CN120344725A

CN120344725A - 减少测序文库中游离接头的方法

Info

Publication number: CN120344725A
Application number: CN202280102106.5A
Authority: CN
Inventors: 王欧; 师虓; 郭斐; 陈俊毅; 季州翔; 章文蔚; 董宇亮
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2025-07-18
Also published as: WO2024138320A1

Abstract

提供了一种构建测序文库的方法、测序文库、测序方法以及构建测序文库的试剂盒。其中，构建测序文库的方法包括：对连接有接头的待测样本在核酸外切酶的作用下消化处理，以便获得目的测序文库。

Description

减少测序文库中游离接头的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及构建测序文库的方法及其应用，更具体的，涉及构建测序文库的方法、测序文库、对目标核酸分子进行测序的方法以及试剂盒。

背景技术

核酸测序已经成为生命科学研究领域不可或缺的重要研究手段。而与之相伴而生的，基于大规模测序数据的基因组学技术也已经在不同的研究和应用方向发挥重要作用，如对复杂疾病的起因溯源和其发展过程的动态监控，对经济型作物和动物的定向育种，对不同生物遗传资源的研究和保护等。

但以上研究的先决条件在于如何利用高通量并行测序获得高精度的，完整的核酸序列。现今主流的合成法测序技术的测序准确性较高，大部分测序碱基的原始正确率可以达到99.9％以上，然而其读长较短，使用这些短读长序列，无论是重测序比对还是从头组装，均难以还原出完整的目标核酸序列。

因此如何获取核酸序列中的长距离信息已成为目前测序技术研究的热点问题之一。目前可以提供长读长测序解决方案的商业化公司主要有两家。第一家是美国太平洋生物科技公司(Pacific Bioscience，简称Pacbio)的单分子实时测序，和英国牛津纳米孔科技公司(Oxford Nanopore，简称ONT)的纳米孔测序。此外，国外的Quantum SI，Genia，国内如齐碳，今世，安序源等公司均已进入这一技术领域并有原型机发布。

随着科学技术进步，当前临床样本变异检测已经不满足于只检测小范围变异(单核苷酸突变和小删除/插入突变)，一些由大范围结构变异所引发的遗传异常正在逐渐被解析，由于结构变异检测对于测序读长较为敏感，因此长读长测序技术也将逐步从科技服务领域转向临床检测领域，对测序技术的准确度和成本控制的要求也将随之提升。

在准确度方面，Pacbio公司在2019年推出的基于环化一致性测序的Hi-Fi测序方法(图1)，重复5次读取可以达到平均测序正确率99％以上，但因为需要对同一分子进行多次重复测序，因而成本较高。

为了能够节约成本，牛津纳米孔公司最新推出的PromethION 48系统，可以实现单Gb成本在2-16美元，已经逐渐接近市场上应用较广的合成法测序成本。该系统的正确率虽然相比Pacbio的环化一致性测序方法仍有不足，但根据牛津纳米孔公司最新披露的数据，其正确率可以达到98.4％，相比早期纳米孔数据已经有了显著提升。

目前纳米孔测序方案的是其成本较低，但测序准确率仍有一定提升空间。与常规合成法测序不同，纳米孔测序文库一般的插入片段较长，从几千个碱基至百万个碱基，因此其双链末端相比短插入片段文库更少，接头连接效率偏低。而由于纳米孔测序接头上一般偶联有测序所必需的控速蛋白，因此在连接后进行磁珠或柱纯化时，无法使用带有醇类的清洗试剂，从而造成接头较难被纯化步骤移除，导致测序过程中的非目的片段测出，造成测序准确率下降。

因此，本领域迫切需要开发一种除去测序文库中游离接头的方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。

为了能够避免进行柱纯化过程使用醇类清洗剂带来的控速蛋白变性问题，发明人发现，可以在建库过程中加入一种核酸外切酶除去文库中的残余接头，在纯化过程中，不使用醇类清洗剂，仅使用磁珠或柱纯化即可，避免测序过程中的非目的片段测出，能够提高测序准确率，增加测序通量，在短时间获得高品质测序reads。

基于上述发现，在本发明的第一方面，本发明提出了一种建立测序文库的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：对连接有接头的待测样本在核酸外切酶的作用下消化处理，以便获得所述测序文库。根据本发明实施例的方法，通过引入核酸外切酶，降解掉完全没有发生连接的待测片段、没有连接在待测插入片段两端的单链游离接头以及接头连接不完全的产物(是指只有一端连接接头，另一端未连接接头的产物)，从而减少测序通道时间被非期望文库占用的时间，进而提升测序通量，增加测序准确率。

根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述方法包括对未发生连接的待测片段、没有连接在待测插入片段两端的游离接头以及接头连接不完全的产物进行核酸外切酶消化处理获得消化处理产物。

根据本发明的实施例，进一步包括将获得的消化处理产物进行解旋处理。

根据本发明的实施例，所述解旋处理是在解旋酶的作用下进行的。

根据本发明的实施例，所述解旋酶沿DNA的移动方向为5’端至3’端，所述核酸外切酶为5’->3’核酸外切酶。

根据本发明的实施例，所述核酸外切酶识别双链DNA且所述核酸外切酶为5’->3’核酸外切酶，所述核酸外切酶包括选自T7 exonuclease，Lambda exonuclease，T5 Exonuclease，Exonuclease VI，Exonuclease VIII(truncated)中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述核酸外切酶优选为T7 exonuclease。

根据本发明的实施例，所述解旋酶沿DNA的移动方向为3’端至5’端，所述核酸外切酶为3’->5’核酸外切酶。

根据本发明的实施例，所述3’->5’核酸外切酶识别双链DNA，并且所述核酸外切酶包括选自Exonuclease III，Exonuclease IX，Exonuclease X中的至少之一。

根据本发明的实施例，所述核酸外切酶识别单链DNA。

根据本发明的实施例，所述建立测序文库方法还可以包括对连接有接头的待测样本的5’端和/或3’端进行防降解修饰处理。对于采用一些可以识别单链DNA的5’末端并进行水解的外切酶(如：T7 exonuclease，T5 exonuclease，Lambda exonuclease，Exonuclease VI，Exonuclease VIII(truncated))对连接产物进行消化处理，可以预先对单链的5’末端，例如连接有Y型接头的待测序列的5’末端进行一些化学修饰，用于抵抗核酸酶的降解。

根据本发明的实施例，所述防降解修饰包括选自磷酸修饰，2’-OH修饰(RNA碱基)，2’-F修饰，LNA锁核苷酸修饰和PNA肽核酸修饰的至少之一。

根据本发明的实施例，所述消化处理是在37℃，连接产物与T7核酸外切酶比例为44：1条件下进行4～6min。

根据本发明的实施例，所述接头为Y型接头或非Y型接头。

根据本发明的实施例，所述非Y型接头具有如下所述结构的至少之一：完整互补双链，互补双链-不互补单链-互补双链，5’突出单链-互补双链，3’突出单链-互补双链。

根据本发明的实施例，所述建立测序文库的方法进一步包括对消化处理产物进行纯化处理。

根据本发明的实施例，所述纯化处理采用Ampure XP磁珠纯化。

根据本发明的实施例，所述连接有接头的待测样本是通过如下方式获得的：

(1)将待测样本进行末端修复和加A处理(加poly-A尾巴)；

(2)将加A处理产物进行接头连接处理，以便获得所述连接有接头的待测样本。

根据本发明的实施例，所述末端修复和加A处理之后和连接处理之前，进一步包括对加A处理产物进行第一纯化处理。

根据本发明的实施例，所述连接处理之后，进一步包括对连接处理产物进行第二纯化处理。

根据本发明的实施例，所述待测样本为DNA样本。

根据本发明的实施例，将待测样本进行末端修复和加A处理之前，进一步包括将待测样本进行片段化处理。

在本发明的第二个方面，本发明还提出了一种测序文库。根据本发明的实施例，所述测序文库是根据本发明实施例的建立测序文库的方法，获得核酸样本的测序文库。发明人发现，利用该方法获得的测序文库中没有发生连接的待测片段、没有连接在待测插入片段两端的游离接头以及接头连接不完全的产物显著降低，并且操作简单、测序准确度明显高、可重复性好、成本低、测序通量大。

在本发明的第三个方面，本发明还提供了一种测序方法。根据本发明的实施例，该方法包括对上述的测序文库进行测序处理，以便获得待测样本的序列。发明人发现，利用该方法能够高效地确定核酸样本的序列信息，并且灵敏度高、精确度高、可重复性好、测序通量大。

根据本发明的具体实施例，所述测序是在纳米孔测序平台上进行的。当所述测序在纳米孔测序平台上进行时，测序接头上一般偶联有测序所必需的控速蛋白，因此在连接后进行磁珠或柱纯化时，无法使用带有醇类的清洗试剂，当利用本发明第一方面方面所构建的测序文库时，在测序文库纯化时就将没有发生连接的待测片段、没有连接在待测插入片段两端的游离接头以及接头连接不完全的产物降解，避免了测序过程中的非目的片段测出，测序准确率显著提高。

在本发明的第四个方面，本发明还提供了一种用于构建测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括试剂，试剂中含有核酸外切酶，用于对连接有接头的待测样本消化处理。发明人发现，利用本发明的试剂盒，结合上述建立测序文库的方法、测序文库、测序方法，能够有效地获得的测序文库，并能够有效地应用于高通量测序平台，进而能够有效地确定该核酸样本的核酸序列信息，且获得的信息精确度高、测序通量大。

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述试剂进一步包括第一试剂，所述第一试剂适于将待测样本进行片段化处理。

根据本发明的实施例，所述试剂进一步包括第二试剂，所述第二试剂适于对将待测样本进行末端修复和加A处理。

根据本发明的实施例，所述试剂进一步包括第三试剂，所述第三试剂适于将待测样本进行接头连接处理。

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括接头，所述接头携带5’末端磷酸基团。

根据本发明的实施例，所述核酸外切酶包括T7 exonuclease，Lambda exonuclease，T5 Exonuclease，Exonuclease VI，Exonuclease VIII(truncated)，Exonuclease III，Exonuclease IX，Exonuclease X中的至少之一。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为根据本发明实施例的Pacbio环化一致性测序原理；

图2为根据本发明实施例的无外切酶的纳米孔文库构建流程图；

图3为根据本发明实施例的含有外切酶步骤的建库过程(测序方向为5’->3’)；

图4为根据本发明实施例的含有外切酶步骤的建库过程(测序方向为3’->5’)；

图5为根据本发明实施例的纯化后蛋白质控结果；

图6为根据本发明实施例的酶切前后文库条带对比；

图7为根据本发明实施例的有无酶切文库电信号变化情况对比；

图8为根据本发明实施例的原始文库测序与酶切文库测序游离接头占比统计。

发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

建立测序文库的方法

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种建立测序文库的方法。根据本发明的实施例，参照图3和图4，该方法包括以下步骤：

根据本发明的实施例，第一步，对基因组的DNA序列进行选择性打断，以便获得片段化的基因组DNA分子，这样可以提高上机测序时较高的文库捕获率。第二步，对片段化的基因组DNA分子进行末端修复加“A”。第三步，对加“A”后的基因组DNA进行产物纯化处理，目的是获得较纯的样品，以便于增加测序时的正确率以及测序通量。第四步，将纯化处理后得到的样品进行接头连接。根据本发明的实施例，接头连接是指将接头与T4DNA连接酶(NEB,E6057AVIAL)进行混合处理，最后获得接头连接后的样品。第五步，对接头连接样品进行产物纯化，更高纯度的样品对于上机测序的精确度以及数据量极为重要。第六步，纯化后的连接产物在首先在核酸外切酶的作用下消化处理，降解完全没有发生连接的待测片段、没有连接在待测插入片段两端的游离接头中的一条链以及接头连接不完全的产物，从而减少测序通道时间被非期望文库占用的时间，进而提升测序通量。根据本发明的实施例，核酸外切酶可选择T7 exonuclease，Lambda exonuclease，T5 Exonuclease，Exonuclease VI，Exonuclease VIII(truncated)，Exonuclease III，Exonuclease IX，Exonuclease X中的至少之一。第七步，将核酸外切酶处理过的样品进行产物纯化处理，获得初步文库样品。第八步，将获得的初步文库样品与解旋酶Dda蛋白进行共孵育，最终获得可用于测序上机的文库。根据本发明的实施例，解旋酶沿DNA的移动方向为5’端至3’端(图3)或3’端至5’端(图4)。

根据本发明实施例，所述解旋酶与T7核酸外切酶，可以同时加入。

根据本发明的实施例，利用该方法能够高效地制备测序样本，并且获得的测序文库能够有效地应用于高通量测序平台，进而能够有效地确定该文库样本的核酸序列信息。另外，发明人惊奇地发现，本发明的制备测序文库的方法，过程简单，极易操作，操作流程极易标准化，易于推广，并且费用低、灵敏度高、精确度高、可重复性好。

测序文库的获得

由上述建立测序文库的方法获得待测样本的文库。

测序方法

根据本发明的具体实施例，将待测文库样本在纳米孔测序平台进行上机测序。通过采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过。由于ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。

马达蛋白

马达蛋白(本发明实施例2中的解旋酶)是指分布于细胞内部或细胞表面的一类蛋白质，它负责细胞内的一部分物质或者整个细胞的宏观运动。

引物

在本文中所用的术语“引物”是能与模板互补配对，在DNA聚合酶的作用下能够合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸，甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。

iSpC3

iSpC3为一段3个烃基的碳链，常于寡核苷酸链中用作间隔器。

iSp18

iSp18为一种18原子长的六乙二醇链，常用于寡核苷酸链中用作间隔器。

下面将结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：制备Ad3接头序列

本实施例中，通过使化学合成的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2退火，制得Ad3接头序列。

1.将订购SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2引物序列(生工生物)，按照说明书将SEQ ID NO.1引物和SEQ ID NO.2引物用TE缓冲液(pH＝8)溶解成终浓度为100μM的储存液。随后分别取10μL储存液，加入40μL TE缓冲液(pH＝8)稀释为终浓度20μM的工作液。

5’-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTTTTTTTTTYYYYGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCT-3’(X＝iSpC3；Y＝iSp18；SEQ ID NO.1)

5’pho-GCAATATCAGCACCAACAGAAACAACCTTTGAGGCGAGCGGTCAA-3’(SEQ ID NO.2)

分别取上一步稀释得到的30μL SEQ ID NO.1引物的工作液和30μL SEQ ID NO.2引物的工作液混合在一起，并使用涡旋振荡仪充分震荡混匀，使用热循环仪加热至70℃孵育10分钟，随后按照0.1℃/s的降温速度降至25℃后继续孵育半小时，至此得到退火后的10μM的接头溶液，接头产物命名为Ad3，并置于-20度冰箱保存。

实施例2.解旋酶Dda的克隆、表达和纯化

本实施例通过在大肠杆菌中重组表达而制备解旋酶Dda(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，该解旋酶用作马达蛋白。

1.从生工生物订购全长Dda的cDNA全长序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，将其连接入PET.28a(+)质粒中，使用双酶切对载体进行切割，双酶切位点为Nde1和Xho1，表达出N端具有6×His标签和凝血酶(thrombin)酶切位点的Dda蛋白。

2.将克隆好的PET.28a(+)-Dda质粒转化入ArcticExpress(DE3)感受态细菌(Tolo Biotech,96183-02)或其衍生菌中。挑取单菌落，转入5mL含有卡那霉素的LB培养基中进行扩繁，37℃震荡培养过夜。然后转接入1L的LB(包含卡那霉素)中，37℃震荡培养至OD ₆₀₀为0.6-0.8,降温至16℃，加入终浓度500μM的IPTG诱导Dda表达过夜。

3.按照下述配方配制五种缓冲液：

缓冲液A:20mM Tris-HCl pH 7.5,250mM NaCl,20mM咪唑；

缓冲液B:20mM Tris-HCl pH 7.5,250mM NaCl,300mM咪唑；

缓冲液C:20mM Tris-HCl pH 7.5,50mM NaCl；

缓冲液D:20mM Tris-HCl pH 7.5,1000mM NaCl；

缓冲液E:20mM Tris-HCl pH 7.5,100mM NaCl。

4.收集步骤2中表达的Dda菌体，使用步骤3缓冲液A重悬菌体,用细胞破碎仪破碎菌体，然后离心取上清液。将上清液与事先用缓冲液A平衡好的Ni-NTA填料混合，结合1h。收集填料，用缓冲液A大量清洗填料，直至没有杂蛋白被洗出。然后在填料中加入缓冲液B洗脱Dda。将洗脱得到的Dda过缓冲液C平衡好的脱盐柱，进行缓冲液更换。然后加入适量凝血酶(thrombin)(翊圣生物,20402ES05)，然后将混合样品加入到缓冲液C平衡好的ssDNA纤维素(Sigma,D8273-10G)填料中，4℃酶切和结合过夜。收集ssDNA纤维素填料，用缓冲液C洗3-4次，然后用缓冲液D洗脱。将ssDNA纤维素纯化后的蛋白浓缩液通过分子筛Superdex 200(Sigma，GE28-9909-44)，所用分子筛缓冲液为缓冲液E。收集目的蛋白，浓缩，冻存。采用Nanodrop对纯化后的蛋白进行浓度定量。同时使用HPLC和SDS-PAGE电泳对蛋白进行纯度检测，结果如图5所示。

实施例3有外切酶步骤的测序文库构建：

本发明实施例完整流程如图3所示。选取测序方向为5’->3’。其中，构建测序文库的主要步骤包括：初始核酸分子片段化(可选)，末端修复加A，接头连接，核酸酶处理，锚定序列退火。

1.DNA打断(可选)

如果基因组起始投入量低于12μg，为提高上机测序时较高的文库捕获率，可以选择将DNA进行片段化。推荐使用Covaris g-TUBE(Covaris,520079)进行片段化打断，打断体系和步骤参考g-TUBE说明书。

2.末端修复加“A”

2.1在1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube(Eppendorf,0030108051)中，根据样本浓度计算总DNA为12μg需要加入的样本的体积，补Nuclease-Free water(Thermofisher,AM9932)将样本体积均一化为288μL。

2.2根据表1的比例，在离心管中配制检测所需量的末端修复加“A”反应混合液。此步需在冰上配制，将配制好的末端修复加“A”反应混合液涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

表1：末端修复加“A”反应混合液

组分	单个反应体积
FFPE DNA修复混合物(NEB,M6630LVIAL)	12μL
FFPE DNA修复缓冲液(E6622AAVIAL)	21μL
末端修复酶混合物(NEB,E6051AAVIAL)	18μL
末端修复反应缓冲液(NEB,E6052AAVIAL)	21μL
总体积	72μL

2.3用移液器吸取72μL配制好的末端修复反应加“A”混合液加入步骤2.1的DNA LoBind Microcentrifuge Tube(Eppendorf,0030108051)中，用扩口枪头轻柔吹打混匀，或用手轻弹管壁混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。

2.4用扩口吸头将360μL末端修复反应液分装至6个PCR管中，每管分装60μL，瞬时离心将反应液收集至管底。

2.5将2.4中PCR管置于PCR仪中，按照表2的条件进行反应。

表2：末端修复加“A”反应条件

温度	时间
热盖(105℃)	ON
20℃	10min
65℃	10min
4℃	Hold

2.6瞬时离心将反应液收集至管底，将6管末端修复加“A”后的样品合并转移到一个干净的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中。

3.末端修复加“A”产物纯化

3.1提前30min从4度冰箱中取出Ampure XP磁珠(Beckman Coulter,A63882)震荡混匀后置于室温，使用前再充分震荡混匀。

3.2吸取360μL磁珠加入到2.6的样品中，用手轻弹管壁混匀，或用扩口枪头轻柔吹打至少6次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入管中。

3.3在旋转混匀仪上室温孵育5min。

3.4将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架，静置2～5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清液并丢弃。

3.5保持DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)置于磁力架上，加入750μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30s后小心吸取上清液并丢弃。

3.6重复步骤3.5。将离心管从磁力架取下后瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底剩余液体吸干。

3.7保持DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)置于磁力架上，打开离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。

3.8将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)从磁力架上取下，加入392μL Nuclease-Free water(Thermofisher,AM9932)进行DNA洗脱，用手轻弹管壁混匀。瞬时离心3秒，将管内液体收集至管底。

3.9室温下孵育5min。

3.10将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架上，静置2～5min至液体澄清，将390μL上清液转移到新的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中。剩余样品可用于进行浓度测定，推荐使用Qubit-dsDNA HS Assay Kit(Thermofisher,Q32854)对纯化后的末端修复加“A”产物进行浓度测定。

4.接头连接

4.1将金属浴温度设置为25℃，进行预热。

4.2将接头(Ad3)和T4DNA连接酶(NEB,E6057AVIAL)从-20度冰箱中取出，轻弹管壁混匀后瞬时离心，置于冰上。将Quick Ligation Reaction Buffer(NEB,E6058AVIAL)解冻，吹打混匀后瞬时离心，之后放置于冰上。按照表3进行连接反应混合液配制。

表3：连接反应混合液

组分	单个反应体积
快速连接反应缓冲液(NEB,E6058AVIAL)	120μL
T4DNA连接酶(NEB,E6057AVIAL)	60μL
总体积	180μL

4.3向3.10中装有390μL纯化后的末端修复加“A”产物的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中加入30uL实施例1中植被的Ad3接头。用扩口吸头轻轻吹打混匀6次，瞬时离心将反应液收集在管底。

4.4用移液器缓慢吸取180μL配制好的接头连接反应混合液加入步骤4.3的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中，用扩口吸头轻轻吹打混匀6次，瞬时离心将反应液收集在管底。

4.5将步骤4.4中的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)置于4.1中25℃预热的金属浴中进行连接反应，计时器计时30min。

4.6反应结束后，将反应管瞬时离心，将反应液收集至管底。

5.连接产物纯化

5.1提前30min从4℃冰箱中取出Ampure XP磁珠(Beckman Coulter,A63882)震荡混匀后置于室温，使用前再充分震荡混匀。

5.2吸取240μL磁珠加入到4.6的样品中，用手轻弹管壁混匀，或用扩口枪头轻柔吹打至少6次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入管中。

5.3在旋转混匀仪上室温孵育5min。

5.4将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架，静置2～5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清液并丢弃。

5.5保持DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)置于磁力架上，加入900μL Wash buffer1(for short Fragment)或Wash buffer2(for long Fragment)，将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)从磁力架取下，轻弹管壁将磁珠混匀。混匀后重新放置回磁力架，静置2-5min，直至磁珠全部靠壁，小心吸取上清液并丢弃。

5.6重复步骤5.5。将离心管从磁力架取下后瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底剩余液体吸干。

5.7将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)从磁力架上取下，加入68μL洗脱缓冲液(Elution buffer)进行DNA洗脱，用手轻弹管壁混匀。瞬时离心3秒，将管内液体收集至管底。

5.8室温下孵育10min，当文库插入片段较长时改在37℃下孵育10min。

5.9将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架上，静置2～5min至液体澄清，将66μL上清液转移到新的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中。剩余样品可用于进行浓度测定，推荐使用Qubit-dsDNA HS Assay Kit(Thermofisher,Q32854)对纯化后的连接产物进行浓度测定。

6.酶消化

6.1将金属浴温度设置为37℃，进行预热。

6.2将T7 Exonuclease(T7核酸外切酶；NEB，M0263LVIAL)和NE Buffer ^TM 4(NEB,B7004SVIAL)从试剂盒中取出，涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心后放置于冰上。按照表4进行酶消化反应混合液配制。

表4：酶消化反应混合液

组分	单个反应体积
NE Buffer ^TM 4(NEB,B7004SVIAL)	7.5μL
T7 Exonuclease(NEB,M0263LVIAL)	1.5μL
总体积	9μL

6.3向5.9中装有66μL纯化后的连接产物的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube中加入9μL酶消化反应混合液，用扩口吸头轻轻吹打混匀6次，瞬时离心将反应液收集在管底。

6.4将步骤6.3中的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)置于6.1中37℃预热的金属浴中进行连接反应，计时器计时5min。

6.5反应结束后，将反应管瞬时离心，将反应液收集至管底。

7.酶消化产物纯化

7.1提前30min从4℃冰箱中取出Ampure XP磁珠(Beckman Coulter,A63882)震荡混匀后置于室温，使用前再充分震荡混匀。

7.2吸取75μL磁珠加入到6.5的样品中，用手轻弹管壁混匀，或用扩口枪头轻柔吹打至少6次至完全混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入管中。

7.3在旋转混匀仪上室温孵育5min。

7.4将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架，静置2～5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清液并丢弃。

7.5保持DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)置于磁力架上，加入200μL Wash buffer1(for short Fragment)，将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)从磁力架取下，轻弹管壁将磁珠混匀。混匀后重新放置回磁力架，静置2-5min，直至磁珠全部靠壁，小心吸取上清液并丢弃。

7.6重复步骤7.5。尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。

7.7将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)从磁力架上取下，加入62μL洗脱缓冲液(Elution buffer)进行DNA洗脱，用手轻弹管壁混匀。瞬时离心3秒，将管内液体收集至管底。

7.8室温下孵育10min，当文库过长时采用37℃条件孵育。

7.9将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架上，静置2～5min至液体澄清，将60μL上清液转移到新的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中。剩余样品可用于进行浓度测定，推荐使用Qubit-dsDNA HS Assay Kit(Thermofisher,Q32854)对纯化后的酶消化产物进行浓度测定。

7.10至此完成全部建库流程，产物可放置于4度冰箱保存72小时。

7.11使用一种质粒酶切产物作为质控品进行上述建库流程操作，酶切前后对比结果显示在连接后存在三种形式的分子，分别为未连接上接头的原始模板，连接了单端接头和连接了两端接头的文库。经过外切酶处理后，未连接接头和连接有单端接头的产物明显减少，并且随酶切时间增加，连接双端接头产物并未出现明显减少，表明该步酶处理可以有效富集目标双端接头连接产物(图6)。

实施例4无外切酶步骤的测序文库构建

本发明实施例完整流程如图2所示。

1.DNA打断(可选)

2.末端修复加“A”

89122.1在1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube(Eppendorf,0030108051)中，根据样本浓度计算总DNA为12μg需要加入的样本的体积，补Nuclease-Free water(Thermofisher,AM9932)将样本体积均一化为288μL。

2.2根据表5的比例，在离心管中配制检测所需量的末端修复加“A”反应混合液。此步骤需在冰上配制，将配制好的末端修复加“A”反应混合液涡旋震荡3次，每次3s，瞬时离心将反应液收集至管底。

表5：末端修复加“A”反应混合液

2.5将2.4中PCR管置于PCR仪中，按照表6的条件进行反应。

表6：末端修复加“A”反应条件

温度	时间
热盖(105℃)	ON
20℃	10min
65℃	10min
4℃	Hold

3.末端修复加“A”产物纯化

3.3在旋转混匀仪上室温孵育5min。

3.6重复步骤3.5。将离心管从磁力架取下后瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将离心管底部剩余液体吸干。

3.9室温下孵育5min。

4.接头连接

4.1将金属浴设置为25℃，进行预热。

4.2将接头(Ad3)和T4DNA连接酶(NEB,E6057AVIAL)从-20度冰箱中取出，轻弹管壁混匀后瞬时离心，置于冰上。将Quick Ligation Reaction Buffer(NEB,E6058AVIAL)解冻，吹打混匀后瞬时离心，之后放置于冰上。按照表7进行连接反应混合液配制。

表7：连接反应混合液

4.3向3.10中装有390μL纯化后的末端修复加“A”产物的1.5mL DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)中加入30uL实施例1中制备的Ad3接头。用扩口吸头轻轻吹打混匀6次，瞬时离心将反应液收集在管底。

4.6反应结束后，将反应管瞬时离心，将反应液收集至管底。

5.连接产物纯化

5.1提前30min从4度冰箱中取出Ampure XP磁珠(Beckman Coulter,A63882)震荡混匀后置于室温，使用前再充分震荡混匀。

5.3在旋转混匀仪上室温孵育5min。

5.4将DNA LoBind Microcentrifuge Tube管(Eppendorf,0030108051)瞬时离心后置于磁力架，静置2～5min至液体澄清，用移液器小心吸取上清并丢弃。

实施例5：测序文库制备

本实施例将实施例3和实施例4中得到的测序文库分别与实施例2中制备的解旋酶Dda 蛋白进行孵育，制备得到最终用于测序上机的文库。

1.向容量瓶中100mL 1M Tris-HCL PH 7.5缓冲液及100mL 1M KCl溶液，加入超纯水定容至1L，配制成2X结合缓冲液。

2.按照下表8在冰上配制解旋酶Dda(由实施例2制备)及文库的混合溶液，随后30℃孵育一小时。

表8：马达蛋白与文库结合体系

试剂	体积
2x结合缓冲液	50μL
解旋酶Dda	20μL
纯化后连接产物	20μL
水	10μL

3.使用Qubit DNA HS试剂盒对文库进行定量，标记清楚浓度后，将产物置于4℃冰箱保存备用。

实施列6：纳米孔测序

本实施例基于膜片钳平台的纳米孔检测平台，对实施例6制备的目标测序文库进行纳米孔测序，以验证本申请的所构建的测序文库在纳米孔测序中的优点，即可被测序分子数的增加。

1.参考耿佳,郭培宣(“噬菌体phi29DNA包装马达磷脂膜嵌合体在单分子检测及纳米医学领域的应用”.生命科学,2011,23(11):1114-1129)中的单通道电生理检测系统，搭建基于膜片钳平台的纳米孔检测平台，将孔蛋白(Sigma-Aldrich,H9395-5mg)插入磷脂双分子层膜上，形成单通道纳米孔。

2.将实施例5中获得的测序文库加入到该单通道体系中，通过膜片钳体系检测并记录电流振幅变化。

3.对实施例3和实施例4文库测序单位时间内有如图7所示电流变化，可以看出，在单位时间内，使用酶切处理后的文库测序序列明显变多，游离接头序列信号减少，静息电位所占时间变少，测序通量明显提升。

4.通过对接头信号的判别算法检测测序文库读取序列和游离接头序列的多少，原始文库与酶切文库游离接头占比对比结果显示，经过酶切后，被测得的游离接头占比从原始文库的41.46％下降至8.82％，同时文库分子占比从原始的58.54％提升至91.18％(图8)。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

一种建立测序文库的方法，其特征在于，包括：

对连接有接头的待测样本在核酸外切酶的作用下消化处理，以便获得所述测序文库。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对消化处理产物进行解旋处理；

任选地，所述解旋处理是在解旋酶的作用下进行的。
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述解旋酶沿DNA的移动方向为5’端至3’端，所述核酸外切酶为5’->3’核酸外切酶；

任选地，所述5’->3’核酸外切酶识别双链DNA，所述核酸外切酶包括选自T7 exonuclease，Lambda exonuclease，T5 Exonuclease，Exonuclease VI，Exonuclease VIII(truncated)中的至少之一；

优选地，所述核酸外切酶为T7 exonuclease。
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述解旋酶沿DNA的移动方向为3’端至5’端，所述核酸外切酶为3’->5’核酸外切酶；

任选地，所述3’->5’核酸外切酶识别双链DNA，所述核酸外切酶包括选自Exonuclease III，Exonuclease IX，Exonuclease X中的至少之一。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸外切酶识别单链DNA。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对连接有接头的待测样本的5’端和/或3’端进行防降解修饰处理；

任选地，所述防降解修饰包括选自磷酸修饰，2’-OH修饰(RNA碱基)，2’-F修饰，LNA锁核苷酸修饰和PNA肽核酸修饰的至少之一。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化处理是在37℃，连接产物与T7核酸外切酶比例为44：1条件下进行4～6min。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头为Y型接头或非Y型接头；

任选地，所述非Y型接头具有如下结构的至少之一：

完整互补双链，互补双链-不互补单链-互补双链，5’突出单链-互补双链，3’突出单链-互补双链。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括对消化处理产物进行纯化处理；任选地，所述纯化处理采用Ampure XP磁珠纯化。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连接有接头的待测样本是通过如下方式获得的：

将待测样本进行末端修复和加A处理；

将加A处理产物进行接头连接处理，以便获得所述连接有接头的待测样本；

任选地，所述末端修复和加A处理之后和连接处理之前，进一步包括对加A处理产物进行第一纯化处理；

任选地，连接处理之后，进一步包括对连接处理产物进行第二纯化处理。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本为DNA样本。
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将待测样本进行末端修复和加A处理之前，进一步包括将待测样本进行片段化处理。
一种测序文库，其特征在于，所述测序文库是通过权利要求1～12任一项所述的方法获得的。
一种测序方法，其特征在于，包括：对权利要求13所述的测序文库进行测序处理，以便获得待测样本的序列；

任选地，所述测序是在纳米孔测序平台上进行的。
一种用于构建测序文库的试剂盒，其特征在于，包括：试剂，所述试剂包括核酸外切酶，用于对连接有接头的待测样本消化处理；

任选地，进一步包括第一试剂，所述第一试剂适于将待测样本进行片段化处理；

任选地，进一步包括第二试剂，所述第二试剂适于对将待测样本进行末端修复和加A处理；

任选地，进一步包括第三试剂，所述第三试剂适于将待测样本进行接头连接处理。
根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括接头，所述接头携带5’末端磷酸基团。
根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸外切酶包括T7 exonuclease，Lambda exonuclease，T5 Exonuclease，Exonuclease VI，Exonuclease VIII(truncated)，Exonuclease III，Exonuclease IX，Exonuclease X中的至少之一。