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CN1198187A - DszD在红球菌IGTS8为DBT脱硫中的应用 - Google Patents

DszD在红球菌IGTS8为DBT脱硫中的应用 Download PDF

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CN1198187A
CN1198187A CN95197963A CN95197963A CN1198187A CN 1198187 A CN1198187 A CN 1198187A CN 95197963 A CN95197963 A CN 95197963A CN 95197963 A CN95197963 A CN 95197963A CN 1198187 A CN1198187 A CN 1198187A
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dna
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科文·A·格雷
查尔斯·H·司夸尔斯
丹尼尔·J·蒙蒂卡罗
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Energy Biosystems Corp
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Abstract

本发明涉及在生物催化剂中添加氧化还原酶能增加矿物燃料脱硫反应速度这一新发现。该发明可归结为一种提高含有机硫化物的矿物燃料的脱硫速度的方法,该方法包括下述步骤:(a)使矿物燃料与水相接触,其中水相包含能使碳－硫键断裂的生物催化剂和增速剂量的氧化还原酶,借此形成矿物燃料与水相的混合物;(b)使步骤(a)形成的混合物保持在生物催化剂足以使有机硫分子中碳硫键断裂的条件下,借此获得有机硫含量较低的矿物燃料;(c)将有机硫含量较低的矿物燃料从最后的水相当中分离出来。该发明还涉及包含一种或多种重组DNA分子的突变微生物,其中重组DNA分子将给用于包含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂和氧化还原酶编码。该发明进一步涉及一种组合物,该组合物包括(a)能使包含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂和(b)氧化还原酶。

Description

DszD在红球菌IGTS8为DBT脱硫中的应用
本发明的背景技术
矿物燃料的生物脱硫技术已经被研究了半个多世纪。这些研究工作的目标一直是开发以生物技术为基础的在燃烧之前从矿物燃料，如煤、原油、和石油级份中除硫的方法。开发脱硫方法的动力是由于矿物燃料中硫含量越来越大，而且限制排放硫的规定也越来越严格。参阅Monticello等人的“Practical Consideration in Biodesulfurization ofPetroleum”(IGT’s 3d Intl.Symp.on Gas，Oil，Coal and Env.Biotech.，(Dec.3-5，1990)New Orleans，LA.)。
为了给矿物燃料脱硫，已经研制了许多生物催化剂和方法，包括在美国专利第5,356,801，5,358,870，5,358,813，5,198,341，5,132,219，5,344,778，5,104,801，和5,002,888中介绍的那些催化剂和方法，在此通过引述将它们的内容并入本文。经济分析指出，限制这些技术商品化的原因之一是需要提高反应速度和生物催化剂的特异活性，如涉及脱硫反应的细菌和酶的特异活性。在文献中已经报告的反应速度和特异活性(每克生物催化剂每小时除去的硫)比在最佳工业技术中需要的速度和活性要低得多。所以，需要提高生物催化剂的寿命和特异活性。
本发明概述
本发明有关于最近发现的从红球菌IGTS8中提纯的一类蛋白质能使与矿物燃料脱硫有关的两种单氧合酶(DszC和DszA)活化。无论是DszC还是DszA在被提纯到均质程度时都失去了酶活性，但是，在添加了这种补充的蛋白质(在此称之为DszD)时，酶的活性得以恢复。这种蛋白质的作用被认为是将NADH的氧化作用与底物分子的氧合作用结合起来。搜寻序列数据库发现DszD与另一种最新识别的红球菌属蛋白质，即ThcE是等价的，这种蛋白质是在有莠去津(农药)、硫代氨基甲酸酯除草剂和伯醇存在时诱发的。根据序列相似性，ThcE似乎是III族醇脱氢酶的一员，即氧化还原酶，特指与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的醇氧化还原酶。DszD单体的分子量近似为50,000(以SDS-PAGE测定)，但是，按高压液相色谱的尺寸筛析色谱法(HPLCsize exclusion chromatography)其行为象多倍体蛋白质(十倍体)。DszD对DszC和DszA的活化作用遵循饱和动力学。
因此，本发明与由于在生物催化剂或反应介质中添加氧化还原酶而加快矿物燃料的微生物脱硫速度这一发现有关。本发明被归结成一种提高含有机硫化物的矿物燃料脱硫速度的方法，该方法包括下述步骤：
(a)使矿物燃料接触包含能使碳-硫键断裂的生物催化剂(如DszA、DszB和/或DszC)和增速剂量的氧化还原酶的水相，借此形成矿物燃料与水相的混合物；
(b)使步骤(a)形成的混合物保持在借助生物催化剂足以使有机硫分子中碳硫键断裂的条件下，借此获得有机硫含量降低的矿物燃料；
(c)将降低了有机硫含量的矿物燃料从所得到的水相当中分离出来。
本发明还涉及用增速剂量的氧化还原酶提高由DszA和/或DszC催化的反应速度。例如，这可以借助向生物催化剂中添加氧化还原酶或借助在生物催化剂中造成氧化还原酶的表达或过度表达来实现。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种重组微生物，该微生物包含一种或多种重组DNA分子，这些重组DNA分子将给生物催化剂和氧化还原酶编码，其中所述生物催化剂能够在含有机硫分子的矿物燃料脱硫工艺中催化一个或多个步骤。
本发明还涉及一种组合物，该组合物包括：(a)在包含有机硫分子的矿物燃料脱硫工艺中能催化一个或多个步骤的生物催化剂，和(b)氧化还原酶。
附图的简要说明
图1是在离子交换色谱分级后DszC和DszA活性的图示说明。将DszC(15μg)添加到每个级份中，并检验从DBT到DBTO和DBTO2的转换。将DszA(5μg)添加到每个级份中，并检验从DBT磺酸内酯到BHBP的转换。还检验了内源的DszC的活性。
图2是在Superdex 75尺寸筛析色谱分级后DszC活性的图示说明。将DszC(15μg)添加到每个级份中，并检验从DBT到DBTO2的转换。在Superdex 75尺寸筛析色谱之后DszA的活性。将DszA(5μg)添加到每个级份中，并检验从DBT磺酸内酯到BHBP的转换。
图3是说明DszD纯化过程的SDS-PAGE(14％的丙烯酰胺)的电泳凝胶图。带1给出分子量标准(Biorad，200，116，97.4，66，45，31，21.5，和14.5kDa)；带2是粗细胞溶胞物；带3是Q-琼脂糖处理之后；带4是Toyopearl-DEAE处理之后；带5是MonoQ处理之后；带6是Superdex 75处理之后。
图4说明伴随着DszD添加剂量递增DszC活性的变化。用剂量递增的DszD滴定剂量固定(0.33nmol)的DszC。
图5说明伴随着DszD添加剂量递增DszA活性的变化。用剂量递增的DszD滴定剂量固定(0.16nmol)的DszA。
图6表示ThcE(DszD)基因的DNA序列和假定的氨基酸顺序。
本发明的详细描述
在石油的提炼和精炼技术中，术语“有机硫”通常被理解为有一个或多个硫原子(被称为杂原子)通过共价键连接在碳氢骨架上的有机分子。这些硫原子可以直接连到碳氢骨架上(例如通过一个或多个碳-硫键)，也可以以取代基(例如硫酸酯基)的形式连接在分子的碳氢骨架上。这类具有一个或多个硫杂原子的有机分子通常被统称为“有机硫化物”。这些化合物的碳氢部分可以是脂族的、芳族的，或者一部分是脂族的，另一部分是芳族的。
有一个或多个硫原子借助碳-硫原子键直接或间接连接到碳氢骨架中毗邻的碳原子上，这样的环状或稠合多环有机硫化物被统称为“含硫杂环”。鉴于含硫杂原子的五元芳环，将存在于许多类型含硫杂环中的硫统称为“噻吩硫”。噻吩是最简单的含硫杂环，它的组成是C4H4S。
已知含硫杂环对于常规脱硫处理，如加氢脱硫过程(HDS)是稳定的。含硫杂环可以有比较简单的化学结构，也可以有比较复杂的化学结构。在复杂的杂环中，在多稠合芳环中，其中的一个或多个环可以是杂环。随着分子结构复杂性的增加，脱硫的难度也增大。这就是说，在复杂的含硫杂环(如硫芴，DBT，C12H8S)中难处理的特性(refractory behaviors)最为明显。
DBT是含硫杂环，它具有多重芳环的稠合结构，在该结构中两个六元苄环在一个五元噻吩环的两侧。在加氢脱硫后残留在矿物燃料的精炼中间产品和可燃产物中的大部分有机硫是噻吩硫。这种残留的噻吩硫作为DBT及其衍生物存在，而且有一个或多个烷基或酰基接在一侧或两侧苄环的一个或多个碳原子上。在相关技术中，人们将DBT本身作为模型化合物，以说明那类包括DBT及其衍生物的化合物在涉及噻吩硫的反应中的行为。参阅Monticello和Finnerty的文章，AnnualReviews in Microbiology，vol.39：pp371-389(1985)，位于pp372-373。DBT及其衍生物能够解释具体的原油、煤和沥青中总硫含量的显著百分比。例如，已经有报道认为，这些含硫杂环占据了西得克萨斯原油总硫含量中的高达70wt％，在中东原油总硫含量中占据了40wt％。因此，DBT作为模型化合物被认为是与在矿物燃料，例如特殊地理位置的原油、煤或沥青，各种精炼的中间产品以及由它们制成的燃料产品等中发现的各种形式的噻吩硫非常相关的(同上)。DBT及其衍生物的另一个特征是在释放到环境中之后将长期存在，没有显著的生物降解。参阅Gundlach等人的文章，发表在Science，vol.221，pp122-129(1983)上。所以，从矿物燃料或其他的含有机硫化物的含碳物质中除去这些有机硫化物是符合需要的。
适合按照本发明进行脱硫处理的矿物燃料或含碳物质是包含有机硫的矿物燃料或含碳物质。这种矿物燃料被称为“基质矿物燃料”。包含丰富的噻吩硫的基质矿物燃料，特别适合按照这里介绍的方法脱硫。这种基质矿物燃料的实例包括产于Cerro Negro或Orinoco的重原油、产于Athabascan的焦油和其它类型的沥青；石油的精炼级份，如轻循环油、自然通风燃烧的重柴油、一号柴油；以及在原产地(如Pocahontas #3、Lewis-Stock、Australian Glencoe或Wyodak coal)用煤制造的液体。
生物催化脱硫(BDS)是借助生物催化剂在有机硫化物中(最好是有选择地)造成碳-硫键氧化断裂，从有机硫化物，包括难处理的有机硫化物，如含硫杂环中切除、释放或除去硫。BDS处理从上述难处理有机硫化物中得到的是脱硫的碳氢骨架以及无机硫物质，这两部分物质很容易借助已知技术(如分馏或水萃取)彼此分开。例如，在经受BDS处理时DBT“转变成”羟基联苯。
BDS是借助生物催化剂实施的。生物催化剂包括一种或多种非人体生物(例如重组的和未重组的、存活的和非存活的微生物)，它们从功能上表达一种或多种酶，并单独地或彼此合作控制除硫过程，借助所述化合物中的硫的氧化和(或)碳-硫键断裂从有机硫化物(包括含硫杂环)中除硫；从这些生物获得的一种或多种酶；或是这些生物和酶的混合物。在矿物燃料或其它含碳物质脱硫过程中呈现一种或多种需要的生物催化活性的生物在这里被称为Dsz+。缺乏这种活性的生物在这里被称为Dsz-。“生物催化剂”在这里被定义为在有适当的协同因子和(或)协同酶存在时将拥有催化一种或多种反应能力的生物或来源于该生物的物质。
本发明涉及从含有机硫分子的含碳材料如矿物燃料中脱硫的改进方法，该方法包括将增速剂量的氧化还原酶添加到能使含碳材料脱硫的生物催化剂中。
在这里使用的生物催化剂通常在技术上是已知的。几位研究者已经报告了天然细菌经遗传基因诱发变异变成能使DBT降解代谢的突变种系。参阅Kilbane，J.J.的文章，Resour.Cons.Recycl.，Vol.3，pp69-79，(1990)、授权给Isbister，J.D.和R.C.Doyle的美国专利第4,562,156号(1985)、以及Hartdegan，F.J.等人的文章，Chem.Eng.Progress，pp 63-67(1984)。在这些突变种中许多品种在使DBT脱硫方面并无特异性。因此，借助这种微生物脱硫将损失一部分燃料热值。Isbister和Doyle报告了一种假单胞菌属的变异种系似乎能有选择地使DBT脱硫。
Kilbane报告了对混合细菌培养物进行化学诱变，借此生产能有选择地借助氧化途径使DBT脱硫的细菌。这种培养物由细菌组成，这些细菌可以从天然资源中获得，例如从污泥、炼油厂的废水、栽培土壤、煤、焦油污染的土壤等资源中获取，并且能在DBT连续脱硫的条件下保持在培养物中。然后，将这种培养物暴露在化学诱变剂1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍之下。借助这种突变种系培养物，DBT代谢的主要降解产物是羟基联苯，硫作为水溶性无机硫酸盐被释放出来，分子中的碳氢部分基本上作为单羟基联苯完整地被保留下来。参阅Kilbane，J.J.的文章，Resour.Cons.Recycl.，Vol.3，pp69-79(1990)，在此通过引述将其并入本文。
Kilbane还从这种混合细菌培养物中分离出红球菌属的变异种系。这个变异种系，即IGTS8或ATCC No.53968是本发明优先选用的生物催化剂。Kilbane，J.J.在美国专利第5,104,801号中详细地介绍了这种变异种系的分离与特征，在此通过引述将其并入本文。这种微生物已经存放在American Type Culture Collection(ATCC)，12301 Park LawnDrive，Rockville，Maryland，U.S A.20852，under the terms of the BudapestTreaty，并且指定的存放号为ATCC Deposit No.53968。一种适当的ATCC No.53968生物催化剂制剂是按美国专利第5,104,801号介绍的方法制备的一种活微生物和这些微生物的变异种系或衍生物(例如参照美国专利第5,358,869号)的培养物。在美国专利第5,132,219、5,344,778和5,358,870号中介绍的从ATCC No.53968获得的不含细胞的酶制剂或其变异种系也可以被使用。这些酶制剂可以被进一步纯化并使用。
其他的以相同或相似的方式工作的微生物实例包括在Resour.Conserv.Recycl.，Vol.3，pp69-79中Kilbane介绍的微生物集团(几种微生物的混合物)、Kilbane在美国专利第5,002,888(1991年3月26日授权)、5,104,801(1992年4月14日授权)、5,344,778、5,132,219、5,198,341、5,344,778、5,356,813、5,356,801、5,358,869、5,358,870(Kilbane在题为“Biodesulfurization”的文章中也有介绍，见Proc.7th Ann.Int’l.Pittsburgh Caol Conf pp373-382)、以及5,198,341号(1993年3月30日授权)中揭示的微生物、Omori等人在“Desulfurization of dibenzothiophene by Corynebacterium sp.strain SY1”中揭示的微生物(参阅58 Appl.Env.Microbiol.，No.3，pp911-915)、以及Izumi等人揭示的微生物(参阅Applied andEnvironmental Microbiology，vol.60，pp223-226(1994)，这些技术全部在此通过引述并入本文。
上述的每种微生物都能在本发明中起生物催化剂的作用，因为每种微生物都产生一种或多种参与特定化学反应的酶(蛋白质生物催化剂)，借此从难处理的有机硫化物中将硫去除。上述美国专利列举的任何一种微生物的突变衍生物或基因工程衍生物只要能保持适当的生物催化功能也都可以作为生物催化剂使用。
在现在介绍的脱硫方法中适合用作生物催化剂或生物催化剂来源的其它微生物可以借助已知技术从天然微生物中获取。如上所述，这些方法包括将从天然来源，例如从包括污泥、炼油厂的废水、栽培土壤、煤、焦油污染的土壤等天然资源中获取的微生物制剂，在以难处理的有机硫化物如含硫杂环作为硫的唯一来源的选择性生长条件下进行培养；将微生物制剂暴露在化学或物理诱变物；或者使用这些方法的组合。Isbister和Doyle在美国专利第4,562,156号(1985年12月31日授权)中，Kilbane在Resour.Conserv.Recycl.，Vol.3，pp69-79(1990)和美国专利第5,002,888、5,104,801和5,198,341号中，以及Omori及其合作者在58 Appl.Env.Microbiol.，No.3，pp 911-915(1992)中都详细地列举了这些技术，在此将这些技术通过引述并入本文。
正象前面解释的那样，酶是能够由活细胞制造的蛋白质生物催化剂或酞生物催化剂。酶直接或间接地促进发生特定的化学反应或一系列化学反应(称之为路径)，而其本身在这些反应中不被消耗。酶可以包括一种或多种未经修饰的、或转译后、或在合成后被修饰的多肽链、片段或部分链段，它们在有适当的辅助的协同酶、协同因子或协同反应物存在时都催化需要的反应或反应系列。与本发明实施方案有关的反应或反应系列以从难处理的有机硫化物(如含硫杂环)的碳氢骨架上切除硫作为反应终点。从前为难处理的有机硫化物的碳氢骨架基本保持完整。在本发明中作为生物催化剂使用的微生物或酶，优选在生长时不消耗上述难处理的有机硫化物中的碳氢骨架作为碳的来源。因此，基质矿物燃料的燃料热值不下降。
虽然活的微生物(如培养物)可以作为生物催化剂使用，但是这不是必需的。在本发明中有用的生物催化酶制剂包括借助常规方法获得的并能实现生物催化功能的微生物的溶菌产物、提取物、级份(fraction)、子级份(subfraction)或纯化产物。一般地说，这些酶制剂基本上没有完整的微生物细胞。Kilbane和Monticello在美国专利第5,132,219(1992年7月21日授权)和5,358,870号(1992年7月11日提交)等美国专利中揭示了一些适合在这里使用的酶制剂。Rambosek等人在美国专利第5,356,813号中揭示了一些重组微生物和酶制剂，它们是依据红球菌属醑剂ATCC No.53968设计的并适合在这里使用。在特别优选的实施方案中，生物催化剂在重组的宿主细胞中被过分表达(overexpressed)，如包含一个以上基因或基因组拷贝的宿主细胞。例如，借助红球菌IGTS8给硫芴脱硫已经表明至少涉及三种酶(指定为DszA、DszB和DszC)，其中DszA和DszC现在被当作是一氧合酶。这样，在特别优选的实施方案中生物催化剂包括一种或多种酶，DszA、DszB和/或DszC。
适合在此使用的酶生物催化剂制剂可以被或不被附着在固体载体上，如膜、滤膜、聚合物树脂、玻璃颗粒或玻璃珠、陶瓷颗粒或陶瓷珠。使用固定的酶制剂有利于生物催化剂与反应介质分离，例如，有利于将经过处理已经除去了难处理的有机硫化物的矿物燃料分离出来。
生物催化剂的特异活性是单位质量(生物催化剂)的生物催化活性的度量。因此，具体的生物催化剂的特异活性取决于所用的微生物或用作生物催化酶来源的微生物的性质和种类，以及该生物催化剂制剂的制备和/或储存方法。具体的生物催化剂制剂的浓度可以按具体使用环境的需要进行调整。例如，在活微生物(如ATCC No.53968)的培养物被用作生物催化剂制剂的场合，可以将适当的缺乏除含硫杂环外的硫的来源的培养介质与适当的微生物搀和，然后发酵，直至达到需要的培养物密度为止。所得到的培养物可以用补充介质或另一种适当的缓冲介质稀释，或着借助离心之类方法回收存在于培养物中的微生物细胞，然后以比原来培养物更高的浓度重新悬浮。微生物和酶生物催化剂的浓度可以作类似的调整。用这种方式，可以获得适当体积的具有预定的特异活性和/或浓度的生物催化剂制剂。
如上所述，已经从红球菌IGTS8提纯出来了一种蛋白质(定名为DszD)，它在生物脱硫路径中使两种单氧合酶(DszC和DszA)活化并提高它们的活性。这种蛋白质的功能被认为是将NADH的氧化作用与借助DszC和DszA作用的底物分子的氧合作用结合起来。搜寻序列数据库发现DszD与另一种最近分离出来的红球菌属蛋白质即ThcE是等价的，有报告说后者是在有莠去津(农药)、硫代氨基甲酸酯除草剂和伯醇存在时诱发产生的。ThcE是III族醇脱氢酶的一员，或氧化还原酶，特指与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的醇氧化还原酶，并且Nagy等人在Arch.Microbiol.vol.163，pp 439-446(1995)中已经做过介绍，在此通过引述将其并入本文。DszD单体分子量近似为50,000(按SDS-PAGE)，但是，在高压液相色谱的尺寸筛析色谱(HPLC sizeexclusion chromatography)上其行为象多倍体蛋白质(十倍体)。DszD对DszC和DszA的活化作用遵循饱和动力学。
依据上述发现，DBT的脱硫可以借助添加氧化还原酶得到增强。适当的氧化还原酶包括单氧合酶的还原酶、或醇氧化还原酶，如与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺(NDMA)有关的醇氧化还原酶(MNO)。已有报告说，III族醇脱氢酶或氧化还原酶使伯醇氧化并使电子受体(如非生理化合物NDMA)还原。它们通常包含有牢固的但不是共价键连接的NAD+的分子，它在醇和电子受体(如NDMA)之间充当电子转移的媒体。在这里定义的术语“氧化还原酶”包括拥有增强和/或激活DszC和/或DszA活性能力的内生酶或野生酶(endogenous orwild-type enzymes)、重组产生的酶、融合蛋白质(fusion proteins)、活性片段、突变种系或它们的组合。突变种系包括等位基因变异体、氨基酸或位点定向(site-directed)的突变体或衍生物(例如用重组DNA技术制备的那些产物)。另一种制造突变种系的方法是对宿主微生物采用其它的物理或化学的诱变技术。优选从红球菌属或红球菌源，如IGTS8或红球菌N186/21中分离酶。其它的优选方案包括重组氧化还原酶，其中氧化还原酶的氨基酸顺序相对这些酶的氨基酸顺序是高度同源的(例如，至少大约90％)。另外，同源的氧化还原酶，如从Amycolatopsis methanolics和Mycobacterium gastri中分离出来的氧化还原酶就可以被使用。
如上所述，能够在这里使用的氧化还原酶包括那些本领域已知的并能在自然界找到后就能直接使用的氧化还原酶(例如包含蛋白质或酶的微生物级份)、从市场上获得的或能通过重组制造的氧化还原酶。例如，DszD的DNA和氨基酸顺序已经由Nagy等人在ArchMicrobiology，vol.163，pp439-446(1995)中做过阐述(在图6中有图示说明)并能够用于改造适当的宿主微生物，例如本领域已知的并在美国专利第5,356,801号中讨论过的那些宿主微生物。DNA序列能够采用已知的技术如PCR从适当的红球菌中分离出来。
在另一个实施方案中，氧化还原酶可以借助脱硫微生物(如IGTS8)过分表达。例如可以借助诱变实现这个目的。适当的诱变剂包括辐射，如紫外辐射，和化学诱变，如N-甲基-N’-亚硝基胍、羟胺、乙基甲磺酸和亚硝酸。诱变以及找出具有增加了的酶活性的突变种的后续筛选可以按照本领域已知的方法进行。
当氧化还原酶是重组体时，蛋白质能被合成并优选就地形成过度表达(overexpress)，例如借助添加包含一份或多份给氧化还原酶编码的DNA顺序的拷贝的重组体微生物。在特别优先的实施方案中，给氧化还原酶编码的重组体微生物还拥有一种或多种能够在矿物燃料的生物脱硫中催化一个或多个反应的酶，特别是DszA和/或DszC。例如在适当的启动子的支配下，给氧化还原酶编码的DNA可以被转染到IGTS8或另一种能使矿物燃料脱硫的微生物中。在另一个实施例中，给氧化还原酶编码的DNA可以被同时(例如存在于同一质粒或载体中)或独立地转染到具有给脱硫生物催化剂制剂或酶编码的DNA的共同宿主细胞中。例如，在受相同或不同的启动子的支配下，给氧化还原酶编码DNA可以是给用于矿物燃料脱硫的生物催化剂编码的DNA。在一个实施方案中氧化还原酶的DNA被整合或连接IGTS8的脱硫基因团或操纵子中。
将氧化还原酶按增速剂量添加到反应混合物当中。在此定义的“增速剂量”是与原来获得的速度相比能够大幅度增加生物催化剂的反应速度(包括使生物催化剂活化)的剂量。例如，当生物催化剂是IGTS8、一种不含细胞的级份或其经纯化的酶制剂时，氧化还原酶的增速剂量是除了在获得生物催化剂时在生物催化剂中固有的氧化还原酶剂量外还包括大幅度增加脱硫速度所需的氧化还原酶剂量。例如，与单独使用生物催化剂本身相比，脱硫速度可以至少增加25％、50％或者100％。在一个实施方案中，氧化还原酶以达到或接近饱和动力学域值的剂量添加到反应介质中。
带有给DszD编码的DNA序列的微生物能够在使基因表达为最大的条件下生长。例如，包含该基因的红球菌能够在有醇(如乙醇、乙醇胺、丙三醇或丙醇)、醛(如丙醛)、硫代氨基甲酸酯(或盐)或莠去津存在的条件下生长。这些化合物可以诱导或增加微生物中的基因表达。
综上所述，本发明一方面涉及包含一种或多种给能够使含有机硫化物的矿物燃料脱硫的氧化还原酶和/或生物催化剂编码的基因的DNA分子或其片段。这些DNA分子或其片段可以是经过纯化或分离的天然来源的DNA，也可以是(异种的或外来的)重组体DNA，例如存在于非人类的宿主生物中的DNA。DNA可以借助已知技术如PCR分离出来，以便依据图6给出的核苷酸顺序设计寡核苷酸引物。
本发明的重组体DNA分子包括借助化学或生物手段将一种或多种给能够有选择地切断碳-硫键的生物催化剂和氧化还原酶编码的基因插入到DNA链中后所得到的DNA，其中所述基因不是原来就存在于那个DNA链中的基因。重组体DNA包括任何利用限制性核酸酶、核酸杂化、DNA无性繁殖、DNA合成等方法或借助所述方法的组合而合成的DNA。构建方法可以在Maniatis等人的著作中以及其它本领域技术人员熟知的其它方法中找到。
构建本发明的DNA质粒合载体的方法包括在Maniatis等人介绍的那些方法和本领域技术人员熟知的其它方法。术语“DNA质粒”和“载体”包括任何有复制能力的质粒和载体，它们能够具有借助化学或生物手段插入的外来的或异源的DNA，并且随后在变成适当的非人类宿主生物时，能够表达外来的或异源的DNA插入的产物(例如，能够表示本发明的生物催化剂和氧化还原酶)。此外，这些质粒和载体必须能够接受包含本发明的基因(或基因组)的DNA分子或其片段的插入，其中所述基因(或基因组)给生物催化剂编码。构建DNA质粒和载体的方法包括Maniatis等人介绍的那些方法和本领域技术人员所熟知的其它方法。
本发明的质粒包括任何包含给氧化还原酶和/或生物催化剂编码的基因(或基因组)的DNA片段。术语“质粒”包括任何能够借助转染或结合转移到宿主微生物上去DNA片段。构建和提取DNA质粒的方法包括Maniatis等人介绍的那些方法和本领域技术人员所熟知的其它方法。
本发明的重组非人类宿主生物可以由本领域的技术人员借助各种方法建立。例如，可以使用Maniatis等人说明的电穿孔方法。术语“非人类宿主生物”包括任何能够摄取和表达外来的DNA、异源的DNA或重组体DNA的非人类的生物体。宿主生物优选采用细菌，更优选选用假单胞菌(Pseudonomad)。
在生物催化脱硫阶段，包含有含硫杂环的含碳物质或矿物燃料与生物催化剂和氧化还原酶混合。生物催化剂、氧化还原酶以及含碳物质(如矿物燃料)的相对剂量可以调整，以适应具体的生产条件或满足脱硫处理后对物质中残留的硫含量的具体要求。在给定数量的底物中加入的生物催化剂制剂的数量将取决于具体的生物催化剂和氧化还原酶的性质、浓度和特异活性，以及在底物中存在的无机硫化物和有机硫化物的性质和相对丰度和所要达到的脱硫程度。
依据本发明的矿物燃料脱硫方法涉及两个方面。第一，宿主生物或由它获得的生物催化制剂和氧化还原酶与待脱硫的矿物燃料接触。这可以在具有或不具有搅拌设备或混合设备的任何适宜的容器中完成。混合物彻底混合并保育足够长的时间，以便允许切断有机硫化物中大量的碳-硫键，借此生产脱硫的矿物燃料。在一个实施方案中，用含有生物或酶成分和矿物燃料的水性培养物生产一种水乳液或微滴乳液，该乳液在生物催化剂切断碳-硫键时允许生物在乳液中繁殖。
温度、混合比和脱硫速度等变量将根据所用的生物催化剂和/或氧化还原酶变化。这些参数可以通过常规的试验确定下来。
几种适当的监测脱硫速度和脱硫程度的技术是已知的，本领域的技术人员很容易获得这些技术。基线和时间历程样品可以从保育的混合物中制备并测定矿物燃料中残留的有机硫。例如，可以利用X-射线荧光计(XRF)或原子发射光谱(火焰光度计)监测正在经受生物催化处理的样品中硫从有机硫化物(如DBT)中消失的过程。最好借助气相色谱之类的方法首先将这些分子成分分离出来。
本发明的方法和生物催化组合物(包括重组体微生物)对早期揭示的脱硫方法作出了重大的出乎意料的改进。已经表明，在体外由纯化的DszA和DszC蛋白质催化的反应由于添加氧化还原酶而被激活。依据文献中最新的观点这是特别出乎意料的，这些观点认为FAD直接与DszC键合(Denome等人，J.Bacteriol.，vol.176，pp 6707-6716，1994)并且认为NADH是该系统需要的唯一的协同因子(Ohshiro等人，FEMS Microbiol.Lett.，vol.118，pp341-344，1994)。其它人提出DszA、DszB和DszC是唯一能够对将要发生的脱硫反应作出响应的酶(Piddington等人，Appl.Env.Microbiol.，vol.67，pp468-475，1995)。
在脱硫反应不受任何机理或理论限制的情况下，据信该反应路径如下：
Figure A9519796300201
其中，氧化还原酶被认为是一个短的电子迁移链，它将还原当量的电子从NADH(或其他的电子供体)提交给酶DszC和/或DszA(可能是氧化还原酶的生理电子受体)。酶DszC被认为是负责生物催化从DBT变成DBTO2的氧化反应。而酶DszA被认为是负责从DBTO2变成PPS(酚基苯基亚硫酸酯)的氧合反应。
特别优选的是将协同因子FMN以及电子供体NADH或NADPH添加到反应介质中。按照已知的方法添加NADH或NADPH再生系统也是优选的，该再生系统适合将NAD+变成NADH。
下面将结合实施例进一步说明本发明。本发明的优选实施例红球菌IGTS8的生长
在2000ml摇动的烧瓶中放入500ml富养的介质，让冷冻的红球菌IGTS8在30℃的该介质中生长48小时，其中红球菌的品系为CPE-648并且包含Piddington等人介绍的质粒pENOK3(参阅Appl.Environ.Microbiol.，vol.61，pp468-475，1995)，其基因型为DszA-、DszB-、和DszC+。在15升的NBS发酵桶中放入相同的介质，用上述的培养物接种(接种物4％)。让这种培养物在30℃生长48小时，同时控制pH值(在6.8至7.3之间)、搅拌和被溶解的氧(＞50％饱和)。最后，将5％的接种物转移到生产规模的发酵桶(300升Chemap)中，桶中包含基础盐介质(basal salts medium)、0.5g/L的Ivanhoe防沫剂、8g/L的乙醇和1.5mM的二甲基亚砜。让该培养物生长45小时，光密度达到11，并且在运行的第一个24小时中的加倍时间为4.3小时。借助Westfalia离心机浓缩该细胞悬浮液，得到大约2.5公斤湿的细胞糊。纯化前在-70℃下储存这种细胞糊。DszD的提纯
将上述方法培养的红球菌的湿细胞糊150g重新悬浮到25mM NaPi缓冲液A中，该缓冲液pH值为7.5，包含100mM NaCl、0.5mM DTT、1mM PMSF和DNAse。细胞悬浮液在French压力舱(压力20,000psi.)中通过两次，然后以30,000×g的加速度离心45分钟(5℃)，以除去未破细胞和细胞碎片。所有后续的色谱步骤都是在4℃利用Pharmacia FPLC系统完成的。将上层清液导入用含有100mM NaCl的缓冲液A平衡的Q-琼脂糖柱(2.6cm×20cm)。接下来用相同的缓冲液充分淋洗该色谱柱，直至淋洗液的OD280接近零为止。以5ml/分钟流速用线性梯度为NaCl从100mM至500mM的缓冲液A展柱180分钟，并且每个级份收集10ml。将这些显示DszD活性的级份汇集起来并对缓冲液A透析过夜。将透析物导入用缓冲液A平衡的ToyopearlDEAE-650M柱(2.6cm×10cm)。以4ml/分钟流速用NaCl线性梯度为0至200mM的缓冲液A中展柱90分钟，并且每个级份收集4ml。将这些包含DszD活性的级份汇集起来并对缓冲液A透析过夜。将透析物导入用缓冲液A平衡的Pharmacia MonoQ柱。以0.5ml/分钟流速用线性梯度为从160mM至300mM的NaCl展柱30分钟，每个级份收集0.5ml。将显示了DszD活性的级份合并，并利用Amicon微型浓缩器浓缩至0.2ml(截至分子量为10kDa)。然后将浓缩后的样品加到用含100mM NaCl的缓冲液A平衡的Pharmacia Superdex 75尺寸筛析色谱柱。用相同的缓冲液以0.2mL/分钟流速洗脱，每个级份收集0.2ml。将包含DszD活性的级份汇集起来并利用微型浓缩器浓缩，在使用前该蛋白质保存在冰上。对最终的制剂作SDS-PAGE分析(14％的聚丙烯酰胺)，结果呈现单一谱带，单体的分子量近似为50,000Da。酶测定
DszD的活性是借助监测在受DszC和DszD联合催化时由DBT产生的DBTO和DBTO2进行测量的。DszC是从上述的E.coli表达系统获得的。该测定(在25mM的NaPi中、pH值为7.5，100mM NaCl和0.5mM DTT)包含DszC(6至15μg)、3mM的NADH、10μM的FMN、100μM的DBT，和包含DszD的样品。允许测试混合物在30℃并以300rpm的速度摇动的条件下保育一段时间(通常是15至60分钟)。借助添加乙腈(至50％)中止反应，反应产物借助反相HPLC进行分析。DszD对DszA的激活借助相同的方法进行检验(DszA同样从上述的E.coli获取)，不同的是底物换成DBT的磺内酯，产物是2，2’-二羟基联苯(BHBP)。结果
DszD的纯化
图1表示来自第一阴离子交换柱(Q-琼脂糖)的各个级份的DszD活性分布。从这些数据可以看到：活性在级份20附近开始，一直延续到级份60附近。在这些反应中DszC和DszA都被激活，而且内源的DszC的活性也出现在这些级份中(注意级份40至50)。级份40至60被汇集起来，进一步在Toyopearl-DEAE上分离。与Q-琼脂糖柱相似的活性图可以在Toyopearl-DEAE后面的色谱图上看到，所不同的是在较低的盐浓度下淋洗到活性物，内源的DszC的活性出现在比较靠后的级份中(在级份40中有少量的活性)。这进一步从Western分析结果得到证实，该结果表明DszC淋洗峰值在级份45至50之间(数据未示出)。级份15至35被汇集到一起，加到MonoQ柱。来自这个柱的活性级份被汇集起来，浓缩并借助色谱法在Superdex 75 FPLC柱上进一步分离。这个柱的活性分布示于图2。这张图表明在相同的级份中DszA和DszC都被蛋白质激活。SDS-PAGE分析结果(图3)表明最终的制剂由分子量近似为50,000的单一的多肽组成。利用HewlettPackard 1050高压液体色谱系统中的TosoHaas TSK3000SW尺寸筛析柱得到的分析结果表明单一的蛋白质淋洗峰在质量接近50,000Da处，说明天然蛋白质最可能是十倍体(decamer)。
DszD对DszC和DszA的激活作用
图4表明DszD对DszC的激活作用遵循饱和动力学。当DszD对DszC的比例增加时，可以观察到DBTO2形成率也增加。初始的形成率随DszD：DszC变化的曲线表明达到了饱和。图5表明DszA被同一制剂激活的结果。可以看到相同的效果，即在添加更多的DszD时，DszA的反应速度增加。
DszD的氨基酸顺序
DszD从属于氨基末端的顺序并且获得了下面的顺序(一个字母的氨基酸缩写)：H2N-AIELNQIWDFPIKEFHPFPRALMGVGAHDIIGVEAKNGFKRTLLM-COOH
                    (序列号：3)
检索数据库的结果是与红球菌属蛋白质ThcE的顺序100％地吻合(参阅：Nagy等人，Arch.Microbiol.，vol.163，pp 439-446，1995)。图6列举了DNA顺序与假想的氨基酸顺序。这种蛋白质与在其它的涉及醇的氧化和电子受体的还原有关的格兰氏阳性生物中找到的醇(N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺(NDMA))氧化还原酶是高度同源性的。在这种生物(体)中的生理电子受体是未知的。等同物
本领域的技术人员人将知道或者通过不多的例行试验就能确定许多与本文介绍的具体实施方案等价的方案。这些方案和其他等价方案都在本发明的权利要求的范围内。

Claims (39)

1.一种提高包含有机硫化物的矿物燃料的脱硫速度的方法，该方法包括：(a)使矿物燃料与水相接触，其中水相包含能使碳-硫键断裂的生物催化剂和增速剂量的氧化还原酶，借此形成矿物燃料与水相的混合物；(b)使步骤(a)形成的混合物保持在生物催化剂足以使有机硫分子中的碳-硫键断裂的条件下，借此获得降低有机硫含量的矿物燃料；以及(c)将有机硫含量较低的矿物燃料从得到的水相当中分离出来。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原酶是III型醇脱氢酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原酶是与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的醇氧化还原酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述氧化还原酶来源于红球菌属。
5.根据权利要求4所述的方法，该方法进一步包括添加NADH或NADPH和核黄素。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述矿物燃料是液烃。
7.根据权利要求4所述的方法，其中碳-硫键的断裂是借助氧化途径完成的。
8.根据权利要求7所述的方法，其中能够使碳-硫键断裂的生物催化剂是微生物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中微生物包含一种重组DNA分子，这种分子给一种或多种能使碳-硫键断裂的酶编码。
10.根据权利要求9所述的方法，其中重组DNA分子衍生自红球菌ATCC53968。
11.根据权利要求7所述的方法，其中能使碳-硫键断裂的生物催化剂是不含细胞的部分。
12.根据权利要求11所述的方法，其中能使碳-硫键断裂的生物催化剂是红球菌ATCC53968的不含细胞的部分。
13.根据权利要求7所述的方法，其中生物催化剂包括来自能使碳-硫键断裂的微生物的一种或多种酶或酶的部分。
14.根据权利要求13所述的方法，其中微生物是红球菌ATCC53968。
15.根据权利要求7所述的方法，其中能使碳-硫键断裂的生物催化剂和氧化还原酶是借助一种微生物重组生产的。
16.一种DNA分子，该分子包括给氧化还原酶编码的DNA和给能使包含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂编码的DNA。
17.根据权利要求16所述的DNA分子，其中氧化还原酶是III型醇脱氢酶。
18.根据权利要求16所述的DNA分子，其中氧化还原酶是与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的醇氧化还原酶。
19.根据权利要求16所述的DNA分子，其中氧化还原酶来源于红球菌属。
20.根据权利要求19所述的DNA分子，其中给生物催化剂编码的DNA分子来源于红球菌ATCC53968。
21.一种包含重组DNA分子的微生物，其中所述的微生物编码：a)氧化还原酶，和b)一种或多种生物脱硫酶。
22.根据权利要求21所述的微生物，其中氧化还原酶是III型醇脱氢酶。
23.根据权利要求21所述的微生物，其中氧化还原酶是与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的醇氧化还原酶。
24.根据权利要求21所述的微生物，其中给氧化还原酶编码的DNA来源于红球菌属。
25.根据权利要求24所述的微生物，其中给一种或多种生物脱硫酶编码的DNA来源于红球菌ATCC53968。
26.一种组合物，包括：(a)氧化还原酶；和(b)能使包含有机硫分子的矿物燃料脱硫的生物催化剂。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中氧化还原酶是III型醇脱氢酶。
28.根据权利要求26所述的组合物，其中氧化还原酶是与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的氧化还原酶。
29.根据权利要求26所述的组合物，其中给氧化还原酶编码的DNA来源于红球菌属。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中生物催化剂是红球菌ATCC53968或它的酶。
31.根据权利要求27所述的组合物，该组合物进一步包括核黄素和NAD或NADH。
32.一种用于增加含有机硫化物的含碳物质的反应速度的方法，该方法包括下述步骤：(a)使矿物燃料与水相接触，其中水相包含能使碳-硫键断裂的生物催化剂和增速剂量的氧化还原酶；(b)使步骤(a)形成的混合物保持在生物催化剂足以使有机硫化物反应的条件下。
33.根据权利要求32所述的方法，其中氧化还原酶是III型醇脱氢酶。
34.根据权利要求32所述的方法，其中氧化还原酶是与N，N’-二甲基-4-亚硝基苯胺有关的醇氧化还原酶。
35.根据权利要求32所述的方法，其中氧化还原酶来源于红球菌属。
36.根据权利要求35所述的方法，其中生物催化剂是单氧合酶。
37.根据权利要求35所述的方法，其中生物催化剂是DszA或DszC。
38.根据权利要求37所述的方法，该方法进一步包括添加NADH或NADPH和核黄素。
39.根据权利要求38所述的方法，其中含硫化合物是取代的或未取代的硫芴。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358743A (zh) * 2019-06-03 2019-10-22 华南理工大学 一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000197485A (ja) * 1999-01-07 2000-07-18 Daicel Chem Ind Ltd 酸化還元酵素の生産能を有する微生物において酸化還元酵素の電子受容体再生活性を高める方法、および該方法により調製された微生物の利用
WO2000042122A1 (en) * 1999-01-14 2000-07-20 Energy Biosystems Corporation Growth of biocatalyst within biodesulfurization system
ES2168945B1 (es) * 2000-03-20 2003-12-01 Consejo Superior Investigacion Un procedimiento para desulfurar dibenzotiofeno utilizando como biocatalizador una cepa de pseudomonas putida recombinante.
JP2001359165A (ja) 2000-06-15 2001-12-26 Mitsubishi Electric Corp モバイル通信システム

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5104801A (en) * 1990-01-05 1992-04-14 Institute Of Gas Technology Mutant microorganisms useful for cleavage of organic c-s bonds
US5198341A (en) * 1990-01-05 1993-03-30 Institute Of Gas Technology Useful for cleavage of organic C-S bonds Bacillus sphaericus microorganism
US5002888A (en) * 1990-01-05 1991-03-26 Institute Of Gas Technology Mutant microorganisms useful for cleavage of organic C-S bonds
US5132219A (en) * 1990-02-28 1992-07-21 Institute Of Gas Technology Enzymes from Rhodococcus rhodochrous strain ATCC No. 53968, Bacillus sphaericus strain ATCC No. 53969 and mixtures thereof for cleavage of organic C--S bonds of carbonaceous material
US5344778A (en) * 1990-02-28 1994-09-06 Institute Of Gas Technology Process for enzymatic cleavage of C-S bonds and process for reducing the sulfur content of sulfur-containing organic carbonaceous material
US5358870A (en) * 1990-02-28 1994-10-25 Institute Of Gas Technology Microemulsion process for direct biocatalytic desulfurization of organosulfur molecules
US5356813A (en) * 1992-04-30 1994-10-18 Energy Biosystems Corporation Process for the desulfurization and the desalting of a fossil fuel
WO1994001563A1 (en) * 1992-07-10 1994-01-20 Energy Biosystems Corporation Recombinant dna encoding a desulfurization biocatalyst

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110358743A (zh) * 2019-06-03 2019-10-22 华南理工大学 一种单加氧酶DszC突变体及其制备方法和应用

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