CN119753111A - 对多核苷酸进行测序的方法 - Google Patents

Abstract

提供一种用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，包括监测与靶单链多核苷酸互补的核苷酸的依次掺入，其中所述核苷酸各自附接至引发不同发光动力学或发光类型的化学发光标记物，其中每个掺入的核苷酸通过检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学或发光类型和随后除去所述化学发光标记物来鉴别。

Description

对多核苷酸进行测序的方法

本申请是申请号为201880095214.8的中国专利申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及通过监测用化学发光标记物标记的核苷酸的依次掺入来对多核苷酸进行测序的方法，其中所述监测包括检测每个掺入的核苷酸的化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学或发光类型。

发明背景

在过去10多年，第二代基因测序技术已经逐步从新兴技术发展为主流的测序手段，并逐步成为临床领域的重要检测工具，在传染性疾病防御和控制、遗传病的诊断、无创产前筛查等领域发挥着越来越大的作用。为了进一步扩大测序市场，让测序仪平民化，低成本小型化测序仪的开发逐渐成为了测序领域的发展趋势。作为二代测序技术的经典手段，基于四通道、双通道以及单通道的三种测序方法各有千秋，但三者相比，单通道测序以其耗材更少、成本更低、更易实现仪器小型化便携式等优势，已逐渐成为测序领域的发展趋势。目前市场上基于单色通道的产品主要包括ion torrent系列的测序仪、454测序仪以及illumina公司最新推出的Iseq100。

目前基于单通道的测序技术中，ion torrent系列的仪器因多聚物结构测序错误率高而限制了其使用范围，同样罗氏的454仪器也因测序准确率不够高，加上其高额的测序成本已逐渐退出了测序市场。Illumia公司的Iseq100基于单色荧光技术和半导体技术，实现了小型化的测序仪，且保持了较高的测序质量。但是因其光信号通过激光器激发，仪器需要配置额外的激光器，从而增加了仪器的体积。另外为了避免激发光产生的背景值，需要对半导体芯片做特殊处理从而滤掉激发光产生的背景，这种处理将造成高额的成本，从而增加了测序成本。

因此，本领域仍然需要改进的测序技术，其测序成本较低并且保持较高的测序质量。

发明概述

本发明涉及利用化学发光标记物标记核苷酸，并通过监测这样标记的核苷酸的依次掺入来对多核苷酸进行测序。更具体地，本发明涉及通过检测每个掺入的核苷酸的化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学或发光类型来监测核苷酸的依次掺入。

在一个方面，本发明涉及用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，其包括监测与靶单链多核苷酸互补的核苷酸的依次掺入，其中所述核苷酸各自附接至引发不同发光动力学的化学发光标记物，其中每个掺入的核苷酸通过检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学和随后除去所述化学发光标记物来鉴别。

在具体的实施方案中，核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团，其中在掺入每个核苷酸之后修饰或除去所述保护基团，以便暴露3’-OH基团。

在具体的实施方案中，化学发光标记物和所述保护基团在相同的条件下被除去。

在具体的实施方案中，核苷酸选自核苷酸A、G、C和T或U。

在具体的实施方案中，化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学的检测包括使所述化学发光标记物与合适的底物接触以触发化学发光反应，和检测由此发出的光的发光动力学。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光动力学的生物化学发光标记物及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光动力学的荧光素酶及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物是引发不同发光动力学的两种荧光素酶的组合。

在一个方面，本发明涉及用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，其包括监测与靶单链多核苷酸互补的核苷酸的依次掺入，其中所述核苷酸各自附接至引发不同发光类型的化学发光标记物，其中每个掺入的核苷酸通过检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光类型和随后除去所述化学发光标记物来鉴别。

在具体的实施方案中，核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团，其中在掺入每个核苷酸之后修饰或除去所述保护基团，以便暴露3’-OH基团。

在具体的实施方案中，化学发光标记物和所述保护基团在相同的条件下被除去。

在具体的实施方案中，核苷酸选自核苷酸A、G、C和T或U。

在具体的实施方案中，化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学的检测包括使所述化学发光标记物与合适的底物接触以触发化学发光反应，和检测由此发出的光的发光类型。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光类型的生物化学发光标记物及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光类型的荧光素酶及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物是引发不同发光类型的两种荧光素酶的组合。

在具体的实施方案中，发光类型包括闪光类型、辉光类型以及混合类型。

在一个方面，本发明涉及用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，其包括(a)提供一种或多种核苷酸，其中所述核苷酸各自附接至不同的化学发光标记物，其中每种类型的核苷酸所附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光标记物不同的发光动力学；(b)将一个核苷酸掺入到所述靶单链多核苷酸的互补链上；(c)检测(b)的核苷酸的化学发光标记物，以便确定掺入的核苷酸的类型；(d)除去(b)的核苷酸的化学发光标记物；和(e)任选重复步骤(b)-(d)一次或多次，以便测定靶单链多核苷酸的序列。

在具体的实施方案中，检测(b)的核苷酸的化学发光标记物包括使所述化学发光标记物与合适的底物接触以触发化学发光反应，和检测由此发出的光的发光动力学。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光动力学的生物化学发光标记物及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光动力学的荧光素酶及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物是引发不同发光动力学的两种荧光素酶的组合。

在具体的实施方案中，核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团，其中在掺入核苷酸之后修饰或除去所述保护基团，以便暴露3’-OH基团。

在具体的实施方案中，化学发光标记物和所述保护基团在相同的条件下被除去。

在具体的实施方案中，核苷酸选自核苷酸A、G、C和T或U。

在具体的实施方案中，使每一个核苷酸依次与所述靶单链多核苷酸接触，在添加下一个核苷酸之前除去未掺入的核苷酸，并且其中所述化学发光标记物的检测和除去是在添加每一个核苷酸之后或在添加所有四种核苷酸之后进行的。

在具体的实施方案中，使一种、两种、三种或所有四种核苷酸同时与所述靶单链多核苷酸接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，其中所述化学发光标记物的检测和除去是在添加所述一种、两种、三种或所有四种核苷酸之后进行的。

在一个方面，本发明涉及用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，其包括(a)提供一种或多种核苷酸，其中所述核苷酸各自附接至不同的化学发光标记物，其中每种类型的核苷酸所附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光标记物不同的发光类型；(b)将一个核苷酸掺入到所述靶单链多核苷酸的互补链上；(c)检测(b)的核苷酸的化学发光标记物，以便确定掺入的核苷酸的类型；(d)除去(b)的核苷酸的化学发光标记物；和(e)任选重复步骤(b)-(d)一次或多次，以便测定靶单链多核苷酸的序列。

在具体的实施方案中，检测(b)的核苷酸的化学发光标记物包括使所述化学发光标记物与合适的底物接触以触发化学发光反应，和检测由此发出的光的发光类型。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光类型的生物化学发光标记物及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物选自引发不同发光类型的荧光素酶及其任意组合。

在具体的实施方案中，化学发光标记物是引发不同发光类型的两种荧光素酶的组合。

在具体的实施方案中，发光类型包括闪光类型、辉光类型以及混合类型。

在具体的实施方案中，核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团，其中在掺入核苷酸之后修饰或除去所述保护基团，以便暴露3’-OH基团。

在具体的实施方案中，化学发光标记物和所述保护基团在相同的条件下被除去。

在具体的实施方案中，核苷酸选自核苷酸A、G、C和T或U。

在具体的实施方案中，使每一个核苷酸依次与所述靶单链多核苷酸接触，在添加下一个核苷酸之前除去未掺入的核苷酸，并且其中所述化学发光标记物的检测和除去是在添加每一个核苷酸之后或在添加所有四种核苷酸之后进行的。

在具体的实施方案中，使一种、两种、三种或所有四种核苷酸同时与所述靶单链多核苷酸接触，并且在检测之前除去未掺入的核苷酸，其中所述化学发光标记物的检测和除去是在添加所述一种、两种、三种或所有四种核苷酸之后进行的。

在各个方面，核苷酸与化学发光标记物之间的附接包括通过亲和相互作用介导的附接。

在具体的实施方案中，亲和相互作用包括抗原-抗体相互作用和生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用。

在具体的实施方案中，通过将化学发光标记物连接至参与亲和相互作用的成员之一，并将核苷酸连接至参与亲和相互作用的其他成员，从而通过所述成员之间的亲和相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。

在具体的实施方案中，与核苷酸连接的成员是生物素，与化学发光标记物连接的成员是亲和素(例如链霉亲和素)。

在具体的实施方案中，与核苷酸连接的成员是地高辛，与化学发光标记物连接的成员是抗地高辛抗体。

在具体的实施方案中，与核苷酸连接的成员是地高辛，与化学发光标记物连接的成员是亲和素(例如链霉亲和素)，其中地高辛与亲和素通过与生物素连接的抗地高辛抗体亲和结合。

在具体的实施方案中，在所述核苷酸中，第一种核苷酸附接至第一化学发光标记物，第二种核苷酸附接至第二化学发光标记物，第三种核苷酸附接至第一化学发光标记物和第二化学发光标记物两者，第四种核苷酸不附接至任何化学发光标记物。

在具体的实施方案中，在所述核苷酸中，第一种核苷酸附接至第一荧光素酶，第二种核苷酸附接至第二荧光素酶，第三种核苷酸附接至第一荧光素酶和第二荧光素酶两者，第四种核苷酸不附接至任何荧光素酶。

在其他方面，本发明还涉及试剂盒，其包含：(a)选自核苷酸A、G、C和T或U的一种或多种核苷酸，其中所述核苷酸各自附接至不同的化学发光标记物，其中与每种类型的核苷酸附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光标记物不同的发光动力学和/或发光类型；和(b)它们的包装材料。

在具体的实施方案中，试剂盒还包含酶和适合所述酶起作用的缓冲液。

在具体的实施方案中，试剂盒还包含与所述化学发光标记物反应的合适的底物。

附图说明

图1显示了不同发光动力学的实例。

图2显示了根据本发明的一个实施方案对多核苷酸进行测序的流程图。

图3显示了根据本发明的一个实施方案对多核苷酸进行测序的信号曲线。

图4显示了根据本发明的一个实施方案对多核苷酸进行测序的信号曲线的比较。

发明详述

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文提及的所有专利、申请和其他出版物均通过引用整体并入本文。如果本文中提出的定义与通过引用并入本文的专利、申请和其他出版物中所述的定义相抵触或不一致，则以本文所述的定义为准。

如本文所用，术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其类似物。多核苷酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列两者。多核苷酸分子可以来源于双链DNA(dsDNA)形式(例如，基因组DNA、PCR和扩增产物等)，或者可以来源于单链形式的DNA(ssDNA)或RNA并且其可以转化为dsDNA形式，并且反之亦然。多核苷酸分子的准确序列可以是已知的或未知的。以下是多核苷酸的示例性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、任何上述序列的核酸探针、引物或扩增拷贝。

多核苷酸可以包括核苷酸或核苷酸类似物。核苷酸通常含有糖(如核糖或脱氧核糖)、碱基和至少一个磷酸基。核苷酸可以是无碱基的(即，缺少碱基)。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰磷酸盐糖主链核苷酸及其混合物。核苷酸的实例包括(例如)腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、胞苷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧腺苷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸腺嘧啶核苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸腺嘧啶核苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、去氧胞二磷(dCDP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。还可以在本文所述的方法中使用包含修饰的碱基的核苷酸类似物。无论是具有天然主链还是类似结构，可以包含在多核苷酸中的示例性修饰的碱基包括(例如)肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤(hypoxathanine)、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶、15-卤代脲嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤素取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤、7-去氮腺嘌呤、3-去氮鸟嘌呤、3-去氮腺嘌呤等。如本领域中已知的，某些核苷酸类似物不能引入多核苷酸，例如，核苷酸类似物，如腺苷5’-磷酰硫酸。

如本文所用，术语“核苷酸A”是指含有腺嘌呤(A)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如ATP、dATP。“核苷酸G”是指含有鸟嘌呤(G)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如GTP、dGTP。“核苷酸C”是指含有胞嘧啶(C)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如CTP、dCTP。“核苷酸T”是指含有胸腺嘧啶(T)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如TTP、dTTP。“核苷酸U”是指含有尿嘧啶(U)或其修饰物或类似物的核苷酸，例如UTP、dUTP。

核苷酸的标记

本发明涉及用化学发光标记物标记核苷酸，从而使得可以区分不同的核苷酸。

如本文所用，术语“化学发光标记物”是指可以被附接至核苷酸的任何化合物，其可以通过与合适的底物接触以触发化学发光反应，从而在不需要激发光的情况下产生可检测的光信号。一般而言，参与化学发光反应的任何组分均可以用作如本文所述的化学发光标记物，相对应地，参与化学发光反应的其他组分在本文中被称为该化学发光标记物的底物。常用的适合的化学发光标记物的实例包括但不限于过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、水母发光蛋白、官能化的铁-卟啉衍生物、鲁米那、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、磺酰胺等。化学发光标记物的底物将取决于所使用的具体化学发光标记物，例如碱性磷酸酶的底物可以是AMPPD(金刚烷基1,2-二氧恶烷芳香磷酸酯)，荧光素酶的底物可以是荧光素，吖啶酯的底物可以是氢氧化钠和H₂O₂的混合物等。关于化学发光标记物及其相应底物的详细描述可参见例如Larry J.Kricka，Chemiluminescent and Bioluminescent Techniques，CLIN.CHEM.37/9,1472-1481(1991)和Tsuji,A.等人编辑(2005)Bioluminescence andchemiluminescence:Progress and perspectives.World Scientific:[s.l.].ISBN 978-981-256-118-3.596pp.。

在优选的实施方案中，如本文所用的化学发光标记物是生物化学发光标记物。

如本文所用，术语“生物化学发光标记物”是指可以被附接至核苷酸的任何化合物，其可以通过与合适的底物接触以触发生物发光反应，从而在不需要激发光的情况下产生可检测的光信号。生物发光是化学发光的一种，其是通过在体内或在某些类型生物的分泌物中发生的化学反应产生的光。生物化学发光标记物的实例可以包括例如荧光素酶、水母光蛋白、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖氧化酶等。生物化学发光标记物的底物将取决于所使用的具体生物化学发光标记物，例如荧光素酶的底物可以是荧光素，水母光蛋白的底物可以是钙离子。关于生物化学发光标记物及其相应底物的详细描述可参见例如Larry J.Kricka，Chemiluminescent and Bioluminescent Techniques，CLIN.CHEM.37/9,1472-1481(1991)和Tsuji,A.等人编辑(2005)Bioluminescence and chemiluminescence:Progress andperspectives.World Scientific:[s.l.].ISBN 978-981-256-118-3.596pp.。

在优选的实施方案中，如本文所用的生物化学发光标记物是荧光素酶。在具体的实施方案中，荧光素酶选自长腹水蚤(Gaussia)荧光素酶、海肾(Renilla)荧光素酶、腰鞭毛虫荧光素酶、萤火虫荧光素酶、真菌荧光素酶、细菌荧光素酶和弯喉萤(vargula)荧光素酶。

如本文所用，“用化学发光标记物标记核苷酸”意指将化学发光标记物附接至核苷酸。将化学发光标记物附接至核苷酸的具体方式是本领域技术人员已知的，例如可以参见以下文献(均通过引用并入本文)中的相关描述：Sambrook等人,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989),第10章；美国专利号4,581,333,5,283,174,5,547,842,5,656,207和5,658,737。在一个实施方案中，可以通过共价键将化学发光标记物直接附接至核苷酸。在另一个实施方案中，可以通过连接基团将化学发光标记物附接至核苷酸。

在优选的实施方案中，通过亲和相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。如本领域技术人员所熟知的，“亲和相互作用”通常是指生物分子(例如蛋白质分子，例如酶、抗体)与其特异性识别的物质之间的特异性相互作用。亲和相互作用可以包括例如抗原-抗体相互作用和生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用。抗原-抗体相互作用的实例可以是例如地高辛-抗地高辛抗体相互作用。

在利用亲和相互作用的实施方案中，可以将化学发光标记物连接至参与亲和相互作用的成员之一，并将核苷酸连接至参与亲和相互作用的其他成员，从而通过所述成员之间的亲和相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。

在利用地高辛-抗地高辛抗体相互作用的示例性实施方案中，可以将地高辛连接至核苷酸，并将化学发光标记物连接至抗地高辛抗体，从而通过地高辛-抗地高辛抗体相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。

在利用生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用的示例性实施方案中，可以将生物素连接至核苷酸，并将化学发光标记物连接至亲和素(例如链霉亲和素)，从而通过生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。在另一个实施方案中，本发明还涉及核苷酸的多重标记，即将多于一种化学发光标记物附接至同一核苷酸。在优选的实施方案中，通过不同亲和相互作用将多于一种化学发光标记物附接至同一核苷酸。这可以例如通过将参与不同亲和相互作用的成员同时连接至核苷酸，并将待附接至核苷酸的不同化学发光标记物分别连接至参与所述不同亲和相互作用的其他成员，从而通过所述不同亲和相互作用实现多于一种化学发光标记物与核苷酸的附接。在优选的实施方案中，通过不同亲和相互作用将两种不同的化学发光标记物附接至同一核苷酸。

在将两种不同的化学发光标记物附接至核苷酸的示例性实施方案中，可以将核苷酸同时连接至参与第一亲和相互作用的成员之一和参与第二亲和相互作用的成员之一，并将第一化学发光标记物连接至参与第一亲和相互作用的其他成员，和将第二化学发光标记物连接至参与第一亲和相互作用的其他成员，从而通过所述第一亲和相互作用和第二亲和相互作用将所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物附接至核苷酸。

在一个实施方案中，所述第一亲和相互作用是地高辛-抗地高辛抗体相互作用，所述第二亲和相互作用是生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用。在具体的实施方案中，可以将核苷酸同时连接至地高辛和生物素，并将第一化学发光标记物连接至抗地高辛抗体，和将第二化学发光标记物连接至亲和素(例如链霉亲和素)，从而通过地高辛-抗地高辛抗体相互作用和生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用将所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物附接至核苷酸。

在另一个具体的实施方案中，可以将核苷酸同时连接至地高辛和生物素，并将第一化学发光标记物连接至抗地高辛抗体，和将第二化学发光标记物连接至亲和素(例如链霉亲和素)，从而通过地高辛-抗地高辛抗体相互作用和生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用将所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物附接至核苷酸。

此外，还可以通过组合不同的亲和相互作用来将一种化学发光标记物附接至核苷酸。在一个示例性的实施方案中，可以例如将核苷酸连接至参与第一亲和相互作用的成员之一，将参与第二亲和相互作用的成员之一连接至参与第一亲和相互作用的其他成员，以及将化学发光标记物连接至参与第二亲和相互作用的其他成员，从而通过所述第一亲和相互作用和第二亲和相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。

在一个具体的实施方案中，可以例如将核苷酸连接至地高辛，将生物素连接至抗地高辛抗体，以及将化学发光标记物连接至亲和素(例如链霉亲和素)，从而通过地高辛-抗地高辛抗体相互作用和生物素-亲和素(例如链霉亲和素)相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。

如本文所用，化学发光标记物或核苷酸与参与亲和相互作用的成员之间的“连接”可以是本领域已知的任何适合形式的连接。这样的连接可以包括例如直接连接或间接连接，例如经由接头的连接，还可以包括例如非共价连接(例如通过氢键、亲和相互作用等介导的连接或)和共价连接，还可以例如形成重组表达的融合蛋白来实现这样的连接。

化学发光反应的发光动力学

本发明涉及通过检测化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学来检测被所述化学发光标记物标记的核苷酸。

如本文所用，“化学发光反应的发光动力学”是指化学发光反应发出的光的强度随时间的变化特征谱。这可以例如通过绘制化学发光反应发出的光的强度随时间的变化曲线来表征。

在现有技术中，通常通过在特定波长处检测化学发光反应发出的光来检测并区分不同的化学发光标记物。然而，本发明人已发现，通过检测化学发光反应的发光动力学也可以用来检测和区分不同的化学发光标记物。这样的不同的化学发光标记物各自引发不同的发光动力学。如本文所用，“引发”不同的发光动力学意指化学发光标记物参与的化学发光反应发出的光具有不同的发光动力学。

本发明的这样的检测方法是有利的，因为可以区分发光波长相近但具有不同发光动力学的化学发光标记物。

因此，在具体的实施方案中，本发明涉及鉴别核苷酸的方法，其包括用引发不同发光动力学的化学发光标记物标记核苷酸，和检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学。本发明还涉及用引发不同发光动力学的化学发光标记物标记的核苷酸。

因此，在一个具体的实施方案中，可以用引发第一发光动力学的第一化学发光标记物标记第一核苷酸，用引发第二发光动力学的第二化学发光标记物标记第二核苷酸，和用引发第三发光动力学的第三化学发光标记物标记第三核苷酸，以及第四核苷酸不进行任何标记，从而可以通过检测所述化学发光标记物各自的发光动力学来鉴别所述四种核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明还涉及用引发不同发光动力学的化学发光标记物的组合来多重标记核苷酸。例如，可以如上文所述通过不同亲和相互作用将引发不同发光动力学的化学发光标记物附接至同一核苷酸。这样的技术方案是有利的，因为引发不同发光动力学的化学发光标记物的组合将引发与该组合中的每个化学发光标记物所引发的发光动力学不同的发光动力学，从而可以减少成本。

在具体的实施方案中，本发明涉及用引发不同发光动力学的两种化学发光标记物的组合来双重标记核苷酸。在具体的实施方案中，可以用引发第一发光动力学的第一化学发光标记物标记第一核苷酸，用引发第二发光动力学的第二化学发光标记物标记第二核苷酸，和用所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物双重标记第三核苷酸，以及第四核苷酸不进行任何标记，从而可以通过检测所述化学发光标记物各自的发光动力学来鉴别所述四种核苷酸，其中所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物的双重标记可以引发与所述第一发光动力学和第二发光动力学不同的发光动力学。

在优选的实施方案中，所述核苷酸选自核苷酸A、G、C和T/U。

化学发光反应的发光类型

在进一步的实施方案中，本发明涉及通过检测化学发光标记物参与的化学发光反应的发光类型来检测被所述化学发光标记物标记的核苷酸。

如本文所用，“化学发光反应的发光类型”是根据化学发光反应发出的光的持续时间来划分的，其通常包括闪光类型和辉光类型。闪光类型的发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。辉光类型的发光时间在数分钟至数十分钟以上，如辣根过氧化物酶-鲁米诺系统、碱性磷酸酶-AMPPD系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。在本发明中，还将介于闪光类型和辉光类型之间的发光类型称为混合类型。混合类型的发光通常是通过将闪光类型的发光和辉光类型的发光混合在一起而产生的。例如当引发闪光类型的化学发光标记物与引发辉光类型的化学发光标记物混合在一起并同时与其底物接触并发光时，会产生介于闪光类型和辉光类型之间的混合发光列类型。闪光类型、辉光类型和混合类型的发光特征谱的典型示例由图1所示。

通过检测化学发光反应的发光类型来检测化学发光标记物是有利的，因为可以区分发光动力学相近但发光类型显著不同的化学发光标记物。这样的检测还尤其适合于检测化学发光标记物的多重标记，因为具有不同发光类型的化学发光标记物的组合可以导致显著区别于单独化学发光标记物的发光类型。

因此，在具体的实施方案中，本发明涉及鉴别核苷酸的方法，其包括用引发不同发光类型的化学发光标记物标记核苷酸，和检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光类型。本发明还涉及用引发不同发光类型的化学发光标记物标记的核苷酸。

在具体的实施方案中，可以用引发第一发光类型的第一化学发光标记物标记第一核苷酸，用引发第二发光类型的第二化学发光标记物标记第二核苷酸，和用所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物双重标记第三核苷酸，以及第四核苷酸不进行任何标记，从而可以通过检测所述化学发光标记物各自的发光类型来鉴别所述四种核苷酸，其中所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物的双重标记可以引发与所述第一发光类型和第二发光类型不同的发光类型。

在具体的实施方案中，所述第一发光类型是闪光类型，所述第二发光类型是辉光类型。在具体的实施方案中，所述第一化学发光标记物和第二化学发光标记物的双重标记引发的发光类型介于所述第一发光类型(例如闪光类型)和第二发光类型(例如辉光类型)之间，其在本文被称为混合类型。

在优选的实施方案中，所述核苷酸选自核苷酸A、G、C和T/U。

多核苷酸的测序

本发明的用引发不同发光动力学的化学发光标记物标记的核苷酸以及用引发不同发光类型的化学发光标记物标记的核苷酸可用于各种核酸测序方法。优选地，本发明的用引发不同发光动力学的化学发光标记物标记的核苷酸以及用引发不同发光类型的化学发光标记物标记的核苷酸适用于合成法测序。如本文所用的合成法测序是本领域熟知的各种合成法测序方法。基本地，合成法测序涉及首先将被测序的核酸分子与测序引物杂交，随后在聚合酶的存在下，以被测序的核酸分子为模板在测序引物的3’端聚合如本文所述的经标记的核苷酸。聚合之后，通过检测所述标记来鉴定该经标记的核苷酸。在从经标记的核苷酸上除去标记(即如本文所述的化学发光标记物)之后，开始下一个聚合测序循环。

此外核酸测序方法还可以用本文所述的核苷酸进行公开于美国专利号5302509中的方法。

用于测定靶多核苷酸序列的方法可以这样进行：使靶多核苷酸序列变性，使靶单链多核苷酸分别与不同的核苷酸接触，以便形成所述靶核苷酸的互补体，并且检测所述核苷酸的掺入。所述方法利用了聚合，使得聚合酶通过掺入互补于所述靶的正确的核苷酸，以延伸所述互补链。所述聚合反应还需要特殊引物来启动聚合作用。

对每一轮反应来说，所述经标记的核苷酸的掺入是通过聚合酶进行的，并随后测定所述掺入事件。存在很多不同的聚合酶，并且对本领域普通技术人员来说容易确定最适合的聚合酶。优选的酶包括DNA聚合酶I、Klenow片段、DNA聚合酶III、T4或T7 DNA聚合酶、Taq聚合酶或vent聚合酶。还可以使用通过工程方法改造成具有特定性质的聚合酶。

所述测序方法优选对排列在固体支持物上的靶多核苷酸进行。可以通过接头分子将多个靶多核苷酸固定在所述固体支持物上，或者可以连接在诸如微球体的颗粒上，所述颗粒还可以连接在固体支持材料上。

可以通过多种方法将所述多核苷酸连接在所述固体支持物上，包括使用生物素-链亲和素相互作用。用于将多核苷酸固定在固体支持物上的方法为本领域所公知，并且包括石板印刷技术以及将每一种多核苷酸点样在固体支持物的特定位置上。合适的固体支持物为本领域所公知，并且包括玻璃载玻片和珠、陶瓷和硅表面和塑料材料。所述支持物通常是平面，尽管也可以使用微珠(微球体)，并且还可以通过已知方法将后者连接在其他固体支持物上。所述微球体可以具有任何合适的大小，其直径通常为10-100纳米。在优选实施方案中，将所述多核苷酸直接连接在平面上，优选连接在平的玻璃表面上。连接优选通过共价键的形式进行。所使用的阵列优选是单分子阵列，它包括位于独特的光学可分辨区域的多核苷酸，例如如在国际申请号WO00/06770中所描述的。

进行聚合的必须条件对本领域技术人员来说是熟知的。为了进行所述聚合酶反应，通常首先必须使引物序列与所述靶多核苷酸退火，所述引物序列是由所述聚合酶识别的，并且起着所述互补链随后延伸的起始位点的作用。所述引物序列可以相对所述靶多核苷酸作为独立的成分添加。另外，所述引物和靶多核苷酸可以分别是一个单链分子的一部分，由所述引物部分与所述靶的一部分形成分子内双链体，即发卡环结构。可以在所述分子的任何位点，将该结构固定在所述固体支持物上。进行所述聚合酶反应所必需的其他条件，对本领域技术人员来说是熟知的，这些条件包括温度、pH、缓冲液组成。

随后，使本发明的经标记的核苷酸与所述靶多核苷酸接触，以便能够进行聚合。所述核苷酸可以依次添加，即分别添加每一种类型的核苷酸(A，C，G或T/U)，或同时添加。

使所述聚合步骤进行足以掺入一个核苷酸的时间。

然后除去未掺入的核苷酸，例如，通过对所述阵列实施洗涤步骤，并且随后可以进行对掺入标记的检测。

检测可以通过常规方法进行，例如可以根据核苷酸所携带的具体化学发光标记物使合成的核酸与相应的底物接触，并检测由此发出的光的发光动力学或发光类型。

在检测之后，可以用合适条件除去所述标记。

本发明的经标记的核苷酸的使用并不局限于DNA测序技术，还可用本发明的核苷酸实施包括多核苷酸合成，DNA杂交分析，和单核苷酸多态性研究的其他形式。涉及到核苷酸和酶之间的相互作用的任何技术，都可以利用本发明的分子。例如，可以将所述分子用作逆转录酶或末端转移酶的底物。

在具体的实施方案中，本发明的经标记的核苷酸还具有3’保护基团。在本发明的一些实施方案中，保护基团和化学发光标记物通常是3’阻断的经标记的核苷酸上的两种不同的基团，但在另一些实施方案中，保护基团和化学发光标记物也可以是同一基团。

如本文所用，术语“保护基团”意指这样的基团，其阻止聚合酶(其将含有该基团的核苷酸掺入到正在合成的多核苷酸链上的)在将含有该基团的核苷酸掺入到正在合成的多核苷酸链上后继续催化另一核苷酸的掺入。这样的保护基团在本文中也被称为3’-OH保护基团。包含这样的保护基团的核苷酸在本文中也被称为3’阻断的核苷酸。保护基团可以是能够被添加到核苷酸上任何合适的基团，只要该保护基团能防止另外的核苷酸分子被加入至多核苷酸链中且同时在不破坏该多核苷酸链的情况下易于从核苷酸的糖部分除去。此外，经保护基团修饰的核苷酸需要耐受聚合酶或用于将该修饰的核苷酸掺入多核苷酸链内的其他适合的酶。因此，理想的保护基团表现出长期的稳定性，可被聚合酶高效地掺入，阻止核苷酸的二次掺入或进一步掺入，并且能够在不破坏多核苷酸结构的温和条件下优选地在水性条件下被除去。

现有技术已描述了多种符合上述描述的保护基团。例如，WO 91/06678公开3'-OH保护基团包括酯和醚,-F,-NH₂,-OCH₃,-N₃,-OPO₃,-NHCOCH₃,2硝基苯碳酸酯,2,4-次磺酰二硝基和四氢呋喃醚。Metzker等人(Nucleic Acids Research,22(20):4259-4267,1994)公开了八种3’-修饰的2-脱氧核糖核苷5’-三磷酸酯(3’-修饰的dNTP)的合成和应用。WO2002/029003描述了在聚合酶反应中使用烯丙基保护基团对DNA生长链上的3’-OH基团加帽。优选地，可以使用国际申请公开WO2014139596和WO2004/018497中报导的各种保护基团，包括例如WO2014139596的图1A中示例的那些保护基团和权利要求书中限定的那些3’羟基保护基(即保护基团)，和例如WO2004/018497的图3和4中示例的那些保护基团和权利要求书中限定的那些保护基团。上述参考文献均通过引用整体并入本文。

本领域技术人员将会理解如何将合适的保护基团连接在核糖环上，以便阻断与3′-OH的相互作用。所述保护基团可以直接连接在3’位置上，或者可以连接在2’位置上(所述保护基团具有足够的大小或电荷，以便阻断3’位置上的相互作用)。另外，所述保护基团可以连接在3′和2′位置，并且可以被裂解，以便暴露出3′OH基团。

在成功地将3'阻断的核苷酸掺入核酸链后，测序方案需要除去保护基团以产生用于连续链合成的可用的3'-OH位点。如本文所用的可从经修饰的核苷酸上除去保护基团的试剂在很大程度上取决于所使用的保护基团。例如，从3'羟基官能团除去酯保护基团通常通过碱水解来实现。除去保护基团的容易程度差异很大；通常，羰基碳上取代基的电负性越大，除去的容易度越大。例如，高电负性的三氟乙酸基团在甲醇中在pH7下能够从3'羟基快速裂解(Cramer等人，1963)，因此其在该pH下的聚合期间是不稳定的。苯氧基乙酸酯基团在少于1分钟内裂解，但是需要显著更高的pH，例如用NH-/甲醇实现(Reese和Steward，1968)。使用除碱水解以外的化学方法可以选择性地切割各种各样的羟基保护基团。通过用亲核试剂例如苯硫酚和硫代硫酸盐处理可迅速裂解2,4-二硝基苯硫基(Letsinger等，1964)。烯丙基醚通过用丙酮/水中的Hg(II)处理而裂解(Gigg and Warren，1968)。使用Ag(I)或Hg(II)在中性条件下除去四氢噻喃基醚(Cohen and Steele，1966；Cruse等人，1978)。光化学去阻断可以与可光化学裂解的保护基团一起使用。有几种保护基团可用于这种方法。使用邻硝基苄醚作为核糖核苷的2'-羟基官能性的保护基团是已知且被证明的(Ohtsuka等，1978)；其通过在260nm的照射进行除去。碳酸烷基邻硝基苄基碳酸酯保护基也通过在pH7的照射下被除去(Cama and Christensen，1978)。3'-OH保护基团的酶解解阻断也是可能的。已经证明T4多核苷酸激酶可以将3'-磷酸酯末端转化成3'-羟基末端，然后可以用作DNA聚合酶I的引物(Henner等，1983)。该3'-磷酸酶活性用于除去含有磷酸酯作为保护基团的那些dNTP类似物的3'保护基团。

可从3'阻断的核苷酸上除去保护基团的其它试剂包括例如膦(例如三(羟甲基)膦(THP))，其可以例如将含叠氮化物的3’-OH保护基团从核苷酸上除去(关于膦的此应用可参见例如WO2014139596中的记载，其全部内容通过引用并入本文)。可从3'阻断的核苷酸上除去保护基团的其它试剂还包括例如如WO2004/018497的说明书中第114-116页描述的用于除去作为3’-OH保护基团的3’-烯丙基、3,4-二甲氧基苄氧基甲基或氟甲氧甲基的相应试剂。

在本发明的实施方案中，化学发光标记物优选在检测后与保护基团一起被除去。

在某些实施方案中，化学发光标记物可以被掺入保护基团，从而允许在将3'阻断的核苷酸掺入核酸链后其能够与保护基团一起被除去。例如，可以将放射性物质例如C¹⁴或P³²掺入保护基团中。或者，可以使保护基团含有这样的基团，其自身不发荧光，但可与其他物质发生荧光反应。例如可以使保护基团含有金属结合配体例如羧酸基团，其可以与添加的稀土金属离子例如铕或铽离子反应以产生荧光物质。

在其他实施方案中，化学发光标记物可以利用连接基团与保护基团分开地连接在核苷酸上。这样的化学发光标记物可以例如连接到核苷酸的嘌呤或嘧啶碱基上。在某些实施方案中，所用的连接基团是可裂解的。可裂解的连接基团的使用能确保所述标记可以在检测之后除去，这避免了与后续掺入的任何经标记的核苷酸的任何信号干扰。在另一些实施方案中，可以使用不可裂解的连接基团，因为在经标记的核苷酸掺入核酸链之后，不需要后续的核苷酸掺入，因此不需要将标记从核苷酸中除去。

在另外的实施方案中，化学发光标记物和/或连接基团可以具有足以发挥阻断其他核苷酸掺入到多核苷酸链上的大小或结构(也就是说，所述标记本身可用作保护基团)。所述阻断可能是由于空间位阻造成的，或者可能是由于大小、电荷和结构的组合造成的。

可裂解的连接基团为本领域所公知，并且可以采用常规化学方法，以便将连接基团连接在核苷酸碱基和化学发光标记物上。连接基团可以连接在核苷酸碱基的任何位置上，其前提是，仍然能进行Watson-Crick碱基配对。对于嘌呤碱基来说，如果所述连接基团是通过所述嘌呤或优选的脱氮嘌呤类似物的7号位置，通过8-修饰的嘌呤，通过N-6修饰的腺嘌呤或N-2修饰的鸟嘌呤连接的话将是优选的。对于嘧啶来说，连接优选是通过胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶上的5号位置和胞苷上的N-4位置连接的。

使用术语“可裂解的连接基团”并非意味着需要除去整个连接基团(例如，从核苷酸碱基中除去)。当化学发光标记物与碱基相连接时，核苷裂解位点可位于连接基团上的位置，该位置能够确保在裂解后一部分的连接基团仍与所述核苷酸碱基保持连接。

合适的连接基团包括但不局限于二硫连接基团，酸不稳定性连接基团(包括二烷氧基苄基连接基团，Sieber连接基团，吲哚连接基团，叔丁基Sieber连接基团)，亲电可裂解的连接基团，亲核可裂解的连接基团，光可裂解的连接基团，在还原条件、氧化条件下裂解的连接基团，保险栓(safety-catch)连接基团，以及通过消除机制进行裂解的连接基团。合适的连接基团可以用标准化学保护基团改良，正如在以下文献中所披露的：Greene&Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons。Guillier等披露了用于固相合成的其他合适的可裂解的连接基团(Chem.Rev.100：2092-2157，2000)。

所述连接基团可以通过任何合适的方法裂解，包括接触酸，碱，亲核试剂，亲电试剂，自由基，金属，还原或氧化试剂，光照，温度，酶等，下文将示例性描述各种可裂解的连接基团的合适裂解方式。通常地，所述可裂解的连接基团可以在与所述保护基团相同的条件下裂解，以使得仅需要一次处理即可除去所述化学发光标记物和保护基团。

亲电裂解的连接基团典型地被质子所裂解，并包括对酸敏感的裂解。合适的亲电裂解的连接基团包括修饰的苄基系统，诸如三苯甲基、对烃氧基苄基酯和对烃氧基苄基酰胺。其他适合的连接基团包括叔丁氧羰基(Boc)基团和缩醛系统。为制备合适的连接分子，还可以考虑在硫缩醛或其他含硫保护基的裂解中使用诸如镍、银或汞的亲硫金属。亲核裂解的连接基团包括在水中不稳定的基团(即，能够在碱性pH值下简单地裂解)，例如酯类，以及对非水性亲核试剂不稳定的基团。氟离子可用于裂解诸如三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的基团中的硅氧键。可光解的连接基团在糖化学中被广泛使用。优选地，激活裂解所需的光不影响修饰的核苷酸中的其他组分。例如，如果使用荧光团作为标记，优选地，该荧光团吸收与裂解所述连接分子所需的光不同波长的光。适合的连接基团包括那些基于O-硝基苄基化合物和硝基藜芦基化合物的连接基团。也可以使用基于安息香化学的连接基团(Lee等人,J.Org.Chem.64:3454-3460,1999)。已知多种对还原裂解敏感的连接基团。使用基于钯催化剂的催化氢化已用于裂解苄基和苄氧羰基基团。二硫键还原也为本领域所知。基于氧化的方法为本领域所公知。这些方法包括对烃氧基苄基的氧化以及硫和硒连接基团的氧化。使用碘溶液(aqueous iodine)来使二硫化物和其他基于硫或硒的连接基团裂解也在本发明的范围内。安全拉手型连接基团(safety-catchlinker)为那些在两步中裂解的连接基团。在优选的系统中，第一步是反应性亲核中心的产生，随后的第二步涉及分子内环化，这导致裂解。例如，可以用肼或光化学方法处理乙酰丙酸酯连接来释放活性的胺，然后所述胺被环化以使分子中其他位置的酯裂解(Burgess等人,J.Org.Chem.62:5165-5168,1997)。也可以使用消除反应裂解连接基团。可以使用诸如芴甲氧羰基和氰基乙基的基团的碱催化的消除以及烯丙基系统的钯催化的还原消除。

在某些实施方案中，连接基团可包含间隔单元。连接基团的长度并不重要，只要所述化学发光标记物与核苷酸保持足够的距离，以免干扰核苷酸与酶之间的相互作用。

在某些实施方案中，连接基团可由与3’-OH保护基团类似的官能团组成。这会使得仅需要单一处理就除去化学发光标记物和保护基团。特别优选的连接基团是可通过膦裂解的含叠氮化物的连接基团。

如本文所用的可从经修饰的核苷酸上除去化学发光标记物的试剂在很大程度上取决于所使用的化学发光标记物。例如，在化学发光标记物掺入保护基团的情况下，使用上文所述的除去保护基团的试剂除去化学发光标记物。或者，在化学发光标记物通过可裂解的连接基团连接至核苷酸的碱基时，使用如上文所述的裂解连接基团的试剂除去化学发光标记物。在优选的实施方案中，使用相同的试剂来从经修饰的核苷酸上除去化学发光标记物和保护基团，例如在连接基团由与3’-OH保护基团类似的官能团组成的情况下。

本发明的一个示例性实施方案

在一个具体的实施方案中，本发明涉及利用不同的发光类型(闪光和辉光)区分四种核苷酸从而实现基因测序的方法。此方法不需要额外的激发光源，可以满足低成本便携式的测序仪开发。在此方法中，利用两种不同的荧光素酶及其底物产生不同发光形式的特点，根据不同的发光曲线来区分不同的核苷酸。所述荧光素酶来源包括但不限于firefly，gaussia，Renilla等生物。所述荧光素酶可以亲和相互作用的方式连接到四种脱氧核苷酸衍生物上。

在更具体的实施方案中，本发明涉及用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，其包括

(a)提供四种核苷酸，其中第一种核苷酸附接至第一荧光素酶，第二种核苷酸附接至第二荧光素酶，第三种核苷酸附接至第一荧光素酶和第二荧光素酶两者，第四种核苷酸不附接至任何荧光素酶，其中所述第一荧光素酶和第二荧光素酶在与其底物反应时表现出不同的发光动力学或发光类型；在优选的实施方案中，所述第一荧光素酶和第二荧光素酶的底物相同，例如选自腔肠素；

(b)将一个核苷酸掺入到所述靶单链多核苷酸的互补链上；

(c)检测(b)的核苷酸的化学发光标记物，以便确定掺入的核苷酸的类型；

(d)除去(b)的核苷酸的化学发光标记物；和

(e)任选重复步骤(b)-(d)一次或多次，以便测定靶单链多核苷酸的序列。

实施例

1.测序文库构建

(1)设计如下DNA序列：GATATCTGCAGGCAT AGAATGAATATTATTGAATCAATAATTAAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAACTAGTACGTCAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTTTACAACTACGATAATGGGCTGGATACATGGAATGATTATAGATATATTAAGGAATAATGTTAATTAATGCCTAAATTAATTAATCTAAGGGGGTTAATACTTCAGCCTGTGATATC，为建库方便，在序列的两端添加了相同寡核苷酸序列如两端加下划线字体，并在中间部分插入了BGI-SEQ500的接头序列如斜体标记的序列。将上述序列交给金斯瑞生物科技公司合成，为了序列的无限使用将合成的序列插在pUC57载体上，并转化至大肠杆菌中。

(2)培养适合量的含有已知文库的大肠杆菌，并提取质粒，设计如下一对引物：GATATCTGCAGGCAT，GATATCACAGGCTGA，按如下体系(表一)和流程(表二)将已知序列扩增出来，PCR产物使用磁珠纯化的方式进行。纯化好的PCR产物加入split oligo(ATGCCTGCAGATATCGATATCACAGGCTGA)按照BGIseq-500SE50环化建库试剂盒及流程进行环化建库，待用；

表一(酶来源于BGI自产)

表二：

2.文库序列的扩增

购买Thermo fisher公司的链霉亲和素包被的96孔板，将100ul 1uM 5’端生物素修饰的引物(RCA)GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG与其中一个孔常温孵育30min，去掉反应液体，加入6ng实施例1中所构建的文库和20ul BGISEQ-500试剂盒中的DNB制备缓冲液I，在60℃与上述生物素修饰的引物进行引物杂交5min后，加入40ul BGISEQ-500测序试剂盒中的DNB聚合酶I和4ul DNB聚合酶II，在30℃反应60min，加热至65℃终止反应，并小心去除反应液。加入100ul 5uM的测序引物GCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT，常温杂交30min，小心去掉反应液；

3.测序

(1)Acme Bioscience公司外包合成如下式所示的4种dNTP：

(2)试剂准备:

配制测序反应中所需要的如下试剂

聚合反应液：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，10mM(NH4)₂SO₄，0.02mg/ml聚合酶BG9(BGI)，3mM MgSO₄，1mM EDTA，上述四种dNTP各1uM；

聚合缓冲液：50mM Tris-HCl，50mM NaCl，Tween20 0.05％；

洗脱缓冲液：5XSSC，Tween20 0.05％；

抗体反应液：TBST缓冲液，1uM抗-地高辛-s-s-生物素(Abcam)；

抗体洗脱液：TBST缓冲液

自发光酶反应液1：TBST缓冲液，2ug/ml SA-gluc(M2)-glow(avidity)；

自发光酶反应液2：TBST缓冲液，2ug/ml SA-gluc(8990)-flash(avidity)

底物发光液：配制50mM tris-HCl 0.5mM NaCl缓冲液，将50XCoelenterazine(nonolight)稀释成1X；

切除缓冲液：20mM THPP，0.5M NaCl，0.05％tween20；

(3)测序反应：

测序流程如图2所示。

a.聚合：在(1)中扩增好文库的孔中，加入100ul聚合酶反应液，将酶标仪温度升高至55℃，反应3min，使四种dNTP聚合到扩增好的温控上，小心去除反应液后，加入100ul洗脱反应液，轻轻吹打几次，去除洗脱反应液

b.自发光酶1结合：加入100ul自发光酶反应液1，在35℃的条件下，孵育30min，使SA-gluc(M2)-glow结合到dNTP-生物素上，去除反应液，加入洗脱液，轻轻吹打几次，去除洗脱液；

c.自发光酶2结合：加入100ul抗体反应液，35℃下，孵育3min，使抗-地高辛-s-s-生物素结合到dNTP-地高辛上，去除反应液，加入200ul抗体洗脱液，轻轻吹打几次，去除抗体洗脱液；加入自发光酶2反应液100ul，35℃反应2min，使SA-gluc(8990)-flash通过结合抗-地高辛-s-s-生物素结合到dNTP-地高辛上，去除反应液；加入200ul洗脱液，轻轻吹打几次，去除洗脱液；

d.自发光检测：设置酶标仪参数，加入底物发光液，检测自发光曲线；根据信号曲线图，读取相应碱基；

e.切除；去掉自发光反应液，加入200ul洗脱缓冲液，轻轻吹打几次后，去掉洗脱缓冲液，加入100ul切除反应液，55℃，反应3min后，去除切除反应液；加入200ul洗脱缓冲液清洗，重复清洗三次；

f.重复a-e步骤，进行下个循环测序；

(4)测序结果

a.10bp测序信号曲线如图3和图4所示：

b.测序结果分析：

比较所有循环的信号变化曲线，如下图所示，根据每个循环信号下降的形式可以判断出：

核苷酸A:循环1,循环4,循环5,循环8；

核苷酸T:循环2,循环7

核苷酸C:循环3,循环6,循环9

核苷酸G:循环10

与待测文库前10bp的碱基序列：TACAACTACG匹配。

Claims (18)

1.一种用于确定靶单链多核苷酸的序列的方法，其包括：

(1)将核苷酸掺入到靶单链多核苷酸的互补链上；

(2)将所述核苷酸各自附接至不同的化学发光标记物；

(3)检测所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学：

A)若发光动力学为第一发光动力学，则将所述核苷酸鉴定为第一核苷酸，

B)若发光动力学为第二发光动力学，则将所述核苷酸鉴定为第二核苷酸，

C)若发光动力学为第三发光动力学，则将所述核苷酸鉴定为第三核苷酸，

D)若无发光动力学，则将所述核苷酸鉴定为第四核苷酸，

其中，发光动力学是所述化学发光反应发出的光的强度随时间的变化特征谱，且所述第一发光动力学的变化特征谱、所述第二发光动力学的变化特征谱和所述第三发光动力学的变化特征谱互不相同；

(4)基于发光动力学来鉴别每个掺入的核苷酸的类型。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述第一核苷酸附接至第一化学发光标记物，所述第一化学发光标记物引发第一发光动力学；

所述第二核苷酸附接至第二化学发光标记物，所述第二化学发光标记物引发第二发光动力学；

所述第三核苷酸附接至第三化学发光标记物，所述第三化学发光标记物引发第三发光动力学；

所述第四种核苷酸不附接化学发光标记物。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述第一核苷酸附接至第一化学发光标记物，所述第一化学发光标记物引发第一发光动力学；

所述第二核苷酸附接至第二化学发光标记物，所述第二化学发光标记物引发第二发光动力学；

所述第三种核苷酸附接至所述第一化学发光标记物和所述第二化学发光标记物两者，附接所述第一化学发光标记物和所述第二化学发光标记物两者引发第三发光动力学；

所述第四种核苷酸不附接化学发光标记物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述第一发光动力学为闪光类型，所述第二发光动力学为辉光类型，第三发光动力学为混合类型。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述核苷酸与所述化学发光标记物之间的附接包括通过亲和相互作用介导的附接。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述亲和相互作用包括抗原-抗体相互作用和生物素-亲和素相互作用。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：

(5)修饰或除去掺入的核苷酸的保护基团以便暴露3’-OH基团，其中所述核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的所述保护基团。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其进一步包括：

(6)除去掺入的核苷酸附接的化学发光标记物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述化学发光标记物和所述保护基团同时被除去。

10.根据权利要求8或9所述的方法，任选重复步骤(1)-(6)一次或多次，以便测定靶单链多核苷酸的序列。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述化学发光标记物参与的化学发光反应的发光动力学的检测包括使所述化学发光标记物与合适的底物接触以触发化学发光反应，和检测由此发出的光的发光动力学，其中

所述化学发光标记物选自引发不同发光动力学的生物化学发光标记物及其任意组合，或

所述化学发光标记物选自引发不同发光动力学的荧光素酶及其任意组合，或

所述化学发光标记物是引发不同发光动力学的两种荧光素酶的组合。

12.根据权利要求2所述的方法，在所述核苷酸中，第一种核苷酸附接至第一荧光素酶，第二种核苷酸附接至第二荧光素酶，第三种核苷酸附接至第一荧光素酶和第二荧光素酶两者，第四种核苷酸不附接至荧光素酶。

13.根据权利要求5所述的方法，其中通过将化学发光标记物连接至参与亲和相互作用的成员之一，并将核苷酸连接至参与亲和相互作用的另一成员，从而通过所述成员之间的亲和相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸，或

其中与核苷酸连接的成员是生物素，与化学发光标记物连接的成员是亲和素，或

其中与核苷酸连接的成员是地高辛，与化学发光标记物连接的成员是抗地高辛抗体，或

其中与核苷酸连接的成员是地高辛，与化学发光标记物连接的成员是亲和素，其中地高辛与亲和素通过与生物素连接的抗地高辛抗体亲和结合。

14.一种用于确定靶单链多核苷酸的序列的试剂盒，其包含：

(1)靶单链多核苷酸，

(2)选自核苷酸A、G、C和T或U的一种或多种核苷酸，

(3)化学发光标记物，

其中，所述核苷酸各自附接至不同的化学发光标记物，与每种类型的核苷酸附接的化学发光标记物在检测时表现出与其他类型的核苷酸所附接的化学发光标记物不同的发光动力学；

其中，发光动力学是所述化学发光反应发出的光的强度随时间的变化特征谱；

其中，所述第一核苷酸附接至第一化学发光标记物，所述第二核苷酸附接至第二化学发光标记物，所述第三核苷酸附接至第三化学发光标记物，所述第四种核苷酸不附接化学发光标记物。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中通过抗原-抗体或生物素-亲和素的亲和相互作用将化学发光标记物附接至核苷酸。

16.根据权利要求14所述的试剂盒，所述靶单链多核苷酸固定在固体支持物上。

17.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述核苷酸各自的核糖或脱氧核糖部分包含通过2’或3’氧原子附接的保护基团。

18.根据权利要求14所述的试剂盒，其包括以下至少一种：

(4)酶和适合所述酶起作用的缓冲液；

(5)与所述化学发光标记物反应的合适的底物；

(6)切除反应液，其去除化学发光标记物，和/或修饰或除去保护基团以便暴露3’-OH基团。