条链上的CDR通过FR区紧密结合在一起，并与另一条链上的CDR共同构成抗体的抗原结合位点。因此，抗体通常至少含有维持鸟苷结合所需的CDR。
以前曾从MRLmpj/lpr狼疮小鼠模型中产生过4H2杂交瘤。4H2不会定位于溶酶体或内体，而在其它运载工具(如TAT肽)的情况下，货物分子往往会在溶酶体或内体被破坏。4H2是细胞穿透性狼疮抗鸟苷抗体，可降低细胞中ERK和Akt的磷酸化，对携带一系列小GTPaseK-Ras突变的癌细胞有毒性，而对携带WT K-Ras的细胞则无明显毒性。参见已公开的国际申请WO 2015/134607和WO 2017/218824，其中每项申请的全部内容均通过引用具体纳入。
4H2抗体通常是单克隆4H2或其变体、其衍生物、其片段、其融合体或其人源化形式，其可结合与4H2相同或不同的表位。
1.抗体序列
a.4H2轻链可变区
mAb 4H2的kappa轻链可变区(VL)的氨基酸序列为：
DIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1)。
互补决定区(CDR)以下划线显示，包括RASQSISNYLH(SEQ ID NO:2)；CDR L2:YASQSIS(SEQ ID NO:3)；CDR L3:QQSNSWPLT(SEQ ID NO:4)。
b.4H2重链可变区
mAb 4H2的重链可变区(VH)的氨基酸序列为：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGRVNPSNGGISYNQKFKGKATLTVDKSLSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGPYTMYYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5)。
互补决定区(CDR)用下划线表示，包括CDR H1:DYYMN(SEQ ID NO:6)；CDR H2:RVNPSNGGISYNQKFKG(SEQ ID NO:7)；CDR H3:GPYTMYY(SEQ ID NO:8)。
2.抗体的形式
可使用的示例性抗体包括任何类别的全免疫球蛋白(即完整抗体)、其片段以及至少含有抗体抗原结合可变区的合成蛋白。不同抗体的可变区在序列上存在差异，可用于每种特定抗体与其特定抗原的结合和特异性。然而，抗体可变区的变异性通常并不是均匀分布的。它通常集中在轻链和重链可变区中被称为互补决定区(CDR)或超变区的三个区段。可变区中保守程度较高的部分称为框架(FR)。天然重链和轻链的可变区各包括四个FR区，主要采用β-折叠构象，由三个CDR连接，形成连接β-折叠构象的环，在某些情况下还构成β-折叠构象的一部分。每条链上的CDR通过FR区紧密结合在一起，并与另一条链上的CDR共同构成抗体的抗原结合位点。因此，抗体可以包括穿透细胞和结合鸟苷所需的CDR成分。
抗体可以是人源化抗体或嵌合抗体，或其片段、其变体或其融合蛋白。人源化非人抗体的方法在本领域是众所周知的。通常来说，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“导入”残基，通常源自“导入”可变区。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。
4H2抗体可由抗体片段或融合蛋白组成，该抗体片段或融合蛋白包括与4H2的CDR或其变体或其人源化形式的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的一个或多个CDR(例如SEQ ID NO:1和5中任何一个的CDR，例如分别为SEQ ID NO:2-4和6-8)。可通过BLAST蛋白比对确定两个氨基酸序列的同一性百分比。在一些实施方案中，抗体包括一个、两个、三个、四个、五个或全部六个上述优选可变区的CDR(例如，SEQ ID NO:1和5)，没有任何变化，或每个CDR最多有0、1、2、3、4或5个变化(即每个CDR独立选择)，或所有CDR的总变化。
4H2抗体可由抗体片段或融合蛋白组成，该抗体片段或融合蛋白包括与4H2或其人源化形式(如SEQ ID NO:5和1)的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％相同的可变重链和/或轻链的氨基酸序列。
优选地，抗体包括与轻链CDR1、CDR2和CDR3结合的重链CDR1、CDR2和CDR3。
因此，在某些实施方案中，细胞穿透性抗体包括SEQ ID NO:5和1的CDR或整个重链和轻链可变区；或其人源化形式。
许多非人抗体(如来源于小鼠、大鼠或兔子的抗体)对人类具有天然抗原性，因此在给人类使用时会引起不良的免疫应答。因此，提供了人源化的4H2抗体、抗体片段和融合物。人源化抗原结合分子可降低抗体或抗体片段或scFv在给人用药时引起不良免疫应答的几率。
非人类(如鼠类)抗体的其人源化形式包括嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段，它们含有源自非人类免疫球蛋白的最小序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体抗体互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异性、亲和力和容量的非人类物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基所取代。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架残基会被相应的非人类残基取代。人源化抗体还可能含有既不存在于受体抗体中也不存在于导入的CDR或框架序列中的残基。通常来说，人源化抗体将基本上包括至少一个(通常是两个)可变区，其中所有或基本所有的CDR区域都与非人免疫球蛋白的CDR区域相对应，而所有或基本所有的FR区域都是人免疫球蛋白共识序列的FR区域。人源化抗体优选至少包括一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。
人源化非人抗体的方法在本领域是众所周知的。通常来说，人源化抗体具有从非人源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“导入”残基，通常源自“导入”可变区。抗体人源化技术通常涉及使用重组DNA技术来操纵编码抗体分子的一条或多条多肽链的DNA序列。人源化基本上可以通过将啮齿动物的CDR或CDR序列替换为人类抗体的相应序列来实现。因此，非人抗体(或其片段)的人源化形式是嵌合抗体或片段，其中基本上少于完整的人类可变区已被非人物种的相应序列所取代。实际上，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类动物抗体中类似位点的残基所取代。
为了减少抗原性，选择用于制造人源化抗体的轻人类可变区和重人类可变区非常重要。根据“最佳拟合”法，将啮齿类动物抗体的可变区序列对照已知人类可变区序列整个文库进行筛选。最接近啮齿类动物序列的人类序列被接受为人源化抗体的人类框架(FR)。另一种方法是使用衍生自轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共识序列所衍生的框架。同一框架可用于多个不同的人源化抗体。
更重要的是，抗体在人源化的同时，还要保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为了实现这一目标，人源化抗体优选是通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产品的方法制备。三维免疫球蛋白模型可获得的，也是本领域技术人员所熟悉的。现有的计算机程序可以说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。通过检查这些显示，可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中可能发挥的作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合抗原能力的残基。通过这种方法，可以从共识序列和导入序列中选择并组合FR残基，从而获得所需的抗体特性，如增加对靶抗原的亲和力。通常来说，CDR残基直接且最实质性地参与影响抗原的结合。
此外，还包括具有生物活性的抗体片段。这些片段无论是否附接到其它序列，都包括对特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、置换或其它选择性修饰，前提是与未修饰的抗体或抗体片段相比，该片段的活性没有明显改变或受损。
生产本公开的抗原蛋白的特异性单链抗体的技术也可以进行调整。生产单链抗体的方法为本领域技术人员所熟知。单链抗体可以通过使用短肽连接臂将重链和轻链的可变区融合在一起，从而在单个分子上重建抗原结合位点。在已开发出的单链抗体可变片段(scFv)中，一个可变区的C端与另一个可变区的N端通过15至25个氨基酸的肽或连接臂连接在一起，而不会明显破坏抗原结合或结合的特异性。选择连接臂以允许重链和轻链以正确的构象方向结合在一起。
可以对4H2抗体进行修饰，以提高其治疗潜力。例如，在某些实施方案中，细胞穿透性4H2抗体与靶细胞胞质和/或细胞核中对第二个例如治疗靶点特异的另一种抗体缀合。例如，细胞穿透性4H2抗体可以是含有4H2 Fv和单克隆抗体单链可变片段的融合蛋白，该单克隆抗体可特异性结合第二靶点。在其它实施方案中，细胞穿透性4H2抗体是双特异性抗体片段，其具有源自4H2的第一重链和第一轻链，以及源自特异性结合第二靶点的单克隆抗体的第二重链和第二轻链。
在某些实施方案中，第二靶点对靶细胞类型、组织、器官等具有特异性。因此，第二重链和第二轻链可作为靶向部分，将复合物靶向某靶细胞类型、组织、器官。在一些实施方案中，第二重链和第二轻链靶向造血干细胞、CD34+细胞、T细胞、癌细胞或感染细胞或任何其它优选的细胞类型，例如，通过靶向在优选细胞类型上表达的受体或配体。在某些实施方案中，第二重链和第二轻链靶向胸腺、脾脏或癌细胞。
在某些实施方案中，尤其是用于体内靶向T细胞的实施方案中，例如，用于体内生产CAR T细胞的实施方案中，可以靶向免疫细胞或T细胞标记物，如CD3、CD5、CD7或CD8。例如，抗CD8抗体和抗CD3 Fab片段都已被用于体内靶向T细胞(Pfeiffer，等.，EMBO MolMed.，10(11)(2018).pii:e9158.doi:10.15252/emmm.201809158.，Smith，等.，NatNanotechnol.，12(8):813-820(2017).doi:10.1038/nnano.2017.57)。因此，在一些实施方案中，4H2抗体或抗原结合片段或融合蛋白是双特异性抗体部分，该部分可特异性地与CD3、CD5、CD7、CD8或另一种免疫细胞(如T细胞)标记物或特定组织如胸腺、脾脏或肝脏的标记物结合。
示例性片段和融合物包括但不限于单链抗体、单链可变片段(scFv)、二价单链可变片段(di-scFv)、三价单链可变片段(tri-scFv)、双特异性抗体片段(diabody)、三特异性抗体片段(triabody)、四价抗体片段(teratbody)、二硫键连接的可变片段(sdFv)、Fab'、F(ab')2、可变片段(Fv)和单域抗体片段(sdAb)。
例如，二价单链可变片段(di-scFv)可以通过连接两个scFv来设计。这可以通过生产具有两个VH区和两个VL区的单肽链来实现，从而产生串联scFv。scFv也可以设计为连接肽，但连接肽太短，两个可变区无法折叠在一起(约5个氨基酸)，从而迫使scFv二聚化。这种类型被称为双特异性抗体片段(diabody)。研究表明，双特异性抗体片段(diabody)的解离常数比相应的scFv低40倍，这意味着它们对靶标的亲和力要高得多。更短的连接臂(一个或两个氨基酸)可导致三聚体(即，三特异性抗体片段triabodies或tribodies)的形成。此外还产生了四价抗体片段(teratbody)。与双特异性抗体片段(diabody)相比，它们对靶标的亲和力甚至更高。在某些实施方案中，4H2抗体可包括两个或多个相连的4H2单链可变片段(如4H2 di-scFv、4H2 tri-scFv)或其保守变体。在某些实施方案中，4H2抗体是双特异性抗体片段(diabody)或三特异性抗体片段(triabody)(如4H2双特异性抗体片段(4H2diabody)、4H2三特异性抗体片段(triabody))。
在某些实施方案中，抗体与细胞穿透部分(如细胞穿透肽)缀合或融合，以促进抗体进入细胞。细胞穿透肽的实例包括但不限于聚精氨酸(如R9)、触角足序列(Antennapediasequences)、TAT、HIV-Tat、穿透素(Penetratin)、Antp-3A(Antp突变体)、Buforin II、细胞穿透肽(Transportan)、MAP(模型两亲性肽)、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、Pep-1、SynB1、Pep-7、HN-1、BGSC(双胍-精胺-胆固醇)和BGTC(双胍-三乙烯四胺-胆固醇)。在其它实施方案中，抗体是通过TransMabsTM技术修饰的(InNexus Biotech.,Inc.,Vancouver,BC)
通过将抗体或其片段与治疗剂偶联，可增强抗体的功能。抗体或抗体片段与治疗剂的偶联可以通过制造免疫偶联物或融合蛋白来实现，也可以通过将抗体或抗体片段与包括抗体或抗体片段和治疗剂的核酸如DNA或RNA(如siRNA)连接来实现。
重组融合蛋白是通过融合基因的基因工程创造的蛋白。这通常包括从编码第一种蛋白的cDNA序列中移除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR将第二种蛋白的cDNA序列添加到框架中。然后，DNA序列将作为单一蛋白在细胞中表达。这种蛋白可以被设计为包括两种原始蛋白的完整序列，也可以只包括其中一种的一部分。如果两个实体都是蛋白，通常还会添加连接臂(或“间隔基”)，使蛋白更有可能独立折叠，并按照预期的方式运行。
在某些实施方案中，对细胞穿透性抗体进行修饰以改变其半衰期。在某些实施方案中，希望能延长抗体的半衰期，使其在血液循环中或治疗部位存在的时间更长。例如，可能需要使抗体滴度在血液循环中或治疗部位保持较长时间。在其它实施方案中，4H2抗体的半衰期会缩短，以减少潜在的副作用。4H2Fv等抗体片段的半衰期可能比完整尺寸抗体的半衰期短。改变半衰期的其它方法是已知的，可用于所述方法中。用可延长半衰期的Fc变体设计抗体，例如，可以使用XtendTM抗体半衰期延长技术(Xencor,Monrovia,CA)。
a.连接臂
本文所用术语“连接臂”包括但不限于肽连接臂。只要不干扰可变区与表位的结合，肽连接臂可以是任何大小。在某些实施方案中，连接臂包括一个或多个甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸残基。单价单链抗体可变片段(scFv)，其中一个可变区的C端通常通过15至25个氨基酸肽或连接臂与另一个可变区的N端相连。选择连接臂以允许使重链和轻链以正确的构象方向结合在一起。如上所述，双特异性抗体片段(diabody)、三特异性抗体片段(triabody)等的连接臂通常比单价scFv的连接臂短。二价、三价和其它多价scFv通常包括三个或更多连接臂。连接臂的长度和/或氨基酸组成可以相同，也可以不同。因此，连接臂的数量、连接臂的组成和连接臂的长度可根据本领域已知的scFv所需效价来确定。连接臂能允许或驱动形成二价、三价和其它多价scFv。
例如，连接臂可包括4-8个氨基酸。在具体实施方案中，连接臂包括氨基酸序列GQSSRSS(SEQ ID NO:10)。在另一实施方案中，连接臂包括15-20个氨基酸，例如18个氨基酸。在具体实施方案中，连接臂包括氨基酸序列GQSSRSSSGGGSSGGGS(SEQ ID NO:11)。其它柔性连接臂包括但不限于氨基酸序列Gly-Ser、Gly-Ser-Gly-Ser(SEQ ID NO:12)、Ala-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:13)、(Gly4-Ser)2(SEQ ID NO:14)和(Gly4-Ser)4(SEQID NO:15)以及(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:16)。
其它示例性连接臂包括，例如RADAAPGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)和ASTKGPSVFPLAPLESSGS(SEQ ID NO:18)。
b.示例性4H2 scFv序列
本领域技术人员将理解，示例性融合蛋白或其结构域可用于构建上文更详细讨论的融合蛋白。例如，在一些实施方案中，scFv包括与VH可变区(如SEQ ID NO:5或其功能变体或其片段)相连的scFv，该scFv包括Vk可变区(SEQ ID NO:1或其功能变体或其片段)。在一些实施方案中，di-scFv包括第一scFv，该scFv包括Vk可变区(SEQ ID NO:1或其功能变体或其片段)，与VH可变区(例如，SEQ ID NO:5或其功能变体或其片段)相连，与包括Vk可变区(如SEQ ID NO:1或其功能变体或其片段)的第二scFv连接，与VH可变区(如SEQ ID NO:5或其功能变体或其片段)连接。在一些实施方案中，三价单链可变片段(tri-scFv)包括双价单链可变片段(di-scFv)，其与第三scFv结构域连接，第三scFv结构域包括与VH可变区连接的Vk可变区(如SEQ ID NO:1，或其功能变体或其片段)，并与VH可变区(如SEQ ID NO:5，或其功能变体或其片段)连接。
例如，Vk可变区可通过例如连接臂(如(GGGGS)3(SEQ ID NO:19))单独或连接臂和轻链CH1的(6aa)的组合(如RADAAP(SEQ ID NO:20))与VH可变区连接。scFv可通过连接臂(如人IgG CH1起始的13个氨基酸(如ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO:21))单独连接或与旋转序列(如LESSGS(SEQ ID NO:22))组合连接。其它合适的连接臂已在上文讨论过，也是本领域已知的。
在某些实施方案中，融合蛋白包括附加的结构域。例如，在某些实施方案中，融合蛋白包括提高溶解度的序列。在某些实施方案中，融合蛋白包括一个或多个可提高融合蛋白的纯化、分离、捕获、鉴定、分离等的结构域。示例性结构域包括例如Myc标记和/或His标记。其它可取代结构域和附加结构域已在上文详细讨论。
还提供了示例性scFv分子。
DIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSG TDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKADAAPGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGAS VKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGRVNPSNGGISYNQKFKGKATLTVDKSLSTAYMQLNSLTSEDSAV YYCARGPYTMYYWGQGTSVTVSSHHHHHH(SEQ ID NO:9)
单下划线：4H2 VL序列
双下划线：连接臂序列
虚线下划线：4H2 VH序列
波浪下划线：His6标签
例如，scFv可以包括与SEQ ID NO:9的4H2 VH的N端序列连接的SEQ ID NO:9的4H2VL序列的C端，或与SEQ ID NO:9的4H2 VL的N端序列连接的SEQ ID NO:9的4H2 VH序列的C端。SEQ ID NO:9的连接臂可以用替代连接臂代替，包括但不限于本文公开的替代连接臂。通常，连接臂约为10至约25个氨基酸，通常包括甘氨酸。SEQ ID NO:9的His6标签可以用另一种标签取代，移至scFv的N末端或完全删除。在一些实施方案中，4H2 VL、4H2 VH或其组合是SEQ ID NO:9的4H2 VL和/或4H2 VH的变体或其人源化形式。在某些实施方案中，与SEQID NO:9的4H2 VL和/或4H2 VH相比，4H2 VL和/或4H2 VH结构域的N端、C端均被截短。scFv可以包括SEQ ID NO:9的4H2 VL和/或4H2 VH的3个CDR或其人源化形式。在一些实施方案中，抗体、片段或其融合物与SEQ ID NO:9的序列同一性至少为50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。在某些实施方案中，抗体或片段或其融合物的VL结构域与SEQ ID NO:9的4H2 VL结构域具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，抗体、片段或其融合物的VH结构域与SEQ ID NO:9的4H2 VH结构域具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
SEQ ID NO:9及其人源化形式和其变体可用于本文公开的任何组合物和方法中。在某些实施方案中，SEQ ID NO:9或其人源化形式或其变体可用于治疗方法，如本文公开的方法，而无需与纳米载体或治疗剂缀合。因此，在某些实施方案中，SEQ ID NO:9或其人源化形式或其变体只是治疗剂。在某些实施方案中，SEQ ID NO:9或其人源化形式或其变体不是治疗剂(例如，只是靶向部分)，或者是两种或多种治疗剂之一。
c.示例性4H2双特异性抗体
下面的实施例13中使用了示例性双特异性抗体。该抗体具有图12A所示的格式以及重链和轻链可变区序列：
4H2序列
VL：
DIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1)
VH：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGRVNPSNGGISYNQKFKGKATLTVDKSLSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGPYTMYYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5)
CD5序列
VL：
NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVGTAVAWYOQKPDQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLOPEDIATYFCHQYNSYNTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:23)
VH：
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQAPGKGLEWVAHIWWDDDVYYNPSLKSRLTITKDASKDQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRRRATGTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:24)
该抗体只是示例性的，可以理解的是，还明确提供了其它形式、替代序列，特别是框架序列，甚至是靶向CD5以外抗原的其它第二臂结合结构域。例如，在某些实施方案中，提供具有SEQ ID NO:1、5、23和24的CDR或其人源化形式(例如，每个CDR或总共有1、2、3个突变，如保守取代)的嵌合或人源化双特异性抗体，其具有人重链和轻链可变区框架和任选地具有恒定结构域。
4H2的预测CDR已在上文中以下划线标明。抗CD5的预测CDR在上文中以下划线标出，并明确提供：
CDR L1:QASQDVGTAVA(SEQ ID NO:25)；CDR L2:YWTSTRHT(SEQ ID NO:26)；HQYNSYNT CDR L3:(SEQ ID NO:27)。
CDR H1:TFSGFSLSTSGMGVG(SEQ ID NO:28)；CDR H2:HIWWDDDVY(SEQ ID NO:29)；CDR H3:RRATGTGFDY(SEQ ID NO:30)。
例如，4H2-CD5双特异性抗体片段可由抗体片段或融合蛋白组成，该抗体片段或融合蛋白包括一个或多个与4H2或其变体或其人源化形式的CDR的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性的CDR(例如，SEQ ID NO:1和5中的任一个CDR，如分别为SEQ ID NO:2-4和6-8)与抗CD5抗体片段或其融合蛋白或其变体或其人源化形式(例如，SEQ ID NO:23和24中的任一个CDR，如分别为SEQ ID NO:25-27和28-30)的组合。可通过BLAST蛋白比对确定两个氨基酸序列的同一性百分比。在一些实施方案中，抗体包括一个、两个、三个、四个、五个或全部六个上述优选可变区的CDR(例如，SEQ ID NO:1和5和/或23和24)，没有任何变化，或每个CDR(即，每个CDR独立选择)或所有CDR累计最多有0、1、2、3、4或5个变化。
4H2-CD5双特异性抗体可由抗体片段或融合蛋白组成，抗体片段或融合蛋白包括可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列，该氨基酸序列与4H2或其人源化形式(如SEQ IDNO:5和1)的可变重链和/或可变轻链的氨基酸序列和抗CD5或其人源化形式(如SEQ ID NO:24和23)的可变重链和/或轻链的氨基酸序列具有至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的同一性。
优选地，双特异性抗体包括4H2中每一种的重链CDR1、CDR2、CDR3与轻链CDR1、CDR2、CDR3的组合，并与抗CD5抗体的对应CDR区的组合。
因此，在某些实施方案中，细胞穿透双特异性抗体包括SEQ ID NO:5和1和24和23的CDR或整个重链和轻链可变区；或其人源化形式。
B.附加药物
以下结果表明，细胞外核酸可通过4H2促进细胞穿透。此外细胞质DNA激活cGAS会导致内源性产生环GMP-AMP，这是一种独特的第二信使，可与干扰素基因刺激因子(STING)结合，导致TANK结合激酶1(TBK1)和IRF3被激活，从而导致编码I型干扰素的基因转录(Pesiridis和Fitzgerald，Nature Reviews Genetics第20卷，第657-674页(2019))。下面的实验结果表明，4H2能激活cGAS和其它模式识别受体(PPR)，如TLR7。这种激活可能是通过4H2直接结合和激活，也可能是通过免疫受体、4H2和细胞质核酸和/或GTP之间的同时相互作用间接结合。
因此，所公开的组合物可用于促进核酸货物的递送。另外或可选地，4H2抗体也可在有或没有核酸货物的帮助下用于调节免疫应答。例如，在某些实施方案中，组合物和方法包括核酸和/或GTP(也称为核酸货物)，以促进4H2细胞穿透和/或激活cGAS和/或另一种PRR，如TLR7。
此外，STING激动剂已被提出用于多种不同的治疗目的，包括治疗癌症、感染和用作疫苗佐剂。参见，例如，Pesiridis和Fitzgerald，Nature Reviews Genetics第20卷，第657-674页(2019)，其全部内容通过引用并入本文。因此，在某些实施方案中，所公开的组合物和方法包括促进这些应用的附加药物。附加药物的非限制性实例包括但不限于附加STING激动剂、疫苗组合物和免疫检查点抑制剂，下文将更详细地讨论其中的每一种。在一些实施方案中，附加药物是核酸(如免疫刺激寡核苷酸、编码疫苗成分如肽抗原的核酸等)。这类核酸的附加药物可以是核酸货物，也可以是单独给受试者的附加剂或替代剂。
因此，任何附加药物都可以与4H2抗体处于相同或不同的混合物中，并且可以与4H2抗体在相同或不同的时间施用。在某些实施方案中，例如附加药物是核酸货物时，附加药物和4H2抗体在给受试者施用前接触并形成复合物。抗体与核酸货物之间的相互作用是非共价的。在这种实施方案中，可将复合物施用给受试者。尽管被称为货物，但如本文所公开的，货物核酸也可以单独施用，因此在这些条件下不一定是4H2抗体的货物。
1.货物
还提供了核酸货物。正如下文更详细地讨论的，所公开的4H2抗体可用于将核酸货物递送至细胞，以达到任何目的。在具体实施方案中，货物还可用于增加4H2抗体的细胞穿透和/或增加cGAS和/或另一种PRR(如TLR7)的活化。在本文提供的核酸递送方法中所用，4H2通常与核酸货物复合的细胞接触。抗体或结合蛋白与核酸货物之间的相互作用是非共价的。
核酸货物可以是单链或双链，也可以是单个核苷酸、核苷酸或核碱基，或多个核苷酸、核苷酸或核碱基。在某些实施方案中，货物是GTP、GDP、GMP、cGAMP或cGMP。核酸货物可以是DNA、RNA、核酸类似物或其组合，或包括DNA、RNA、核酸类似物或其组合。如下文所述，核酸类似物可以在碱基部分、糖基部分或磷酸骨架上进行修饰。例如，这种修饰可以提高核酸的稳定性、杂交性或可溶性。4H2可与鸟苷结合。因此，货物通常包括一个或多个鸟嘌呤核碱基，优选一个或多个鸟嘌呤核苷。
核酸货物可以是功能性的，即，是药剂或编码药剂，药剂一旦被递送到细胞内就具有生物活性，也可以是非功能性的，只是促进4H2递送到细胞质和/或激活cGAS和/或另一种PRR(如TLR7)。下文将更详细地讨论示例性货物，但包括编码目的多肽的mRNA或DNA，例如包括表达构建体和载体、抑制性核酸(如siRNA)或编码抑制性核酸的核酸，例如包括表达构建体和载体，或非编码RNA或DNA。
所公开的组合物可以包括多个单个核酸货物分子。在某些实施方案中，组合物包括多个(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)不同的核酸分子。
在某些实施方案中，货物分子的长度为0.001、0.01、1、10’s、100’s、1,000’s、10,000’s和/或100,000’s千碱基。
在某些实施例中，例如货物可以介于0.001kb和100kb之间，或介于0.001kb kb和50kb之间，或介于0.001kb kb和25kb之间，或介于0.001kb和12.5kb之间，或介于0.001kb和10kb之间，或介于0.001kb和8kb之间，或介于0.001kb和5kb之间，或介于0.001kb和2.5kb之间，或介于0.001kb和1kb之间，或介于0.01kb和100kb之间，或介于0.01kb和50kb之间，或介于0.01kb和25kb之间，或介于0.01kb和12.5kb之间，或介于0.01kb和10kb之间，或介于0.01kb和8kb之间，或介于0.01kb和5kb之间，或介于0.01kb和2.5kb之间，或介于0.01kb和1kb之间，或介于0.1kb和100kb之间，或介于0.1kb kb和50kb之间，或介于0.1kb kb和25kb之间，或介于0.1kb和12.5kb之间，或介于0.1kb和10kb之间，或介于0.1kb和8kb之间，或介于0.1kb和5kb之间，或介于0.1kb和2.5kb，或介于0.1kb和1kb之间，或介于1kb和100kb之间，或介于1kb kb和50kb之间，或介于1kb kb和25kb之间，或介于1kb和12.5kb之间，或介于1kb和10kb之间，或介于1kb和8kb之间，或介于1kb和5kb之间，或介于1kb和2.5kb之间，均包含端点值。
在某些实施方案中，例如货物可以介于0.2kb和10kb之间，或介于0.2kb和5kb之间，或介于0.2kb和2.5kb之间，或介于0.2kb和1kb之间，或介于0.2kb和0.5kb之间，或介于0.2kb和0.25kb之间，或介于0.5kb和10kb之间，或介于0.5kb和5kb之间，或介于1kb和5kb之间，或介于1kb和3kb之间，或介于2kb和10kb之间，或介于3kb和5kb之间。
可以理解的是，在具体应用中，核酸货物的长度可以是一个或多个离散长度，例如，落在上述范围(包括端点)的一个范围内，每个范围的具体值已明确公开。例如，大小可以小到单个核苷酸或核碱基。在示例性应用中，货物是环状二核苷酸，如cGAMP，它是STING激动剂。在其它实施方案中，货物是短寡聚物。例如，短至8mer的寡聚物可用于反义或剪接转换。稍长的寡聚体(如18至20个聚合物)可用于基因编辑。
a.货物的形式
核酸货物是核酸，可以是分离的核酸组合物。本文所用的“分离的核酸”是指与哺乳动物基因组中存在的其它核酸分子分离的核酸，包括哺乳动物基因组中通常位于核酸一侧或两侧的核酸。本文所使用的有关核酸的术语“分离的”还包括与任何非天然存在的核酸序列的组合，因为这种非天然存在的序列在自然界中是找不到的，在天然存在的基因组中也没有直接相邻的序列。
分离的核酸可以是例如DNA分子，条件是天然基因组中紧靠该DNA分子侧翼的核酸序列之一被移除或缺失。因此，分离的核酸包括但不限于作为独立于其它序列的单独分子存在的DNA分子(例如：化学合成的核酸或通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及掺入载体、自主复制质粒、病毒(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或疱疹病毒)或原核细胞或真核细胞基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸还可以包括工程化核酸，如作为杂交或融合核酸一部分的重组DNA分子。存在于诸如cDNA文库或基因组文库或含有基因组DNA限制性消化物的凝胶切片中的数百至数百万个其它核酸中的核酸不能被视为分离的核酸。
编码多肽的核酸序列包括基因组序列。还公开了外显子已被删除的mRNA/cDNA序列。还公开了编码多肽的其它核酸序列，如包括上述氨基酸序列及其片段和其变体的多肽。编码多肽的核酸可以被优化以在所选的表达宿主中表达。可以用编码相同氨基酸的取代密码子代替密码子，以解决核酸序列来源生物与表达宿主之间密码子用法的差异。通过这种方式，核酸可使用表达宿主优选的密码子合成。
核酸可以是有义或反义取向的，也可以与编码多肽的参考序列互补。
i.载体
货物可以是载体，例如编码多肽和/或功能性核酸的载体。如上文所述的核酸，可以插入载体用于在细胞中表达。本文所用的“载体”是复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒，可将另一个DNA片段插入其中，以实现插入片段的复制。载体可以是表达载体。“表达载体”是包括一个或多个表达控制序列的载体，“表达控制序列”是控制和调节另一个DNA序列转录和/或翻译的DNA序列。
载体中的核酸可与一个或多个表达控制序列可操作地连接。例如，可将控制序列整合到基因构建体中，从而使表达控制序列有效控制目的编码序列的表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由DNA分子区域组成的表达控制序列，通常位于转录起始点上游100个核苷酸以内(通常靠近RNA聚合酶II的起始位点)。要使编码序列受启动子控制，就必须将多肽翻译阅读框的翻译起始位点置于启动子下游1到50个核苷酸之间。增强子在时间、位置和水平方面具有表达特异性。与启动子不同，增强子可以在距离转录位点不同的位置发挥作用。
增强子也可以位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录成mRNA时，该编码序列是“可操作地连接”的，并在细胞中的受表达控制序列的控制，然后将mRNA翻译成该编码序列编码的蛋白。
合适的表达载体包括但不限于质粒、粘粒和病毒载体，例如源自噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、细胞巨细胞病毒、逆转录病毒、疫苗病毒、腺病毒和腺病毒相关的载体。许多载体和表达系统都可以从Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(La Jolla,CA)和Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA)等公司购得。
在某些实施方案中，货物被递送到细胞内并保持在染色体外。在某些实施方案中，货物被导入宿主细胞并整合到宿主细胞的基因组中。如下文所详细讨论的，组合物可用在基因治疗方法中。基因治疗方法可包括将改变细胞基因型的多核苷酸导入细胞。多核苷酸的导入可以通过基因重组纠正、替换或以其它方式改变内源基因。方法可包括引入有缺陷基因的整个替换拷贝、异源基因或小核酸分子(如寡核苷酸)。例如，可将校正基因导入宿主基因组的非特异性位置。
在某些实施方案中，货物是载体。构建含有基因序列和适当转录与翻译控制元件的表达载体的方法是本领域众所周知的。这些方法包括体外DNA重组技术、合成技术和体内基因重组。表达载体通常包括调控序列和必要的元件，用于插入的编码序列的翻译和/或转录，例如，可以是目的多核苷酸。编码序列可与启动子和/或增强子可操作地连接，以帮助控制所需基因产物的表达。根据基因表达的预期控制类型，生物技术中使用的启动子有不同类型。通常可分为组成型启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子和合成型启动子。
例如，在某些实施方案中，目的多核苷酸与启动子或本领域已知的其它调控元件可操作地连接在一起。因此，货物可以是载体，如表达载体。多核苷酸在原核或真核系统中的工程化表达可通过重组表达领域技术人员通常已知的技术进行。表达载体通常包括在一个或多个启动子控制下的已公开组合物之一。要使编码序列“受”启动子的“控制”，通常要将阅读框的翻译起始位点的5'端置于所选启动子的“下游”(即3'端)约1至50个核苷酸之间。“上游”启动子刺激插入DNA的转录，促进编码重组蛋白或功能性核酸的表达。这就是本文中“重组表达”的含义。
有许多标准技术可用于构建含有适当核酸和转录/翻译控制序列的表达载体，以便在各种宿主表达系统中实现蛋白、肽或功能性核酸的表达。
用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括复制起点(必要时)、位于待表达基因前方的启动子，以及任何必要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。复制起点可以通过构建载体来提供，其中包括外源复制起点，如可能源自SV40或其它病毒(如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)来源，也可以由宿主细胞染色体复制机制提供。如果载体整合到宿主细胞染色体中，后者通常就足够了。
启动子可以源自哺乳动物细胞的基因组(如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(如腺病毒晚期启动子；疫苗病毒7.5K启动子)。此外，利用通常与所需基因序列相关的启动子或控制序列也是可能的，而且可能是理想的，前提是这些控制序列与宿主细胞系统兼容。
可以利用多种基于病毒的表达系统，例如，常用的启动子源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40，SV40)。SV40病毒的早期启动子和晚期启动子都很有用，因为这两种启动子都可以很容易地从病毒中获得，作为片段，其中还包括SV40病毒的复制起点。也可使用较小或较大的SV40片段，但需包括从HindIII位点向位于病毒复制起点的BglI位点延伸的约250bp序列。
在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可将编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合体上，如晚期启动子和三联先导序列。然后可通过体外重组或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入到病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)后，致使重组病毒能够存活，并能在感染的宿主体内表达蛋白。所公开组合物的有效翻译可能还需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。此外，可能还需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员很容易确定这种需要并提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须与所需编码序列的阅读框同框(或同相)，以确保整个插入片段的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子的来源多种多样，既有天然的，也有人工合成的。包括适当的转录增强子元件或转录终止子可提高表达效率。
在真核表达中，如果原始克隆片段中不包括一个适当的多聚腺苷酸化位点，那么通常还需要在转录单元中加入适当的多聚腺苷酸化位点。通常情况下，多聚腺苷酸化位点位于蛋白终止位点“下游”约30至2000个核苷酸处，即转录终止前的位置。
为了长期、高产地生产重组蛋白，稳定表达是优选。例如，可以工程化能稳定表达编码蛋白的构建体的细胞系。与使用含有病毒复制起源的表达载体不同，宿主细胞可以用由适当的表达控制元件(如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的载体进行转化。引入外源DNA后，可让工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记赋予细胞选择抗性，使细胞能将质粒稳定地整合到其染色体中，并生长形成集落，集落进而可被克隆和扩增成细胞系。
ii.mRNA
货物可以是mRNA
也可以使用具有提高稳定性和/或翻译效率的化学结构。例如，RNA可以具有5'和3'UTR。例如，3'UTR的长度可以超过100个核苷酸。在某些实施方案中，3'UTR序列在100至5000个核苷酸之间。在某些实施方案中，5'UTR的长度在0至3000个核苷酸之间。要添加到编码区的5'和3'UTR序列的长度可以通过不同的方法改变，包括但不限于设计与UTR不同区域退火的PCR引物。使用这种方法，本领域普通技术人员可以修改5'和3'UTR长度，以便在转录RNA递送后达到最佳翻译效率。
5'和3'UTR可以是目的基因天然存在的内源性5'和3'UTR。或者，也可以通过在正向和反向引物中掺入UTR序列或对模板进行任何其它修饰来添加非目的基因内源性的UTR序列。使用非目的基因内源性的UTR序列可用于改变RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，众所周知，3'UTR序列中富含的AU元件会降低mRNA的稳定性。因此，可根据本领域众所周知的UTR特性选择或设计3'UTR，以提高转录RNA的稳定性。
在某些实施方案中，5'UTR包括内源基因的Kozak序列。或者，在如上所述通过PCR添加非目的基因内源性的5'UTR时，可通过添加5'UTR序列重新设计共识Kozak序列。Kozak序列可以提高某些RNA转录本的翻译效率，但似乎并非所有RNA都需要Kozak序列才能实现高效翻译。许多mRNA对Kozak序列的要求在本领域是众所周知的。在其它实施方案中，5'UTR可以源自RNA病毒，其RNA基因组在细胞中是稳定的。在其它实施方案中，可在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物，以阻碍核酸外切酶对mRNA的降解。
在某些实施方案中，mRNA的5'端有帽子，3'端有poly(A)尾巴或其组合决定了核糖体的结合、翻译的起始和mRNA在细胞中的稳定性。
5'端帽子为RNA分子提供稳定性。例如，5'帽子可以是m7G(5')ppp(5')G,m7G(5')ppp(5')A、G(5')ppp(5')G或G(5')ppp(5')A帽子类似物，这些都可以在市场上买到。5'帽子也可以是抗反向帽子类似物(ARCA)(Stepinski等，RNA，7:1468-95(2001))或任何其它合适的类似物。5'帽子可以使用本领域已知的技术掺入(Cougot等，Trends in Biochem.Sci.，29:436-444(2001)；Stepinski等，RNA，7:1468-95(2001)；Elango等，Biochim.Res.Res.Commun.，330:958-966(2005))。
RNA还可以包括内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，它可以启动非帽依赖性核糖体与mRNA结合并促进翻译的启动。
通常来说，poly(A)尾的长度与转录RNA的稳定性呈正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾部的腺苷数在100到5000之间。
可以在PCR过程中使用含有poly T尾的反向引物，如100T尾(大小可以是50-5000T)，或在PCR之后使用任何其它方法，包括但不限于DNA连接或体外重组，产生poly A片段。poly(A)尾还能为RNA提供稳定性并减少其降解。RNA的poly(A)尾可以通过体外转录后使用poly(A)聚合酶(如大肠杆菌poly A聚合酶(E-PAP))进一步地或选择性地进行延伸。
此外，在3'端附接不同的化学基团可以增加mRNA的稳定性。这种附接物可以包括修饰/人工核苷酸、适配体和其它化合物。例如，可以使用poly(A)聚合酶将ATP类似物掺入到poly(A)尾中。ATP类似物可进一步提高RNA的稳定性。合适的ATP类似物包括但不限于cordiocipin和8-氮杂腺苷。
b.货物顺序
i.相关多肽
货物可编码一种或多种蛋白。货物可以是单顺反子或多顺反子的多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸是多基因的。例如，多核苷酸可以是例如mRNA或表达构建体，如载体。
货物可以编码一种或多种目的多肽。多肽可以是任何多肽。例如，多核苷酸编码的多肽可以是对生物体有治疗或预防作用的多肽，或可用于诊断生物体中疾病或病症的多肽。例如，为了治疗癌症、自身免疫性疾病、寄生虫、病毒、细菌、真菌或其它感染，要表达的多核苷酸可以编码多肽，该多肽可作为免疫系统细胞的配体或受体发挥作用，或可起到刺激或抑制生物体免疫系统的作用。
在某些实施方案中，多核苷酸可补充或取代生物体内存在缺陷的多核苷酸。
在具体实施方案中，多核苷酸编码肌营养不良蛋白(Dystrophin)、肌营养相关蛋白(Utrophin)或其组合。这种组合物可以有效量施用，以治疗肌营养不良症，尤其是治疗肌肉营养不良症的受试者，例如杜氏肌肉营养不良症的受试者。
在另一个具体实施方案中，多核苷酸编码抗原，例如可用于疫苗制剂和相关方法的抗原。在一个具体实施方案中，多核苷酸编码病毒抗原，例如，SARS-CoV-2抗原。因此，提供了用于预防和治疗SARS-CoV-2病毒及与之相关的病毒感染和疾病(包括COVID19)的组合物及其使用方法。
在某些实施方案中，多核苷酸包括选择性标记，例如，在真核细胞中有效的选择性标记，如耐药性选择标记。这种选择性标记基因可以编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或生长所必需的因子。典型的选择基因编码的蛋白可赋予细胞对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、卡那霉素、庆大霉素、博莱霉素(Zeocin)或四环素)的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或提供培养基中缺失的关键营养组分。
在下面的工作实施例12中，编码野生型Merlin(在2型神经纤维瘤病中发生突变的蛋白)的核酸(即NF2)可减少肿瘤生长。因此，在某些实施方案中，核酸编码致癌蛋白(如Merlin)的野生型或其它补偿性变体。
在某些实施方案中，多核苷酸包括报告基因。报告基因通常是宿主细胞中不存在或不表达的基因。报告基因通常编码可提供某种表型变化或酶特性的蛋白。Weising等.Ann.Rev.Genetics,22,421(1988)。优选的报告基因包括葡糖醛酸酶(GUS)基因和GFP基因。
ii.功能性核酸
货物可以是功能性核酸或编码功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，如结合靶分子或催化特定反应。如下文详述，功能性核酸分子可分为以下非限制性类别：反义分子、siRNA、miRNA、适配体、核酶、RNAi、外部引导序列和环状二核苷酸。功能性核酸分子可以作为靶分子所具有的特定活性的效应物、抑制剂、调节剂和刺激剂，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其它分子的全新活性。
功能性核酸分子可与任何大分子，如DNA、RNA、多肽或碳水化合物链相互作用。因此，功能性核酸可以与目标多肽的mRNA或基因组DNA发生作用，也可以与多肽本身发生作用。通常情况下，功能性核酸是根据靶分子与功能性核酸分子之间的序列同源性设计来与其它核酸相互作用的。在其它情况下，功能性核酸分子与靶分子之间的特异性识别并非基于功能性核酸分子与靶分子之间的序列同源性，而是基于允许发生特异性识别的三级结构的形成。
因此，组合物可以包括一种或多种旨在减少基因或其基因产物表达的功能性核酸。例如，功能性核酸或多肽可以设计为靶向并减少或抑制mRNA的表达或翻译；或减少或抑制蛋白的表达、降低蛋白活性或增加蛋白降解。在某些实施方案中，组合物包括适用于体内表达功能性核酸的载体。
(1)反义
功能性核酸可以是反义分子或编码反义分子。反义分子被设计为通过规范或非规范碱基配对与靶核酸分子相互作用。反义分子与靶分子的相互作用被设计为通过例如RNAse H介导的RNA-DNA杂交降解来促进靶分子的破坏。或者，反义分子被设计为中断靶分子上通常会发生的加工功能，如转录或复制。反义分子可以根据靶分子的序列来设计。有许多方法可以通过寻找靶分子中最易接近的区域来优化反义效率。典型的方法包括体外选择实验和使用DMS和DEPC进行DNA修饰研究。反义分子与靶分子结合的解离常数(Kd)优选小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12。
(2)RNA干扰
在某些实施方案中，功能性核酸通过RNA干扰诱导基因沉默。基因表达也可以通过RNA干扰(RNAi)以高度特异性的方式被有效沉默。这种沉默最初是通过添加双链RNA(dsRNA)被观察到的(Fire等(1998)，Nature，391:806-11；Napoli等(1990)，Plant Cell 2:279-89；Hannon等(2002)，Nature，418:244-51)。一旦dsRNA进入细胞，它就会被RNase III样酶Dicer裂解成长度为21-23个核苷酸的双链小干扰RNA(siRNA)，其3'端含有2个核苷酸的突出端(Elbashir等(2001)，Genes Dev，15:188-200；Bernstein等(2001)，Nature，409:363-6；Hammond等(2000)，Nature，404:293-6)。在依赖ATP的步骤中，siRNA被整合到多亚基蛋白复合物(通常称为RNAi诱导的沉默复合物(RISC))中，该复合物引导siRNA进入靶RNA序列(Nykanen,等.(2001)，Cell，107：309-21)。siRNA双链在某个时间点会解链，而反义链似乎仍与RISC结合，并通过内切酶和外切酶的组合引导互补mRNA序列的降解(Martinez等(2002)，Cell，110：563-74)。然而，iRNA或siRNA的作用或使用并不局限于任何类型的机制。
短干扰RNA(siRNA)是双链RNA，可诱导序列特异性转录后基因沉默，从而降低甚至抑制基因表达。在一个实例中，siRNA在siRNA和靶RNA之间的序列同一性的区域内触发同源RNA分子(如mRNA)的特异性降解。例如，WO 02/44321公开了siRNA与3'突出端碱基配对时，能对靶mRNA进行序列特异性降解，其制备这些siRNA的方法通过引用并入本文。
在哺乳动物细胞中，可以使用人工合成的短双链RNA来实现序列特异性基因沉默，这种RNA可模拟由dicer酶产生的siRNA(Elbashir等(2001)，Nature，411:494498)(Ui-Tei等(2000)，FEBS Lett 479:79-82)。siRNA可以通过化学合成或体外合成，也可以是短的双链发夹样RNA(shRNA)在细胞内加工成siRNA的结果。合成siRNA通常使用算法和传统DNA/RNA合成器进行设计。供应商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、Glen Research(Sterling,Virginia)、MWB Biotech(Esbersberg,德国)、Proligo(Boulder,Colorado)和Qiagen(Vento，荷兰)。siRNA也可以使用Ambion的siRNA构建试剂盒等试剂盒在体外合成。
从载体中生产siRNA更常见的方法是通过短发夹RNAse(shRNA)转录完成的。生产具有shRNA载体的试剂盒有售，例如Imgenex的GENESUPPRESSORTM构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM诱导型RNAi质粒和慢病毒载体。
在某些实施方案中，功能性核酸是siRNA、shRNA、miRNA。在某些实施方案中，组合物包括表达功能性核酸的载体。
(3)适配体
功能性核酸可以是适配体或编码适配体。适配体是与靶分子相互作用的分子，优选以特定的方式相互作用。通常，适配体是长度为15-50个碱基的小核酸，可折叠成确定的二级和三级结构，如茎环或G-四联体。适配体可以与ATP和茶碱等小分子以及逆转录酶和凝血酶等大分子结合。适配体可以与Kd小于10-12M的靶分子非常紧密地结合。优选适配体与Kd小于10-6、10-8、10-10或10-12的靶分子结合。适配体能以极高的特异性结合靶分子。例如，已经分离出的适配体，其与靶分子和仅在一个位置不同的另一分子之间的结合亲和力相差超过10,000倍。优选的是，适配体与靶分子的解离常数(Kd)至少比与背景结合分子的Kd低10、100、1000、10,000或100,000倍。在对多肽等分子进行比较时，背景分子优选不同的多肽。
(4)核糖酶
功能性核酸可以是核酶或编码核酶。核糖酶是能够催化分子内或分子间化学反应的核酸分子。优选核糖酶能催化分子间反应。有许多不同类型的核糖酶可以催化核酸酶或核酸聚合酶类型的反应，这些核糖酶都是基于自然系统中发现的核糖酶，例如锤头核糖酶。还有一些核糖酶并不存在于天然系统中，而是经过工程改造后用于从头催化特定的反应。优选的核糖酶能切割RNA或DNA底物，更优选切割RNA底物。核糖酶通常通过识别和结合目标底物并随后切割来进行切割核酸底物。这种识别通常主要基于规范或非规范碱基对相互作用。由于目标底物的识别是基于目标底物的序列，因此这一特性使核糖酶成为核酸靶向特异性切割的最佳候选物。
(5)外部引导序列
功能性核酸可以是外部引导序列或编码外部引导序列。外部引导序列(EGS)是与靶核酸分子结合形成复合物的分子，RNase P能识别复合物，然后切割靶分子。EGS可以设计成专门针对所选择的RNA分子。RNAse P可帮助加工细胞内的转运核糖核酸(tRNA)。细菌RNAse P可以通过使用EGS被募集来切割几乎任何RNA序列，EGS可使目标RNA:EGS复合物模拟天然tRNA底物。同样，真核EGS/RNAse P引导的RNA切割也可用于切割真核细胞内的所需靶标。如何制造和使用EGS分子来促进各种不同靶分子的切割，其代表性的实例已为本领域所熟知。
制作和使用用于在体内表达功能性核酸(如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、miRNA、EGSs、核酶和适配体)的载体的方法是本领域已知的。
(6)环二核苷酸
在某些实施方案中，4H2抗体与免疫刺激性寡核苷酸组合共同施用。免疫刺激寡核苷酸可以是货物，因此可以与抗体复合施用，也可以单独施用。在某些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸是环状二核苷酸。
功能性核酸可以是环状二核苷酸或编码环状二核苷酸。环状二核苷酸直接与STING适配器蛋白结合，从而产生IFN-β(Zhang等，Mol Cell.，51(2):226-35(2013)。doi:10.1016/j.molcel.2013.05.022.)。本领域已知几种典型和非典型二核苷酸，包括但不限于GMP-AMP(cGAS)、2'3'-cGAMP、2'3'-cGAMP、3'3'-cGAMP、c-di-GMP、2'2'-cGAMP、2'3'-cGAM(PS)2(Rp/Sp)、氟化3'3'-cGAMP、氟化c-di-GMP、或2'3'-c-di-GMP,c-di-AMP,c-di-GMP,cAIMP(CL592),cAIMP二氟化物(CL614),cAIM(PS)2二氟化物(Rp/Sp)(CL656),氟化c-di-AMP、2'3'-c-di-AMP、2'3'-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)、2'3'-c-di-AM(PS)2(Rp,Rp)、氟化c-di-GMP、2'3'-c-di-GMP、c-di-IMP和DMXAA。
(7)免疫刺激性寡核苷酸
在某些实施方案中，免疫刺激性寡核苷酸是寡核苷酸配体或编码寡核苷酸配体。实例包括但不限于模式识别受体(PRR)配体。
模式识别受体的实例包括在先天性免疫应答的启动中发挥作用的Toll样家族信号分子，同时也影响后来的和更具抗原特异性的适应性免疫应答。因此，寡核苷酸可作为Toll样家族信号分子(如Toll样受体9(TLR9))的配体。例如，人类浆细胞样树突状细胞和B细胞上的TLR9可检测到未甲基化的CpG位点(Zaida等，Infection and Immunity，76(5)：2123-2129，(2008))。因此，寡核苷酸序列可包括一个或多个未甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤(CG或CpG，可互换使用)二核苷酸基序。“p”指的是DNA的磷酸二酯骨架，然而，在某些实施方案中，包括CG的寡核苷酸可以具有修饰的骨架，例如硫代磷酸酯(PS)骨架。
在某些实施方案中，寡核苷酸可以包括一个以上的CG二核苷酸，这些二核苷酸可以连续排列，也可以被中间的核苷酸隔开。CpG基序可以位于寡核苷酸序列的内部。许多核苷酸序列都能刺激TLR9，但CG二核苷酸的数量和位置以及CG二核苷酸侧翼的精确碱基序列都有不同。许多核苷酸序列能够通过CG二核苷酸的数量和位置的变化，以及CG二核苷酸侧翼的精确碱基序列的变化来刺激TLR9。
通常，CG ODN根据其序列、二级结构和对人类外周血单核细胞(PBMC)的影响进行分类。这五类分别是A类(D型)、B类(K型)、C类、P类和S类(Vollmer,J&Krieg,AM,AdvancedDrug Delivery Reviews 61(3)：195-204(2009)，以引用方式并入本文)。CG ODN可刺激I型干扰素(如IFNα)的产生，并诱导树突状细胞(DC)成熟。某些种类的ODN也是通过间接细胞因子信号传导的自然杀伤(NK)细胞的强激活剂。有些种类ODN还是人类B细胞和单核细胞成熟的强刺激剂(Weiner,GL,PNAS USA 94(20):10833-7(1997)；Dalpke,AH,Immunology 106(1)：102-12(2002)；Hartmann，G，J of Immun.164(3):1617-2(2000)，其中每个均通过引用纳入本文。
其它PRR Toll样受体包括可分别识别双链RNA、单链RNA和短双链RNA的TLR3和TLR7，以及视黄酸诱导基因I(RIG-I)样受体，即RIG-I和黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)，它们是已知的细胞质中的RNA感应受体。
RIG-I(视黄酸诱导蛋白1，又称Ddx58)和MDA-5(黑色素瘤分化相关基因5，又称Ifih1或Helicard)是细胞质RNA解旋酶，属于RIG-I样受体(RLR)家族，对宿主的抗病毒反应至关重要。
RIG-I和MDA-5感应RNA病毒的复制中间体双链RNA(dsRNA)，并通过线粒体抗病毒信号蛋白MAVS(又称IPS-1、VISA或Cardif)发出信号，从而产生I型干扰素(IFN-α和IFN-β)。
RIG-I检测的病毒RNA具有未加帽的5'-二磷酸或三磷酸末端和短的钝端双链，这两个基本特征有助于其与自身RNA的区分。MDA-5生理配体的特征尚未完全明确。然而，RIG-I和MDA-5对双链RNA(dsRNA)的长度表现出不同的依赖性：RIG-I选择性地结合短dsRNA，而MDA-5则选择性地结合长dsRNA。与此相符的是，RIG-I和MDA-5与合成的dsRNA类似物Poly(I:C)的结合具有不同的长度偏好。
在某些情况下，RIG-I还能间接感知dsDNA。病毒dsDNA可被RNA聚合酶III转录成具有5'-三磷酸基团的dsRNA。因此，B型DNA的合成类似物Poly(dA:dT)构成了另一种RIG-I配体。
示例性RIG-I配体包括但不限于5'ppp-dsRNA、RIG-I的特异性激动剂；3p-hpRNA、RIG-I的特异性激动剂；根据poly(I:C)的大小被RIG-I和/或MDA-5识别的Poly(I:C)/LyoVec复合物；RIG-I间接识别的Poly(dA:dT)/LyoVec复合物。
在某些实施方案中，寡核苷酸含有TLR3、TLR7、TLR8、TLR9或RIG-I样受体或其组合的功能性配体。
免疫刺激性寡核苷酸及其制造方法的实例在本领域是已知的，并可通过商业途径获得，例如，参见Bodera,P.Recent Pat Inflamm Allergy Drug Discov.5(1):87-93(2011),incorporat通过引用并入本文。
C.货物的成分
所公开的核酸货物可以是DNA或RNA核苷酸或包括DNA或RNA核苷酸，它们通常包括杂环碱基(核酸碱基)、连接到杂环碱基上的糖基和使糖基的羟基功能酯化的磷酸基。主要的天然核苷酸包括作为杂环碱基的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤，以及通过磷酸二酯键连接的核糖或脱氧核糖。
在某些实施方案中，货物包括或由经过化学修饰的核苷酸类似物组成，相对于DNA或RNA对应物，这些核苷酸类似物可提高稳定性、半衰期或对靶受体的特异性或亲和性。化学修饰包括核碱基、糖分子、核苷酸连接或其组合的化学修饰。本文所用的“修饰核苷酸”或“化学修饰核苷酸”是指对杂环碱基、糖基或磷酸基中的一个或多个成分进行化学修饰的核苷酸。在某些实施方案中，与相同核碱基序列的DNA或RNA相比，修饰核苷酸的电荷减少。例如，寡核苷酸可以带低负电荷、无电荷或正电荷。
通常，核苷类似物支持能够通过沃森-克里克碱基配对与标准多核苷酸碱基形成氢键结合的碱基，其中类似物骨架呈现碱基的方式允许寡核苷酸类似物分子与标准多核苷酸(如单链RNA或单链DNA)中的碱基以序列特异性的方式发生氢键结合。在某些实施方案中，类似物具有基本上不带电荷的含磷骨架。
i.杂环碱基
天然存在的主要核苷酸包括尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤等杂环碱基。货物可包括其核碱基成分的化学修饰。杂环碱基或杂环碱基类似物的化学修饰可有效提高与靶序列结合的亲和力或稳定性。化学修饰的杂环碱基包括但不限于肌苷、5-(1-丙炔基)尿嘧啶(pU)、5-(1-丙炔基)胞嘧啶(pC)、5-甲基胞嘧啶、8-氧代腺嘌呤、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5和2-氨基-5-(2'-脱氧-.β.-D-呋喃核糖基)吡啶(2-氨基吡啶)，以及各种吡咯并嘧啶和吡唑并嘧啶衍生物。
ii.糖类修饰
货物分子中还可包括带有修饰糖基或糖基类似物的核苷酸。糖基修饰包括但不限于2'-O-氨基乙氧基、2'-O-氨基乙基(2'-OAE)、2'-O-甲氧基、2'-O-甲基、2-胍基乙基(2'-OGE)、2'-O,4'-C-亚甲基(LNA)、2'-O-(甲氧基乙基)(2'-OME)和2'-O-(N-(甲基)乙酰氨基)(2'-OMA)。2'-O-氨基乙基糖取代物是特别优选，因为它们在中性pH下会质子化，从而抑制了TFO与目标双链体之间的电荷排斥。这种修饰能稳定核糖或脱氧核糖的C3'-内构象，还能与双链嘌呤链中的i-1磷酸形成桥连结构。
在某些实施方案中，核酸是吗啉代寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸通常由两个以上含有嘌呤或嘧啶碱基配对部分的吗啉单体组成，可通过碱基特异性氢键与多核苷酸中的碱基结合。嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶。吗啉代低聚物的合成、结构和结合特性详见美国专利5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063和5,506,337。
基于吗啉代的亚基的重要特性通常包括：能够通过稳定、不带电荷的骨架连接以低聚物形式连接；能够支持核苷酸碱基(如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、尿嘧啶或肌苷)，从而使形成的聚合物能与具有高TM的互补碱基的靶核酸(包括靶RNA)杂交，甚至与短至10-14个碱基的寡聚体杂交；寡聚体能被主动转运到哺乳动物细胞中；以及寡聚体：RNA异源双链体抵抗RNAse降解的能力。
在某些实施方案中，如上所述，寡核苷酸采用了含有碱基配对部分的吗啉代基亚单位，并由不带电荷的连接臂连接。例如，吗啉寡核苷酸可以是磷酸二酰胺吗啉寡聚体。
iii.核苷酸内连接
寡核苷酸通过核苷酸间键连接，核苷酸间键是指两个核苷单元之间的化学连接。对DNA或RNA寡核苷酸的磷酸骨架进行修饰可提高寡核苷酸的结合亲和力或稳定性，或降低寡核苷酸被核酸酶消化的敏感性。阳离子修饰，包括但不限于二乙基乙二胺(DEED)或二甲基氨基丙胺(DMAP)，由于能降低寡核苷酸与靶标之间的静电排斥，可能特别有用。对磷酸骨架的修饰还包括用硫原子取代磷酸二酯键中的一个非桥接氧原子。这种取代会产生取代磷酸二酯键的硫代磷酸核苷间键。事实证明，含有硫代磷酸核苷间键的寡核苷酸在体内更稳定。
电荷减少的修饰核苷酸的实例包括修饰的核苷酸间键联，如具有非手性和不带电荷的亚基间键联的磷酸类似物(如Sterchak,E.P.等，Organic.Chem.，52:4202,(1987))，以及具有非手性亚基间连接的不带电的吗啉代聚合物(如上文所述，参见例如美国专利5,034,506)。一些核苷间连接类似物包括吗啉代、缩醛和聚酰胺连接杂环。
在另一个实施方案中，货物由锁定核酸组成。锁定核酸(LNA)是修饰的RNA核苷酸(例如，见Braasch等，Chem.Biol.，8(1):1-7(2001))。LNA与DNA形成的杂交体比DNA/DNA杂交体更稳定，这一特性类似于肽核酸(PNA)/DNA杂交体。因此，LNA可以像PNA分子一样使用。在某些实施方案中，可以通过添加正电荷来提高LNA的结合效率。商用核酸合成仪和标准亚磷酰胺化学方法可用于制造LNA。
在某些实施方案中，货物由肽核酸组成。肽核酸(PNA)是人工合成的DNA模拟物，其中寡核苷酸的磷酸骨架被重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元全部取代，磷酸二酯键通常被肽键取代。各种杂环碱基通过亚甲基羰基键与骨架相连。肽核酸(PNA)保持与传统DNA寡核苷酸相似的杂环碱基间距，但属于非手性和带中性电荷的分子。肽核酸由肽核酸单体组成。
其它骨架修饰包括肽和氨基酸的变化和修饰。因此，PNA等寡核苷酸的骨架成分可以是肽链，也可以是非肽的肽链。实例包括乙酰帽、氨基间隔物(如8-氨基-3,6-二氧杂辛酸)(此处称为O-连接臂)、氨基酸(如赖氨酸)(如果希望PNA带有正电荷则尤其有用)等。PNA的化学组装方法是众所周知的。例如，参见美国专利5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,736,336、5,773,571和5,786,571。
可选地，货物包括一个或多个末端残基，或在一个或两个末端进行修饰，以增加稳定性和/或寡核苷酸对其目标的亲和力。常用的带正电荷的基团包括氨基酸如赖氨酸和精氨酸，但其它带正电荷的基团也可能有用。还可进一步对货物进行修饰，使用丙胺基团进行末端封端以防止降解。寡核苷酸的3'或5'封端程序在本领域是众所周知的。
在某些实施方案中，核酸可以是单链或双链。
iv.微调结合
可以根据这些特性修饰货物的序列，并微调货物与4H2结合蛋白之间的结合强度。
4H2抗体与鸟苷结合，因此可增加鸟嘌呤的数量和/或选择鸟嘌呤在多核苷酸序列中的位置，以增加抗体的结合力，产生抗体结合位点，增加与单个多核苷酸结合的抗体数量，和/或将抗体靶向结合到多核苷酸的特定位置。另外或可选地，减少多核苷酸中鸟嘌呤的数量和/或选择多核苷酸序列中鸟嘌呤缺失的位置，也可用于增加抗体的结合、减少或移除抗体的结合位点、减少与单个多核苷酸结合的抗体数量和/或将抗体靶向结合到多核苷酸的替代位置。
例如，所公开的任何货物都可以包括或由鸟嘌呤(G)(如单G、双G或多G)单独或与2、3、4或更多腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或肌苷(I)组合而成。在某些实施方案中，将合成的非编码序列添加到货物中，以增加或减少与4H2结合蛋白的结合。这种序列可以是，但不一定是，在核酸货物的5'或3'端。货物可以是单链或双链DNA或RNA。
此外或可选地，这些结合特性在合理设计货物的核酸序列的过程中，还可以利用密码子优化来增加结合偏好(如偏好鸟嘌呤)或减少结合偏好(如偏好腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)或肌苷(I))。
2.疫苗制剂
疫苗需要强大的免疫应答。本文所述的4H2抗体可作为疫苗的成分施用，以增强与之相关的免疫应答。在某些实施方案中，本文公开的疫苗包括4H2抗体、抗原和可选地其它附加药剂的佐剂。
a.抗原
抗原可以是肽、蛋白、多糖、糖类、脂类、核酸或其组合。抗原可以源自癌细胞或白血病细胞等转化细胞，也可以是整个细胞或其免疫原性成分。合适的抗原是本领域已知的，可从商业政府和科学来源获得。
抗原可以是源自肿瘤的纯化或部分纯化的多肽，也可以是通过在异源表达系统中表达编码多肽抗原的DNA而产生的重组多肽。抗原可以是编码全部或部分抗原蛋白的DNA或RNA(如mRNA)。DNA可以是载体DNA的形式，如病毒载体或质粒DNA。
抗原可以单独提供，也可以组合形式提供。此外，抗原还可以以多肽或核酸的复合混合物形式提供。
例如，抗原可以例如是肿瘤抗原，也可以源自需要接种疫苗的传染病病原体或疾病，如脊髓灰质炎、破伤风、流感(流行性感冒)、乙型肝炎、甲型肝炎、丙型肝炎、风疹、Hib、麻疹、百日咳(pertussis)、肺炎球菌疾病、HIV、SAR-CoV-2或下文详细讨论的任何其它感染和疾病。
i.病毒抗原
病毒抗原可从任何病毒中分离出来，包括但不限于以下任何病毒科的病毒：沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)、星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、巴德纳病毒属(Badnavirus)、仓鼠病毒科(Barnaviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、芽抱杆菌病毒科(Bromoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、毛状病毒属(Capillovirus)、卡拉病毒属(Carlavirus)、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、圆环病毒科(Circoviridae)、棒状病毒属(Closterovirus)、芽胞杆菌病毒科(Comoviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(如，冠状病毒科(如严重急性呼吸系统综合症(SARS)病毒)、背膜病毒科(Corticoviridae)、囊状病毒科(Cystoviridae)、德尔塔病毒科(Deltavirus)、石竹病毒属(Dianthovirus)、耳突花叶病毒属(Enamovirus)、丝状病毒科(Filoviridae)(如，马尔堡病毒和埃博拉病毒毒株(如扎伊尔型、雷斯顿型、科特迪瓦型或苏丹型))、黄病毒科(Flaviviridae)，(例如，丙型肝炎病毒、登革热病毒1型、登革热病毒2型、登革热病毒3型和登革热病毒4型)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(如人类疱疹病毒1型、3型、4型、5型和6型，以及巨细胞病毒)、低病毒科(Hypoviridae)、虹彩病毒科(Hypoviridae)、利维病毒科(Leviviridae)、脂毛病毒科(Lipothrixviridae)、微小病毒科(Microviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(如流感病毒A型、B型和C型)、乳头瘤病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(如麻疹病毒、腮腺炎病毒和人呼吸道合胞病毒)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)(如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、肝病毒和口蹄疫病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(如痘苗病毒和天花病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(如轮状病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(如慢病毒，如人类免疫缺陷病毒(HIV)1和HIV 2)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(如狂犬病病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、披膜病毒科(Togaviridae)(如风疹病毒、登革热病毒等)和全病毒科(Totiviridae)。合适的病毒抗原还包括登革热蛋白M、登革热蛋白E、登革热D1NS1、登革热D1NS2和登革热D1NS3的全部或部分。
病毒抗原可源自特定的病毒株或病毒株的组合，如SAR-CoV-2、乳头状瘤病毒(papilloma virus)、疱疹病毒(herpes virus)(即单纯疱疹1型和2型)；肝炎病毒，如甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)和庚型肝炎病毒(HGV)、蜱传脑炎病毒；副流感病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒(Epstein-Barr病毒)、轮状病毒、鼻病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、马脑炎、日本脑炎病毒、黄热病病毒、裂谷热病毒和淋巴脉络膜丛脑膜炎病毒。
ii.细菌抗原
细菌抗原可来源于任何细菌，包括但不限于放线菌(Actinomyces)、念珠藻(Anabaena)、芽孢杆菌(Bacillus)、拟杆菌(Bacteroides)、蛭弧菌(Bdellovibrio)、百日咳鲍特菌(Bordetella)、伯氏疏螺旋体(Borrelia)、弯曲杆菌(Campylobacter)、柄杆菌(Caulobacter)、衣原体(Chlamydia)、绿菌(Chlorobium)、着色菌(Chromatium)、梭菌(Clostridium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、噬细胞菌(Cytophaga)、异常球菌(Deinococcus)、大肠杆菌(Escherichia)、土拉弗朗西斯菌(Francisella)、盐杆菌(Halobacterium)、日形杆菌(Heliobacter)、流感嗜血杆菌(Haemophilus)、b型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza type B，HIB)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、嗜肺军团菌(Legionella)、钩端螺旋体(Leptospira)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria)、脑膜炎奈瑟菌A、B和C型(Meningococcus A,B and C)、甲烷杆菌(Methanobacterium)、微球菌(Micrococcus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、支原体(Mycoplasma)、粘细菌(Myxococcus)、奈瑟氏菌(Neisseria)、硝化杆菌(Nitrobacter)、颤藻(Oscillatoria)、原绿菌(Prochloron)、变形杆菌(Proteus)、假单胞菌(Pseudomonas)、光合细菌(Phodospirillum)、立克次体(Rickettsia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、螺旋体(Spirillum)、螺旋体(Spir℃haeta)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、硫化叶菌(Sulfolobus)、热原质体(Thermoplasma)、硫杆菌(Thiobacillus)、梅毒螺旋体(Treponema)、霍乱弧菌(Vibrio)、耶尔森氏菌(Yersinia)。
iii.寄生虫抗原
寄生虫的抗原可以从寄生虫获得，例如但不限于来源于新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、星形诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、立克次体(Rickettsia rickettsii)、伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydial psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydial trachomatis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)。这些抗原包括孢子虫抗原、疟原虫抗原，例如环子孢子蛋白、子孢子表面蛋白、肝期抗原、顶膜相关蛋白或裂殖子表面蛋白的全部或部分。
iv.肿瘤抗原
抗原可以是肿瘤抗原，包括肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原，如，但不限于α-肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-1、2和3、neo-PAP、肌球蛋白I类、OS-9、pml-RARα融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、Bage-1、Gage 3、4、5、6、7、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-A1,2,3,4,6,10,12、Mage-C2、NA-88、NY-Eso-1/Lage-2、SP17、SSX-2和TRP2-Int2、MelanA(MART-I)、gp100(Pmel17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15(58)、CEA、RAGE、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、PRAME、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、Epstein Barr病毒抗原、EBNA、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、b-Catenin、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-甲胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环蛋白C关联蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。肿瘤抗原，如卡介苗(BCG)，也可作为免疫增强剂用于佐剂。
b.佐剂
可选地，本文所述的疫苗可以包括佐剂。佐剂可以是但不限于以下一种或多种：油乳液(如弗罗因德佐剂)、皂素制剂、病毒体和病毒样颗粒、细菌和微生物衍生物、免疫刺激性寡核苷酸、ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物、明矾、卡介苗(BCG)、含矿物成分(如矿物盐，如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)、矿物盐，如铝盐和钙盐、氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等)、生物粘合剂和/或粘液粘合剂、微粒、脂质体、聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂、聚磷腈、胞壁酰肽、咪唑喹啉酮化合物、以及表面活性组分(如溶血卵磷脂、泊洛沙姆多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、匙孔帽贝血蓝蛋白和二硝基苯酚)。
佐剂还可包括免疫调节剂，如细胞因子、白细胞介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。除PD-1拮抗剂外，还可施用其它共刺激分子，包括B7家族的其它多肽。此类蛋白佐剂可以以全长多肽或其活性片段的形式提供，也可以以RNA或DNA(如质粒DNA)的形式提供。
3.免疫检查点调节剂
4H2抗体可与免疫检查点调节剂联合使用。
免疫检查点可以是刺激性的，也可以是抑制性的，肿瘤可以利用这些检查点来保护自己免受免疫系统的攻击。目前获批的检查点疗法可阻断抑制性检查点受体，但激活刺激性检查点的疗法研究也在进行之中。因此，免疫检查点调节剂可以是阻断抑制性检查点的调节剂，也可以是激活刺激性检查点的调节剂。通常，免疫检查点调节剂是可以诱导或以其它方式激活或增加针对靶细胞(例如癌细胞或受感染细胞)的免疫应答的调节剂。因此，在某些实施方案中，免疫检查点调节剂可以是嵌合抗原受体(CAR)导向的细胞，如CAR-T细胞。在另一个实施方案中，免疫检查点调节剂可以是溶瘤病毒。
在优选的实施方案中，免疫检查点调节剂可阻断抑制性检查点。因此，阻断对免疫细胞的负反馈信号传导可增强对肿瘤的免疫应答。因此，在某些实施方案中，向受试者施用有效量的免疫检查点调节剂以阻断抑制性检查点。示例性化合物是阻断或以其它方式抑制例如PD-1、PD-L1或CTLA4的化合物。
a.PD-1拮抗剂
在某些实施方案中，活性剂是PD-1拮抗剂。T细胞的活化通常取决于T细胞受体(TCR)与通过主要组织相容性复合体(MHC)呈递的抗原肽接触后的抗原特异性信号，而这种反应的程度则由各种辅助刺激分子发出的抗原非依赖性正负信号控制。后者通常是CD28/B7家族的成员。相反，程序性死亡-1(PD-1)是CD28受体家族的成员，在T细胞上被诱导时会产生负向免疫应答。PD-1与其配体之一(B7-H1或B7-DC)接触会诱导抑制性反应，从而降低T细胞的增殖和/或T细胞反应的强度和/或持续时间。合适的PD-1拮抗剂在美国专利8,114,845、8,609,089和8,709,416中均有描述，包括结合并阻断PD-1配体以干扰或抑制配体与PD-1受体结合的化合物或药剂，或直接结合并阻断PD-1受体而不通过PD-1受体诱导抑制性信号转导的化合物或药剂。
在某些实施方案中，PD-1受体拮抗剂直接与PD-1受体结合而不触发抑制性信号转导，同时也与PD-1受体的配体结合，以减少或抑制配体触发通过PD-1受体的信号转导。通过减少与PD-1受体结合并触发抑制信号转导的配体的数量和/或量，被PD-1信号传导传递的负信号衰减的细胞会更少，从而可以实现更强大的免疫应答。
目前认为，PD-1信号是通过与PD-1配体(如B7-H1或B7-DC)结合，并与主要组织相容性复合体(MHC)呈递的肽抗原紧密相邻而驱动的(例如，见Freeman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，105:10275-10276(2008))。因此，能阻止PD-1和TCR在T细胞膜上共结合的蛋白、抗体或小分子也是有用的PD-1拮抗剂。
在优选的实施方案中，PD-1受体拮抗剂是小分子拮抗剂或抗体，它们通过与PD-1的配体或PD-1本身结合，减少或干扰PD-1受体的信号转导，尤其是在PD-1与TCR的共结合不遵循这样结合的情况下，从而不触发通过PD-1受体的抑制性信号转导。其它PD-1拮抗剂包括与PD-1或PD-1的配体如PD-L1(又称B7-H1)和PD-L2(又称B7-DC)结合的抗体，以及其它抗体。
合适的抗PD-1抗体包括但不限于以下文献中描述的抗体：
PCT/IL03/00425(Hardy等，WO/2003/099196)
PCT/JP2006/309606(Korman等，WO/2006/121168)
PCT/US2008/008925(Li等，WO/2009/014708)
PCT/JP03/08420(Honjo等，WO/2004/004771)
PCT/JP04/00549(Honjo等，WO/2004/072286)
PCT/IB2003/006304(Collins等，WO/2004/056875)
PCT/US2007/088851(Ahmed等，WO/2008/083174)
PCT/US2006/026046(Korman等，WO/2007/005874)
PCT/US2008/084923(Terrett等.,WO/2009/073533)
Berger等，Clin.Cancer Res.，14:30443051(2008)。
抗PD-1抗体的具体实例是MDX-1106(参见Kosak，US20070166281(2007年7月19日公开)，第42段)，这是人抗PD-1抗体，优选以3mg/kg的剂量施用。
示例性的抗B7-H1抗体包括但不限于以下文献中描述的抗体：
PCT/US06/022423(WO/2006/133396，2006年12月14日公开)
PCT/US07/088851(WO/2008/083174,2008年7月10日公开)
US2006/0110383(2006年5月25日公开)
抗B7-H1抗体的具体实例是MDX-1105(WO/2007/005874，2007年1月11日公开)，这是人抗B7-H1抗体。
关于抗B7-DC抗体，请参见7,411,051、7,052,694、7,390,888和美国已公开申请2006/0099203。
抗体可以是双特异性抗体，包括与PD-1受体结合的抗体，该受体与PD-1配体(如B7-H1)结合的抗体桥接。在某些实施方案中，PD-1结合部分可减少或抑制通过PD-1受体的信号转导。
其它示例性的PD-1受体拮抗剂包括但不限于B7-DC多肽，包括这些多肽的同源物和其变体，以及上述任何多肽的活性片段，以及掺入上述任何这些多肽的融合蛋白。在优选的实施方案中，融合蛋白包括与抗体(如人IgG)的Fc部分偶联的B7-DC的可溶性部分，并且不包含人B7-DC跨膜区的全部或部分。
PD-1拮抗剂也可以是哺乳动物B7-H1的片段，优选源自小鼠或灵长类动物，优选人类，其中该片段与PD-1结合并阻断PD-1，但不会导致通过PD-1的抑制性信号转导。片段也可以是融合蛋白的一部分，例如Ig融合蛋白。
其它有用的多肽PD-1拮抗剂包括与PD-1受体的配体结合的多肽。这些多肽包括PD-1受体蛋白或其可溶性片段，它们能与PD-1配体(如B7-H1或B7-DC)结合，阻止与内源性PD-1受体结合，从而阻止抑制性信号转导。B7-H1还能与蛋白B7.1结合(Butte等，Immunity，第27卷，第111-122页，(2007))。这些片段还包括PD-1蛋白的可溶性ECD部分，该部分包括突变，如A99L突变，可增加与天然配体的结合(Molnar等，PNAS，105:10483-10488(2008))。能与B7-H1配体结合并阻止与内源性PD-1受体结合，从而阻止抑制性信号转导的B7-1或其可溶性片段也是有用的。
PD-1和B7-H1反义核酸(DNA和RNA)以及siRNA分子也可以是PD-1拮抗剂。这种反义分子可阻止T细胞上PD-1的表达以及T细胞配体(如B7-H1、PD-L1和/或PD-L2)的产生。例如，siRNA(例如，长度约21个核苷酸，其对编码PD-1或编码PD-1配体的基因是特异性的，并且该寡核苷酸能容易地商购)与载体如聚乙烯亚胺复合(参见Cubillos-Ruiz等，J.Clin.Invest.119(8):2231-2244(2009))，很容易被表达PD-1和PD-1配体的细胞摄取，并减少这些受体和配体的表达，从而减少T细胞中的抑制信号转导，从而激活T细胞。
示例性PD-1抑制剂包括但不限于
-Pembrolizumab(原名MK-3475或lambrolizumab，Keytruda)由默克公司开发，2014年首次获得美国食品药品管理局批准用于治疗黑色素瘤。
-Nivolumab(Opdivo)由百时美施贵宝公司开发，2014年首次获得美国食品药品管理局批准用于治疗黑色素瘤。
-pidilizumab，由CureTech公司开发
-葛兰素史克和MedImmune公司开发的AMP-224
-葛兰素史克和MedImmune公司开发的AMP-514
-诺华公司开发的PDR001
-Regeneron和赛诺菲公司开发的cemiplimab
示例性PD-L1抑制剂包括但不限于
-Atezolizumab(Tecentriq)是罗氏基因泰克公司开发的全人源化IgG1(免疫球蛋白1抗体)。2016年，FDA批准将atezolizumab用于治疗尿路上皮癌和非小细胞肺癌。
-Avelumab(Bavencio)是默克雪兰诺和辉瑞公司开发的全人IgG1抗体。Avelumab已获FDA批准用于治疗转移性默克尔细胞癌。该药治疗胃癌的III期临床试验失败。
-Durvalumab(Imfinzi)是阿斯利康公司开发的全人源IgG1抗体。Durvalumab已获得FDA批准，用于治疗尿路上皮癌和化疗后不可切除的非小细胞肺癌。
-百时美施贵宝公司开发的BMS-936559
-Checkpoint Therapeutics公司开发的CK-301
参见，例如，Iwai等，Journal of Biomedical Science，(2017)24:26，DOI10.1186/s12929-017-0329-9。
b.CTLA4拮抗剂
其它有助于介导免疫应答中T细胞效应的分子也可考虑作为活性剂。例如，在某些实施方案中，分子是与非PD-1的免疫应答介导分子结合的制剂。在优选的实施方案中，分子是CTLA4的拮抗剂，例如拮抗性抗CTLA4的抗体。PCT/US2006/043690(Fischkoff等.,WO/2007/056539)中描述了抗CTLA4抗体的实例。
抗-PD-1、抗-B7-H1和抗-CTLA4抗体的剂量在本领域是已知的，可在0.1至100mg/kg的范围内，优选为1至50mg/kg较窄的范围，更优选为10至20mg/kg的范围。对人类受试者而言，合适的剂量为5至15mg/kg，最优选10mg/kg的抗体(例如，人抗PD-1抗体，如MDX-1106)。
CTLA拮抗剂的具体实例包括伊匹单抗(Ipilimumab)，又称MDX-010或MDX-101，人抗CTLA4抗体，优选施用剂量约为10mg/kg，以及特瑞莫单抗(Tremelimumab)，人抗CTLA4抗体，优选施用剂量约为15mg/kg。另见Sammartino等，Clinical Kidney Journal，3(2):135-137(2010)，2009年12月在线发表。
在其它实施方案中，拮抗剂是小分子。一系列小型有机化合物已被证明能与B7-1配体结合，阻止与CTLA4结合(见Erbe等，J.Biol.Chem.，277:7363-7368(2002)。这种小分子有机物可以单独施用，也可以与抗CTLA4抗体一起施用，以减少对T细胞的抑制性信号转导。
c.嵌合抗原受体导向细胞
调节剂可以是嵌合抗原受体导向细胞。本文所用术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常是两种，当其在免疫效应细胞中时，为细胞提供对癌症细胞的特异性，并产生细胞内信号。在某些实施方案中，CAR至少包括抗原结合结构域，如胞外结合结构域、跨膜结构域和胞质信号结构域(也称为“胞内信号结构域”)，其中包括源自如下定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能信号结构域。在一个实施方案中，刺激分子是与T细胞受体复合物相关的zeta链(ζ链)(“zeta刺激结构域”)。在一个实施方案中，细胞质信号传导结构域还包括一个或多个源自至少一种共刺激分子(例如，4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28)的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，其中胞内信号结构域包括源自刺激分子的功能信号结构域。在各种实施方案中，CAR是与CD3-zeta跨膜结构域融合的单链可变片段(scFv)的融合蛋白。然而，其它细胞内信号结构域，如CD28、41-BB和Ox40也可以以各种组合使用，以提供所需的细胞内信号。在某些实施方案中，本文公开的CAR包括胞外结合结构域。
本文所用术语“抗原结合结构域”在本公开内容中指的是CAR中特异性识别和结合目标抗原的部分。抗原结合结合结构域"可来源于本文公开的结合蛋白，如抗体或其片段。在某些实施方案中，“结合结构域”是单链可变片段(scFv)。在某些实施方案中，“结合结构域”包括本文公开的结合蛋白的互补性决定区。在该实施方案中，CAR导向细胞可代表诱导cGAS/STING信号转导的4H2细胞穿透性抗体(假设它穿透癌细胞)或其组合与诱导、增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂的组合。例如，结合结构域可以代表细胞穿透性抗体，修饰的T细胞可以代表免疫细胞调节剂。在另一个实例中，本文公开的CAR导向细胞与本文公开的细胞穿透性4H2抗体一起施用。
本文所用术语“zeta”或“CD3-zeta”在本文中用于定义GenBan Acc.BAG36664.1提供的蛋白质，或源自非人类物种的等效残基，“zeta刺激结构域”或可替代地“CD3-zeta刺激结构域”被定义为zeta链胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所需的初始信号。
本文所用术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答(如促进免疫效应反应)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞，例如α/βT细胞和γ/δT细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓系来源的吞噬细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是异源的。在某些实施方案中，免疫效应细胞是自体的。在一些实施方案中，免疫检查点调节剂是CAR导向T细胞(CAR-T细胞)。示例性CAR-T细胞包括Axicabtagene ciloleucel(KTE-C19，Axi-cel)、Tisagenlecleucel、Lisocabtagene Maraleucel(liso-cel；JCAR017)。
免疫效应细胞，如T细胞，通常可采用以前描述过的方法进行活化和扩增，例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041中所述的。举例来说，免疫效应细胞群(例如，T调节细胞耗竭细胞)可以通过与表面接触而得到扩增，该表面附着有刺激CD3复合物相关信号的制剂和刺激T细胞表面共刺激分子的配体。
d.溶瘤病毒
调节剂可以是溶瘤病毒。在本公开内容中，术语“溶瘤病毒”是指能够感染癌细胞并减少其生长的病毒。例如，溶瘤病毒可以抑制细胞增殖。在某些实施方案中，溶瘤病毒可以杀死癌细胞。在某些实施方案中，与相应的正常细胞相比，溶瘤病毒优先感染癌细胞并抑制其生长。在另一个实施方案中，与相应的正常细胞相比，溶瘤病毒优先在癌细胞中复制并抑制其生长。
在某些实施方案中，溶瘤病毒能够自然感染癌细胞并减少其生长。这类病毒的例子包括新城疫病毒、水泡性口炎病毒、粘液瘤病毒、呼肠孤病毒、辛德比斯病毒、麻疹病毒和柯萨奇病毒。能够自然感染癌细胞并减少其生长的溶瘤病毒，通常利用癌细胞中发生的细胞畸变来靶向癌细胞。例如，溶瘤病毒可利用表面附着受体、活化的癌基因(如Ras、Akt、p53)和/或干扰素(IFN)途径缺陷。
在另一个实施方案中，本公开所包括的溶瘤病毒经过工程化处理，可感染癌细胞并减少其生长。适用于此类工程的示例性病毒包括溶瘤DNA病毒，如腺病毒、单纯疱疹病毒(HSV)和痘苗病毒；以及溶瘤RNA病毒，如慢病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、塞尼卡谷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、新城疫病毒、水泡性口炎病毒(VSV)和细小病毒，如啮齿类动物原细小病毒H-1PV。在某些实施方案中，溶瘤病毒包括上述病毒的骨架。
在某些实施方案中，可对溶瘤病毒的肿瘤特异性进行工程化改造，以突变或删除病毒在正常细胞中存活所需但在癌细胞中不能存活的基因。例如，可通过突变或删除编码胸苷激酶(核酸代谢所需的酶)的基因来改造溶瘤病毒。在这个例子中，病毒依赖于细胞胸苷激酶的表达，胸苷激酶在增殖的癌细胞中表达量很高，但在正常细胞中却受到抑制。在另一个例子中，溶瘤病毒被设计成包括能与肿瘤特异性细胞表面分子结合的衣壳蛋白。在某些实施方案中，噬菌体蛋白是纤维蛋白、五聚体蛋白或六聚体蛋白。在另一个例子中，溶瘤病毒被改造成包括肿瘤特异性细胞表面分子，用于转导靶向癌细胞。示例性的肿瘤特异性细胞表面分子可包括整合素、表皮生长因子受体家族成员、蛋白多糖、二唾液酸神经节苷脂、B7-H3、CA-125、EpCAM、ICAM-1、DAF、A21、整合素-α2β1、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、CEA、肿瘤相关糖蛋白、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD152、CD155、MUC1、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体a、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、PSMA、RON-受体和细胞毒性T淋巴细胞抗原4。
溶瘤病毒可以具有复制能力。在某些实施方案中，与相应的正常细胞相比，溶瘤病毒可选择性地在癌细胞中复制。
有条件的复制可以通过例如插入肿瘤特异性启动子来驱动关键基因的表达来实现。这种启动子可以根据肿瘤和相应周围组织之间的基因表达差异来确定。示例性天然启动子包括AFP、CCKAR、CEA、erbB2、Cerb2、COX2、CXCR4、E2F1、HE4、LP、MUC1、PSA、Survivin、TRP1、STAT3、hTERT和Tyr。示例性复合启动子包括AFP/hAFP、SV40/AFP、CEA/CEA、PSA/PSA、SV40/Tyr和Tyr/Tyr。
各种病毒都可以按照上述实例中的方法进行工程化改造。例如，溶瘤病毒可以是修饰的HSV、慢病毒、杆状病毒、逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)或重组形式，如重组腺相关病毒(rAAV)或其衍生物，如自互补型腺相关病毒(scAAV)或非整合型腺病毒。溶瘤病毒可以是修饰的HSV溶瘤病毒，可以是修饰的慢病毒。其它示例病毒包括疫苗病毒、水泡性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒和马拉巴病毒(maraba virus)。
在其它实例中，溶瘤病毒可以是各种AV或AAV血清型之一。在某些实施方案中，溶瘤病毒是血清型1。在另一个实例中，溶瘤病毒是血清型2。在其它实例中，溶瘤病毒是血清型3、4、7、8、9、10、11、12或13。在另一个实例中，溶瘤病毒是血清型5。在另一个实例中，溶瘤病毒是血清型6。
示例性的溶瘤病毒包括T-Vec(HSV-1；Amgen)、JX-594(Vaccina；Sillajen)、JX-594(AdV；Cold Genesys)、Reolysin(呼肠孤病毒；Oncolytics Biotech)。溶瘤病毒的其它实例公开于WO 2003/080083、WO 2005/086922、WO 2007/088229、WO 2008/110579、WO2010/108931、WO 2010/128182、WO 2013/112942、WO 2013/116778、WO 2014/204814、WO2015/077624和WO 2015/166082、WO 2015/089280。
e.其它免疫检查点调节剂
其它免疫检查点的靶点包括但不限于ICOS、OX40、GITR、4-1BB、CD40、CD27-CD70、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、B7-H3、KIR、PARP等，并被靶向单独用于癌症治疗或与抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA化合物组合用于癌症治疗。例如，参见Iwai等，Journal of BiomedicalScience.24(1):26.doi:10.1186/s12929-017-0329-9；Donini,等.,J ThoracDis.2018May；10(Suppl 13):S1581-S1601.Doi:10.21037/jtd.2018.02.79。因此，在一些实施方案中，4H2抗体与靶向ICOS、OX40、GITR、4-1BB、CD40、CD27-CD70、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、B7-H3、KIR或PARP的化合物或其组合联合施用，单独施用或与靶向PD-1、PD-L1和/或CTLA的化合物联合施用。在另一个实施方案中，免疫检查点调节剂是WO 2016/013870中公开的抗体。
C.药物组合物
本组合物可与药学上可接受的载体组合用于治疗。
组合物优选与合适的药用载体结合用于治疗。此类组合物包括有效量的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂。
组合物可以是在合适的药物载体中局部(topically)、局部(locally)或全身施用的制剂。E.W.Martin(Mark Publishing Company，1975)所著的Remington'sPharmaceutical Sciences第15版公开了典型的载体和制备方法。抗体或由其形成的复合物也可以包封在由可生物降解或不可生物降解的聚合物或蛋白或脂质体形成的合适的生物相容性颗粒中，以便靶向细胞。此类系统为本领域技术人员所熟知。在某些实施方案中，抗体或由其形成的复合物被包封在纳米颗粒中。
注射制剂可采用单位剂量形式，如安瓿或多剂量容器，可选择添加防腐剂。组合物可采用无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳液等形式，在某些实施方案中其可与受试者的血液等渗。非水溶剂的例子有聚丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、芝麻油、椰子油、花生油(arachis oil)、花生油(peanut oil)、矿物油、可注射的有机酯如油酸乙酯，或不挥发油包括合成的单甘油酯或双甘油酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠外载体包括氯化钠溶液、1,3-丁二醇、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳化林格氏液或不挥发油。静脉注射载体包括液体和营养补充剂以及电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)。材料可以是溶液、乳液或悬浮液(例如，掺入颗粒、脂质体或细胞中)。通常，制剂中会使用适量的药学上可接受的盐，以使制剂等渗。可向药物组合物中添加海藻糖，其用量通常为1-5％。溶液的pH值优选在约5到8左右，优选在约7到7.5左右。
药物组合物可包括载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂和表面活性剂。载体制剂可参见Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa。本领域技术人员可以很容易地确定制备和配制组合物的各种参数，而无需进行过多的实验。
也可以将组合物单独或与其它适当成分组合制成气雾剂制剂(即，它们可以“雾化”)，通过吸入施用。气雾剂制剂可以放入可接受的加压推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气和空气。对于吸入施用，化合物可以通过加压包或雾化器，使用合适的推进剂，以气溶胶喷雾的形式施用。
在某些实施方案中，化合物包括具有制剂成分的药学上可接受的载体，例如盐、载体、缓冲剂、乳化剂、稀释剂、赋形剂、螯合剂、防腐剂、增溶剂或稳定剂。
核酸可与胆固醇、月桂酸和具有C32官能团的石胆酸衍生物等亲脂性基团缀合，以提高细胞吸收率。例如，胆固醇已被证明可提高siRNA在体外的吸收和血清稳定性(Lorenz等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,14(19):4975-4977(2004))和体内的吸收和血清稳定性(Soutschek等，Nature，432(7014):173-178(2004))。此外，研究还表明，类固醇缀合的寡核苷酸与血液中不同的脂蛋白(如低密度脂蛋白(LDL))结合，可保护其完整性并促进生物分布(Rump等，Biochem.Pharmacol，59(11):1407-1416(2000))。其它可连接或缀合到上述核酸以增加细胞摄取的基团包括：吖啶衍生物；交联剂，如补骨脂素衍生物、叠氮苯甲酰基、丙黄素和叠氮丙黄素；人工核酸内切酶；金属络合物，如乙二胺四乙酸-铁(II)(EDTA-Fe(II))和卟啉-铁(II)；烷基化基团；核酸酶，如碱性磷酸酶；末端转移酶；抗体酶；胆固醇基团；亲脂性载体；肽缀合物；长链醇；磷酸酯；放射性标记物；非放射性标记物；碳水化合物；以及聚赖氨酸或其它多胺。Levy等的美国专利6,919,208也介绍了增强递送的方法。这些药物制剂可以采用本身已知的方式制造，例如通过常规的混合、溶解、制粒、研磨、乳化、包封、包埋或冻干工艺。
其它载体包括持续释放制剂，如含有抗体或由此形成的复合物的固体疏水性聚合物半透性基质，这种基质为成形颗粒形式，如薄膜、脂质体或微颗粒。植入包括插入可植入的递送系统，如微球、水凝胶、聚合物贮库、胆固醇基质、聚合物系统，如基质侵蚀和/或扩散系统以及非聚合物系统。吸入包括在吸入器中将组合物与气雾剂一起施用，可单独施用，也可附着在可吸收的载体施用。对于全身施用，组合物优选包封在脂质体中。
可以使用侵入性装置(如血管导管或泌尿导管)和介入性装置(如具有药物递送能力并配置为扩张装置或支架移植物的支架)，以能够以组织特异性吸收药剂和/或核苷酸递送系统的方式递送组合物。
可以使用生物可降解植入物通过扩散或通过聚合物基质降解的方式来递送制剂。在某些实施方案中，制剂的施用可设计为在一定时间段内(例如数小时、数天、数周、数月或数年)连续暴露于组合物。例如，可以通过重复施用制剂或持续或控释递送系统来实现，在这种递送系统中，组合物无需重复施用即可长期施用。
其它适用的递送系统包括缓释、延释、持续释放或控释递送系统。在许多情况下，这些系统可以避免重复施用，为受试者和医生带来更多便利。许多类型的释放递送系统都是可用的，也是本领域普通技术人员所熟知的。例如，它们包括基于聚合物的系统，如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酸酐、聚己内酯、共聚草酸酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和/或其组合。含有核酸的上述聚合物的微胶囊在例如美国专利5,075,109中有描述。其它实例还包括基于脂质的非聚合物系统，包括甾醇，如胆固醇、胆固醇酯、脂肪酸或中性脂肪，如甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放系统；基于脂质体的系统；基于磷脂的系统；硅胶系统；基于肽的系统；蜡涂层；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；或部分融合的植入物。制剂可以例如是微球、水凝胶、聚合物贮库、胆固醇基质或聚合物系统等。在某些实施方案中，该系统可以通过控制含有抗体或由其形成的复合物的制剂的扩散或侵蚀/降解速率等方式，实现组合物的持续或受控释放。
组合物可配制成肺部或粘膜施用。施用可包括将组合物递送到肺部、鼻腔、口腔(舌下、口腔)、阴道或直肠粘膜。本文所用术语气雾剂是指任何颗粒细雾的制剂，可以是溶液或悬浮液，无论其是否使用推进剂产生。气雾剂可以使用标准技术生产，如超声波或高压处理。
经上呼吸道施用时，制剂可配制成溶液，如水或等渗生理盐水，缓冲液或非缓冲液，也可配制成悬浮液，作为滴剂或喷雾剂进行鼻内施用。优选地，这些溶液或悬浮液相对于鼻腔分泌物是等渗的，并且具有大约相同的pH值，例如从约pH值4.0到约pH值7.4，或者从约pH值6.0到约pH值7.0。缓冲液应是生理上相容的，简单举例包括磷酸盐缓冲液。
可以使用颗粒递送载体将组合物递送至靶细胞。纳米颗粒通常指直径在500纳米到小于0.5纳米范围内的颗粒，优选直径在50到500纳米范围内，更优选直径在50到300纳米范围内。聚合物颗粒的细胞内化高度依赖于其尺寸，纳米聚合物颗粒被细胞内化的效率远远高于微米聚合物颗粒。例如，Desai等的研究表明，与直径为1μM的微粒相比，直径为100nm的纳米颗粒被培养的Caco-2细胞吸收的数量要多出约2.5倍(Desai等，Pharm.Res.,14:1568-73(1997))。纳米颗粒在体内扩散到组织深处的能力也更强。
在某些实施方案中，递送载体是树枝状聚合物。
优选的生物可降解聚合物实例包括可通过水解降解的合成聚合物，如聚(羟基酸)，如乳酸和乙醇酸的聚合物和共聚物，其它可降解聚酯，聚酐、聚(原)酯、聚酯、聚氨酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(己内酯)、聚(羟基烷酸酯)、聚(丙交酯-共-己内酯)和聚(胺-共-酯)聚合物，如Zhou等Nature Materials，11:82-90(2012)和WO 2013/082529、美国申请公开2014/0342003和WO 2016/081621中所描述的聚合物。
在一些实施方案中，特别是用于体内靶向T细胞的实施方案，例如，用于体内生产CAR T细胞，可以靶向免疫细胞或T细胞标记，如CD3、CD7或CD8，或靶组织如肝脏的标记。例如，抗CD8抗体和抗CD3 Fab片段都已被用于体内靶向T细胞(Pfeiffer，等.，EMBO MolMed.，10(11)(2018).pii：e9158.doi：10.15252/emmm.201809158.，Smith，等.，NatNanotechnol.，12(8):813-820(2017).doi：10.1038/nnano.2017.57)。因此，在一些实施方案中，颗粒或其它递送载体包括对CD3、CD7、CD8或另一种免疫细胞(如T细胞)标记物特异的靶向部分，或胸腺、脾脏或肝脏等特定组织的标记物。例如，结合部分可以是抗体或其抗原结合片段。
靶向部分可以与纳米颗粒或其它的递送载体相关联、连接、缀合或以其它方式直接或间接地附接。靶向部分可以是与靶细胞表面的受体或其它分子结合的蛋白、肽、核酸分子、糖或多糖。可以通过选择靶向部分来调节与接枝物结合的特异性和亲和性。
部分的实例包括，例如，靶向部分，其可将分子递送到特定细胞，如造血干细胞、CD34+细胞、T细胞或任何其它优选细胞类型的抗体，以及在优选细胞类型上表达的受体和配体。优选地，所述部分靶向造血干细胞。靶向细胞外基质(“ECM”)的分子的例子包括糖胺聚糖(“GAG”)和胶原蛋白。在一个实施方案中，聚合物颗粒的外表面可进行修饰，以增强颗粒与选定细胞或组织相互作用的能力。优选采用上述方法，将与靶向部分缀合的适配器元件插入颗粒中。然而，在另一个实施方案中，具有羧基末端的聚合物微粒或纳米颗粒的外表面可与具有游离胺末端的靶向部分连接。
附接在聚合物微粒和纳米颗粒上的其它有用配体包括病原体相关分子模式(PAMP)。PAMP靶向细胞或组织表面的Toll样受体(TLR)，或向细胞或组织内部发出信号，从而可能增加摄取。与颗粒表面缀合或共包封的PAMP可包括：未甲基化的CpG DNA(细菌)、双链RNA(病毒)、脂多糖(细菌)、肽聚糖(细菌)、脂阿拉伯甘露聚糖(细菌)、酵母多糖(酵母)、原体脂蛋白，如MALP-2(细菌)、鞭毛蛋白(细菌)、聚(肌苷酸-胞苷酸)(细菌)、脂磷壁酸(细菌)或咪唑喹啉(合成)。
在另一个实施方案中，可使用甘露糖胺处理颗粒的外表面，从而使颗粒的外表面甘露糖化。这种处理可使颗粒在抗原呈递细胞表面的甘露糖受体上与靶细胞或组织结合。另外，与含有Fc部分(靶向Fc受体)、热休克蛋白分子(HSP受体)、磷脂酰丝氨酸(清道夫受体)和脂多糖(LPS)的免疫球蛋白分子进行表面缀合的是细胞或组织上的附加受体靶点。
凝集素可共价附接到微粒和纳米颗粒上，使其对粘蛋白和粘膜细胞层具有靶向特异性。
靶向部分的选择取决于纳米颗粒组合物的施用方法和要靶向的细胞或组织。靶向部分通常可增加颗粒与细胞或组织的结合亲和力，或将纳米颗粒靶向器官中的特定组织或组织中的特定细胞类型。在某些实施方案中，靶向部分靶向胸腺、脾脏或癌细胞。
粘蛋白的任何天然成分以纯化或部分纯化的形式共价附接到微粒上，可降低珠-肠道界面的表面张力，增加珠在粘蛋白层中的溶解度。含有附加悬挂羧酸侧基的聚氨基酸(如聚天冬氨酸和聚谷氨酸)的附着可增加生物粘附性。使用分子量在15,000至50,000kDa范围内的聚氨基酸，产生附接在颗粒表面的120至425个氨基酸残基的链。聚氨基链可通过粘蛋白链中的链缠结和羧基电荷的增加来提高生物粘附性。
III.使用方法
A.递送核酸
提供了使用4H2抗体加强核酸构建体递送的方法。通常情况下，首先将有效量的4H2抗体与需要递送到细胞中的核酸货物接触。例如，可将核酸货物和抗体在溶液中混合足够长的时间，使核酸货物和抗体形成复合物。然后，将混合物与细胞接触。在其它实施方案中，将货物和抗体加入到含有细胞或以其它方式浸泡细胞的溶液中，在细胞存在的情况下形成复合物。复合物可在体外、离体或体内与细胞接触。因此，在某些实施方案中，将复合物溶液加入培养的细胞中或注射到待处理的动物体内。治疗可以是，例如通过简单的静脉注射施用，将抗体和核酸货物的混合物施用于有需要的受试者。
组合物和方法可包括由RNA、DNA、PNA或其他修饰核酸或其组合形成的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种不同的核酸构建体。
组合物的有效量或治疗有效量可以是足以治疗、抑制或缓解疾病或病症中的一种或多种症状的剂量，或以其它方式提供所需的药理和/或生理效果的剂量，例如，减少、抑制或逆转疾病或病症的一种或多种病理生理机制。
有效量也可以是相对于在没有抗体的情况下施用核酸货物，能够有效提高核酸货物递送的速率、数量和/或质量的量。组合物的制剂要适配施用方式。
药学上可接受的载体部分取决于施用的特定组合物以及施用组合物的特定方法。因此，含有复合物的药物组合物有多种合适的制剂。精确的剂量会根据各种因素而变化，例如与受试者因变量(如年龄、免疫系统健康状况、临床症状等)。
可以每天一次、两次或三次；每周一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次；每月一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次或八次，施用或以其它方式与靶细胞接触。例如，在某些实施方案中，组合物每两天或三天施用一次，或每周平均施用约2至约4次。因此，在某些实施方案中，组合物是作为包括两种或两种以上单独治疗的剂量方案的一部分施用的。
剂量方案包括维持方案(两次或多次施用之间剂量保持不变)、升级方案(两次或多次施用之间剂量增加)、降级方案(两次或多次施用之间剂量减少)或其组合。
在某些实施方案中，第一个剂量可以是低剂量。可以继续增加剂量，直到满意的生化反应或临床反应为止。临床反应将取决于所治疗的疾病或病症和/或所期望的结果。在某些实施方案中，剂量可以增加，直到确定治疗效果，优选同时不引起不希望的毒性或将其控制在可接受范围内。接下来，剂量可以维持或稳定减少到维持剂量。这些方法可用于标准化、优化或定制治疗的剂量水平、剂量频率或持续时间。
通常来说，在施用前，尤其是体内施用时，抗体和核酸要混合一段时间，例如在室温下。在某些实施方案中，络合的时间范围为例如1分钟至30分钟(包括端值)，或10分钟至20分钟(包括端值)，优选的络合时间约为15分钟。抗体剂量范围为0.0001毫克至1毫克(包括端值)，优选剂量约为0.1毫克。核酸剂量范围为0.001微克至100微克(包括端值)，优选剂量为10微克。在下面的实验中，4H2/mRNA的比例为1:1w/w和3:1w/w，当然也可以考虑其它比例。在某些实施方案中，抗体与核酸的比例可采用10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5w/w。
在某些实施方案中，RNA和/或DNA货物与载体DNA混合。载体DNA可以是，例如质粒DNA或低分子量的DNA，例如源自鲑鱼精子的DNA。在某些实施方案中，载体DNA是非编码DNA。载体DNA可以是单链或双链，也可以是其组合。在某些实施方案中，载体DNA由长度为1-10、1-100、1-1,000或1-10,000个核苷酸的核酸或其任何子范围或整数或其组合组成。载体DNA通常不与抗体缀合或以其他方式共价连接。载体DNA通常与货物核酸和抗体共孵育，并作为复合物一起共同递送。
1.体外和离体方法
对于体外和离体方法，细胞通常在培养过程中与组合物接触。对于离体方法，可从受试者体内分离细胞，并使细胞与组合物离体接触，以产生含有载货核酸的细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是从待治疗的受试者或同基因宿主中分离出来的。靶细胞可在与组合物接触前从受试者体内取出。抗体和货物可以一起或分别与细胞接触，也可以作为预先形成的复合物与细胞接触。
2.体内方法
在某些实施方案中，在体内向细胞递送核酸货物用于基因编辑和/或治疗受试者的疾病或病症。通常包括抗体-核酸货物复合物的组合物可以直接施用于受试者进行体内治疗。
通常来说，施用化合物(包括抗体、寡核苷酸和相关分子)的方法在本领域是众所周知的。特别是已经用于核酸治疗的施用途径以及目前使用的制剂，为上述供体寡核苷酸提供了优选的施用途径和制剂。优选将组合物注射或输注到动物体内。
组合物可以通过多种途径施用，包括但不限于静脉注射、腹膜内注射、羊膜内注射、肌肉注射、皮下注射或局部(舌下、直肠、鼻内、肺部、直肠粘膜和阴道)和口服(舌下、口腔)。
在某些实施方案中，组合物是为肺部施用而配制的，如鼻内施用或口腔吸入。制剂的施用可以通过任何可接受的方法来实现，使复合物到达其目标。根据所治疗的疾病，施用可以是局部施用(即，施用至特定区域、生理系统、组织、器官或细胞类型)，也可以是全身施用。WO 2017/143042中也讨论了体内递送的组合物和方法。
这些方法还可以包括体内向胚胎或胎儿或其怀孕母亲施用有效量的抗体-核酸复合物组合物。在某些方法中，通过将组合物注射和/或输注到静脉或动脉，如卵黄静脉或脐静脉，或注入胚胎或胎儿的羊膜囊，在子宫内递送组合物。参见，例如，Ricciardi等，NatCommun.2018年6月26日；9(1):2481.doi:10.1038/s41467-018-04894-2，以及WO 2018/187493。
3.应用
可使用4H2抗体将编码目的多肽或功能性核酸的核酸货物，如mRNA、功能性核酸、DNA表达构建体、载体等递送到细胞中，以在细胞中表达或抑制多肽。这些组合物和方法可用于各种不同的应用。非限制性实例包括：CRISPR和gRNA表达载体+/-编辑DNA、大DNA(质粒和表达载体)的递送、基因替换和基因治疗、DNA和/或RNA的递送，例如，用于体内或离体生成CAR-T细胞和简化体内或离体CAR-T细胞的生产、siRNA的递送、mRNA的递送等。下文将讨论与基因治疗/基因编辑和免疫调节，特别是嵌合抗原受体T细胞生产有关的示例性应用。
a.基因治疗和基因编辑
在某些实施方案中，组合物可用于基因编辑。例如，这些方法特别适用于治疗由单个基因突变引起的遗传缺陷、病症和疾病，例如，纠正由点突变引起的遗传缺陷、病症和疾病。如果靶基因含有导致遗传疾病的突变，那么这些方法可用于突变修复，使靶基因的DNA序列恢复正常。靶序列可以在基因的编码DNA序列中，也可以在内含子中。靶序列也可以在调控靶基因表达的DNA序列内，包括启动子或增强子序列。
在本文所述方法中，可将与复合物接触过的细胞施用给受试者。受试者可能患有血友病、肌肉营养不良、球蛋白病、囊性纤维化、着色性干皮病或溶酶体贮积症，或视网膜、眼、脑或脊柱的遗传性疾病或获得性疾病，或冠状动脉或其它血管疾病。在这些实施方案中，基因修饰、基因替换、基因添加或其组合可以有效地减少受试者疾病或病症的一种或多种症状。
在某些实施方案中，所公开的组合物可用于视网膜基因治疗。遗传性视网膜疾病(IRD)通常是由单基因突变引起的，包括但不限于2型Leber先天性无视力症(LCA)、脉络膜血症(CHM)、斯特加特病(Stargardt)、视网膜色素变性(如RHO、USH2A和RPGR的突变)和X-连锁视网膜劈裂症(XLRS)。可使用不同的施用途径，包括玻璃体内、视网膜下和脉络膜上，并提供不同的生物分布。另见Gupta等，“Gene Therapy for Inherited Retinal Disease,”Review of Ophthalmology，2022年5月10日。
在某些实施方案中，所公开的组合物和方法可用于诱导或增强受损内皮细胞的修复，例如在血管重建时。因此，所公开的组合物和方法可作为心血管手术和其它干预措施的辅助手段。例如，血管重建术是可以恢复阻塞的动脉或静脉血流的治疗手段。所公开的组合物和方法可与此类干预措施结合使用，以减少促炎细胞因子(如IL-6、Il-8和TNF-a)的表达或生物活性，增加内皮细胞的生长和增殖，和/或减少新生内膜增生(如平滑肌细胞的生长、增殖、迁移等)。
在一些实施方案中，所公开的组合物和方法包括向需要治疗的部位或邻近部位局部递送。这种局部部位包括但不限于脑部、耳部和皮肤，这种递送可用于治疗与之相关的疾病。
在一些实施方案中，货物包括编码核酸酶的核酸、供体寡核苷酸或编码供体寡核苷酸的核酸，或其组合。
1.基因编辑核酸酶
核酸货物包括编码在靶细胞基因组中诱导单链或双链断裂的一个或多个元件的核酸，可选地，但优选与其它元件组合的货物，如供体寡核苷酸和/或，特别是在CRISPR/Cas的情况下，系统的其它元件如gRNA。这些组合物可用于减少或以其它方式修饰靶基因的表达。
(1).断链诱导元件
CRISPR/Cas
在某些实施方案中，核酸货物包括CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物的一个或多个元件、编码CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物的一个或多个元件的核酸或其组合。本文所用的CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物是指在哺乳动物受试者体内进行CRISPR/Cas介导的基因组编辑所需的CRISPR系统元件。如下文所详细讨论的，CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物通常包括一个或多个编码crRNA、tracrRNA(或其嵌合体，也称为引导RNA或单引导RNA)和Cas酶(如Cas9)的核酸。CRISPR/Cas介导的基因组编辑组合物可以选择性地包括供体多核苷酸，该供体多核苷酸可以在靶位点或邻近靶位点(例如，由Cas9诱导的单链或双链断裂位点)重组到靶细胞的基因组中。
CRISPR/Cas系统已被改造为基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)，用于真核生物(例如，见Cong，Science，15:339(6121):819-823(2013)和Jinek等，Science，337(6096):816-21(2012))。通过用所需的元件(包括Cas基因和专门设计的CRISPR)转染细胞，生物体的基因组可在任何需要的位置被切割和修饰。WO 2013/176772和WO 2014/018423详细描述了使用CRISPR/Cas系统制备用于基因组编辑的组合物的方法，其全部内容特此通过引用并入本文。
本文公开的递送方法适用于CRISPR/Cas系统的多种变体。
通常来说，“CRISPR系统”是指参与表达或指导CRISPR相关(“Cas”)基因活性的转录本和其它元件的统称，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(在内源性CRISPR系统中包括“直接重复”和经过tracrRNA处理的部分直接重复)、引导序列(在内源性CRISPR系统中也称为“间隔基”)或源自CRISPR基因座的其它序列和转录物。与引导序列(如直接重复-间隔基-直接重复)可操作连接的一个或多个tracr配对序列也可在加工前称为前pre-crRNA(前CRISPRRNA)或经核酸酶加工后称为crRNA。
如下文详述，在某些实施方案中，tracrRNA和crRNA连接并形成嵌合的crRNA-tracrRNA杂交体，其中成熟的crRNA通过合成茎环与部分tracrRNA融合，以模拟天然的crRNA:tracrRNA双链，如Cong，Science，15:339(6121):819-823(2013)和Jinek等，Science，337(6096):816-21(2012)所述。单个融合的crRNA-tracrRNA构建体在本文中也被称为引导RNA或gRNA(或单引导RNA(sgRNA))。在sgRNA中，crRNA部分可被定义为“靶序列”，而tracrRNA通常被称为“支架”。
在某些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件源自I型、II型或III型CRISPR系统。在某些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件源自包括内源性CRISPR系统的特定生物体，如化脓性链球菌。
通常来说，CRISPR系统的特征在于具有促进在靶序列位点形成CRISPR复合物(在内源性CRISPR系统中也称为原间隔基)的元件。在形成CRISPR复合物的情况下，“靶序列”指的是引导序列被设计为与之具有互补性的序列，靶序列与引导序列之间的杂交可促进CRISPR复合物的形成。靶序列可以是任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方案中，靶序列位于细胞核或细胞质中。
在靶核酸中，每个原间隔基都与原间隔基邻接基序(PAM)相关联，该基序的识别具有CRISPR系统特异性。在化脓链球菌CRISPR/Cas系统中，PAM是核苷酸序列NGG。在嗜热链球菌CRISPR/Cas系统中，PAM是核苷酸序列NNAGAAW。tracrRNA双链体通过crRNA的间隔区与原间隔DNA之间形成的异源双链体，将Cas引导到由原间隔基和必要的PAM组成的DNA靶点。
通常情况下，在内源性CRISPR系统中，CRISPR复合物(包括与靶序列杂交并与一个或多个Cas蛋白复合的引导序列)的形成会导致靶序列内或附近(例如，在距离靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多碱基对的范围内)的一条或两条链被切割。全部或部分tracr序列还可以构成CRISPR复合物的一部分，例如通过与引导序列可操作连接的tracr配对序列的全部或部分杂交。
一旦确定了所需的DNA靶序列，有许多资源可以帮助研究人员确定合适的靶位点。例如，许多公共资源，包括生物信息学生成的约190,000个潜在sgRNA的列表，可用于靶向40％以上的人类外显子，可帮助研究人员选择靶位点并设计相关sgRNA以影响位点上的缺口或双链断裂。另请参阅crispr.u-psud.fr/，该工具旨在帮助科学家在多种物种中找到CRISPR靶点并生成适当的crRNA序列。
在一些实施方案中，一种或多种驱动CRISPR系统的一个或多个元件表达的载体被导入靶细胞，从而使CRISPR系统元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。例如，Cas酶、与tracr配对序列连接的引导序列和tracr序列可分别可操作地与不同载体上的不同调控元件连接。或者，由相同或不同的调控元件表达的两个或多个元件可以组合在单个载体中，由一个或多个附加载体提供未包括在第一个载体中的CRISPR系统的任何元件。组合在单一载体中的CRISPR系统元件可以以任何合适的方向排列，例如一个元件位于第二个元件的5'(“上游”)或3'(“下游”)。一个元件的编码序列可以位于第二个元件的编码序列的相同或相反的链上，并且方向相同或相反。在一些实施方案中，单个启动子驱动编码CRISPR酶和一个或多个引导序列、tracr配对序列(可选地与引导序列可操作地连接)以及嵌入一个或多个内含子序列(例如，每个在不同的内含子中，两个或多个在至少一个内含子中，或全部在单个内含子中)的tracr的表达。在一些实施方案中，CRISPR酶、引导序列、tracr配对序列和tracr序列与相同的启动子可操作地连接到相同的启动子并由其表达。
在一些实施方案中，载体包括一个或多个插入位点，如限制性内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点(例如，大约或多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个，或更多个插入位点)位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。在一些实施方案中，载体包括插入位点，该插入位点位于tracr伴侣序列的上游，以及可选地位于与tracr伴侣序列可操作连接的调控元件的下游，使得在向插入位点插入引导序列后，引导序列在表达时可引导CRISPR复合物与真核细胞中的靶序列进行序列特异性结合。在某些实施方案中，载体包括两个或多个插入位点，每个插入位点位于两个示踪序列之间，以便在每个位点插入引导序列。在这种安排中，两个或多个引导序列可以包括单个引导序列的两个或多个拷贝、两个或多个不同的引导序列或其组合。当使用多个不同的引导序列时，单个表达构建体可用于将CRISPR活性靶向细胞内多个不同的相应靶序列。例如，单个载体可包括约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20个引导序列。在一些实施方案中，可提供约或多于约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个这样的含引导序列的载体，并可选择性地将其递送至细胞。
在一些实施方案中，载体包括与编码CRISPR酶(如Cas蛋白)的酶编码序列可操作连接的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4，其同源物或其修饰型。在一些实施方案中，未修饰的CRISPR酶具有DNA切割活性，如Cas9。在一些实施方案中，CRISPR酶在目标序列的位置，如靶序列内和/或靶序列的互补序列内，指导一条或两条链的切割。在一些实施方案中，CRISPR酶在距靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对的范围内指导一条或两条链的切割。
在一些实施方案中，载体编码的CRISPR酶相对于相应的野生型酶发生突变，从而使突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条链或两条链的能力。例如，化脓性链球菌Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸的取代(D10A)使Cas9从能切割两条链的核酸酶转变为缺口酶(切割单链)。使Cas9成为切口酶的其它突变实例包括但不限于H840A、N854A和N863A。再例如，Cas9的两个或多个催化结构域(RuvC I、RuvC II和RuvCIII)可以被突变，从而产生基本上缺乏所有DNA切割活性的突变Cas9。在一些实施方案中，D10A突变与H840A、N854A或N863A突变中的一种或多种结合，产生基本上缺乏所有DNA切割活性的Cas9酶。在一些实施方案中，当突变酶的DNA切割活性相对于其非突变形式小于约25％、10％、5％>、1％>、0.1％>、0.01％或更低时，CRISPR酶被认为基本上缺乏所有DNA切割活性。
在某些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列经过密码子优化，可在特定细胞(如真核细胞)中表达。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类动物。通常来说，密码子优化是指通过用宿主细胞基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列中的至少一个密码子(例如，大约或超过大约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多密码子)，同时保持天然氨基酸序列，从而修饰核酸序列以增强其在宿主细胞中的表达的过程。不同物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特殊的偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而翻译效率又被认为取决于被翻译密码子的性质和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性等因素。
细胞中选定的tRNA的优势通常反映了肽合成中最常用的密码子。因此，基于密码子优化，可以定制基因用于在特定生物体中的最佳基因表达。密码子用法表可在“密码子用法数据库”(Codon Usage Database)等网站上找到，这些表格可以通过多种方式进行调整。参见Nakamura,Y.,等.Nucl.Acids Res.,28:292(2000)。也可以使用计算机算法，例如GeneForge(Aptagen；Jacobus,PA)，对特定序列进行密码子优化，以便在特定宿主细胞中表达。在一些实施方案中，编码CRISPR酶的序列中的一个或多个密码子(如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多，或所有密码子)对应于特定氨基酸最常用的密码子。
在某些实施方案中，载体编码的CRISPR酶包括一个或多个核定位序列(NLS)。当存在一个以上的NLS时，每个NLS都可以独立于其它NLS进行选择，使得单个NLS可以存在于一个以上的拷贝中，和/或与存在于一个或多个拷贝中的一个或多个其它NLS组合。在某些实施方案中，当NLS的最近氨基酸在沿着多肽链从N或C端约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或更多氨基酸的范围内时，NLS即被视为靠近N或C端。
通常来说，一个或多个NLS的强度足以驱动CRISPR酶以可检测到的量在真核细胞的细胞核中积累。通常来说，核定位活性的强度可能源自于CRISPR酶中NLS的数量、所使用的特定NLS或这些因素的组合。
可采用任何合适的技术检测细胞核内的积累。例如，可将可检测的标记与CRISPR酶融合，细胞内的位置就可以被可视化，如与检测细胞核位置的方法(如DAPI等细胞核特异性染色剂)相结合。细胞核也可以从细胞中分离出来，然后用任何适合检测蛋白的方法，如免疫组织化学、蛋白质免疫印迹(Western blot)或酶活性测定，对细胞核内容物进行分析。与没有暴露于CRISPR酶或复合物的对照组相比，或与暴露于缺乏一个或多个NLS的CRISPR酶的对照组相比，细胞核中的积累也可以间接确定，例如，通过检测CRISPR复合物形成的影响(例如，检测靶序列上DNA切割或突变，或检测受CRISPR复合物形成和/或CRISPR酶活性影响的基因表达活性的改变)来确定。
在某些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件受可诱导启动子控制，可诱导启动子包括可诱导Cas，如Cas9。
Cong，Science，15:339(6121):819-823(2013)报道，异源表达Cas9、tracrRNA、pre-crRNA(或Cas9和sgRNA)可实现哺乳动物染色体的靶向切割。因此，本文公开的方法中使用的CRISPR系统，以及货物核酸是载体系统，它可以包括一个或多个编码CRISPR系统元件的载体，CRISPR系统元件可以包括与CRISPR/Cas系统嵌合RNA(chiRNA)多核苷酸序列可操作连接的第一调控元件，其中多核苷酸序列包括(a)能够与真核细胞中的靶序列杂交的引导序列，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列；以及与编码CRISPR酶的酶编码序列可操作连接的第二调控元件，该酶可选择性地包括至少一个或多个核定位序列。元件(a)、(b)和(c)可以以5'到3的方向排列，其中Cas9和CRISPR RNA位于系统的相同或不同载体上，其中当转录时，tracr配对序列与tracr序列杂交，引导序列引导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合，并且其中CRISPR复合物可包括与(1)与靶序列杂交的引导序列和(2)与tracr序列杂交的tracr配对序列复合的CRISPR酶，其中编码CRISPR酶的酶编码序列进一步编码异源功能域。在某些实施方案中，一个或多个载体还编码合适的Cas酶，例如Cas9。不同的遗传元件可以受相同或不同启动子的控制。
虽然不同的工程CRISPR系统的具体细节可以有所不同，但总体方法是相似的。有意使用CRISPR技术靶向DNA序列(可使用多种在线工具之一进行识别)的研究人员可以将含有靶序列的短DNA片段插入引导RNA表达质粒中。sgRNA表达质粒包括靶序列(约20个核苷酸)、tracrRNA序列的一种形式(支架)以及合适的启动子和在真核细胞中进行正确加工的必要元件。这种载体是市售的(例如，参见Addgene)。许多系统依赖于定制的互补寡核苷酸，将其退火形成双链DNA，然后克隆到sgRNA表达质粒中。sgRNA与源自相同或不同质粒的适当Cas酶在转染细胞中共同表达，导致所期望的靶位点的单链或双链断裂(取决于Cas酶的活性)。
(2)锌指核酸酶
在某些实施方案中，诱导靶细胞基因组发生单链或双链断裂的元件是一种或多种编码锌指核酸酶(ZFNs)的核酸构建体。因此，核酸货物可以编码ZFN。
ZFN通常是融合蛋白，包括来源于与切割结构域相连的锌指蛋白的DNA结合结构域。最常见的切割结构域是IIS型酶Fokl。Fok1可催化DNA的双链切割，一条链上距其识别位点9个核苷酸，另一条链上距其识别位点13个核苷酸。例如，请参阅美国专利.5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等.Proc.,Natl.Acad.Sci.USA 89(1992):4275-4279；Li等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2764-2768(1993)；Kim等Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:883-887(1994a)；Kim等，J.Biol.Chem.269:31,978-31,982(1994b).这些酶中的一种或多种(或其酶功能片段)可用作切割结构域的来源。DNA结合结构域原则上可设计成靶向任何目的基因组位置，它可以是Cys2His2锌指的串联阵列，每个锌指通常可识别靶DNA序列中的三到四个核苷酸。Cys2His2结构域具有一般结构：Phe(有时为Tyr)-Cys-(2至4个氨基酸)-Cys-(3个氨基酸)-Phe(有时为Tyr)-(5个氨基酸)-Leu-(2个氨基酸)-His-(3个氨基酸)-His。通过将多个锌指连接在一起(数目可变：在已发表的研究中，每个单体使用了三到六个锌指)，ZFN对可以设计成与18-36个核苷酸长的基因组序列结合。
工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的经验选择方法。例如，合理设计包括使用包括三聚体(或四聚体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三聚体或四聚体核苷酸序列与结合特定三聚体或四聚体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。例如，请参阅美国专利.6,140,081；6,453,242；6,534,261；6,610,512；6,746,838；6,866,997；7,067,617；美国公开申请号2002/0165356；2004/0197892；2007/0154989；2007/0213269；以及国际专利申请公开WO 98/53059和WO 2003/016496。
(3).转录激活因子样效应蛋白核酸酶
在某些实施方案中，诱导靶细胞基因组单链或双链断裂的元件是编码转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN)的核酸构建体或多个构建体。因此，核酸货物可以编码TALEN。
TALEN的整体结构与ZFN相似，主要区别在于DNA结合结构域源自TAL效应蛋白，即植物病原菌的转录因子。TALEN的DNA结合结构域是氨基酸重复序列的串联阵列，每个重复序列长约34个残基。这些重复序列彼此非常相似；通常它们主要在两个位置(氨基酸12和13，称为重复可变双残基，或RVD)有所不同。每个RVD指定优先结合四个可能的核苷酸之一，这意味着每个TALEN重复序列结合单个碱基对，但已知NN RVD除了结合鸟嘌呤外，还结合腺嘌呤。与锌指蛋白相比，TAL效应器DNA结合的机理了解较少，但它们看似更简单的代码可能对工程核酸酶的设计非常有益。TALEN也能以二聚体形式切割，靶序列相对较长(迄今报道的最短靶序列每单体可结合13个核苷酸)，而且似乎对结合位点之间的间隔长度的要求没有ZFN那么严格。单体和二聚体TALEN可包括10个以上、14个以上、20个以上或24个以上的重复。
Cermak,等,Nucl.Acids Res.1-11(2011)。美国公开申请2011/0145940公开了TAL效应器和用其修饰DNA的方法。Miller等，Nature Biotechnol 29:143(2011)，报道了通过将TAL截短变体与Fokl核酸酶的催化结构域连接，制备用于位点特异性核酸酶结构的TALEN。结果表明，TALEN能诱导永生化人体细胞中的基因修饰。TALE结合结构域的通常设计原则可在例如WO 2011/072246中找到。
ii.供体多核苷酸
本文所述基因组编辑系统的核酸酶活性可切割靶DNA，在靶DNA中产生单链断裂或双链断裂。细胞至少可以通过两种方式修复双链断裂：非同源末端连接和同源定向修复。在非同源末端连接(NHEJ)中，双链断裂是通过断裂末端彼此直接连接来修复的。因此，虽然可能会丢失一些核酸组分，导致缺失，但不会有新的核酸组分插入该位点。在同源定向修复(HDR)中，与被切割的靶DNA序列具有同源性的供体多核苷酸被用作修复被切割的靶DNA序列的模板，导致遗传信息从供体多核苷酸转移到靶DNA上。因此，新的核酸组分可以被插入/复制到该位点。
因此，在某些实施方案中，核酸货物是供体多核苷酸或包括供体多核苷酸。NHEJ和/或同源定向修复对靶DNA的修饰可用于诱导基因校正、基因置换、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、基因突变等。
因此，基因组编辑组合物对DNA的切割可用于通过切割靶DNA序列，并允许细胞在没有外源提供的供体多核苷酸的情况下修复该序列，从靶DNA序列中删除核酸组分。或者，如果基因组编辑组合物包括供体多核苷酸序列，该序列至少包括与靶DNA序列同源的片段，则这些方法可用于向靶DNA序列中添加核酸组分，即插入或替换核酸组分(例如，“敲入”编码蛋白、siRNA、miRNA等的核酸)，添加标签(例如，6xHis、荧光蛋白(如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等)、血凝素(HA)、FLAG等)、向基因添加调节序列(如启动子、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入序列(IRES)、2A肽、起始密码子、终止密码子、剪接信号、定位信号等)，修饰核酸序列(如引入突变)等。因此，组合物可用于以特定位点(即“靶向”)的方式修饰DNA，例如基因敲除、基因敲入、基因编辑、基因标记等，如基因治疗中使用的。
在需要将多核苷酸序列插入靶DNA序列的应用中，还需要向细胞提供包括待插入的供体序列的多核苷酸。所述“供体序列”或“供体多核苷酸”或“供体寡核苷酸”是指插入切割位点的核酸序列。供体多核苷酸通常与切割位点处的基因组序列有足够的同源性，例如，与切割位点侧翼的核苷酸序列有70％、80％、85％、90％、95％或100％的同源性，例如，在切割位点的约50个碱基或更少的范围内，例如，约30个碱基内、约15个碱基内、约10个碱基内、约5个碱基内，或紧邻切割位点侧翼，以支持切割位点与其具有同源性的基因组序列之间的同源性定向修复。供体序列通常与其取代的基因组序列不相同。相反，只要存在足够的同源性以支持同源定向修复，供体序列可包括相对于基因组序列的至少一个或多个单碱基变化、插入、缺失、倒置或重排。在某些实施方案中，供体序列包括侧翼有两个同源区域的非同源序列，使得靶DNA区域和两个侧翼序列之间的同源定向修复导致非同源序列插入靶区域。
b.免疫调节
i.CAR T细胞
所公开的组合物和方法尤其适用于制备表达免疫受体，特别是嵌合免疫受体(CIR)，如嵌合抗原受体(CAR)的淋巴细胞。人工免疫受体(在本文中也称为嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体、嵌合抗原受体(CAR)和嵌合免疫受体(CIR))是工程化受体，其可将选定的特异性移植到细胞上。如下文详细讨论的，根据所讨论的方法修饰的细胞可用于治疗癌症、感染、炎症和自身免疫性疾病的各种免疫疗法中。
在特别优选的实施方案中，将编码嵌合抗原受体货物的mRNA或DNA递送到免疫细胞，如淋巴细胞。
货物可在体内、离体或体外递送给免疫细胞。在优选的实施方案中，货物是mRNA，这样可以降低成本、便于制造、减少副作用(如细胞因子风暴、神经毒性、移植物抗宿主疾病等)中的一种或多种。在具体实施方案中，从需要CAR T细胞疗法的受试者身上收集免疫细胞(如T细胞)，使用本文公开的组合物和方法将编码一种或多种CAR T细胞构建体的mRNA递送到收集的细胞中，然后将细胞送回受试者体内。在某些实施方案中，从最初收集细胞到将细胞送回受试者体内，整个过程需要1周或更短时间，例如1、2、3、4、5、6或7天。在具体实施方案中，从最初收集细胞到将其送回受试者体内的过程在1或2天内完成，或在1天以内完成，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。
嵌合抗原受体的设计和开发策略在Dotti等在Immunol Rev.2014January；257(1)：doi:10.1111/imr.12131(35页)进行了综述，其全部内容通过引用具体并入本文，以及Dotti，Molecular Therapy，22(5):899-890(2014)、Karlsson等，Cancer Gene Therapy，20:386-93(2013)、Charo等，Cancer Res.，65(5):2001-8(2005)、Jensen等，Immunol Rev.，257(1)：127-144(2014),Eaton,等.,Gene Therapy,9:527-35(2002),Barrett,等.,AnnuRev Med.,65:333-347(2014),Cartellieri,等、Journal of Biomedicine andBiotechnology，2010卷，文章ID 956304，13页，doi:10.1155/2010/956304；以及美国公开申请2015/0017120、2015/0283178、2015/0290244、2014/0050709和2013/0071414。
CAR结合了单克隆抗体的抗原结合特性与T细胞的裂解能力和自我更新能力，与传统T细胞相比具有多项优势(Ramos和Dotti，Expert Opin Biol Ther.，11:855-873(2011)；Curran等，J Gene Med.，14:405-415(2012)；Maher，ISRN Oncol.2012:278093(2012))。CAR-T细胞不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)识别并杀死癌细胞。因此，靶细胞识别不受肿瘤逃避MHC限制T细胞识别的一些机制影响，例如人类白细胞抗原(HLA)I类分子下调和抗原加工缺陷。
嵌合免疫受体最初开发于20世纪80代，最初包括单克隆抗体的可变区(抗原结合区)和T细胞受体(TCR)α和β链的恒定区(Kuwana等，Biochem Biophys Res Commun，149:960-968(1987))。1993年，对这一设计进行了修改，加入了源自单克隆抗体重链和轻链抗原结合区的单链可变片段(scFv)的胞外结构域、跨膜结构域和带有源自CD3-ζ的信号传导结构域的胞内结构域。后来的CAR通常都遵循了类似的结构设计，具有共刺激信号胞内结构域。因此，本文方法中使用的CAR构建体可以包括抗原结合结构域或胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域、胞内结构域及其组合。
在某些实施方案中，胞外结构域是scFv。scFv的亲和力可预测CAR的功能(Hudecek等，Clin Cancer Res.，19(12):3153-64(2013)；Chmielewski等，J Immunol.，173:7647-7653(2004))。抗原结合和随后的激活也可以通过在CAR中添加柔性的连接臂来修饰，这样就可以表达两种不同的scFv，识别两种不同的抗原(Grada等，Mol Ther Nucleic Acids，2:e105(2013))(称为串联CAR(TanCAR))。串联CAR可更有效地杀死单独表达低水平每种抗原的癌症，还可降低单一抗原丢失变体引起的肿瘤免疫逃逸风险。其它胞外结构域包括IL13Rα2(Kahlon等，Cancer Res，64:9160-9166(2004)；Brown等，Clin Cancer Res，18(8):2199-209(2012)；Kong等，Clin Cancer Res，18:5949-5960(2012)、NKG2D配体和CD70受体、肽配体(如T1E肽配体)以及所谓的“通用胞外结构域”(如设计用于识别与生物素标记的单克隆抗体接触的靶标的链霉亲和素(avidin)胞外结构域，或设计用于识别与FITC标记的单克隆抗体接触的靶标的FITC特异性单链抗体片段(scFv)。(Zhang，等，Blood，106:1544-1551(2005)，Barber等，Exp Hematol.，36:1318-1328(2008)，Shaffer等，Blood，117:4304-4314(2011)，Davies等，Mol Med.，18:565-576(2012)，Urbanska等，Cancer Res.，72:1844-1852(2012)，Tamada等，Clin Cancer Res.，18:6436-6445(2012))。
在某些实施方案中，CAR包括铰链区。虽然胞外结构域对CAR的特异性很重要，但连接胞外结构域和跨膜结构域的序列(铰链区)也可通过产生CAR长度和柔韧性的差异影响CAR-T细胞的功能。例如，铰链可包括源自免疫球蛋白(如IgG1)的CH2CH3铰链或其片段。例如，Hudecek等(Hudecek,等.,Clin Cancer Res，19(12):3153-64(2013))比较了CH2-CH3铰链[229个氨基酸(AA)]、CH3铰链(119个AA)和短铰链(12AA)对表达第三代ROR1特异性CAR的T细胞效应器功能的影响，发现表达“短铰链”CAR的T细胞具有更强的抗肿瘤活性，而其它研究人员则发现CH2-CH3铰链削弱了第一代CD30特异性CAR的表位识别(Hombach,等，GeneTher，7:1067-1075(2000))。
在铰链结构域(如果没有铰链结构域，则为胞外结构域)和信号内结构域之间通常存在跨膜结构域，最典型的跨膜结构域源自CD3-ζ、CD4、CD8或CD28分子。与铰链结构域一样，跨膜结构域也会影响CAR-T细胞的效应器功能。
抗原识别后，CAR胞内结构域向T细胞传递激活和共刺激刺激信号。T细胞的激活依赖于胞质结构域中的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)对TCR复合物的胞质CD3-ζ结构域的磷酸化(Irving等，Cell，64:891-901(1991))。虽然大多数CAR胞内结构域都包括源自CD3-ζ的激活结构域，但也有一些包括ITAM结构域，如IgE-γ结构域的Fc受体(Haynes等，JImmunol.，166:182-187(2001))。
表达CAR的细胞的靶向特异性由抗体/胞外结构域识别的抗原决定。所公开的组合物和方法可用于制造靶向任何抗原的构建体和表达构建体的细胞。在免疫疗法，特别是癌症免疫疗法方面，很多抗原和适合靶向抗原的合适胞外结构域是众所周知的。与天然TCR不同的是，大多数基于scFv的CAR能识别细胞表面表达的靶抗原，而不是由细胞的MHC加工和呈现的内部抗原，然而，CAR相比经典TCR的优势在于，它们可以识别蛋白质表位以外的结构，包括碳水化合物和糖脂Dotti,等.,Immunol Rev.2014年1月；257(1):.doi:10.1111/imr.12131(35页)，从而增加了潜在靶抗原库。优选靶点包括只在癌细胞或其周围基质上表达的抗原(Cheever等，Clin Cancer Res.，15:5323-5337(2009))，如对神经胶质瘤细胞特异性的表皮生长因子受体的剪接变体(EGFRvIII)(Sampson等，Semin Immunol.，20(5):267-75(2008))。然而，人抗原也能满足这一要求，而且大多数靶抗原在正常细胞上低水平表达(如GD2、CAIX、HER2)，和/或以谱系限制的方式表达(如CD19、CD20)。
优选靶点和靶向靶点的CAR在本领域是已知的(例如，见Dotti等，ImmunolRev.2014年1月；257(1)：doi:10.1111/imr.12131(35页)。例如，血液恶性肿瘤的CAR靶点包括但不限于CD19(如B细胞)(Savoldo等，J Clin Invest.,121:1822-1826(2011),Cooper,等.,Kochenderfer,等.,Blood,119:2709-2720(2012),Brentjens,等.,MolecularTherapy,17:S157(2009),Brentjens,等.,Nat Med.,9:279-286(2003),Brentjens,等.,Blood,118:4817-4828(2011),Porter,等.,N Engl J Med.,365:725-733(2011),Kalos,等.,Sci Transl Med.,3:95ra73(2011),Brentjens,等.,Sci Transl Med.,5:177ra38(2013),Grupp,等.,N Engl J Med(2013))；CD20(如.,B-细胞)(Jensen,等.,Biol BloodMarrow Transplant(2010),Till,等.,Blood,112:2261-2271(2008),Wang,等.,Hum GeneTher.,18:712-725(2007),Wang,等.,Mol Ther.,9:577-586(2004),Jensen,等.,BiolBlood Marrow Transplant,4:75-83(1998))；CD22(如.,B-细胞)(Haso,等.,Blood,121:1165-1174(2013))；CD30(如.,B-细胞)(Di Stasi,等.,Blood,113:6392-6402(2009),Savoldo,等.,Blood,110:2620-2630(2007),Hombach,等.,Cancer Res.,58:1116-1119(1998))；CD33(如.,髓系细胞)(Finney,等.,J Immunol.,161:2791-2797(1998))；CD70(如.,B细胞/T细胞)(Shaffer,等.,Blood,117:4304-4314(2011))；CD123(如.,髓系细胞)(Tettamanti,等.,Br J Haematol.,161:389-401(2013))；Kappa(如.,B-细胞)(Vera,等.,Blood,108:3890-3897(2006))；Lewis Y(如.,髓系细胞)(Peinert,等.,Gene Ther.,17:678-686(2010),Ritchie,等.,Mol Ther.(2013))；NKG2D ligands(如.,髓系细胞)(Barber,等.,Exp Hematol.,36:1318-1328(2008),Lehner,等.,PLoS One.,7:e31210(2012),Song,等.,Hum Gene Ther.,24:295-305(2013),Spear,等.,J Immunol.188:6389-6398(2012))；ROR1(如.,B-细胞)(Hudecek,等.,Clin Cancer Res.(2013))。
用于实体瘤的CAR靶点包括但不限于：B7H3(如.,肉瘤、胶质瘤)(Cheung,等.,Hybrid Hybridomics,22:209–218(2003))；CAIX(如.,肾脏)(Lamers,等.,J Clin Oncol.,24:e20–e22.(2006)),Weijtens,等.,Int J Cancer,77:181–187(1998))；CD44 v6/v7(如.,宫颈癌)(Hekele,等.,Int J Cancer,68:232-238(1996)),Dall,等.,CancerImmunol Immunother,54:51-60(2005)；CD171(如.,神经母细胞瘤)(Park,等.,Mol Ther.,15:825-833(2007))；CEA(如.,结肠癌)(Nolan,等.,Clin Cancer Res.,5:3928-3941(1999))；EGFRvIII(如.,胶质瘤)(Bullain,等.,J Neurooncol.(2009),Morgan,等.,HumGene Ther.,23:1043-1053(2012))；EGP2(如.,肿瘤)(Meier,等.,Magn Reson Med.,65:756-763(2011),Ren-Heidenreich,等.,Cancer Immunol Immunother.,51:417-423(2002))；EGP40(如.,结肠癌)(Daly,等.,Cancer Gene Ther.,7:284-291(2000)；EphA2(如.,胶质瘤、肺癌)(Chow,等.,Mol Ther.,21:629-637(2013))；ErbB2(HER2)(如.,乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胶质瘤)(Zhao,等.,J Immunol.,183:5563-5574(2009),Morgan,等.,Mol Ther.,18:843-851(2010),Pinthus,等.,114:1774-1781(2004),Teng,等.,Hum GeneTher.,15:699-708(2004),Stancovski,等.,J Immunol.,151:6577-6582(1993),Ahmed,等.,Mol Ther.,17:1779-1787(2009),Ahmed,等.,Clin Cancer Res.,16:474-485(2010),Moritz,等.,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,91:4318-4322(1994))；ErbB受体家族(如.,乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胶质瘤)(Davies,等.,Mol Med.,18:565-576(2012))；ErbB3/4(如.,乳腺癌、卵巢癌)(Muniappan,等.,Cancer Gene Ther.,7:128-134(2000),Altenschmidt,等.,Clin Cancer Res.,2:1001-1008(1996))；HLA-A1/MAGE1(如.,黑色素瘤)(Willemsen,等.,Gene Ther.,8:1601-1608(2001),Willemsen,等.,J Immunol.,174:7853-7858(2005))；HLA-A2/NY-ESO-1(如.,肉瘤、黑色素瘤)(Schuberth,等.,Gene Ther.,20:386-395(2013))；FR-ɑ(如.,卵巢癌)(Hwu,等.,J Exp Med.,178:361-366(1993),Kershaw,等.,Nat Biotechnol.,20:1221-1227(2002),Kershaw,等.,Clin Cancer Res.,12:6106-6115(2006),Hwu,等.,Cancer Res.,55:3369-3373(1995))；FAP(如.,癌症相关成纤维细胞)(Kakarla,等.,Mol Ther.(2013))；FAR(如.,横纹肌肉瘤)(Gattenlohner,等.,CancerRes.,66:24-28(2006))；GD2(如.,神经母细胞瘤、肉瘤、黑色素瘤)(Pule,等.,Nat Med.,14:1264-1270(2008),Louis,等.,Blood,118:6050-6056(2011),Rossig,等.,Int JCancer.,94:228-236(2001))；GD3(如.,黑色素瘤、肺癌)(Yun,等.,Neoplasia.,2:449-459(2000))；HMW-MAA(如.,黑色素瘤)(Burns,等.,Cancer Res.,70:3027-3033(2010))；IL11Rɑ(如.,骨肉瘤)(Huang,等.,Cancer Res.,72:271-281(2012))；IL13Rɑ2(如.,胶质瘤)(Kahlon,等.,Cancer Res.,64:9160-9166(2004),Brown,等.,Clin Cancer Res.(2012),Kong,等.,Clin Cancer Res.,18:5949-5960(2012),Yaghoubi,等.,Nat Clin PractOncol.,6:53-58(2009))；Lewis Y(如.,乳腺/卵巢/胰腺)(Peinert,等.,Gene Ther.,17:678-686(2010),Westwood,等.,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,102:19051-19056(2005),Mezzanzanica,等.,Cancer Gene Ther.,5:401-407(1998))；Mesothelin(如.,间皮瘤、乳腺癌、胰腺癌)(Lanitis,等.,Mol Ther.,20:633-643(2012),Moon,等.,Clin CancerRes.,17:4719-4730(2011))；Mue1(如.,卵巢、乳腺、前列腺)(Wilkie,等.,J Immunol.,180:4901-4909(2008))；NCAM(如.,神经母细胞瘤，结肠直肠癌)(Gilham,等.,JImmunother.,25:139-151(2002))；NKG2D ligands(如.,卵巢，肉瘤)(Barber,等.,ExpHematol.,36:1318-1328(2008),Lehner,等.,PLoS One,7:e31210(2012),Song,等.,GeneTher.,24:295-305(2013),Spear,等.,J Immunol.,188:6389-6398(2012))；PSCA(如.,前列腺，胰腺)(Morgenroth,等.,Prostate,67:1121-1131(2007),Katari,等.,HPB,13:643-650(2011))；PSMA(如.,前列腺癌)(Maher,等.,Nat Biotechnol.,20:70-75(2002),Gong,等.,Neoplasia.,1:123-127(1999))；TAG72(如.,结肠癌)(Hombach,等.,Gastroenterology,113:1163-1170(1997),McGuinness,等.,Hum Gene Ther.,10:165-173(1999))；VEGFR-2(如.,肿瘤脉管系统)(J Clin Invest.,120:3953-3968(2010),Niederman,等.,Proc Natl Acad Sci U.S.A.,99:7009-7014(2002))。
ii.代谢稳定性
在某些实施方案中，通过使细胞(如CAR细胞)具备产生体内限制生长因子的能力，可提高细胞(如CAR细胞)的代谢稳定性。在某些实施方案中，将编码抗凋亡因子(如BCL-XL)的核酸货物瞬时递送到细胞中。B细胞淋巴瘤-特大(Bcl-XL，或BCL2-样1亚型1)是线粒体中的跨膜蛋白。它是Bcl-2蛋白家族的成员，在细胞凋亡的内在途径中作为促存活蛋白，阻止线粒体内容物(如细胞色素c)的释放，从而导致胱天蛋白酶(caspase)激活。编码BCL-XL的氨基酸和核酸序列都是本领域已知的，例如包括UniProtKB-Q07817(B2CL1_HUMAN)，异构体Bcl-X(L)(标识符：Q07817-1)(氨基酸序列)；ENA|U72398|U72398.1人类Bcl-xβ(bcl-x)基因,完整的编码序列(Human Bcl-x beta(bcl-x)gene,complete cds)(基因组核酸序列)；ENA|Z23115|Z23115.1人类bcl-XL mRNA(H.sapiens bcl-XL mRNA)(mRNA/cDNA核酸序列)。
在某些实施方案中，核货物编码增殖诱导因子，如IL-2。编码IL-2的氨基酸和核酸序列都是本领域已知的，例如包括UniProtKB-P60568(IL2_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|X00695|X00695.1人白细胞介素-2(IL-2)基因和5'-侧翼区(基因核酸序列)；ENA|V00564|V00564.1人编码白细胞介素-2(IL-2)的mRNA(mRNA/cDNA核酸序列)。
然而，分泌型IL-2的产生可能会产生不必要的副作用，即同时刺激淋巴瘤和Treg细胞的增殖，并损害记忆T细胞的形成(Zhang等，Nature Medicine，11:1238-1243(2005))。此外，在接受肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗的患者中使用IL-2会增加毒性(Heemskerk等，Human Gene Therapy，19:496-510(2008))。为了避免这种可能性，除了IL-2之外，核酸货物还可以编码嵌合γc细胞因子受体(CγCR)，例如由白细胞介素-7(IL-7)与I L-7Rα/CD127连接组成的嵌合γc细胞因子受体，该受体能够赋予细胞外源细胞因子独立的、细胞内在的STAT5细胞因子信号(Hunter等，Molecular Immunology，56:1-11(2013))。这种设计是模块化的，IL-2Rβ/CD122胞质链可与IL-7Rα/CD127的胞质链交换，以增强Shc的活性。这种构建体模拟了人CD8+T细胞中的野生型IL-2信号传导(Hunter等，Molecular Immunology，56:1-11(2013))，因此其作用应该与IL-2mRNA相似，但不会产生不必要的副作用。
此外，或者，也可以使用其它抗凋亡分子和细胞因子来保持在天然状态下的细胞活力。示例因子包括但不限于：
髓系细胞白血病1(MCL-1)(例如，UniProtKB-Q07820(MCL1_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|AF147742|AF147742.1人类髓系细胞分化蛋白(MCL1)(Homo sapiens myeloid celldifferentiation protein(MCL1)gene)基因、启动子和完整的编码序列(基因组核酸序列)；ENA|AF118124|AF118124.1人类髓系细胞白血病序列1(MCL1)(Homo sapiens myeloidcell leukemia sequence 1)mRNA,完整的编码序列.(mRNA/cDNA核酸序列))，其为抗凋亡因子；
IL-7(如，UniProtKB-P13232(IL7_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|EF064721|EF064721.1人类白细胞介素7(Homo sapiens interleukin 7)(IL7)基因，完整的编码序列.(基因组核酸序列)；ENA|J04156|J04156.1人白细胞介素7(Human interleukin 7)(IL-7)mRNA，完整的编码序列.(mRNA/cDNA核酸序列)，它对T细胞的存活和发育非常重要，以及IL-15(如UniProtKB-P40933(IL15_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|X91233|X91233.1人白细胞介素7(IL-7)mRNA，完整的编码序列.(mRNA/cDNA核酸序列)。
IL-15(例如，UniProtKB-P40933(IL15_HUMAN)(氨基酸序列)；ENA|X91233|X91233.1人类白细胞介素15基因(H.sapiens IL15 gene)(基因组核酸序列)；ENA|U14407|U14407.1人类白细胞介素15基因(Human interleukin 15)(IL15)mRNA,完整的编码序列.(mRNA/cDNA核酸序列))可促进T细胞和NK细胞的存活(Opferman等，Nature，426：671-676(2003)；Meazza等，Journal of Biomedicine&Biotechnology，861920，doi:10.1155/2011/861920(2011)；Michaud等，Journal of Immunotherapy，33：382-390(2010))。这些细胞因子mRNA既可单独使用，也可与BCL-XL、IL-2和/或CγCR mRNA结合使用。因此，在某些实施方案中，编码MCL-1、IL-7、IL-15或其组合的mRNA被递送至细胞。
iii.抑制性CAR(iCAR)
在一些实施方案中，T细胞疗法被递送至CAR细胞，这些疗法已证明对治疗某些癌症具有长期疗效和治愈潜力，然而，其使用会对非癌性组织造成类似于供体淋巴细胞输注后出现的移植物抗宿主病的损害。所公开的任何组合物和方法都可与非特异性免疫抑制(如大剂量皮质类固醇疗法，其对T细胞产生细胞抑制或细胞毒性作用，以抑制免疫应答)、不可逆的T细胞消除(如所谓的自杀基因工程策略)或其组合结合使用。然而，在一些优选的实施方案中，通过在CAR细胞中引入编码抑制性嵌合抗原受体(iCAR)的构建体，可以减少脱靶效应。通过在T细胞中引入抗原特异性的iCAR(诱导性嵌合抗原受体)，可以使具有对肿瘤和非靶组织双重特异性的T细胞仅限于靶向肿瘤，从而保护非靶组织。(Fedorov等，ScienceTranslational Medicine，5:215ra172(2013))。iCAR可包括表面抗原识别结构域，其与强大的急性抑制信号结构域相结合，即使激活受体(如CAR)同时参与，也可以限制T细胞的反应性。在优选的实施方案中，iCAR包括特异性针对抑制性抗原的单链可变片段(scFv)，该抑制性抗原通过跨膜区与免疫抑制受体(如CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物等)的信号结构域融合，该跨膜区可在抗原识别时特异性地抑制T细胞功能。一旦CAR细胞遇到不表达抑制性抗原的细胞(如癌细胞)，iCAR转导的T细胞就能对CAR的靶抗原产生CAR诱导的反应。Fedorov等，Science TranslationalMedicine，5:215ra172(2013))中讨论了使用对PSMA具有特异性的scFv和CTLA-4或PD-1的抑制性信号传导结构域的DNA iCAR。
设计方面的考虑因素包括：PD-1是比CTLA-4更强的抑制剂；除非使用Y165G突变体，否则CTLA-4表现出细胞质定位；iCAR的表达水平非常重要。
iCAR可以针对细胞类型特异性表面分子进行设计。在某些实施方案中，iCAR被设计为防止T细胞、NK细胞或其它免疫细胞对某些组织或细胞类型的反应性。
iv.减少内源性抑制性信号
在某些实施方案中，细胞与核酸货物接触，核酸货物可对细胞进行重编程，以防止一种或多种抗原的表达。例如，在某些实施方案中，核酸货物是干扰RNA或编码干扰RNA，其可阻止编码CTLA-4或PD-1等抗原的mRNA的表达。这种方法可用于制备通用供体细胞。用于改变同种异体抗原表达的RNA可单独使用，也可与导致靶细胞去分化的RNA组合使用。
尽管上述提供的组合物和方法利用了抑制性信号结构域(例如，人工iCAR中CTLA-4或PD-1)来限制靶向/非肿瘤细胞毒性，但是另外或可选地，通过减少CAR细胞中内源性抑制信号的表达，使CAR细胞对敌对肿瘤微环境的抑制信号产生抗性，从而提高CAR细胞的整体肿瘤效应器效率。
CTLA-4和PD-1在活化和功能的不同阶段抑制T细胞。CTLA-4可调节T细胞对自身抗原的反应，因为基因敲除的小鼠在没有特异性抗原暴露的情况下，由于高度活跃的组织浸润性T细胞而自发出现器官损伤(Tivol等，Immunity 3:541-547(1995)；Waterhouse等，science，270:985-988(1995))。有趣的是，Treg细胞中CTLA-4的条件性基因敲除再现了全基因敲除的效果，表明它在Treg细胞中正常发挥作用(Wing等，science，322:271-275(2008))。相比之下，PD-L1基因敲除的小鼠容易发生自身免疫倾向，但不会自发地形成正常器官的大量炎症细胞浸润，这表明它的主要生理功能是以可诱导的方式介导对正在进行的组织炎症的负反馈控制(Dong等，Immunity，20:327-336(2004))。事实上，根据“适应性抵抗”假说，大多数肿瘤在应答IFNγ时都会上调PD-L1；效应T细胞释放的关键细胞因子包括CART细胞(Greenwald等，Annu Rev Immunol，23:515-548(2005)；Carreno等，Annu RevImmunol，20:29-53(2002)、Chen等，The Journal of Clinical Investigation，125:3384-3391(2015)；Keir等，Annu Rev Immunol，26:677-704(2008)；Pentcheva-Hoang等，Immunological Reviews，229:67-87(2009))。然后，PD-L1向T细胞传递抑制信号，减少其增殖、细胞因子和穿孔素的产生(Butte等，Immunity，27:111-122(2007)；Chen等，Immunology，4:336-347(2004)；Park等，Blood，116:1291-1298(2010)；Wherry等，NatImmunol，12:492-499(2011)；Zou等，Immunology，8:467-477(2008))。此外，T细胞通过B7-H1向癌细胞发出反向信号，诱导抗凋亡效应，从而抵消Fas-L信号(Azuma等，Blood，111:3635-3643(2008))。Azuma等，Blood，111:3635-3643(2008)。
鉴于癌细胞对B7-H1的上调及其表达与癌症进展和不良临床预后有关(Flies等，Journal of Immunotherapy，30:251-260(2007)；Nish imura等，Immunity，11:141-151(1999)；Wang等，Curr Top Microbiol Immunol，344:245-267(2011))，拮抗PD-1和CTLA-4通路的抗体在实体瘤尤其是黑色素瘤中显示出显著疗效，拮抗PD-1和CTLA-4通路的抗体对实体瘤，尤其是黑色素瘤有显著疗效，二者的组合显示出更强的活性。抗CTLA-4抗体，ipilimumab，主要通过抑制Treg细胞，增加T细胞对肿瘤的浸润以及提高肿瘤内CD8+细胞与调节性T细胞(Treg)的比例(CD8+:Treg)，从而改善转移性黑色素瘤患者的总生存率(Hamid等，J Transl Med，9:204(2011)；Ribas等，Clinical Cancer Research:An OfficialJournal of the American Association for Cancer Research，15:6267-6276(2009)；Twyman-Sai nt等，Nature，520:373-377(2015))。抗PD-1抗体nivolumab在转移性黑色素瘤中显示出30-40％的总体反应率(Robert等，The New England Journal of Medicine，372:320-330(2015)；Topalian等，J Clin Oncol，32:1020-1030(2014))，其它实体瘤的早期临床试验也有类似发现，包括转移性肾癌、非小细胞肺癌和复发性霍奇金淋巴瘤(Ansell等，The New England Journal of Medicine，372:311-319(2015)；Brahmer等，J Clin Oncol，28:3167-3175(2010)；Topalian等，The New England Journal of Medicine，366:2443-2454(2012))。由于小鼠黑色素瘤模型对抗CTLA-4抗体的耐药性是由于PD-L181的上调所致，ipilimumab和nivolumab的联合治疗在小鼠模型和人类患者中都显示出了进一步的疗效(Larkin等，The New England Journal of Medicine，373:23-34(2015)；Spranger等，JImmunother Cancer，2，3，doi:10.1186/2051-1426-2-3(2014)；Yu等，Clinical CancerResearch:An Official Journal of the American Ass℃iation for Cancer Research,16:6019-6028(2010))。鉴于检查点抑制途径的重要性，人们认为PD-1/CTLA-4抑制将松开刹车，而嵌合抗原受体将踩下油门。重要的是，可以利用瞬时递送技术来瞬时释放制动，使得这些细胞不会导致未来的自身免疫性疾病。
(1).CRISPRi
为避免永久性基因组修饰和抑制信号(如PD-1和CTLA-4)失活，可利用dCAS9CRISPRi系统(Larson等，Nat Protoc，8:2180-2196(2013))。编码酶失活的dCAS9-KRAB抑制结构域、融合蛋白和抑制信号蛋白(如CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物等)的sgRNA的核酸可共同递送到CAR细胞中。sgRNA可以设计为靶向近端启动子区和编码区(非模板链)。替代方法是利用单组分Cpf1CRISPR系统，其是用于电穿孔和表达的更小RNA(Zetsche等，cell，doi:10.1016/j.cell.2015.09.038(2015))。上述任何一种RNA成分也可由DNA表达构建体编码，如载体，例如质粒。因此，RNA、DNA或其组合都可以作为核酸货物。
虽然ipilimumab对CTLA-4的广泛抑制会导致自身免疫后遗症，但通过限制对CAR细胞的损失和mRNA递送的瞬时性，相信这些副作用会减少。随着时间的推移，抑制功能将会及时恢复。
(2).抑制性RNA
可递送至细胞的核酸货物可以是功能性核酸或多肽或编码功能性核酸或多肽，其被设计为靶向和减少或抑制抑制性信号分子mRNA的表达或翻译；或减少或抑制抑制性信号分子蛋白的表达、降低其活性或增加其降解。合适的技术包括但不限于反义分子、siRNA、miRNA、适配体、核酶、三链形成分子、RNAi等。在某些实施方案中，mRNA编码可减少抑制性信号传导的拮抗剂多肽。
在某些实施方案中，可以将适合减少或沉默CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGF-β受体显性阴性类似物等表达的功能性RNA的货物或编码这些功能性RNA的货物单独或组合递送至细胞。
在某些实施方案中，货物是RNA或DNA，其编码的多肽可降低生物利用度或作为CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4(CD244)、BTLA(CD272)、KIR、TIM-3、TGFβ受体显性阴性类似物或免疫抑制通路中另一种蛋白的拮抗剂或其它负性调节剂或抑制剂。这种蛋白可以是旁分泌蛋白、内分泌蛋白或自分泌蛋白。它可以在细胞内调节细胞。它可以被分泌并调节表达细胞和/或其它(如邻近)细胞。它可以是调节表达细胞和/或其它细胞的跨膜蛋白。蛋白可以是融合蛋白，例如Ig融合蛋白。
v.促凋亡因子
还提供了激活和重新激活细胞凋亡途径的组合物和方法。在某些实施方案中，核酸是激活、重新激活或以其它方式增强或增加内在凋亡途径的因子或制剂或编码激活、重新激活或以其它方式增强或增加内在凋亡途径的因子或制剂。优选的是，该因子能激活、重新激活或以其它方式增强癌(如肿瘤)细胞的内在凋亡途径，更优选的是，该因子对癌细胞具有特异性或靶向性。
在某些实施方案中，细胞在递送抗凋亡因子或促增殖因子(如上文讨论的或本领域已知的因子)后，比未处理的细胞对诱导的细胞凋亡更具抵抗性或更不敏感。例如相对于处理过的T细胞，促凋亡因子可以诱导或增加未处理细胞的凋亡，而且优选对癌细胞有选择性。该疗法可对癌细胞进行双管齐下的攻击，一种是细胞攻击，另一种是分子攻击。
通过靶向BCL-2家族成员，可激活、重新激活或以其它方式增强内在凋亡途径。BCL-2家族成员根据功能和Bcl-2同源(BH)结构域可分为三个亚组：多结构域抗凋亡蛋白(如BCL-2或BCL-XL)、多结构域促凋亡蛋白(如BAX和BAK)以及仅含BH3结构域的促凋亡蛋白(如BIM)。仅含BH3结构域的(BH3-only)的亚组成员，如BIM，作为死亡哨兵分布在细胞各处，随时准备将细胞损伤的各种生理和病理信号传递给位于线粒体的核心凋亡机制(Danial等，cell，116:205-219(2004))。
在某些实施方案中，促凋亡因子是促凋亡BH3-模拟物。各种促凋亡BH3-模拟物可以模拟BIM的天然促凋亡活性，并能操纵凋亡途径的多个点。例如，BIM SAHB(BCL-2结构域的稳定α螺旋)、ABT-737和ABT-199是促凋亡的BH3模拟物,其通过对促凋亡BH3-only螺旋结构域与由抗凋亡蛋白的BH1、BH2和BH3结构域汇合形成的疏水沟之间的相互作用进行结构研究而设计(Oltersdorf等，Nature，435:677-681(2005))。
4.靶细胞
在某些实施方案中，一种或多种特定细胞类型或组织是所公开复合物的靶细胞。靶细胞可以是体外、离体或在受试者体内(即体内)。本文讨论的应用可以在体外、离体或体内进行。对于体外应用，可以收集或分离细胞，并在培养过程中进行处理。经离体处理的细胞可以以治疗有效量施用给有需要的受试者。对于体内应用，货物可以被动地递送到靶细胞，例如，基于组合物的循环、局部递送等，或可以主动地靶向，例如，使用额外的细胞、组织、器官特异性靶向部分。因此，在某些实施方案中，货物被递送到靶细胞，而排除其它细胞。在某些实施方案中，货物被递送到靶细胞和非靶细胞。
研究人员可根据所需的治疗和疗法以及核酸货物的预期效果选择靶细胞。例如，当核酸货物旨在诱导细胞死亡时，靶细胞可能是癌细胞；当核酸货物旨在诱导基因组改变时，靶细胞可能是干细胞；当核酸货物编码嵌合抗原受体时，靶细胞可能是免疫细胞。
4H2以对双嘧达莫敏感的方式渗入细胞，加入GUO后会增强这种渗入，这表明核苷转运蛋白依赖性转运可以被局部核酸促进。
在某些实施方案中，靶细胞的质膜上表达核苷转运蛋白。核苷转运蛋白的表达相对普遍，但在不同组织和细胞类型中表达丰度不同。例如，ENT2在脑部、心脏、胎盘、胸腺、胰腺、前列腺和肾脏中的表达已被证实(Griffiths等，Biochem J，1997.328(Pt 3)：第739-43页，Crawford等，J Biol Chem，1998.273(9):p.5288-93)。与其它转运蛋白相比，ENT2是骨骼肌中mRNA表达量最高的转运蛋白之一(Baldwin等，Pflugers Arch，2004.447(5):p.735-43,Govindarajan,等.,Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2007.293(5)：第R1809-22页)。因此，在某些实施方案中，靶细胞是脑部、心脏、胎盘、胸腺、胰腺、前列腺、肾脏或骨骼肌。
下文将讨论其它非限制性的示例性靶细胞。
i.祖细胞和干细胞
细胞可以是造血祖细胞或造血干细胞。在某些实施方案中，特别是与基因编辑和基因治疗有关的实施方案中，靶细胞是CD34+造血干细胞。造血干细胞(HSC)，如CD34+细胞是多能干细胞，可产生包括红细胞在内的所有血细胞类型。
本领域技术人员可以分离和富集干细胞。这种分离和富集CD34+及其它细胞的方法是本领域已知的，例如公开于美国专利4,965,204；4,714,680；5,061,620；5,643,741；5,677,136；5,716,827；5,750,397和5,759,793。如本文中在富含造血祖细胞和干细胞的背景下使用的，“富含”表示所需元件(如造血祖细胞和造血干细胞)的比例高于细胞天然来源中的比例。与天然来源的细胞相比，细胞组合物可富集至少一个数量级，优选两个或三个数量级，更优选10、100、200或1000个数量级。
在人体中，CD34+细胞可从脐带血、骨髓中回收，或在向供体皮下注射或静脉注射造血生长因子，如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)进行细胞因子动员后的血液中回收，皮下注射或静脉注射的量足以使造血干细胞从骨髓间隙进入外周循环。最初，骨髓细胞可从任何合适的骨髓来源获得，如胫骨、股骨、脊柱和其它骨腔。为了分离骨髓，可使用适当的溶液冲洗骨，该溶液将是平衡盐溶液，方便地补充胎牛血清或其它天然存在的因子，结合可接受的低浓度缓冲液，通常约为5至25mM。方便的缓冲液包括Hepes缓冲液、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。
细胞可通过阳性和阴性选择技术进行筛选。可使用与造血祖细胞或造血干细胞表面抗原(如CD34)结合的市售抗体选择细胞，使用的方法为本领域技术人员所熟知。例如，可将抗体与磁珠结合，利用免疫原性程序回收所需的细胞类型。其它技术包括使用荧光激活细胞分选(FACS)。CD34抗原存在于非白血病个体造血系统中的祖细胞上，在单克隆抗体My-10识别的细胞群上表达(即表达CD34抗原)，可用于分离骨髓移植用干细胞。作为HB-8483保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)的My-10可作为抗HPCA 1在市场上可买到。此外，还可利用从人类骨髓中分化出的“专用”细胞进行阴性选择，以选择任何所需的细胞标记。例如，祖细胞或干细胞，最优选CD34+细胞，可表征为CD3-、CD7-、CD8-、CD10-、CD14-、CD15-、CD19-、CD20-、CD33-、II类HLA+和Thy-1+中的任何一种。
祖细胞或干细胞分离出来后，可在任何合适的培养基中生长繁殖。例如，祖细胞或干细胞可在来自基质细胞的条件培养基中生长，如从骨髓或肝脏中获得的与分泌因子有关的基质细胞，或在包含支持干细胞增殖的细胞表面因子的培养基中生长。使用合适的单克隆抗体去除不需要的细胞，可以去除基质细胞中的造血细胞。
分离出的细胞与抗体和核酸货物复合物离体接触。货物被递送到的细胞可称为修饰细胞。可以简单地将复合物溶液添加到培养细胞中即可。可希望使细胞同步进入S期。同步培养细胞的方法，例如通过双胸苷阻断，是本领域已知的(Zielke等，Methods CellBiol.，8:107-121(1974))。
经修饰的细胞在给受试者用药前可在培养液中保持或扩增。根据细胞类型的不同，培养条件通常是本领域已知的。尤其是CD34+的维持条件已经得到了很好的研究，并有几种合适的方法可供选择。离体多潜能造血细胞扩增的常见方法是在白细胞介素-3等早期作用细胞因子存在下培养纯化的祖细胞或干细胞。研究还表明，在离体维持造血祖细胞的营养培养基中，加入血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和flt3配体(Flt-3L；即flt-3L基因产物的配体)有助于体外扩增原始的(即相对未分化的)人类造血祖细胞，而且这些细胞能够在SCID-hu小鼠体内进行移植(Luens等，1998，Blood 91:1206-1215)。在其它已知的方法中，细胞可离体在营养培养基中维持(如数分钟、数小时或3、6、9、13或更多天)，培养基中包括小鼠催乳素样蛋白E(mPLP-E)或小鼠催乳素样蛋白F(mPIP-F；统称为mPLP-E/IF)(美国专利6,261,841)。当然，也可以使用其它合适的细胞培养和扩增方法。如美国专利5,945,337所述，细胞也可在无血清培养基中培养。
在另一个实施方案中，使用特定的白细胞介素和生长因子组合将修饰的造血干细胞在离体分化成CD4+细胞培养物，然后再使用本领域众所周知的方法给受试者用药。细胞可在体外大量扩增，与分离的造血干细胞原始群体相比，细胞可以大量离体扩增，优选至少扩增5倍，更优选至少扩增10倍，甚至更优选至少扩增20倍。
在另一个实施方案中，细胞可以是去分化的体细胞。体细胞可被重新编程，成为多能干细胞样细胞，其可被诱导成为造血祖细胞。然后，造血祖细胞可以用上述有关CD34+细胞的组合物进行处理。可被重编程的代表性体细胞包括但不限于成纤维细胞、脂肪细胞和肌肉细胞。来自诱导干细胞样细胞的造血祖细胞已在小鼠中成功培育(Hanna,J.等.Science,318:1920-1923(2007))。
要从诱导干细胞样细胞中产生造血祖细胞，需要从宿主身上获取体细胞。在优选的实施方案中，体细胞是自体成纤维细胞。培养这些细胞并用编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子的载体转导。培养转导的细胞和筛选胚胎干细胞(ES)形态和ES细胞标记，包括但不限于AP、SSEA1和Nanog。对转导的ES细胞进行培养和诱导，以产生诱导干细胞样细胞。然后对细胞进行CD41和c-kit标记筛选(早期造血祖细胞标记)以及髓系和红系分化标记的筛选。
经修饰的造血干细胞或经修饰的细胞(包括例如诱导的造血祖细胞等)随后被导入受试者体内。细胞的递送可采用多种方法，最优选的方法包括通过输注静脉施用，以及直接向骨膜、骨髓和/或皮下注射。
接受修饰细胞的受试者可进行骨髓调节，以增强细胞的移植。接受者可在使用细胞前接受放射治疗或化疗，以促进细胞的移植。施用后，细胞通常需要一段时间才能进行移植。造血干细胞或祖细胞的大量移植通常需要数周至数月的时间。
要达到显著的预防或治疗效果，可能并不需要高比例的修饰造血干细胞移植。据信，移植后的细胞会随着时间的推移而扩增，以增加修饰细胞的比例。相信在某些情况下，只需要植入少量或小比例的修饰造血干细胞，就能达到预防或治疗效果。
在优选的实施方案中，要施用给受试者的细胞将是自体细胞，例如，来源于受试者的细胞，或同基因型细胞。
ii.胚胎
在某些实施方案中，组合物和方法可用于体外递送货物至胚胎细胞。这些方法通常包括在体外用有效量的抗体-货物DNA与胚胎接触，以提高货物向胚胎的转导。胚胎可以是单细胞的受精卵，但也可以在受精前和受精过程中处理雄性和雌性配子，以及具有2、4、8或16个细胞的胚胎，不仅包括受精卵，还包括桑椹胚和囊胚细胞。在某些实施方案中，胚胎在体外受精期间或之后的第0-6天与组合物接触。
接触可以是将组合物添加到浸泡胚胎的液体培养基中。例如，可将组合物直接移液到胚胎培养基中，然后由胚胎吸收。
iii.免疫细胞
在某些实施方案中，靶细胞是一种或多种类型的免疫细胞。例如，可以利用或以其它方式靶向不同类型的细胞用于免疫调节和基于CAR的疗法的靶细胞。优选的靶向/工程化T细胞可能因肿瘤和过继疗法的目标而异。效应T细胞通常是优选，因为它们能分泌高水平的效应细胞因子，并能在体外肿瘤靶标的熟练杀手(Barrett等，Annu Rev Med.，65:333-347(2014))。CD3-CD56+NK细胞和CD3+CD8+T细胞是两种具有强大CAR介导细胞毒性的互补淋巴细胞群。将CD8+T细胞与CD4+辅助性T细胞一起使用会导致抑制性T-reg细胞的增加和抑制CD8+T细胞的细胞毒性。由于重编程的CD8+T细胞已被预激活，因此它们可直接作用于肿瘤细胞，而无需在淋巴结中激活，因此CD4+T细胞的支持并非必不可少。
此外，有证据表明，输注幼稚T细胞(Rosenberg等，Adv.Cancer Res.,25:323-388(1977))、中心记忆性T细胞(TCM细胞)(Berger等，J.Clin.Invest.，118:294-305(2008))、Th17细胞(Paulos等Sci.Transl.Med.,2:55-78(2010))和T干细胞记忆细胞(Gattinoni等，Nat.Med.，17:1290-1297(2012))在某些应用中都可能具有某些优势，例如，由于其高复制能力。肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)也因其抗原特异性而具有某些优势，可用于本文公开的递送策略中。
虽然有时被称为CAR细胞、CAR免疫细胞和CART细胞(或CAR T细胞)，但可以理解的是，本文公开的CAR和其它递送策略也可以在其它细胞类型中实施，特别是不同类型的免疫细胞，包括本文讨论的那些细胞(如，淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、B细胞、抗原递呈细胞、巨噬细胞等)和其它地方描述的细胞(例如，参见Barrett等，Annu Rev Med.，65:333-347(2014))。
iv.癌细胞和肿瘤
在某些实施方案中，靶细胞是癌细胞。在这样的实施方案中，提供了可用于癌症(包括肿瘤治疗)的治疗方法。
可递送至癌细胞的货物包括但不限于表达一种或多种促凋亡因子、免疫原因子或肿瘤抑制因子的构建体；基因编辑组合物、靶向癌基因的抑制性核酸；以及本文和其它地方讨论的其它策略。在某些实施方案中，货物是编码促凋亡因子或免疫原性因子的mRNA，这种因子能增加针对细胞的免疫应答。在其它实施方案中，货物是减少癌基因或其它致癌转录本的表达siRNA。
在成熟的动物体内，大多数器官和组织的细胞更新与细胞死亡之间通常保持着平衡。体内的各类成熟细胞都有一定的寿命；当这些细胞死亡时，新细胞会通过各类干细胞的增殖和分化而产生。在正常情况下，新细胞的产生受到严格调控，任何特定类型细胞的数量都保持不变。但偶尔也会出现对正常生长控制机制不再有反应的细胞。这些细胞产生的细胞克隆可以扩展到相当大的规模，形成肿瘤或新生物。不能无限生长且不会广泛侵入健康周围组织的肿瘤是良性的。肿瘤继续生长并呈进行性侵袭性是恶性的。术语癌症特指恶性肿瘤。除了不受控制的生长外，恶性肿瘤还会出现转移。在这个过程中，小簇癌细胞从肿瘤中脱落，侵入血液或淋巴管，并被带到其它组织，在那里继续增殖。这样，一个部位的原发性肿瘤就会在另一个部位产生继发性肿瘤。
本文所述的组合物和方法可用于治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者，延缓或抑制肿瘤在受试者体内的生长，减小肿瘤的生长或大小，抑制或减少肿瘤的转移，和/或抑制或减少与肿瘤发生或生长相关的症状。
本文根据肿瘤来源组织的胚胎起源对可治疗的恶性肿瘤进行分类。癌是产生于内胚层组织或外胚层组织的肿瘤，如皮肤或内脏和腺体的上皮衬里。所公开的组合物对治疗癌症特别有效。肉瘤较少发生，源自中胚层结缔组织，如骨、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病以单细胞形式增殖，而淋巴瘤则倾向于以肿瘤块形式生长。恶性肿瘤可能出现在身体的多个器官或组织中，从而形成癌症。
可使用所提供的组合物和方法治疗的癌症类型包括但不限于血管癌(例如多发性骨髓瘤)、腺癌和肉瘤，这些癌症可能发生在骨、膀胱、脑、乳腺、宫颈、结肠直肠、食管、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、胰腺、前列腺、皮肤、胃和子宫等部位。
在某些实施方案中，所公开的组合物用于同时治疗多种癌症类型。这些组合物还可用于治疗多个部位的转移瘤或肿瘤。
B.调节免疫应答的方法
提供了增强免疫应答的方法。免疫应答可以针对癌症和感染等增加。因此，还提供了治疗癌症和感染的方法，以及为健康受试者和患病受试者接种疫苗的方法。免疫应答也参与伤口愈合，因此也提供了促进伤口愈合的方法。免疫调节也参与了一些自身免疫性疾病，如多发性硬化症，因此也提供了促进多发性硬化症免疫调节的方法。因此，在某些实施方案中，受试者有伤口或多发性硬化症。
这些方法通常包括给有需要的受试者施用有效量的4H2抗体，以增加cGAS和/或另一种PRR(如TLR7)的活化。在一些实施方案中，这些组合物和方法可通过直接结合和4H2激活，或通过cGAS和/或其它PPR、4H2和细胞质核酸和/或GTP之间的同时相互作用间接结合，增加cGAS和/或另一种PRR(如TLR7)的活化。活化的cGAS催化前体分子ATP和GTP形成cGAMP，cGAS产生的cGAMP促进NF-kB的核转位。因此，在某些实施方案中，所公开的组合物增加了cGAMP的产生和/或促进了NF-kB的核转位。通常，这些方法是通过cGAS/STING通路诱导或增强信号传导来增强免疫应答。
在一些实施方案中，所述组合物和方法包括刺激T细胞增殖、肿瘤血管塌陷并促进肿瘤细胞死亡和凋亡、增强肿瘤相关抗原的释放、通过依赖于T辅助细胞1(TH1)、TH2和/或TH17细胞反应的机制改善抗原特异性IgG反应、降低病毒或细菌负荷、降低对病毒或细菌的易感性或其任何组合。另请参阅Motwani和Fitzgerald，Nature Reviews Genetics第20卷，第657-674页(2019)，其全文以引用的方式并入本文，其中描述了增强cGAS/STING信号转导的其它结果。在一些实施方案中，组合物和方法包括增加肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)向肿瘤的募集。
下文的结果还显示，4H2与TLR7相互作用，而且据信是以核酸依赖的方式进行的。TLR家族在病原体识别和先天性免疫激活方面发挥着重要作用。TLR可识别感染性病原体上表达的病原体相关分子模式(PAMP)，并介导产生有效免疫发展所需的细胞因子。TLR7是细胞内模式识别受体，可识别内体中的单链RNA，这是巨噬细胞和树突状细胞内化的病毒基因组的共同特征。例如，TLR7可识别HIV和HCV等病毒的单链RNA。TLR7可以识别富含GU的单链RNA。
结果表明，4H2至少能激活cGAS和TLR7，或许还能激活其它诱导免疫应答的受体，这就为4H2作为免疫刺激剂的使用增加了另一个层面。其它可能被4H2激活的免疫受体包括但不限于其它PPRs，如RIG-I样受体和其它toll样受体，包括但不限于TLR3、TLR8、TLR9等。其它受体包括但不限于其配体被作为货物和/或佐剂提及的那些受体。
在某些实施方案中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的4H2抗体与一种或多种附加药物如核酸货物、免疫刺激核酸、疫苗成分、免疫检查点调节剂或其组合。在某些实施方案中，4H2抗体和附加药物可结合使用，以提供比单独使用任何一种药剂更大程度的增强cGAS/STING和/或另一种免疫受体如PPR(如TLR7)的信号传导。例如，在某些实施方案中，如治疗癌症，增强的活性是更强的抗肿瘤活性。
4H2抗体和/或免疫检查点调节剂可以局部施用或全身施用于受试者，也可以涂布或结合到设备上或设备中。
所公开的单一疗法和组合疗法及治疗方案通常包括治疗疾病或其症状，或用于实现所需的生理变化的方法，包括给动物(如哺乳动物，尤其是人类)施用有效量的4H2抗体，以治疗疾病(如癌症或感染)或其症状，或产生生理变化。
当与附加药物联合施用时，4H2抗体和附加药物可以一起施用，如作为同一组合物的一部分，也可以在同一时间或不同时间分别和独立施用(即4H2抗体和免疫检查点调节剂的施用彼此相隔一定时间)。因此，术语“组合”或“联合”是指两种制剂同时、同步或顺序施用。组合物可以同时施用(如作为混合物施用)、分别但同时施用(如通过不同的静脉管路给同一受试者施用；一种药物口服施用，另一种药物输液或注射施用等)或按顺序施用(如先给一种药物，后给第二种药物)。
在某些实施方案中，组合所取得的结果部分或完全是单个成分所取得结果的叠加。在某些实施方案中，组合使用所取得的效果比单独使用单个成分所取得的效果更具加成作用。通过组合所达到的效果超过了各个单独成分所达到效果的简单相加。在某些实施方案中，一种或两种药剂组合使用的有效量低于每种制剂单独施用时的有效量。在某些实施方案中，联合用药时一种或两种药剂的用量在单独使用时为亚治疗量。
组合疗法或其单个药剂的效果可取决于要治疗的疾病或病症或其进展情况。例如，在某些实施方案中，相对于单独使用每种药剂，组合疗法扩大了可治疗的对象(如癌症或感染的类型)。因此，在某些实施方案中，组合对癌症或感染的效果可以与单独药剂对癌症或感染的作用相比较。
单一疗法和组合疗法的治疗方案可包括一次或多次施用4H2抗体。联合疗法的治疗方案可包括施用一种或多种附加药物。
在某些实施方案中，4H2抗体和附加药物依次施用，例如在两种或多种不同的药物组合物中施用。在某些实施方案中，4H2抗体在首次施用附加药物之前施用。在其它实施方案中，附加药物在首次施用4H2抗体之前施用。例如，可在同一天对受试者施用4H2抗体和附加药物。或者，4H2抗体和附加药物可以在不同的日期给受试者施用。
4H2抗体可在施用附加药物之前或之后至少1、2、3、5、10、15、20、24或30小时或数天施用。或者，免疫检查点调节剂可在施用4H2抗体之前或之后至少1、2、3、5、10、15、20、24或30小时或之后施用。在某些实施方案中，4H2抗体和附加药物的相加作用或超过相加作用的作用在施用后一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周或一周以上后明显可见。
药剂的剂量方案或周期可以完全或部分重叠，也可以是连续的。例如，在某些实施方案中，4H2抗体的所有此类施用均发生在施用附加药物之前或之后。或者，一个或多个剂量的4H2抗体的施用可以与附加药物的施用在时间上错开，以形成均匀或不均匀的疗程，其中先施用一个或多个剂量的4H2抗体，然后施用一个或多个剂量的附加药物，最后施用一个或多个剂量的4H2抗体；或者先施用一个或多个剂量的附加药物，然后施用一个或多个剂量的4H2抗体，最后施用一个或多个剂量的附加药物；等，所有这些都可根据实施治疗的研究人员或临床医生选择或希望的任何时间表进行。
每种药剂的有效量可以以单一单位剂量(如，作为剂量单位)施用或在有限时间间隔内施用的亚治疗剂量的形式施用。这种单位剂量可以在有限的时间内每天施用，例如最长3天，或最长5天，或最长7天，或最长10天，或最长15天，或最长20天，或最长25天，这些都是特别考虑到的。
1.治疗癌症
本文公开的疗法可用于治疗、减轻和/或预防受试者的癌症。因此，组合物可以有效量施用，以治疗、减少和/或预防受试者的癌症。治疗癌症或肿瘤的有效量或治疗有效量通常是指足以减轻或预防癌症的至少一种症状，或以其它方式提供所需的药理和/或生理效应的剂量。症状可以是物理性的，如肿瘤负荷，也可以是生物性的，如减少癌细胞增殖或增加癌细胞死亡。在某些实施方案中，用量可有效杀死肿瘤细胞或减少或抑制肿瘤细胞的增殖或转移。在某些实施方案中，用量可有效减轻肿瘤负荷。在某些实施方案中，有效用量可减少或预防至少一种癌症并发症。
在成熟的动物体内，大多数器官和组织的细胞更新与细胞死亡之间通常保持平衡。体内的各类成熟细胞都有一定的寿命；当这些细胞死亡时，新细胞通过各类干细胞的增殖和分化产生。在正常情况下，新细胞的产生是受到调控的，任何特定类型细胞的数量都保持不变。但偶尔也会出现对正常生长控制机制不再有反应的细胞。这些细胞产生的克隆细胞可以扩展到相当大的规模，形成肿瘤或赘生物。不能无限生长且不广泛侵袭健康周围组织的肿瘤是良性的。持续生长并逐渐侵袭的肿瘤是恶性的。术语癌症通常是指恶性肿瘤。除了不受控制的生长外，恶性肿瘤还会出现转移。在这个过程中，小簇癌细胞从肿瘤中脱落，侵入血液或淋巴管，并被带到其它组织，在那里继续增殖。这样，一个部位的原发性肿瘤就会在另一个部位产生继发性肿瘤。
本文所述的组合物和方法可用于治疗患有良性或恶性肿瘤的受试者，延缓或抑制肿瘤在受试者体内的生长，减小肿瘤的生长或大小，抑制或减少肿瘤的转移，和/或抑制或减少与肿瘤发展或生长相关的症状。
可治疗的恶性肿瘤可根据肿瘤来源组织的胚胎起源进行分类。癌是产生于内胚层或外胚层组织的肿瘤，如皮肤或内脏和腺体的上皮衬里。所公开的组合物对治疗癌症特别有效。较少发生的肉瘤源自中胚层结缔组织，如骨、脂肪和软骨。白血病和淋巴瘤是骨髓造血细胞的恶性肿瘤。白血病以单细胞形式增殖，而淋巴瘤则倾向于以瘤块形式生长。恶性肿瘤可能出现在身体的多个器官或组织中，从而形成癌症。
所公开的抗原结合分子可用于治疗存在生长失控、侵袭或转移的细胞。
以一个或多个Ras基因突变或编码Ras/MAPK信号通路其它成分的基因突变为特征的癌细胞尤其是所公开组合物的特别好的靶标。
癌细胞的形成可能是由于Ras基因的体细胞功能获得性突变，导致小GTP酶Ras酶的激活突变。H-Ras、N-Ras或K-Ras基因的致癌突变最常与人类恶性肿瘤相关。在某些实施方案中，细胞表达小GTP酶Ras家族的突变形式，如K-Ras。在某些实施方案中，细胞不表达野生型Ras基因。
在Ras细胞内信号通路的其它上游或下游成分中也发现了致癌突变，包括胞质激酶和膜RTK(Ras/MAPK通路)。
K-Ras基因中的致癌突变可导致外源性Ras蛋白的组成性激活。示例性突变包括密码子12、13和/或61中的突变，这些突变会导致K-ras蛋白的12、13或61位氨基酸发生任何变化。这包括例如，但不限于K-ras氨基酸12(将甘氨酸变为天冬氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、精氨酸或缬氨酸)以及氨基酸13和61(将谷氨酰胺变为赖氨酸、精氨酸、亮氨酸或天冬氨酸)。另一种描述K-Ras突变的方法是G12A、G12C、G12D、G12S、G12I、G12R、G12V、G13C、G13D、G13S、Q61L、Q61R。同样，第12、13、61位氨基酸含量的任何变化都被认为是示例性突变。
组合物可用于治疗的具有代表性但非限制性的癌症包括血液和淋巴系统癌症(包括白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤)、泌尿生殖系统癌症(包括前列腺癌、膀胱癌、肾癌、尿道癌、阴茎癌及睾丸癌)、神经系统癌症(包括脑膜瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突星形细胞瘤、室管膜瘤)、头颈部癌症(包括口腔、鼻腔、鼻咽腔、口咽腔、喉部及鼻旁窦的的鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞和非小细胞肺癌)、妇科癌症(包括宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、卵巢癌和输卵管癌)、胃肠道癌症(包括胃癌、小肠癌、结直肠癌、肝癌、肝胆管癌和胰腺癌)、皮肤癌(包括黑色素瘤、鳞状细胞癌和基底细胞癌)、乳腺癌(包括导管癌和小叶癌以及三阴性乳腺癌)和小儿癌症(包括神经母细胞瘤、尤文氏肉瘤、肾母细胞瘤、髓母细胞瘤)。因此，在一些实施方案中，本公开涉及治疗乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、脑癌、皮肤癌、肝癌、胃癌、胰腺癌或血癌的方法。在某些实施方案中，本公开涉及治疗胶质母细胞瘤。
所公开的任何方法都可与放疗、化疗(如抗肿瘤药物)或其组合进一步结合使用，以治疗任何癌症，包括癌、胶质瘤、肉瘤或淋巴瘤。可与所公开的抗原结合分子结合的抗肿瘤药物的实例包括但不限于烷化剂类(如替莫唑胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、甲氯乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、达卡巴嗪、洛莫司汀、卡莫司汀、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥和异环磷酰胺)、抗代谢药类(如氟尿嘧啶、吉西他滨、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、氟达拉滨和氟尿苷)、某些抗有丝分裂药和长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛)、蒽环类(包括多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、伊达比星和表柔比星，以及放线菌素类，如放线菌素D)、细胞毒性抗生素类(包括丝裂霉素、普卡霉素和博来霉素)，以及拓扑异构酶抑制剂类(包括喜树碱类如伊立替康和拓扑替康，以及表鬼臼毒素的衍生物如安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷)。
目前正在探索将STING免疫疗法与其它免疫调节剂相结合的策略。通过向B16.F10肿瘤进行瘤内注射(i.t.injection)cGAMP时，其抗肿瘤效果在与抗程序性死亡蛋白-1(PD-1)和抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)抗体联合使用时得到了增强。(Demaria等，Proc Natl Acad Sci U S A(2015)112(50):15408-13.10.1073/PNAS.1512832112)。在其它研究中，CDN与抗PD-1一起在鳞状细胞癌模型以及黑色素瘤的小鼠模型中激发的抗肿瘤效果比单一疗法强得多(Gadkaree等，Head Neck(2017)39(6):1086-94.10.1002/hed.24704；Wang等，Proc Natl Acad Sci U S A(2017)114(7):1637-42.10.1073/PNAS.1621363114)。Luo等将STING激活纳米疫苗与抗PD1抗体结合，在TC-1肿瘤模型中产生了长期抗肿瘤记忆，结果令人鼓舞(Luo等，Nat Nanotechnol(2017)12(7):648-54.10.1038/nnano.2017.52)。因此，特别优选的治疗癌症的方法包括给受试者施用4H2抗体和检查点调节剂的组合。
2.感染和病毒转化细胞
在某些实施方案中，组合物可用于治疗或预防细胞被细菌或病毒感染(例如肿瘤病毒)。
因此，组合物可用于治疗局部或全身感染。
可治疗的代表性感染包括但不限于由微生物引起的感染，这些微生物包括但不限于放线菌(Actinomyces)、鱼腥藻(Anabaena)、芽孢杆菌(Bacillus)、拟杆菌(Bacteroides)、蛭弧菌(Bdellovibrio)、鲍特菌(Bordetella)、疏螺旋体(Borrelia)、弯曲杆菌(Campylobacter)、柄杆菌(Caulobacter)、衣原体(Chlamydia)、绿菌(Chlorobium)、着色菌(Chromatium)、梭菌(Clostridium)、棒状杆菌(Corynebacterium)、噬胞菌(Cytophaga)、异常球菌(Deinococcus)、埃希菌(Escherichia)、弗朗西斯菌(Francisella)、嗜盐菌(Halobacterium)、螺杆菌(Heliobacter)、嗜血杆菌(Haemophilus)、乙型流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza type B(HIB))、组织胞浆菌(Histoplasma)、丛毛单胞菌(Hyphomicrobium)、军团菌(Legionella)、利什曼病菌(Leishmania)、钩端螺旋体(Leptspirosis)、李斯特菌(Listeria)、脑膜炎球菌(Meningococcus)A、B和C、甲烷杆菌(Methanobacterium)、微球菌(Micrococcus)、分枝杆菌(Myobacterium)(如结核杆菌Tuberculosis)、支原体(Mycoplasma)、(Myxococcus)、粘球菌(Myxococcus)、奈瑟菌(Neisseria)、硝化杆菌(Nitrobacter)、颤藻(Oscillatoria)、原绿菌(Prochloron)、变形杆菌(Proteus)、假单胞菌(Pseudomonas)、红螺菌(Phodospirillum)、立克次体(Rickettsia)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、螺旋菌(Spirillum)、螺旋体(Spir℃haeta)、葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、链霉菌(Streptomyces)、硫化叶菌(Sulfolobus)、热原体(Thermoplasma)、硫杆菌(Thiobacillus)、和密螺旋体(Treponema)、弧菌(Vibrio)、耶尔森菌(Yersinia)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、星状诺卡菌(N℃ardia asteroides)、立克次体(Rickettsia ricketsii)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydialpsittaci)、沙眼衣原体(Chlamydial trachomatis)、恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)和曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)。
可受所公开组合物影响的示例病毒包括人类乳头瘤病毒(HPV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒(HHV-8)、梅克尔细胞多瘤病毒、爱泼斯坦-巴氏病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)和人类巨细胞病毒(CMV)，包括但不限于免疫缺陷病毒(如HIV)、人乳头状瘤病毒(如HPV)、疱疹(如HSV)、脑炎、流感(如甲型流感病毒)、普通感冒(如人鼻病毒)、冠状病毒(如SARS-CoV-2)、寨卡病毒、登革热病毒和水泡性口炎病毒(VSV)等病毒感染。
例如，组合物可以局部用药治疗病毒性皮肤病，如疱疹或带状疱疹或生殖器疣。组合物还可用于治疗全身性病毒性疾病，包括但不限于艾滋病、流感、普通感冒或脑炎。
施用组合物可影响的其它病毒性疾病包括科罗拉多蜱热(由柯尔特病毒(Coltivirus)、RNA病毒引起)、西尼罗河热(脑炎，由主要发生在中东和非洲的黄病毒引起)、黄热病、狂犬病(由许多不同的弹状病毒科嗜神经病毒株引起)、病毒性肝炎、肠胃炎(病毒性)--由诺沃克病毒和诺沃克样病毒、轮状病毒、杯状病毒和星状病毒引起的急性病毒性肠胃炎、脊髓灰质炎、由可发生频繁抗原变异的正粘病毒引起的流行性感冒(流感)、麻疹(风疹)、副粘病毒科、腮腺炎、由统称为急性呼吸道病毒的多种病毒引起的包括病毒性肺炎和急性呼吸道综合征(如喉气管支气管炎，俗称“哮吼”)在内的呼吸道综合征，以及由呼吸道合胞病毒(RSV，幼儿呼吸道感染最危险的病因)引起的呼吸道疾病。
在某些实施方案中，所公开的组合物用于治疗或预防病毒感染或病毒感染的扩散或恶化。例如，在某些实施方案中，组合物用于治疗或预防已暴露于病毒或有暴露于病毒风险(如本文讨论的病毒)的受试者的病毒感染或病毒感染的扩散或恶化。
3.疫苗接种
组合物可以在接种疫苗之前、同时或之后施用。在一个实施方案中，在施用疫苗的同时施用4H2抗体组合物。
所公开的组合物可与预防性疫苗或治疗性疫苗联合施用，疫苗可用于启动或增强受试者对已有抗原(如癌症患者的肿瘤抗原)的免疫应答。
根据本领域众所周知的原理，预防性、治疗性或脱敏性免疫应答的预期结果可能因疾病而异。同样，针对癌症、过敏原或传染性病原体的免疫应答可以完全治疗疾病，也可以减轻症状，或者是针对疾病的整体治疗干预中的一个方面。例如，针对癌症的免疫应答刺激可与手术、化疗、放射治疗、激素治疗和其它免疫学方法相结合，以影响治疗效果。
STING激动剂与肿瘤疫苗结合时，可增强抗肿瘤反应。例如，CDN配体与产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的细胞癌症疫苗配制在一起，称为STINGVAX，在几种已建立的癌症模型中显示出很强的体内疗效(Fu，等.，Sci Transl Med(2015)7(283):283ra52.10.1126/scitranslmed.aaa4306)，STING激动剂与传统化疗药物或放疗联合使用可引发抗肿瘤反应(Xia，等、Cancer Res(2016)76(22):6747-59.10.1158/0008-5472.CAN-16-1404；Baird,等.,Cancer Res(2016)76(1):50-61.10.1158/0008-5472.CAN-14-3619).因此，治疗有此需要的受试者的特别优选的方法包括给受试者施用4H2抗体和疫苗的一种或多种成分的组合。该疫苗可以对抗，例如癌症或传染性病原体等。
4.伤口愈合
在某些实施方案中，组合物可用于促进伤口愈合。cGAMP激活STING可促进皮肤伤口愈合(Mizutani等，J Dermatol Sci 202097(10:21-29))。
组合物可促进愈合的代表性伤口包括外伤或手术造成的皮肤伤口、外伤或手术造成的眼部伤口以及外伤或手术造成的内脏器官伤口。
例如，可以局部施用组合物，治疗外伤或手术造成的皮肤或眼部伤口，或局部注射组合物，治疗外伤或手术造成的皮肤或眼部或内脏器官伤口。
5.用于治疗多发性硬化症的免疫调节
在一些实施方案中，组合物可用于促进免疫调节，以治疗自身免疫和/或免疫调节障碍的疾病，如多发性硬化症。通过cGAMP激活STING可抑制多发性硬化症模型中的疾病(Johnson等，J Immunol 2021206(9)：2015-28)。
例如，组合物可以全身施用治疗多发性硬化症。
6.神经纤维瘤病(NF)
神经纤维瘤病(NF)是具有神经和皮肤表现的斑痣性错构瘤病或综合征，属于罕见的遗传性疾病，通常会引起神经的良性肿瘤和身体其它部位(包括皮肤)的增生。
神经纤维瘤病2型是由NF2基因(编码Merlin蛋白)突变引起的神经系统非癌症肿瘤生长为特征的疾病。与神经纤维瘤病2型相关的最常见肿瘤称为前庭神经鞘瘤。这些肿瘤沿着从内耳向大脑传递信息的神经(听觉神经)生长。在覆盖大脑和脊髓的薄膜(脑膜)上形成的肿瘤也常见于神经纤维瘤病2型。这些肿瘤被称为脑膜瘤。肿瘤也可能发生在这种疾病患者大脑或脊髓的其它神经或组织上。在某些实施方案中，方法包括递送编码NF2的核酸(如mRNA)。
下面的结果表明，4H2可以介导递送至NF2 mRNA的基因，并对体内的NF2肿瘤产生影响。因此，在一些实施方案中，受试者患有神经纤维瘤病，例如神经纤维瘤病2型。在一些实施方案中，组合物用于治疗患有神经鞘瘤和/或脑膜瘤的受试者。
通过以下编号段落可以进一步理解本发明：
1.一种组合物，包括以下组分或由以下组分组成
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)，或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；以及
(b)核酸货物，包括编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
2.段1所述的组合物，其中(a)包括
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQ ID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ IDNO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
3.段1或2所述的组合物，其中(a)包括与单克隆抗体4H2相同或不同的表位特异性。
4.段1-3中任一段所述的组合物，其中(a)是具有单克隆抗体4H2的抗原结合部位的重组抗体。
5.一种组合物，包括：
(a)结合蛋白，包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQ ID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ ID NO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式
和
(b)核酸货物，包括编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
6.段1-5中任一段所述的组合物，其中(a)是双特异性的。
7.段6的组合物，其中(a)靶向目的细胞类型。
8.段1-7中任一段所述的组合物，其中(a)和(b)是非共价连接的或相关联的。
9.段1-8中任一段所述的组合物，其中(a)和(b)是复合物。
10.段1-9中任一段所述的组合物，其中(b)包括DNA、RNA、PNA或其它修饰的核酸，或核酸类似物，或其组合。
11.段1-10中任一段所述的组合物，其中(b)包括mRNA。
12.段1-11中任一段所述的组合物，其中(b)包括载体。
13.段12所述的组合物，其中所述载体包括编码目的多肽的核酸序列，所述核酸序列与表达控制序列可操作地连接。
14.段13的组合物，其中所述载体是质粒。
15.段1-14中任一段所述的组合物，其中(b)包括编码Cas内切酶、gRNA或其组合的核酸。
16.段1-15中任一段所述的组合物，其中(b)包括编码嵌合抗原受体多肽的核酸。
17.段1-16中任一段所述的组合物，其中(b)包括功能性核酸。
18.段1-17中任一段所述的组合物，其中(b)包括编码功能性核酸的核酸。
19.段17或18所述的组合物，其中功能性核酸是反义分子、siRNA、miRNA、适配体、核酶、RNAi或外部引导序列。
20.段1-19中任一段所述的组合物，其中(b)包括多个单一核酸分子。
21.段1-19中任一段所述的组合物，其中(b)包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同核酸分子。
22.段1-21中任一段所述的组合物，其中(b)包括长度在约1至25,000个核碱基之间的核酸分子或由其组成。
23.段1-22中任一段所述的组合物，其中(b)包括单链核酸、双链核酸或其组合或由其组成。
24.段1-23中任一段所述的组合物，还包括载体DNA。
25.段24所述的组合物，其中载体DNA是非编码DNA。
26.段24或25所述的组合物，其中(b)由RNA组成。
27.一种药物组合物，包括段1-26中任一段所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。
28.段27所述的组合物还包括包封(a)和(b)复合物的聚合物纳米颗粒。
29.段28所述的组合物，其中靶向部分、细胞穿透肽或其组合与纳米颗粒相关联、连接、缀合或以其它方式直接或间接附接于纳米颗粒。
30.一种向细胞递送核酸货物的方法，包括使细胞与有效量的段1-29中任一段所述的组合物接触。
31.段30所述的方法，其中所述接触发生在体外。
32.段31所述的方法，其中细胞是造血干细胞或T细胞。
33.段30-32中任一段所述的方法，还包括将细胞施用给需要的受试者。
34.段33所述的方法，其中细胞以有效量施用给受试者以治疗疾病或病症的一种或多种症状。
35.段30所述的方法，其中接触发生在给需要的受试者施用后的体内。
36.段33-35中任一段所述的方法，其中受试者患有疾病或病症。
37.段36所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传疾病、癌症或感染或传染性疾病。
38.段36或段37所述的方法，其中(b)以有效量递送到受试者的细胞中，以减轻受试者疾病或病症的一种或多种症状。
39.一种制备段1-29中任一段所述的组合物的方法，包括在与细胞接触之前，将(a)和(b)在适当温度下孵育和/或混合有效时间，以形成(a)和(b)的复合物。
40.一种制备段1-29中任一段所述的组合物的方法，包括孵育和/或混合(a)和(b)约1分钟至约30分钟，约10分钟至约20分钟，或约15分钟，可选地，在室温或37℃。
41.前述段落中任一段所述的组合物或方法，其中(a):(b)的比例在1:3和5:1之间，可选地，该比例为1:1或3:1。
42.一种增强有需要的受试者细胞中免疫受体活化的方法，包括施用有效量的(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)，或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体，可选地，其中免疫受体是cGAS或另一种模式识别受体(PRR)，可选地是toll样受体，可选地是TLR7。
43.段42所述的方法，其中受试者患有癌症或感染。
44.段42或43所述的方法，其中受试者没有癌症。
45.段42-44中任一段所述的方法，其中受试者有需要愈合的伤口。
46.段42-44中任一段所述的方法，其中受试者有免疫失调，可选地，其中免疫失调是多发性硬化症。
47.段42-46中任一段所述的方法，还包括给受试者(b)施用附加的药剂。
48.段47所述的方法，其中(b)选自核酸货物、免疫刺激性核酸、一种或多种疫苗成分、诱导、增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂及其组合。
49.一种治疗癌症或感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的以下组合
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；以及
(b)可诱导、增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂。
50.段48-49中任一段所述的方法，其中免疫检查点调节剂诱导针对癌症或感染的免疫应答。
51.段48-50中任一段所述的方法，其中免疫检查点调节剂减少免疫抑制通路。
52.段51所述的方法，其中免疫抑制通路是PD-1通路。
53.段48-52中任一段所述的方法，其中免疫检查点调节剂选自由PD-1拮抗剂、PD-1配体拮抗剂和CTLA4拮抗剂组成的组。
54.段48-50中任一段所述的方法，其中免疫检查点调节剂增加免疫激活途径。
55.段48-54中任一段所述的方法，其中免疫检查点调节剂是抗体。
56.段48-54中任一段所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是CAR-T细胞。
57.段48-54中任一段所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是溶瘤病毒。
58.一种治疗癌症或感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的以下组合：
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)，或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；和
(b)免疫刺激性核酸。
59.段48或58所述的方法，其中免疫刺激性核酸是STING激动剂。
60.一种给受试者接种疫苗的方法，包括给受试者注射
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；以及
(b)一种或多种疫苗成分。
61.段48或60所述的方法，其中所述一种或多种疫苗成分包括抗原、编码抗原的核酸、佐剂、编码佐剂的核酸或其组合。
62.段61所述的方法，其中抗原来源于细菌或病毒。
63.段48-62中任一段所述的方法，其中与通过在没有(a)或(b)的情况下施用(a)或(b)相比，施用(a)和(b)的组合使癌症或感染的一种或多种症状的减轻超过加和。
64.段48-63中任一段所述的方法，其中，在对受试者施用(b)之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18或24小时，1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3或4周，或其任何组合，向所述受试者施用(a)。
65.段48-63中任一段所述的方法，其中在对受试者施用(a)之前的1、2、3、4、5、6、8、10、12、18或24小时，1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3或4周，或其任何组合，向所述受试者施用(b)。
66.段42-65中任一段所述的方法，还包括向受试者施用一种或多种附加的活性剂，所述活性剂选自由化疗剂、抗感染剂及其组合组成的组。
67.段42-66中任一段所述的方法，还包括手术或放射治疗。
68.段42-67中任一段所述的方法，还包括核酸货物。
69.段68所述的方法，其中(a)和核酸货物在复合物中。
70.段68或69所述的方法，其中(b)是核酸货物，可选地，其中核酸货物由包括DNA、RNA、PNA、PMO、或其它修饰的核酸、或核酸类似物、或其组合组成。
71.段68或段69所述的方法，其中(b)不是核酸货物。
72.段42-71中任一段所述的方法，其中(a)包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR和分别包括SEQ ID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ ID NO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
73.段42-72中任一段所述的方法，其中(a)包括与单克隆抗体4H2相同或不同的表位特异性。
74.段42-73中任一段所述的方法，其中(a)是具有单克隆抗体4H2的抗原结合部位的重组抗体。
75.段42-74中任一段所述的方法，其中(a)包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR和分别包括SEQ ID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ ID NO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
76.段42-75中任一段所述的方法，其中(a)是双特异性的。
77.段76所述的方法，其中(a)靶向目的细胞类型。
78.一种药物组合物，包括段48-77中任一段的(a)和(b)以及药学上可接受的赋形剂。
79.段78所述的药物组合物包括核酸货物。
80.段79所述的药物组合物，其中(b)是核酸货物。
81.段79所述的药物组合物，其中(b)不是核酸货物。
82.段79-81中任一段所述的药物组合物，其中(a)和核酸货物在复合物中。
83.段82所述的药物组合物还包括包封(a)、(b)、核酸货物或其组合的聚合物纳米颗粒。
84.段78-83中任一段所述的药物组合物，其中靶向部分、细胞穿透肽或其组合与(a)、(b)、核酸货物、纳米颗粒或其组合直接或间接关联、连接、融合、缀合或以其它方式附接。
85.一种组合物，包括：
(a)双特异性结合蛋白，包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR和分别包括SEQ ID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(ai)或(aii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ ID NO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式
和
与免疫细胞标记物结合的结合结构域。
86.段85所述的组合物，其中免疫细胞标记物是CD5。
87.段86所述的组合物，其中与CD5结合的结合结构域包括：
(vi)SEQ ID NO:24的CDR与SEQ ID NO:23的CDR的组合；
(vii)分别包括SEQ ID NO:25-27氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR和分别包括SEQ ID NO:28-30氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(viii)(iv)或(iiv)的人源化形式；
(ix)包括与SEQ ID NO:24至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ ID NO:23至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链结合；或
(x)(ix)的人源化形式。
88.段85-87中任一段所述的组合物，包括：
(b)核酸货物，包括编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
89.一种增加有需要的受试者的免疫应答的方法，包括给受试者施用有效量的段85-88中任一段所述的组合物。
90.权利要求89所述的方法，其中受试者患有癌症或感染。
91.结合蛋白，可选地，抗体，包括：
(i)SEQ ID NO:24的CDR与SEQ ID NO:23的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:25-27氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQ ID NO:28-30氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:24至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ ID NO:23至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
实施例
针对宿主DNA反应的自身抗体导致了与系统性红斑狼疮(SLE)相关的炎症和I型干扰素特征(Nehar-Belaid等，Nat Immunol 2(9)：1094-1106(2020),Li,等.,Clin ExpImmunol 159(3)：281-291(2010)).一些抗DNA自身抗体可穿透活细胞，避免溶酶体降解，并进入细胞核或细胞质(Hansen等，J Biol Chem.282:20790-20793(2007)，Noble等，Nat RevRheumatol12(7)：429-34(2016)).cGAS细胞质核酸传感器在先天性免疫的核心机制中，会激活STING/干扰素通路(Wan等，Front Immunol.13:826880(2022))，目前尚不清楚细胞质定位的抗DNA自身抗体与cGAS活性之间是否存在相互作用。
抗DNA自身抗体表现出多种核酸结合特异性，其中一些可识别DNA的多种构象和序列(Shoenfeld等，N Engl J Med.308(8):414-420(1983))和另一些则表现出对单个核苷的精细特异性(Weisbar等，Clin Immunol and Immunopathol.27:403-11(1983),Yee&Weisbart,Clin Immunol and Immunopathol.36:161-67(1985))。鸟苷(GUO)是最具免疫原性的核苷，与其它抗DNA自身抗体相比，抗鸟苷自身抗体滴度与系统性红斑狼疮病的相关性更好(Stollar&Borel，J Immunol 117:1308-1313(1976)；Colburn等，Lupus 10:410-7(2001)；Weisbar等，Clin Immunol and Immunopathol.27:403-11(1983))。值得注意的是，系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中的抗GUO自身抗体与G蛋白上结合GUO的表位相同(Colburn等，Journal of Rheumatology 30(5)：993-97(2003)，Pai等，Nature 341：209-14(1989))，细胞穿透性抗GUO自身抗体被认为会干扰G蛋白介导的细胞信号传导(Colburn&Green，Clin Chim Acta 370：9-16(2006))。
从系统性红斑狼疮的小鼠模型中分离出了多种细胞穿透性抗DNA自身抗体。虽然这些抗体大多能穿透活细胞的细胞核，但抗GUO自身抗体4H2却因其细胞质定位而显著不同。4H2结合的GUO上的表位定位于G蛋白结合的位点，这与人类系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中抗GUO自身抗体结合的报道相吻合(Colburn等，Journal of Rheumatology 30(5)，993-97(2003))。此外，4H2还能穿透并降低培养细胞中的cAMP浓度，这与干扰G蛋白信号传导是一致的(Colburn&Green，Clin Chim Acta 370:9-16(2006))。以下结果表明，4H2的细胞质穿透与核苷转运有关，4H2与核酸结合并介导核酸转运，与cGAS结合并增强其活性，从而对肿瘤细胞造成cGAS依赖性毒性。
实施例1 4H2定位于癌细胞的细胞质，避开内体和溶酶体
材料与方法
杂交瘤和细胞系
4H2杂交瘤是通过与加州大学洛杉矶分校的MTA获得的。杂交瘤的维持和抗体从上清液中的纯化，如前所述(Noble等，Sci Rep 4:5958(2014))。IgG对照为鼠单克隆IgG2a。如前所述(Rattray等，JCI Insight 6(14):e145875(2021))，从CHO细胞培养基中纯化了3E10的人源化、去免疫化和CDR优化的di-scFv片段，称为Deoxymab-1(“DX1”)，其全部内容通过引用特别并入本文。Cal12T细胞获自Horizon Discovery Ltd(Cambridge,UK)。hCMEC/D3细胞购自MilliporeSigma(SCC066)。NHA购自Lonza。与C57/BL6小鼠同基因的小鼠GSC购自MDAnderson癌症中心。细胞在添加10％FBS的RPMI 1640培养基中生长，并在37℃/5％CO2温度下保存。
细胞穿透和共定位免疫荧光检测
活的Cal12T细胞生长在玻璃盖玻片上，用对照培养基或含有0.5mg/mL 4H2的培养基处理一小时。然后清洗细胞并固定，用Alexa Fluor 488缀合山羊抗小鼠IgG抗体(CellSignal ing,Danvers,MA)进行免疫染色，检测4H2在细胞内的位置，如前所述(Chang等，Acta neuropathol Commun9:112(2021))。为了进行共定位研究，还用单独的兔一抗对固定的细胞进行了过夜检测，以检测内体(C45B10抗EEA1抗体，Cell Signaling)、溶酶体(D2D11抗LAMP1抗体，Cell Signaling)、内质网(C81H6抗PDI抗体，Cell Signaling)、高尔基体(D2B6N抗RCAS1抗体,Cell Signaling)、线粒体(3E11抗COX IV，Cell Signaling)，然后用PBS冲洗，并与Alexa Fluor 555缀合的山羊抗兔IgG抗体(Cell Signaling)在室温下孵育一小时。最后一系列清洗后，用含DAPI的Prolong Gold抗淬灭封片剂(Cell Signaling)处理细胞，并使用EVOS fl数字荧光显微镜(Advanced Microscopy Group,Bothell,WA)在明场、DAPI、GFP或RFP滤光片下成像。使用ImageJ(NIH，Bethesda，MD)合并荧光图像。在进行DP研究时，用对照培养基或含有100mM DP(MilliporeSigma，D9766)的培养基预处理细胞三十分钟，然后加入1mg/mL 4H2一小时，然后按上述方法评估细胞穿透情况。使用ImageJ对至少30个细胞的4H2荧光强度进行定量。
4H2的FITC标记和活细胞成像
使用Pierce FITC抗体标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)用FITC标记纯化的4H2。对于活细胞穿透试验，用0.5mg/mL的FITC标记4H2处理Cal12T和A549细胞过夜，然后用500nM MitoTracker Red FM(Thermo Fisher Scientific)处理45分钟，再用1μg/mL Hoechst 33342(Thermo Fisher Scientific)处理15分钟。然后用PBS冲洗细胞，并使用EVOS fl数字荧光显微镜成像。
蛋白质免疫印迹(Western blotting)
用含有指定量IgG对照或4H2的培养基处理细胞过夜，然后制备细胞裂解液，进行4-15％SDS-PAGE分析和硝酸纤维素转移。用TBST中的5％牛奶封闭的膜与相关一抗在4℃下孵育过夜，洗涤后与HRP缀合的抗兔或抗小鼠IgG二抗(Cell Signaling)在室温下孵育一小时。再次洗涤后，用Lumiglo(Cell Signaling)检测条带。使用的一抗包括兔抗p-ERK1/2(T202/Y204)(Cell Signaling)、兔抗pan-ERK1/2(Cell Signaling)或鼠抗β-肌动蛋白(Ambion,Austin,TX)、NF-kB p65兔抗体(Cell Signaling，#8242)。
统计分析
图表使用GraphPad Prism 9.4.1版本生成。体内研究的P值通过Student’t检验或对数秩检验(log-rank)确定。误差线表示SEM。
结果
此前有关4H2的研究报道了它对淋巴细胞和甲状腺上皮细胞的穿透作用(13)。实验被设计为测试4H2对实体瘤癌细胞的穿透性。从杂交瘤上清液中纯化的4H2如预期一样在SDS-PAGE上迁移，并穿透了培养的非小细胞肺癌Cal12T细胞，表现出明显的细胞质定位。用抗肌动蛋白一抗和抗小鼠IgG二抗对4H2处理24小时后的细胞裂解液进行western blot分析，发现4H2重链(HC)和轻链(LC)的条带均出现在预期分子量(MW)位置(图1A)。这表明抗体链在穿透细胞24小时后仍保持完整。用FITC标记的4H2处理非小细胞肺癌细胞(A549和Cal12T)，并用MitoTracker Red FM和Hoechst 33342(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)复染，通过活细胞成像排除了固定伪影的影响。FITC、Hoechst和MitoTracker图像的叠加显示，细胞核中没有4H2 FITC信号，并确认与MitoTracker重叠，这与之前的报告一致(Colburn&Green，Clin Chim Acta 370:9-16(2006))。
抗体内吞并在溶酶体中降解是很常见的现象，但4H2在穿透细胞24小时后仍然保持完整(图1A)。荧光共定位研究探测了4H2在细胞内的定位。用Alexa Fluor 488缀合的抗小鼠IgG抗体免疫染色4H2处理的Cal12T细胞，并用兔一抗检测早期内体(EEA1)、溶酶体(LAMP1)、高尔基体(RASC1)内质网(PDI)和线粒体(COX IV)，然后用Alexa Fluor 555缀合的抗兔IgG抗体和DAPI核复染(Cell Signaling Technology,Danvers,MA)。4H2未与任何测试的细胞器(包括内体或溶酶体)共定位。
实施例2 4H2可降低ERK1/2的活化
之前有报道称4H2可降低大鼠上皮细胞中的cAMP含量，表明其干扰了G蛋白介导的信号传导(Colburn&Green，Clin Chim Acta 370:9-16(2006))。测量Ras下游的ERK1/2磷酸化为评估G蛋白活性提供了另一种方法。用对照培养基或1mg/mL IgG对照或4H2处理Cal12T细胞的裂解液，通过western blot检测总ERK1/2含量和磷酸化ERK1/2含量。4H2不影响ERK1/2的总含量，但降低了其磷酸化程度，而IgG对照对ERK1/2的总含量或pERK1/2没有影响(图1B)。这些结果与4H2对G蛋白信号转导的干扰一致。
实施例3 4H2通过核苷转运蛋白依赖机制穿透活细胞
这里观察到的4H2缺乏早期降解和避免进入内质体/溶酶体的现象表明，4H2的细胞穿透机制是非内吞作用介导的。先前的研究表明，从产生4H2的同一狼疮模型中分离出的核穿透性抗DNA自身抗体3E10，利用平衡核苷转运蛋白(ENT)穿过细胞膜并穿过血脑屏障(BBB)(Hansen等，J Biol Chem.282:20790-20793(2007),Rattray,等.,JCI Insight 6(14):e145875(2021))。会议摘要中报告的初步数据显示，核苷转运蛋白在Jurkat细胞摄取4H2的过程中也发挥了类似的作用(Andersen等，J Investig Med.57(1):168(2009)).实验被设计为通过用转运抑制剂双嘧达莫(DP)处理Cal12T细胞来探究4H2转运对核苷转运的依赖性，并检查其对随后4H2穿透细胞效率的影响。相对于没有DP时，有DP时4H2的穿透率降低到0.290.03(P<0.0001)(图1C中的图像由ImageJ定量)。这表明4H2和3E10一样，使用依赖核苷转运蛋白的机制转运到细胞中。
实施例4 4H2与细胞中的RNA结合
3E10和4H2都是从同一个狼疮模型中分离出来的抗DNA抗体，它们都利用核苷转运来穿透细胞。然而，它们在细胞内的定位模式却不同(3E10：细胞核，4H2：细胞质)。最初认为4H2只是无法穿过核膜，如果4H2能够接触到核DNA，就会与核DNA结合。如果是正确的，那么4H2和3E10之间的比较，可能有助于进一步阐明3E10穿过核膜的机制。用冷冻乙醇预固定EO771细胞以暴露细胞质和细胞核抗原，用IgG对照、IgG1 Deoxymab形式的3E10(本文也称为“Deoxymab-3”和“DX3”(Shirali等，DNA-targeting and cell-penetrating antibody-drug conjugate，bioRxiv.doi:doi.org/10.1101/2023.04.12.536500))，或4H2进行检测。结果显示，对照IgG与细胞的结合极少，而DX3则显示出特异性核结合。然而，4H2信号仍主要存在于细胞质中，尽管它能接触到在乙醇中预固定后暴露的核内容物。
用4H2处理过的EO771活细胞和预固定EO771细胞的图像之间的一个重要差异表明，4H2在活细胞中的定位是细胞质而不是细胞核。在活细胞的细胞核中检测不到4H2信号，但在固定细胞的细胞核中观察到离散的4H2信号簇。细胞核中的这些4H2信号的局灶性分布区域与4H2结合核仁的结果一致(Pederson等，Cold Spring Harb Perspect Biol.3,a000638(2011))。4H2与细胞质和核仁的结合提高了4H2在细胞中优先结合RNA而不是DNA的可能性。与此相一致的是，抗RNA IgG与预固定的EO771细胞的结合模式与观察到的4H2模式非常吻合。为了证实4H2与细胞中的RNA结合，将EO771细胞预固定在冷冻乙醇中，并与IgG对照或抗RNA IgG抗体(以阻断RNA结合位点)一起孵育，然后用FITC标记的4H2一起孵育。抗RNA IgG(而非IgG对照)干扰了4H2-FITC与细胞质和核仁的结合，这证实了4H2与细胞中的RNA结合。基于这些发现，认为4H2与RNA结合是其在细胞质中滞留的原因。
实施例5GUO通过4H2增强细胞穿透力
细胞外DNA/核苷通过3E10促进细胞穿透(Weisbart，等.，Sci Rep5:12022(2015)，Chen，等.，Oncotarget 7(37)：59965-59975(2016))，并促使其定位到坏死的肿瘤中，从而释放DNA。这一特性结合其穿越血脑屏障(BBB)的能力，构成了持续开发用于脑肿瘤治疗的增强型3E10片段(如DX1)的理论依据(Rattray等，JCI Insight 6(14):e145875(2021))。在认识到4H2采用与3E10相似的细胞穿透机制后，设计实验为确定添加核苷，特别是基于4H2的已知结合表位的GUO，是否会增强4H2的细胞穿透力。用PBS对照、IgG对照、DX1或4H2处理人U87胶质瘤和小鼠胶质瘤干细胞样细胞(GSC)，并用免疫荧光检测抗体的穿透性。DX1定位于U87和GSC的细胞核，4H2定位于细胞质。对照组IgG对任何细胞都没有明显的穿透作用。与DX1在缺乏腺苷(ADE)的介质中的穿透相比，加入腺苷(ADE)后，DX1对GSC细胞核的穿透力增强到1.7±0.01(P<0.0001)(图2A)。相比之下，ADE并没有改善4H2的穿透性，相对于没有ADE的情况，观察到的穿透率为0.97±0.16(ns)(图2B)。然而，与不添加GUO时的穿透率相比，添加GUO后，4H2的穿透率提高到3.2±0.3(P<0.0001)(图2C)。这些发现与4H2通过核苷转运蛋白依赖性和GUO响应性的细胞穿透机制相一致。
实施例6 4H2以核苷转运蛋白依赖性方式穿过BBB的Transwell模型
材料和方法
BBB的Transwell模型
使用先前描述的方案(Rattray等，JCI Insight 6(14):e145875(2021))测试4H2穿过BBB Transwell模型的能力。简而言之，将hCMEC/D3脑内皮细胞和正常人星形胶质细胞(NHA)分别粘附在用纤维连接蛋白(MilliporeSigma F1141)和聚L-赖氨酸(MilliporeSigma P4832)涂覆的细胞培养插入物(MilliporeSigma 353095)的顶端侧和基底侧。如前所述(REF)确认了功能屏障的形成，并用对照缓冲液或50mM DP处理BBB模型30分钟，然后用5mM 4H2±50mM DP处理。通过对基底侧室内容物上的抗小鼠IgG斑点印迹进行ImageJ定量，评估在DP存在或不存在的情况下，4H2在15和30分钟时的相对跨屏障渗透量。
结果
核苷转运通过3E10促进穿过BBB和脑肿瘤定位(Rattray等，JCI Insight 6(14):e145875(2021))。鉴于细胞穿透机制的相似性，设计实验来确定4H2是否也能穿过BBB并穿透脑肿瘤。与此相一致的是，4H2成功穿过了BBB的Transwell模型，从顶端室移动到基底侧室。在使用4H2之前用核苷转运抑制剂双嘧达莫(DP)处理BBB会减少抗体转运，这表明核苷转运依赖性的交叉(图2D)。
实施例7 4H2定位于原位GBM，增加TIL的招募，延长体内存活时间
材料与方法
原位GBM研究
研究根据耶鲁大学IACUC批准的方案进行。采用之前描述的方法(Rattray等，JCIInsight 6(14):e145875(2021))，通过立体定向注射50,000个细胞(经工程改造以表达荧光素酶的GSC或GL261)，在5-6周龄的雌性C57/BL6小鼠体内建立原位GBM肿瘤。在GSC研究中，通过IVIS确认肿瘤形成的小鼠被随机分组，随机接受每周一次的尾静脉注射IgG对照(40mg/kg尾静脉)或4H2(40mg/kg尾静脉)治疗，持续三周；并接受GL261结果中所述的IgG对照(40mg/kg尾静脉)、4H2(40mg/kg尾静脉)、抗PD1(5mg/kg IP)及其组合治疗。在整个治疗过程中和治疗后都对小鼠进行密切监测，并对神经系统变化或体重减轻的终点小鼠实施人道安乐死。使用GraphPad Prism 9.4.1版生成Kaplan Meier生存图和中位生存期。进行抗体定位研究，在单次静脉注射IgG对照或4H2(40mg/kg)24小时后收集肿瘤和正常组织，用10％中性缓冲福尔马林固定，并进行石蜡包埋。采用先前描述的方案(Rattray等，JCIInsight 6(14):e145875(2021))，通过抗小鼠IgG-HRP(1:50)进行免疫组化(IHC)检测抗体的存在。用DAB和甲基绿复染显现信号。
结果
经IVIS确认患有原位GSC衍生脑肿瘤的小鼠经尾静脉注射单剂量IgG对照或40mg/kg的4H2。24小时后收集肿瘤和正常组织，并通过IHC评估抗体的存在。经4H2处理后，GBM肿瘤细胞的细胞质中检测到明显的抗体染色，而IgG对照组未检测到。用IgG对照组或4H2治疗小鼠后，在远离肿瘤的正常脑组织中均未检测到抗体染色。在正常组织中，与IgG对照组相比，4H2在肾脏中的定位增加，但在骨骼肌中的两种抗体分布相似。
将携带原位GSC衍生的GBM肿瘤的小鼠随机分为IgG对照组(4只，N＝4)和4H2组(5只，N＝5)，每周尾静脉注射40mg/kg，连续注射三周，并监测毒性和存活率。未观察到任何不良反应。与接受IgG对照组治疗的小鼠相比，4H2可使中位存活率提高66％(**P<0.01，对数秩检验)。在用4H2治疗的组中，完成研究时的存活率为40％，IgG对照组的存活率为0％(图3A，表1)。
表1：IgG对照组或4H2治疗C57/BL6小鼠GSC衍生的原位GBM肿瘤研究完成时的中位存活期和存活率
治疗组 中位生存期(天) 100天存活率％
IgG 38.5 0
4H2 64 40
第二种GBM模型中，携带GL261原位GBM肿瘤的小鼠被随机分为IgG对照(6只)、4H2(6只)、抗-PD1(6只)、抗-PD1+IgG对照(7只)和抗-PD1+4H2(7只)每周给药一次，治疗三周，并监测毒性和存活情况。未观察到不良反应。与IgG对照组相比，4H2的中位生存期提高了32％(*P＝0.03，对数秩检验)。当与抗-PD1联合使用时，与抗PD1+IgG对照组相比，4H2可使中位生存期提高50％(*P＝0.02，对数秩检验)。单用4H2或4H2+抗PD1治疗组的研究完成后存活率分别为33％和29％，而其它各组的存活率均为0％(图3B，表2)。这些结果证明了4H2作为单药以及与抗PD1联合治疗GL261 GBM肿瘤的疗效。
表2：用IgG对照、4H2或抗PD1组合治疗C57/BL6小鼠GL261衍生的原位GBM肿瘤，研究完成时的中位生存期和百分比。
治疗组 中位生存期(天) 70天存活率％
IgG 20.5 0
4H2 27 33
抗PD1抗体 26.5 0
抗PD1抗体+IgG 24 0
抗PD1抗体+4H2 36 29
从机理上讲，4H2导致的存活时间延长可能是cGAS介导的GBM肿瘤细胞衰老/毒性、cGAS介导的免疫应答增强或两者共同作用的结果。对符合安乐死标准的小鼠肿瘤(IgG对照组和4H2组分别为4只和3只)进行了TUNEL和CD8+T细胞染色评估。与IgG对照组治疗的小鼠的肿瘤相比，4H2治疗与肿瘤TUNEL信号和CD8+T细胞含量增加相关，分别增加4.5±0.6倍和1.5±0.2倍(P<0.05)(图4A、4B)。与IgG对照组相比，4H2治疗可使肿瘤中的CD8含量增加53％，相对含量为1.53±0.15(*P<0.03)(图4B)。这表明4H2导致了TIL的增加，并指出对4H2的反应中存在免疫介导的成分。
为了测试免疫系统在介导4H2抗肿瘤作用中的重要性，对颅内携带PPQ GBM肿瘤的无胸腺裸鼠随机分组，每周用IgG对照组(分别为4只和6只)或4H2组(分别为4只和6只)治疗1次或2次，并测量存活率。未观察到4H2的不良反应。与IgG对照组相比，4H2没有显著提高中位生存期，所有组的研究结束时的生存率均为0％(图4C、4D，表3、4)。这些结果表明，4H2在体内的抗肿瘤作用依赖于功能性免疫系统中的T细胞。
表3：每周用IgG对照或4H2治疗PPQ原位GBM肿瘤的无胸腺裸鼠研究完成时的中位生存期和存活率。与IgG对照组相比，4H2没有改变存活率(P＝ns，log-rank检验)。
治疗组 中位生存期(天) 20天存活率％
IgG对照 11.5 0
4H2 12 0
表4：每周两次IgG对照或4H2治疗PPQ原位GBM肿瘤的无胸腺裸鼠研究完成时的中位生存期和存活率。与IgG对照组相比，4H2没有改变存活率(P＝ns，对数秩检验)。
治疗组 中位生存期(天) 20天存活率％
IgG对照 8.5 0
4H2 12 0
实施例8 4H2以核酸依赖方式与cGAS结合
材料与方法
GSC下拉试验(pulldown)
用1mg/mL IgG对照组或4H2处理GSC一小时后，使用NE-PERTM核与胞质蛋白提取试剂盒(Thermo Fisher，#78833)清洗并收集内容物。在500mL最终提取体积中加入50mL 50％蛋白G珠浆，在4℃温度下旋转孵育1.5小时。洗珠，剩余的结合蛋白用40mL SDS上样缓冲液洗脱。用1:1000的兔抗鼠cGAS(Cell Signal ing#31659)和1:5000的山羊抗兔HRP二抗(abcam ab205718)通过蛋白质印迹法检测Ras或cGAS，对样品进行分析。
cGAS结合研究
将2毫克重组人cGAS(Cayman)与8毫克IgG对照或4H2核酸(1.25毫克PvuII-消化的pcDNA3和50mM GTP)在500mL含0.01％Triton X-100的PBS中于4℃旋转孵育一小时。在反应中加入50mL 50％蛋白G珠浆，在4℃温度下旋转孵育一小时。取出珠子，用PBS+0.05％Triton X100冲洗五次，用50mL温和的洗脱缓冲液(fisher)洗脱结合蛋白。用兔抗人cGAS单克隆抗体(Cell Signaling，#15102)或HRP连接的马抗小鼠IgG(Cell Signaling，#7076)对样品进行western blot分析。
检测结果
环GMP-AMP合成酶(cGAS)是细胞质核酸传感器，在先天性免疫中发挥着核心作用。当被激活时，cGAS产生环状GMP-AMP(cGAMP)，以促进干扰素基因刺激因子(STING)信号传导和I型干扰素反应(18)。关于4H2在GBM模型中带来生存益处的机制，主流理论主要集中在细胞信号通路干扰和免疫应答增强两方面。在用IgG对照或4H2处理GSC后进行了抗体pulldown分析，以探究4H2与Ras或cGAS之间的相互作用。选择Ras作为靶点是基于它在细胞信号传导中扮演着关键G蛋白的角色，而选择cGAS作为靶点是基于它具有细胞质核酸传感器的功能，可催化GTP形成cGAMP。未观察到4H2-Ras相互作用(图5A)，但与IgG对照相比，cGAS在4H2的作用下产生了更强的下拉效果(图5B)。通过将纯化的cGAS与IgG对照或4H2孵育，并测试加入核酸对结合的竞争性抑制，进一步评估了4H2-cGAS的结合。4H2与cGAS的结合得到了证实，并且在有核酸存在的情况下，4H2与cGAS的结合减少，这与竞争性抑制是一致的。IgG对照与背景非特异性cGAS结合不受核酸存在的影响(图5C，5D)。
这一结果表明，4H2可能是通过与中间核酸(如内源性mRNA)或与4H2结合后被运入细胞的核酸结合而与细胞质中的cGAS发生相互作用的。纯化的重组cGAS与对照IgG或4H2+/-核酸酶苯佐酶(Benzonase)孵育，以降解与4H2结合的任何核酸，并用蛋白G分离抗体及其相互作用蛋白。与蛋白G/IgG对照相比，4H2与纯化的cGAS的结合更强，核酸酶的加入减少了4H2与cGAS的相互作用，但没有减少非特异性蛋白G/IgG对照与cGAS的结合(图5D-5F)。这些发现表明4H2-cGAS界面依赖于核酸的存在。
实施例9 4H2可增强cGAS的活性
材料与方法
cGAS活性测定
按照生产商的说明，使用cGAS抑制剂筛选检测试剂盒(#701930，Cayman)检测IgG对照或4H2(0-160毫克)对相对cGAMP生成的影响。
NF-kB试验
用1mg/ml IgG对照IgG或4H2在生长培养基(DMEM+10％FBS)中处理GSC 18小时。使用NE-PERTM核与胞质蛋白提取试剂盒(Thermo Fisher，#78833)提取胞质蛋白组分和核蛋白组分，并用NF-kB(Cell Signaling，#8242)western blot进行评估，Lamin B1为上样对照。
cGAS敲除和集落形成试验
将培养于6孔板中的GSCs(胶质瘤干细胞)用RNAiMax(Thermo Fisher)转染100nM对照siRNA或cGAS siRNA(Dharmacon)，转染两天后通过Western blot验证cGAS敲除效率。随后用IgG对照或4H2(0-1.6mM)处理细胞，并通过集落形成实验评估克隆存活率。
结果
活化的cGAS催化前体分子ATP和GTP形成cGAMP。通过在IgG对照或4H2存在下，测量cGAS的相对cGAMP产量，评估4H2对体外cGAS活性的影响。与IgG对照组相比，4H2可使cGAMP的产量增加83％±18(图6A)。cGAS产生的cGAMP通过NF-kB促进核转位，实验旨在通过western blot研究4H2对IgG对照组或4H2处理后GSC中NF-kB核含量的影响。与IgG对照组相比，4H2处理的细胞中NF-kB核含量增加(图6B)。最后，经western blot证实，GSC被siRNA敲除cGAS(图6C)。对照组和敲除cGAS的GSC用IgG对照组或4H2(0-1.6mM)处理，并通过集落形成试验进行评估。cGAS敲除显著降低了GSC对4H2的敏感性，表明cGAS依赖性毒性(图6D)。经1.6μM 4H2处理的对照组或cGAS敲除的PPQ细胞中的存活率分别为0.16±0.09和0.46±0.07(P<0.05)(图6D)。对PPQ细胞的细胞质和细胞核内容物进行western blot也显示，与IgG对照处理的细胞相比，4H2中NF-κB核含量增加了2.2±0.2倍(P<0.05)(图6E)，这与4H2介导的cGAS激活一致。
实施例10 4H2向细胞递送核酸
材料和方法
DNA结合试验
将0.5mg环状或线性化pcDNA3质粒DNA(5.4kb)与10mg IgG对照或4H2在50ml缓冲液(PBS或含10mM Mg或1mM EDTA的结合缓冲液)中室温下孵育一小时。样品在用SYBRTMGreen I(Thermo Fisher)染色的1％琼脂糖凝胶上通过EMSA进行评估。
RNA结合试验
将0.2mg总RNA或GFP mRNA与对照IgG或4H2(0-4mg)在室温下孵育一小时。样品在用SYBRTM Green I(Thermo Fisher)染色的1％琼脂糖凝胶上进行EMSA评估。
检测结果
cGAS是启动先天性免疫应答的细胞质核酸传感器。上述发现表明，4H2与cGAS相互作用并促进其活性。这种相互作用的具体细节尚不清楚，可能包括直接结合，也可能是通过与4H2带入细胞质的含GUO核酸共同结合而间接结合。考虑到这种可能性，设计了实验来探索4H2将外源DNA和RNA带入细胞的能力。4H2与环状和线性化质粒DNA以及总DNA和mRNA的结合已通过EMSA得到证实(图7A、7B)。将与4H2或DX1混合的荧光素酶表达质粒加入培养的U87胶质瘤细胞中，24小时后测量荧光素酶信号。用DX1+质粒处理的细胞中荧光素酶信号最小，而4H2+质粒产生的信号要强得多(图8A)。将荧光素酶mRNA包入脂质纳米颗粒(MC3-LNP)或与DX1或4H2混合，加入培养的U87胶质瘤细胞中，24小时后测量荧光素酶信号。4H2+mRNA和负载了mRNA的MC3-LNPs产生了相似的荧光素酶信号，而DX1+mRNA则没有显示明显的信号(图8B)。
实施例11 4H2在体内介导局部基因递送
材料与方法
核酸递送试验
对于DNA，pGL4.13(luc2/SV40)质粒与DX1或4H2一起孵育后加入培养的U87胶质瘤细胞中。24小时后测定荧光素酶活性。对于RNA，Luc mRNA与DX1或4H2一起孵育，或包封到MC3-LNP脂质纳米颗粒中。将样本加入培养的U87胶质瘤细胞中。24小时后测定荧光素酶活性。
向大脑和视网膜递送mRNA
研究按照耶鲁大学IACUC批准的方案进行。对5-6周龄的雌性Ai9 Cre报告小鼠(杰克逊实验室)进行颅内或眼内注射4H2/Cre mRNA(w/w 3)处理。二十四小时后收集大脑和眼球并切片进行免疫荧光。通过可视化RFP荧光检测功能性Cre重组酶的活性。
向肿瘤递送mRNA
研究按照耶鲁大学IACUC批准的方案进行。H358肿瘤是通过向5-6周龄的雌性裸鼠侧腹部皮下注射产生的，使用之前描述的方案(Chen等，Oncotarget7(37)：59965-59975(2016))。肿瘤形成后进行卡尺测量。当肿瘤达到约100立方毫米时，对小鼠进行瘤内注射荧光素酶(Luc)mRNA与DX1或4H2的混合物，重量比(w/w)为3。如前所述(Rattray等，JCIInsight 6(14):e145875(2021))，通过IVIS可视化荧光素酶信号。
向骨骼肌递送mRNA。
研究按照耶鲁大学IACUC批准的方案进行。对5-6周龄的雌性C57/BL6小鼠肌肉注射荧光素酶(Luc)mRNA与DX1或4H2的混合物，重量比(w/w)为3(左股四头肌)或1(右股四头肌)。如前所述(Rattray等，JCI Insight 6(14):e145875(2021))，通过IVI S可视化荧光素酶信号。
实验结果
与IgG对照组相比，全身施用的4H2显示对原位脑肿瘤的定位增加，但对正常脑的定位没有增加(图3A、3B)。这被认为反映了坏死GBM肿瘤释放的DNA/核苷通过核苷转运蛋白促进了4H2的肿瘤定位。核苷转运蛋白在正常大脑中也有表达(Chang等，Acta neuropatholCommun 9:112(2021))，设计实验测试直接注射4H2和核酸的混合物是否会促进摄取以产生局部基因表达。利用经改造的Ai9小鼠，在Cre重组酶表达后在组织中产生RFP，以检验4H2介导的基因在大脑中的递送。将4H2+Cre mRNA注入小鼠大脑，24小时后测量RFP信号。沿脑内注射轨迹可检测到反映Cre活性的RFP信号(图9A)。在另一项实验中，通过眼内注射4H2+CremRNA对Ai9小鼠进行治疗，24小时后RFP信号的可视化，显示视网膜中有很强的Cre活性，这与已知的视网膜核苷转运蛋白的表达一致(Dos Santos-Rodrigues等，Vitam Horm 98:487-523(2015))，证明了4H2介导的视网膜基因治疗(图9B)。
在已知大量表达核苷转运蛋白的肿瘤和骨骼肌中评估了4H2将mRNA递送到颅外组织的情况。裸鼠皮下H358侧腹肿瘤经瘤内注射DX1+荧光素酶mRNA或4H2+荧光素酶mRNA处理后，通过连续IVIS监测荧光素酶的表达。用DX1+荧光素酶mRNA处理的肿瘤未检测到信号，但4H2+荧光素酶mRNA在6、24和72小时时在肿瘤中产生了强烈而持久的信号(图10A)。肿瘤外没有观察到明显的信号。在另一项实验中，对非荷瘤C57/BL6小鼠进行股四头肌注射4H2+荧光素酶mRNA处理后，可在6小时和24小时时显示出定位于注射的肌肉的荧光素酶信号(图10B)。
实施例12 4H2作为治疗NF2的基因递送载体
通过在坐骨神经中接种表达荧光素酶的HEI193细胞，建立了小鼠异种移植物。17天后，使用IVIS对小鼠进行成像。根据荧光素酶的表达情况，小鼠被分为4组，分别接受生理盐水、单独的4H2、具有携带NF2 cDNA质粒的4H2以及直接注射4H2 mRNA的治疗。第二次治疗在肿瘤接种后第42天进行。肿瘤生长情况由IVIS监测。图11A展示了代表性活体成像(IVIS)图像，图11B为随时间变化的荧光强度曲线图。4H2+DNA和4H2+mRNA与未经处理的对照组和单独使用4H2相比，可减少肿瘤生长，进一步说明了4H2通过递送治疗性核酸治疗疾病的能力。
实施例13：4H2-CD5双特异性抗体片段用于向T细胞靶向递送基因
图12A-12C举例说明了用于向T细胞靶向递送基因的4H2-CD5双特异性抗体片段的设计和使用
4H2序列
VL：
DIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSIISVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1)
VH：
EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTDYYMNWVKQSHGKSLEWIGRVNPSNGGISYNQKFKGKATLTVDKSLSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARGPYTMYYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:5)
CD5序列
VL：
NIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDVGTAVAWYOQKPDQSPKLLIYWTSTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLOPEDIATYFCHQYNSYNTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:23)
VH：
QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQAPGKGLEWVAHIWWDDDVYYNPSLKSRLTITKDASKDQVSLKLSSVTAADTAVYYCVRRRATGTGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:24)
图12A是4H2-CD5双特异性抗体片段的设计示意图。Ai9小鼠模型可通过检测DeRed表达来测量Cre重组酶的递送。向携带MC38肿瘤的Ai9小鼠瘤内注射对照组、4H2+Cre mRNA或4H2-CD5双特异性抗体+Cre mRNA。48小时后，对小鼠进行安乐死。肿瘤被分离并解离成单细胞。用流式细胞术分析肿瘤内的T细胞中DeRed的表达。与对照组或4H2+Cre mRNA相比，经4H2-CD5+Cre mRNA处理的肿瘤中的T细胞显示出更高的DeRed信号。代表性的FACS图如图12B所示，组合分析见图12C。这些实验例证了基于4H2的双特异性抗体片段，其用于通过4H2的细胞穿透和核酸结合特性，结合第二抗体组分(本例中为针对T细胞的CD5)所提供的归巢特异性，将核酸递送至特定细胞的策略。
实施例14 4H2结合并激活toll样受体7(TLR7)
TLR7是细胞内模式识别受体，可识别RNA并启动先天性免疫应答。TLR7对富含GU的RNA反应特别敏感。4H2是抗G自身抗体。实验旨在确定4H2是否以核酸依赖的方式与TLR7相互作用，类似于上述4H2-cGAS相互作用的结果。
用IgG对照或4H2处理的胶质瘤干细胞样细胞(GSC)的细胞裂解物，通过westernblot检测TLR7。代表活化切割TLR7的条带在用4H2处理的细胞中显著增加。代表性印迹如(图13A)所示，用ImageJ测定的相对于IgG对照的切割TLR7含量如(图13B)所示。这些结果表明4H2能诱导TLR7的裂解。
用蛋白G珠从IgG对照或4H2处理的GSC裂解物中拉下抗体和结合蛋白，然后用TLR7进行western blot分析(图13C)。在该试验中，4H2(而非IgG对照)与已切割的TLR7有很强的结合力，这在该试验中从它与4H2的下拉作用中可得到证明。印迹是两个独立实验的代表。这些结果表明4H2与切割的TLR7结合。
由于4H2可同时激活cGAS和TLR7，这就为4H2作为免疫刺激剂的用途增加了另一个层面。已在寻找可用于免疫疗法的TLR7激动剂，但4H2可同时激活cGAS和TLR7，这使它有别于其它只能激活TLR7或cGAS而不能同时激活两者的激动剂。
总结
本研究揭示了狼疮抗GUO自身抗体与cGAS之间以前未知的相互作用。具体来说，细胞穿透性狼疮抗GUO自身抗体4H2可定位到细胞质并避开内体，与核酸结合并将其递送到细胞和组织，激活cGAS，对胶质瘤细胞产生cGAS依赖性毒性，并增加原位GBM模型的存活率。这些发现为在生物技术中应用抗GUO自身抗体提供了机会，并提出了这种抗体有助于cGAS激活和与系统性红斑狼疮(SLE)相关的I型干扰素特征的可能性。
核苷转运抑制剂DP的抑制作用和游离GUO对4H2穿透力的增强表明，4H2的细胞穿透依赖于核苷转运蛋白。与此相一致的是，全身施用的4H2能在释放DNA/核苷的脑肿瘤中定位，但不能在正常脑组织中定位。然而，当4H2与mRNA作为复合物直接注射时，却能将基因递送到正常脑部。同样，4H2/mRNA在眼内注射后可在视网膜和颅外靶组织(包括肿瘤和骨骼肌)中产生局部基因表达。总之，这些发现将4H2的细胞穿透与核苷转运联系起来，并将4H2确立为核酸的非共价细胞质递送配体。
4H2和3E10是从同一个狼疮模型中分离出来的，耐人寻味的是，它们似乎都具有穿透细胞和穿越BBB的核苷转运蛋白依赖机制，但与此同时，它们却定位于完全不同的细胞区室。两者都避开内体和溶酶体，但3E10定位于细胞核，而4H2定位于细胞质。造成这种差异的原因目前尚不清楚，但这或许可以解释为什么与3E10相比，4H2向细胞递送功能性mRNA的能力更强，因为mRNA的翻译是在细胞质而不是细胞核中进行的。
4H2激活cGAS和TLR7的确切机制尚不清楚。可能的机制包括4H2直接结合和激活，或通过cGAS和TLR7、4H2以及细胞质核酸和/或GTP之间的同时相互作用间接结合。总之，4H2具有核苷转运蛋白依赖性的细胞质穿透方法，能够向细胞递送核酸并激活cGAS和TLR7，是一种引人注目的制剂，可用于肿瘤中作为免疫刺激剂，用于基因治疗中作为核酸的非共价细胞质递送配体，以及用于疫苗设计中同时递送基因和激活免疫受体(如cGAS和TLR7)以增强反应。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文引用的文献及其引用的材料均通过引用明确纳入本文。
本领域技术人员将认识到，或只需常规实验就能确定，在此描述的本发明的具体实施例的许多等效物。这些等效物应包括在以下权利要求中。

Claims (91)

1.一种组合物，其包括或由以下组分组成
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)，或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；以及
(b)核酸货物，包括编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中(a)包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ IDNO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中(a)包括与单克隆抗体4H2相同或不同的表位特异性。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中(a)是具有单克隆抗体4H2的抗原结合部位的重组抗体。
5.一种组合物，包括：
(a)结合蛋白，其包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ IDNO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式、
和
(b)核酸货物，其包括编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中(a)是双特异性的。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中(a)靶向目的细胞类型。
8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物，其中(a)和(b)是非共价连接或相关联的。
9.根据根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中(a)和(b)是复合物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中(b)包括DNA、RNA、PNA或其它修饰的核酸，或核酸类似物，或其组合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中(b)包括mRNA。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中(b)包括载体。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述载体包括与表达控制序列可操作连接的编码目的多肽的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述载体是质粒。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中(b)包括编码Cas内切酶、gRNA或其组合的核酸。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中(b)包括编码嵌合抗原受体多肽的核酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中(b)包括功能性核酸。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中(b)包括编码功能性核酸的核酸。
19.根据权利要求17或18所述的组合物，其中所述功能性核酸是反义分子、siRNA、miRNA、适配体、核酶、RNAi或外部引导序列。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中(b)包括多个单一核酸分子。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中(b)包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同的核酸分子。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中(b)包括或由长度在约1至25000个核碱基之间的核酸分子组成。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中(b)包括或由单链核酸、双链核酸或其组合组成。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的组合物，还包括载体DNA。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述载体DNA是非编码DNA。
26.根据权利要求24或25所述的组合物，其中(b)由RNA组成。
27.一种药物组合物，包括权利要求1-26中任一项所述的组合物和药学上可接受的赋形剂。
28.根据权利要求27所述的组合物，还包括包封(a)和(b)复合物的聚合物纳米颗粒。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中靶向部分、细胞穿透肽或其组合与所述纳米颗粒关联、连接、缀合或以其它方式直接或间接地附接在所述纳米颗粒上。
30.一种向细胞递送核酸货物的方法，包括使细胞与有效量的权利要求1-29中任一项所述的组合物接触。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述接触发生在体外。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞是造血干细胞或T细胞。
33.根据权利要求30-32中任一项所述的方法，还包括将所述细胞施用给需要的受试者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞以有效量施用给所述受试者以治疗疾病或病症的一种或多种症状。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述接触在给需要的受试者施用后于体内发生。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述疾病或病症是遗传性疾病、癌症或感染或传染性疾病。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中(b)以有效量递送到所述受试者的细胞中，以减轻所述受试者所述疾病或病症的一种或多种症状。
39.一种制备权利要求1-29中任一项所述组合物的方法，包括在与细胞接触之前，在适当的温度下将(a)和(b)培养和/或混合一定时间，以形成(a)和(b)的复合物。
40.一种制备权利要求1-29中任一项所述组合物的方法，包括孵育和/或混合(a)和(b)约1分钟至约30分钟，约10分钟至约20分钟，或约15分钟，可选地，在室温或37℃。
41.根据权利要求1-40任一项所述的组合物或方法，其中(a)：(b)的比例在1:3至5:1之间，可选地，所述比例为1:1或3:1。
42.一种增加所需受试者细胞中免疫受体活化的方法，包括施用有效量的(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)，或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；可选地，其中所述免疫受体是cGAS或另一种模式识别受体(PRR)，可选地，是toll样受体，可选地，是TLR7。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述受试者患有癌症或感染。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述受试者没有癌症。
45.根据权利要求42-44任一项所述的方法，其中所述受试者有需要愈合的伤口。
46.根据权利要求42-44任一项所述的方法，其中所述受试者有免疫失调，可选地，所述免疫失调是多发性硬化症。
47.根据权利要求42-46任一项所述的方法，还包括给所述受试者(b)施用附加的制剂。
48.根据权利要求47所述的方法，其中(b)选自核酸货物、免疫刺激性核酸、一种或多种疫苗成分、诱导，增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂及其组合。
49.一种治疗癌症或感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的以下组分的组合：
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；以及
(b)可诱导、增加或增强免疫应答的免疫检查点调节剂。
50.根据权利要求48-49任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂诱导针对癌症或感染的免疫应答。
51.根据权利要求48-50任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂减少免疫抑制通路。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述免疫抑制通路是PD-1通路。
53.根据权利要求48-52任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂选自由PD-1拮抗剂、PD-1配体拮抗剂和CTLA4拮抗剂组成的组。
54.根据权利要求48-50任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂增加免疫激活途径。
55.根据权利要求48-54中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是抗体。
56.根据权利要求48-54中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是CAR-T细胞。
57.根据权利要求48-54中任一项所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是溶瘤病毒。
58.一种治疗癌症或感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的以下组分的组合
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选地，选自单价、二价或多价单链可变片段(scFv)，或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；和
(b)免疫刺激性核酸。
59.根据权利要求48或58所述的方法，其中所述免疫刺激性核酸是STING激动剂。
60.一种给受试者接种疫苗的方法，包括给受试者注射
(a)完整的4H2单克隆抗体或其细胞穿透性片段，可选单价、二价或多价单链可变片段(scFv)或双特异性抗体片段；或其人源化形式、其嵌合形式或其变体；以及
(b)一种或多种疫苗成分。
61.根据权利要求48或60所述的方法，其中所述一种或多种疫苗成分包括抗原、编码抗原的核酸、佐剂、编码佐剂的核酸或其组合。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述抗原来源于细菌或病毒。
63.根据权利要求48-62中任一项所述的方法，其中与通过在没有(a)或(b)的情况下，施用(a)或(b)相比，施用(a)和(b)的组合使癌症或感染的一种或多种症状的减轻超过加和。
64.根据权利要求48-63中任一项所述的方法，其中(a)在对所述受试者施用(b)之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18或24小时，1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3或4周，或其任何组合，向所述受试者施用(a)。
65.根据权利要求48-63中任一项所述的方法，其中在对所述受试者施用(a)之前1、2、3、4、5、6、8、10、12、18或24小时，1、2、3、4、5、6或7天，1、2、3或4周，或其任何组合，向所述受试者施用(b)。
66.根据权利要求42-65中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用一种或多种附加的活性剂，所述活性剂选自由化疗剂、抗感染剂及其组合组成的组。
67.根据权利要求42-66中任一项所述的方法还包括手术或放射治疗。
68.根据权利要求42-67中任一项所述的方法，包括核酸货物。
69.根据权利要求68所述的方法，其中(a)和所述核酸货物在复合物中。
70.根据权利要求68或69所述的方法，其中(b)是所述核酸货物，可选地，其中所述核酸货物由DNA、RNA、PNA、PMO、或其它修饰的核酸、或核酸类似物、或其组合组成。
71.根据权利要求68或69所述的方法，其中(b)不是所述核酸货物。
72.根据权利要求42-71任一项所述的方法，其中(a)包括
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR和分别包括SEQID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链，和包括与SEQID NO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
73.根据权利要求42-72中任一项所述的方法，其中(a)包括与单克隆抗体4H2相同或不同的表位特异性。
74.根据权利要求42-73中任一项所述的方法，其中(a)是具有单克隆抗体4H2的抗原结合部位的重组抗体。
75.根据权利要求42-74中任一项所述的方法，其中(a)包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ IDNO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
76.根据权利要求42-75中任一项所述的方法，其中(a)是双特异性的。
77.根据权利要求76所述的方法，其中(a)靶向目的细胞类型。
78.一种药物组合物，包括权利要求48-77任一项所述的(a)和(b)以及药学上可接受的赋形剂。
79.根据权利要求78所述的药物组合物，包括核酸货物。
80.根据权利要求79所述的药物组合物，其中(b)是所述核酸货物。
81.根据权利要求79所述的药物组合物，其中(b)不是所述核酸货物。
82.根据权利要求79-81所述任一项的药物组合物，其中(a)和所述核酸货物在复合物中。
83.根据权利要求82所述的药物组合物，还包括包封(a)、(b)、所述核酸货物或其组合的聚合物纳米颗粒。
84.根据权利要求78-83中任一项所述的药物组合物，其中靶向部分、细胞穿透肽或其组合与(a)、(b)、所述核酸货物、所述纳米颗粒或其组合直接或间接相关联、连接、融合、缀合或以其它方式附接。
85.一种组合物，包括
(a)一种双特异性结合蛋白，包括：
(i)SEQ ID NO:5的CDR与SEQ ID NO:1的CDR组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:6-8氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQID NO:2-4氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(ai)或(aii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:5至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与SEQ IDNO:1至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式，和
与免疫细胞标记物结合的结合结构域。
86.根据权利要求85所述的组合物，其中免疫细胞标记物是CD5。
87.根据权利要求86所述的组合物，其中与CD5结合的结合结构域包括
(vi)SEQ ID NO:24的CDR与SEQ ID NO:23的CDR的组合；
(vii)分别包括SEQ ID NO:25-27氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR与分别包括SEQ ID NO:28-30氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(viii)(iv)或(iiv)的人源化形式；
(ix)包括与所述SEQ ID NO:24至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链和包括与所述SEQ ID NO:23至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(x)(ix)的人源化形式。
88.根据权利要求85-87任一项所述的组合物，包括
(b)核酸货物，包括编码多肽的核酸、功能性核酸、编码功能性核酸的核酸或其组合。
89.一种增加有需要的受试者的免疫应答的方法，包括给受试者施用有效量的权利要求85-88任一项所述的组合物。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述受试者患有癌症或感染。
91.一种结合蛋白，可选地，是抗体，包括
(i)SEQ ID NO:24的CDR与SEQ ID NO:23的CDR的组合；
(ii)分别包括SEQ ID NO:25-27氨基酸序列的第一、第二和第三重链CDR和分别包括SEQ ID NO:28-30氨基酸序列的第一、第二和第三轻链CDR的组合；
(iii)(i)或(ii)的人源化形式；
(iv)包括与SEQ ID NO:24至少有85％序列同一性的氨基酸序列的重链，和包括与SEQID NO:23至少有85％序列同一性的氨基酸序列的轻链的组合；或
(v)(iv)的人源化形式。
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