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CN120603841A - 用于改变植物避荫性的方法和组合物 - Google Patents

用于改变植物避荫性的方法和组合物

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CN120603841A
CN120603841A CN202480007942.4A CN202480007942A CN120603841A CN 120603841 A CN120603841 A CN 120603841A CN 202480007942 A CN202480007942 A CN 202480007942A CN 120603841 A CN120603841 A CN 120603841A
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plant
pif
gene
seq
sequence
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CN202480007942.4A
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B·C·W·克劳福德
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Pairing Plant Service Co ltd
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Abstract

本发明涉及用于修饰植物中的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子基因以抑制避荫响应的组合物和方法。本发明进一步涉及使用本发明的方法和组合物产生的植物和植物部分。

Description

用于改变植物避荫性的方法和组合物
关于序列表的电子文件的声明
标题为1499-122_ST26.xml、大小为405,907字节、于2024年1月30日生成并随附提交的XML格式的序列表特此通过引用并入到本说明书中以用于其公开。
技术领域
本发明涉及用于修饰植物中的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子基因以抑制避荫响应的组合物和方法。本发明进一步涉及使用本发明的方法和组合物产生的植物和植物部分。
优先权声明
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2023年2月16日提交的美国临时申请第63/485,263号的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
避荫响应(SAR)是对可用光的质量或数量下降的响应(Kebrom和Brutnell,《实验植物学杂志(J Exp Bot)》58:3079-3089(2007))，其中植物试图通过向资源(主要是光)生长来胜过邻近植物。植物过度拥挤可能产生其中植物缺乏活力和产量下降的避荫综合征(SAS)。避荫涉及在植物的环境中存在的红光与远红光的相对比例(Ballare等人《科学(Science)》,247:329-332(1990))。植物吸收大部分可用的红光，但反射远红光，包括将这种光反射到附近的植物上。当植物在其环境中检测到持续的远红光时，所述植物将经历形态和生理响应。这些响应可以包括分枝减少、植物高度增加、叶片面积减小、生长素重新分配、乙烯产生增加和开花加速。SAS的特征在于根/冠比增加、植物高度增加以及单株植物产量降低。在典型的单一栽培作物环境中，通过避荫进行的植物间竞争被认为是一种浪费的生存机制。
需要用于调节植物中的避荫响应的新策略来改善作物性能。
发明内容
本发明的一方面提供了一种植物或其部分，所述植物或其部分包含在编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因中的至少一个突变，其中所述突变破坏所述PIF转录因子与所述植物或其部分中的DNA的结合，任选地其中所述突变可以是非天然突变。
本发明的第二方面提供了一种植物细胞，其包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)CRISPR-Cas相关效应蛋白；以及(b)向导核酸(gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，所述向导核酸具有间隔子序列，所述间隔子序列与编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性靶基因具有互补性。
本发明的第三方面提供了一种植物细胞，其包含在光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变，其中所述突变是使用包含与编码所述PIF转录因子的内源性PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域的编辑系统引入到所述内源性PIF基因中的取代、插入和/或缺失，其中所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中所述突变可以是非天然突变。
本发明的第四方面提供了一种提供多株植物的方法，当所述多株植物中的每株植物在种植区中彼此紧邻种植时，所述多株植物具有增加的产量，所述方法包含将两株或更多株本发明的植物彼此紧邻种植，由此提供与彼此紧邻种植的多株对照植物相比具有增加的产量的多株植物。
在第五方面，提供了一种生产/培育不含转基因的经基因组编辑的植物的方法，所述方法包含：(a)使本发明的植物与不含转基因的植物杂交，由此将突变引入到所述不含转基因的植物中；以及(b)选择包含所述突变但不含转基因的子代植物，由此产生不含转基因的经基因组编辑的植物。
在第六方面，提供了一种在植物中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中产生突变的方法，所述方法包含：(a)将基因编辑系统靶向到所述PIF基因的一部分，所述部分包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；以及(b)选择包含位于所述PIF基因的区中的修饰的植物，所述区与SEQID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者具有至少80％序列同一性，任选地其中所述突变可以是非天然突变。
在第七方面，提供了一种在光敏色素相互作用因子(PIF)多肽中产生变化的方法，所述方法包含：将编辑系统引入到植物细胞中，其中所述编辑系统靶向到编码所述PIF多肽的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因的区，以及使所述内源性PIF基因的所述区与所述编辑系统接触，由此将突变引入到所述内源性PIF基因中并在所述植物细胞的所述PIF多肽中产生变化。
第八方面提供了一种检测植物中的突变体PIF基因(内源性PIF基因中的突变)的方法，所述方法包含在所述植物的基因组中检测PIF基因，所述PIF基因具有在与SEQ IDNO:75-112中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区内的至少一个突变。
第九方面提供了一种用于编辑植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包含以位点特异性方式切割所述植物细胞中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点，所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此在所述植物细胞的所述内源性PIF基因中产生编辑。
在第十方面，提供了一种用于制备植物的方法，所述方法包含：(a)使包含编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因的植物细胞群体与靶向到所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接至与所述内源性基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性基因(i)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(iv)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区；(b)从所述群体中选择植物细胞，所述植物细胞包含所述编码PIF转录因子的内源性基因中的突变，其中所述突变是(iii)或(iv)的多肽中的或由(i)或(ii)的核苷酸序列中的任一者编码的多肽中的至少一个氨基酸残基的取代，其中所述突变修饰所述PIF转录因子的bHLH结构域；以及(c)使所选植物细胞生长成包含所述编码PIF转录因子的内源性基因中的所述突变的植物。
在第十一方面，提供了一种用于减少/抑制植物中的避荫响应的方法，所述方法包含：(a)使包含编码PIF转录因子的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因的植物细胞与靶向到所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接至与所述内源性PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性PIF基因：(i)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(iv)编码与SEQID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此产生包含在所述编码PIF多肽的内源性PIF基因中的突变的植物细胞；以及(b)使所述植物细胞生长成植物，由此减少/抑制所述植物中的所述避荫响应。
在第十二方面，提供了一种用于产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含具有在内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的突变的至少一个细胞(例如，一个或多个细胞)，所述方法包含使所述植物或其部分中的所述内源性PIF基因内的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的所述核酸结合结构域与所述内源性PIF基因内的靶位点结合，其中所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此产生植物或其部分，所述植物或其部分包含具有在所述内源性PIF基因中的突变的至少一个细胞。
在第十三方面，提供了一种产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含在光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变，所述方法包含使所述植物或其部分中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的所述核酸结合结构域与所述内源性PIF基因内的所述靶位点结合，其中所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此产生植物或其部分，所述植物或其部分具有含有经修饰的bHLH结构域的经突变的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子。
在第十四方面，提供了一种用于修饰植物或其部分中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)以减少/抑制所述植物或其部分中的避荫响应的方法，所述方法包含修饰所述植物或其部分中的内源性PIF基因内的靶位点，其中所述内源性PIF基因(a)包含与SEQ IDNO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ IDNO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此修饰所述内源性PIF基因并且减少/抑制所述植物或其部分中的避荫响应。
在第十五方面，提供了一种向导核酸，其与编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因内的靶位点结合，所述内源性基因包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；或编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或所述靶位点包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者的具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；或编码与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
另外的方面提供了一种系统，其包含本发明的向导核酸以及与所述向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白。
另一方面，提供了一种基因编辑系统，其包含与向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述向导核酸包含与光敏色素相互作用因子(PIF)基因结合的间隔子序列。
另外的方面提供了一种复合物，其包含包括切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白和向导核酸，其中所述向导核酸与光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合，所述PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，其中所述切割结构域切割所述PIF基因中的靶链。
在另外的方面，提供了一种表达盒，其包含(a)编码包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，以及(b)向导核酸，所述向导核酸与光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合，其中所述向导核酸包含间隔子序列，所述间隔子序列与所述PIF基因内的所述靶位点互补并且与所述靶位点结合，所述PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区。
另外的方面提供了一种核酸，其编码如本文所述的包含经突变的bHLH结构域的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子，和/或一种核酸，其包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
本文还提供了一种如本文所述进行修饰的PIF多肽。在一些实施例中，经修饰的PIF多肽包含与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
进一步提供了通过本发明的方法产生并且在其基因组中包含一个或大于一个经突变的PIF基因的植物、植物细胞和植物部分；以及用于制备本发明的植物、植物细胞和/或植物部分的多肽、多核苷酸、核酸构建体、表达盒和载体。
本发明的这些和其它方面在下面的本发明的描述中更详细地阐述。
序列的简要说明
SEQ ID NO:1-17是可用于本发明的示例性Cas12a氨基酸序列。
SEQ ID NO:18-20是可用于本发明的示例性Cas12a核苷酸序列。
SEQ ID NO:21-22是编码启动子和内含子的示例性调控序列。
SEQ ID NO:23-29是可用于本发明的示例性胞嘧啶脱氨酶序列。
SEQ ID NO:30-40是可用于本发明的示例性腺嘌呤脱氨酶氨基酸序列。
SEQ ID NO:41是可用于本发明的示例性尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)序列。
SEQ ID NO:42-44提供了可用于本发明的示例肽标签和亲和多肽。
SEQ ID NO:45-55提供了可用于本发明的示例性RNA募集基序和对应亲和多肽。
SEQ ID NO:56-57是可用于本发明的示例性Cas9多肽序列。
SEQ ID NO:58-68是可用于本发明的示例性Cas9多核苷酸序列。
SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:72是示例PIF3基因组序列。
SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:78是示例PIF4基因组序列。
SEQ ID NO:81是示例PIF5基因组序列。
SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:73是示例PIF3 cDNA序列。
SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79是示例PIF4 cDNA序列。
SEQ ID NO:82是示例PIF5 cDNA序列。
SEQ ID NO:71是由SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70编码的示例PIF3多肽序列。
SEQ ID NO:74是由SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73编码的示例PIF3多肽序列。
SEQ ID NO:77是由SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76编码的示例PIF4多肽序列。
SEQ ID NO:80是由SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79编码的示例PIF4多肽序列。
SEQ ID NO:83是由SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82编码的示例PIF5多肽序列。
SEQ ID NO:84-112是来自PIF多核苷酸(SEQ ID NO:84-87(PIF3)、SEQ ID NO:88-91(PIF3)、SEQ ID NO:92-95(PIF4)、SEQ ID NO:96-108(PIF4)、SEQ ID NO:109-112(PIF5))的示例核酸序列(区)。
SEQ ID NO:113是来自PIF转录因子的示例区。
SEQ ID NO:114-119是可用于本发明的用于核酸向导的示例间隔子序列。
SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和135是如本文所述编辑的示例经突变的PIF基因组序列。
SEQ ID NO:121、123、125、127和131是示例经突变的PIF多肽。
SEQ ID NO:136是从SEQ ID NO:78缺失以产生经突变的核酸序列SEQ ID NO:132的11个连续核苷酸的一部分。
SEQ ID NO:137是从SEQ ID NO:78缺失以产生经突变的核酸序列SEQ ID NO:134的10个连续核苷酸的一部分。
具体实施方式
现在将在下文中参考以下实例来描述本发明，在以下实例中示出了本发明的实施例。此描述并不旨在成为可实施本发明的所有不同方式或者可添加到本发明中的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例示出的特征可并入到其它实施例中，并且关于特定实施例示出的特征可从所述实施例中删除。因此，本发明设想在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。此外，对于本领域技术人员来说，根据本公开，对本文提出的各个实施例的许多变化和添加将是显而易见的，这些变化和添加不背离本发明。因此，以下描述旨在示出本发明的一些特定实施例，而不是详尽地说明其所有排列、组合和变化。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本发明的描述中使用的术语仅仅是为了描述特定实施例的目的，并非旨在限制本发明。
本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用以其整体并入本文，以用于与其中呈现参考文献的句子和/或段落相关的教导。
除非上下文另外指出，否则具体意在本文描述的本发明的各种特征可以以任何组合使用。此外，本发明还设想在本发明的一些实施例中，可排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。为了说明，如果说明书陈述了组合物包含组分A、B和C，则具体意在A、B或C中的任一者或其组合可单独地或以任何组合的形式被省略和放弃。
如在本发明和所附权利要求的描述中所使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文清楚地另外指出。
同样如本文所使用的，“和/或”是指并且涵盖相关所列项中的一个或多个项的任何和所有可能的组合，以及当以替代形式(“或”)解释时组合的缺少。
如本文所用的术语“约”当指可测量值如量或浓度等时，意在涵盖指定值的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化以及指定值。例如，“约X”，其中X是可测量值，意在包括X以及X的±10％、±5％、±1％、±0.5％或甚至±0.1％的变化。本文提供的可测量值的范围可包括其中的任何其它范围和/或单个值。
如本文所用，如“在X和Y之间”和“在约X和Y之间”的短语应当解释为包括X和Y。如本文所用，如“在约X和Y之间”的短语是指“在约X和约Y之间”，并且如“从约X至Y”的短语是指“从约X至约Y”。
除非本文另外指出，本文中数值范围的列举仅旨在用作单独提及落入所述范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入到说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。例如，如果公开了范围10至15，则也公开了11、12、13和14。
如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”指定存在所陈述的特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其组。
如本文所用，过渡短语“大体上由……组成”意指权利要求的范围应被解释为涵盖权利要求中所列举的指定材料或步骤以及对要求保护的发明的基本和新颖特性没有实质性影响的材料或步骤。因此，当用在本发明的权利要求中时，术语“基本上由…组成”不旨在被解释为等同于“包含”。
如本文所用，术语“增加(increase)”、“增加(increasing)”、“增加(increased)”、“增强(enhance)”、“增强(enhanced)”、“增强(enhancing)”和“增强(enhancement)”(及其语法变体)描述了与对照相比，至少约15％、20％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。
如本文所用，术语“减少(reduce)”、“减少(reduced)”、“减少(reducing)”、“减少(reduction)”、“减小”和“降低”(及其语法变体)描述，例如，与对照相比，至少约5％、10％、15％、20％、25％、35％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％的减少。在一些实施例中，所述减少可以产生没有或基本上没有(即，微乎其微的量，例如，小于约10％或甚至5％)可检测的活性或量。
“对照植物”通常是与经编辑的植物相同的植物，但是对照植物未被类似地编辑，并且因此缺乏突变。对照植物可以是等基因植物和/或野生型植物。因此，对照植物与如本文所述的突变渗入其中的受试植物可以是相同的培育种系、品种或栽培品种，但是对照培育种系、品种或栽培品种不含突变。在一些实施例中，本发明的植物与对照植物之间的比较是在相同的生长条件下，例如相同的环境条件(土壤、水合作用、光、热、养分等)下进行的。
如本文所用，关于核酸分子和/或核苷酸序列(例如，RNA或DNA)的术语“表达(express)”、“表达(expresses)”、“表达(expressed)”或“表达(expression)”等表示核酸分子和/或核苷酸序列被转录并且任选地被翻译。因此，核酸分子和/或核苷酸序列可以表达所关注的多肽或例如功能性未经翻译的RNA。
如本文所用，术语“异源”是指源自于外来物种的核苷酸/多肽，或者在来自于同一物种的情况下，是基本上在组合物和/或基因组基因座中通过有意的人为干预从其天然形式修饰的。“异源”或“重组”核苷酸序列是与其所引入到的宿主细胞不天然缔合的核苷酸序列，包括天然存在的核苷酸序列的非天然存在的多个拷贝。
“天然”或“野生型”核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源性核酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。因此，例如,“野生型mRNA”是天然存在于参考生物中或对于参考生物具有内源性的mRNA。
如本文所用，术语“杂合的”是指其中不同等位基因位于同源染色体上的对应基因座处的遗传状态。
如本文所用，术语“纯合”是指其中相同的等位基因驻留在同源染色体上的对应基因座处的基因状态。
如本文所用，术语“等位基因”是指出现在特定基因座处的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列之一。
“无效等位基因”是由基因突变引起的非功能性等位基因，所述基因突变导致完全不产生对应蛋白质或产生非功能性的蛋白质。
“敲除突变”是这样的突变，其导致无功能蛋白质，但其可能具有可检测的转录物或蛋白质。
“隐性突变”是当纯合时产生表型，但当基因座杂合时表型不可观察到的基因突变。
“显性突变”是在存在基因的非突变拷贝的情况下产生突变体表型的基因突变。显性突变可以是功能丧失或功能获得突变、亚效等位基因突变、超等位基因突变或弱功能丧失或弱功能获得。
“显性负性突变”是产生改变的基因产物(例如，相对于野生型具有异常功能)的突变，所述基因产物不利地影响野生型等位基因或基因产物的功能。例如，“显性负性突变”可以阻断野生型基因产物的功能。显性负性突变还可以被称为“反效等位基因突变”。
“半显性突变”是指其中杂合生物体中的表型的外显度小于纯合生物体所观察到的表型的外显度的突变。
“弱功能丧失型突变”是产生与野生型基因产物相比具有部分功能或功能降低(部分失活)的基因产物的突变。
“亚效等位基因突变”是使基因功能部分丧失但功能/活性未完全丧失的突变，所述部分丧失可以通过表达减少(例如，蛋白质减少和/或RNA减少)或功能性能降低(例如，活性降低)而发生。“亚效”等位基因是由基因突变引起的半功能性等位基因，其会产生以介于正常效率的1％与99％之间的任何水平起作用的对应蛋白质。
“超效等位基因突变”是使基因产物的表达增加和/或基因产物的活性增加的突变。
“功能获得型”等位基因或突变是赋予经编码的基因产物新功能和/或赋予新基因表达模式的突变。在一些实施例中，功能获得型突变可以是显性的或半显性的。
如本文所用,“非天然突变”是指通过人为干预产生并且不同于存在于相同基因中的自然发生的突变(例如，天然存在的，并且不是人类进行的修饰的结果)的突变。
“基因座”是染色体上的其中基因或标志物或等位基因所位于的位置。在一些实施例中，基因座可以涵盖一个或多个核苷酸。
如本文所用，术语“所期望的等位基因”、“靶等位基因”和/或“所关注的等位基因”可互换使用，以指代与所期望的性状相关的等位基因。在一些实施例中，所需等位基因可与给定性状的增加或减少(相对于对照)相关，这取决于所需表型的性质。在本发明的一些实施例中，短语“所需等位基因”、“靶等位基因”或“所关注的等位基因”是指相对于不具有一个或多个靶等位基因的对照植物，在非水胁迫条件下与植物的产量增加相关的等位基因。
当性状与标记连锁时，并且当所述标记的存在是包含所述标记的植物/种质中是否和/或以何种程度出现所需性状或性状形式的指示时，所述标记与所述性状“相关”。类似地，当标志物与等位基因或染色体区间有关时，并且当所述标志物的存在是所述等位基因或染色体区间是否存在于包含所述标志物的植物/种质中的指示时，所述标志物与所述等位基因或染色体区间“相关联”。
如本文所用，术语“回交(backcross)”和“回交(backcrossing)”是指子代植物与其亲本之一回交一次或多次(例如，1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次等)的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有要渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人标记辅助回交：具体实例(Marker-assisted Backcrossing:APractical Example),于《分子标记物的技术和用途(TECHNIQUES ET UTILISATIONS DESMARQUEURS MOLECULAIRES LES COLLOQUES)》,第72卷,第45-56页(1995)；以及Openshaw等人,回交培育中的标记辅助选择(Marker-assisted Selection in Backcross Breeding),于《“分子标记数据分析研讨会”的论文集(PROCEEDINGS OF THE SYMPOSIUM“ANALYSIS OFMOLECULAR MARKER DATA”)》,第41-43页(1994)。初始的杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，依此类推。
如本文所用，术语“杂交(cross)”或“杂交(crossed)”是指通过授粉融合配子而产生子代(例如，细胞、种子或植物)。所述术语涵盖有性杂交(一株植物对另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自同一植物时)。术语“杂交(crossing)”是指通过授粉融合配子而产生子代的行为。
如本文所用，术语“基因渗入(introgression)”、“基因渗入(introgressing)”和“基因渗入(introgressed)”是指一个或多个遗传基因座的所需等位基因或所需等位基因的组合从一种遗传背景到另一种遗传背景的天然和人工传递。例如，指定基因座处的所需等位基因可通过同一物种的两个亲本之间的有性杂交传递给至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。另选地，例如，等位基因的传递可通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需等位基因。所需等位基因可以是标志物、QTL、转基因等的所选等位基因。包含所需等位基因的子代可与具有所需遗传背景的品系回交一次或多次(例如，1次、2次、3次、4次或更多次)，选择所需等位基因，结果是所需等位基因被固定在所需遗传背景中。例如，与非水胁迫条件下产量提高相关的标志物可从供体渗入到不包含所述标志物并且在非水胁迫条件下不表现出产量提高的轮回亲本中。然后可将所得子代回交一次或多次并进行选择，直到子代拥有与轮回亲本背景中非水胁迫条件下产量提高相关的遗传标志物为止。
“遗传图谱”是对给定物种内一个或多个染色体上的基因座之间遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描绘。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离是通过其之间的重组频率来测量的。可使用多种标志物来检测基因座之间的重组。遗传图谱是作图群体、所用标志物类型以及不同群体之间每个标志物的多态性潜力的产物。基因座之间的顺序和遗传距离可因遗传图谱而异。
如本文所用，术语“基因型”是指个体(或个体群体)在一个或多个遗传基因座处的遗传构成，与可观察和/或可检测和/或表现的性状(表型)形成对比。基因型是由个体从其亲本遗传的一个或多个已知基因座的等位基因定义的。术语基因型可用于指代个体在单个基因座、多个基因座处的遗传构成，或更一般地，术语基因型可用于指代个体基因组中所有基因的遗传组成。基因型可例如使用标记来间接表征和/或通过核酸测序来直接表征。
如本文所用，术语“种质”是指个体(例如，植物)、一组个体(例如，植物品系、品种或科)或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质，或来自个体(例如，植物)、一组个体(例如，植物品系、品种或科)或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分或者可以与生物体或细胞分开。一般来说，种质提供具有特定遗传组成的遗传物质，为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传品质提供基础。如本文所用，种质包括可生长新植物的细胞、种子或组织，以及可培养成完整植物的植物部分(例如，叶、茎、芽、根、花粉、细胞等)。
如本文所用，术语“栽培品种”和“品种”是指通过结构或遗传特征和/或性能可与同一物种内的其它品种区分开的一组相似植物。
如本文所用，术语“外来”、“外来品系”和“外来种质”是指非优良的任何植物、品系或种质。一般来说，外来植物/种质并非源自任何已知的优良植物或种质，而是被选择以将一个或多个所需遗传元件引入培育计划中(例如，将新的等位基因引入培育计划中)。
如本文所用，术语“杂交体”在植物培育的上下文中是指通过使不同品系或品种或物种的植物杂交(包括但不限于两个近交系之间的杂交)而产生的遗传上不同的亲本的子代的植物。
如本文所用，术语“近交系”是指基本上纯合的植物或品种。所述术语可指在整个基因组中基本上纯合的植物或植物品种，或者关于特别所关注的基因组的一部分基本上纯合的植物或植物品种。
“单倍型”是个体在多个遗传基因座处的基因型，即等位基因的组合。通常，定义单倍型的遗传基因座在物理上和遗传上是连锁的，即在相同的染色体片段上。术语“单倍型”可指特定基因座(如单个标志物基因座)处的多态性，或者沿着染色体片段的多个基因座处的多态性。
如本文所用，“避荫响应”被定义为植物响应于低红光:远红光(R:FR)比率经历的某种生长习惯。对避荫响应的抑制是指植物响应于低R:FR光比率表现出的生长变化的抑制或减少。在一个方面，可以通过测量在低R:FR光比率的受控环境中包含本发明的性状(例如，如本文所述的经突变的PIF转录因子)的植物和不含所述性状的等基因植物的高度来显示对避荫响应的抑制。当在存在0.16的R:FR比率的情况下在相同条件下生长时，包含本发明的性状的植物将比不包含所述性状的等基因植物(例如，在胚芽鞘、V1鞘或V2鞘测量的高度)矮至少5％(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150％或更矮或其中的任何范围或值；例如矮约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25％至约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150％或更矮)(例如，矮约5％至约10％、矮约5％至约15％、矮约5％至约20％、矮约5％至约25％、矮约5％至约30％、矮约5％至约40％、矮约5％至约50％、矮约10％至约20％、矮约10％至约30％、矮约10％至约50％、矮10％至约70％、矮约15％至约20％、矮约15％至约30％、矮15％至约50％、矮约20％至约30％、矮约20％至约50％、矮约20％至约70％、矮约40％至约50％、矮约40％至约60％、矮约40％至约80％、矮约40％至约100％、矮约50％至约70％、矮约50％至约100％、矮约50％至约125％、矮约75％至约100％、矮约75％至约120％、矮约75％至约140％等)。
表现出SAR的植物显示出下胚轴和节间过度伸长、较长的叶、窄叶、受损的根生长、早期开花和减少的种子集、低光合作用效率、增强的绿色对齐、高倒伏率、加速的衰老、减少的籽粒灌浆；以及疾病和草本响应机制的主动抑制。与不包含SAR减少的植物相比，其中如本文所述SAR减少的植物可能具有增加的产量。如本文所用，“增加的产量”是指与生长相关的任何植物性状，例如生物量、产量、氮利用效率(NUE)、花序大小/重量、果实产量、果实品质、果实大小、种子大小、种子数、叶组织重量、结瘤数、结瘤质量、结瘤活性、种穗数、分蘖数、花数、块茎数、块茎质量、球茎质量、种子数、种子总质量、出叶率、分蘖出现率、出苗率、根长、根数、根群的大小和/或重量或其任何组合。因此，在一些方面，“增加的产量”可以包括但不限于与对照植物或其部分(例如，生长在低R:FR光比率的环境(例如，避荫环境；例如，约0.16的R:FR比率)中的不包含编码如本文所述的PIF转录因子的经突变的内源性核酸的植物，包括在与其它植物紧邻生长时)相比，增加的花序产生、增加的果实产量(例如，增加的果实的数量、重量和/或大小；例如，增加的例如玉米的穗的数量、重量和/或大小)、增加的果实品质、增加的根的数量、大小和/或重量、增加的分生组织大小、增加的种子大小、增加的生物量和/或提高的氮利用效率。在一些方面，增加的产量可表示为单位土地面积生产的籽粒(例如，每英亩土地的蒲式耳)的数量。
“种子重量”由如种子长度、种子宽度和种子厚度以及籽粒灌浆等籽粒形态性状共同确定，并且这些性状全部由定量遗传学控制。
如本文所用,“高度降低”意指响应于丰富的远红光抑制茎伸长。因此，例如，如与不包含突变并且也在避荫条件下生长的对照植物相比，具有如本文所述的PIF基因中的突变的植物在避荫条件下生长时表现出降低的高度。
如本文所用，“降低的冠:根比”意指地上生物量相对于地下生物量的比例的降低。因此，例如，如与不包含突变并且也在避荫条件下生长的对照植物相比，具有如本文所述的PIF基因中的突变的植物在避荫条件下生长时表现出降低的冠:根比。
如本文所用，“增加的直立生长”意指与也经历避荫的没有突变的对照植物相比，具有如本文所述的PIF基因中的突变的植物在经历避荫时(如在以高密度种植时)继续直立生长，而不是在光的方向上“倾斜”或生长。直立生长增加的植物比对照植物生长得更垂直。
如本文所用，“开花时间基本上没有变化”意指如与经历避荫的对照植物(不包含突变)相比，具有如本文所述的PIF基因中的突变的植物在经历避荫时，如在以高密度种植时，所述植物保持其正常开花时间。
与不包含(缺乏)至少一个内源性PIF基因中的修饰的植物相比，其中至少一个(例如，一个或多个，例如，1、2、3或4个或更多个)内源性PIF基因如本文所述进行修饰(例如，包含如本文所述的修饰)的植物可以具有经改善的产量性状。如本文所用，“经改善的产量性状”是指与生长相关的任何植物性状，例如生物量、产量、氮利用效率(NUE)、花序大小/重量、果实产量、果实品质、果实大小、种子大小(例如，种子面积、种子大小)、种子数量、叶组织重量、生节数量、生节质量、生节活性、种子头数量、分蘖数量、分枝数量、花数量、块茎数量、块茎质量、球茎质量、种子数量、种子总质量、出叶率、分蘖/分枝出现率、出苗率、根长度、根数量、根群的大小和/或重量或其任何组合。在一些方面，“经改善的产量性状”可以包括但不限于与对照植物或其部分(例如，不包含如本文所述的经突变的内源性PIF核酸的植物)相比，增加的花序产生，增加的果实产量(例如，增加的果实的数量、重量和/或大小；例如，增加的例如玉米的穗的数量、重量和/或长度)，增加的果实品质、增加的根的数量、大小和/或重量、增加的分生组织大小、增加的种子大小(例如，种子面积和/或种子重量)、增加的生物量、增加的叶大小、提高的氮利用效率、增加的高度、增加的节间数量和/或增加的节间长度。在一些方面中，经改善的产量性状可表示为单位土地面积生产的籽粒/种子的数量(例如，每英亩土地的蒲式耳数)。在一些实施例中，一个或多个经改善的产量性状可以是增加的籽粒行数，任选地不减少穗长。
如本文所用，“对照植物”意指不含有如本文所述的经编辑的PIF基因的植物。对照植物用于鉴定和选择如本文所述编辑的植物，其与对照植物相比具有增强的性状或改变的表型。合适的对照植物可以是用于产生包含经突变的PIF基因的植物的亲本品系植物，例如，缺乏如本文所述的内源性PIF基因中的编辑的野生型植物。合适的对照植物也可以是含有赋予其它性状的重组核酸的植物，例如，除草剂耐受性增强的转基因植物。在一些情况下，合适的对照植物可以是缺乏如本文所述的经突变的PIF基因的杂合或半合转基因植物品系的子代(包括籽粒重量)，与对照植物或其部分相比，具有增加的籽粒行数(任选地其中穗长基本上不减少)、增加的荚的数量、增加的每荚的种子数量和增加的穗长。
如本文所用，“性状”是植物或特定植物材料或细胞的生理学、形态学、生物化学或物理特性。在一些情况下，此特性是人眼可见的并且可机械地测量，如种子或植物的大小、重量、形状、形态、长度、高度、生长速率和发育阶段，或者可通过生物化学技术测量，如检测种子或叶的蛋白质、淀粉、某些代谢物或油含量，或通过观察代谢或生理过程，例如，通过测量对缺水或特定盐或糖浓度的耐受性，或通过测量一个或多个基因的表达水平，例如，通过采用Northern分析、RT-PCR、微阵列基因表达阵列或报告基因表达系统，或通过农业观察如高渗胁迫耐受性或产量。然而，任何技术都可用来测量转基因植物中任何所选化学化合物或大分子的量、比较水平或差异。
如本文所用，“增强的性状”意指由如本文所述的PIF基因中的突变引起的植物的特征。此类性状包括但不限于增强的农艺性状，所述增强的农艺性状的特征在于植物形态学、生理学、生长和发育、产量增强、营养增强、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐受性。在一些实施例中，增强的性状/改变的表型可以是，例如，减少的从种植到成熟的天数、增加的茎大小、增加的叶数、增加的营养阶段株高生长速率、增加的穗大小、增加的每株植物穗干重、增加的每穗籽粒数、增加的每籽粒重量、增加的每株植物籽粒数、减少的穗空粒、延长的灌浆期、降低的株高、增加的根分枝数量、增加的总根长、耐旱性、提高的水利用效率、耐寒性、提高的氮利用效率和/或增加的产量。在一些实施例中，性状是在非胁迫条件下增加的产量或在环境胁迫条件下增加的产量。胁迫条件可以包括生物胁迫和非生物胁迫，例如，干旱、避荫、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫侵扰、线虫侵扰、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、氮养分利用度降低、磷养分利用度降低和高植物密度。“产量”可受到许多特性的影响，包括但不限于植物高度、植物生物量、荚果数量、植物上的荚果位置、节间数量、荚果破碎发生率、谷粒大小、穗大小、穗尖灌浆度、籽粒败育、结瘤和固氮效率、养分同化效率、生物和非生物胁迫抗性、碳同化、植物构型、抗倒伏性、种子发芽百分比、幼苗活力和童期性状。产量还可受到以下因素的影响：发芽效率(包括胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括胁迫条件下的生长速率)、开花时间和持续时间、穗数、穗大小、穗重量、每个穗或每个荚果的种子数量、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)和种子灌浆的特性。
还如本文所用，术语“性状修饰”涵盖通过在包含如本文所述的内源性PIF基因中的突变的植物中相对于不包含所述突变的植物(如野生型植物或负分离体)产生可检测的特征差异来改变天然存在的性状。在一些情况下，性状更改可以定量地评价。例如，与对照植物相比，性状更改可以使观察到的性状特性或表型增加或减少。众所周知，更改的性状可能会有自然变体。因此，与对照植物相比，观察到的性状修饰可导致植物中性状特征或表型的正态分布和量级的变化。
本公开涉及一种具有改善的经济相关特性(更具体地减少的避荫)的植物。更具体而言，本公开涉及一种包含如本文所述的在PIF基因中的突变的植物，其中如与缺乏所述突变的对照植物相比，所述植物具有减少的避荫响应(例如，包含如本文所述的突变的植物在避荫条件下生长时产生比在相同条件下生长的缺乏突变的植物更矮的植物)。在一些实施例中，本公开的植物进一步表现出与产量相关的改善的性状，包括但不限于增加的氮利用效率、增加的氮胁迫耐受性、增加的水利用效率和/或增加的耐旱性，如下文所定义和讨论的。
产量可被定义为来自作物的具有经济价值的可测量产物。产量可在数量和/或质量的范围内定义。产量可直接取决于若干因素，例如，器官的数量和大小(例如，花数量)、植物构型(如分枝的数量、植物生物量，例如根生物量增加、根角更陡和/或根更长等)、开花时间和持续时间、籽粒灌浆期。根构型和发育、光合效率、养分吸收、胁迫耐受性、早期活力、延迟衰老和功能性滞绿表型可以是决定产量的因素。因此，优化上述因素可有助于提高作物产量。
本文提及的产量相关性状的增加/改善也可被认为是指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述一个或多个部分可以包括地上和/或地下(可收获)植物部分。具体地，此类可收获部分是种子，并且本公开的方法的执行产生相对于合适的对照植物的种子产量，产量提高并且特别是种子产量提高的植物。术语植物的“产量”可涉及所述植物的营养生物量(根和/或苗生物量)、繁殖器官和/或繁殖体(如种子)。在一些实施例中，实施本公开的方法导致植物具有相对于合适的对照植物减少的避荫响应。
本公开的植物的增加的产量可通过多种方式测量，包括容重、每株植物的种子数、种子重量、每单位面积的种子数(例如，每英亩的种子数或种子重量)、每英亩蒲式耳数、每英亩吨数或每公顷千克数。产量提高可归因于关键生物化学化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用率提高，或者归因于对环境胁迫(如冷、热、干旱、盐、避荫、高植物密度以及害虫或病原体侵袭)的响应改善。
“产量提高”可表现为以下一种或多种：(i)植物的一个或多个部分，特别是植物的地上(可收获)部分的植物生物量(重量)增加、根生物量增加(根数量增加、根厚度增加、根长度增加)或任何其它可收获部分的生物量增加；或(ii)早期活力提高，本文定义为发芽后约三周幼苗地上面积提高。
“早期活力”是指活跃健康的植物生长，尤其是在植物生长的早期阶段，并且可由于例如植物更好地适应其环境(例如，优化对能源的利用、对养分的吸收以及在苗和根之间分配碳)引起的植物适应度增加产生。例如，早期活力可以是种子在种植后发芽和出苗的能力以及幼小植物在出苗后生长和发育的能力的组合。具有早期活力的植物还表现出幼苗存活率提高和作物定植更好，这通常会使田地高度均匀，其中大多数植物基本上同时达到各个发育阶段，从而通常使得产量提高。因此，早期活力可通过测量各种因素来确定，如籽粒重量、发芽百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长、根和苗生物量、冠层大小和颜色等。
此外，增加的产量还可表现为增加的总种子产量，这可归因于下列中的一种或多种：由于基于每株植物和/或单个种子的种子重量的增加引起的种子生物量(种子重量)的增加，例如，增加的每株植物花/圆锥花序数；增加的荚数；增加的节数；增加的每个圆锥花序/植物花(“小花”)数；增加的种子灌浆率；增加的灌浆种子数；增加的种子大小(长度、宽度、面积、周长和/或重量)，这也可影响种子的组成；和/或增加的种子体积，这也可影响种子的组成。在一个实施例中，增加的产量可以是增加的种子产量，例如，增加的种子重量；增加的灌浆种子数；和/或增加的收获指数。
产量提高还可以引起构型更改，或者可由于植物构型更改而发生。
产量提高也可表现为收获指数提高，其表示为可收获部分(如种子)的产量相较于总生物量的比率。
本公开还扩展到植物的可收获部分，如但不限于种子、叶、果实、花、圆荚、荚果、长角果、坚果、茎、根茎、块茎和球茎。本公开还涉及源自此类植物的可收获部分的产物，如干颗粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本公开提供了一种用于提高植物的“产量”或者植物或植物部分的“广亩产量”的方法，其被定义为每单位面积可收获的植物部分，例如每英亩种子数或种子重量、每英亩磅数、每英亩蒲式耳数、每英亩吨数、每英亩吨数、每公顷千克数。
如本文所用，“氮利用效率”是指使施用的每单位氮的植物产量、生物量、活力和生长速率增加的过程。这些过程可以包括植物对氮的吸收、同化、积累、信号传导、感测、再转移(在植物内)和利用。
如本文所用，“氮利用效率提高”是指在经受与正常或标准条件下相同的可利用/施用量的氮时，植物比正常情况更快或更好地生长、发育或产出的能力；在经受低于最优的可利用/施用量的氮时或在氮限制条件下植物正常生长、发育或产出的能力，或更快或更好地生长、发育或产出的能力。
如本文所用，“氮限制条件”是指提供低于植物充分或成功的代谢、生长、繁殖成功和/或存活所需的最优氮量的生长条件或环境。
如本文所用，“氮胁迫耐受性提高”是指在经受低于最优的可利用/施用量的氮时或在氮限制条件下植物正常生长、发育或产出的能力，或更快或更好地生长、发育或产出的能力。
植物氮利用效率提高可以在田地中转化为在供应较少的氮的同时收获相似数量的产量，或者通过供应最优/足够量的氮来获得产量提高。氮利用效率提高可以改善植物氮胁迫耐受性，还可改善作物品质和种子的生物化学成分，如蛋白质产量和油产量。术语“氮利用效率提高”、“氮利用效率增强”和“氮胁迫耐受性”在本公开中可互换使用，以指代在氮限制条件下具有提高的生产力的植物。
如本文所用，“水利用效率”是指每单位蒸腾的水蒸气被叶子同化的二氧化碳的量。其构成了控制干燥环境中植物生产力的最重要性状之一。“耐旱性”是指植物适应干燥或干旱条件的程度。植物对缺水的生理响应包括叶片萎蔫、叶面积减小、叶片脱落以及通过将养分引导到植物的地下部分来刺激根生长。通常，植物在开花和种子发育(繁殖阶段)期间更容易受到干旱的影响，因为植物的资源偏向支持根生长。此外，脱落酸(ABA)是一种植物胁迫激素，其诱导叶片气孔(参与气体交换的微观孔隙)关闭，从而减少蒸腾作用造成的水分损失，并降低光合作用速率。这些响应在短期内提高了植物的水利用效率。术语“水利用效率提高”、“水利用效率增强”和“耐旱性提高”在本公开中可互换使用，以指代在水限制条件下生产力提高的植物。
如本文所用，“水利用效率提高”是指在经受与正常或标准条件下相同的可利用/施用量的水时，植物比正常情况更快或更好地生长、发育或产出的能力；在经受减少的可利用/施用量的水(水输入)时或在水胁迫或缺水胁迫的条件下植物正常生长、发育或产出的能力，或更快或更好地生长、发育或产出的能力。
如本文所用，“耐旱性增加”是指在经受减少的可利用/施用量的水和/或在短期或长期干旱的条件下植物正常生长、发育或产出的能力，或者比正常情况更快或更好地生长、发育或产出的能力；在经受减少的可利用/施用量的水(水输入)时或在缺水胁迫的条件下或短期或长期干旱的条件下植物正常生长、发育或产出的能力。
如本文所用，“干旱胁迫”是指导致缺水并使植物受到胁迫和/或对植物组织造成损害和/或对籽粒/作物产量产生负面影响的干燥期(短期或长期/延长)；导致缺水和/或温度升高并使植物受到胁迫和/或对植物组织造成损害和/或对籽粒/作物产量产生负面影响的干燥期(短期或长期/延长)。
如本文所用，“缺水”是指提供低于植物充分/成功的生长和发育所需的最优水量的条件或环境。
如本文所用，“水胁迫”是指提供相对于植物/作物充分/成功的生长和发育所需的水量不适当(更少/不足或更多/过量)的水量的条件或环境，从而使植物受到胁迫和/或对植物组织造成损害和/或对籽粒/作物产量产生负面影响。
如本文所用，“缺水胁迫”是指提供相对于植物/作物充分/成功的生长和发育所需的水量更少/不足的水量的条件或环境，从而使植物受到胁迫和/或对植物组织造成损害和/或对籽粒产量产生负面影响。
如本文所用，术语“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”和“多核苷酸”是指线性或支链、单链或双链的RNA或DNA，或其杂交体。所述术语还涵盖RNA/DNA杂交体。当合成地产生dsRNA时，也可以使用不太常见的碱基，如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤等以进行反义、dsRNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已被证明以高亲和力结合RNA，并且是基因表达的强效反义抑制剂。也可进行其它修饰，如对磷酸二酯骨架或RNA核糖基团中的2'-羟基的修饰。
如本文所用，术语“核苷酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸从核酸分子的5'至3'端的序列，并且包括DNA或RNA分子，包括cDNA、DNA片段或部分、基因组DNA、合成(例如，化学合成)DNA、质粒DNA、mRNA和反义RNA，其中任何一个都可以是单链或双链。术语“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸构建体”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”在本文中也可互换使用，是指核苷酸的杂聚物。本文提供的核酸分子和/或核苷酸序列在本文中从左到右以5'至3'方向呈现，并使用美国序列规则37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中规定的用于表示核苷酸字符的标准代码表示。如本文所用，“5'区”可表示最接近多核苷酸的5'端的多核苷酸区。因此，例如，多核苷酸的5'区中的元素可位于从位于多核苷酸的5'端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。如本文所用，“3'区”可表示最接近多核苷酸的3'端的多核苷酸区。因此，例如，多核苷酸的3'区中的元素可位于从位于多核苷酸的3'端的第一个核苷酸到位于多核苷酸中间的核苷酸的任何位置。
如本文关于核酸所用的，术语“片段”或“部分”是指相对于参考核酸长度减少(例如，减少了1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个或更多个核苷酸或其中的任何范围或值)并且包含与参考核酸的对应部分相同或几乎相同(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续核苷酸的核苷酸序列或基本上由其组成和/或由其序列组成的核酸。在适当情况下，这种核酸片段可以包括在较大的多核苷酸中，所述核酸片段是所述较大的多核苷酸的组成部分。作为实例，本发明的向导核酸的重复序列可以包含野生型CRISPR-Cas重复序列的一部分(例如，野生型CRISR-Cas重复序列；例如，来自CRISPR Cas系统，例如Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c等的重复序列)。
在一些实施例中，核酸片段或部分可以包含以下、基本上由以下组成和/或由以下组成：PIF多核苷酸(例如，基因组DNA或cDNA)的约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、70、75、80、81、82、83、84、85、90、95、100、101、102、103、104、105、110、111、112、113、114、115、120、121、122、123、124、125、130、135、140、141、142、143、144、145、150、151、152、153、154、155、160、165、170、175、176、177、178、179、180、185、190、191、192、193、194、195、200、205、210、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、230、235、240、245、250、255、256、257、258、259、260、265、270、271、272、273、274、275、280、285、290、295、300、305、310、320、330、335、336、337、338、339、340、350、360、370、380、390、395、400、410、415、420、425、430、435、440、445、450、500、550、600、660、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、22、2250、2300、2350、2400、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2550或2600个或更多个连续核苷酸或其中的任何范围或值，任选地PIF多核苷酸的片段可以为约20个核苷酸至约120个核苷酸、约20个核苷酸至约250个核苷酸、约20个核苷酸至约350个核苷酸、约100个核苷酸至约250个核苷酸、约100个核苷酸至约350个核苷酸、约150个核苷酸至约400个核苷酸，例如约60、80、100、120、140、160、180或200个核苷酸至约210、220、240、260、280、300或350个或更多个连续核苷酸(例如，SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者，例如，SEQ ID NO:84-112，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111或112中的任一者的连续核苷酸)。
如本文关于多肽所用的，术语“片段”或“部分”可指相对于参考多肽长度减少并且包含与参考多肽的对应部分相同或几乎相同(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同)的连续氨基酸的氨基酸序列，基本上由其组成和/或由其组成的多肽。在适当情况下，此类多肽片段可以被包括在较大的多肽中，所述多肽片段是所述较大的多肽的组成部分。在一些实施例中，所述多肽片段包含参考多肽的至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、300、350、400个或更多个连续氨基酸，基本上由其组成或由其组成。在一些实施例中，PIF转录因子的片段包含至少约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个或更多个连续氨基酸(例如，SEQ ID NO:71、74、77、80、83中的任一者，例如SEQ ID NO:113的片段或部分)、基本上由其组成或由其组成。
在一些实施例中，“部分”可与从多肽中缺失的氨基酸数量有关。因此例如，PIF转录因子多肽的缺失的“部分”可以包含从SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列(或从与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性)的序列)缺失的至少一个氨基酸残基(例如，至少1个或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个或更多个连续氨基酸残基)(例如，缺失约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10至约30、31、32、33、34、35、36、37、38、37或40个残基)。在一些实施例中，同一性百分比可以是至少85％。在一些实施例中，同一性百分比可以是至少90％。在一些实施例中，同一性百分比可以是至少95％。在一些实施例中，同一性百分比可以为100％。
多核苷酸或多肽的“区”分别是指所述多核苷酸或多肽的连续核苷酸或连续氨基酸残基的一部分。例如，PIF多核苷酸序列的区可以包括但不限于SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核酸序列中的任一者。在一些实施例中，PIF多肽序列的区可以包括但不限于SEQ ID NO:113的氨基酸序列。在一些实施例中，区可以是用于在PIF多核苷酸或PIF转录因子中进行修饰的靶区或靶位点。
在一些实施例中，“序列特异性核酸结合结构域”(例如，序列特异性DNA结合结构域)可以与PIF基因(例如，SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82)和/或与PIF核酸的一个或多个片段、部分或区(例如，SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112)结合。
如本文关于核酸所用的，术语“功能片段”是指编码多肽功能片段的核酸。关于多肽的“功能片段”是保留天然参考多肽的一种或多种活性的多肽片段。
如本文所用，术语“基因”是指能够用于产生mRNA、反义RNA、miRNA、抗微小RNA反义寡脱氧核糖核苷酸(AMO)等的核酸分子。基因可能能够或可能不能够用于产生功能蛋白或基因产物。基因可以包括编码区和非编码区两者(例如，内含子、调节元件、启动子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区)。基因可以是“分离的”，这意味着核酸基本上或大体上不含通常在天然状态下与核酸相伴存在的组分。此类组分包括其它细胞材料、来自重组生产的培养基和/或用于化学合成核酸的各种化学物质。
术语“突变”是指点突变(例如，错义或无义，或引起移码的单碱基对的插入或缺失)、插入、缺失和/或截短。当突变是氨基酸序列内的一个残基被另一个残基取代，或者序列内一个或多个残基的缺失或插入时，通常通过识别原始残基，随后识别所述残基在序列内的位置以及新取代的残基的同一性来描述突变。在一些实施例中，缺失或插入是框内缺失或框内插入。在一些实施例中，缺失或插入可以是移码缺失或移码插入。在一些实施例中，缺失可以使得产生过早终止密码子的移码突变，从而截短蛋白质。截短可以包括多肽的C-末端处或多肽的N-末端处的截短。多肽的截短可以是编码多肽的基因的对应5'端或3'端缺失的结果。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”是指多核苷酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。例如，序列“A-G-T”(5'至3')与互补序列“T-C-A”(3'至5')结合。两个单链分子之间的互补性可以是“部分的”，其中只有一些核苷酸结合，或者当单链分子之间存在完全互补性时，互补性可以是完全的。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
如本文所用，“互补”可以意指与比较核苷酸序列100％的互补性，或其可以意指与比较核苷酸序列小于100％的互补性(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98％、99％等的互补性，例如，基本互补性)。
具有同源性的不同核酸或蛋白质在本文中称为“同源物”。术语同源物包括来自同一物种和其它物种的同源序列以及来自同一物种和其它物种的直系同源序列。“同源性”是指两个或更多个核酸和/或氨基酸序列之间的相似性水平，以位置同一性(即，序列相似性或同一性)百分比表示。同源性还指不同核酸或蛋白质之间的相似功能性质概念。因此，本发明的组合物和方法进一步包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。如本文所用，“直系同源”是指不同物种中的同源核苷酸序列和/或氨基酸序列，这些序列在物种形成过程中产生于共同的祖先基因。本发明的核苷酸序列的同源物与本发明的所述核苷酸序列具有基本序列同一性(例如，至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。
如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或多肽序列在整个组分(例如，核苷酸或氨基酸)比对窗口中不变的程度。“同一性”可容易通过已知的方法计算，包括但不限于在以下文献中描述的方法：《计算分子生物学(Computational MolecularBiology)》(Lesk,A.M.编辑)纽约的牛津大学出版社(Oxford University Press,NewYork)(1988)；《生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)》(Smith,D.W.编辑)纽约的学术出版社(Academic Press)(1993)；《序列数据的计算机分析，第I部分(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)》(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)新泽西州的胡马纳出版社(Humana Press,New Jersey)(1994)；《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)》(von Heinje,G.编辑)学术出版社(1987)；以及《序列分析引物(Sequence Analysis Primer)》(Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)纽约的斯托克顿出版社(Stockton Press)(1991)。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指当两个序列最佳比对时，与测试(“主题”)多核苷酸分子(或其互补链)相比，参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)的线性多核苷酸序列中相同核苷酸的百分比。在一些实施例中，“序列同一性百分比”可指与参考多肽相比，氨基酸序列中相同氨基酸的百分比。关于PIF基因，序列可以与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少约80％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因可以与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少约85％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因可以与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因可以与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有至少约95％序列同一性，任选地其中所述PIF基因可以与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81和/或82中的任一者的核苷酸序列具有约100％序列同一性。如本文所述的PIF多肽可以与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的多肽序列具有至少约80％序列同一性。在一些实施例中，PIF多肽可以与SEQID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的多肽序列具有至少约85％序列同一性。在一些实施例中，PIF多肽可以与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的多肽序列具有至少约90％序列同一性。在一些实施例中，PIF多肽可以与SEQ ID NO:71、74、77、80和/或83中的任一者的多肽序列具有至少约95％序列同一性，任选地其中所述PIF多肽可以与SEQ IDNO:71、74、77、80和/或83中的任一者的多肽序列具有约100％序列同一性。关于PIF基因的区或部分，所述区或部分可以与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列具有至少约80％序列同一性，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少约80％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因的区或部分可与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列具有至少约85％序列同一性，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少约85％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因的区或部分可以与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列具有至少约90％序列同一性，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少约90％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因的区或部分可以与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列具有至少约95％序列同一性，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少约95％序列同一性。在一些实施例中，PIF基因的区或部分可以与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108和/或109-112中的任一者的核苷酸序列具有约100％序列同一性，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有约100％序列同一性。关于PIF多肽的区或部分，所述区或部分可以与SEQ ID NO:113的多肽序列具有至少约80％序列同一性。在一些实施例中，PIF多肽的区或部分可以与SEQ ID NO:113的多肽序列具有至少约85％序列同一性。在一些实施例中，PIF多肽的区或部分可以与SEQ ID NO:113的多肽序列具有至少约90％序列同一性。在一些实施例中，PIF多肽的区或部分可以与SEQ ID NO:113的多肽序列具有至少约95％序列同一性，任选地其中PIF多肽的区或部分可以与SEQ ID NO:113的多肽序列具有约100％序列同一性。在一些实施例中，经突变的PIF基因可以与具有SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者的核苷酸序列的经突变的PIF基因具有至少约90％序列同一性。在一些实施例中，经突变的PIF基因可以与具有SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者的核苷酸序列的经突变的PIF基因具有至少约95％序列同一性。在一些实施例中，经突变的PIF基因可以与具有SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者的核苷酸序列的经突变的PIF基因具有约100％序列同一性。在一些实施例中，经突变的PIF多肽可以与具有SEQ IDNO:121、123、125、127和/或131中的任一者的氨基酸序列的经突变的PIF多肽具有至少约90％序列同一性。在一些实施例中，经突变的PIF多肽可以与具有SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者的氨基酸序列的经突变的PIF多肽具有至少约95％序列同一性。在一些实施例中，经突变的PIF多肽可以与具有SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者的氨基酸序列的经突变的PIF多肽具有约100％序列同一性。
如本文所用，在两个核酸分子、核苷酸序列或多肽序列的上下文中，短语“基本上相同”或“基本同一性”是指在进行比较和比对以获得最大对应性时，如使用以下序列比较算法中的一种或通过目视检查所测量的，两个或更多个具有至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％核苷酸或氨基酸残基同一性的序列或子序列。在本发明的一些实施例中，基本同一性存在于本发明的核苷酸序列的连续核苷酸区内，所述区的长度为约10个核苷酸至约20个核苷酸、约10个核苷酸至约25个核苷酸、约10个核苷酸至约30个核苷酸、约15个核苷酸至约25个核苷酸、约30个核苷酸至约40个核苷酸、约50个核苷酸至约60个核苷酸、约70个核苷酸至约80个核苷酸、约90个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约200个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约100个核苷酸至约400个核苷酸、约100个核苷酸至约500个核苷酸、约100个核苷酸至约600个核苷酸、约100个核苷酸至约800个核苷酸、约100个核苷酸至约900个核苷酸或更多个核苷酸，以及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施例中，核苷酸序列可在至少约20个连续核苷酸(例如，约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300个或更多个核苷酸)内基本上相同。在一些实施例中，两个或更多个PIF基因可以在SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者(参见例如SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112)的至少约30个或更多个连续核苷酸(例如，30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、54、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600个或更多个连续核苷酸)上彼此基本上相同。
在本发明的一些实施例中，基本同一性存在于本发明的多肽的连续氨基酸残基区内，所述区的长度为约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基、约5个氨基酸残基至约10个氨基酸残基、约5个氨基酸残基至约55个氨基酸残基、约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约7个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约10个氨基酸残基至约25个氨基酸残基、约15个氨基酸残基至约30个氨基酸残基、约20个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约40个氨基酸残基、约25个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约30个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约50个氨基酸残基、约40个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约50个氨基酸残基至约70个氨基酸残基、约60个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约70个氨基酸残基至约80个氨基酸残基、约90个氨基酸残基至约100个氨基酸残基或更多个氨基酸残基，以及其中的任何范围，直至序列的全长。在一些实施例中，多肽序列可在至少约8、9、10、11、12、13、14或更多个连续氨基酸残基(例如，长度为约8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、130、140、150、175、200、225、250、275、300、325、350、400、450、500个或更多个氨基酸或者更多个连续氨基酸残基)内彼此基本上相同。在一些实施例中，两个或更多个PIF转录因子多肽可在SEQ ID NO:71、74、77、80或83或其中的任何范围或值，参见例如SEQ ID NO:113的至少约10个至约150个连续氨基酸残基(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145或150个残基或更多个残基)内彼此基本上相同。在一些实施例中，基本上相同的核苷酸或蛋白质序列可执行与其基本上相同的核苷酸(或经编码的蛋白质序列)基本上相同的功能。
对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于所指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
用于比对比较窗口的序列最佳比对是本领域技术人员所熟知的，并且可通过如Smith和Waterman的局部同源算法、Needleman和Wunsch的同源比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法等工具进行，并且任选地通过这些算法的计算机化实现来进行，如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，其可作为Wisconsin(Accelrys Inc.,SanDiego,CA)的一部分获得。用于测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是两个比对序列共享的相同组分的数量除以参考序列片段(例如，整个参考序列或参考序列的较小定义部分)中的组分总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分的比较，或者是与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，还可以使用用于转译核苷酸序列的BLASTX 2.0版和用于多核苷酸序列的BLASTN 2.0版来确定“同一性百分比”。
当两个核苷酸序列在严格条件下彼此杂交时，也可认为这两个序列基本上是互补的。在一些实施例中，被认为基本上互补的两个核苷酸序列在高度严格的条件下彼此杂交。
在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)的上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。有关核酸杂交的广泛指南可见于Tijssen《生物化学和分子生物学的实验室技术-核酸探针杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes)》第I部分第2章“杂交的原理和核酸探针测定的策略的概述(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays)”纽约的爱思唯尔出版社(Elsevier,New York)(1993)。一般来讲，高度严格的杂交和洗涤条件被选择为在定义的离子强度和pH下，比特定序列的热解链温度(Tm)低约5℃。
Tm是50％靶序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在定义的离子强度和pH下)。非常严格的条件被选择为等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹中，具有超过100个互补残基的互补核苷酸序列在滤膜上杂交的严格杂交条件的实例是在42℃下用50％甲酰胺与1mg肝素杂交过夜。高度严格的洗涤条件的实例是在72℃下用0.15M NaCl洗涤约15分钟。严格洗涤条件的实例是在65℃下用0.2x SSC洗涤15分钟(对于SSC缓冲液的描述，参见下文Sambrook)。通常，在进行高严格度洗涤之前，先进行低严格度洗涤以去除背景探针信号。例如超过100个核苷酸的双链体的中严格度洗涤的实例是在45℃下用1x SSC洗涤15分钟。例如超过100个核苷酸的双链体的低严格度洗涤的实例是在40℃下用4-6x SSC洗涤15分钟。对于短探针(例如，约10至50个核苷酸)，严格条件通常涉及小于约1.0M Na离子的盐浓度，在pH 7.0至8.3下通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度通常为至少约30℃。添加去稳定剂(如甲酰胺)也可达到严格条件。一般来说，在特定的杂交测定中，为对不相关探针观察到的信噪比2倍(或更高)的信噪比表明检测到特异性杂交。如果核苷酸序列编码的蛋白质基本上相同，则在严格条件下彼此不杂交的核苷酸序列仍然基本上相同。例如，当使用遗传密码允许的最大密码子简并性产生核苷酸序列的拷贝时，就会发生这种情况。
本发明的多核苷酸和/或重组核酸构建体(例如，表达盒和/或载体)可针对表达进行密码子优化。在一些实施例中，本发明的编辑系统的多核苷酸、核酸构建体、表达盒和/或载体(例如，包含/编码序列特异性核酸结合结构域(例如，来自以下的序列特异性核酸结合结构域：多核苷酸引导的核酸内切酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、Argonaute蛋白和/或CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)(例如，I型CRISPR-Cas效应蛋白、II型CRISPR-Cas效应蛋白、III型CRISPR-Cas效应蛋白、IV型CRISPR-Cas效应蛋白、V型CRISPR-Cas效应蛋白或VI型CRISPR-Cas效应蛋白))、核酸酶(例如，核酸内切酶(例如，Fok1)、多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN))、脱氨酶蛋白/结构域(例如，腺嘌呤脱氨酶、胞嘧啶脱氨酶)、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5'-3'核酸外切酶多肽的多核苷酸和/或亲和多肽、肽标签等)可针对植物中的表达进行密码子优化。在一些实施例中，本发明的经密码子优化的核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体与未进行密码子优化的参考核酸、多核苷酸、表达盒和/或载体具有约70％至约99.9％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％)同一性或更大。
本发明的多核苷酸或核酸构建体可与多种启动子和/或其它调节元件可操作地缔合以用于在植物和/或植物细胞中表达。因此，在一些实施例中，本发明的多核苷酸或核酸构建体还可包含与一个或多个核苷酸序列可操作地连接的一个或多个启动子、内含子、增强子和/或终止子。在一些实施例中，启动子可与内含子可操作地缔合(例如，Ubi1启动子和内含子)。在一些实施例中，与内含子缔合的启动子可被称为“启动子区”(例如，Ubi1启动子和内含子)(参见例如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22)。
如本文所用，涉及多核苷酸的“可操作地连接”或“可操作地缔合”，意指所指示的元件在功能上彼此相关，并且通常也在物理上相关。因此，如本文所用，术语“可操作地连接”或“可操作地缔合”是指单个核酸分子上功能上关联的核苷酸序列。因此，与第二核苷酸序列可操作地连接的第一核苷酸序列是指第一核苷酸序列与第二核苷酸序列处于功能关系的情况。例如，如果启动子影响核苷酸序列的转录或表达，则所述启动子与所述核苷酸序列可操作地缔合。本领域技术人员将理解，控制序列(例如，启动子)不必和与其可操作地缔合的核苷酸序列相邻，只要控制序列的功能是指导其表达即可。因此，例如，启动子和核苷酸序列之间可存在介于中间的未翻译但转录的核酸序列，并且启动子仍可被视为与核苷酸序列“可操作地连接”。
如本文所用，涉及多肽的术语“连接”是指一个多肽与另一个多肽的连接。多肽可直接(例如，通过肽键)或通过接头与另一个多肽(在N-末端或C-末端)连接。
术语“接头”是本领域公认的，是指连接两个分子或部分的化学基团或分子，所述两个分子或部分例如为融合蛋白的两个结构域，如，例如，DNA结合多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽；或DNA核酸内切酶多肽或结构域和肽标签和/或逆转录酶和与肽标签结合的亲和多肽。接头可由单个连接分子构成，或可包含超过一个连接分子。在一些实施例中，接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，如二价有机部分。在一些实施例中，接头可以是氨基酸，或者可以是肽。在一些实施例中，接头是肽。
在一些实施例中，可用于本发明的肽接头的长度可以是约2至约100个或更多个氨基酸，例如，长度为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸(例如，长度为约2至约40、约2至约50、约2至约60、约4至约40、约4至约50、约4至约60、约5至约40、约5至约50、约5至约60、约9至约40、约9至约50、约9至约60、约10至约40、约10至约50、约10至约60，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个氨基酸至约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个氨基酸(例如，长度为约105、110、115、120、130、140、150个或更多个氨基酸)。在一些实施例中，肽接头可以是GS接头。
在一些实施例中，两个或更多个多核苷酸分子可通过接头连接，所述接头可以是有机分子、基团、聚合物或化学部分，如二价有机部分。多核苷酸可通过共价或非共价键或结合(包括例如通过Watson-Crick碱基配对或通过一个或多个连接核苷酸)来与另一个多核苷酸(在5'端或3'端)连接或融合。在一些实施例中，某种结构的多核苷酸基序可插入到另一个多核苷酸序列内(例如，向导RNA中发夹结构的延伸)。在一些实施例中，连接核苷酸可以是天然存在的核苷酸。在一些实施例中，连接核苷酸可以是非天然存在的核苷酸。
“启动子”是控制或调控与启动子可操作地缔合的核苷酸序列(例如，编码序列)转录的核苷酸序列。由启动子控制或调控的编码序列可编码多肽和/或功能性RNA。通常，“启动子”是指包含RNA聚合酶II的结合位点并指导转录起始的核苷酸序列。一般来说，启动子位于相对于对应编码序列的编码区起点的5'或上游。启动子可以包含充当基因表达调控剂的其它元件；例如，启动子区。这些包括TATA盒共有序列，通常还包括CAAT盒共有序列(Breathnach和Chambon,(1981)《生物化学年鉴(Annu.Rev.Biochem.)》50:349)。在植物中，CAAT盒可被AGGA盒取代(Messing等人,(1983)于《植物的基因工程化(GeneticEngineering of Plants)》,T.Kosuge,C.Meredith和A.Hollaender(编辑),普伦姆出版社(Plenum Press),第211-227页)。
可用于本发明的启动子可以包括，例如，组成性、诱导性、时间调控性、发育调控性、化学调控性、组织偏好性和/或组织特异性的启动子，用于制备重组核酸分子，例如，“合成核酸构建体”或“蛋白质-RNA复合物”。这些不同类型的启动子是本领域已知的。
对启动子的选择可因表达的时间和空间要求而异，也可因要转化的宿主细胞而异。许多不同生物体的启动子在本领域是众所周知的。基于本领域存在的广泛知识，可为所关注的特定宿主生物体选择适当的启动子。因此，例如，对模式生物体中高度组成性表达的基因上游的启动子知之甚多，并且这些知识可以很容易地获得，并在适当时在其它系统中实施。
在一些实施例中，在植物中有功能的启动子可与本发明的构建体一起使用。可用于驱动在植物中表达的启动子的非限制性实例包括RubisCo小亚基基因1的启动子(PrbcS1)、肌动蛋白基因的启动子(Pactin)、硝酸还原酶基因的启动子(Pnr)和重复碳酸酐酶基因1的启动子(Pdca1)(参见Walker等人,《植物细胞报告(Plant CellRep)》.23:727-735(2005)；Li等人,《基因(Gene)》403:132-142(2007)；Li等人,《分子生物学报告(MolBiol.Rep)》.37:1143-1154(2010))。PrbcS1和Pactin是组成性启动子，并且Pnr和Pdca1是诱导性启动子。Pnr由硝酸盐诱导并被铵抑制(Li等人,《基因》403:132-142(2007))，并且Pdca1由盐诱导(Li等人,《分子生物学报告》37:1143-1154(2010))。在一些实施例中，可用于本发明的启动子是RNA聚合酶II(Pol II)启动子。在一些实施例中，来自玉米(Zea mays)的U6启动子或7SL启动子可用于本发明的构建体。在一些实施例中，来自玉米的U6c启动子和/或7SL启动子可用于驱动向导核酸的表达。在一些实施例中，来自大豆(Glycine max)的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于本发明的构建体。在一些实施例中，来自大豆的U6c启动子、U6i启动子和/或7SL启动子可用于驱动向导核酸的表达。
可用于植物的组成性启动子的实例包括但不限于夜香树病毒(cestrum virus)启动子(cmp)(美国专利第7,166,770号)、水稻肌动蛋白1启动子(Wang等人(1992)《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》12:3399-3406；以及美国专利第5,641,876号)、CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)《自然(Nature)》313:810-812)、CaMV 19S启动子(Lawton等人(1987)《植物分子生物学(Plant Mol.Biol)》.9:315-324)、nos启动子(Ebert等人(1987)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci USA)》84:5745-5749)、Adh启动子(Walker等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:6624-6629)、蔗糖合成酶启动子(Yang和Russell(1990)《美国国家科学院院刊》87:4144-4148)和泛素启动子。源自泛素的组成性启动子在许多细胞类型中积累。已从几种植物物种中克隆了泛素启动子以用于转基因植物，例如，向日葵(Binet等人,1991.《植物科学(Plant Science)》79:87-94)、玉米(Christensen等人,1989.《植物分子生物学(Plant Molec.Biol)》.12:619-632)和拟南芥(Norris等人,1993.《植物分子生物学》21:895-906)。已在转基因单子叶植物系统中开发了玉米泛素启动子(UbiP)，并且在专利公开EP 0 342 926中公开了其序列和被构建用于单子叶植物转化的载体。泛素启动子适用于在转基因植物，尤其是单子叶植物中表达本发明的核苷酸序列。此外，McElroy等人(《分子遗传学和基因组学(Mol.Gen.Genet)》231:150-160(1991))描述的启动子表达盒可很容易地被改良用于本发明的核苷酸序列的表达，并且特别适用于单子叶植物宿主。
在一些实施例中，组织特异性/组织偏好性启动子可用于在植物细胞中表达异源多核苷酸。组织特异性或偏好性表达模式包括但不限于绿色组织特异性或偏好性、根特异性或偏好性、茎特异性或偏好性、花特异性或偏好性或花粉特异性或偏好性。适合在绿色组织中表达的启动子包括调控参与光合作用的基因的许多启动子，其中许多是从单子叶植物和双子叶植物克隆而来的。在一个实施例中，可用于本发明的启动子是来自磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子(Hudspeth和Grula,《植物分子生物学》.12:579-589(1989))。组织特异性启动子的非限制性实例包括与编码种子储存蛋白(如β-伴大豆球蛋白、菜籽球蛋白(cruciferin)、菜籽白蛋白(napin)和菜豆球蛋白)、玉米醇溶蛋白或油体蛋白(如油质蛋白)或参与脂肪酸生物合成的蛋白(包括酰基载体蛋白、硬脂酰-ACP去饱和酶和脂肪酸去饱和酶(fad 2-1))的基因缔合的那些，以及胚发育过程中表达的其它核酸(如Bce4，参见例如Kridl等人(1991)《种子科学报告(Seed Sci.Res)》.1:209-219；以及EP专利第255378号)。可用于在植物、特别是玉米中表达本发明的核苷酸序列的组织特异性或组织偏好性启动子包括但不限于那些指导在根、髓、叶或花粉中表达的启动子。例如，在WO 93/07278(其全文以引用方式并入本文)中公开了此类启动子。可用于本发明的组织特异性或组织偏好性启动子的其它非限制性实例是美国专利6,040,504中公开的棉花rubisco启动子；在美国专利5,604,121中公开的水稻蔗糖合成酶启动子；由de Framond(FEBS290:103-106(1991)；授予Ciba-Geigy的EP 0 452269)所述的根特异性启动子；在美国专利5,625,136(授予Ciba-Geigy)中描述的茎特异性启动子，其驱动玉米trpA基因的表达；在WO 01/73087中公开的夜香树黄化曲叶病毒启动子；以及花粉特异性或偏好性启动子，包括但不限于来自水稻的ProOsLPS10和ProOsLPS11(Nguyen等人,《植物生物技术学报告(PlantBiotechnol.Reports)》9(5):297-306(2015))、来自玉米的ZmSTK2_USP(Wang等人,《基因组(Genome)》60(6):485-495(2017))、来自番茄的LAT52和LAT59(Twell等人,《发展(Development)》109(3):705-713(1990))、Zm13(美国专利第10,421,972号)、来自拟南芥的PLA2-δ启动子(美国专利第7,141,424号)和/或来自玉米的ZmC5启动子(国际PCT公开第WO1999/042587号)。
植物组织特异性/组织偏好性启动子的另外的实例包括但不限于根毛特异性顺式元件(RHE)(Kim等人,《植物细胞(The Plant Cell)》18:2958-2970(2006))、根特异性启动子RCc3(Jeong等人,《植物生理学(Plant Physiol)》.153:185-197(2010))和RB7(美国专利第5459252号)、凝集素启动子(Lindstrom等人(1990)《衍生遗传学(Der.Genet.)》11:160-167；以及Vodkin(1983)《临床和生物学研究的进展(Prog.Clin.Biol.Res.)》138:87-98)、玉米醇脱氢酶1启动子(Dennis等人(1984)《核酸研究(Nucleic Acids Res)》.12:3983-4000)、S-腺嘌呤-L-甲硫氨酸合成酶(SAMS)(Vander Mijnsbrugge等人(1996)《植物与细胞生理学(Plant and Cell Physiology)》,37(8):1108-1115)、玉米光捕获复合物启动子(Bansal等人(1992)《美国国家科学院院刊》89:3654-3658)、玉米热休克蛋白启动子(O'Dell等人(1985)《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J)》.5:451-458；以及Rochester等人(1986)《欧洲分子生物学学会杂志》5:451-458)、豌豆小亚基RuBP羧化酶启动子(Cashmore,“编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基的核基因(Nuclear genes encoding the smallsubunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase)”第29-39页,于:《植物的基因工程化》(Hollaender编辑,普伦姆出版社1983)；以及Poulsen等人(1986)《分子遗传学和基因组学》205:193-200)、Ti质粒甘露碱合成酶启动子(Langridge等人(1989)《美国国家科学院院刊》86:3219-3223)、Ti质粒胭脂碱合成酶启动子(Langridge等人(1989),见上)、矮牵牛查尔酮异构酶启动子(van Tunen等人(1988)《欧洲分子生物学学会杂志》7:1257-1263)、豆类富甘氨酸蛋白1启动子(Keller等人(1989)《基因发展(Genes Dev)》.3:1639-1646)、截短的CaMV 35S启动子(O'Dell等人(1985)《自然》313:810-812)、马铃薯糖蛋白启动子(Wenzler等人(1989)《植物分子生物学》.13:347-354)、根细胞启动子(Yamamoto等人(1990)《核酸研究》18:7449)、玉米醇溶蛋白启动子(Kriz等人(1987)《分子遗传学和基因组学》207:90-98；Langridge等人(1983)《细胞(Cell)》34:1015-1022；Reina等人(1990)《核酸研究》18:6425；Reina等人(1990)《核酸研究》18:7449；以及Wandelt等人(1989)《核酸研究》17:2354)、球蛋白-1启动子(Belanger等人(1991)《遗传学(Genetics)》129:863-872)、α-微管蛋白cab启动子(Sullivan等人(1989)《分子遗传学和基因组学》215:431-440)、PEPCase启动子(Hudspeth和Grula(1989)《植物分子生物学》12:579-589)、R基因复合物相关启动子(Chandler等人(1989)《植物细胞》1:1175-1183)和查尔酮合成酶启动子(Franken等人(1991)《欧洲分子生物学学会杂志》10:2605-2612)。
可用于种子特异性表达的是豌豆球蛋白启动子(Czako等人(1992)《分子遗传学和基因组学》235:33-40)；以及美国专利第5,625,136号中公开的种子特异性启动子。可用于在成熟叶中表达的启动子是那些在衰老开始时转换的启动子，如来自拟南芥的SAG启动子(Gan等人(1995)《科学》270:1986-1988)。
此外，可使用在叶绿体中有功能的启动子。此类启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5'UTR和美国专利第7,579,516号中公开的其它启动子。可用于本发明的其它启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
可用于本发明的另外的调节元件包括但不限于内含子、增强子、终止序列和/或5'和3'非翻译区。
可用于本发明的内含子可以是在植物中鉴定并从植物中分离，然后插入到用于植物转化的表达盒中的内含子。如本领域技术人员所理解的，内含子可以包含自我切除所需的序列，并被框内掺入到核酸构建体/表达盒中。内含子可用作间隔子以在一个核酸构建体中分开多个蛋白质编码序列，或者可在一个蛋白质编码序列内使用内含子，例如，以稳定mRNA。如果其在蛋白质编码序列内使用，则其被“框内”插入，并包括切除位点。内含子也可与启动子缔合以改善或更改表达。作为实例，可用于本发明的启动子/内含子组合包括但不限于玉米Ubi1启动子和内含子的启动子/内含子组合(参见，例如，SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22)。
可用于本发明的内含子的非限制性实例包括来自以下基因的内含子：ADHI基因(例如，Adh1-S内含子1、2和6)、泛素基因(Ubi1)、RuBisCO小亚基(rbcS)基因、RuBisCO大亚基(rbcL)基因、肌动蛋白基因(例如，肌动蛋白-1内含子)、丙酮酸脱氢酶激酶基因(pdk)、硝酸还原酶基因(nr)、重复碳酸酐酶基因1(Tdca1)、psbA基因、atpA基因或其任何组合。
在一些实施例中，本发明的多核苷酸和/或核酸构建体可以是“表达盒”，或可以包含在表达盒内。如本文所用，“表达盒”是指重组核酸分子，所述重组核酸分子包含例如本发明的一个或多个多核苷酸(例如，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白或结构域的多核苷酸、编码5'-3'核酸外切酶多肽或结构域的多核苷酸、向导核酸和/或逆转录酶(RT)模板)，其中多核苷酸与一个或多个控制序列(例如，启动子、终止子等)可操作地缔合。因此，在一些实施例中，可提供一个或多个表达盒，其被设计用于表达例如本发明的核酸构建体(例如，编码序列特异性核酸结合结构域(例如，序列特异性DNA结合结构域)的多核苷酸、编码核酸酶多肽/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码5'-3'核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、编码肽标签的多核苷酸和/或编码亲和多肽的多核苷酸等，或包含向导核酸、延伸的向导核酸和/或RT模板等)。当本发明的表达盒包含超过一个多核苷酸时，多核苷酸可以可操作地连接到驱动所有多核苷酸表达的单个启动子，或者所述多核苷酸可以可操作地连接到一个或多个单独的启动子(例如，三个多核苷酸可由一个、两个或三个启动子以任何组合驱动)。当使用两个或更多个单独的启动子时，启动子可以是同一启动子，或其可以是不同的启动子。因此，当包含在单个表达盒中时，编码序列特异性核酸结合结构域的多核苷酸、编码核酸酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码CRISPR-Cas效应蛋白/结构域的多核苷酸、编码脱氨酶蛋白/结构域的多核苷酸、编码逆转录酶多肽/结构域的多核苷酸(例如，RNA依赖性DNA聚合酶)和/或编码5'-3'核酸外切酶多肽/结构域的多核苷酸、向导核酸、延伸的向导核酸和/或RT模板可以各自可操作地连接到单个启动子或任何组合的单独启动子。
包含本发明的核酸构建体的表达盒可以是嵌合的，这意味着其至少一个组分相对于其至少一个其它组分是异源的(例如，来自宿主生物体的启动子可操作地连接到要在宿主生物体中表达的所关注的多核苷酸，其中所关注的多核苷酸来自与宿主不同的生物体，或者通常不与所述启动子相伴存在)。表达盒也可以是天然存在的，但已以可用于异源表达的重组形式获得。
表达盒可任选地包括转录和/或翻译终止区(即终止区)和/或在所选宿主细胞中有功能的增强子区。多种转录终止子和增强子是本领域已知的，并且可用于表达盒中。转录终止子负责终止转录并纠正mRNA多聚腺嘌呤酸化。终止区和/或增强子区可对转录起始区来说是天然的，可对下列来说是天然的：例如，编码序列特异性DNA结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等，或者可对宿主细胞来说是天然的，或者可对另一来源(例如，对例如启动子、编码序列特异性DNA结合蛋白的基因、编码核酸酶的基因、编码逆转录酶的基因、编码脱氨酶的基因等，或对宿主细胞，或其任何组合来说外源的或异源的)来说是天然的。
本发明的表达盒还可包括编码可选择标记的多核苷酸，所述可选择标记可用于选择转化的宿主细胞。如本文所用，“可选择标志物”是指这样的多核苷酸序列：当表达时，赋予表达所述标志物的宿主细胞独特的表型，从而允许将此类转化的细胞与没有所述标志物的细胞区分开来。这种多核苷酸序列可编码可选择或可筛选的标志物，这取决于所述标志物是否赋予可通过化学手段(如通过使用选择剂(例如，抗生素等))选择的性状，或者所述标志物是否只是通过观察或测试(如通过筛选(例如，荧光))即可鉴定的性状。合适的可选择标志物的许多实例是本领域已知的，并且可用于本文所述的表达盒中。
除表达盒外，本文所述的核酸分子/构建体和多核苷酸序列也可与载体结合使用。术语“载体”是指用于将核酸(或多个核酸)转移、递送或引入到细胞中的组合物。载体包含核酸构建体(例如，表达盒)，所述核酸构建体包含待转移、递送或引入的核苷酸序列。用于转化宿主生物体的载体在本领域是众所周知的。一般类别载体的非限制性实例包括病毒载体、质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、粘粒载体、福斯质粒(fosmid)载体、噬菌体、人工染色体、微环或双链或单链线性或环状形式的农杆菌(Agrobacterium)二元载体，这些载体可以是或可以不是可自转移或可移动的。在一些实施例中，病毒载体可包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒载体。如本文定义的载体可通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)来转化原核或真核宿主。此外，还包括穿梭载体，穿梭载体是指能够天然或有意地在两种不同的宿主生物体中复制的DNA载体，宿主生物体可以选自放线菌和相关物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。在一些实施例中，载体中的核酸受适当的启动子或其它调节元件的控制，并且与适当的启动子或其它调节元件可操作地连接，以便在宿主细胞中转录。载体可以是在多种宿主中起作用的双功能表达载体。在基因组DNA的情况下，这可以包含其自己的启动子和/或其它调节元件，而在cDNA的情况下，这可受适当的启动子和/或其它调控元件的控制，以便在宿主细胞中表达。因此，本发明的核酸或多核苷酸和/或包含所述核酸或多核苷酸的表达盒可以包含在如本文所述和本领域已知的载体中。
如本文所用，“接触(contact)”、“接触(contacting)”、“接触(contacted)”及其语法变体是指在适合进行所需反应(例如，转化、转录控制、基因组编辑、产生切口和/或切割)的条件下将所需反应的组分放在一起。作为实例，靶核酸可与序列特异性DNA结合蛋白(例如，多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白))和脱氨酶或编码这些的核酸构建体在以下的条件下接触：序列特异性DNA结合蛋白、逆转录酶和脱氨酶表达并且序列特异性DNA结合蛋白与靶核酸结合，并且逆转录酶和/或脱氨酶可以与序列特异性DNA结合蛋白融合或募集到序列特异性DNA结合蛋白(例如，通过与序列特异性DNA结合蛋白融合的肽标签和与逆转录酶和/或脱氨酶融合的亲和标签)，因此，脱氨酶和/或逆转录酶位于靶核酸附近，从而修饰靶核酸。可使用利用其它蛋白质-蛋白质相互作用的募集逆转录酶和/或脱氨酶的其它方法，并且RNA-蛋白质相互作用和化学相互作用也可用于蛋白质-蛋白质和蛋白质-核酸募集。
如本文所用，涉及靶核酸的“修饰(modifying)”或“修饰(modification)”包括编辑(例如，突变)、共价改变、交换/取代核酸/核苷酸碱基、缺失、切割、产生切口和/或改变对靶核酸的转录控制。在一些实施例中，修饰可包括任何类型的一个或多个单碱基变化(SNP)。
术语“调节”，如在转录因子“调节”表型(例如，对光照的响应(例如，光响应，例如，避荫响应))的上下文中所使用的，意指转录因子影响一个或多个基因表达的能力，从而改变表型，例如，对光照的响应。
在所关注的多核苷酸的上下文中，“引入(Introducing)”、“引入(introduce)”、“引入(introduced)”(及其语法变体)是指将所关注的核苷酸序列(例如，多核苷酸、RT模板、核酸构建体和/或向导核酸)以一定方式呈递给植物、其植物部分或其细胞，使得所述核苷酸序列进入细胞内部。
术语“转化”或“转染”可互换使用，如本文所用是指将异源核酸引入细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。因此，在一些实施例中，宿主细胞或宿主生物体(例如，植物)可用本发明的多核苷酸/核酸分子稳定地转化。在一些实施例中，宿主细胞或宿主生物体可用本发明的多核苷酸/核酸分子瞬时转化。
在多核苷酸的上下文中，“瞬时转化”是指多核苷酸被引入细胞中，但不整合到细胞的基因组中。
在多核苷酸被引入细胞中的上下文中，“稳定引入”或“被稳定引入”意指引入的多核苷酸被稳定掺入到细胞的基因组中，因此细胞被多核苷酸稳定转化。
如本文所用，“稳定转化”或“被稳定转化”是指核酸分子被引入细胞中并整合到细胞的基因组中。因此，整合的核酸分子能够被其子代继承，更具体地讲，能够被连续多代的子代继承。如本文所用，“基因组”包括核基因组和质体基因组，因此包括将核酸整合到例如叶绿体或线粒体基因组中。如本文所用，稳定转化也可指在染色体外维持的转基因，例如，作为微染色体或质粒。
瞬时转化可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或Western印迹来检测，其可检测由引入生物体中的一个或多个转基因编码的肽或多肽的存在。可通过例如对细胞的基因组DNA与核酸序列进行Southern印迹杂交测定来检测细胞的稳定转化，所述核酸序列与引入生物体(例如，植物)中的转基因的核苷酸序列特异性杂交。可通过例如对细胞的RNA与核酸序列进行Northern印迹杂交测定来检测细胞的稳定转化，所述核酸序列与引入宿主生物体中的转基因的核苷酸序列特异性杂交。细胞的稳定转化也可通过例如聚合酶链反应(PCR)或本领域公知的其它扩增反应来检测，这些反应采用与转基因的靶序列杂交的特异性引物序列，导致转基因序列的扩增，从而可根据标准方法对转基因序列进行检测。转化也可通过本领域熟知的直接测序和/或杂交方案来检测。
因此，在一些实施例中，本发明的核苷酸序列、多核苷酸、核酸构建体和/或表达盒可被瞬时表达和/或其可被稳定地掺入到宿主生物体的基因组中。因此，在一些实施例中，本发明的核酸构建体(例如，包含如本文所述用于编辑的多核苷酸的一个或多个表达盒)可与向导核酸一起被瞬时引入细胞中，因此，不会在细胞中维持DNA。
本发明的核酸构建体可通过本领域技术人员已知的任何方法引入植物细胞中。转化方法的非限制性实例包括通过细菌介导的核酸递送(例如，通过农杆菌)的转化、病毒介导的核酸递送、碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送、脂质体介导的核酸递送、显微注射、微粒轰击、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、纳米颗粒介导的转化、超声处理、浸润、PEG介导的核酸摄取，以及使得核酸引入植物细胞中的任何其它电、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任何组合。用于转化真核生物体和原核生物体的程序是本领域众所周知的和常规的，并且在文献中均有描述(参见例如Jiang等人,2013.《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》31:233-239；Ran等人,《自然方案(Nature Protocols)》8:2281–2308(2013))。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人(“将外源DNA引入植物的程序(Procedures for Introducing Foreign DNAinto Plants)”于《植物分子生物学和生物技术方法(Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology)》,Glick,B.R.和Thompson,J.E.编辑(博卡拉顿的CRC出版社公司(CRC Press,Inc.,Boca Raton),1993),第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(《细胞与分子生物学快报(Cell.Mol.Biol.Lett.)》7:849-858(2002))。
在本发明的一些实施例中，细胞的转化可以包含核转化。在其它实施例中，细胞的转化可以包含质体转化(例如，叶绿体转化)。在更进一步的实施例中，本发明的核酸可通过常规培育技术引入细胞中。在一些实施例中，多核苷酸、表达盒和/或载体中的一者或多者可通过农杆菌转化来引入植物细胞中。
因此，多核苷酸可以以本领域公知的任何数量的方式引入植物、植物部分、植物细胞中。本发明的方法不依赖于用于将一个或多个核苷酸序列引入植物中的特定方法，只要其能够进入细胞内部即可。如果要引入超过一个多核苷酸，其可组装为单个核酸构建体的一部分或组装为单独的核酸构建体，并且可位于相同或不同的核酸构建体上。因此，可将多核苷酸在单个转化事件中引入所关注的细胞中，或在单独的转化事件中引入所关注的细胞中，或另选地，可将多核苷酸作为培育方案的一部分掺入植物中。
植物对邻近植物作出响应，以便更好地与邻近植物竞争资源，特别是对光的获取。虽然这在自然或野生环境中是一种适应性优势，但在单一作物农业中，植物与共同贡献产量的相同种类作物植物竞争，因此当在农场中平均时，单独植物的净收益会损失。这种对邻近植物的响应被称为避荫响应(SAR)，这会引起植物活力差和植物产量降低(避荫综合征；SAS)。例如，通过高强度培育，玉米的产量(蒲式耳/英亩)稳定增加。然而，产量的增加最近开始趋于平稳，并且需要在田间评价和培育方面进行大量投资，以证明遗传增益。需要新的遗传修饰方法来显著提高产量，这是通过传统方法不可能实现的。可通过两种根本不同的方式提高作物产量：1)产量本身的提高，其中工程化的植物获得了优势，如改善的光合作用或优化的碳水化合物分配，或2)去除了与高产农业不一致的退化生存机制。避荫响应(SAR)或避荫综合征(SAS)就是这样的生存机制。SAS/SAR的特征在于根冠比增加，植物高度增加以及单株植物产量降低，并且在典型的单一栽培作物环境中，这种对竞争的响应是一种浪费的生存机制。
植物用来检测邻近植物的环境信号是R:FR光比率的变化，其中从叶组织反射的光相对于直接到达植物的光向FR波长移动。植物利用光敏色素系统来检测光的波长并发出植物变化的信号。光敏色素系统的组件包括：光敏色素、光敏色素相互作用因子(PIF)和信号转导级联，所述信号转导级联包括转录因子，如HB53，并且最终以激素产生(特别是辅助素)和细胞伸长结束。
PIF是避荫响应的正调控剂(Levar等人《植物细胞》21(11):3535-3553(2009)；Quail,P.H.《植物评论年鉴(Annual Plant Reviews)》.81–105(2018)；Shi等人《生物化学和生物物理研究通讯(Biochem Bioph Res Co)》516:112–119(2019)；Hornitschek等人《欧洲分子生物学学会杂志》28:3893–3902(2009))。在高密度(HD)种植下，当存在低R:FR比时，PIF形成转录因子复合物以促进细胞伸长(Oh等人《植物细胞》21(2):403-419(2009))。在正常光照条件下，光活性phyB与PIF相互作用，从而产生其经由26S蛋白酶体的磷酸化和降解或通过不太了解的机制的失活(Pham等人,《植物生理学》176(2),1025-1038(2018))。PIF转录因子在结构上由属于碱性螺旋环螺旋(bHLH)类别来定义，所述碱性螺旋环螺旋通过二聚化起作用并充当SAR的正调控剂。位于C末端处的bHLH结构域在DNA结合和二聚体形成中起作用。另外，已经通过突变体或功能表征鉴定了许多bHLH蛋白。例如，bHLH蛋白的拮抗对、籽粒长度1的正调控剂(PGL1)和PGL1的拮抗剂(APG)参与控制水稻中的籽粒产量组分(Heang等人《培育科学(Breeding Science)》62(2):133-141(2012))。APG是bHLH转录因子，其通过与PGL1异二聚化来限制籽粒大小。
本发明使用基因编辑来修饰触发作物中的避荫的调控因子(例如，显性阴性突变体)解决了与种植密度耐受性增加和由于种植差异性导致的产量损失减少(以英亩为基础)相关的问题。具有这种编辑过的基因组的植物将具有降低的避荫能力。
因此，本发明提供了一种植物或其部分，所述植物或其部分包含在编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因中的至少一个突变(例如，1、2、3、4或5个或更多个突变)，其中所述突变破坏所述PIF转录因子与所述植物或其部分中的DNA的结合。在一些实施例中，PIF转录因子是碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子。在一些实施例中，至少一个突变可以在编码PIF转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域的内源性基因的区中。在一些实施例中，PIF转录因子能够调节所述植物中的对光照的响应(例如，避荫响应(SAR))。在一些实施例中，PIF转录因子可以是碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子，任选地光敏色素相互作用因子3(PIF3)转录因子、光敏色素相互作用因子4(PIF4)转录因子或光敏色素相互作用因子5(PIF5)转录因子。在一些实施例中，编码PIF转录因子的内源性基因可以是光敏色素相互作用因子3(PIF3)基因、光敏色素相互作用因子4(PIF4)基因或光敏色素相互作用因子5(PIF5)基因。在一些实施例中，包含经突变的PIF基因的植物或其部分包含经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，编码可用于本发明的PIF转录因子的内源性基因：(a)包含与SEQID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ IDNO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。在一些实施例中，至少一个突变可以在与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的经编码的PIF转录因子的区中。因此，本发明的植物或植物部分可以包含在编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因中的至少一个突变(例如，一个或多个突变)，任选地其中所述突变破坏所述PIF转录因子与所述植物或其部分中的DNA的结合，其中编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因(例如，内源性PIF基因)(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQID NO:71、74、77、80或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。
植物中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的突变可以是任何类型的突变，包括但不限于碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入。在一些实施例中，可用于本发明的突变是非天然突变。
在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变可以使得PIF转录因子具有经破坏的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域(例如，碱性结构域)，并且任选地产生由经突变的PIF转录因子进行的DNA结合的经破坏的结合。例如，所述突变可以是PIF转录因子基因的一个或多个碱基的取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，所述至少一个突变可以产生PIF转录因子中的氨基酸残基的修饰(例如，取代、插入、缺失)。在一些实施例中，所述至少一个突变可以是产生PIF转录因子的氨基酸残基的取代，任选地PIF转录因子的碱性结构域中的氨基酸残基的取代的碱基取代。在一些实施例中，至少一个非天然突变可以包含变为A、T、G或C的碱基取代，这产生氨基酸取代，由此破坏碱性结构域，并且任选地破坏PIF转录因子对DNA的结合。
在一些实施例中，内源性PIF基因中的所述至少一个突变(例如，一个或多个突变)可以包含碱基取代，任选地其中所述碱基取代引起氨基酸残基的取代。在一些实施例中，碱基取代引起PIF转录因子的碱性结构域中的氨基酸残基的取代，任选地其中所述氨基酸取代破坏PIF转录因子的bHLH结构域，由此破坏PIF转录因子与DNA的结合。在一些实施例中，所述至少一个突变是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ IDNO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代。在一些实施例中，所述至少一个突变可以是在参考SEQ ID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代。在一些实施例中，氨基酸取代可以是将谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)的取代(E>K)，任选地参考SEQ ID NO:113的E6K。
在一些实施例中，编码PIF转录因子的内源性基因中的至少一个突变(例如，一个或多个突变)可以产生显性负等位基因、隐性等位基因、无效等位基因、弱功能丧失型等位基因或亚效等位基因。
在一些实施例中，与对照相比，包含如本文所述的PIF基因中的突变的植物可以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量，任选地其中相对于标准种植密度，所述种植密度增加了约5％至约75％(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75％或其中的任何范围或值)，而不降低基于每株植物的植物产量。出于比较目的，例如对于玉米，标准种植密度可以是每英亩约25,000株植物至每英亩约35,000株植物，而例如对于大豆，标准种植密度可在每英亩约100,000株植物至每英亩约125,000株植物的范围内。如本领域所理解的，标准种植密度将至少根据作物种类而变化。如本文所用，与在正常光下生长的无效/野生型品系相比，“以增加的密度种植，而不降低植物产量”意指产量降低10％或更小。也就是说，当以增加的密度种植时，包含降低SAR的本发明的突变的植物的产率将是在正常光下生长的无效/野生型品系的产率的约90％-100％。
在一些实施例中，和与一株或多株植物紧邻种植的不包含减少的避荫响应的植物相比，包含如本文所述的PIF基因中的突变的植物在与一株或多株植物紧邻种植时可以表现出减少的避荫响应，任选地在与一株或多株植物紧邻种植时表现出以下表型中的至少一种：增加的产量、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。
在一些实施例中，所述内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的所述至少一个突变产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因与包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的经突变的PIF基因具有至少90％序列同一性(例如，至少91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5％，任选地所述序列同一性可以是100％)，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，提供了一种植物细胞，其包含编辑系统，所述编辑系统包含：(a)CRISPR-Cas相关效应蛋白；以及(b)向导核酸(gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，所述向导核酸具有间隔子序列，所述间隔子序列与编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性靶基因具有互补性。内源性PIF转录因子可以是任何参与避荫响应的PIF转录因子。在一些实施例中，内源性PIF基因编码碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子(例如，PIF转录因子)。在一些实施例中，所述向导核酸的间隔子序列与其共享互补性的所述PIF基因(a)包含与SEQ IDNO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。在一些实施例中，可用于本发明的间隔子序列可以包括但不限于SEQ ID NO:114-119中的任一者的核苷酸序列或其反向互补序列或其组合。编辑系统可用于在编码PIF蛋白质的内源性靶基因中产生突变。在一些实施例中，突变是非天然突变。
在一些实施例中，提供了一种植物细胞，其包含在光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变，其中所述突变是使用包含与编码所述PIF转录因子的内源性PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域的编辑系统引入到所述内源性PIF基因中的取代、插入和/或缺失，其中所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。在一些实施例中，所述编辑系统的所述核酸结合结构域可以来自由多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。
在一些实施例中，内源性PIF基因中产生的缺失或插入可以是1个碱基对至约100个碱基对(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个碱基对，或其中的任何范围或值)的缺失或插入。在一些实施例中，所述突变可以是PIF基因中的一个或多个碱基对的取代。在一些实施例中，所述取代可以在PIF基因的编码碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域的区中。在一些实施例中，PIF基因中的突变可以位于PIF基因的与编码SEQ ID NO:113的氨基酸序列的核酸序列具有至少80％序列同一性的区中。
在一些实施例中，突变可以是变为A、T、G或C的碱基取代，任选地其中所述碱基取代产生氨基酸取代。在一些实施例中，至少一个突变可以是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ ID NO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ IDNO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的碱基取代。在一些实施例中，所述至少一个突变可以是在参考SEQ ID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代。在一些实施例中，氨基酸取代可以是将谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)(E>K)的取代，任选地参考SEQ ID NO:113的E6K。在一些实施例中，编码PIF转录因子的内源性基因中的至少一个突变(例如，一个或多个突变)可以产生显性负等位基因、隐性等位基因、无效等位基因、弱功能丧失型等位基因或亚效等位基因。在一些实施例中，突变可以是非天然突变。
可用于本发明的植物或植物部分可以是双子叶植物或单子叶植物。可用于本发明的植物或其部分的非限制性实例包括但不限于玉米、大豆、油菜籽、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、核桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜、黑莓、树莓、覆盆子或芸苔(Brassica spp)。在一些实施例中，植物部分可以是来自植物的细胞，所述植物包括但不限于单子叶植物或双子叶植物，任选地玉米、大豆、油菜籽、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、核桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜、黑莓、树莓、覆盆子或芸苔。在一些实施例中，植物可以由本发明的植物细胞或植物部分再生。在一些方面中，植物细胞可以是不再生成植物的非繁殖植物细胞。包含PIF基因中的至少一个突变的本发明的植物可以包含减弱的避荫响应(SAR)。在一些实施例中，和与一株或多株植物紧邻种植的不包含减少的避荫响应的植物相比，包含PIF基因中的至少一个突变的由本发明的植物细胞再生的植物在与一株或多株植物紧邻种植时可以表现出减少的避荫响应，任选地在与一株或多株植物紧邻种植时可以表现出以下表型中的至少一种：增加的产量、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。在一些实施例中，再生植物能够以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量，任选地其中种植密度增加了约5％至约75％，而不降低基于每株植物的植物产量。
在一些实施例中，植物细胞中所包含的经突变的PIF基因可以与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性(任选地序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)，和/或可以编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
本文还提供了一种提供多株植物的方法，当所述多株植物中的每株植物在种植区中彼此紧邻种植时，所述多株植物具有增加的产量(例如，增加的小花繁殖力、增加的种子数量和/或增加的种子重量)的多株植物的方法，所述方法包含将两株或更多株本发明的植物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、400、5000或10,000株或更多株本发明的植物)(例如，包含PIF基因中的突变并且具有减弱的避荫响应)在种植区中种植，由此提供与不包含所述突变的多株对照植物相比(例如，与不包含所述突变的等基因野生型植物相比)具有增加的产量的多株植物。种植区可以是多株植物可以种植在一起的任何区，包括但不限于田地(例如，耕地、农田)、生长室、温室、休闲区、草坪和/或路边等。
“紧邻”是指可以产生SAR的任何特定植物种类的高种植密度。例如，在一些实施例中，“紧邻”包括由植物的种子间隔约6.1英寸或更小(例如，间隔约6.1、6、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.2、5.1、5、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4、3.9、3.8、3.7、3.6、3.5、3.4、3.3、3.2、3.1、3、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1、2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5英寸等或其中的任何范围或值)进行种植得到的植物的密度。如本领域技术人员所理解的，为实现高密度种植，每英亩种植的种子数量将根据植物种类而变化。例如，玉米的高密度种植包括在30英寸或更大的行距下每英亩每英亩大于35,000粒种子。
在一些实施例中，提供了一种生产/培育不含转基因的经编辑的植物的方法，所述方法包含：使本发明的植物(例如，包含如本文所述的内源性PIF基因中的突变并且具有减弱的避荫响应的植物)与不含转基因的植物杂交，由此将至少一个突变(例如，一个或多个突变)引入到所述不含转基因的植物中(例如，引入到子代植物中)；以及选择包含所述至少一个突变并且不含转基因的子代植物，由此产生不含转基因的经编辑(例如，经碱基编辑)的植物。在一些实施例中，至少一个突变可以是非天然突变。
在一些实施例中，本发明提供了一种在植物中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中产生突变的方法，所述方法包含：(a)将基因编辑系统靶向到所述PIF基因的一部分，所述部分(i)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(iv)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％；以及(b)选择包含位于所述PIF基因的区中的修饰的植物，所述区与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性。在一些实施例中，产生的突变产生与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核酸和/或产生与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的多肽。
在一些实施例中，提供了在PIF基因中产生变化的方法，所述方法包含：将编辑系统引入到植物细胞中，其中所述编辑系统靶向到编码所述PIF多肽的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因的区，以及使所述内源性PIF基因的所述区与所述编辑系统接触，由此将突变引入到所述内源性PIF基因中并在所述植物细胞的所述PIF多肽中产生变化。在一些实施例中，产生变化的PIF基因包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的核苷酸序列和/或编码与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，PIF基因的可以被靶向的区与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者包含至少80％序列同一性，任选地其中所述PIF基因的可以被靶向的区编码与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，使植物细胞中的内源性PIF基因的区与编辑系统接触产生植物细胞，所述植物细胞在其基因组中包含经编辑的内源性PIF基因。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含(a)由所述植物细胞再生植物；(b)使所述植物自交以产生子代植物(E1)；(c)测定(b)的所述子代植物的减少的避荫响应(SAR)/避荫综合征(SAS)；以及(d)选择与缺乏所述突变的对照植物相比表现出减少的避荫响应(SAR)/避荫综合征(SAS)的所述子代植物。在一些实施例中，所述方法可以进一步包含(e)使(d)的所选子代植物自交以产生子代植物(E2)；(f)测定(e)的所述子代植物的减少的避荫响应(SAR)/避荫综合征(SAS)；以及(g)选择与对照植物相比表现出减少的避荫响应(SAR)/避荫综合征(SAS)的所述子代植物，任选地另外重复(e)至(g)一次或多次。
在一些实施例中，由本发明的方法产生的经突变的PIF基因可以包含与SEQ IDNO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，植物可以包含如本文所述的一个或多个(例如，至少一个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个)经突变的PIF基因，任选地其中对于任何给定等位基因处的一个或多个突变，经编辑的植物可以是杂合的或纯合的或其组合。在一些实施例中，植物可以是杂合的，并且在其基因组中的特定基因座处包含PIF基因的一个等位基因中的突变，并且在相同基因的第二拷贝中的相同基因座处是野生型。在一些实施例中，在特定PIF基因座中，植物可以包含特定PIF基因的每个等位基因处的不同的突变，或者可以包含在每个等位基因处的相同的突变。
在一些实施例中，提供了一种检测植物或植物部分(例如，植物细胞)中的突变体PIF基因(内源性PIF基因中的突变)的方法，所述方法包含在所述植物的基因组中检测PIF基因，所述PIF基因具有在与SEQ ID NO:84-112中的任一者的核苷酸序列，任选地与SEQ IDNO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)的区内的至少一个突变，任选地其中所述突变是至少一个核苷酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)的取代。在一些实施例中，被检测的突变体PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，提供了一种用于编辑植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包含以位点特异性方式切割所述植物细胞中的内源性PIF基因内的靶位点，所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此在所述植物细胞的所述内源性PIF基因中产生编辑。在一些实施例中，PIF基因编码包含碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域的PIF转录因子，并且所述编辑在由内源性PIF基因编码的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中产生突变。在一些实施例中，编辑在内源性PIF转录因子基因中产生突变，任选地非天然突变，所述突变产生具有降低的DNA结合的PIF转录因子。在一些实施例中，所述编辑可以位于PIF转录因子的区中，所述区与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地至少90％或95％，任选地100％)。在一些实施例中，内源性PIF基因中的编辑可以产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因与如本文所述的经突变的PIF基因具有至少90％序列同一性(例如，90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)，和/或经突变的PIF转录因子，所述经突变的PIF转录因子与具有SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者的氨基酸序列的经突变的PIF转录因子多肽具有至少90％序列同一性(例如，至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，任选地所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)。在一些实施例中，植物可以由包含内源性PIF基因中的编辑的植物细胞再生，以产生在其内源性PIF基因中包含所述编辑的植物。在一些实施例中，植物不是由植物细胞再生的。在一些实施例中，与不包含编辑的对照植物相比，包含在其内源性PIF基因中的编辑的植物表现出减弱的避荫响应。
当与缺乏如本文所述进行编辑的内源性PIF基因的对照植物相比时，包含如本文所述进行编辑的内源性PIF基因以提供PIF转录因子的植物，任选地具有降低的DNA结合，可以表现出减弱的避荫响应。包含如本文所述的经编辑的内源性PIF基因的植物可以与在相同环境条件下生长时未被如此编辑的植物进行比较，所述环境条件例如具有低R:FR光比率的环境，例如避荫条件(例如，约0.16的R:FR比率；或范围为约0.09至约0.7(例如，约0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、018、0.19、0.2、0.21、0.23、0.24、0.25至约0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7或其中的任何范围或值)的R:FR比率)。
在一些实施例中，提供了一种用于制备植物的方法，所述方法包含：(a)使包含编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因的植物细胞群体与靶向到所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接至与所述内源性基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性基因(i)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(iv)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％；(b)从所述群体中选择植物细胞，所述植物细胞包含所述编码PIF转录因子的内源性基因中的突变，其中所述突变是(iii)或(iv)的多肽中的或由(i)或(ii)的核苷酸序列中的任一者编码的多肽中的至少一个氨基酸残基的取代，其中所述突变修饰所述PIF转录因子的bHLH结构域；以及(c)使所选植物细胞生长成包含所述编码PIF转录因子的内源性基因中的所述突变的植物，任选地其中所述突变降低或消除所述PIF转录因子与DNA结合的能力。在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变可以产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135的核酸中的任一者具有至少90％序列同一性(例如，至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，任选地所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)和/或可以编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，提供了一种用于减少/抑制植物中的避荫响应的方法，所述方法包含：(a)使包含编码PIF转录因子的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因的植物细胞与靶向到所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接至与所述内源性PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性PIF基因：(i)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(iv)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(i)、(ii)、(iii)和/或(iv)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此产生包含在所述编码PIF多肽的内源性PIF基因中的突变的植物细胞；以及(b)使所述植物细胞生长成植物，由此减少/抑制所述植物中的所述避荫响应。在一些实施例中，所述经再生的植物包含经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135的核酸中的任一者具有至少90％序列同一性(例如，至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，任选地所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，提供了一种用于产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含具有在内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的突变的至少一个细胞(例如，一个或多个细胞)，所述方法包含使所述植物或其部分中的所述内源性PIF基因内的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的所述核酸结合结构域与所述内源性PIF基因内的靶位点结合，其中所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此产生植物或其部分，所述植物或其部分包含具有在所述内源性PIF基因中的突变的至少一个细胞。在一些实施例中，具有经突变的内源性PIF基因的植物或其部分中的至少一个细胞产生与DNA结合减少的PIF转录因子。在一些实施例中，所产生的植物包含经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135的核酸中的任一者具有至少90％序列同一性(例如，至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，任选地所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，一种产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含在光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变，所述方法包含使所述植物或其部分中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的所述核酸结合结构域与所述内源性PIF基因内的所述靶位点结合，其中所述内源性PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此产生植物或其部分，所述植物或其部分具有含有经修饰的bHLH结构域的经突变的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子。在一些实施例中，所述方法可以产生植物或其部分，所述植物或其部分包含经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135的核酸中的任一者具有至少90％序列同一性(例如，至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％，任选地所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
在一些实施例中，内源性PIF基因可以是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因，所述基因编码PIF转录因子能够调节所述植物中的对光照的响应(例如，避荫响应(SAR))。
在一些实施例中，靶位点可以是PIF基因的区或在所述区内，所述区与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少85％或者可以是至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)，或与编码SEQ ID NO:113的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性。
在一些实施例中，突变可以是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入，任选地是非天然突变。在一些实施例中，突变是变为A、T、G或C的碱基取代。在一些实施例中，PIF基因中的突变引起经编码的PIF转录因子中的氨基酸取代，任选地其中所述氨基酸取代破坏PIF转录因子的bHLH结构域。在一些实施例中，所述突变可以是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ ID NO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代，任选地其中所述至少一个突变是在参考SEQ ID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代，任选地将谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)(E>K)的取代(例如，参考SEQ ID NO:113的E6K)。在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变产生具有降低的DNA结合的PIF转录因子。在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变可以是显性负突变、隐性突变、无效突变、弱功能丧失型突变或亚效突变。
在一些实施例中，通过本发明的方法产生的植物或其部分包含如本文所述的经突变的内源性PIF基因和/或经突变的PIF转录因子，并且与缺乏内源性PIF基因中的突变的对照植物，例如，所述植物或植物部分在其内源性PIF基因内不具有与编辑系统或包含切割结构域和核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)的核酸酶接触的靶位点相比，表现出减弱/减少的避荫响应。在一些实施例中，当在相同的环境条件(例如避荫环境，例如低R:FR比率环境)下生长时，可以在经编辑的植物与对照植物之间进行与对照植物的比较。
和与一株或多株其它植物紧邻种植的缺乏如本文所述的经突变的内源性PIF转录因子的植物相比，包含如本文所述的经突变的内源性PIF基因并且表现出减弱/减少的避荫响应的植物在与一株或多株其它植物紧邻种植时进一步表现出一种或多种表型，所述一种或多种表型可以包括但不限于：增加的产量、增加的直立生长、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；开花时间没有变化和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。在一些实施例中，具有减少的SAR的植物比在相同环境条件(例如，避荫环境，例如，低R:FR比率环境)下生长的对照植物矮至少约5％(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150％或更矮或其中的任何范围或值)。包含如本文所述的经突变的内源性PIF转录因子并且表现出减弱/减少的避荫响应的植物可以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量，任选地其中种植密度可以增加了约5％至约75％(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74或75％或其中的任何范围或值)，而不降低基于每株植物的植物产量。
在一些实施例中，与植物细胞、植物细胞群体和/或靶位点接触的核酸酶切割内源性PIF基因，由此将突变引入到由内源性PIF基因编码的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中。可用于本发明的核酸酶可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸酶。此类核酸酶包括但不限于锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如，Fok1)和/或CRISPR-Cas效应蛋白。同样，可用于本发明的核酸酶的任何核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)可以是可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸结合结构域。此类核酸结合结构域包括但不限于锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute和/或CRISPR-Cas效应子DNA结合结构域。在一些实施例中，突变是非天然突变。
在一些实施例中，提供了一种编辑植物或植物部分中的内源性PIF基因的方法，所述方法包含使所述植物或植物部分中的所述PIF基因内的靶位点与胞嘧啶碱基编辑系统接触，所述胞嘧啶碱基编辑系统包含胞嘧啶脱氨酶和与所述PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，其中所述PIF基因(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ IDNO:84-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ IDNO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此编辑所述植物或植物部分中的所述内源性PIF基因。在一些实施例中，突变降低了由PIF转录因子进行的DNA结合。在一些实施例中，包含具有如本文所述的突变的内源性PIF基因的植物表现出减少的避荫响应(SAR)(例如，在与其它植物紧邻种植时增加的产量)。
在一些实施例中，提供了一种编辑植物或植物部分中的内源性PIF基因的方法，所述方法包含使所述植物或植物部分中的所述PIF基因内的靶位点与胞嘧啶碱基编辑系统接触，所述胞嘧啶碱基编辑系统包含腺嘌呤脱氨酶和与所述PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，其中所述PIF基因(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ IDNO:84-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ IDNO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此编辑所述植物或植物部分中的所述内源性PIF基因。在一些实施例中，突变降低了由PIF转录因子进行的DNA结合。在一些实施例中，包含具有如本文所述的突变的内源性PIF基因的植物表现出减少的避荫响应(SAR)(例如，在与其它植物紧邻种植时增加的产量)。
在一些实施例中，提供了一种用于修饰植物或其部分中的内源性PIF基因以减少/抑制所述植物或其部分中的避荫响应(SAR)的方法，所述方法包含修饰所述植物或其部分中的所述内源性PIF基因内的靶位点，其中所述内源性PIF基因(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此修饰所述内源性PIF基因并且减少/抑制SAR植物或其部分。在一些实施例中，靶位点是PIF基因的区，所述区与SEQ IDNO:84-112中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性，任选地其中序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。
在一些实施例中，本发明提供了一种产生包含内源性PIF基因中的突变以及至少一种所关注的多核苷酸的植物的方法，所述方法包含使包含内源性PIF基因中的至少一个突变的本发明的植物(第一植物)与包含至少一种所关注的多核苷酸的第二植物杂交以产生子代植物；以及选择包含PIF基因中的至少一个突变和所述至少一种所关注的多核苷酸的子代植物，由此产生所述包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物。
还提供了一种产生包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物的方法，所述方法包含将至少一种所关注的多核苷酸引入到包含PIF基因中的至少一个突变的本发明的植物中，由此产生包含PIF基因中的至少一个突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物。
另外还提供了一种产生植物的方法，所述植物包含内源性PIF基因中的突变并表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型，所述方法包含使作为本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)的第一植物与表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的第二植物杂交；以及选择包含所述PIF基因中的所述突变以及改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的子代植物，由此产生所述包含内源性PIF基因中的突变并与对照植物相比表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的植物。
在一些实施例中，本发明提供了一种产生包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物的方法，所述方法包含使作为本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)的第一植物与包含至少一种所关注的多核苷酸的第二植物杂交以产生子代植物；以及选择包含PIF基因中的突变和所述至少一种所关注的多核苷酸的子代植物，由此产生所述包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物。
还提供了一种产生包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物的方法，所述方法包含将至少一种所关注的多核苷酸引入到本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)中，由此产生包含PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物。
在一些实施例中，提供了一种产生植物的方法，所述植物包含内源性PIF基因中的突变并表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型，所述方法包含使作为本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)的第一植物与表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的第二植物杂交；以及选择包含所述PIF基因中的所述突变以及改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的子代植物，由此产生所述包含内源性PIF基因中的突变并与对照植物相比表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的植物。
还提供了一种控制容器(例如，盆或种子盘等)、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上的杂草的方法，所述方法包含向在容器、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上生长的一株或多株(多株)本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)施涂除草剂，由此控制其中正在生长所述一株或多株植物的所述容器、所述生长室、所述温室、所述田地、所述休闲区、所述草坪中或所述路边上的所述杂草。
在一些实施例中，提供了一种减少植物上的昆虫捕食的方法，所述方法包含向一株或多株本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)施涂杀虫剂，由此减少所述一株或多株植物上的昆虫捕食。
在一些实施例中，提供了一种减少植物上的真菌病的方法，所述方法包含向一株或多株本发明的植物(例如包含内源性PIF基因中的至少一个突变)施涂杀真菌剂，由此减少所述一株或多株植物上的真菌病，任选地其中所述一株或多株植物在容器、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上生长。
在一些实施例中，提供了一种减少植物上的细菌病的方法，所述方法包含向一株或多株本发明的植物(例如，包含内源性PIF基因中的至少一个突变)施涂杀细菌剂，由此减少所述一株或多株植物上的细菌病，任选地其中所述一株或多株植物在容器、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上生长。
所关注的多核苷酸可以是能够赋予植物期望的表型或以其它方式改变植物的表型或基因型的任何多核苷酸。在一些实施例中，所关注的多核苷酸可以包括但不限于赋予除草剂耐受性、昆虫抗性、线虫抗性、抗病性、增加的产量、增加的养分利用效率和/或非生物胁迫抗性的多核苷酸。
因此，要根据本发明优先处理的植物或植物栽培品种包括通过遗传修饰获得遗传物质的所有植物，所述遗传物质赋予这些植物特别有利的有用特性(“性状”)。此类特性的实例是更好的植物生长、活力、胁迫耐受性、直立性、抗倒伏性、养分吸收、植物营养和/或产量，特别是改善的生长、增加的对高温或低温的耐受性、增加的对干旱或水或土壤盐度水平的耐受性、增强的开花性能、更容易收获、加速成熟、更高产量、更高品质和/或收获产品的更高营养价值、收获产品的更好储存寿命和/或可加工性。
此类特性的另外实例是增加的对动物和微生物害虫的抗性，如对昆虫、蛛形纲动物、线虫、螨虫、蛞蝓和蜗牛的抗性，这是由于例如植物中形成的毒素引起的。在编码赋予对此类动物和微生物害虫，特别是昆虫的耐受性特性的蛋白质的DNA序列中，将特别提到来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的编码Bt蛋白的遗传物质，Bt蛋白在文献中被广泛描述并为本领域技术人员所熟知。还将提到从如发光杆菌属(Photorhabdus)等细菌中提取的蛋白质(WO97/17432和WO98/08932)。具体地，将提到Bt Cry或VIP蛋白，其包括CrylA、CryIAb、CryIAc、CryIIA、CryIIIA、CryIIIB2、Cry9c Cry2Ab、Cry3Bb和CryIF蛋白或其毒性片段，以及其杂交体或组合，尤其是CrylF蛋白或源自CrylF蛋白的杂交体(例如，杂交CrylA-CrylF蛋白或其毒性片段)，CrylA型蛋白或其毒性片段，优选地CrylAc蛋白或来源于CrylAc蛋白的杂交体(例如，杂交CrylAb-CrylAc蛋白)或CrylAb或Bt2蛋白或其毒性片段，Cry2Ae、Cry2Af或Cry2Ag蛋白或其毒性片段，CrylA.105蛋白或其毒性片段，VIP3Aa19蛋白，VIP3Aa20蛋白，在COT202或COT203棉花事件中产生的VIP3A蛋白，如Estruch等人(1996),《美国国家科学院院刊》28；93(11):5389-94中所述的VIP3Aa蛋白或其毒性片段，如WO2001/47952中所述的Cry蛋白，来自致病杆菌属(Xenorhabdus)(如WO98/50427中所述)、沙雷氏菌属(Serratia)(特别是来自嗜虫沙雷氏菌(S.entomophila))或发光杆菌属菌株的杀虫蛋白，如WO98/08932中所述的来自发光杆菌属的Tc蛋白。此外，本文中还包括这些蛋白质中的任何一种在一些氨基酸(1-10个，优选地1-5个)上不同于任何上述命名的序列的任何变体或突变体，这些序列特别是其毒性片段的序列，或者融合到转运肽，如质体转运肽，或另一种蛋白质或肽。
此类特性的另一个特别强调的实例是赋予对一种或多种除草剂的耐受性，所述一种或多种除草剂例如为咪唑啉酮、磺酰脲、草甘膦或草丁膦。在编码蛋白质(这些蛋白质赋予经转化的植物细胞和植物对某些除草剂的耐受性的特性)的DNA序列(即，所关注的多核苷酸)中，将特别提到WO2009/152359中描述的bar或PAT基因或天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)基因，所述基因赋予对草铵膦除草剂的耐受性；编码合适的EPSPS(5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸-合成酶)的基因，所述基因赋予对以EPSPS为靶标的除草剂(尤其是如草甘膦及其盐的除草剂)的耐受性；编码草甘膦-n-乙酰转移酶的基因，或编码草甘膦氧化还原酶的基因。另外合适的除草剂耐受性性状包括至少一种ALS(乙酰乳酸合酶)抑制剂(例如，WO2007/024782)；经突变的拟南芥ALS/AHAS基因(例如，美国专利6,855,533)；编码2,4-D-单加氧酶的基因，所述基因赋予对2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的耐受性；以及编码麦草畏单加氧酶的基因，所述基因赋予对麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的耐受性。
此类特性的另外实例是增加的对植物病原真菌、细菌和/或病毒的抗性，这是由于例如系统获得性抗性(SAR)、系统素、植物抗毒素、激发子以及抗性基因和相应表达的蛋白质和毒素引起的。
可根据本发明优先处理的转基因植物或植物栽培品种中特别有用的转基因事件包括事件531/PV-GHBK04(棉花，昆虫对照，描述于WO2002/040677)、事件1143-14A(棉花，昆虫对照，未存放，描述于WO2006/128569)；事件1143-51B(棉花，昆虫对照，未存放，描述于WO2006/128570)；事件1445(棉花，除草剂耐受性，未存放，描述于US-A 2002-120964或WO2002/034946)；事件17053(水稻，除草剂耐受性，存放为PTA-9843，描述于WO2010/117737)；事件17314(水稻，除草剂耐受性，存放为PTA-9844，描述于WO2010/117735)；事件281-24-236(棉花，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为PTA-6233，描述于WO2005/103266或US-A 2005-216969)；事件3006-210-23(棉花，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为PTA-6233，描述于US-A 2007-143876orWO2005/103266)；事件3272(玉米，品质性状，存放为PTA-9972，描述于WO2006/098952或US-A 2006-230473)；事件33391(小麦，除草剂耐受性，存放为PTA-2347，描述于WO2002/027004)、事件40416(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCCPTA-11508，描述于WO 11/075593)；事件43A47(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCCPTA-11509，描述于WO2011/075595)；事件5307(玉米，昆虫对照，存放为ATCC PTA-9561，描述于WO2010/077816)；事件ASR-368(常绿草，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-4816，描述于US-A2006-162007或WO2004/053062)；事件B16(玉米，除草剂耐受性，未存放，描述于US-A2003-126634)；事件BPS-CV127-9(大豆，除草剂耐受性，存放为NCIMB No.41603，描述于WO2010/080829)；事件BLRl(油菜籽，雄性不育的恢复，存放为NCIMB 41193，描述于WO2005/074671)、事件CE43-67B(棉花，昆虫对照，存放为DSMACC2724，描述于US-A 2009-217423或WO2006/128573)；事件CE44-69D(棉花，昆虫对照，未存放，描述于US-A 2010-0024077)；事件CE44-69D(棉花，昆虫对照，未存放，描述于WO2006/128571)；事件CE46-02A(棉花，昆虫对照，未存放，描述于WO2006/128572)；事件COT102(棉花，昆虫对照，未存放，描述于US-A2006-130175或WO2004/039986)；事件COT202(棉花，昆虫对照，未存放，描述于US-A2007-067868或WO2005/054479)；事件COT203(棉花，昆虫对照，未存放，描述于WO2005/054480)；事件DAS21606-3/1606(大豆，除草剂耐受性，存放为PTA-11028，描述于WO2012/033794)、事件DAS40278(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-10244，描述于WO2011/022469)；事件DAS-44406-6/pDAB8264.44.06.l(大豆，除草剂耐受性，存放为PTA-11336，描述于WO2012/075426)、事件DAS-14536-7/pDAB8291.45.36.2(大豆，除草剂耐受性，存放为PTA-11335，描述于WO2012/075429)、事件DAS-59122-7(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCCPTA11384，描述于US-A2006-070139)；事件DAS-59132(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，未存放，描述于WO2009/100188)；事件DAS68416(大豆，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-10442，描述于WO2011/066384或WO2011/066360)；事件DP-098140-6(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-8296，描述于US-A2009-137395或WO 08/112019)；事件DP-305423-1(大豆，品质性状，未存放，描述于US-A2008-312082或WO2008/054747)；事件DP-32138-1(玉米，杂交系统，存放为ATCC PTA-9158，描述于US-A2009-0210970或WO2009/103049)；事件DP-356043-5(大豆，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-8287，描述于US-A 2010-0184079或WO2008/002872)；事件EE-I(茄子，昆虫对照，未存放，描述于WO 07/091277)；事件Fil 17(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC 209031，描述于US-A2006-059581或WO 98/044140)；事件FG72(大豆，除草剂耐受性，存放为PTA-11041，描述于WO2011/063413)、事件GA21(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC 209033，描述于US-A2005-086719或WO 98/044140)；事件GG25(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC 209032，描述于US-A 2005-188434或WO98/044140)；事件GHB119(棉花，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-8398，描述于WO2008/151780)；事件GHB614(棉花，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-6878，描述于US-A 2010-050282或W02007/017186)；事件GJ11(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC 209030，描述于US-A 2005-188434或WO98/044140)；事件GM RZ13(糖甜菜，病毒抗性，存放为NCIMB-41601，描述于WO2010/076212)；事件H7-l(糖甜菜，除草剂耐受性，存放为NCIMB 41158或NCIMB 41159，描述于US-A 2004-172669或WO 2004/074492)；事件JOPLINl(小麦，耐病性，未存放，描述于US-A2008-064032)；事件LL27(大豆，除草剂耐受性，存放为NCIMB41658，描述于WO2006/108674或US-A2008-320616)；事件LL55(大豆，除草剂耐受性，存放为NCIMB 41660，描述于WO2006/108675或US-A 2008-196127)；事件LLcotton25(棉花，除草剂耐受性，存放为ATCCPTA-3343，描述于WO2003/013224或US A2003-097687)；事件LLRICE06(水稻，除草剂耐受性，存放为ATCC 203353，描述于US 6,468,747或WO2000/026345)；事件LLRice62(水稻，除草剂耐受性，存放为ATCC 203352，描述于WO2000/026345)、事件LLRICE601(水稻，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-2600，描述于US-A 2008-2289060或WO2000/026356)；事件LY038(玉米，品质性状，存放为ATCC PTA-5623，描述于US-A 2007-028322或WO2005/061720)；事件MIR162(玉米，昆虫对照，存放为PTA-8166，描述于US-A 2009-300784或WO2007/142840)；事件MIR604(玉米，昆虫对照，未存放，描述于US-A 2008-167456或WO2005/103301)；事件MON15985(棉花，昆虫对照，存放为ATCC PTA-2516，描述于US-A 2004-250317或WO2002/100163)；事件MON810(玉米，昆虫对照，未存放，描述于US-A 2002-102582)；事件MON863(玉米，昆虫对照，存放为ATCC PTA-2605，描述于WO2004/011601或US-A2006-095986)；事件MON87427(玉米，授粉控制，存放为ATCC PTA-7899，描述于WO2011/062904)；事件MON87460(玉米，抗压能力，存放为ATCC PTA-8910，描述于WO2009/111263或US-A 2011-0138504)；事件MON87701(大豆，昆虫对照，存放为ATCC PTA-8194，描述于US-A 2009-130071或WO2009/064652)；事件MON87705(大豆，品质性状-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-9241，描述于US-A 2010-0080887或WO2010/037016)；事件MON87708(大豆，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-9670，描述于WO2011/034704)；事件MON87712(大豆，产量，存放为PTA-10296，描述于WO2012/051199)、事件MON87754(大豆，品质性状，存放为ATCC PTA-9385，描述于WO2010/024976)；事件MON87769(大豆，品质性状，存放为ATCC PTA-8911，描述于US-A 2011-0067141或WO2009/102873)；事件MON88017(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCCPTA-5582，描述于US-A 2008-028482或WO2005/059103)；事件MON88913(棉花，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-4854，描述于WO2004/072235或US-A2006-059590)；事件MON88302(油菜籽，除草剂耐受性，存放为PTA-10955，描述于WO2011/153186)、事件MON88701(棉花，除草剂耐受性，存放为PTA-11754，描述于WO2012/134808)、事件MON89034(玉米，昆虫对照，存放为ATCC PTA-7455，描述于WO 07/140256或US-A 2008-260932)；事件MON89788(大豆，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-6708，描述于US-A2006-282915或WO2006/130436)；事件MSl 1(油菜籽，授粉控制-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-850或PTA-2485，描述于WO2001/031042)；事件MS8(油菜籽，授粉控制-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-730，描述于WO2001/041558或US-A2003-188347)；事件NK603(玉米，除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-2478，描述于US-A2007-292854)；事件PE-7(水稻，昆虫对照，未存放，描述于WO2008/114282)；事件RF3(油菜籽，授粉控制-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-730，描述于WO2001/041558或US-A2003-188347)；事件RT73(油菜籽，除草剂耐受性，未存放，描述于WO2002/036831或US-A2008-070260)；事件SYHT0H2/SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，存放为PTA-11226，描述于WO2012/082548)、事件T227-1(糖甜菜，除草剂耐受性，未存放，描述于WO2002/44407或US-A2009-265817)；事件T25(玉米，除草剂耐受性，未存放，描述于US-A 2001-029014或WO2001/051654)；事件T304-40(棉花，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-8171，描述于US-A2010-077501或WO2008/122406)；事件T342-142(棉花，昆虫对照，未存放，描述于WO2006/128568)；事件TC1507(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，未存放，描述于US-A2005-039226或WO2004/099447)；事件VIP1034(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为ATCC PTA-3925，描述于WO2003/052073)、事件32316(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为PTA-11507，描述于WO2011/084632)、事件4114(玉米，昆虫对照-除草剂耐受性，存放为PTA-11506，描述于W02011/084621)、事件EE-GM3/FG72(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11041)，任选地用以下事件叠加：事件EE-GM1/LL27或事件EE-GM2/LL55(WO2011/063413A2)、事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10442，WO2011/066360Al)、事件DAS-68416-4(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10442，WO2011/066384Al)、事件DP-040416-8(玉米，昆虫对照，ATCC登录号PTA-11508，WO2011/075593Al)、事件DP-043A47-3(玉米，昆虫对照，ATCC登录号PTA-11509，WO2011/075595Al)、事件DP-004114-3(玉米，昆虫对照，ATCC登录号PTA-11506，WO2011/084621Al)、事件DP-032316-8(玉米，昆虫对照，ATCC登录号PTA-11507，WO2011/084632Al)、事件MON-88302-9(油菜籽，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-10955，WO2011/153186Al)、事件DAS-21606-3(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11028，WO2012/033794A2)、事件MON-87712-4(大豆，品质性状，ATCC登录号PTA-10296，WO2012/051199A2)、事件DAS-44406-6(大豆，叠加除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11336，WO2012/075426Al)、事件DAS-14536-7(大豆，叠加除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11335，WO2012/075429Al)、事件SYN-000H2-5(大豆，除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11226，WO2012/082548A2)、事件DP-061061-7(油菜籽，除草剂耐受性，未存放不可用，WO2012071039Al)、事件DP-073496-4(油菜籽，除草剂耐受性，未存放不可用，US2012131692)、事件8264.44.06.1(大豆，叠加除草剂耐受性，登录号PTA-11336，WO2012075426A2)、事件8291.45.36.2(大豆，叠加除草剂耐受性，登录号PTA-11335，WO2012075429A2)、事件SYHT0H2(大豆，ATCC登录号PTA-11226，WO2012/082548A2)、事件MON88701(棉花，ATCC登录号PTA-11754，WO2012/134808Al)、事件KK179-2(苜蓿ATCC登录号PTA-11833，WO2013/003558Al)、事件pDAB8264.42.32.1(大豆，叠加除草剂耐受性，ATCC登录号PTA-11993，WO2013/010094Al)、事件MZDT09Y(玉米，ATCC登录号PTA-13025，WO2013/012775Al)。
赋予所讨论的所需性状的基因/事件(例如，所关注的多核苷酸)也可在转基因植物中彼此组合存在。可能提及的转基因植物的实例是重要的作物植物，如谷类(小麦、水稻、黑小麦、大麦、黑麦、燕麦)、玉米、大豆、马铃薯、糖甜菜、甘蔗、番茄、豌豆和其它类型的蔬菜、棉花、烟草、油菜籽以及水果植物(水果有苹果、梨、柑橘类水果和葡萄)，特别强调的是玉米、大豆、小麦、水稻、马铃薯、棉花、甘蔗、烟草和油菜籽。特别强调的性状是植物对昆虫、蛛形纲动物、线虫、蛞蝓和蜗牛的抗性增强，以及植物对一种或多种除草剂的抗性增强。
可根据本发明优先处理的此类植物、植物部分或植物种子的市售实例包括商业产品，如以RIBROUNDUPVT DOUBLEVT TRIPLEBOLLGARDROUNDUP READY 2ROUNDUP2XTENDTM、INTACTA RR2VISTIVE和/或XTENDFLEXTM商品名销售或分销的植物种子。
可用于本发明的PIF基因包括能够调节所述植物中的对光照的响应(例如，避荫响应(SAR))的任何内源性PIF基因，并且其中如本文所述的突变可以在包含突变的植物或其部分中赋予减少的SAR/SAS。在一些实施例中，PIF基因编码碱性亮氨酸拉链(bZIP)转录因子并且在促进光形态发生中起作用，例如PIF转录因子。在一些实施例中，PIF基因(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。
在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变可以是产生PIF转录因子的任何突变，所述任何突变可以在包含经突变的PIF基因的植物中赋予减少的SAR响应，任选地可以在与其它植物紧邻种植时赋予增加的产量。在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变可以是非天然突变。在一些实施例中，内源性PIF基因中的至少一个突变(例如，一个或多个突变)是点突变，任选地是碱基取代、碱基插入和/或碱基缺失。在一些实施例中，内源性PIF基因中的至少一个突变是显性负突变、隐性突变、无效突变、弱功能丧失型突变或亚效突变。在一些实施例中，植物中的内源性PIF基因中的突变可以是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入，所述突变产生在与其它植物紧邻种植时具有减少的SAR响应和/或增加的产量的植物。在一些实施例中，植物中的内源性PIF基因中的突变可以是取代、缺失和/或插入，所述突变引起显性负突变、隐性突变、无效突变、弱功能丧失型突变或亚效突变以及在与其它植物紧邻种植时具有减少的SAR响应和/或增加的产量的植物。例如，突变可以是1个核苷酸或2、3、4或5个连续核苷酸取代、缺失和/或插入成约100个连续核苷酸。在一些实施例中，突变可以是变为A、T、G或C的碱基取代。在一些实施例中，PIF基因中的突变产生经编码的PIF转录因子中的氨基酸取代，任选地其中所述氨基酸取代破坏PIF转录因子的bHLH结构域。在一些实施例中，所述突变可以是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ IDNO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代，任选地其中所述至少一个突变是在参考SEQ IDNO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代，任选地将谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)(E>K)的取代(例如，参考SEQ ID NO:113的E6K)。在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变产生具有降低的DNA结合的PIF转录因子。
在一些实施例中，通过本发明的方法产生的突变产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性(例如，至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)的经编辑的核苷酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽，任选地其中经突变的PIF基因中的突变是非天然突变。
在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变可以在通过编辑系统进行切割之后进行，所述编辑系统包含核酸酶和与靶核酸(例如，PIF基因)内的靶位点结合的核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域)。因此，在一些实施例中，本发明提供了一种用于修饰植物或其部分中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)以减少/抑制所述植物或其部分中的避荫响应的方法，所述方法包含修饰所述植物或其部分中的内源性PIF基因内的靶位点，其中所述内源性PIF基因(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的核苷酸序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，由此修饰所述内源性PIF基因并且减少/抑制所述植物或其部分中的避荫响应。在一些实施例中，内源性PIF基因的修饰产生经突变的内源性PIF基因，所述经突变的内源性PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％同一性的序列，任选地其中与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135的同一性百分比可以是至少95％，或者所述同一性百分比可以是100％。
可用于本发明的核酸酶可以切割内源性PIF基因，由此将突变引入到内源性PIF基因中。此类核酸酶包括但不限于锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如，Fok1)和/或CRISPR-Cas效应蛋白。同样，可用于本发明的核酸结合结构域(例如，DNA结合结构域、RNA结合结构域)包括可用于编辑/修饰靶核酸的任何核酸结合结构域。此类核酸结合结构域包括但不限于锌指、转录激活因子样DNA结合结构域(TAL)、argonaute和/或CRISPR-Cas效应子DNA结合结构域。
在一些实施例中，提供了一种向导核酸(例如，gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，所述向导核酸与内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合，所述内源性PIF基因包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；或编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；所述靶位点包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的一者具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，任选地其中所述序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。在一些实施例中，所述向导核酸与内源性PIF基因内的靶核酸结合，所述内源性PIF基因具有Zm00001d040536(SEQ ID NO:69)、Zm00001d008205(SEQ ID NO:72)、Zm00001d031044(SEQ ID NO:75)、Zm00001d033267(SEQ ID NO:78)和/或Zm00001d034298(SEQ ID NO:81)的基因标识号(基因ID)(Maize遗传学和基因组数据库(Maize GDB))，任选地其中Zm00001d040536(SEQ ID NO:69)内的靶区可以包含SEQ ID NO:84-87的核苷酸序列中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，Zm00001d008205(SEQ IDNO:72)内的靶区可以包含SEQ ID NO:88-91的核苷酸序列中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，Zm00001d031044(SEQ ID NO:75)内的靶区可以包含SEQ ID NO:92-95的核苷酸序列中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，Zm00001d033267(SEQ ID NO:78)内的靶区可以包含SEQ ID NO:96-108的核苷酸序列中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，并且Zm00001d034298(SEQ ID NO:81)内的靶区可以包含SEQ ID NO:109-112的核苷酸序列中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分。在一些实施例中，靶区可以包含编码SEQID NO:113的氨基酸序列的核酸的连续核苷酸的一部分。
在一些实施例中，本发明的向导核酸可以与之结合的靶位点可以包含核苷酸序列或其部分，所述核苷酸序列或其部分与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)，或者与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性，和/或可以编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)的序列。
可用于本发明的向导的示例间隔子序列可以包含与以下的互补性：核苷酸序列的片段或部分，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者，任选地SEQ ID NO:69、72、75、78或81和/或SEQ ID NO:84-112(任选地，与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者)具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)；或者核苷酸序列的片段或部分，所述核苷酸序列编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83和/或SEQ ID NO:113的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)的序列的多肽。
在一些实施例中，靶核酸是能够调节植物中的对光照的响应的内源性PIF基因。在一些实施例中，靶核酸内的靶位点可以包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82，参见例如SEQ ID NO:84-112的核苷酸序列中的任一者的区、部分或片段具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列，或者可以编码与SEQ ID NO:71、74、77、80或83(例如，SEQID NO:113)的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的区。
在一些实施例中，向导核酸可以包含具有SEQ ID NO:114-119中的任一者的核苷酸序列的间隔子、或其反向互补序列或其任何组合。
在一些实施例中，提供了一种系统，其包含本发明的向导核酸和与向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白。在一些实施例中，所述系统可以进一步包含与向导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中tracr核酸与向导核酸共价连接。
如本文所用，“与向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白”是指在CRISPR-Cas效应蛋白与向导核酸之间形成以将CRISPR-Cas效应蛋白导向至基因内的靶位点的复合物。
在一些实施例中，提供了基因编辑系统，所述基因编辑系统包含与向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述向导核酸包含与光敏色素相互作用因子(PIF)基因结合的间隔子序列。在一些实施例中，可用于所述基因编辑系统的PIF基因(a)包含与SEQ IDNO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。
在一些实施例中，基因编辑系统的向导核酸可以包含与核苷酸序列的区、部分或片段具有互补性的间隔子序列，所述核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者(例如，SEQ ID NO:84-112)具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)，或者可以编码序列的区、部分或片段，所述区、部分或片段与SEQ IDNO:71、74、77、80或83(例如，SEQ ID NO:113)的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性，任选地其中与SEQ ID NO:69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。在一些实施例中，基因编辑系统可以进一步包含与向导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸与所述向导核酸共价连接。在一些实施例中，PIF基因是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因。在一些实施例中，提供了与内源性PIF基因中的靶核酸结合的向导核酸，所述内源性PIF基因具有Zm00001d040536(SEQ ID NO:69)、Zm00001d008205(SEQ ID NO:72)、Zm00001d031044(SEQ ID NO:75)、Zm00001d033267(SEQ ID NO:78)和/或Zm00001d034298(SEQ ID NO:81)的基因标识号(基因ID)(Maize遗传学和基因组数据库(Maize GDB))，任选地其中Zm00001d040536(SEQ ID NO:69)内的靶区可以包含SEQ ID NO:84-87的核苷酸序列中的任何一个或多个，任选地SEQ ID NO:84、85、86和/或87中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，Zm00001d008205(SEQ ID NO:72)内的靶区可以包含SEQ ID NO:88-91的核苷酸序列中的任何一个或多个，任选地SEQ ID NO:88、89、90和/或91中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，Zm00001d031044(SEQ ID NO:75)内的靶区可以包含SEQ ID NO:92-95的核苷酸序列中的任何一个或多个，任选地SEQ ID NO:92、93、94和/或95中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，Zm00001d033267(SEQ ID NO:78)内的靶区可以包含SEQID NO:96-108的核苷酸序列中的任何一个或多个，任选地SEQ ID NO:96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107和/或108中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分，并且Zm00001d034298(SEQ ID NO:81)内的靶区可以包含SEQ ID NO:109-112的核苷酸序列中的任何一个或多个，任选地SEQ ID NO:109、110、111和/或112中的任何一个或多个的连续核苷酸的一部分。在一些实施例中，靶区可以包含编码SEQ ID NO:113的氨基酸序列的核酸的连续核苷酸的一部分。
本发明进一步提供了一种复合物，其包含包括切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白和向导核酸，其中所述向导核酸与光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合，所述PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％，其中所述切割结构域切割所述PIF基因中的靶链。在一些实施例中，PIF基因是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因。在一些实施例中，切割结构域切割PIF基因中的靶链，从而在包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％同一性的序列的内源性PIF基因中产生突变。在一些实施例中，与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者的序列同一性可以是至少95％。在一些实施例中，与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者的序列同一性可以是100％。在一些实施例中，内源性PIF基因中的突变是非天然突变。
本文还提供了表达盒，所述表达盒包含(a)编码包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，以及(b)与光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合的向导核酸，其中所述向导核酸包含与所述PIF基因内的靶位点互补并且与所述靶位点结合的间隔子序列，所述PIF基因：(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。在一些实施例中，PIF基因是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因。
在一些实施例中，提供了核酸，其编码包含经突变的bHLH结构域的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子，任选地其中所述突变破坏由PIF转录因子进行的DNA结合。在一些实施例中，所述突变可以是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQID NO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代。在一些实施例中，所述突变可以是在参考SEQID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代，任选地E6K。在一些实施例中，核酸包含经突变的PIF基因，其中所述经突变的PIF基因可以包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134和/或135中的任一者具有至少90％序列同一性(例如，至少约90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性，任选地序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％)的序列，和/或编码经突变的PIF多肽，所述经突变的PIF多肽包含与SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131中的任一者具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。还提供了包含SEQ ID NO:121、123、125、127和/或131的经修饰的氨基酸序列中的任一者的经修饰的PIF多肽。
进一步提供了包含如本文所述的经突变的PIF核酸和/或经突变的PIF转录因子多肽的植物或其部分。在一些实施例中，所述植物可以是玉米植物。在一些实施例中，所述植物可以是小麦植物。在一些实施例中，与彼此紧邻种植但缺乏突变并且没有表现出减少的避荫响应的一株或多株植物相比，包含如本文所述的经突变的PIF并且具有减少的SAR的植物、玉米植物和/或小麦植物在与包含如本文所述的经突变的PIF并且具有减少的SAR的一株或多株植物紧邻种植时可以表现出增加的产量、增加的直立生长、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长、增加的茎机械强度、降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆、开花时间没有变化和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。在一些实施例中，当彼此紧邻种植时，包含减少的SAR的本发明的植物可以比在相同环境条件(例如，避荫环境，例如，低R:FR比率环境)下生长的对照植物矮至少约5％(例如，矮约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25％至约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150％或更矮)。在一些实施例中，包含如本文所述的经突变的PIF核酸和/或经突变的PIF转录因子多肽的玉米植物表现出短身材/半矮型表型。在一些实施例中，提供了一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分包含在内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的至少一个突变，所述内源性PIF基因具有Zm00001d040536、Zm00001d008205、Zm00001d031044、Zm00001d033267或Zm00001d034298(例如，分别是SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:75、SEQ ID NO:78和/或SEQ ID NO:81)的基因标识号(基因ID)(Maize遗传学和基因组数据库(Maize GDB))，任选地其中所述突变是非天然突变。
在一些实施例中，本发明的方法可以进一步包含由包含内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的至少一个突变(例如，一个或多个突变)的植物细胞或植物部分再生植物，任选地其中所述突变破坏经编码的PIF多肽与DNA的结合。在一些实施例中，与不包含内源性PIF基因中的至少一个突变并且因此在一株或多株其它植物紧邻种植时不包含减少的避荫响应的对照植物相比，包含内源性PIF基因中的至少一个突变的植物在与一株或多株其它植物紧邻种植时可以表现出减少的SAR响应、增加的产量、增加的直立生长、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长、增加的茎机械强度、降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆、开花时间没有变化和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。在一些实施例中，突变可以是非天然突变。在一些实施例中，突变是碱基取代，任选地产生经编码的PIF多肽中的氨基酸残基的取代。在一些实施例中，取代引起显性负突变、隐性突变、无效突变、弱功能丧失型突变或亚效突变。
可用于本发明的编辑系统可以是现在已知或以后开发的任何位点特异性(序列特异性)基因组编辑系统，所述系统可以靶特异性方式引入突变。例如，编辑系统(例如，位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包括但不限于CRISPR-Cas编辑系统、大范围核酸酶编辑系统、锌指核酸酶(ZFN)编辑系统、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)编辑系统、碱基编辑系统和/或先导编辑系统，其中的每一者都可以包含当在细胞中作为系统表达时可以以序列特异性方式修饰(突变)靶核酸的一个或多个多肽和/或一个或多个多核苷酸。在一些实施例中，编辑系统(例如，位点特异性或序列特异性编辑系统)可以包含一个或多个多核苷酸和/或一个或多个多肽，包括但不限于核酸结合结构域(DNA结合结构域)、核酸酶和/或其它多肽和/或多核苷酸。
在一些实施例中，编辑系统可以包含一个或多个序列特异性核酸结合结构域(DNA结合结构域)，其可以来自例如由多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。在一些实施例中，编辑系统可以包含一个或多个切割结构域(例如，核酸酶)，包括但不限于核酸内切酶(例如，Fok1)、由多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶和/或转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)。在一些实施例中，编辑系统可以包含一个或多个多肽，其包括但不限于脱氨酶(例如，胞嘧啶脱氨酶、腺嘌呤脱氨酶)、逆转录酶、Dna2多肽和/或5'瓣状核酸内切酶(FEN)。在一些实施例中，编辑系统可以包含一个或多个多核苷酸，包括但不限于CRISPR阵列(CRISPR向导)核酸、延伸的向导核酸和/或逆转录酶模板。
在一些实施例中，修饰或编辑PIF基因的方法可以包含使靶核酸(例如，编码PIF转录因子的核酸)与融合到脱氨酶结构域(例如，腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)的碱基编辑融合蛋白(例如，序列特异性DNA结合蛋白(例如，CRISPR-Cas效应蛋白或结构域))和向导核酸接触，其中向导核酸能够将碱基编辑融合蛋白引导/靶向至靶核酸，由此编辑靶核酸内的基因座。在一些实施例中，碱基编辑融合蛋白和向导核酸可以被包含在一个或多个表达盒中。在一些实施例中，靶核酸可以与碱基编辑融合蛋白和包含向导核酸的表达盒接触。在一些实施例中，序列特异性DNA结合融合蛋白和向导可以作为核糖核蛋白(RNP)提供。在一些实施例中，细胞可以与大于一个碱基编辑融合蛋白和/或一个或多个可以靶向细胞中的一个或多个靶核酸的向导核酸接触。
在一些实施例中，修饰或编辑PIF基因的方法可以包含使靶核酸(例如，编码PIF转录因子的核酸)与和肽标签融合的序列特异性DNA结合融合蛋白(例如，序列特异性DNA结合蛋白(例如，CRISPR-Cas效应蛋白或结构域))、包含与能够与肽标签结合的亲和多肽融合的脱氨酶结构域(例如，腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶)的脱氨酶结构域的脱氨酶融合蛋白和向导核酸接触，其中所述向导核酸能够将序列特异性DNA结合融合蛋白引导/靶向到靶核酸，并且序列特异性DNA结合融合蛋白能够经由肽标签-亲和多肽相互作用将脱氨酶融合蛋白募集到靶核酸，由此编辑靶核酸内的基因座。在一些实施例中，序列特异性DNA结合融合蛋白可以与和肽标签结合的亲和多肽融合，并且脱氨酶可以与肽标签融合，由此将脱氨酶募集到序列特异性DNA结合融合蛋白以及靶核酸。在一些实施例中，序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和向导核酸可以被包含在一个或多个表达盒中。在一些实施例中，靶核酸可以与序列特异性结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和包含向导核酸的表达盒接触。在一些实施例中，序列特异性DNA结合融合蛋白、脱氨酶融合蛋白和向导可以作为核糖核蛋白(RNP)提供。
在一些实施例中，如先导编辑等方法可用于在内源性PIF基因中产生突变。在先导编辑中，RNA依赖性DNA聚合酶(逆转录酶，RT)和逆转录酶模板(RT模板)与序列特异性核酸结合结构域组合使用，所述序列特异性核酸结合结构域赋予以序列特异性方式识别和结合靶标的能力，并且也可在靶标内引起含PAM链的切口。核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应蛋白，并且在这种情况下，CRISPR阵列或向导RNA可以是延伸的向导，其包含延伸部分，所述延伸部分包含引物结合位点(PSB)和要掺入到基因组(模板)中的编辑。类似于碱基编辑，先导编辑可利用各种方法募集用于靶位点编辑的蛋白质，此类方法包括在所选基因组编辑过程中使用的蛋白质和核酸之间的非共价和共价相互作用。
在一些实施例中，PIF基因的突变或修饰可以是碱基取代、碱基插入、碱基缺失和/或点突变，所述突变或修饰产生具有降低的DNA结合的经突变的PIF转录因子(例如，经突变的PIF转录因子)和/或在包含经突变/经修饰的PFI基因的植物或其部分上赋予降低的SAR。在一些实施例中，植物部分可以是细胞。在一些实施例中，植物或其植物部分可以是如本文所述的任何植物或其部分。在一些实施例中，可用于本发明的植物可以是玉米、大豆、油菜籽、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、核桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜或芸苔。在一些实施例中，与缺乏内源性PIF基因中的至少一个突变并且因此在所述植物与一株或多株其它植物紧邻种植时缺乏减少的避荫响应的对照植物相比，包含包括在其碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变的经突变的内源性PIF转录因子(例如，包含包括在经编码的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变的经突变的PIF基因)的植物在与一株或多株其它植物紧邻种植时可以包含减少的SAR、增加的产量、增加的直立生长、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长、增加的茎机械强度、降低的倒伏率、延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆、开花时间没有变化和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。在一些实施例中，所述植物可以是玉米植物，所述玉米植物包含具有经突变的碱性结构域的经突变的内源性PIF转录因子(任选地，减少的DNA结合)，并且任选地表现出减少的SAR、增加的产量、增加的直立生长、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度、降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆、开花时间没有变化和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。
在一些实施例中，引入到内源性PIF基因中的突变可以是非天然突变，所述突变任选地引起由经编码的PIF多肽进行的DNA结合减少。在一些实施例中，引入到内源性PIF基因中的突变可以是至少一个核苷酸、至少两个连续核苷酸或至少三个连续核苷酸的取代、插入和/或缺失，其中所述突变可以在碱性结构域中，并且任选地引起由经编码的PIF多肽进行的DNA结合减少。在一些实施例中，引入到内源性PIF基因中的突变可以是至少一个核苷酸(例如，一个或多个核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8个或9个或更多个核苷酸)的取代，任选地所述取代引起经编码的PIF转录因子中的氨基酸残基的取代。在一些实施例中，PIF转录因子中的氨基酸残基的取代可以在PIF转录因子的碱性结构域中，任选地其中所述取代在PIF基因的编码与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的区中。
在一些实施例中，可用于本发明的编辑系统的序列特异性核酸结合结构域(序列特异性DNA结合结构域)可以来自例如由多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。
在一些实施例中，序列特异性核酸结合结构域可以是CRISPR-Cas效应蛋白，任选地其中所述CRISPR-Cas效应蛋白可以来自I型CRISPR-Cas系统、II型CRISPR-Cas系统、III型CRISPR-Cas系统、IV型CRISPR-Cas系统、V型CRISPR-Cas系统或VI型CRISPR-Cas系统。在一些实施例中，本发明的CRISPR-Cas效应蛋白可来自II型CRISPR-Cas系统或V型CRISPR-Cas系统。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是II型CRISPR-Cas效应蛋白，例如Cas9效应蛋白。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是V型CRISPR-Cas效应蛋白，例如Cas12效应蛋白。
如本文所用，“CRISPR-Cas效应蛋白”是切割或切割核酸、结合核酸(例如，靶核酸和/或向导核酸)和/或鉴别、识别或结合如本文所定义的向导核酸的蛋白质或多肽或其结构域。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是酶(例如，核酸酶、核酸内切酶、切口酶等)或其部分和/或可充当酶。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白是指CRISPR-Cas核酸酶多肽或其结构域，所述CRISPR-Cas核酸酶多肽或其结构域包含核酸酶活性或其中核酸酶活性已被降低或消除，和/或包含切口酶活性或其中切口酶活性已被降低或消除，和/或包含单链DNA切割活性(ss DNA酶活性)或其中ss DNA酶活性已被降低或消除，和/或包含自我加工RNA酶活性或其中自我加工RNA酶活性已被降低或消除。CRISPR-Cas效应蛋白可结合靶核酸。
在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可包括但不限于Cas9、C2c1、C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3”、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5核酸酶，任选地其中CRISPR-Cas效应蛋白可以是Cas9、Cas12a(Cpf1)、Cas12b、Cas12c(C2c3)、Cas12d(CasY)、Cas12e(CasX)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、C2c4、C2c5、C2c8、C2c9、C2c10、Cas14a、Cas14b和/或Cas14c效应蛋白。
在一些实施例中，可用于本发明的CRISPR-Cas效应蛋白可包含其核酸酶活性位点(例如，RuvC、HNH，例如，Cas12a核酸酶结构域的RuvC位点，例如，Cas9核酸酶结构域的RuvC位点和/或HNH位点)中的突变。CRISPR-Cas效应蛋白具有其核酸酶活性位点中的突变，因此不再包含核酸酶活性，通常被称为“死的”，例如dCas。在一些实施例中，具有其核酸酶活性位点中的突变的CRISPR-Cas效应蛋白结构域或多肽与没有所述突变的相同CRISPR-Cas效应蛋白(例如切口酶，例如Cas9切口酶、Cas12a切口酶)相比可具有受损的活性或降低的活性。
可用于本发明的CRISPR Cas9效应蛋白或CRISPR Cas9效应子结构域可以是任何已知或后来鉴定的Cas9核酸酶。在一些实施例中，CRISPR Cas9多肽可以是来自以下的Cas9多肽：例如，链球菌属物种(Streptococcus spp.)(例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)、嗜热链球菌(S.thermophilus))、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、坎德勒菌属物种(Kandleria spp.)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)、酒球菌属物种(Oenococcus spp.)、片球菌属物种(Pediococcusspp.)、魏斯氏菌属物种(Weissella spp.)和/或欧陆森氏菌属物种(Olsenella spp.)。示例Cas9序列包括但不限于SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57的氨基酸序列或SEQ ID NO:58-68的核苷酸序列。
在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9多肽，并且识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali等人,《科学》2013；339(6121):823-826)。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于嗜热链球菌(Streptococcusthermophiles)的Cas9多肽，并且识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(参见，例如，Horvath等人,《科学》2010；327(5962):167-170，以及Deveau等人,《细菌学杂志(J Bacteriol)》2008；190(4):1390-1400)。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于变形链球菌(Streptococcusmutans)的Cas9多肽，并且识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见例如，Deveau等人,《细菌学杂志》2008；190(4):1390-1400)。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于金黄色链球菌(Streptococcusaureus)的Cas9多肽，并且识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于金黄色链球菌(S.aureus)的Cas9蛋白，其识别PAM序列基序NGRRT(R＝A或G)。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于金黄色链球菌的Cas9多肽，其识别PAM序列基序NGRRV(R＝A或G)。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)的Cas9多肽，并且识别PAM序列基序NGATT或NGCTT(R＝A或G，V＝A、G或C)(参见例如，Hou等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》2013,1-6)。在上述实施例中，N可以是任何核苷酸残基，例如A、G、C或T中的任一者。在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可以是来源于沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的Cas13a蛋白，其识别可以位于靶核酸内的单个3'A、U或C的前间隔子侧翼序列(PFS)(或RNA PAM(rPAM))序列基序。
在一些实施例中，CRISPR-Cas效应蛋白可来源于Cas12a，其是V型规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-Cas核酸酶，参见例如，SEQ ID NO:1-17的氨基酸序列，SEQ ID NO:18-20的核酸序列。Cas12a在几个方面不同于更广为人知的II型CRISPR Cas9核酸酶。例如，Cas9识别位于其向导RNA(gRNA、sgRNA、crRNA、crDNA、CRISPR阵列)结合位点(前间隔子、靶核酸、靶DNA)3'的富含G的前间隔子邻近基序(PAM)(3'-NGG)，而Cas12a识别位于靶核酸5'的富含T的PAM(5'-TTN、5'-TTTN)。事实上，Cas9和Cas12a与其向导RNA结合的取向相对于其N和C末端而言几乎相反。此外，Cas12a酶使用单向导RNA(gRNA、CRISPR阵列、crRNA)，而不是天然Cas9系统中发现的双向导RNA(sgRNA(例如，crRNA和tracrRNA))，并且Cas12a加工其自身的gRNA。此外，Cas12a核酸酶活性产生交错的DNA双链断裂，而不是由Cas9核酸酶活性产生的平端，并且Cas12a依赖于单个RuvC结构域来切割两条DNA链，而Cas9利用HNH结构域和RuvC结构域来切割。
可用于本发明的CRISPR Cas12a效应蛋白/结构域可以是任何已知或后来鉴定的Cas12a多肽(以前称为Cpf1)(参见，例如，美国专利第9,790,490号，其关于Cpf1(Cas12a)序列的公开内容以引用方式并入)。术语“Cas12a”、“Cas12a多肽”或“Cas12a结构域”是指包含Cas12a多肽或其片段的RNA引导的核酸酶，所述片段包含Cas12a的向导核酸结合结构域和/或Cas12a的活性、无活性或部分活性的DNA切割结构域。在一些实施例中，可用于本发明的Cas12a可以包含核酸酶活性位点(例如，Cas12a结构域的RuvC位点)中的突变。具有其核酸酶活性位点中的突变并因此不再包含核酸酶活性的Cas12a结构域或Cas12a多肽通常被称为死Cas12a(例如，dCas12a)。在一些实施例中，具有其核酸酶活性位点中的突变的Cas12a结构域或Cas12a多肽可具有受损的活性，例如，可具有切口酶活性。
可用于碱基编辑的任何脱氨酶结构域/多肽可用于本发明。在一些实施例中，脱氨酶结构域可以是胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域。可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶(或胞苷脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的胞嘧啶脱氨酶(参见，例如，美国专利第10,167,457号以及Thuronyi等人,《自然生物技术》37:1070–1079(2019)，所述参考文献中的每一者关于其胞嘧啶脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。胞嘧啶脱氨酶可分别催化胞苷或脱氧胞苷水解脱氨为尿苷或脱氧尿苷。因此，在一些实施例中，可用于本发明的脱氨酶或脱氨酶结构域可以是胞苷脱氨酶结构域，其催化胞嘧啶水解脱氨为尿嘧啶。在一些实施例中，胞嘧啶脱氨酶可以是天然存在的胞嘧啶脱氨酶的变体，包括但不限于灵长类动物(例如，人、猴、黑猩猩、大猩猩)、狗、奶牛、大鼠或小鼠。因此，在一些实施例中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与野生型胞嘧啶脱氨酶约70％至约100％相同(例如，与天然存在的胞嘧啶脱氨酶约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同以及其中的任何范围或值)。
在一些实施例中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以是载脂蛋白B mRNA编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶。在一些实施例中，胞嘧啶脱氨酶可以是APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶、APOBEC3H脱氨酶、APOBEC4脱氨酶、人激活诱导脱氨酶(hAID)、rAPOBEC1、FERNY和/或CDA1，任选地pmCDA1、atCDA1(例如，At2g19570)，以及其进化形式(例如，SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ ID NO:29)。在一些实施例中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的APOBEC1脱氨酶。在一些实施例中，胞嘧啶脱氨酶可以是具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的APOBEC3A脱氨酶。在一些实施例中，胞嘧啶脱氨酶可以是CDA1脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDA1。在一些实施例中，胞嘧啶脱氨酶可以是FERNY脱氨酶，任选地是具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的FERNY。在一些实施例中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与天然存在的胞嘧啶脱氨酶(例如，经进化的脱氨酶)的氨基酸序列约70％至约100％相同(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同)。在一些实施例中，可用于本发明的胞嘧啶脱氨酶可以与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25或SEQ IDNO:26的氨基酸序列约70％至约99.5％相同(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同)(例如，与SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28或SEQ IDNO:29的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同)。在一些实施例中，编码胞嘧啶脱氨酶的多核苷酸可以针对植物中的表达进行密码子优化，并且经密码子优化的多肽可以与参考多核苷酸约70％至99.5％相同。
在一些实施例中，本发明的核酸构建体可以进一步编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂)多肽/结构域。因此，在一些实施例中，编码CRISPR-Cas效应蛋白和胞嘧啶脱氨酶结构域(例如，编码包含融合到胞嘧啶脱氨酶结构域的CRISPR-Cas效应蛋白结构域，和/或融合到肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽的CRISPR-Cas效应蛋白结构域，和/或融合到肽标签或能够结合肽标签的亲和多肽的脱氨酶蛋白结构域的融合蛋白)的核酸构建体可以进一步编码尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)，任选地其中UGI可针对植物中的表达进行密码子优化。在一些实施例中，本发明提供了包含CRISPR-Cas效应子多肽、脱氨酶结构域和UGI的融合蛋白和/或编码其的一个或多个多核苷酸，任选地其中一个或多个多核苷酸可针对植物中的表达进行密码子优化。在一些实施例中，本发明提供了融合蛋白，其中CRISPR-Cas效应子多肽、脱氨酶结构域和UGI可融合到如本文所述的肽标签和亲和多肽的任何组合，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到CRISPR-Cas效应子多肽和靶核酸。在一些实施例中，向导核酸可连接到募集RNA基序，并且脱氨酶结构域和/或UGI中的一者或多者可融合到能够与募集RNA基序相互作用的亲和多肽，从而将脱氨酶结构域和UGI募集到靶核酸。
可用于本发明的“尿嘧啶糖基化酶抑制剂”可以是能够抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶碱基切除修复酶的任何蛋白质。在一些实施例中，UGI结构域包含野生型UGI或其片段。在一些实施例中，可用于本发明的UGI结构域可以与天然存在的UGI结构域的氨基酸序列约70％至约100％相同(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％相同以及其中的任何范围或值)。在一些实施例中，UGI结构域可包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列或与SEQ ID NO:41的氨基酸序列具有约70％至约99.5％序列同一性(例如，与SEQ ID NO:41的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％相同)的多肽。例如，在一些实施例中，UGI结构域可包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的片段，所述片段与SEQ ID NO:41的氨基酸序列的连续核苷酸的一部分(例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸；例如，约10、15、20、25、30、35、40、45至约50、55、60、65、70、75、80个连续核苷酸)100％相同。在一些实施例中，UGI结构域可以是与已知UGI具有约70％至约99.5％序列同一性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％序列同一性以及其中的任何范围或值)的已知UGI(例如，SEQ ID NO:41)的变体。在一些实施例中，编码UGI的多核苷酸可针对植物(例如，植物)中的表达进行密码子优化，并且密码子优化的多肽可与参考多核苷酸约70％至约99.5％相同。
可用于本发明的腺嘌呤脱氨酶(或腺嘌呤脱氨酶)可以是来自任何生物体的任何已知或后来鉴定的腺嘌呤脱氨酶(参见，例如，美国专利第10,113,163号，所述专利关于其腺嘌呤脱氨酶的公开内容通过引用并入本文)。腺嘌呤脱氨酶可催化腺嘌呤或腺嘌呤的水解脱氨。在一些实施例中，腺嘌呤脱氨酶可分别催化腺嘌呤或脱氧腺嘌呤水解脱氨为肌苷或脱氧肌苷。在一些实施例中，腺嘌呤脱氨酶可催化DNA中的腺嘌呤或腺嘌呤的水解脱氨。在一些实施例中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶可产生靶核酸的正义(例如，“+”；模板)链中的A→G转换或靶核酸的反义(例如，“-”，互补)链中的T→C转换。
在一些实施例中，腺嘌呤脱氨酶可以是天然存在的腺嘌呤脱氨酶的变体。因此，在一些实施例中，腺嘌呤脱氨酶可以与野生型腺嘌呤脱氨酶约70％至100％相同(例如，与天然存在的腺嘌呤脱氨酶约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同以及其中的任何范围或值)。在一些实施例中，一种或多种脱氨酶不是天然存在的，并且可被称为经工程化的、经突变的或经进化的腺嘌呤脱氨酶。因此，例如，经工程化、经突变或经进化的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域可以与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域约70％至99.9％相同(例如，与天然存在的腺嘌呤脱氨酶多肽或腺嘌呤脱氨酶结构域约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同以及其中的任何范围或值)。在一些实施例中，腺嘌呤脱氨酶可来自细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)等)。在一些实施例中，编码腺嘌呤脱氨酶多肽/结构域的多核苷酸可针对植物中的表达进行密码子优化。
在一些实施例中，腺嘌呤脱氨酶结构域可以是野生型tRNA特异性腺嘌呤脱氨酶结构域，例如tRNA特异性腺嘌呤脱氨酶(TadA)，和/或经突变的/经进化的腺嘌呤脱氨酶结构域，例如经突变的/经进化的tRNA特异性腺嘌呤脱氨酶结构域(TadA*)。在一些实施例中，TadA结构域可来自大肠杆菌(E.coli)。在一些实施例中，TadA可被修饰，例如被截短，相对于全长TadA缺失一个或多个N-末端和/或C-末端氨基酸(例如，相对于全长TadA，可能缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、6、17、18、19或20个N-末端和/或C-末端氨基酸残基)。在一些实施例中，TadA多肽或TadA结构域不包含N-末端甲硫氨酸。在一些实施例中，野生型大肠杆菌TadA包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施例中，突变/进化的大肠杆菌TadA*包含SEQ ID NO:31-40(例如，SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)的氨基酸序列。在一些实施例中，编码TadA/TadA*的多核苷酸可针对植物中的表达进行密码子优化。
胞嘧啶脱氨酶催化胞嘧啶脱氨并产生胸苷(通过尿嘧啶中间体)，引起基因组中互补链中的C到T转换或G到A转换。因此，在一些实施例中，由本发明的多核苷酸编码的胞嘧啶脱氨酶产生靶核酸的正义(例如，“+”；模板)链中的C→T转换或靶核酸的反义(例如，“-”，互补)链中的G→A转换。
在一些实施例中，由本发明的核酸构建体编码的腺嘌呤脱氨酶产生靶核酸的正义(例如，“+”；模板)链中的A→G转换或靶核酸的反义(例如，“-”，互补)链中的T→C转换。
本发明的编码包含序列特异性DNA结合蛋白和胞嘧啶脱氨酶多肽的碱基编辑器的核酸构建体，以及编码其的核酸构建体/表达盒/载体，可与向导核酸组合使用以用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸(包括但不限于质粒序列)中产生C→T或G→A突变；在编码序列中产生C→T或G→A突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生C→T或G→A突变以产生终止密码子；在编码序列中产生C→T或G→A突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏转录因子结合；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接点。
本发明的编码包含序列特异性DNA结合蛋白和腺嘌呤脱氨酶多肽的碱基编辑器的核酸构建体，以及编码其的表达盒和/或载体，可与向导核酸组合使用以用于修饰靶核酸，包括但不限于在靶核酸(包括但不限于质粒序列)中产生A→G或T→C突变；在编码序列中产生A→G或T→C突变以改变氨基酸身份；在编码序列中产生A→G或T→C突变以产生终止密码子；在编码序列中产生A→G或T→C突变以破坏起始密码子；在基因组DNA中产生点突变以破坏功能；和/或在基因组DNA中产生点突变以破坏剪接点。
本发明的包含CRISPR-Cas效应蛋白或其融合蛋白的核酸构建体可与向导RNA(gRNA、CRISPR阵列、CRISPR RNA、crRNA)组合使用以修饰靶核酸，所述向导RNA被设计成与经编码的CRISPR-Cas效应蛋白或结构域一起发挥作用。可用于本发明的向导核酸包含至少一个间隔子序列和至少一个重复序列。向导核酸能够与由本发明的核酸构建体编码和表达的CRISPR-Cas核酸酶结构域形成复合物，并且间隔子序列能够与靶核酸杂交，由此引导复合物(例如，CRISPR-Cas效应子融合蛋白(例如，与脱氨酶结构域融合的CRISPR-Cas效应子结构域和/或与肽标签或亲和多肽融合以募集脱氨酶结构域和任选地UGI的CRISPR-Cas效应子结构域)至靶核酸，其中靶核酸可被脱氨酶结构域修饰(例如，切割或编辑)或调节(例如，调节转录)。
作为实例，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域连接的Cas9结构域(例如，融合蛋白)的核酸构建体可与Cas9向导核酸组合使用以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。在另一个实例中，编码与腺嘌呤脱氨酶结构域连接的Cas9结构域(例如，融合蛋白)的核酸构建体可与Cas9向导核酸组合使用以修饰靶核酸，其中融合蛋白的腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的腺嘌呤碱基脱氨基，从而编辑靶核酸。
同样，编码与胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域连接的Cas12a结构域(或其它选定CRISPR-Cas核酸酶，例如C2c1、C2c3、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3”、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5)(例如，融合蛋白)的核酸构建体可与Cas12a向导核酸(或其它选定CRISPR-Cas核酸酶的向导核酸)组合使用以修饰靶核酸，其中融合蛋白的胞嘧啶脱氨酶结构域或腺嘌呤脱氨酶结构域使靶核酸中的胞嘧啶碱基脱氨基，由此编辑靶核酸。
如本文所用，“向导核酸”、“向导RNA”、“gRNA”、“CRISPR RNA/DNA”、“crRNA”或“crDNA”是指包含与靶DNA(例如，前间隔子)互补(和杂交)的至少一个间隔子序列和至少一个重复序列(例如，V型Cas12a CRISPR-Cas系统的重复序列，或其片段或部分；II型Cas9CRISPR-Cas系统的重复序列，或其片段；V型C2c1 CRISPR Cas系统的重复序列，或其片段；例如C2c3、Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas3'、Cas3”、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4(dinG)和/或Csf5的CRISPR-Cas系统的重复序列或其片段)的核酸，其中重复序列可以连接到间隔子序列的5'端和/或3'端。本发明的gRNA的设计可基于I型、II型、III型、IV型、V型或VI型CRISPR-Cas系统。
在一些实施例中，Cas12a gRNA从5'到3'可以包含重复序列(全长或其部分(“柄”)；例如，假结样结构)和间隔子序列。
在一些实施例中，向导核酸可以包含大于一个重复序列-间隔子序列(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个重复-间隔子序列)(例如，重复-间隔子-重复，例如，重复-间隔子-重复-间隔子-重复-间隔子-重复-间隔子-重复-间隔子等)。本发明的向导核酸是合成的、人造的并且在自然界中不存在。gRNA可以很长，并且可用作适体(如在MS2募集策略中)或悬挂间隔子的其它RNA结构。
如本文所用，“重复序列”是指例如野生型CRISPR Cas基因座(例如，Cas9基因座、Cas12a基因座、C2c1基因座等)的任何重复序列或与由本发明的核酸构建体编码的CRISPR-Cas效应蛋白一起发挥作用的合成crRNA的重复序列。可用于本发明的重复序列可以是CRISPR-Cas基因座的任何已知或后来鉴定的重复序列(例如，I型、II型、III型、IV型、V型或VI型)，或者其可以是被设计成在I、II、III、IV、V或VI型CRISPR-Cas系统中发挥作用的合成重复序列。重复序列可包含发夹结构和/或茎环结构。在一些实施例中，重复序列可在其5'端形成假结样结构(即，“柄”)。因此，在一些实施例中，重复序列可与来自野生型I型CRISPR-Cas基因座、II型CRISPR-Cas基因座、III型CRISPR-Cas基因座、IV型CRISPR-Cas基因座、V型CRISPR-Cas基因座和/或VI型CRISPR-Cas基因座的重复序列相同或基本上相同。来自野生型CRISPR-Cas基因座的重复序列可通过已建立的算法来确定，如使用通过CRISPRdb提供的CRISPRfinder(参见，Grissa等人《核酸研究》35(网络服务器专刊):W52-7)。在一些实施例中，重复序列或其部分在其3'端连接到间隔子序列的5'端，从而形成重复-间隔子序列(例如，向导核酸、向导RNA/DNA、crRNA、crDNA)。
在一些实施例中，重复序列包含至少10个核苷酸、基本上由其组成或由其组成，这取决于特定重复序列以及包含重复序列的向导核酸是加工的还是未加工的(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50至100个或更多个核苷酸，或其中的任何范围或值)。在一些实施例中，重复序列包含约10至约20、约10至约30、约10至约45、约10至约50、约15至约30、约15至约40、约15至约45、约15至约50、约20至约30、约20至约40、约20至约50、约30至约40、约40至约80、约50至约100个或更多个核苷酸、基本上由其组成或由其组成。
与间隔子序列的5'端连接的重复序列可包含重复序列的一部分(例如，野生型重复序列的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个或更多个连续核苷酸)。在一些实施例中，与间隔子序列的5'端连接的重复序列的一部分的长度可以是约五至约十个连续核苷酸(例如，约5、6、7、8、9、10个核苷酸)并且与野生型CRISPR Cas重复核苷酸序列的相同区(例如，5'端)具有至少90％序列同一性(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施例中，重复序列的一部分可在其5'端包含假结样结构(例如，“柄”)。
如本文所用的“间隔子序列”是与靶核酸(例如，靶DNA)(例如，前间隔子)的一部分互补的核苷酸序列。在一些实施例中，所述间隔子序列与PIF基因的连续核苷酸的一部分互补，其中所述PIF基因(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性(例如，至少约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、99或100％序列同一性)的序列；(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者，任选地与SEQ ID NO:84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111和/或112中的任一者具有至少80％序列同一性的区；(c)编码包含与SEQ IDNO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，任选地其中(a)、(b)、(c)和/或(d)的序列同一性可以是至少85％或至少90％，或者所述序列同一性可以是至少95％，任选地所述序列同一性可以是100％。间隔子序列可以与靶核酸完全互补或基本上互补(例如，至少约70％互补(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多))。在一些实施例中，如与靶核酸相比，间隔子序列可以具有一个、两个、三个、四个或五个错配，所述错配可以是连续的或不连续的。在一些实施例中，间隔子序列可以与靶核酸具有70％互补性。在其它实施例中，间隔子核苷酸序列可以与靶核酸具有80％互补性。在仍其它实施例中，间隔子核苷酸序列可以与靶核酸(前间隔子)具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％互补性等。在一些实施例中，间隔子序列与靶核酸100％互补。间隔子序列的长度可以为约15个核苷酸至约30个核苷酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸或其中的任何范围或值)。因此，在一些实施例中，间隔子序列可以在靶核酸(例如，前间隔子)的长度为至少约15个核苷酸至约30个核苷酸的区上具有完全互补性或基本互补性。在一些实施例中，间隔子的长度为约20个核苷酸。在一些实施例中，间隔子的长度为约21、22或23个核苷酸。在一些实施例中，间隔子序列可以包含SEQ ID NO:114-119的序列中的任一者或其反向互补序列或任何组合。
在一些实施例中，向导核酸的间隔子序列的5'区可以与靶DNA相同，而间隔子的3'区可与靶DNA基本上互补(如V型CRISPR-Cas系统的间隔子)，或者向导核酸的间隔子序列的3'区可以与靶DNA相同，而间隔子的5'区可与靶DNA基本上互补(如II型CRISPR-Cas系统的间隔子)，并且因此，间隔子序列与靶DNA的总体互补性可以小于100％。因此，例如，在V型CRISPR-Cas系统的向导中，例如20个核苷酸的间隔子序列的5'区(即，种子区)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列的3'区中的其余核苷酸与靶DNA基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施例中，间隔子序列的5'端的前1个至8个核苷酸(例如，前1、2、3、4、5、6、7、8个核苷酸以及其中的任何范围)与靶DNA可以100％互补，而间隔子序列的3'区中的其余核苷酸与靶DNA基本上互补(例如，至少约50％互补(例如，50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多))。
作为另一个实例，在II型CRISPR-Cas系统的向导中，例如20个核苷酸的间隔子序列的3'区(即，种子区)中的前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸可以与靶DNA 100％互补，而间隔子序列的5'区中的其余核苷酸与靶DNA基本上互补(例如，至少约70％互补)。在一些实施例中，间隔子序列的3'端的前1个至10个核苷酸(例如，前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个核苷酸以及其中的任何范围)与靶DNA可以100％互补，而间隔子序列的5'区中的其余核苷酸与靶DNA基本上互补(例如，至少约50％互补(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或其中的任何范围或值))。
在一些实施例中，间隔子的种子区的长度可以是约8个至约10个核苷酸、长度可以是约5个至约6个核苷酸或长度可以是约6个核苷酸。
如本文所用，“靶核酸”、“靶DNA”、“靶核苷酸序列”、“靶区”或“基因组中的靶区”是指植物的基因组的与本发明的向导核酸中的间隔子序列完全互补(100％互补)或基本上互补(例如，至少70％互补(例如，70％，71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多))的区。可用于CRISPR-Cas系统的靶区可紧邻生物体的基因组(例如，植物基因组)中的PAM序列的3'(例如，V型CRISPR-Cas系统)或紧邻其5'(例如，II型CRISPR-Cas系统)定位。靶区可以选自紧邻PAM序列定位的至少15个连续核苷酸(例如，16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个核苷酸等)的任何区。
“前间隔子序列”是指靶双链DNA，具体是指与CRISPR重复-间隔子序列(例如，向导核酸、CRISPR阵列、crRNA)的间隔子序列完全或基本上互补(并杂交)的靶DNA部分(例如，或基因组中的靶区)。
在V型CRISPR-Cas(例如，Cas12a)系统和II型CRISPR-Cas(Cas9)系统的情况下，前间隔子序列的侧翼是(例如，紧邻)前间隔子邻近基序(PAM)。对于IV型CRISPR-Cas系统，PAM位于非靶链的5'端和靶链的3'端(参见下文，作为实例)。
在II型CRISPR-Cas(例如，Cas9)系统的情况下，PAM紧邻靶区的3'定位。I型CRISPR-Cas系统的PAM位于靶链的5'。没有已知的用于III型CRISPR-Cas系统的PAM。Makarova等人描述了CRISPR系统的所有类别、类型和亚型的命名(《自然评论微生物学(Nature Reviews Microbiology)》13:722–736(2015))。向导结构和PAM由R.Barrangou(《基因组生物学(Genome Biol)》.16:247(2015))描述。
典型的Cas12a PAM富含T。在一些实施例中，典型的Cas12a PAM序列可以是5'-TTN、5'-TTTN或5'-TTTV。在一些实施例中，典型的Cas9(例如，酿脓链球菌)PAM可以是5'-NGG-3'。在一些实施例中，可使用非典型的PAM，但效率可能较低。
本领域技术人员可通过已建立的实验和计算方法确定附加PAM序列。因此，例如，实验方法包括靶向侧接有所有可能的核苷酸序列的序列并鉴定不经历靶向的序列成员，如通过靶质粒DNA的转化(Esvelt等人,2013.《自然方法(Nat.Methods)》10:1116-1121；Jiang等人,2013.《自然生物技术》31:233-239)。在一些方面中，计算方法可以包括对天然间隔子进行BLAST搜索以鉴定噬菌体或质粒中的原始靶DNA序列，并比对这些序列以确定与靶序列相邻的保守序列(Briner和Barrangou,2014.《应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)》80:994-1001；Mojica等人,2009.《微生物学(Microbiology)》155:733-740)。
在一些实施例中，本发明提供了包含本发明的核酸构建体(例如，本发明的编辑系统的一个或多个组分)的表达盒和/或载体。在一些实施例中，可提供包含本发明的核酸构建体和/或一个或多个向导核酸的表达盒和/或载体。在一些实施例中，编码碱基编辑器(例如，包含CRISPR-Cas效应蛋白和脱氨酶结构域的构建体(例如，融合蛋白))的本发明的核酸构建体或用于碱基编辑的组分(例如，与肽标签或亲和多肽融合的CRISPR-Cas效应蛋白、与肽标签或亲和多肽融合的脱氨酶结构域和/或与肽标签或亲和多肽融合的UGI)可包含在与包含一个或多个向导核酸的表达盒或载体相同或分开的表达盒或载体上。当编码碱基编辑器的核酸构建体或用于碱基编辑的组分包含在与包含向导核酸的表达盒或载体分开的表达盒或载体上时，靶核酸可按彼此和向导核酸的任何顺序与编码碱基编辑器的表达盒或载体或用于碱基编辑的组分接触(例如，一起提供)，例如，在提供包含向导核酸的表达盒(例如，与靶核酸接触)之前、同时或之后。
本发明的融合蛋白可以包含融合到如本领域已知的肽标签或与肽标签相互作用的亲和多肽的序列特异性核酸结合结构域、CRISPR-Cas多肽和/或脱氨酶结构域，以用于将脱氨酶募集到靶核酸。募集方法还可以包含与RNA募集基序连接的向导核酸和融合到能够与RNA募集基序相互作用的亲和多肽的脱氨酶，从而将脱氨酶募集到靶核酸。另选地，化学相互作用可用于将多肽(例如，脱氨酶)募集到靶核酸。
可用于本发明的肽标签(例如，表位)可包括但不限于GCN4肽标签(例如，Sun-Tag)、c-Myc亲和标签、HA亲和标签、His亲和标签、S亲和标签、甲硫氨酸-His亲和标签、RGD-His亲和标签、FLAG八肽、strep标签或strep标签II、V5标签和/或VSV-G表位。在一些实施例中，肽标签还可以包括由SH2结构域识别的特定序列环境中的磷酸化酪氨酸，含有由14-3-3蛋白质识别的磷酸丝氨酸的特征性共有序列，由SH3结构域、PDZ蛋白质相互作用结构域或PDZ信号序列识别的富含脯氨酸的肽基序，以及来自植物的AGO钩基序。在WO2018/136783和美国专利申请公开号2017/0219596中公开了肽标签，通过引用将其肽标签的公开内容并入。可与多肽连接并且存在可与另一多肽连接的对应亲和多肽的任何表位都可在本发明中用作肽标签。肽标签可包含或存在于肽标签的一个拷贝或2个或更多个拷贝中(例如，多聚化肽标签或多聚化表位)(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、9、20、21、22、23、24或25个或更多个肽标签)。当多聚化时，肽标签可彼此直接融合，或者其可通过一个或多个氨基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸，任选地约3个至约10个、约4个至约10个、约5个至约10个、约5个至约15个或约5个至约20个氨基酸等，以及其中的任何值或范围)彼此连接。在一些实施例中，与肽标签相互作用/结合的亲和多肽可以是抗体。在一些实施例中，抗体可以是scFv抗体。在一些实施例中，与肽标签结合的亲和多肽可以是合成的(例如，为亲和相互作用而进化的)，包括但不限于亲和体(affibody)、抗运载蛋白(anticalin)、单抗体(monobody)和/或DARPin(参见例如，Sha等人,《蛋白质科学(Protein Sci)》.26(5):910-924(2017))；Gilbreth(《结构生物学的最新观点(Curr Opin Struc Biol)》22(4):413-420(2013))，美国专利第9,982,053号，所述参考文献中的每一者关于亲和体、抗运载蛋白、单抗体和/或DARPin的教导内容通过引用以其整体并入。实例肽标签序列及其亲和多肽包括但不限于SEQ ID NO:42-44的氨基酸序列。
在一些实施例中，向导核酸可连接到RNA募集基序，并且待募集的多肽(例如，脱氨酶)可融合到与RNA募集基序结合的亲和多肽，其中向导序列与靶核酸结合并且RNA募集基序与亲和多肽结合，从而将多肽募集到向导序列并使靶核酸与多肽(例如，脱氨酶)接触。在一些实施例中，可将两个或更多个多肽募集到向导核酸，从而使靶核酸与两个或更多个多肽(例如，脱氨酶)接触。示例RNA募集基序及其亲和多肽包括但不限于SEQ ID NO:45-55的序列。
在一些实施例中，与亲和多肽融合的多肽可以是逆转录酶，并且向导核酸可以是与RNA募集基序连接的延伸的向导核酸。在一些实施例中，RNA募集基序可位于延伸的向导核酸的延伸部分的3'端(例如，5'-3'，重复序列-间隔子-延伸部分(RT模板-引物结合位点)-RNA募集基序)。在一些实施例中，RNA募集基序可嵌入延伸部分中。
在本发明的一些实施例中，延伸的向导RNA和/或向导RNA可连接到一个或两个或更多个RNA募集基序(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个基序；例如，至少10至约25个基序)，任选地其中两个或更多个RNA募集基序可以是相同的RNA募集基序或不同的RNA募集基序。在一些实施例中，RNA募集基序和对应亲和多肽可包括但不限于端粒酶Ku结合基序(例如，Ku结合发夹)和对应亲和多肽Ku(例如，Ku异二聚体)、端粒酶Sm7结合基序和对应亲和多肽Sm7、MS2噬菌体操纵子茎环和对应亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)、PP7噬菌体操纵子茎环和对应亲和多肽PP7外壳蛋白(PCP)、SfMu噬菌体Com茎环和对应亲和多肽Com RNA结合蛋白、PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)和/或合成的RNA适体和适体配体作为对应亲和多肽。在一些实施例中，RNA募集基序和对应亲和多肽可以是MS2噬菌体操纵子茎环和亲和多肽MS2外壳蛋白(MCP)。在一些实施例中，RNA募集基序和对应亲和多肽可以是PUF结合位点(PBS)和亲和多肽Pumilio/fem-3mRNA结合因子(PUF)。
在一些实施例中，用于募集多肽和核酸的组分可以是通过化学相互作用起作用的那些组分，其可以包括但不限于雷帕霉素诱导的FRB-FKBP二聚化；生物素-链霉亲和素；SNAP标签；Halo标签；CLIP标签；化合物诱导的DmrA-DmrC异二聚体；双功能配体(例如，两种蛋白质结合化学物质融合在一起；例如二氢叶酸还原酶(DHFR)。
在一些实施例中，针对在植物中的表达进行优化的本发明的核酸构建体、表达盒或载体与包含相同多核苷酸但未针对在植物中的表达进行密码子优化的核酸构建体、表达盒或载体可以约70％至100％相同(例如，约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％)。
本文还提供了包含本发明的一个或多个多核苷酸、向导核酸、核酸构建体、表达盒或载体的细胞。
本发明的核酸构建体(例如，包含序列特异性核酸结合结构域、CRISPR-Cas效应子结构域、脱氨酶结构域、逆转录酶(RT)、RT模板和/或向导核酸等的构建体)和包含其的表达盒/载体可用作本发明的编辑系统，以用于修饰靶核酸和/或其表达。
任何植物或植物部分(或植物分组成例如属或更高级分类的组群)的靶核酸可使用本发明的多肽、多核苷酸、核糖核蛋白(RNP)、核酸构建体、表达盒和/或载体来修饰(例如，突变，例如，碱基编辑、切割、产生切口等)，包括被子植物、裸子植物、单子叶植物、双子叶植物、C3、C4、CAM植物、苔藓植物、蕨类植物和/或拟蕨植物、微藻和/或大型藻类。可如本文所述进行修饰的植物和/或植物部分可以是任何植物物种/品种/栽培品种的植物和/或植物部分。在一些实施例中，可如本文所述进行修饰的植物是单子叶植物。在一些实施例中，可如本文所述进行修饰的植物是双子叶植物。
如本文所用，术语“植物部分”包括但不限于生殖组织(例如，花瓣、萼片、雄蕊、雌蕊、花托、花药、花粉、花、果实、花蕾、胚珠、种子、胚、种子、胚、坚果、果仁、果穗、玉米棒和壳)；营养组织(例如，叶柄、茎、根、根毛、根尖、髓部、胚芽鞘、茎秆、苗、枝、树皮、顶端分生组织、腋芽、子叶、下胚轴和叶)；维管组织(例如，韧皮部和木质部)；特化细胞，如表皮细胞、薄壁细胞、厚角细胞、厚壁细胞、气孔、保卫细胞、角质层、叶肉细胞；愈伤组织；和插条。术语“植物部分”还包括植物细胞，包括在植物和/或植物的部分、植物原生质体、植物组织、植物器官、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等中完整的植物细胞。如本文所用，“苗”是指地上部分，包括叶和茎。如本文所用，术语“组织培养物”涵盖组织、细胞、原生质体和愈伤组织的培养物。
如本文所用，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，其通常包含细胞壁，但也包括原生质体。本发明的植物细胞可以是分离的单细胞的形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是更高组织单元，如植物组织(包括愈伤组织)或植物器官的一部分。在一些实施例中，植物细胞可以是藻类细胞。“原生质体”是没有细胞壁或仅具有部分细胞壁的分离的植物细胞。因此，在本发明的一些实施例中，包含本发明的核酸分子和/或核苷酸序列的转基因细胞是任何植物或植物部分的细胞，包括但不限于根细胞、叶细胞、组织培养细胞、种子细胞、花细胞、果实细胞、花粉细胞等。在本发明的一些方面，植物部分可以是植物种质。在一些方面中，植物细胞可以是不再生成植物的非繁殖植物细胞。
“植物细胞培养物”是指植物单元(如原生质体、细胞培养细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和处于各种发育阶段的胚)的培养物。
如本文所用，“植物器官”是植物的独特且明显的结构化和分化的部分，如根、茎、叶、花蕾或胚。
如本文所用，“植物组织”是指组织成结构和功能单元的一组植物细胞。包括在植物原位或培养物中的任何植物组织。所述术语包括但不限于整株植物、植物器官、植物种子、组织培养物和组织成结构和/或功能单元的任何植物细胞群。所述术语与上面列出的或本定义所包含的任何特定类型的植物组织结合或不结合使用时，并不旨在排除任何其它类型的植物组织。
在本发明的一些实施例中，提供了转基因组织培养物或转基因植物细胞培养物，其中转基因组织或细胞培养物包含本发明的核酸分子/核苷酸序列。在一些实施例中，通过使转基因植物与非转基因植物培育并在子代中选择包含所需基因编辑而不是用于产生所述编辑的转基因的植物，可从由转基因组织或细胞发育而来的植物中消除转基因。
包含内源性PIF基因的任何植物(其中PIF基因能够调节植物中的避荫响应(SAR))都可以如本文所述进行修饰以减少/减弱或消除植物中的SAR。在一些实施例中，植物可以是单子叶植物。在一些实施例中，植物可以是双子叶植物。
可如本文所述进行修饰的植物的非限制性实例可以包括草坪草(例如，早熟禾、翦股颖、黑麦草、羊茅)、羽毛芦苇草、簇生毛草、芒草、芦竹、柳枝稷、蔬菜作物，包括洋蓟、苤蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、萝蔓莴苣)、黄肉芋、香瓜(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜、白兰瓜、哈密瓜)、芸苔作物(例如，芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、绍菜、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、防风草、菊苣、辣椒、土豆、葫芦科植物(例如，西葫芦、黄瓜、西葫芦、南瓜、番瓜、白兰瓜、西瓜、哈密瓜)、萝卜、干球洋葱(dry bulb onion)、芜菁甘蓝、茄子、婆罗门参、阔叶菊苣、小葱、苦苣、大蒜、菠菜、青葱、南瓜、绿叶蔬菜、甜菜(糖甜菜和饲用甜菜)、甘薯、莙荙菜、辣根、番茄、红萝卜和香料；水果作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、无花果、坚果(例如，栗子、山核桃、开心果、榛子、开心果、花生、核桃、澳洲坚果、杏仁等)、柑橘属(例如，克莱门氏小柑橘、金橘、橙子、葡萄柚、橘子、柑橘、柠檬、酸橙等)、蓝莓、覆盆子、波森莓、蔓越莓、醋栗果、醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄(酿酒葡萄和鲜食葡萄)、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、香瓜、芒果、木瓜和荔枝，大田作物植物，如三叶草、苜蓿、梯牧草、月见草、白芒花、玉米/玉米(饲料玉米、甜玉米、爆米花玉米)、啤酒花、荷荷巴、荞麦、红花、藜麦、小麦、水稻、大麦、黑麦、小米、高粱、燕麦、小黑麦、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类(例如，青豆和干豆)、扁豆、豌豆(例如，田豆、荷兰豆、甜脆豌豆)、大豆、鹰嘴豆(鸡豆))、油料植物(油菜、油菜籽、芥末、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、油棕)、浮萍、拟南芥、纤维植物(棉花、亚麻、黄麻)、樟科植物(肉桂、樟脑)或如咖啡树、甘蔗、茶和天然橡胶植物的植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物(例如，玫瑰、郁金香、紫罗兰)，以及树木，如林木(阔叶树和常绿树，如针叶树；例如，榆树、白蜡树、橡树、枫树、冷杉、云杉、雪松、松树、桦树、柏树、桉树、柳树)以及灌木和其它苗木。在一些实施例中，本发明的核酸构建体和/或编码其的表达盒和/或载体可用于修饰玉米、大豆、小麦、油菜、水稻、番茄、辣椒或向日葵等。
在一些实施例中，可如本文所述进行修饰的植物可包括但不限于玉米、大豆、油菜籽、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、核桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜或芸苔(例如，甘蓝型油菜(B.napus)、甘蓝(B.oleraceae)、芜菁(B.rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)和/或黑芥(B.nigra))。
在一些实施例中，可如本文所述进行修饰的植物是玉米植物(即玉米、玉蜀黍(Zeamays))。在一些实施例中，可如本文所述进行修饰的植物是小麦植物(例如，普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(T.durum)和/或密穗小麦(T.compactum))。
现在将参考以下实例描述本发明。应该理解，这些实例并不旨在限制本发明的权利要求的范围，而是旨在作为某些实施例的示例。技术人员想到的示例性方法的任何变化都旨在落入本发明的范围内。
实例
实例1：PIF的基因组编辑构建体的设计
一种策略被设计成在玉米PIF基因(Zm00001d040536、Zm00001d008205、Zm00001d031044、Zm00001d033267和/或Zm00001d034298(分别是SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:78和/或SEQ ID NO:81)中产生改变的等位基因以改变避荫响应。为了产生一系列等位基因，将包含间隔子(SEQ ID NO:114-119)中的一个或多个的CRISPR-Cas向导核酸设计并置于若干构建体中，所述间隔子与玉米PIF基因内，例如如本文所述的玉米PIF基因(SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112)的区内的一种或多种靶标具有互补性(任选地反向互补)。使用农杆菌将这些构建体引入到干燥的切除的玉米胚中。利用抗生素选择在体外维持经转化的组织以再生正转化株。选择健康的非嵌合植物(E0)并种植在生长托盘中。从再生植物(E0代)收集组织用于DNA提取，并且随后的分子筛选用于鉴定PIF基因中的编辑。将植物鉴定为(1)健康、非嵌合和可育的，并且将(2)低转基因拷贝和(3)PIF基因中的编辑推进到下一代。
实例2：经编辑的等位基因
如实例1中所述产生具有PIF基因的经编辑的等位基因的玉米植物，并在表1中进一步描述。
表1：PIF基因的经编辑的等位基因
实例3：避荫测定
使用装配有LED光阵列的两个生长帐篷(来自AgroMax公司(AgroMax)的4x4银背帐篷)来评价植物中的避荫响应。其中一个帐篷用于标准光条件，并且包含全光谱LED光、红光和远红光，而第二帐篷用于模拟避荫条件，并且包含全光谱LED光和远红光。两个帐篷的温度设定为28℃持续16小时，并且23℃持续8小时夜。下表2和表3中所示的LED设置是用于避荫实验的光设置。
表2：控制帐篷的光设置
表3：用于避荫帐篷的光设置
红色/远红色比率基于红色范围(约640-680nm)和远红色范围(约710-750nm)中的光合光子通量来计算。直接午后阳光下的红色/远红色比率为约1-1.5。用对照帐篷校准测定，从而提供此范围内的比率。避荫帐篷中的照明布置成具有0.12-0.2的红色/远比。
将玉米种子直接播种到土壤/平层中，并将平层置于具有标准照明的常规温室中以使种子发芽。在5天内，将平层转移到对照帐篷或避荫帐篷。在实验的其余部分期间，在三个不同位置(中间、最右角和近右角)测量每个帐篷中的光强度和质量。由于整个帐篷的光强度的变化，具有植物的托盘每天/每隔一天旋转。
使植物生长，直到其达到V2阶段(帐篷中大约7天)，其中V2生长阶段被确定为是在第二叶出现并且两个最低叶具有可见根颈并且第二叶具有尖端时。
通过在土壤水平上切割幼苗并拍摄幼苗的图像来收集叶高度(以毫米为单位测量)。处理图像以确定V1叶的高度(V1SHHT)和V2叶的高度(V2SHHT)。实例4：经编辑的等位基因植物表型避荫响应
针对如实例3所述的避荫响应对实例2中描述的玉米植物进行评价。测量的植物表型包括暴露于正常照明的植物和暴露于避荫照明的植物的V1叶的高度和V2叶的高度。结果汇总于表4-9中。这些观察结果表明，对PIF基因的修饰影响植物避荫响应，这可能影响田地环境中的植物生长习惯，这可能影响产率。
表4：V1鞘高度(mm)经编辑的等位基因Zm00001d040536
等位基因 光处理 平均值 标准偏差 植物的数量
野生型对照(避荫) 对照 44.9 3.1 28
野生型对照(避荫) 避荫 49.4 4.2 30
纯合等位基因A 对照 49.4 4.2 19
纯合等位基因A 避荫 53.0 3.1 19
纯合等位基因B 对照 45.7 5.8 23
纯合等位基因B 避荫 51.0 4.2 27
表5：V2鞘高度(mm)经编辑的等位基因Zm00001d040536
等位基因 光处理 平均值 标准偏差 植物的数量
野生型对照(避荫) 对照 92.3 3.2 28
野生型对照(避荫) 避荫 100.4 5.6 30
纯合等位基因A 对照 95.6 4.6 18
纯合等位基因A 避荫 103.0 4.3 19
纯合等位基因B 对照 93.2 7.5 22
纯合等位基因B 避荫 98.9 6.6 27
表6：Zm00001d034298或Zm00001d034298的V1鞘高度(以mm为单位)经编辑的等位基因
等位基因 光处理 平均值 标准偏差 植物的数量
野生型对照(避荫) 对照 49.1 4.3 30
野生型对照(避荫) 避荫 51.0 3.6 28
阳性对照(减少避荫) 对照 43.3 2.6 19
阳性对照(减少避荫) 避荫 44.7 2.5 24
纯合等位基因C 对照 42.5 3.8 30
纯合等位基因C 避荫 44.1 2.9 25
纯合等位基因D 对照 40.6 4.2 31
纯合等位基因D 避荫 46.9 4.0 28
纯合等位基因E 对照 44.5 3.7 29
纯合等位基因E 避荫 43.6 3.4 23
纯合等位基因F 对照 47.0 3.7 30
纯合等位基因F 避荫 49.5 4.1 26
纯合等位基因G 对照 41.1 4.4 25
纯合等位基因G 避荫 48.5 3.0 21
表7：Zm00001d034298或Zm00001d034298的V2鞘高度(以mm为单位)经编辑的等位基因
表8：Zm00001d033267的V1鞘高度(以mm为单位)经编辑的等位基因
等位基因 光处理 平均值 标准偏差 植物的数量
野生型对照(避荫) 对照 52.2 3.3 25
野生型对照(避荫) 避荫 56.7 3.5 30
阳性对照(减少避荫) 对照 49.4 3.8 18
阳性对照(减少避荫) 避荫 54.9 3.7 25
纯合等位基因H 对照 43.4 3.3 30
纯合等位基因H 避荫 49.4 2.6 26
纯合等位基因I 对照 48.4 3.6 27
纯合等位基因I 避荫 50.3 4.1 30
纯合等位基因J 对照 47.1 2.6 30
纯合等位基因J 避荫 51.6 4.1 28
纯合等位基因K 对照 43.8 5.3 24
纯合等位基因K 避荫 44.8 6.1 19
表9：Zm00001d033267的V2鞘高度(以mm为单位)经编辑的等位基因
等位基因 光处理 平均值 标准偏差 植物的数量
野生型对照(避荫) 对照 97.2 5.3 26
野生型对照(避荫) 避荫 108.1 6.1 30
阳性对照(减少避荫) 对照 96.5 3.9 17
阳性对照(减少避荫) 避荫 108.7 5.5 23
纯合等位基因H 对照 92.4 4.1 29
纯合等位基因H 避荫 108.1 4.5 25
纯合等位基因I 对照 96.9 3.7 26
纯合等位基因I 避荫 99.4 6.5 29
纯合等位基因J 对照 94.1 3.8 29
纯合等位基因J 避荫 99.8 4.7 27
纯合等位基因K 对照 90.6 5.8 23
纯合等位基因K 避荫 90.1 8.5 19
前述内容是对本发明的说明，不应被解释为对本发明的限制。本发明由以下权利要求限定，权利要求的等同物也包括在其中。

Claims (110)

1.一种植物或其部分，所述植物或其部分包含在编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因中的至少一个突变，其中所述突变破坏所述PIF转录因子与所述植物或其部分中的DNA的结合。
2.根据权利要求1所述的植物或其部分，其中所述PIF转录因子是碱性螺旋环螺旋(bHLH)转录因子。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变在编码所述PIF转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域的所述内源性基因的区中。
4.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述PIF转录因子能够调节所述植物中的对光照的响应(例如，避荫响应(SAR))。
5.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中编码PIF转录因子的内源性基因中的所述至少一个突变产生显性负等位基因、隐性等位基因、无效等位基因、弱功能丧失型等位基因或亚效等位基因。
6.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述编码PIF转录因子的内源性基因是光敏色素相互作用因子3(PIF3)基因、光敏色素相互作用因子4(PIF4)基因或光敏色素相互作用因子5(PIF5)基因。
7.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物是玉米、大豆、油菜籽、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、核桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜、黑莓、树莓、覆盆子或芸苔(Brassicaspp)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述编码PIF转录因子的内源性基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区。
10.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入。
11.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变包含变为A、T、G或C的碱基取代，所述碱基取代产生氨基酸取代。
12.根据权利要求11所述的植物或其部分，其中所述氨基酸取代破坏所述PIF转录因子的所述bHLH结构域。
13.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ ID NO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代。
14.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变是在参考SEQ ID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代。
15.根据权利要求11至14中任一项所述的植物或其部分，其中所述氨基酸取代是谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)。
16.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变是非天然突变。
17.根据前述权利要求中任一项所述的植物或植物部分，其中和与一株或多株植物紧邻种植的不包含减少的避荫响应的植物相比，所述植物在与一株或多株植物紧邻种植时表现出减少的避荫响应，任选地在与一株或多株植物紧邻种植时表现出以下表型中的至少一种：增加的产量、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。
18.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述植物能够以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量。
19.根据权利要求18所述的植物或其部分，其中所述种植密度增加了约5％至约75％，而不降低基于每株植物的植物产量。
20.根据前述权利要求中任一项所述的植物或其部分，其中所述至少一个突变产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
21.一种包含编辑系统的植物细胞，所述编辑系统包含：
(a)CRISPR-Cas相关效应蛋白；以及
(b)向导核酸(gRNA、gDNA、crRNA、crDNA)，所述向导核酸具有间隔子序列，所述间隔子序列与编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性靶基因具有互补性。
22.根据权利要求21所述的植物细胞，其中所述编码PIF转录因子的内源性基因是光敏色素相互作用因子3(PIF3)基因、光敏色素相互作用因子4(PIF4)基因或光敏色素相互作用因子5(PIF5)基因。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的植物细胞，其中所述编码PIF转录因子的内源性基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的植物细胞，其中所述向导核酸包含SEQ IDNO:114-119中的任一者的核苷酸序列(间隔子)或其任何组合。
25.一种植物细胞，其包含在光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变，其中所述突变是使用包含与编码所述PIF转录因子的内源性PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域的编辑系统引入到所述内源性PIF基因中的取代、插入和/或缺失，其中所述内源性PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区。
26.根据权利要求25所述的植物细胞，其中内源性基因PIF基因是光敏色素相互作用因子3(PIF3)基因、光敏色素相互作用因子4(PIF4)基因或光敏色素相互作用因子5(PIF5)基因。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的植物细胞，其中所述编辑系统的所述核酸结合结构域来自由多核苷酸引导的核酸内切酶、CRISPR-Cas核酸内切酶(例如，CRISPR-Cas效应蛋白)、锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和/或Argonaute蛋白。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的植物细胞，其中所述突变包含变为A、T、G或C的碱基取代，任选地其中所述碱基取代产生氨基酸取代。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的植物细胞，其中所述突变是所述PIF转录因子的区中的至少一个氨基酸残基的取代，所述区与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少90％序列同一性。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的植物细胞，其中所述植物细胞是来自以下的细胞：玉米、大豆、油菜籽、小麦、水稻、棉花、甘蔗、糖甜菜、大麦、燕麦、苜蓿、向日葵、红花、油棕、芝麻、椰子、烟草、马铃薯、甘薯、木薯、咖啡、苹果、李子、杏、桃、樱桃、梨、无花果、香蕉、柑橘、可可、鳄梨、橄榄、杏仁、核桃、草莓、西瓜、胡椒、葡萄、番茄、黄瓜、黑莓、树莓、覆盆子或芸苔，任选地其中所述植物细胞来自玉米。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的植物细胞，其中所述突变是非天然突变。
32.根据权利要求25至30中任一项所述的植物细胞，其中至少一个突变产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
33.一种植物，其由根据权利要求1至20中任一项所述的植物部分或由根据权利要求21至32中任一项所述的植物细胞再生，并且包含内源性PIF基因中的所述突变。
34.根据权利要求33所述的植物，其中和与一株或多株植物紧邻种植的不包含减少的避荫响应的植物相比，所述植物在与一株或多株植物紧邻种植时表现出减少的避荫响应，任选地在与一株或多株植物紧邻种植时表现出以下表型中的至少一种：增加的产量、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的植物，其中所述植物能够以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量。
36.根据权利要求35所述的植物或其部分，其中所述种植密度增加了约5％至约75％，而不降低基于每株植物的植物产量。
37.一种提供多株植物的方法，当所述多株植物中的每株植物在种植区中彼此紧邻种植时，所述多株植物具有增加的产量，所述方法包含将两株或更多株根据权利要求1至20或33至36中任一项所述的植物在种植区中彼此紧邻种植，由此提供与彼此紧邻种植的多株对照植物相比具有增加的产量的多株植物。
38.一种生产/培育不含转基因的经基因组编辑的(例如，经碱基编辑的)植物的方法，所述方法包含：
(a)使根据权利要求1至20或33至36中任一项所述的植物与不含转基因的植物杂交，由此将所述突变引入到所述不含转基因的植物中；以及
(b)选择包含所述突变但不含转基因的子代植物，由此产生不含转基因的经基因组编辑的(例如，经碱基编辑的)植物。
39.一种在植物中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中产生突变的方法，所述方法包含：
(a)将基因编辑系统靶向到所述PIF基因的一部分，所述部分包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；以及
(b)选择包含位于所述PIF基因的区中的修饰的植物，所述区与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者具有至少80％序列同一性。
40.一种在光敏色素相互作用因子(PIF)多肽中产生变化的方法，所述方法包含：
将编辑系统引入到植物细胞中，其中所述编辑系统靶向到编码所述PIF多肽的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因的区，以及
使所述内源性PIF基因的所述区与所述编辑系统接触，由此将突变引入到所述内源性PIF基因中并在所述植物细胞的所述PIF多肽中产生变化。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述内源性PIF基因包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82中的任一者具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，和/或编码与SEQ ID NO:71、74、77、80或83中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中所靶向的所述内源性PIF基因的所述区与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列包含至少80％序列同一性。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，其中在所述PIF多肽的区中产生变化，所述区包含与SEQ ID NO:113中的任一者具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，其中使所述植物细胞中的所述内源性PIF基因的所述区与所述编辑系统接触产生植物细胞，所述植物细胞在其基因组中包含经编辑的PIF基因，所述方法进一步包含(a)由所述植物细胞再生植物；(b)使所述植物自交以产生子代植物(E1)；(c)测定(b)的所述子代植物的减少的避荫响应；以及(d)选择与对照植物相比表现出减少的避荫响应的表型的所述子代植物。
45.根据权利要求44所述的方法，其进一步包含(e)使(d)的所选子代植物自交以产生子代植物(E2)；(f)测定(e)的所述子代植物的减少的避荫响应；以及(g)选择与对照植物相比表现出减少的避荫响应的表型的所述子代植物，任选地另外重复(e)至(g)一次或多次。
46.一种检测植物中的突变体PIF基因(内源性PIF基因中的突变)的方法，所述方法包含在所述植物的基因组中检测PIF基因，所述PIF基因具有在与SEQ ID NO:84-112中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性的区内的至少一个突变。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所检测的所述突变体PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述突变体PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
48.一种用于编辑植物细胞的基因组中的特异性位点的方法，所述方法包含以位点特异性方式切割所述植物细胞中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点，所述内源性PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此在所述植物细胞的所述内源性PIF基因中产生编辑。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述编辑在由所述内源性PIF基因编码的PIF多肽的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中产生突变。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其进一步包含由包含所述内源性PIF基因中的所述编辑的所述植物细胞再生植物，以产生在其内源性PIF基因中包含所述编辑的植物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中与缺乏所述编辑的对照植物相比，在其内源性PIF转录因子基因中包含所述编辑的所述植物具有减弱的避荫响应。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述编辑产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
53.一种用于制备植物的方法，所述方法包含：
(a)使包含编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因的植物细胞群体与靶向到所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接至与所述内源性基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性基因
(i)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(iv)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区；
(b)从所述群体中选择植物细胞，所述植物细胞包含所述编码PIF转录因子的内源性基因中的突变，其中所述突变是(iii)或(iv)的多肽中的或由(i)或(ii)的核苷酸序列中的任一者编码的多肽中的至少一个氨基酸残基的取代，其中所述突变修饰所述PIF转录因子的bHLH结构域；以及
(c)使所选植物细胞生长成包含所述编码PIF转录因子的内源性基因中的所述突变的植物。
54.一种用于减少/抑制植物中的避荫响应的方法，所述方法包含：
(a)使包含编码PIF转录因子的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因的植物细胞与靶向到所述内源性基因的核酸酶接触，其中所述核酸酶连接至与所述内源性PIF基因内的靶位点结合的核酸结合结构域，所述内源性PIF基因：
(i)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(ii)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(iii)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(iv)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此产生包含在所述编码PIF多肽的内源性PIF基因中的突变的植物细胞；以及
(b)使所述植物细胞生长成植物，由此减少/抑制所述植物中的所述避荫响应。
55.一种用于产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含具有在内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的突变的至少一个细胞，所述方法包含使所述植物或其部分中的所述内源性PIF基因内的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的所述核酸结合结构域与所述内源性PIF基因内的靶位点结合，其中所述内源性PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此产生植物或其部分，所述植物或其部分包含具有在所述内源性PIF基因中的突变的至少一个细胞。
56.一种产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分包含在光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的碱性螺旋环螺旋(bHLH)结构域中的突变，所述方法包含使所述植物或其部分中的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点与包含切割结构域和核酸结合结构域的核酸酶接触，其中所述核酸酶的所述核酸结合结构域与所述内源性PIF基因内的所述靶位点结合，其中所述内源性PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，由此产生植物或其部分，所述植物或其部分具有含有经修饰的bHLH结构域的经突变的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子。
57.根据权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)、核酸内切酶(例如，Fok1)或CRISPR-Cas效应蛋白。
58.根据权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述核酸酶切割内源性PIF转录因子基因，并且突变被引入到由所述内源性PIF转录因子基因编码的所述PIF转录因子的所述bHLH结构域中。
59.根据权利要求53至58中任一项所述的方法，其中所述靶位点是所述PIF基因的区，所述区与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112中的任一者的核苷酸序列具有至少80％序列同一性或与编码SEQ ID NO:113的氨基酸序列的核苷酸序列具有至少80％序列同一性。
60.根据权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述内源性PIF基因是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因。
61.根据权利要求53、54或56至60所述的方法，其中所述PIF转录因子能够调节所述植物中的对光照的响应(例如，避荫响应(SAR))。
62.根据权利要求53至61中任一项所述的方法，其中所述至少一个突变是碱基取代、碱基缺失和/或碱基插入。
63.根据权利要求53至62中任一项所述的方法，其中所述突变是变为A、T、G或C的碱基取代。
64.根据权利要求53至63中任一项所述的方法，其中所述突变产生氨基酸取代，任选地其中所述氨基酸取代破坏所述PIF转录因子的所述bHLH结构域。
65.根据权利要求53至64中任一项所述的方法，其中所述突变是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ ID NO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代。
66.根据权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述突变是在参考SEQ ID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代。
67.根据权利要求65或权利要求66所述的方法，其中所述取代是谷氨酸(E)变为赖氨酸(K)。
68.根据权利要求53至65中任一项所述的方法，其中所述突变是非天然突变。
69.根据权利要求53至68中任一项所述的方法，其中所述内源性PIF基因中的所述突变产生具有降低的DNA结合的PIF转录因子。
70.根据权利要求53至69中任一项所述的方法，其中所述内源性PIF基因中的所述突变是显性负突变、隐性突变、无效突变、弱功能丧失型突变或亚效突变。
71.根据权利要求53至70中任一项所述的方法，其中与对照植物相比，所产生的植物表现出减少的避荫响应。
72.根据权利要求71所述的方法，其中和与一株或多株植物紧邻种植的不包含减少的避荫响应的植物相比，表现出减少的避荫响应的所述植物在与一株或多株植物紧邻种植时表现出以下表型中的至少一种：增加的产量、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。
73.根据权利要求71或权利要求72所述的方法，其中所述植物以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述种植密度增加了约5％至约75％，而不降低基于每株植物的植物产量。
75.根据权利要求53至74中任一项所述的方法，其中所述突变产生经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
76.一种向导核酸，其与编码光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子的内源性基因内的靶位点结合，所述内源性基因包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；或编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或所述靶位点包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的核苷酸序列；或编码与SEQ ID NO:113具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。
77.根据权利要求76所述的向导核酸，其中所述向导核酸包含间隔子，所述间隔子具有SEQ ID NO:114-119中的任一者的核苷酸序列。
78.一种系统，其包含根据权利要求76或权利要求77所述的向导核酸以及与所述向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白。
79.根据权利要求78所述的系统，其进一步包含与所述向导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸和所述向导核酸共价连接。
80.一种基因编辑系统，其包含与向导核酸缔合的CRISPR-Cas效应蛋白，其中所述向导核酸包含与光敏色素相互作用因子(PIF)基因结合的间隔子序列。
81.根据权利要求80所述的基因编辑系统，其中所述PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区。
82.根据权利要求80或权利要求81所述的基因编辑系统，其中所述向导核酸包含间隔子序列，所述间隔子序列具有SEQ ID NO:114-119中的任一者的核苷酸序列。
83.根据权利要求80至82中任一项所述的基因编辑系统，其进一步包含与所述向导核酸和CRISPR-Cas效应蛋白缔合的tracr核酸，任选地其中所述tracr核酸和所述向导核酸共价连接。
84.根据权利要求80至83中任一项所述的基因编辑系统，其中所述PIF基因是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因。
85.一种复合物，其包含包括切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白和向导核酸，其中所述向导核酸与光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合，所述PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区，其中所述切割结构域切割所述PIF基因中的靶链。
86.一种表达盒，其包含(a)编码包含切割结构域的CRISPR-Cas效应蛋白的多核苷酸，以及(b)向导核酸，所述向导核酸与光敏色素相互作用因子(PIF)基因内的靶位点结合，其中所述向导核酸包含间隔子序列，所述间隔子序列与所述PIF基因内的所述靶位点互补并且与所述靶位点结合，所述PIF基因：
(a)包含与SEQ ID NO:69、70、72、73、75、76、78、79、81或82的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列；
(b)包含与SEQ ID NO:84-87、88-91、92-95、96-108或109-112的核苷酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的区；
(c)编码包含与SEQ ID NO:71、74、77、80或83的氨基酸序列中的任一者具有至少80％序列同一性的序列的多肽；和/或
(d)编码与SEQ ID NO:113的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的区。
87.根据权利要求85所述的复合物或根据权利要求86所述的表达盒，其中所述PIF基因是PIF3基因、PIF4基因或PIF5基因。
88.一种核酸，其编码包含经突变的bHLH结构域的光敏色素相互作用因子(PIF)转录因子。
89.根据权利要求88所述的核酸，其中所述PIF转录因子是PIF3转录因子、PIF4转录因子或PIF5转录因子。
90.根据权利要求88或权利要求89所述的核酸，其中所述突变是在参考SEQ ID NO:71的残基位置编号的残基E361处、在参考SEQ ID NO:74的残基位置编号的残基E430处、在参考SEQ ID NO:77的残基位置编号的残基E260处、在参考SEQ ID NO:80的残基位置编号的残基E341处或在参考SEQ ID NO:83的残基位置编号的残基E232处产生氨基酸取代的取代。
91.根据权利要求88至90中任一项所述的核酸，其中所述突变是在参考SEQ ID NO:113的残基位置编号的残基E6位处产生氨基酸取代的取代。
92.根据权利要求88至91中任一项所述的核酸，其中所述核酸包含经突变的PIF基因，所述经突变的PIF基因包含与SEQ ID NO:120、122、124、126、128、129、130、132、133、134或135中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，和/或所述经突变的PIF基因编码与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性的经突变的PIF多肽。
93.一种经修饰的PIF转录因子，其与SEQ ID NO:121、123、125、127或131中的任一者具有至少90％序列同一性。
94.一种植物或其部分，所述植物或其部分包含根据权利要求88至92中任一项所述的核酸或根据权利要求93所述的经修饰的PIF转录因子。
95.一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分包含根据权利要求88至92中任一项所述的核酸和/或根据权利要求93所述的经修饰的PIF转录因子。
96.一种小麦植物或其部分，所述小麦植物或其部分包含根据权利要求88至92中任一项所述的核酸和/或根据权利要求93所述的经修饰的PIF转录因子。
97.根据权利要求94所述的植物、根据权利要求95所述的玉米植物或根据权利要求96所述的小麦植物，其表现出减少的避荫响应的表型。
98.根据权利要求97所述的植物、玉米植物或小麦植物，其中和不包含减少的避荫响应并且与一株或多株植物、玉米植物和/或小麦植物紧邻种植的玉米植物或小麦植物相比，所述植物、玉米植物或小麦植物在与一株或多株植物、玉米植物和/或小麦植物紧邻种植时进一步表现出增加的产量、降低的高度、降低的冠:根比、减少的叶长；增加的茎机械强度；降低的倒伏率；延迟的衰老；增加的光合作用效率和籽粒灌浆；和/或增强的对病原体和食草动物的防御响应。
99.根据权利要求97或权利要求98所述的植物、玉米植物或小麦植物，其中所述植物、所述玉米植物或所述小麦植物以增加的密度种植，而不降低基于每株植物的植物产量。
100.根据权利要求99所述的植物、玉米植物或小麦植物，其中所述种植密度增加了约5％至约75％，而不降低基于每株植物的植物产量。
101.一种玉米植物或其部分，所述玉米植物或其部分包含在具有Zm00001d040536、Zm00001d008205、Zm00001d031044、Zm00001d033267或Zm00001d034298的基因标识号(基因ID)(Maize GDB)的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的至少一个突变，任选地其中所述突变是非天然突变。
102.一种向导核酸，其与在具有Zm00001d040536、Zm00001d008205、Zm00001d031044、Zm00001d033267或Zm00001d034298的基因标识号(基因ID)(Maize GDB)的内源性光敏色素相互作用因子(PIF)基因中的靶核酸结合。
103.一种产生包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物的方法，所述方法包含：
使作为根据权利要求1至20、33至36或94至101中任一项所述的植物的第一植物与包含所述至少一种所关注的多核苷酸的第二植物杂交以产生子代植物；以及
选择包含所述PIF基因中的所述突变和所述至少一种所关注的多核苷酸的子代植物，由此产生所述包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物。
104.一种产生包含内源性PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物的方法，所述方法包含：
将至少一种所关注的多核苷酸引入到根据权利要求1至20、33至36或94至101中任一项所述的植物中，由此产生包含PIF基因中的突变和至少一种所关注的多核苷酸的植物。
105.根据权利要求103或权利要求104中任一项所述的方法，其中所述所关注的多核苷酸是赋予除草剂耐受性、昆虫抗性、抗病性、增加的产量、增加的养分利用效率或非生物胁迫抗性的多核苷酸。
106.一种产生植物的方法，所述植物包含内源性PIF基因中的突变并表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型，所述方法包含
使作为根据权利要求1至20、33至36或94至101中任一项所述的植物的第一植物与表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的第二植物杂交；以及
选择包含所述PIF基因中的所述突变以及改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的子代植物，由此产生所述包含所述内源性PIF基因中的突变并与对照植物相比表现出改善的产量性状、改善的植物构型和/或改善的防御性状的表型的植物。
107.一种控制容器(例如，盆或种子盘等)、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上的杂草的方法，所述方法包含向在容器、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上生长的一株或多株(多株)根据权利要求1至20、33至36或94至101中任一项所述的植物施涂除草剂，由此控制其中正在生长所述一株或多株植物的所述容器、所述生长室、所述温室、所述田地、所述休闲区、所述草坪中或所述路边上的所述杂草。
108.一种减少植物上的昆虫捕食的方法，所述方法包含向一株或多株根据权利要求1至20、33至36或94至101中任一项所述的植物施涂杀虫剂，由此减少所述一株或多株植物上的昆虫捕食。
109.一种减少植物上的真菌病的方法，所述方法包含向一株或多株根据权利要求1至20、33至36或94至101中任一项所述的植物施涂杀真菌剂，由此减少所述一株或多株植物上的真菌病。
110.根据权利要求108或权利要求109所述的方法，其中所述一株或多株植物在容器、生长室、温室、田地、休闲区、草坪中或路边上生长。
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