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CN119744265A - 用于控制鞘翅目昆虫的组合物和方法 - Google Patents

用于控制鞘翅目昆虫的组合物和方法 Download PDF

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CN119744265A
CN119744265A CN202380061202.4A CN202380061202A CN119744265A CN 119744265 A CN119744265 A CN 119744265A CN 202380061202 A CN202380061202 A CN 202380061202A CN 119744265 A CN119744265 A CN 119744265A
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plant
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samsoniacrw
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Syngenta Crop Protection AG Switzerland
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Abstract

披露了针对鞘翅目有害生物具有活性的新型杀有害生物多肽。还提供了编码新型杀昆虫蛋白的核酸分子。编码这些杀有害生物多肽的核苷酸序列可以用于转化原核和真核生物体以表达这些杀昆虫蛋白。还披露了制备这些杀昆虫蛋白的方法以及使用这些杀昆虫蛋白例如在转基因植物中赋予免于昆虫损害的保护的方法。

Description

用于控制鞘翅目昆虫的组合物和方法
关于序列表的电子提交的声明
提供XML格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.§1.831(a)提交的，名称为“82735-SamsoniaCRW_序列表_ST26”，大小为约239千字节，于2023年8月1日生成并经由EFS-Web提交。此序列表在此通过引用以其披露内容特此并入本说明书中。
技术领域
本披露涉及具有杀昆虫活性的新型杀有害生物蛋白、编码这些杀有害生物蛋白且其表达产生这些杀有害生物蛋白的核酸分子、以及用于控制作物植物的农业相关有害生物的组合物和方法。
背景技术
昆虫是引起作物损失的一个主要原因。众多商业上有价值的植物(包括普通的农作物)易受植物有害生物(包括昆虫和线虫)攻击的影响，导致作物产量和品质大幅降低。例如，植物有害生物是导致全世界重要农作物损失的主要因素。昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商也是负担，并且它们也给家庭花匠带来了困扰。
玉米根虫的多个物种被认为是最具破坏性的玉米有害生物。在美国，三个重要的物种是玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera，又称西方玉米根虫)、长角巴氏根萤叶甲(D.longicornis barberi，又称北方玉米根虫)、十一星根萤叶甲(D.undecimpunctata howardi，又称南方玉米根虫)。在美国玉米带中，只有西方和北方玉米根虫被认为是主要的玉米有害生物。另外，美国南部的一种重要的玉米根虫有害生物是墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae))。玉米根虫幼虫通过几乎专一摄食玉米根而造成实质性的植物损害。已显示这种损伤增加了植物倒伏、减少了谷物产量以及营养产量连同改变了谷物的营养物含量。幼虫摄食还通过为潜在地导致根腐病和茎腐病的细菌和真菌感染打开了进入根部的途径，而对玉米造成了间接的影响。成年玉米根虫在晚夏时活跃在玉米地中，在此它们摄食穗、穗丝以及花粉，由此干扰了正常的授粉。
玉米根虫主要是通过密集施用化学杀有害生物剂而得到控制的，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、预防昆虫摄食或繁殖、或者死亡而具有活性。因此，可以达到良好的玉米根虫控制，但并非没有一些低效现象。在一些情况下，这些化学品的应用会影响其他有益生物体。另外，化学杀有害生物剂的广泛使用会导致抗性昆虫品种的发展。最后，玉米根虫幼虫的地下进食偏好使得难以应用杀昆虫剂的挽救处理。因此，大多数杀昆虫剂应用是在种植时预防性地进行，这导致了很大的环境负担。通过各种农田管理实践已部分地改善了这种状况，但对替代性有害生物控制的机制存在着不断增加的需求。
生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素像δ-内毒素(Δ-内毒素；也被称为结晶毒素或Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)菌株，也已经施用至作物植物中，产生了针对昆虫有害生物的令人满意的结果。δ-内毒素是包含在晶体基质中的蛋白质，已知当被某些目和物种的植物有害生物(包括昆虫)摄入时具有杀昆虫活性，但对植物和其他非靶标生物体无害。来自苏云金芽孢杆菌的几种天然Cry蛋白或工程化Cry蛋白已经在转基因作物植物中表达以控制某些鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物，作为化学杀有害生物剂的替代或补充。自2003年以来，控制玉米根虫的转基因玉米杂交种已在美国市售，并表达毒素，例如Cry3Bb1、Cry34Ab1/Cry35Ab1、经修饰的Cry3A(mCry3A)或Cry3Ab(eCry3.1Ab)。
尽管已经显示使用表达Cry蛋白的转基因植物非常有效，但现在针对某些转基因植物中表达的Cry蛋白具有抗性的昆虫有害生物是已知的。因此，仍需要鉴定新型且有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济益处并且是环境可接受的。特别需要的是对根萤叶甲属(Diabrotica)物种(一种主要的玉米有害生物)有毒的蛋白质，与现有昆虫控制产品相比这些蛋白质具有不同的作用方式，以缓和抗性发展。此外，通过这些使环境负担最小化的产品(如通过转基因植物)递送昆虫控制剂是令人希望的。
发明内容
本披露提供了针对至少一种鞘翅目有害生物，例如针对玉米根虫(WCR，玉米根萤叶甲)具有杀昆虫性的多肽，以及这样的多肽和相关核酸在组合物和方法中的用途，例如在植物中或在控制鞘翅目有害生物的方法中的用途。
因此，在一些方面，提供了多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％)同一性。在一些实施例中，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少99％(例如，至少99.5％)同一性。本披露的另外的方面包括多肽，该多肽包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:5-23中的任一个、或SEQ ID NO:71-117中的任一个。在一些实施例中，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)同一性，并且包括在与SEQ ID NO:1的I52、S53、I67、I72、I80、V83、A85、I95、I123、S125、I153、I175、I207、I237、D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241对应的一个或多个位置处的一个或多个取代突变(例如，保守氨基酸取代、丙氨酸取代或亮氨酸取代)。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是在与SEQ ID NO:1的I52、S53、I67、I72、I80、V83、A85、I95、I123、S125、I153、I175、I207或I237中的任何一个或多个对应的一个或多个位置处的一个或多个亮氨酸取代。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是I52L和I180L、I152L和S53L、或I52L和S53L和I80L。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是在与SEQ ID NO:1的D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241中的任何一个或多个对应的一个或多个位置处的一个或多个保守氨基酸或丙氨酸取代。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是在与SEQ ID NO:1的D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241中的任何一个或多个对应的一个或多个位置处的一个或多个丙氨酸取代。在一些实施例中，该多肽在与SEQ ID NO:1的W16、F36、T51L、W105、F122、L127、Y131和S139中的一个或多个对应的一个或多个位置处不包含取代突变。在一些实施例中，提供了与SEQ ID NO:24-26中任一个具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的多肽。在一些实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:24-26中的任一个。在一些实施例中，该多肽针对鞘翅目有害生物具有杀昆虫性。在一些实施例中，该多肽针对根萤叶甲属有害生物(例如，玉米根萤叶甲)具有杀昆虫性。
本披露还提供了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的氨基酸序列，并且对鞘翅目有害生物(例如，根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫(玉米根萤叶甲))有毒性。本披露还涵盖了多肽，该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且对鞘翅目有害生物(例如，根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫(玉米根萤叶甲))有毒性，其中该多肽衍生自Samsonia细菌。本披露的另外的方面包括多肽，该多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或通过保守取代、缺失和/或添加1-5个氨基酸而与SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同，其中该多肽对鞘翅目有害生物(例如，根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫)有毒性。在一些实施例中，该多肽由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5-23中的任一个或SEQ ID NO:71-117中的任一个组成。
本披露的另一方面是核酸分子，该核酸分子包含编码任何上述实施例的多肽的编码序列。在一些实施例中，该编码序列包含与SEQ ID NO:2-4、27-45、49-67或118-164中的任一个具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列或包含SEQ ID NO:2-4、27-45、49-67或118-164中的任一个。在一些实施例中，该编码序列包含与SEQ ID NO:4或49-67中的任一个具有至少80％(例如，至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的核苷酸序列或包含SEQ ID NO:4或49-67中的任一个。在一些实施例中，该编码序列被密码子优化用于在植物(例如，在玉蜀黍植物)中表达。在一些实施例中，该编码序列可操作地连接至异源启动子，例如，植物可表达型异源启动子。
本披露的仍另外的方面是包含任何所述核酸分子的载体以及包含任何所述多肽或任何所述核酸分子的转基因宿主细胞。在一些实施例中，该转基因宿主细胞是植物细胞，如单子叶植物细胞，例如，玉蜀黍细胞。在一些实施例中，该转基因宿主细胞是细菌细胞，如农杆菌属(Agrobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)或大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
本披露的另外的方面是包含任何所述多肽的组合物，任选地进一步包含农业上可接受的运载体。本披露的仍另外的方面是包含任何所述多肽或包含任何所述核酸分子的植物。本披露考虑了这些植物是单子叶植物并且这些植物是玉蜀黍植物。本披露的另外的方面是任何所述植物的种子以及任何所述植物的细胞。
本披露还提供产生转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：将任何所述核酸分子引入植物细胞中，选择包含该核酸分子的植物细胞；以及从所选择的植物细胞再生植物。还提供了用于产生具有增强的杀昆虫特性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中该第一或第二亲本植物是包含本披露的多肽或核酸分子，以及选择具有增强的杀昆虫特性的第一代子代植物，其中所选择的子代植物包含该核酸分子。在一些实施例中，该方法进一步包括使该第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；以及从第二代子代植物中选择具有增强的杀昆虫特性的植物，其中所选择的第二代子代植物包含核酸分子。
本披露还涉及控制鞘翅目有害生物的方法，这些方法包括将任何所述多肽递送至有害生物或其环境，例如在植物或组合物中。在一些实施例中，该鞘翅目有害生物是根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)。在一些实施例中，该多肽是通过摄食(例如有害生物对包含所述多肽的植物部分进行摄食)来递送的。本披露还考虑了SEQ ID NO:1至164中的任一个的序列在生物信息学分析中鉴定杀昆虫蛋白的用途以及包含SEQ ID NO:1、5-26或71-117中的任一个的氨基酸序列的多肽在昆虫生物测定中鉴定杀昆虫蛋白的用途(例如针对鞘翅目有害生物，例如根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)具有杀昆虫性)。
对序列表中的序列的简述
SEQ ID NO:1是在Samsonia erythrinae中鉴定的SamsoniaCRW氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是SamsoniaCRW的天然核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是SamsoniaCRW的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是SamsoniaCRW的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是SamsoniaCRW T51L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是SamsoniaCRW I52L的氨基酸序列
SEQ ID NO:7是SamsoniaCRW S53L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8是SamsoniaCRW I67L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是SamsoniaCRW I72L的氨基酸序列
SEQ ID NO:10是SamsoniaCRW I80L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是SamsoniaCRW V83L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是SamsoniaCRW A85L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13是SamsoniaCRW I95L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是SamsoniaCRW I123L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是SamsoniaCRW S125L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16是SamsoniaCRW I153L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是SamsoniaCRW I175L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是SamsoniaCRW I207L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:19是SamsoniaCRW I237L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是SamsoniaCRW 152L/180L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:21是SamsoniaCRW T51L/I52L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22是SamsoniaCRW I52L/S53L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23是SamsoniaCRW T51L/I52L/S53L的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是MGYP000214679871(SamsoniaCRW直系同源物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25是MGYP000317625865(SamsoniaCRW直系同源物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26是MGYP000301824029(SamsoniaCRW直系同源物)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是SamsoniaCRW T51L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:28是SamsoniaCRW I52L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:29是SamsoniaCRW S53L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是SamsoniaCRW I67L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是SamsoniaCRW I72L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是SamsoniaCRW I80L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:33是SamsoniaCRW V83L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:34是SamsoniaCRW A85L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:35是SamsoniaCRW I95L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:36是SamsoniaCRW I123L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:37是SamsoniaCRW S125L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:38是SamsoniaCRW I153L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:39是SamsoniaCRW I175L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:40是SamsoniaCRW I207L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:41是SamsoniaCRW I237L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:42是SamsoniaCRW I52L/I80L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:43是SamsoniaCRW T51L/I52L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:44是SamsoniaCRW I52L/S53L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:45是SamsoniaCRW T51L/I52L/S53L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:46是MGYP000214679871(SamsoniaCRW直系同源物)的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:47是MGYP000317625865(SamsoniaCRW直系同源物)的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:48是MGYP000301824029(SamsoniaCRW直系同源物)的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:49是SamsoniaCRW T51L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:50是SamsoniaCRW I52L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:51是SamsoniaCRW S53L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:52是SamsoniaCRW I67L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:53是SamsoniaCRW I72L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:54是SamsoniaCRW I80L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:55是SamsoniaCRW V83L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:56是SamsoniaCRW A85L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:57是SamsoniaCRW I95L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:58是SamsoniaCRW I123L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:59是SamsoniaCRW S125L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:60是SamsoniaCRW I153L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:61是SamsoniaCRW I175L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列
SEQ ID NO:62是SamsoniaCRW I207L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:63是SamsoniaCRW I237L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:64是SamsoniaCRW I52L/I80L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:65是SamsoniaCRW T51L/I52L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:66是SamsoniaCRW I52L/S53L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:67是SamsoniaCRW T51L/I52L/S53L的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:68是MGYP000214679871(SamsoniaCRW直系同源物)的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:69是MGYP000317625865(SamsoniaCRW直系同源物)的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:70是MGYP000301824029(SamsoniaCRW直系同源物)的玉蜀黍密码子优化的核苷酸序列。
SEQ ID NO:71是SamsoniaCRW D7A的氨基酸序列
SEQ ID NO:72是SamsoniaCRW T9A的氨基酸序列
SEQ ID NO:73是SamsoniaCRW T11A的氨基酸序列
SEQ ID NO:74是SamsoniaCRW W16A的氨基酸序列
SEQ ID NO:75是SamsoniaCRW E27A的氨基酸序列
SEQ ID NO:76是SamsoniaCRW S28A的氨基酸序列
SEQ ID NO:77是SamsoniaCRW S29A的氨基酸序列
SEQ ID NO:78是SamsoniaCRW M30A的氨基酸序列
SEQ ID NO:79是SamsoniaCRW K31A的氨基酸序列
SEQ ID NO:80是SamsoniaCRW T32A的氨基酸序列
SEQ ID NO:81是SamsoniaCRW H33A的氨基酸序列
SEQ ID NO:82是SamsoniaCRW R34A的氨基酸序列
SEQ ID NO:83是SamsoniaCRW L35A的氨基酸序列
SEQ ID NO:84是SamsoniaCRW F36A的氨基酸序列
SEQ ID NO:85是SamsoniaCRW V37A的氨基酸序列
SEQ ID NO:86是SamsoniaCRW L38A的氨基酸序列
SEQ ID NO:87是SamsoniaCRW S39A的氨基酸序列
SEQ ID NO:88是SamsoniaCRW V83A的氨基酸序列
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SEQ ID NO:164是SamsoniaCRW I52L/S53L/I80L的大肠杆菌密码子优化的核苷酸序列
具体实施方式
该说明书并非旨在成为可以实现本披露的所有不同方式的详细目录或者可以被添加至本披露的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以并入其他实施例中，并且关于一个特定实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本披露考虑了在一些实施例中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征的组合。此外，鉴于本披露内容，本文建议的各种实施例的众多变化和添加对于本领域技术人员是显而易见的，这不脱离本披露。因此，以下描述旨在说明本披露的一些特别的实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文披露的说明中使用的术语是仅出于描述特定实施例的目的，且并不旨在限制本披露。
本文引用的所有的公开、专利申请、专利以及其他参考文件对于引用中提及的有关句子和/或段落的传授内容通过引用以其全文并入。
本文提供的核苷酸序列以5'至3'方向从左至右表示，并且使用代表核苷酸碱基的标准代码表示，如37CFR§§1.821-1.825和世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25中所示，例如：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、以及鸟嘌呤(G)。
氨基酸同样是使用WIPO标准ST.25来指示，例如：丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；1)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、以及缬氨酸(Val；V)。
除非上下文另外指示，明确地预期的是本文所述的本披露的不同特征可以按任何组合使用。而且，本披露还考虑到在本披露的一些实施例中，本文陈述的任何特征或特征的组合可以被排除或省略。举例说明，如果本说明书陈述组合物包含组分A、B和C，明确地预期A、B或C的任何一种或其组合可单一地或以任何组合被省略和放弃。
定义
为了清晰起见，定义了在本说明书中所使用的某些术语并且将其呈现如下：
如本文和所附权利要求所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物，除非上下文另外明确地指示。因此，例如，提及“一种植物”是提及一种或多种植物并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。
如本文所使用的，除非上下文另有明确指示，否则“或”一词还涵盖“和/或”。
术语“约”本文用于意指大约、大致、近似或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐述的数值来限定这个范围。一般而言，术语“约”本文用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本披露的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，精确值(即，无“约”)是优选的。
除非上下文另外指示，否则如本文所使用的，例如“在约X和Y之间”、“在约X和约Y之间”、“从X至Y”和“从约X至约Y”(以及类似短语)的短语应被解释为包括X和Y。单位、前缀以及符号可以其SI公认的形式来表示。除非另外指示，否则核酸以5′至3′方向从左到右书写；氨基酸序列分别以N末端至C末端方向从左到右书写。氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可由其普遍接受的单字母代码来提及。
本披露的杀昆虫蛋白的“活性”意指杀昆虫蛋白作为口服活性昆虫控制剂发挥作用、具有毒性作用(例如抑制昆虫有害生物存活、生长和/或繁殖的能力)、和/或能够干扰或阻止昆虫摄食，这可能引起或者可能不引起昆虫的死亡。当本披露的杀昆虫蛋白被递送至昆虫时，这种结果典型地是该昆虫的死亡，或者该昆虫不以该杀昆虫蛋白可被该昆虫可用的来源为食。“杀有害生物”被定义为有毒的生物活性，其能够控制有害生物(如昆虫、线虫、真菌、细菌或病毒)，优选地通过杀死或破坏它们来进行控制。“杀昆虫”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫，优选地通过杀死它们来进行控制。“杀有害生物剂”是具有杀有害生物活性的药剂。“杀昆虫剂”是具有杀昆虫活性的药剂。
“编码序列”是核酸序列，其转录成RNA(如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正义RNA或反义RNA)，然后优选在生物体中翻译以产生蛋白质。
如本文所使用的，“密码子优化的”序列意指如下核苷酸序列，其中密码子被选择以反映宿主细胞或生物体可以具有的特定密码子偏好性。这典型地是以这样一种方式来完成，该方式是为了保持由待优化的核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列。在某些实施例中，重组DNA构建体的DNA序列包括已经针对该构建体有待在其中进行表达的细胞(例如，动物细胞、植物细胞、或真菌细胞)进行了密码子优化的序列。例如，有待在植物细胞中表达的构建体可以使其全部或部分序列(例如，第一基因抑制元件或基因表达元件)进行密码子优化用于在植物中表达。参见例如，美国专利号6,121,014，将其通过引用并入本文。在实施例中，本披露的多核苷酸被密码子优化用于在植物细胞(例如，双子叶植物细胞或单子叶植物细胞)或细菌细胞中表达。
“控制”昆虫意指通过毒性作用抑制昆虫有害生物存活、生长、摄食、和/或繁殖的能力，和/或限制与昆虫有关的作物植物损害或损失，和/或保护在昆虫有害生物存在下生长时的作物的产量潜力。“控制”昆虫可以是或可以不是意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。在本披露的一些实施例中，“控制”昆虫意味着杀死昆虫。
术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”以及其词形变化意指“包括但不限于”。这些术语指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、或组分的存在但并不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、或其组的存在或添加。术语“由其组成”意指“包括并且限于”。
如本文所使用的，过渡短语“基本上由……组成”(以及语法变体)意指，权利要求书的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要求的披露的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，当用于本披露的权利要求中时，术语“基本上由……组成”并不旨在被解读为等同于“包含(comprising)”。
在本披露的上下文中，“对应于(corresponding to或corresponds to)”意指当将参考序列的氨基酸序列与不同于参考序列的第二氨基酸序列(例如，变体序列或同源序列)比对时，“对应于”该第二氨基酸序列中某些枚举的位置的氨基酸是与参考氨基酸序列中的这些位置比对的那些，但是不一定在相对于本披露的特定参考氨基酸序列而言的这些精确的数字位置中。
“递送(deliver或delivering)”组合物或杀昆虫蛋白意指该组合物或杀昆虫蛋白与昆虫接触，这促进该组合物或杀昆虫蛋白的经口摄取，从而产生对昆虫的毒性作用和控制。组合物或杀昆虫蛋白可以按照许多公认的方式进行递送，例如，通过表达该杀昆虫蛋白的转基因植物、一种或多种配制的蛋白组合物、一种或多种可喷洒的蛋白组合物、诱饵基质、或领域公认的任何其他的毒素递送系统。
术语“结构域”是指沿着进化相关蛋白的序列的比对在特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置上的氨基酸可在同系物之间有所不同，但是在特定位置处高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能中很可能是必需的氨基酸。通过其在蛋白同系物家族的经比对序列中的高度保守性进行鉴别，其可用作鉴别物(identifier)，用来确定所讨论的任何多肽是否属于先前鉴别的多肽组。
本披露的“工程化”蛋白质是指与至少一种相应的亲本蛋白质相比在至少一个氨基酸位置处具有不同序列的蛋白质。工程化蛋白质可以是突变蛋白质，其包含例如相对于亲本蛋白质的一种或多种修饰，如一个或多个氨基酸位置的缺失、添加和/或取代。工程化蛋白质可以是嵌合蛋白质，并且包含例如来自至少两种亲本蛋白质的一个或多个交换或改组的结构域或片段。
“有效昆虫控制量”意指杀昆虫蛋白的浓度，其通过毒性作用抑制昆虫存活、生长、摄食和/或繁殖的能力，或限制昆虫相关的损害或作物植物损失。“有效昆虫控制量”可以意指或可以不意指杀死昆虫，尽管其优选意指杀死昆虫。具有“增强的杀昆虫特性”的转基因植物是以有效昆虫控制量表达一种或多种蛋白质的植物，所以在一些实施例中，相对于未经转化的相同种类的植物，该植物对扩大范围的昆虫物种具有杀昆虫性。这种扩大范围的昆虫物种包括昆虫植物有害生物，例如鞘翅目昆虫有害生物，例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)。
术语“事件”是指包含异源DNA的原始转化体和/或该转化体的子代。术语“事件”也是指通过该转化体和另一种玉蜀黍品系之间进行有性远交(outcross)而产生的子代。即使在与轮回亲本重复回交后，来自转化亲本的插入DNA和侧翼DNA存在于杂交子代的相同染色体位置。该术语“事件”也是指来自包含插入的DNA和与插入的DNA紧邻的侧接基因组序列的原始转化体的DNA，将期待其转移到因包含插入的DNA的一个亲本株系(例如原始转化体和由自体授精产生的子代)与不含该插入的DNA的一个亲本株系的有性杂交而产生的一个子代中。典型地，植物组织的转化产生多个事件，每个上述事件代表DNA构建体插入至植物细胞的基因组中的不同位置中。
如本文所使用的，“表达盒”意指能够在适当的宿主细胞中指导特定的核苷酸序列的表达的核酸序列，包含可操作地连接至目的核苷酸序列的启动子，该目的核苷酸序列可操作地连接至终止信号。它还典型地包含核苷酸序列的适当翻译所需的序列。包含目的核苷酸序列的表达盒可能具有其组分中的至少一种，该组分相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。表达盒还可以是天然存在的但已经以用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，典型地，表达盒相对于宿主而言是异源的，即表达盒的特定核酸序列不是天然存在于宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到宿主细胞或宿主细胞的祖先中。核苷酸序列在表达盒中的表达可以在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，该启动子只在宿主细胞暴露于一些特定的外界刺激时才启动转录。在多细胞生物体(如植物)的情况下，启动子对于特定组织、或器官、或者发育阶段也可以是特异的。
包含目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种而言是异源的。表达盒也可以是包含驱动其天然基因的天然启动子的表达盒；然而，它已经以可用于异源表达的重组形式获得。表达盒的这样的使用使它在其被引入的细胞中不是如此天然存在的。
表达盒还可以任选地包括在植物中发挥作用的转录和/或翻译终止区(即，终止区)。多种转录终止子是可供用于在表达盒中使用的并且负责在超出目的异源核苷酸序列时的转录终止以及正确的mRNA聚腺苷酸化。终止区对于转录起始区可以是天然的，对于可操作地连接的目的核苷酸序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可以是衍生自另一种来源(即，对于启动子、目的核苷酸序列、植物宿主、或其任何组合而言是外来的或异源的)。适当的转录终止子包括但不限于CAMV 35S终止子、tml终止子、胭脂碱合酶终止子和/或豌豆rbcs E9终止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物两者中使用。此外，可以使用编码序列的天然转录终止子。任何已知在植物中发挥作用的可供使用的终止子均可以在本披露的上下文中使用。
当参考多核苷酸(如植物的基因、ORF或其部分、或转基因)使用时，术语“表达”是指通过基因的“转录”(即经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化为RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并在适用的情况下(例如，如果基因编码蛋白质)通过mRNA的“翻译”转化为蛋白质的过程。基因表达可以在该方法的许多阶段进行调节。例如，分别在反义构建体或dsRNA构建体的情况下，表达可仅指反义RNA的转录或仅指dsRNA的转录。在实施例中，“表达”是指正义(mRNA)或功能性RNA的转录和稳定累积。“表达”还可指蛋白质的产生。
“基因”是位于基因组内并且包含编码核酸序列的限定区域，并且典型地还包含其他负责控制该编码部分表达(也就是转录和翻译)的主要调控核酸。基因还可以包含其他5'和3'未翻译序列和终止序列。另外的可能存在的元件是例如内含子。如在自然界中所发现，基因的调控核酸序列在正常情况下可能不与相关联的核酸序列进行可操作地连接，并因此不会是嵌合基因。
当提及基因或多核苷酸或多肽使用时，术语“异源”是指基因或多核苷酸或多肽不是在其天然环境中或含有其非天然环境中存在的一部分(即，已经通过人工改变)。例如，异源基因可以包括自一个物种引入到另一个物种的多核苷酸。异源基因还可以包括对生物体来说是天然的多核苷酸，该多核苷酸已经以一些方式(例如，经突变；以多个拷贝添加；连接至非天然启动子或增强子多核苷酸等)被改变。异源基因可以进一步包括植物基因多核苷酸，该植物基因多核苷酸包括植物基因的cDNA形式；cDNA可以以正义方向(以产生mRNA)或反义方向(以产生与mRNA转录物互补的反义RNA转录物)被表达。在本披露的一个方面，异源基因与内源植物基因的区别在于，异源基因多核苷酸典型地与包含调控元件如启动子的多核苷酸接合，未发现这些多核苷酸与异源基因编码的蛋白质的基因或与染色体中的植物基因多核苷酸天然地相关联，或者这些多核苷酸与在自然界中未发现的染色体的部分(例如，在通常不表达基因的基因座中表达的基因)相关联。另外，“异源”多核苷酸是指不与多核苷酸被引入其中的宿主细胞天然地相关联的多核苷酸，包括天然存在的多核苷酸的非天然存在的多个拷贝。异源核酸序列或核酸分子可以包含嵌合序列，如嵌合表达盒，在该表达盒中，启动子和编码区衍生自多源生物体。启动子序列可以是组成型启动子序列、组织特异性启动子序列、化学诱导型启动子序列、伤口诱导型启动子序列、胁迫诱导型启动子序列、或发育阶段特异性启动子序列。
“同源”核酸序列是与其被引入的宿主细胞天然相关联的核酸序列。
如本文所使用的，术语“增加(increase、increasing、increased)”、“增强(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)”和类似术语描述了在控制植物有害生物方面的升高，例如通过使植物与本披露的多肽接触(如例如，通过转基因表达或通过局部应用方法)。控制的增加可以参考在本披露多肽不存在的情况下植物有害生物的控制水平(例如，不是转基因表达多肽或不是用多肽局部处理的植物)。因此，在实施例中，术语“增加(increase、increasing、increased)”、“增强(enhance、enhanced、enhancing和enhancement)”和类似术语可以指示如与适合的对照(例如，不与本披露的多肽接触的植物、植物部分、植物细胞)相比，至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的升高。
在两个核酸或氨基酸序列的情况下，术语“同一性”或“相同的”是指在全面比对两个序列时，如与测试(“受试”)序列相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或氨基酸序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。除非另有陈述，否则如本文所使用的序列同一性是指如下获得的值：使用在EMBOSS Needle比对工具中实现的Needleman和Wunsch算法((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)，使用默认矩阵文件EBLOSUM62(用于蛋白质)和默认参数(空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5)或DNAfull(用于核酸)和默认参数(空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，末端空位延伸＝0.5)；或其任何等效程序。EMBOSS Needle可例如从EMBL-EBI获得，例如在以下网站：ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/并且如在以下出版物中所述：“The EMBL-EBI search and sequence analysistools APIs in 2019.[2019年EMBL-EBI搜索和序列分析工具API]”Madeira等人NucleicAcids Research[核酸研究],2019年6月,47(W1):W636-W641。如本文所使用的，术语“等效程序”是指任何序列比较程序，对于任两个所讨论序列，在与通过EMBOSS Needle生成的相应比对相比时，该程序生成具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。在一些实施例中，基本上相同的核酸或氨基酸序列可以发挥基本上相同的功能。
如本文所使用的，“杀昆虫”被定义为有毒的生物活性，其能够控制昆虫有害生物，任选地但优选地通过杀死它们来控制。
在一些实施例中，本披露的多核苷酸或多肽是“分离的”。术语“分离的”多核苷酸或多肽是不再存在于其天然环境中的多核苷酸或多肽。本披露的分离的多核苷酸或多肽可以以纯化的形式存在，或者可以存在于重组宿主中，如转基因细菌或转基因植物中。因此，例如，对“分离的”多核苷酸或多肽的要求涵盖当核酸分子包含在转基因植物基因组内时的核酸分子。
当在本披露的核酸分子或多核苷酸的上下文中使用时，术语“分离的”是指在相应源生物体内的染色体多核苷酸上下文中识别并分离/分开的多核苷酸。如果分离的核酸或多核苷酸确实具有天然存在的对应物则其分离的核酸或多核苷酸不是其在其天然环境中存在的核酸。相比之下，非分离的核酸是核酸(如DNA和RNA)，它们是在自然界存在的状态下发现的。例如，在相邻基因附近的宿主细胞染色体上发现给定的多核苷酸(例如，基因)。分离的核酸分子可以单链或双链形式存在。可替代地，其可以包含正义链和反义链(即，核酸分子可以是双链的)。在一些实施例中，本披露的核酸分子是分离的。
术语“基序”或“共有序列”或“特征(signature)”是指进化相关蛋白的序列中的短保守区。基序常常是结构域的高度保守部分，但是也可只包括结构域的一部分，或位于保守结构域外部(如果基序的所有氨基酸位于所限定结构域的外部)。
“天然”或“野生型”核酸、多核苷酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列是指天然存在的或内源性的核酸、多核苷酸、核苷酸序列、多肽或氨基酸序列。
“核酸分子”或“核酸”是单链、双链或部分双链DNA或RNA、或其杂交体的区段，该区段可以从任何来源分离或合成。在本披露的上下文中，核酸分子典型地是DNA的区段。在一些实施例中，本披露的核酸分子是分离的核酸分子。在一些实施例中，本披露的核酸分子包含在载体、植物、植物细胞或细菌细胞内。这些术语还包括指具有天然核糖核苷酸的必要性质的脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，它们具有该必要性质是因为它们在严格杂交条件下与天然存在的核苷酸相比杂交基本上相同的核苷酸序列，和/或允许与一种或多种天然存在的核苷酸相比翻译成一种或多种相同的氨基酸。核酸分子可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或子序列。除非另外指示，否则该术语包括指指定的序列以及其互补序列。因此，出于稳定性或其他原因而对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，仅举两个例子，包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是如该术语在本文使用的多核苷酸。应认识到，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。如本文使用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这些化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(尤其包括简单细胞以及复杂细胞)所特有的DNA和RNA的化学形式。
术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用。
“可操作地连接”是指在单一核酸分子上多核苷酸的关联，这样使得一者的功能影响另一者的功能。例如，当启动子能够影响编码多核苷酸的表达时(即，编码多核苷酸在启动子的转录控制下)，启动子与编码多核苷酸可操作地连接。正义方向或反义方向的编码多核苷酸能够与调控多核苷酸可操作地连接。
如本文所使用的，“杀有害生物”、“杀昆虫”等是指本披露的蛋白控制有害生物的能力或者可以控制有害生物的本披露的一种或多种蛋白的量。
术语“植物”包括指整株植物、植物器官、植物组织(例如叶、茎、根等)、种子以及植物细胞和其子代。如本文所使用的，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉以及小孢子中的细胞。可用于本披露方法的植物种类通常与适于转化技术的高等植物种类一样广泛，这些高等植物种类包括单子叶植物和双子叶植物两者，包括来自以下属的物种：南瓜属、蔷薇属、葡萄属、胡桃属、草莓属、莲属、苜蓿属、红豆草属、三叶草属、葫芦巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、芥菜属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、莨菪属、番茄属、烟草属、茄属、矮牵牛属、洋地黄属、墨角兰属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属、莴苣属、雀麦属(Bromus)、天门冬属、金鱼草属、西丽草属(Heterocallis)、涅墨属(Nemesis)、天竺葵属、黍属(Panieum)、狼尾草属、毛茛属、千里光属、蛾蝶花属、甜瓜属、蓝英花属(Browaalia)、大豆属、豌豆属、菜豆属、黑麦草属、稻属、燕麦属、大麦属、黑麦属、葱属和小麦属。尤其优选的植物是玉蜀黍。
“植物细胞”是植物的结构和生理单位，包含原生质体和细胞壁。植物细胞可以处于分离的单个细胞或培养细胞的形式，或者是作为较高级的组织单位(如例如，植物组织、植物器官、或整株植物)的一部分。
“植物细胞培养物”意指植物单元(如例如，原生质体、细胞培养物细胞、植物组织中的细胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、受精卵、以及处于不同发育阶段的胚)的培养物。
“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、切条、细胞或组织培养物、或植物的任何其他部分或产物。
“植物器官”是植物的独特而明显的已结构化并且分化的部分，如根、茎、叶、花芽或胚。
如本文所使用的，“植物材料”、“植物部分”或“植物组织”是指植物细胞、植物原生质体、植物可由其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织(plant calli)、植物丛(plant clump)、以及在植物或植物部分中完整的植物细胞，这些植物部分例如是胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、粒、穗、穗轴、外壳、茎、根、根尖、花药、块茎、根茎等。植物中或培养中的任何植物组织都包含在术语“植物组织”中。
如本文所使用的，“植物组织”意指组织化成结构和功能单元的一组植物细胞。包括植物中或培养中的任何植物组织。该术语包括但不限于全株植物、植物器官、植物种子、组织培养物以及被组织化成结构和/或功能单元的任何植物细胞群组。该术语与如以上列出的或由该定义以其他方式涵盖的任何特定类型的植物组织的联合应用或单独应用并不旨在排除任何其他类型的植物组织。
如本文所使用的“植物样品”或“生物样品”是指完整或不完整(例如研磨的种子或植物组织、切碎的植物组织、冻干的组织)的植物组织。它还可以是包含完整或不完整种子或植物组织的提取物。生物样品或提取物可以选自由以下组成的组：玉米粉、玉米面、玉米糖浆、玉米油、玉米淀粉，以及全部或部分地包含玉米副产物的制造的谷类食物。
“目的多核苷酸”或“目的核酸”是指任何多核苷酸，当其转移至生物体(例如，植物)中时赋予所述生物体所期望的特征，如昆虫抗性、疾病抗性、除草剂耐受性、抗生素抗性、改善的营养价值、工业过程中改善的性能、商业上有价值的酶或代谢物的生产、改变的繁殖能力等。
本披露多肽的“部分”或“片段”将理解为意指相对于本披露的参考氨基酸序列或核酸序列而言长度减少的氨基酸序列或核酸序列。根据本披露，在适宜的情况下，这样的部分或片段可以包括于它作为组分的较大多肽或核酸内(例如，标记的或融合蛋白或表达盒)。在实施例中，“部分”或“片段”基本上保留了活性如杀昆虫活性(例如，全长蛋白或核酸的杀昆虫活性(例如，至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或甚至100％的活性)，或者具有比全长蛋白更高的活性如杀昆虫活性。
术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在本文中可互换使用。
如本文所使用的，术语“启动子”是指通常位于编码序列翻译起始位点上游(5')的多核苷酸，其通过提供对正确转录所需的RNA聚合酶和其他因子的识别来控制编码序列的表达。例如，启动子可以含有包含被RNA聚合酶识别的基础启动子元件的区域、含有编码序列的5'非翻译区(UTR)的区域和任选地内含子。
如本文所使用的，术语“重组”是指核酸(例如，DNA或RNA)或蛋白质或生物体的如下形式，该形式通常不会在自然界中发现并且正因为如此通过人类干预来产生。如本文所使用的，“重组核酸分子”是包含多核苷酸组合的核酸分子，这些多核苷酸不会天然地共同存在并且是人类干预的结果，例如，由至少两种彼此异源的多核苷酸的组合组成的核酸分子，或人工合成的(例如，使用组装的核苷酸序列合成的多核苷酸)并且包含不同于通常存在于自然界中的多核苷酸的多核苷酸的核酸分子，或包含人工掺入至宿主细胞的基因组DNA中和该宿主细胞基因组相关侧翼DNA中的转基因的核酸分子。重组核酸分子的另一个实例是由将转基因插入至植物的基因组DNA中产生的DNA分子，其可以最终导致该生物体中的重组RNA/或蛋白分子的表达。如本文所使用的，“重组植物”是通常不会在自然界中存在的植物，是人类干预的结果，并且含有可掺入到其基因组中的转基因或异源核酸分子。由于这样的基因组改变，重组植物明显不同于相关的野生型植物。“重组”细菌是自然界中未发现的细菌，该细菌包含异源核酸分子。可以通过用核酸分子转化细菌，或通过将质粒从一种细菌菌株接合样转移到另一种细菌菌株、由此使该质粒包含核酸分子来产生这样的细菌。
如本文所使用的，术语“减少(reduce、reduced、reducing、reduction)”、“减小(diminish)”、和“抑制(suppress)”(及其语法变体)和类似术语是指植物有害生物的存活、生长和/或繁殖的减少，例如通过使植物与本披露的多肽接触(如例如，通过转基因表达或通过局部应用方法)。这种存活、生长和/或繁殖的减少可以参考在本披露多肽不存在的情况下观察到的水平(例如，不是转基因表达多肽或不是用多肽局部处理的植物)。因此，在实施例中，术语“减少(reduce、reduced、reducing、reduction)”、“减小(diminish)”、和“抑制(suppress)”(及其语法变体)和类似术语意指如与不与本披露多肽接触的植物(例如，不是转基因表达多肽或不是用多肽局部处理的植物)相比降低至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在代表性实施例中，减少导致无或基本上无(即不显著量，例如少于约10％、少于约5％或甚至少于约1％)植物有害生物的可检测的存活、生长和/或繁殖。
“调控元件”是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列包括增强子、启动子、翻译增强子序列、内含子、终止子和聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列和合成序列、以及可能是合成序列与天然序列的组合的序列。调控序列可以决定表达水平、表达的空间模式和时间模式，并且对于启动子的子集，决定在诱导性条件下的表达(由外部因子，例如光、温度、化学品和激素来调控)。
如本文所使用的，“选择性标记(selectable marker)”意指如下核苷酸序列，当核苷酸序列表达时向表达该标记的植物、植物部分和/或植物细胞赋予不同的表型，并且因此允许这样的转化的植物、植物部分和/或植物细胞与不具有该标记的那些区别开来。这样的核苷酸序列可以编码一种可选择的亦或可筛选的标记，这取决于该标记是否给予一种可以通过化学方法而被选择的性状，例如通过使用一种选择性药剂(例如，一种抗生素、除草剂、或类似物)，或者取决于该标记是否仅是一种人们可以通过观察或测试而鉴别的性状，例如通过筛选(例如，R基因性状)。
如本文所使用的，“稳定转化”或“稳定转化的”意指将核酸引入细胞并整合到细胞基因组中。因此，整合的核酸能够由其子代遗传，更特别地，由多个连续世代的子代遗传。如本文所使用的，“基因组(genome)”还包括核基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸整合到例如叶绿体基因组中。如在此使用的，稳定转化还可以指一种例如作为微型染色体在染色体外保持的转基因。
“合成的”是指如下核苷酸序列，该核苷酸序列包含在天然序列中不存在的碱基或者一个或多个结构特征。例如，编码本披露的蛋白的人工序列(其更类似于双子叶植物或单子叶植物基因的G+C含量和正常密码子分布)被表述为合成的。
如本文所使用的，对昆虫有害生物是“有毒的”本披露的蛋白意指该蛋白充当口服活性的昆虫控制剂以杀死昆虫有害生物，或者该蛋白能够破坏或阻止昆虫摄食、或引起对昆虫有害生物的生长抑制，其两者可以引起或可以不引起昆虫死亡。当本披露的毒性蛋白被递送至昆虫或昆虫与毒性蛋白进行经口接触时，结果典型地是该昆虫的死亡、或者该昆虫的生长减慢、或者该昆虫停止以使该毒性蛋白可供该昆虫利用的来源为食。
术语“毒素片段”和“毒素部分”在本文可以互换地使用，是指本披露的较长(例如，全长)杀昆虫蛋白的片段或部分，其中该“毒素片段”或“毒素部分”保留杀昆虫活性。例如，在本领域中已知，天然Cry蛋白被表达为原毒素，该原毒素在N-末端和C-末端被加工以产生成熟毒素。在实施例中，本披露的嵌合杀昆虫蛋白的“毒素片段”或“毒素部分”在N-末端和/或C-末端被截短。在实施例中，“毒素片段”或“毒素部分”在N-末端被截短以去除部分或全部N-末端肽基片段，并且任选地包含本文所明确描述的杀昆虫蛋白的至少约400、425、450、475、500、510、520、530、540、550、560、570、580或590个连续氨基酸或与其基本上同一的氨基酸序列。因此，在实施例中，杀昆虫蛋白的“毒素片段”或“毒素部分”在N-末端被截短(例如，以省略部分或全部肽基片段)，例如，一个氨基酸或多于一个氨基酸的N-末端截短，例如多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60个或更多个氨基酸的N-末端截短。在实施例中，杀昆虫蛋白的“毒素片段”或“毒素部分”在C-末端被截短(例如，以省略部分或全部原毒素尾部)，例如，一个氨基酸或多于一个氨基酸的C-末端截短，例如多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、560个或更多个氨基酸的C-末端截短。在实施例中，该“毒素片段”或“毒素部分”包含结构域1和2，以及核心结构域3。在实施例中，该“毒素片段”或“毒素部分”是成熟的(即，加工的)毒素(例如，Cry毒素)。
“转化”是用于将异源核酸引入到宿主细胞或生物体的方法。在特定实施例中，“转化”意指DNA分子稳定地整合到目的生物体的基因组(核或质体)中。在一些特定实施例中，引入植物、植物部分和/或植物细胞中是经由：细菌介导的转化，粒子轰击转化，磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，脂质体介导的转化，纳米粒子介导的转化，聚合物介导的转化，病毒介导的核酸递送，晶须介导的核酸递送，显微注射，超声处理，浸润，聚乙二醇介导的转化，原生质体转化，或导致向植物、植物部分和/或其细胞引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物机制，或其组合。用于转化植物的程序是本领域熟知的和常规的并且普遍描述于文献中。用于植物转化的方法的非限制性实例包括经由以下的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由来自农杆菌属的细菌)，病毒介导的核酸递送，碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送，脂质体介导的核酸递送，显微注射，粒子轰击，磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，纳米粒子介导的转化，超声处理，浸润，PEG介导的核酸吸收，以及导致向植物细胞中引入核酸的任何其他电学、化学、物理(机械)和/或生物机制，包括其任何组合。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人(“Procedures forIntroducing Foreign DNA into Plants[将外来DNA引入至植物中的程序]”于Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]中，Glick,B.R.和Thompson,J.E.,编辑(CRC Press,Inc.[CRC出版有限公司],波卡拉顿,1993),第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(2002,Cell Mol Biol Lett[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。
“转化的”和“转基因”是指异源核酸分子已经引入其中的宿主生物体(例如细菌或植物)。核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者核酸分子还可以作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子能够自主复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因子代。“非转化的”、“非转基因”、或“非重组”宿主是指不含异源核酸分子的野生型生物体，例如细菌或植物。
术语“转基因植物”包括已引入异源核酸分子的植物。通常，异源核酸序列稳定整合于基因组内以使得核酸序列得以传递至连续世代。异源核酸序列可单独或作为重组表达盒的一部分来整合至基因组中。本文使用“转基因”来包括：任何其基因型已因异源核酸序列的存在而改变的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初被这样改变的那些转基因以及那些通过从最初转基因进行有性杂交或无性繁殖所产生的转基因。
术语“载体”是指用于将一种或多种核酸转移、递送或引入细胞中的组合物。载体包含含有待转移、递送或引入的一个或多个核苷酸序列的核酸分子。示例性载体包括质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、噬菌体或病毒载体。杀昆虫蛋白、多肽、核酸分子
本披露提供了新型杀昆虫蛋白，其针对鞘翅目(例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)(北方玉米根虫；NCR)和/或十一星根萤叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera zeae)(墨西哥玉米根虫))和/或其他鞘翅目昆虫有害生物(如科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado Potato Beetle)))具有活性。本披露还涉及核酸(它们的表达产生了本披露的杀昆虫蛋白)，以及涉及制造和使用这些杀昆虫蛋白以控制昆虫有害生物的方法。在实施例中，这些核酸的表达产生杀昆虫蛋白，其可用于控制鞘翅目昆虫(如西方、北方和/或南方玉米根虫)，特别是当表达于转基因植物(如转基因玉米植物)中时。
在一些实施例中，本披露提供了包含以下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQID NO:1、5-23或71-117中的任一个具有至少85％序列同一性(至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8或至少99.9％序列同一性)。
在一些实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:1。
在另一实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:5-23中的任一个。
在另一实施例中，该多肽包含SEQ ID NO:71-117中的任一个。
在一些实施例中，该多肽对鞘翅目有害生物(例如，根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫)有毒性。在一些实施例中，该多肽衍生自特定细菌，例如，Samsonia细菌。在进一步的实施例中，提供了多肽，该多肽由SEQ ID NO:1、5-23或71-117中任一个的氨基酸序列组成，或通过取代(例如，保守氨基酸取代)、缺失和/或添加1-10个氨基酸(例如，1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1个)而与SEQ ID NO:1、5-23或71-117的氨基酸序列不同。一种“保守的氨基酸替换”是其中用一种具有相似侧链的氨基酸残基替换该氨基酸残基的替换。本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有极性、带负电荷的残基及其酰胺的氨基酸(例如，天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有小的脂肪族非极性或微极性残基的氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、甘氨酸)；具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有大的脂肪族非极性残基的氨基酸(例如甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸)；具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)；具有大的芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。在一些实施例中，该多肽与SEQ ID NO:1具有至少90％(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％)同一性，并且包括在与SEQ ID NO:1的I52、S53、I67、I72、I80、V83、A85、I95、I123、S125、I153、I175、I207、I237、D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241对应的一个或多个位置处的一个或多个取代突变(例如，保守氨基酸取代、丙氨酸取代或亮氨酸取代)。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是在与SEQ ID NO:1的I52、S53、I67、I72、I80、V83、A85、I95、I123、S125、I153、I175、I207或I237中的任何一个或多个对应的一个或多个位置处的一个或多个亮氨酸取代。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是I52L和I180L、I152L和S53L、或I52L和S53L和I80L。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是在与SEQ ID NO:1的D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241中的任何一个或多个对应的一个或多个位置处的一个或多个保守氨基酸或丙氨酸取代。在一些实施例中，该一个或多个取代突变是在与SEQ ID NO:1的D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241中的任何一个或多个对应的一个或多个位置处的一个或多个丙氨酸取代。在实施例中，所述多肽对鞘翅目有害生物(例如，根萤叶甲属有害生物，如西方玉米根虫)有毒性。在另一实施例中，本披露提供了由SEQ ID NO:1、5-23或71-117中的任一个的氨基酸序列组成的多肽。
本文所披露的某些序列是彼此的直系同源物，并且彼此具有一定同一性百分比。那些同一性百分比披露于表1中。
膳食暴露是人类可以暴露于转基因植物中表达的杀昆虫蛋白的主要途径。哺乳动物急性经口毒性和蛋白质消化率是EPA对人体健康风险评估的终点。杀昆虫蛋白安全性的进一步科学证据在于，它们已显示使用模拟胃液在体外迅速降解。例如，用代表性Cry1、Cry2和Cry3蛋白进行的七次体外测定的结果确立这些蛋白质通常在30秒内迅速降解。这些结果支持更广泛的结论，即Cry蛋白的这些组的成员(具有显著的氨基酸序列同一性)在人类摄入后可能迅速降解。对植物中表达的每种转基因蛋白进行类似的测试。另一方面考虑是杀昆虫蛋白是否可能引起过敏反应。所证实的转基因杀昆虫蛋白在体外迅速降解应使这样的发生的可能性降至最低。相比之下，食物过敏原通常保留在体外胃肠道模型中，而无过敏史的常见食物蛋白在模拟胃液中迅速降解(Metcalfe等人1996)。
模拟胃液(SGF)测定在代表哺乳动物上消化道的严格控制的条件下测量测试蛋白的体外消化率。例如，在37℃下经一小时的时间段，将细菌产生的测试Cry蛋白(在0.5-5mg/ml的浓度下)以10单位的胃蛋白酶活性/μg测试蛋白的比率暴露于胃蛋白酶(来自猪胃粘膜，溶解于2mg/ml NaCl中，pH 1.2)。在1、2、5、10、30和60分钟的时间点取出样品，并通过添加预热(95℃-2分钟)的终止缓冲液(65％0.5M碳酸氢钠pH 11，35％ Tricine加样缓冲液)立即淬灭，以使胃蛋白酶立即失活，并返回再加热5分钟。一旦测定完成，便通过SDS-PAGE在10％-20％ Tris-Tricine凝胶(肽可见低至1kDa)上检查时间点样品和对照(只有测试蛋白，只有胃蛋白酶)以跟踪由胃蛋白酶进行的消化的动力学和水平。如果测试蛋白或本文蛋白质的显著多肽片段在例如5和/或10分钟时间点处可见，那么它不能被SGF测定消化或不能完全消化，并且可以定性评分为“否”或“不可消化的”。如果测试蛋白和任何显著多肽片段在例如5分钟时间点处可见，那么它可以被SGF测定消化，并且可以定性评分为“是”或“可消化的”。
因此，在一些实施例中，所披露的杀昆虫蛋白可以被修饰以改善蛋白的特性，例如其杀昆虫活性、其溶解度、其稳定性和/或其消化率。例如，所披露的杀昆虫蛋白可以另外包含引入的蛋白酶切割位点和/或半胱氨酸取代。引入的蛋白酶切割位点和/或半胱氨酸取代不是天然存在的，而是作为取代突变或者作为插入或缺失突变或者其一些组合引入到多肽序列中。引入的蛋白酶切割位点可以通过在多肽序列中插入至少一个亮氨酸残基而被引入。在一些实施例中，多肽包含半胱氨酸取代，例如，用另一种氨基酸例如丙氨酸或亮氨酸取代半胱氨酸。引入的突变可使多肽不稳定，因此使得蛋白酶可以接近切割位点，该切割位点是以前由于蛋白质的紧密和/或稳定折叠或者由于空间位阻而无法接近的。引入的蛋白酶切割位点可以是多肽序列中引入的突变，该突变被蛋白酶例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶识别为蛋白水解切割的位点。
在一些实施例中，引入的蛋白酶切割位点可改变现有的蛋白酶切割位点，使得其被不同的蛋白酶识别。针对胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和胃蛋白酶的蛋白酶切割位点在本领域中是熟知的。胰凝乳蛋白酶优先切割肽酰胺键，其中酰胺键的羧基侧(P1位置)是大的疏水性氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)。胰蛋白酶主要在氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧切割肽链，除非其中任何一个随后是脯氨酸。胃蛋白酶在切割疏水性氨基酸和优选芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、和亮氨酸)之间的肽键方面最有效。这些切割位点是优先的切割位点，并不包括由胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶识别的所有切割位点，并且还不包括所有蛋白酶的所有切割位点。
蛋白质中的半胱氨酸通常共价键合至其他半胱氨酸残基以形成二硫键。二硫键在一些蛋白质的折叠和稳定性中起重要作用。与野生型多肽相比，变体多肽可具有改变的或较不稳定的三级结构。例如，引入的突变可以使多肽的三维折叠“松散”，从而使以前不可接近(并且因此不被切割)的蛋白酶切割位点可被蛋白酶接近。这导致引入的突变引入在未经改变的多肽中不存在的蛋白酶切割位点。在优选的实施例中，突变不改变或不显著改变多肽针对鞘翅目有害生物的活性或杀昆虫活性。
所披露的一种或多种杀昆虫蛋白中的每一种针对鳞翅目有害生物具有杀昆虫活性。在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对以下鞘翅目有害生物中的一种或多种具有活性：根萤叶甲属物种(Diabrotica spp.)如巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)、玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、十一星根萤叶甲(D.undecimpunctata howardii)(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(western spottedcucumber beetle))、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spotted leafbeetle))、南美叶甲(D.speciosa)(葫芦甲虫(cucurbit beetle))、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curviplustalata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusal)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲(D.trifasciata)和/或微绿根萤叶甲(D.viridula)；瘦跗叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)，如马铃薯叶甲(L.decemlineata)(科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle))；叶甲虫属物种(Chrysomela spp.)，如黑杨叶甲(C.scripta)(黑杨叶甲虫(cottonwood leaf beetle))；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹(H.hampei)(咖啡豆钻孔虫(coffee berry borer))；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais)(玉蜀黍象(maize weevil))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis)(烟草跳(tobacco flea beetle))和/或黄瓜跳甲(E.cucumeris)(马铃薯跳甲(potato flea beetle))；条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如萝卜菜跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲(crucifer flea beetle))和/或西方黑跳甲(P.pusilla)(西方黑色跳甲(western black flea beetle))；花象属物种(Anthonomusspp.)，如胡椒花象(A.Eugenii)(胡椒茎象甲(pepper weevil))；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius)(铁线虫(wireworms))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如普通梳爪叩头甲(M.communis)(铁线虫)；荚象甲属物种(Ceutorhychus spp.)，如白菜籽龟象(C.assimilis)(甘蓝心皮象鼻虫(cabbage seedpodweevil))；条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如十字花科跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲)；Aeolus属物种(Aeolus spp.)，如A.mellillus(铁线虫)；Aeolus属物种，如A.mancus(小麦铁线虫(wheat wireworm))；砂铁线属物种(Horistonotus spp.)，如砂铁线虫(H.uhlerii)(沙子铁线虫(sand wireworm))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis)(玉蜀黍谷象(maize billbug))、梯牧草谷象(S.zeae)(梯牧草谷象虫(timothy billbug))、牧草长喙象(S.parvulus)(早熟禾谷象(bluegrass billbug))和南方玉米长喙象(S.callosus)(南方玉米谷象(southern corn billbug))；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米铜色跳甲(C.pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beetle))；弧丽金龟属物种(Popilliaspp.)，如日本弧丽金龟(P.japonica)(日本金龟子(Japanese beetle))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican beanbeetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如豆叶甲(C.trifurcate，Bean leaf beetle)；豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata)(斑蝥(Blister beetles))；金龟甲属物种(Holotrichia spp.)，如东北大黑鳃金龟(H.diomphalia Bates，Northeast larger black chafer)；或任何前述的组合。
在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)和巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫)具有杀昆虫活性。
在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对昆虫有害生物或集落具有杀昆虫活性，该昆虫有害生物或集落对另一种杀昆虫剂(包括另一种杀昆虫蛋白(如，例如Bt蛋白))具有抗性。在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对以一种有害生物具有杀昆虫活性，该有害生物对以下有抗性：Cry3A蛋白(例如，mCry3A，包括但不限于玉蜀黍事件MIR604或MZIR098或eCry3.1Ab，包括但不限于玉蜀黍事件5307或MZIR098)、Cry3B蛋白(例如，Cry3Bb1，包括但不限于玉蜀黍事件MON87411或MON88017)、Cry34/35蛋白(例如，Cry34和Cry35，包括但不限于玉蜀黍事件59122和DP-4114)、或IPD072蛋白(例如，IPD072Aa，包括但不限于玉蜀黍事件DP-023211-2)。
所披露的一种或多种杀昆虫蛋白中的每一种还可以针对鳞翅目、半翅目、双翅目、草盲蝽属物种和/或其他刺吸式昆虫(例如直翅目或缨翅目的刺吸式昆虫)具有杀昆虫活性。在一些实施例中，所披露的一种或多种杀昆虫蛋白中的每一种针对以下鳞翅目有害生物中的一种或多种具有活性：灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)(秋黏虫)、海灰翅夜蛾(S.littoralis)(埃及棉叶虫(Egyptian cottonleafworm))、黄条黏虫(S.ornithogalli，yellowstriped armyworm)、西部黄条黏虫(S.praefica，western yellowstriped armyworm)、南方黏虫(S.eridania，southernarmyworm)、斜纹夜蛾(S.litura)(黄地老虎(Common cutworm)/东方叶虫(Orientalleafworm))、黑色黏虫(S.cosmioides，black armyworm)、非洲黏虫(S.exempta，Africanarmyworm)、禾灰翅夜蛾(S.mauritia，lawn armyworm)和/或甜菜夜蛾(S.exigua，beetarmyworm)；玉米螟属物种(Ostrinia spp.)，如欧洲玉米螟(O.nubilalis)(欧洲玉米蛀虫)和/或亚洲玉米螟(O.furnacalis)(亚洲玉米蛀虫)；菜蛾属物种(Plutella spp.)，如小菜蛾(P.xylostella，diamondback moth)；地夜蛾属物种(Agrotis spp.)，如小地老虎(A.ipsilon)(黑色地老虎)、黄地老虎(A.segetum，common cutworm)、泥背地老虎(A.gladiaria，claybacked cutworm)和/或西部灰地老虎(A.orthogonia，pale westerncutworm)；切根虫属物种(Striacosta spp.)，如豆白缘切根虫(S.albicosta)(西部豆切根虫(western bean cutworm))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)，如玉米穗虫(H.zea)(玉米穗蛾(corn earworm)/大豆豆荚虫(soybean podworm))、茶色铃夜蛾(H.punctigera，native budworm)和/或棉铃虫(H.armigera，cotton bollworm)；实夜蛾属物种(Heliothisspp.)，如烟芽夜蛾(H.virescens)(烟夜蛾(tobacco budworm))；蔗螟属物种(Diatraeaspp.)，如西南玉米螟(D.grandiosella，southwestern corn borer)和/或小蔗螟(D.saccharalis，sugarcane borer)；粉纹夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)，如粉纹夜蛾(T.ni，cabbage looper)；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)，如地中海玉米螟(S.nonagroides，Mediterranean corn borer)，粉螟虫(S.inferens，Pink stem borer)和/或粉螟虫(S.calamistis，pink stem borer)；红铃虫属物种(Pectinophora spp.)，如棉红铃虫(P.gossypiella，pink bollworm)；纹卷蛾属物种(Cochylis spp.)，如向日葵细卷叶蛾(C.hospes，banded sunflower moth)；天蛾属物种(Manduca spp.)，如烟草天蛾(M.sexta，tobacco hornworm)和/或番茄天蛾(M.quinquemaculata，tomato hornworm)；玉米苗斑螟属物种(Elasmopalpus spp.)，如南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；尺夜蛾属物种(Pseudoplusia spp.)，如大豆尺蠖(P.includens)(大豆夜蛾(soybean looper))；干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)，如黎豆夜蛾(A.gemmatalis，velvetbean caterpillar)；绿夜蛾属物种(Plathypena spp.)，如苜蓿绿夜蛾(P.scabra，green cloverworm)；马醉木属物种(Pieris spp.)，如大菜粉蝶(P.brassicae)(纹白蝶(cabbage butterfly))；夜蛾属物种(Papaipema spp.)，如蛀茎夜蛾(P.nebris，stalk borer)；黏虫属物种(Pseudaletia spp.)，如一星黏虫(P.unipuncta)(普通黏虫(common armyworm))；疆夜蛾属物种(Peridroma spp.)，如杂色地老虎(P.saucia)(豆杂色夜蛾(variegated cutworm))；茄茎麦蛾属物种(Keiferia spp.)，如番茄蠹蛾(K.lycopersicella)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；菜粉蝶属物种(Artogeiaspp.)，如菜粉蝶(A.rapae)(菜青虫(imported cabbageworm))；茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)，如马铃薯麦蛾(P.operculella，potato tuberworm)；锞蚊夜蛾属物种(Chrysodeixis spp.)，如大豆尺蠖(C.includens)(大豆夜蛾(soybean looper))；脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)，如脏切夜蛾(F.ducens，dingy cutworm)；禾草螟属物种(Chilospp.)，如二化螟(C.suppressalis，striped stem borer)、玉米螟(C.Agamemnon，orientalcorn borer)、斑螟(C.venosatus，spotted borer)和斑茎螟(C.partellus，spotted stalkborer)；纵卷叶野螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)，如稻纵卷叶螟(C.medinalis，riceleaffolder)；多斑野螟属物种(Conogethes spp.)，如桃蛀螟(C.punctiferalis，Yellowpeach moth)；秘夜蛾属物种(Mythimna spp.)，如东方黏虫(M.separata，Orientalarmyworm)；委夜蛾属物种(Athetis spp.)，如二点委夜蛾(A.lepigone，Two-spottedarmyworm)；干夜蛾属物种(Busseola spp.)，如玉蜀黍茎螟虫(B.fusca，maize stalkborer)；豆荚螟属物种(Etiella spp.)，如豆荚斑螟(E.zinckenella，pulse pod borer)；豆食心虫属物种(Leguminivora spp.)，如大豆食心虫(L.glycinivorella，soybean podborer)；豆小卷蛾属物种(Matsumuraeses spp.)，如小豆荚螟(M.phaseoli，adzuki podworm)；啮叶野螟属物种(Omiodes spp.)，如豆啮叶野螟(O.indicata，Soybeanleaffolder/Bean-leaf webworm)；薄荷灰夜蛾属物种(Rachiplusia spp.)，如向日葵尺蠖(R.nu，sunflower Looper)；豆荚螟属物种(Maruca spp.)，如豆荚野螟(M.TestulalisGeyer，Bean pod borer)；长跗萤叶甲属物种(Monolepta spp.)，如(双斑长跗萤叶甲(M.hieroglyphica，Double-spotted leaf beetle)；或任何前述的组合。在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对以下半翅目有害生物中的一种或多种具有活性：中国蝽(Chinavia hilaris)(绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；美洲毛谷杆长蝽(Blissus leucopterus，chinch bug)；棉花网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽(Cyrtopeltismodesta Distant，tomato bug)；棉蝽(Dysdercus suturellus Hernch-Schaffer，cottonstainer)；褐臭蝽(Euschistus servus Say，brown stink bug)；一斑臭蝽(E.variolariusPalisot de Beauvois，one-spotted stink bug)；长蝽属物种(Graptostethus spp.)(果实蝽系群(complex of seed bug))；松叶根蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footedpine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois，tarnishedplant bug)；西部牧草盲椿(L.Hesperus Knight，Western tarnished plant bug)；牧草盲蝽(L.pratensis Linnaeus，common meadow bug)；长毛草盲蝽(L.rugulipennis Poppius)(欧洲牧草盲蝽(European tarnished plant bug))；原丽盲蝽(Lygocoris pabulinusLinnaeus，common green capsid)；稻绿蝽(Nezara viridula Linnaeus)(南方绿蝽象)；稻褐蝽(Oebalus pugnax Fabricius，rice stink bug)；大马利筋长蝽(Oncopeltusfasciatus Dallas，large milkweed bug)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatusReuter，cotton fleahopper)，草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin，strawberry bug)；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen，apple capsid)；番茄蝽(Cyrtopeltis modestus Distant，tomato bug)；烟草黑斑盲蝽(Cyrtopeltis notatus Distant，suckfly)；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatusReuter，whitemarked fleahopper)；皂荚盲蝽(Diaphnocoris chlorionis Say，honeylocust plant bug)；洋葱盲蝽(Labopidicola allii Knight，onion plant bug)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say，rapid plant bug)；四线盲蝽(Poecilocapsus lineatusFabricius，four-lined plant bug)；谷长蝽(Nysius ericae Schilling，false chinchbug)；谷长蝽(Nysius raphanus Howard，false chinch bug)；稻绿蝽(Nezara viridulaLinnaeus)(南方绿蝽象)；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽属物种(Coreidaespp.)；红蝽属物种(Pyrrhocoridae spp.)；谷蛾属物种(Tinidae spp.)；负子蝽属物种(Blostomatidae spp.)；猎蝽属物种(Reduviidae spp.)和臭虫属物种(Cimicidae spp.)；或任何前述的组合。在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对以下双翅目有害生物中的一种或多种具有活性：斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)，如三叶斑潜蝇(L.trifolii，leafminer)和美洲斑潜蝇(L.sativae)(蔬菜潜蝇)；Scrobipalpula属物种，如番茄潜叶虫(S.absoluta，tomato leafminer)；地种蝇属物种(Delia spp.)，如玉米蝇蛆(D.platura)(玉米种蝇(seedcorn maggot))、甘蓝种蝇蛆(D.brassicae)(甘蓝种蝇(cabbage maggot))和甘蓝根花蝇(D.radicum，cabbage root fly)；锈蝇属物种(Psilia spp.)，如胡萝卜锈蝇(P.rosae，carrot rust fly)；根斑蝇属物种(Tetanops spp.)，如甜菜根蛆(T.myopaeformis)(甜菜根斑蝇(sugarbeet root maggot))；或前述的任何组合。在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对以下直翅目有害生物中的一种或多种具有活性：黑蝗属物种(Melanoplus spp.)，如长额负蝗(M.differentialis，Differentialgrasshopper)、红腿蝗(M.femurrubrum，Redlegged grasshopper)、双带蝗(M.bivittatus，Twostriped grasshopper)；或前述的任何组合。在一些实施例中，该一种或多种杀昆虫蛋白针对以下缨翅目有害生物中的一种或多种具有活性：花蓟马属物种(Frankliniellaspp.)，如西花蓟马(F.occidentalis)(西方花蓟马(western flower thrips))和烟褐花蓟马(F.fusca)(烟草蓟马(tobacco thrips))；和蓟马属物种(Thrips spp.)，如烟蓟马(T.tabaci)(葱蓟马(onion thrips))、瓜蓟马(T.palmi，melon thrips)；或前述的任何组合。
所披露的一种或多种杀昆虫蛋白还可针对以下中的任一种或多种具有杀昆虫活性：鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)，玉米缢管蚜(Rhopalosiphum maidis)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、Melanotus cribulosus、圆头犀金龟子(Cyclocephalalurida)、甜菜叩甲(Limonius californicus)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、稻管蓟马(Haplothrips aculeatus)、截形叶螨(Tetranychus truncates)、铜绿鳃金龟(Anomalacorpulenta)、黄胫小车蝗(Oedaleus infernalis)、禾蓟马(Frankliniellatenuicornis)、朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)、绿纹蝗(Aiolopus thalassinustamulus)、大地老虎(Trachea tokionis)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)、Dichelops furcatus、犀牛兜虫(Diloboderus abderu)、玉米黄翅叶蝉(Dalbulus maidis)、Astylus variegathus、栗土蝽(Scaptocoris castanea)、东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)、叩头虫(Agriotes lineatus)、玉米蜡蝉(Peregrinus maidis)、瑞典杆蝇(Oscinella frit)、玉米花蓟马(Frankliniellawilliamsi)、Zyginidia manaliensis、高粱芒蝇(Atherigona soccata)、Nicentritestestaceipes、Myllocerus undecimpustulatus、Atherigona naquii、Amsectaalbistriga、印度谷螟(Plodia interpuctella)、褐纹金针虫(Melanotus caudex)、小白蚁属物种(Microtermes spp.)、稻芒蝇(Atherigona oryzae)、玉米纤毛象(Tanymecusdilaticollis)、Delphacodes kuschelli、痣鳞鳃金龟(Lepidiota stigma)、食叶鳃金龟(Phyllophaga hellery)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、隐纹谷弄蝶(Pelopidasmathias)、中华稻蝗(Oxya chinensis，Thunberg)、三齿长突飞虱(Stenocranuspacificus)、白松虫(Scutigerella immaculata)、Chrysodeixis chalcites、黄毒蛾属物种(Euproctis sp.(毒蛾科))、条跳甲属物种(Phyllotreata spp.(undulata)，Reptaluspanzer)、Cyrtacanthacris tartarica Linnaeus、棉古毒蛾(Orgyia postica)、斑鞘趾铁甲(Dactylispa lameyi)、Patanga succincta Johanson、叶螨属物种(Tetranychusspp.)、卵象属物种(Calomycterus sp.)、Adoretus compressus Weber和Paratetranychusstickney。
所披露的杀昆虫蛋白还可以针对线虫具有活性。如本文所使用的，术语“线虫”涵盖目前已知的或之后鉴定的任何被分类为动物界线虫门的生物体，包括但不限于有腺纲(包括例如：嘴刺目、等咽目、单齿目、矛线目、毛首目、索虫目、姆斯帕目、薄咽目、色矛目、带线虫目、链环目和单宫目)和/或胞管肾纲(包括例如：小杆目、圆线虫目、蛔虫目、旋尾目、驼形目、双胃目、垫刃目和滑刃目)中的线虫。
线虫包括但不限于寄生线虫，如根结线虫、胞囊线虫和/或腐线虫。根据本披露的线虫的示例性属包括但不限于：根结线虫属(根结线虫)、异皮线虫属(胞囊线虫)、球异皮线虫属(Globodera)(胞囊线虫)、穿孔线虫属(穿孔线虫)、肾状线虫属(肾形肾状线虫)、短体线虫属(腐线虫)、滑刃线虫属(叶面线虫)、螺旋线虫属(螺旋线虫)、纽带线虫属(矛线虫)、拟毛刺属(短粗根线虫)、长针线虫属、珍珠线虫属(假根结线虫)、亚粒线虫属(Subanguina)、刺线虫属(刺线虫)、小环线虫属(小环线虫)、环线虫属(环线虫)、茎线虫属(茎线虫)、锥线虫属(锥线虫)、半轮线虫属(半轮线虫)、鞘线虫属(鞘线虫)、潜根线虫属(潜根线虫)、根结线虫属(Hypsoperine)、大茎线虫属(大茎线虫)、Melinius属、刻点胞囊属(Punctodera)、五沟线虫属(Quinisulcius)、盾线虫属(盾线虫)、剑线虫属(匕首线虫)、矮化线虫属(矮化线虫)、穿刺线虫属(穿刺线虫)、伞滑刃属(蛔虫)、及其任何组合。
根据本披露的示例性植物寄生线虫包括但不限于：细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus，pine wood nematode)、龙胆轮线虫属(Criconemoides ornata)、马玲薯腐烂线虫(Ditylenchus destructor，potato rot nematode)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchusdipsaci，stem and bulb nematode)、马铃薯胞囊线虫(Globodera pallida，potato cystnematode)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)(金黄线虫(golden nematode))、大豆胞囊线虫(Heterodera glycines，soybean cyst nematode)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii，sugar beet cyst nematode)；玉米胞囊线虫(Heterodera zeae，corn cystnematode)、禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae，cereal cyst nematode)、胡萝卜异皮线虫(Heterodera carotae)、红三叶异皮线虫(Heterodera trifolii)、哥伦布纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、Hoplolaimusmagnistylus、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、花生根结线虫(Meloidogynearenaria)、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、北方根节线虫(Meloidogynehapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax)、异常珍珠线虫(Nacobbusaberrans)、Naccobus dorsalis、Paratrichodorus christiei、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、Pratylenchus hexincisus、落选短体线虫(Pratylenchusneglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、Pratylenchus projectus、斯克里布纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)、Pratylenchus tenuicaudatus、Pratylenchusthornei、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)、Punctodera chaccoensis、Quinisulciusacutus、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis)、顺逆矮化线虫(Tylenchorhynchus dubius)、柑桔半穿刺线虫(Tylenchulussemipenetrans)、美洲剑线虫(Siphinema americanum)、X.Mediterraneum、以及前述的任何组合。
本披露还涵盖与本披露的杀昆虫蛋白特异性结合的抗体。该抗体可任选地是单克隆抗体或多克隆抗血清。这样的抗体可以使用产生多克隆抗血清的标准免疫学技术来产生，并且如果需要的话，无限增殖免疫宿主的抗体产生细胞用于单克隆抗体产生源。用于生产任何感兴趣物质的抗体的技术是熟知的，例如如在Harlow and Lane(1988.Antibodiesa laboratory manual.[抗体：实验室手册]第726页.Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室])中以及如在Goding(Monoclonal Antibodies:Principles&practice.[单克隆抗体：原理与实践]1986.Academic Press,Inc.[学术出版社公司],奥兰多，佛罗里达州)中所描述。本披露还涵盖杀昆虫蛋白，该杀昆虫蛋白与抗体、特别是单克隆抗体交叉反应，产生了针对本披露的杀昆虫蛋白的一种或多种。
根据本披露的抗体可用于例如在免疫测定中确定例如生物样品中本披露的杀昆虫蛋白或抗原相关多肽的量或存在。这样的测定在质量控制产生含有本披露的杀昆虫蛋白中的一种或多种或抗原相关多肽的组合物中也是有用的。此外，这些抗体可以用来评估本披露的蛋白中的一种或多种或抗原相关多肽的重组产生的功效，以及用于筛选表达文库以确定编码本披露的蛋白中的一种或多种或抗原相关多肽的核苷酸序列的存在。抗体进一步可作为亲和配体用于纯化或分离本披露的蛋白质中的任何一种或多种或抗原相关多肽。
在实施例中，提供了编码本披露的多肽的核酸分子。在一些实施例中，这些核酸分子被密码子优化，例如，如本文进一步描述的。在一些实施例中，编码序列与SEQ ID NO:2-4、27-45、49-67或118-163中任一个具有至少80％同一性(例如，至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8或至少99.9％同一性)。在其他实施例中，编码序列包含SEQ ID NO:2-4、27-45、49-67或118-163中任一个的序列或由其组成。在一些实施例中，编码序列包含编码SEQ ID NO:2-4、27-45或49-67中任一个的相同氨基酸序列的简并核苷酸序列。
表达盒和载体
在一些方面，本披露提供了编码本披露杀昆虫蛋白的表达盒和载体。在一些实施例中，编码序列包含经密码子优化用于在植物(例如，转基因单子叶植物宿主或转基因双子叶植物宿主，如玉米或大豆植物)中表达的合成核苷酸序列。在实施例中，核苷酸编码序列是部分或完全合成的。在代表性实施例中，修饰和/或优化了本披露的核苷酸序列用于在转基因植物(如玉米或大豆)中表达。例如，尽管在许多情况下，来自微生物生物体的基因能够在植物中高水平表达而无需修饰，但在转基因植物中的低表达可能是由于微生物核苷酸序列的缘故，这些序列具有在植物中并不优选的密码子。在本领域中已知，活生物体具有特定的密码子使用偏好，而且在本披露中所描述的这些核苷酸序列的密码子可以被改变以符合植物偏好，同时维持由其编码的氨基酸。此外，在本领域中已知，在植物(例如玉米植物)中高表达可以是由如下编码序列实现的，该编码序列具有至少约35％、或至少约45％、或至少约50％、或至少约60％的GC含量。具有低GC含量的微生物核苷酸序列在植物中也许表达欠佳。尽管某些核苷酸序列可以同时在单子叶植物和双子叶植物物种中充分表达，但是可以对序列进行修饰以便迎合单子叶植物或双子叶植物特定的密码子偏好以及GC含量偏好，因为这些偏好已经被证明是不同的(Murray等人.Nucl.Acids Res.[核酸研究]17:477-498(1989))。此外，在一些实施例中，修饰该核苷酸序列以去除可能导致消息平截(messagetruncation)的不正常剪接位点。使用描述于例如美国专利号5,625,136、5,500,365和6,013,523中的方法，使用熟知的定点诱变、PCR以及合成基因构建技术，可以对这些核苷酸序列做出这样的修饰。
在一些实施例中，本披露提供了根据披露于美国专利号5,625,136中的程序制备的合成编码序列或多核苷酸。在这个程序中，使用了玉蜀黍优选的密码子，即最频繁地编码玉蜀黍中的氨基酸的单个密码子。针对特定的氨基酸的玉蜀黍优选密码子可衍生自例如来源于玉蜀黍的已知基因序列。例如，针对来自玉蜀黍植物的28个基因的玉蜀黍密码子使用发现于以下文献中：Murray等人,Nucleic Acids Research[核酸研究]17:477-498(1989)。应当认识到，密码子进行优化用于在一种植物物种中的表达也将作用于其他植物物种，但密码子进行优化用于表达的植物物种可能不在相同水平。以这种方式，这些核苷酸序列可以进行优化用于在任何植物中表达。应当认识到，核苷酸序列的全部或任何部分可以是优化的或合成的。也就是说，多核苷酸可以包含作为部分天然序列和部分密码子优化序列的核苷酸序列。
在代表性实施例中，本披露的多核苷酸是分离的多核苷酸。在实施例中，本披露的多核苷酸是重组多核苷酸。
在一些实施例中，异源启动子与核酸可操作地连接，该核酸包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：编码对鞘翅目有害生物有毒性的本披露的蛋白质的编码序列。例如，启动子可以包括组成性的、诱导性的、时间调节的、发育调节的、化学调节的、组织优选的和/或组织特异性的启动子。在特定方面，适用于本披露的启动子是能够在植物细胞中(例如在单子叶植物(例如玉蜀黍或水稻)或双子叶植物(例如大豆、棉花)的细胞中)启动核苷酸序列的转录的启动子。
在实施例中，异源启动子是植物可表达型启动子(例如，单子叶植物可表达型或双子叶植物可表达型启动子)。例如但不限于，该植物可表达型启动子选自下组启动子，该组由以下组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS 6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白(potato patatin)、凝集素、CaMV 35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。
尽管已经显示来自双子叶植物的很多启动子在单子叶植物中是可操作的并且反之亦然，但在实施例中，选择双子叶植物启动子用于在双子叶植物中表达，并且选择单子叶植物启动子用于在单子叶植物中表达。不过，对于所选的启动子的起源没有限制；只要它们可有效驱动核苷酸序列在所期望细胞中表达就足够了。
启动子的选择可以依赖于表达的时间和空间需要而变化，并且还依赖于有待转化的宿主细胞而变化。因此，例如，本披露的核苷酸序列的表达可以处于任何植物和/或植物部分中(例如，处于叶子中、处于茎杆或茎中、处于穗中、处于花序中(例如，穗状花序、圆锥花序、穗轴等)、处于根、种子和/或幼苗等中)。例如，在期望在特异性组织或器官中表达的情况下，可以使用组织特异性或组织优选的启动子(例如，根特异性/优选的启动子)。例如，当不期望在特定组织或器官中表达时，可以使用无组织启动子。在实施例中，提供了“无花粉”启动子，其在靶植物物种的花粉中导致低的或无可检测基因表达。相比之下，在期望响应刺激而表达的情况下，可以使用可由刺激或化学物诱导的启动子。在期望在植物的所有细胞中以相对恒定水平连续表达的情况下，可以选择组成型启动子。
适用于本披露的启动子包括但不限于组成性地驱动核苷酸序列的表达的那些启动子、在诱导时驱动表达的那些启动子、以及以组织或发育特异性方式驱动表达的那些启动子。这些不同类型的启动子在本领域是已知的。
合适的组成型启动子包括，例如CaMV 35S启动子(Odell等人,Nature[自然]313:810-812,1985)；拟南芥At6669启动子(参见PCT公开号WO 04081173A2)；玉蜀黍Ubi 1(Christensen等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689,1992)；水稻肌动蛋白(McElroy等人,Plant Cell[植物细胞]2:163-171,1990)；pEMU(Last等人,Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81:581-588,1991)；CaMV 19S(Nilsson等人,Physiol.Plant[植物生理学]100:456-462,1997)；GOS2(de Pater等人,Plant J[植物杂志]11月；2(6):837-44,1992)；泛素(Christensen等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:675-689,1992)；水稻亲环蛋白(Bucholz等人,Plant Mol Biol.[植物分子生物学]25(5):837-43,1994)；玉蜀黍H3组蛋白(Lepetit等人,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]231:276-285,1992)；肌动蛋白2(An等人.,Plant J.[植物杂志]10(1)；107-121,1996)，组成型根尖CT2启动子(参见PCT申请号IL/2005/000627)和合成的超级MAS(Ni等人,The Plant Journal[植物杂志]7:661-76,1995)。其他组成型启动子包括在以下文献中的那些：美国专利号5,659,026、5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；和5,608,142。
对于在植物(任选地是玉蜀黍)中表达本披露的多肽是有用的组织特异性的或组织优选的启动子包括那些直接在根、髓、叶或花粉中表达的启动子。合适的组织特异性启动子包括但不限于叶特异性启动子(如例如由以下文献所述的：Yamamoto等人,Plant J.[植物杂志]12:255-265,1997；Kwon等人,Plant Physiol.[植物生理学]105:357-67,1994；Yamamoto等人,Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35:773-778,1994；Gotor等人,Plant J.[植物杂志]3:509-18,1993；Orozco等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23:1129-1138,1993；以及Matsuoka等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:9586-9590,1993)，种子优选的启动子(例如，来自种子特异性基因；Simon等人,PlantMol.Biol.[植物分子生物学]5.191,1985；Scofield等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]262:12202,1987；Baszczynski等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14:633,1990)，巴西坚果白蛋白(Pearson等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18:235-245,1992)、豆球蛋白(Ellis等人Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]10:203-214,1988)、谷蛋白(Takaiwa等人,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]208:15-22,1986；Takaiwa等人,FEBSLetts.[FEBS快报]221:43-47,1987)，玉米蛋白(Matzke等人,Plant Mol Biol.[植物分子生物学],143).323-32 1990)，napA(Stalberg等人,Planta[植物]199:515-519,1996)，小麦SPA(Albanietal等人,Plant Cell[植物细胞],9:171-184,1997)，向日葵油蛋白(Cummins等人,Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]19:873-876,1992)，胚乳特异性启动子(例如，小麦LMW和HMW、谷蛋白-1(Mol Gen Genet[分子遗传学与普通遗传学]216:81-90,1989；NAR 17:461-2))，小麦a、b和g醇溶蛋白(EMB03:1409-15,1984)，大麦ltrl启动子，大麦B1、C、D醇溶蛋白(Theor Appl Gen[理论与应用遗传学]98:1253-62,1999；Plant J[植物杂志]4:343-55,1993；Mol Gen Genet[分子遗传学与普通遗传学]250:750-60,1996)，大麦DOF(Mena等人，The Plant Journal[植物杂志]，116(1):53-62,1998)，Biz2(EP99106056.7)，合成启动子(Vicente-Carbajosa等人，Plant J[植物杂志].13:629-640,1998)，水稻醇溶谷蛋白NRP33，水稻球蛋白Glb-1(Wu等人，Plant Cell Physiology[植物细胞生理学]39(8)885-889,1998)，水稻α-球蛋白REB/OHP-1(Nakase等人Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]33:513-S22,1997)，水稻ADP-葡萄糖PP(Trans Res[转化研究]6:157-68,1997)，玉蜀黍ESR基因家族(Plant J[植物杂志]12:235-46,1997)，高粱γ-高粱醇溶蛋白(Plant Mol.Biol[植物分子生物学]32:1029-35,1996)]，胚特异性启动子(例如，水稻OSH1；Sato等人，Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]93:8117-8122)，KNOX(Postma-Haarsma等人，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]39:257-71,1999)，水稻油体蛋白(Wu等人，J.Biochem.[生物化学杂志]，123:386,1998)]，花特异性启动子(例如，AtPRP4，查尔酮合酶(chalene synthase，chsA)(Van der Meer等人，Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15,95-109,1990)，LAT52(Twell等人，Mol.Gen Genet.[分子遗传学与普通遗传学]217:240-245；1989)，apetala-3)，以及对植物繁殖组织具有特异性的启动子(例如，OsMADS启动子；美国专利公开2007/0006344)。
适用于在绿色组织中优选表达的启动子的实例包括调节参与光合作用的基因的许多启动子，并且这些中的许多已经从单子叶植物和双子叶植物两者中得以克隆。一种这样的启动子是来源于磷酸烯醇羧化酶基因的玉蜀黍PEPC启动子(Hudspeth和Grula,PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]12:579-589(1989))。另一种用于根特异性表达的启动子是由de Framond(FEBS290:103-106(1991)或美国专利号5,466,785)描述的启动子。另一种在本披露中有用的启动子是描述于美国专利号5,625,136中的茎特异性启动子，它天然地驱动玉蜀黍trpA基因的表达。
此外，可以使用在质体中发挥作用的启动子。这样的启动子的非限制性实例包括噬菌体T3基因9 5'UTR以及其他的披露于美国专利号7,579,516中的启动子。适用于本披露的其他启动子包括但不限于S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子和Kunitz胰蛋白酶抑制剂基因启动子(Kti3)。
在一些实施例中，可以使用诱导型启动子。因此，例如，可以使用化学调节的启动子以通过应用外源化学调节物来调节植物中的基因表达。本披露的核苷酸序列的表达经由化学调节过的启动子进行的调节使得本披露的多肽仅当用诱导的化学物处理作物植物时能被合成。取决于目的，在应用化学物诱导基因表达时启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学物阻抑基因表达时启动子可以是化学阻抑型启动子。这样的用于基因表达的化学诱导的技术的实例详述于公开申请EP 0 332 104和美国专利号5,614,395中。
化学诱导型启动子在本领域是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其由用作发芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、烟草PR-1a启动子(其由水杨酸激活)(例如，PR1a系统)、类固醇反应性启动子(参见例如，Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88,10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.[植物杂志]14,247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)、四环素诱导型启动子和四环素-阻抑型启动子(参见例如，Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]227,229-237和美国专利号5,814,618和5,789,156)、Lac阻遏物系统启动子、铜诱导型系统启动子、水杨酸诱导型系统启动子(例如，PR1a系统)、糖皮质激素诱导型启动子(Aoyama等人(1997)Plant J.[植物杂志]11:605-612)以及蜕皮激素诱导型系统启动子。
诱导型启动子的其他非限制性实例包括ABA诱导型和细胞膨胀诱导型启动子、植物生长素结合蛋白基因启动子(Schwob等人(1993)Plant J.[植物杂志]4:423-432)、UDP葡萄糖类黄酮糖基转移酶启动子(Ralston等人(1988)Genetics[遗传学]119:185-197)、MPI蛋白酶抑制剂启动子(Cordero等人(1994)Plant J.[植物杂志]6:141-150)以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Kohler等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29:1293-1298；Martinez等人(1989)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]208:551-565；和Quigley等人(1989)J.Mol.Evol.[分子进化杂志]29:412-421)。还包括苯磺酰胺诱导型(美国专利号5,364,780)和乙醇诱导型(国际专利申请公开号WO 97/06269和WO 97/06268)系统和谷胱甘肽S-转移酶启动子。同样地，可以使用描述于以下文献中的诱导型启动子中的任一种：Gatz(1996)Current Opinion Biotechnol.[生物技术新见]7:168-172和Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.[植物生理学与植物分子生物学年度综述]48:89-108。适用于指导本披露的核苷酸序列在植物中的表达的其他化学诱导型启动子披露于美国专利5,614,395中。基因表达的化学诱导还详述于EP 0 332 104(授予汽巴-嘉基公司(Ciba-Geigy))和美国专利5,614,395中。
另一类在本披露中有用的启动子是创伤诱导型启动子。这类启动子的实例包括由以下文献中所描述的那些：Stanford等人Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]215:200-208(1989)，Xu等人Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:573-588(1993)，Logemann等人Plant Cell[植物细胞]1:151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle,PlantMolec.Biol.[植物分子生物学]22:783-792(1993)，Firek等人Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]22:129-142(1993)，以及Warner等人Plant J.[植物杂志]3:191-201(1993)。
在一些实施例中，提供了重组载体，其包含本披露的核酸分子或表达盒。用于在植物和其他生物体的转化中使用的某些载体在本领域是已知的。在其他实施例中，载体的非限制性实例包括质粒、粘粒、噬菌粒、人工染色体、噬菌体或病毒载体。在实施例中，载体是植物载体，例如用于植物转化。在实施例中，载体是细菌载体，例如用于细菌转化。适用于植物、细菌和其他生物体的载体是本领域已知的。
一些实施例涉及被设计成表达本披露的多核苷酸和核酸分子的表达盒。在一些实施例中，表达盒包含核酸分子，该核酸分子具有至少一种可操作地连接至目的核苷酸序列(例如，编码本披露的杀昆虫蛋白的核苷酸序列)的控制序列。以这种方式，例如，可操作地连接至待表达的核苷酸序列的植物启动子可以在表达盒中提供，用于在植物、植物部分或植物细胞中的表达。
包含目的多核苷酸的表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少另外一种是异源的。表达盒还可以是天然存在但已经是以适用于异源表达的重组形式获得的表达盒。然而，典型地，表达盒相对于宿主而言是异源的，即表达盒的特定核酸序列不是天然存在于宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到宿主细胞或宿主细胞的祖先中。
除可操作地连接至本披露的核苷酸序列的启动子之外，本披露的表达盒还可以包括其他调控序列。调控序列包括但不限于增强子、内含子、翻译前导序列、终止信号、以及聚腺苷酸化信号序列。
在一些实施例中，表达盒还可以包括编码除了所披露的蛋白之外的其他所期望性状的多核苷酸。这样的包含叠加性状的表达盒可以用来产生具有所期望的具有叠加性状(即，分子叠加)的表型的植物、植物部分或植物细胞。植物中的这样的叠加的组合还可以通过其他方法来产生，包括但不限于通过任何常规的方法学的杂交育种植物。如果是通过遗传转化这些植物来进行叠加的，目的核苷酸序列可以在任何时间并且以任何次序进行组合。例如，包含一种或多种期望性状的转基因植物可以用作靶标以通过随后的转化来引入其他性状。另外的核苷酸序列可以在共转化方案中与由表达盒的任何组合提供的本披露的核苷酸序列、核酸分子、核酸构建体、或组合物同时引入。例如，如果将引入两个核苷酸序列，则它们可以合并在分开的盒(反式)中或合并在相同的盒(顺式)上。多核苷酸的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。还认识到，可以使用位点特异性核酸酶或重组系统(例如，FRT/Flp、Cre/Lox、TALE-核酸内切酶、锌指核酸酶、CRISPR/Cas和相关技术)将多核苷酸堆积在所期望的基因组位置处。参见美国专利号US 7214536、US 8921332、US 8765448、US 5527695、US 5744336、US 5910415、US 6110736、US 6175058、US 6720475、US 6455315、US 6458594和美国专利公开号US2019093090、US2019264218、US2018327785、US2017240911、US2016208272、US2019062765。
表达盒还可以包括用于农艺性状的一种或多种目的多肽或双链RNA分子(dsRNA)的另外的编码序列，这些农艺性状的主要受益者是种子公司、栽培者或谷物加工者。目的多肽可以是由目的核苷酸序列编码的任何多肽。适用于在植物中产生的目的多肽的非限制性实例包括产生农艺学重要性状的那些多肽，这些性状如除草剂抗性(有时也称为“除草剂耐受性”)、病毒抗性、细菌病原体抗性、昆虫抗性、线虫抗性、或真菌抗性。参见，例如美国专利号5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；和6,337,431。该多肽还可以是提高植物活力或产量(包括允许植物在不同的温度、土壤条件以及日光和沉淀水平下生长的性状)的性状、或是允许对展现目的性状的植物进行鉴定的性状(例如，选择性标记、种皮颜色等)。不同的目的多肽以及将这些多肽引入植物的方法描述于例如美国专利号4,761,373；4,769,061；4,810,648；4,940,835；4,975,374；5,013,659；5,162,602；5,276,268；5,304,730；5,495,071；5,554,798；5,561,236；5,569,823；5,767,366；5,879,903；5,928,937；6,084,155；6,329,504和6,337,431；以及美国专利公开号2001/0016956中。
赋予对抑制生长点或分生组织的除草剂(如咪唑啉酮或磺酰脲)的抗性/耐受性的多核苷酸也可以适用于一些实施例中。对于突变型ALS和AHAS酶在这一分类号中的示例性多核苷酸如描述于例如，美国专利号5,767,366和5,928,937中。美国专利号4,761,373和5,013,659涉及抗不同的咪唑啉酮或磺酰脲除草剂的植物。美国专利号4,975,374涉及含有如下核酸的植物细胞和植物，该核酸编码突变型谷氨酰胺合成酶(GS)，该突变型谷氨酰胺合成酶抗已知抑制GS的除草剂(例如，膦丝菌素和甲硫氨酸磺基肟(methioninesulfoximine))的抑制作用。美国专利号5,162,602披露了抗环己二酮和芳氧苯氧丙酸除草剂的抑制作用的植物。该抗性由改变的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)赋予。
赋予对草甘膦抗性的、由核苷酸序列编码的多肽也适用于本披露。参见，例如，美国专利号4,940,835和美国专利号4,769,061。美国专利号5,554,798披露了抗草甘膦的转基因玉蜀黍植物，该抗性由改变的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶基因赋予。
编码对磷酰基化合物(如草铵膦或膦丝菌素、以及吡啶氧丙酸或苯氧丙酸以及环己酮)的抗性的多核苷酸也是适合的。参见，欧洲专利申请号0 242 246。还参见美国专利号5,879,903、5,276,268和5,561,236。
其他合适的多核苷酸包括编码对抑制光合作用的除草剂(如三嗪和苯基氰(腈水解酶))的抗性的那些，参见美国专利号4,810,648。编码用于除草剂抗性的另外的适合的多核苷酸包括编码对2,2-二氯丙酸、烯禾啶、吡氟氯禾灵、咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、均三嗪除草剂以及溴草腈的抗性的那些。同样合适的是赋予对原酶抗性的多核苷酸，或提供对植物疾病增强的抗性的多核苷酸；对不利环境条件(非生物胁迫)的增强的耐受性，该不利环境包括但不限于干旱、过冷、过热或土壤盐度过高或极端的酸性或碱性；以及植物结构或发育的改变，包括发育时间的改变。参见，例如，美国专利公开号2001/0016956和美国专利号6,084,155。
另外的适合的多核苷酸包括对杀有害生物(例如杀昆虫)多肽进行编码的那些。这些多肽可以按足以控制例如昆虫有害生物的量(即，昆虫控制量)来产生。应当认识到在植物中对控制昆虫或其他有害生物必要的杀有害生物多肽的产生量可以变化，这取决于栽培品种、有害生物的类型、环境因素等。可用于另外的昆虫或有害生物抗性的多核苷酸包括例如编码芽孢杆菌属(Bacillus)生物体中鉴定到的毒素的那些。已经克隆了包含编码来自几个亚种的苏云金芽孢杆菌(Bt)Cry蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，并且已经发现这些重组克隆对鳞翅目、双翅目和/或鞘翅目昆虫幼虫是有毒的。此类Bt杀昆虫蛋白的实例包括如下Cry蛋白，例如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1Ea、Cry1Fa、Cry3A、Cry9A、Cry9B、Cry9C等，连同营养期杀昆虫蛋白例如Vip1、Vip2、Vip3等。Bt衍生的蛋白的完整清单可以在万维网在苏塞克斯大学(University of Sussex)维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名法数据库中找到(还参见，Crickmore等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物分子生物学综述]62:807-813)。
在实施例中，另外的多肽是衍生自非Bt来源的杀昆虫多肽，包括但不限于：α淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种(如嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)或伯氏致病杆菌(X.bovienii))杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种(如发光杆菌(P.luminescens)或P.asymobiotica)杀昆虫蛋白、短芽孢杆菌属物种(如侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporous))杀昆虫蛋白、赖氨酸芽孢杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)(如球形赖氨酸芽孢杆菌(L.Sphearicus))杀昆虫蛋白、色杆菌属物种(如C.subtsugae或C.piscinae)杀昆虫蛋白、耶尔森菌属物种(如耶尔森噬虫霉(Y.entomophaga))杀昆虫蛋白、类芽孢杆菌属物种(如丙型类芽孢杆菌属(P.propylaea))杀昆虫蛋白、梭菌属物种(如双酶梭菌(C.bifermentans))杀昆虫蛋白、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(如荧光假单胞菌(P.fluorescens)杀昆虫蛋白和木质素。
适于在植物中产生的多肽进一步包括改善或通过其他方式有助于收获的植物或植物部分转化成为商业上有用的产品(包括例如增加的或改变的碳水化合物含量或分布、改善的发酵特性、增加的油含量、增加的蛋白质含量、改善的消化率、以及增加的营养成分含量(例如，增加的植物甾醇含量、增加的生育酚含量、增加的甾烷醇含量或增加的维生素含量))的那些。目的多肽还包括，例如在收获的作物中导致或促成不需要的组分(例如植酸、或降解糖的酶类)的含量降低的那些。“导致(resulting in)”或“促成(contributingto)”是指这种目的多肽可以直接或间接地促成目的性状的存在(例如，通过异源纤维素酶的使用来增加纤维素降解)。
在一些实施例中，该多肽促成了食品或饲料的改善的消化率。木聚糖酶是半纤维素分解酶，这些酶改进了植物细胞壁的分解，这导致动物更好地利用这些植物营养素。这导致了改善的生长速率和饲料转化。同样，可以减小含有木聚糖的饲料的粘度。在植物细胞内异源产生木聚糖酶也可以促进木质纤维素转化成工业加工中的可发酵糖。
已经鉴定和表征了来自真菌和细菌微生物的许多木聚糖酶(参见，例如，美国专利号5,437,992；Coughlin等人(1993)“Proceedings of the Second TRICEL Symposium onTrichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases[第二届TRICEL里氏木霉纤维素酶和其他水解酶研讨会论文集]”Espoo[埃斯波]；Souminen和Reinikainen编辑(1993)Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research[生物技术和工业发酵研究基础]8:125-135；美国专利公开号2005/0208178；以及PCT公开号WO 03/16654)。特别地，已经在里氏木霉中鉴定出三种特定的木聚糖酶(XYL-I、XYL-II和XYL-III)(Tenkanen等人(1992)Enzyme Microb.Technol.[酶与微生物技术]14:566；Torronen等人(1992)Bio/Technology[生物/技术]10:1461；以及Xu等人(1998)Appl.Microbiol.Biotechnol[应用微生物和生物技术].49:718)。
在其他实施例中，对于本披露有用的多肽可以是多糖降解酶。产生这样的酶的本披露的植物对于产生例如用于生物加工的发酵原料会是有用的。在一些实施例中、可用于发酵过程的酶包括α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角质酶、颗粒淀粉水解酶以及其他葡糖淀粉酶。
多糖降解酶包括：淀粉降解酶如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡萄糖醛酸酶(E.C.3.2.1.131)；外切-1,4-α-D葡聚糖酶如淀粉葡糖苷酶和葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)和其他外切淀粉酶；淀粉脱支酶，如a)异淀粉酶(EC 3.2.1.68)、支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)等；b)纤维素酶如外切-1,4-3-纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)、外切-1,3-β-D-葡聚糖酶(EC 3.2.1.39)、β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)；c)L-阿拉伯糖酶(arabinase)、如内切-1,5-α-L-阿拉伯糖酶(EC 3.2.1.99)、α-阿拉伯糖苷酶(EC 3.2.1.55)等；d)半乳聚糖酶如内切-1,4-β-D-半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)、内切-1,3-β-D-半乳聚糖酶(EC 3.2.1.90)、α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)等；e)甘露聚糖酶，如内切-1,4-β-D-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)、β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)、α-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.24)等；f)木聚糖酶，如内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、β-D-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)、1,3-β-D-木聚糖酶等；和g)其他酶如α-L-岩藻糖苷酶(EC 3.2.1.51)、α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)、果聚糖酶(EC3.2.1.65)、菊粉酶(EC 3.2.1.7)等。在一个实施例中，α-淀粉酶是描述于美国专利号8,093,453(通过引用以其全文并入本文)中的合成α-淀粉酶Amy797E。
可以与本披露一起使用的另外的酶包括蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。真菌蛋白酶包括但不限于从曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)和根霉属(Rhizopus)，如黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)、米曲霉(A.oryzae)和米黑毛霉(M.miehei)获得的那些。在一些实施例中，本披露的多肽可以是纤维二糖水解酶(CBH)(EC3.2.1.91)。在一个实施例中，该纤维二糖水解酶可以是CBH1或CBH2。
可用于本披露的其他酶包括但不限于半纤维素酶，例如甘露聚糖酶和阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)；木质素酶；脂肪酶(例如，E.C.3.1.1.3)、葡萄糖氧化酶、果胶酶、木聚糖酶、转葡糖苷酶、α1,6葡糖苷酶(例如，E.C.3.2.1.20)；酯酶，如阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)和乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；以及角质酶(例如，E.C.3.1.1.74)。
对本披露有用的双链RNA分子包括但不限于抑制靶标昆虫基因的那些。如本文所使用的，词语“基因抑制”当一起考虑时旨在是指用于减少作为基因转录为mRNA和该mRNA的后续翻译的结果而产生的蛋白质的水平的任何熟知的方法。基因抑制还旨在意指减少从基因或编码序列表达蛋白质，包括转录后基因抑制和转录抑制。转录后基因抑制由从靶向抑制的基因或编码序列转录的mRNA的全部或其一部分与用于抑制的相应双链RNA之间的同源性介导，并且是指在细胞中可供被核糖体结合使用的可获得的mRNA的量的实质且可测量的减少。经转录的RNA可以处于正义方向而发挥作用，称为共抑制，处于反义方向而发挥作用，称为反义抑制，或在两个方向上产生dsRNA而发挥作用，称为RNA干扰(RNAi)。转录抑制由细胞中存在作为基因抑制剂的与启动子DNA序列或其补体展示出实质序列同一性而发挥作用的dsRNA介导，称为启动子反式抑制。针对与性状相关的天然植物基因，基因抑制可以是有效的，例如，以提供具有减少水平的由该天然基因编码的蛋白质或具有增强或减少水平的受影响代谢物的植物。针对植物有害生物中的靶基因，基因抑制也可以是有效的，这些有害生物可以摄取或接触含有基因抑制剂的植物材料，这些基因抑制剂专门设计用于阻抑或抑制一种或多种同源或互补序列在该有害生物的细胞中的表达。靶向抑制的这样的基因可以编码必需蛋白质，其预测功能选自由以下组成的组：肌肉形成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶合成、细胞膜电势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子形成、外激素(pheromone)合成、外激素感测、触角形成、翼形成、腿形成、发育和分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸以及凋亡。
转基因细胞、植物、植物部分、种子
在一些方面，本披露进一步提供了包含本披露的杀昆虫蛋白或核酸的转基因细胞、植物、植物部分和种子。在一些实施例中，本披露提供了非人宿主细胞，其包含本披露的多核苷酸、核酸分子、表达盒、载体或多肽。转基因非人宿主细胞可包括但不限于植物细胞(包括单子叶植物细胞和/或双子叶植物细胞)、酵母细胞、细菌细胞或昆虫细胞。因此，在一些实施例中，提供了选自以下属的细菌细胞：芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发光杆菌属、巴氏杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、巴斯德氏菌属、黄单胞菌属、链霉菌属、根瘤菌属、红假单胞菌属、嗜甲基菌属、农杆菌属、醋酸杆菌属、乳酸杆菌属、节杆菌属、固氮菌属、明串珠菌属或产碱杆菌属。因此，例如，作为生物昆虫控制剂，所披露的杀昆虫蛋白可以通过在细菌细胞中表达编码其的多核苷酸来产生。例如，在一些实施例中，提供了包含编码本披露杀昆虫蛋白的多核苷酸的苏云金芽孢杆菌细胞。
在一些实施例中，转基因植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。在另外的实施例中，双子叶植物细胞是大豆细胞、向日葵细胞、番茄细胞、油菜细胞、棉花细胞、甜菜细胞或烟草细胞。在进一步的实施例中，单子叶植物细胞是大麦细胞、玉蜀黍细胞、燕麦细胞、水稻细胞、高粱细胞、甘蔗细胞或小麦细胞。在一些实施例中，本披露提供了包含表达所披露的杀昆虫蛋白的多核苷酸的多种双子叶细胞或单子叶细胞。在实施例中，将多个细胞并列以形成质外体并且使其在自然光照中生长。在实施例中，转基因植物细胞不能再生整株植物。
在本披露的其他实施例中，在高等生物体(例如，植物)中表达本披露的杀昆虫蛋白。这样的转基因植物表达有效量的杀昆虫蛋白以控制植物有害生物，如昆虫有害生物。当昆虫开始摄食这样的转基因植物时，它摄取了所表达的杀昆虫蛋白。这可以妨碍昆虫进一步咬食植物组织或者甚至可以伤害或杀死昆虫。在一些实施例中，所披露的多核苷酸被插入表达盒中，然后该表达盒被稳定地整合到植物的基因组中。在其他实施例中，该多核苷酸被包含在非致病性自我复制的病毒中。
在本披露的一些实施例中，包含本披露的核酸分子或多肽的转基因植物细胞是植物部分、植物器官或植物培养物(各自如在本文描述的)的细胞，包括但不限于根、叶、种子、花、果实、花粉细胞、器官或植物培养物等，或愈伤组织细胞或培养物。
根据本披露转化的转基因植物或植物细胞可以是单子叶或双子叶植物或植物细胞，并包括但不限于玉米(玉蜀黍)、大豆、水稻、小麦、大麦、黑麦、燕麦、高粱、粟、向日葵、红花、甜菜、棉花、甘蔗、油菜、苜蓿、烟草、花生、蔬菜(包括甘薯、豆类、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、西兰花、芜菁、胡萝卜、茄子、黄瓜、萝卜、菠菜、马铃薯、番茄、芦笋、洋葱、大蒜、瓜类、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、绿皮西葫芦)、水果(包括苹果、梨、榅桲、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉)和特种植物如拟南芥以及木本植物如针叶树和落叶树。优选地，本披露的植物是作物植物，如玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等。
一旦所期望的多核苷酸已转化到特定的植物物种中，可以使用任何合适的技术(包括传统的育种技术)将其在该物种中繁殖或转移到相同物种的其他品种中，特别地包括商业品种。
所披露的杀昆虫蛋白可以作为昆虫控制剂在植物部分、植物细胞、植物器官、种子、收获产物、加工产物或提取物等中起作用。换言之，在一些实施例中，该杀昆虫蛋白可以继续执行它在转基因植物中具有的杀昆虫功能。核酸可以起到表达该杀昆虫蛋白的作用。作为编码本披露的杀昆虫蛋白的替代方案，该核酸可用于鉴定本披露的转基因植物部分、植物细胞、植物器官、种子、收获产物、加工产物或提取物。
在实施例中，本披露的转基因植物、植物部分、植物细胞、植物器官或种子对于本披露的多核苷酸或表达盒是半合子的，例如，其中仅一个亲本植物含有本披露的多核苷酸或表达盒的杂交玉米植物。在实施例中，本披露的转基因植物、植物部分、植物细胞、植物器官或种子对于本披露的多核苷酸或表达盒是纯合的。
本披露的另外的实施例包括从本披露的转基因植物或其部分产生的收获产物以及从该收获产物产生的加工产物。收获产物可以是如本文描述的整株植物或任何植物部分。因此，在一些实施例中，收获产物的非限制性实例包括种子、果实、花或其部分(例如，花药、柱头等)、叶、茎等。在其他实施例中，加工产物包括但不限于从收获的本披露的种子或其他植物部分产生的面粉、粗粉、油、淀粉、谷物等，其中所述种子或其他植物部分包含本披露的核酸分子/多核苷酸/核苷酸序列。
在其他实施例中，本披露提供了来自本披露的转基因种子或转基因植物的提取物，其中该提取物包含本披露的核酸分子、多核苷酸、核苷酸序列或杀昆虫蛋白。来自植物或植物部分的提取物可以按照本领域熟知的程序制备(参见de la Torre等人,Food,Agric.Environ.[食品农业与环境]2(1):84-89(2004)；Guidet,Nucleic Acids Res.[核酸研究]22(9):1772-1773(1994)；Lipton等人，Food Agric.Immun.[食品和农业免疫学]12:153-164(2000))。这样的提取物可用于例如检测本披露杀昆虫蛋白或多核苷酸的存在的方法中。
在实施例中，如与不包含编码本披露杀昆虫蛋白的核酸的适合的对照相比，转基因植物、植物部分、植物细胞、植物器官、种子、收获产物、加工产物或提取物对一种或多种昆虫有害生物(例如鞘翅目有害生物，如西方玉米根虫)具有增加的杀昆虫活性。
植物转化
用于植物转化的方法的非限制性实例包括经由以下的转化：细菌介导的核酸递送(例如，经由农杆菌属)，病毒介导的核酸递送，碳化硅或核酸晶须介导的核酸递送，脂质体介导的核酸递送，显微注射，粒子轰击，磷酸钙介导的转化，环糊精介导的转化，电穿孔，纳米粒子介导的转化，超声处理，浸润，PEG介导的核酸吸收，以及导致向植物细胞中引入核酸的任何其他电学、化学、物理(机械)或生物机制，包括其任何组合。本领域已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人(“Procedures for Introducing Foreign DNA intoPlants[将外来DNA引入至植物中的程序]”于Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology[植物分子生物学和生物技术的方法]中，Glick,B.R.和Thompson,J.E.,编辑(CRC Press,Inc.[CRC出版有限公司],波卡拉顿,1993),第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(Cell.Mol.Biol.Lett.[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。
对于农杆菌属介导的转化，二元载体或携带至少一个T-DNA边界序列的载体通常是适合的，而对于直接基因转移(例如，粒子轰击等)，任何载体都是适合的，并且可以使用仅含有目的构建的线性DNA。在直接基因转移的情况下，可以使用以单个DNA物种的转化或共转化(Schocher等人,Biotechnology[生物技术]4:1093-1096(1986))。对于直接基因转移以及农杆菌属介导的转移二者，转化通常(但不是必需的)用如下选择性标记进行，该选择性标记可以是正向选择(例如，磷酸甘露糖异构酶)，提供对抗生素(例如，卡那霉素、潮霉素或甲氨蝶呤)或除草剂(例如，草甘膦或草铵膦)的抗性。然而，选择性标记的选择对于本披露并不是至关重要的。
农杆菌属介导的转化是用于转化植物的常用方法，这是由于其高转化效率以及由于它与许多不同物种的广泛实用性。农杆菌属介导的转化典型地涉及将携带目的外来DNA的二元载体转移至适当的农杆菌属菌株，这可能取决于由宿主农杆菌属菌株在共同存在的Ti质粒上或染色体地携带的vir基因的互补体(Uknes等人,1993,Plant Cell[植物细胞]5:159--169)。将该重组二元载体转移至农杆菌属可以使用携带该重组二元载体的大肠杆菌、辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶标农杆菌属菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将该重组二元载体转移至农杆菌属中(和Willmitzer,(1988)Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:9877)。
可以使用农杆菌属转化双子叶植物以及单子叶植物。用于农杆菌属介导的水稻转化方法包括已熟知的水稻转化方法，如任何以下文献中描述的那些：欧洲专利申请EP1198985 A1、Aldemita和Hodges(Planta[植物]199:612-617,1996)；Chan等人(Plant MolBiol[植物分子生物学]22(3):491-506,1993)、Hiei等人(Plant J[植物杂志]6(2):271-282,1994)，其披露内容通过引用并入本文，其引用程度如同完全阐明一样。在玉米转化的情况下，优选方法是如Ishida等人(Nat.Biotechnol[自然生物技术]14(6):745-50,1996)或Frame等人(Plant Physiol[植物生理学]129(1):13-22,2002)中所描述的，其披露内容通过引用并入本文，其引用程度如同完全阐明一样。所述方法通过以下文献中的实例来进一步描述：B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer[基因转移技术]，于:TransgenicPlants[转基因植物]，第1卷，Engineering and Utilization[工程与利用]，编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press[美国学术出版社](1993)128-143以及Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.[植物生理学与植物分子生物学年度综述]42(1991)205-225。有待表达的核酸或构建体优选地克隆至适合于转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的载体例如pBin19中(Bevan等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]12(1984)8711)。然后，能够以已知的方式使用由这样的载体转化的农杆菌来转化植物，如用作模型的植物像拟南芥或作物植物如烟草植物，方法是例如通过将捣碎的叶或切碎的叶浸没于农杆菌溶液中，并且然后将其在适合的培养基中培养。通过根癌农杆菌转化植物描述于例如，Hagen和Willmitzer,于Nucl.Acid Res.[核酸研究](1988)16,9877中，或者尤其从F.F.White,Vectors for Gene Transfer in Higher Plants[在高等植物中用于基因转移的载体]中已知；描述于Transgenic Plants[转基因植物]，第1卷，Engineering andUtilization[工程与利用]，编辑S.D.Kung和R.Wu,Academic Press[美国学术出版社]，1993，第15-38页。
可以将大豆植物材料适当地转化并且通过本领域的普通技术人员熟知的多种方法再生育性植物。例如，可以通过以下各项得到育性的形态学正常的转基因大豆植物：1)从例如未成熟的子叶、下胚轴或其他合适的组织产生体细胞胚性组织；2)通过粒子轰击或农杆菌属感染进行转化；以及3)再生植物。在一个实例中，如在美国专利号5,024,944中描述的，从大豆的未成熟胚中切除子叶组织，优选地将胚轴移出，并且在含有激素的培养基中进行培养以形成体细胞胚性植物材料。将该材料使用例如直接DNA方法、DNA包被的微弹轰击或用农杆菌属感染来转化，在适合的选择培养基上进行培养，并且任选地还在选择剂的连续存在下再生成育性转基因大豆植物。选择剂可以是抗生素如卡那霉素、潮霉素或除草剂(如草丁膦或草甘膦)，或可替代地，选择可以是基于可见标记基因(如GUS)的表达。可替代地，用于转化的靶组织包括分生组织而不是体细胞克隆胚性组织或任选地是花或形成花的组织。可以找到大豆转化的其他实例，例如通过物理DNA递送方法，如粒子轰击(Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞和发育生物学]27P:175-182；McCabe等人(1988)Bio/technology[生物技术]6:923-926)、晶须法(whisker)(Khalafalla等人(2006)African J.of Biotechnology[非洲生物技术杂志]5:1594-1599)、气溶胶束注射(美国专利号7,001,754)、或者通过农杆菌属介导的递送方法(Hinchee等人(1988)Bio/Technology[生物/技术]6:915-922；美国专利号7,002,058；美国专利申请公开号20040034889；美国专利申请公开号20080229447；Paz等人(2006)Plant Cell Report[植物细胞通讯]25:206-213)。
可以使用不同的转化方法，用上述含有选择性标记基因的二元载体来产生大豆转基因植物。例如，如所述(参见例如美国专利申请公开号20080229447)使用载体来转化未成熟的种子靶标，从而直接使用HPPD抑制剂(例如甲基磺草酮)作为选择剂来产生转基因HPPD大豆植物。任选地，其他除草剂耐受性基因可以在其他序列的旁边存在于多核苷酸中，这些其他序列提供选择/鉴别转化的组织的另外的手段，包括例如提供对卡那霉素、潮霉素、草丁膦、氟丙嘧草酯、或草甘膦的抗性的已知基因。例如，将含有PAT或EPSPS选择性标记基因的不同的二元载体转化到未成熟的大豆种子靶标中，从而如所述的使用农杆菌属介导的转化以及草铵膦或草甘膦选择产生杀有害生物剂和除草剂耐受性植物(参见例如，美国专利申请公开号20080229447)。
通过重组农杆菌属进行的植物转化通常涉及将农杆菌属与来自植物的外植体共培养，并且遵循本领域熟知的方法。在携带位于这些二元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记的选择培养基上对转化的组织进行再生。
如先前所讨论的，另一种用于转化植物、植物部分和植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推进惰性或生物活性的粒子。参见例如，美国专利号4,945,050；5,036,006和5,100,792。通常，此方法涉及在有效于穿透细胞的外表面并提供在其内部中的掺入的条件下在植物细胞处推进惰性或生物活性粒子。当利用惰性粒子时，可以通过用含有目的核酸的载体包被粒子而将载体引入至细胞中。可替代地，一个或多个细胞可以被载体围绕以使得载体通过粒子的激发而被携带至细胞中。也可以将生物学活性的粒子(例如，干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自包含一种或多种被试图引入的核酸)推进入到植物组织中。
在其他实施例中，本披露的多核苷酸可以被直接转化到质体基因组中。在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，以及在McBride等人(1994)Proc.Nati.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]91,7301-7305中广泛描述了质体转化技术。
选择转化的转基因植物、植物细胞或植物组织培养物的方法可以用于本文提供的本披露的方法中。例如，本披露的重组载体还可以包括包含用于选择性标记的核苷酸序列的表达盒，该选择性标记可以用于选择转化的植物、植物部分或植物细胞。
选择性标记的实例包括但不限于编码neo或nptII的核苷酸序列，其赋予对卡那霉素、G418等的抗性(Potrykus等人(1985)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与普通遗传学]199:183-188)；编码bar的核苷酸序列，其赋予对膦丝菌素的抗性；编码改变的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶的核苷酸序列，其赋予对草甘膦的抗性(Hinchee等人(1988)Biotech.[生物科技]6:915-922)；编码腈水解酶如来自臭鼻杆菌的bxn的核苷酸序列，其赋予对溴苯腈的抗性(Stalker等人(1988)Science[科学]242:419-423)；编码改变的乙酰乳酸合酶(ALS)的核苷酸序列，其赋予针对咪唑啉酮、磺酰脲或其他ALS抑制化学药剂的抗性(欧洲专利申请号154204)；编码甲氨蝶呤抗性二氢叶酸还原酶(DHFR)的核苷酸序列(Thillet等人(1988)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]263:12500-12508)；编码茅草枯脱卤酶的核苷酸序列，其赋予针对茅草枯的抗性；编码甘露糖-6-磷酸异构酶(也称为磷酸甘露糖异构酶(PMI))的核苷酸序列，其赋予代谢甘露糖的能力(美国专利号5,767,378和5,994,629)；编码改变的邻氨基苯甲酸合酶的核苷酸序列，其赋予针对5-甲基色氨酸的抗性；或编码hph的核苷酸序列，其赋予对潮霉素的抗性。本领域技术人员能够选择用于在本披露的表达盒中使用的适合的选择性标记。
另外的选择性标记包括但不限于编码β-葡糖醛酸糖苷酶的核苷酸序列或编码多种显色底物已知的酶的uidA(GUS)；R基因座核苷酸序列，其编码调节植物组织中花色苷色素(红色)产生的产物(Dellaporta等人，“Molecular cloning of the maize R-nj alleleby transposon-tagging with Ac[用Ac转座子标记的玉蜀黍R-nj等位基因的分子克隆]”263-282于：Chromosome Structure and Function:Impact of New Concepts[染色体结构和功能：新概念的影响]，18th Stadler Genetics Symposium[第18届斯塔德勒遗传学研讨会](Gustafson和Appels编辑，Plenum Press[普伦姆出版社]1988))；编码β-内酰胺酶的核苷酸序列，β-内酰胺酶是多种显色底物已知的酶(例如PADAC，一种显色头孢菌素)(Sutcliffe(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3737-3741)；编码xylE的核苷酸序列，xylE编码儿茶酚双加氧酶(Zukowsky等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:1101-1105)；编码酪氨酸酶的核苷酸序列，酪氨酸酶是能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌的酶，DOPA和多巴醌又缩合形成黑色素(Katz等人(1983)J.Gen.Microbiol.[普通微生物学杂志]129:2703-2714)；编码β-半乳糖苷酶的核苷酸序列，β-半乳糖苷酶是存在显色底物的酶；编码允许生物发光检测的荧光素酶(lux)的核苷酸序列(Ow等人(1986)Science[科学]234:856-859)；编码可用于钙敏感生物发光检测的水母发光蛋白的核苷酸序列(Prasher等人(1985)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学和生物物理学研究通讯]126:1259-1268)；或编码绿色荧光蛋白的核苷酸序列(Niedz等人(1995)Plant Cell Reports[植物细胞报告]14:403-406)或其他荧光蛋白，例如dsRed或mCherry。本领域技术人员能够选择用于在本披露的表达盒中使用的适合的选择性标记。
此外，如本领域中所熟知的，完整的转基因植物可以使用多种已知技术中的任何技术从转化的植物细胞、植物组织培养物或培养的原生质体再生而来。来自植物细胞、植物组织培养物或培养的原生质体的植物再生描述于例如，Evans等人(Handbook of PlantCell Cultures[植物细胞培养手册],第1卷,MacMilan Publishing Co.[麦克米兰出版公司],纽约(1983))；和Vasil I.R.(编辑)(Cell Culture and Somatic Cell Genetics ofPlants[植物的细胞培养和体细胞遗传学],Acad.Press[学术出版社],奥兰多,第I卷(1984)和第II卷(1986))中。
另外，工程化入以上所述的本披露的转基因种子和植物、植物部分或植物细胞中的遗传特性可以通过有性繁殖或营养生长来传递，并且因此可以在子代植物中维持并繁殖。通常，维持和繁殖利用了被开发以适合特定目的(如收获、播种或耕作)的已知农业方法。
因此，可以按本领域熟知的任意种方法(如上所述的)将多核苷酸引入该植物、植物部分或植物细胞中。因此，没有依赖用于将一种或多种多核苷酸引入植物中的特定方法，相反可以使用允许将该一种或多种多核苷酸稳定地整合到该植物的基因组中的任何方法。在有待引入一种以上多核苷酸的情况下，这些对应的多核苷酸可以作为单一核酸分子的一部分、或者作为分开的核酸分子而进行组装，并且可以位于相同的或不同的核酸分子上。因此，可以在单个转化事件中、在分开的转化事件中、或者例如作为育种方案的一部分在植物中，将这些多核苷酸引入目的细胞中。
一旦所期望的多核苷酸已经被转化进特定的植物物种中，便可以使用传统的育种技术将其在该物种中繁殖或将其转移到相同物种的其他品种中，特别是包括商业品种。
杀昆虫组合物
在一些实施例中，提供了杀昆虫组合物，该杀昆虫组合物包含农业上可接受的运载体中的本披露的杀昆虫蛋白。如本文所使用的，“农业上可接受的运载体”可以包括与活性蛋白组合以促进它应用至植物或其部分或者在植物或其部分中应用的天然或合成的有机或无机材料。农业上可接受的运载体的实例包括但不限于粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。农业上可接受的运载体进一步包括但不限于可用于农业配制品中的惰性组分、分散剂、表面活性剂、佐剂、增粘剂、粘着剂、粘合剂或其组合。这样的组合物可以按使杀有害生物蛋白或其他有害生物控制剂与这些有害生物接触的任何方式施用。因此，可以将这些组合物施用于植物或植物部分的表面，包括种子、叶、花、茎、块茎、根等。在其他实施例中，在植物中产生本披露的杀昆虫蛋白的植物是所表达的杀昆虫蛋白的农业上可接受的运载体，植物和该蛋白的组合是杀昆虫组合物。
在进一步的实施例中，该杀昆虫组合物包含细菌细胞或本披露的转基因细菌细胞，其中该细菌细胞或转基因细菌细胞产生本披露的杀昆虫蛋白。这样的杀昆虫组合物可以通过脱水、冷冻干燥、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌(Bt)的培养物(包括转基因Bt培养物)而制备。在实施例中，本披露的组合物可包含按重量计至少约1％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少99％的本披露的多肽。在另外的实施例中，该组合物包含按重量计从约1％至约99％的本披露的杀昆虫蛋白。
所披露的杀昆虫蛋白可以与其他有害生物控制剂组合使用，以增加有害生物靶标谱和/或用于预防或管理昆虫抗性。此外，所披露的杀昆虫蛋白与杀昆虫剂(其具有不同的作用方式或靶向昆虫肠中不同的受体)组合使用对于预防和/或管理昆虫抗性而言具有特定的功用。
因此，在一些实施例中，提供了控制一种或多种植物有害生物(例如昆虫有害生物，如鳞翅目昆虫有害生物、鞘翅目昆虫有害生物、半翅目昆虫有害生物和/或双翅目昆虫有害生物)的组合物，其中该组合物包含第一有害生物控制剂(其是所披露的杀昆虫蛋白)和至少第二有害生物控制剂(其不同于该第一有害生物控制剂)。在其他实施例中，该组合物是用于局部施用至植物的配制品。在仍其他实施例中，该组合物是转基因植物。在进一步的实施例中，该组合物是局部施用至转基因植物的配制品的组合。在一些实施例中，当转基因植物包含第二有害生物控制剂时，配制品包含第一有害生物控制剂(其是所披露的杀昆虫蛋白)。在其他实施例中，当转基因植物包含第一有害生物控制剂(其是本披露的杀昆虫蛋白)时，配制品包含第二有害生物控制剂。
在一些实施例中，该第二有害生物控制剂可以是以下中的一种或多种：化学杀有害生物剂(如杀昆虫剂)、苏云金芽孢杆菌(Bt)杀昆虫蛋白、和/或非Bt杀有害生物剂，包括但不限于致病杆菌属杀昆虫蛋白、发光杆菌属杀昆虫蛋白、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)杀昆虫蛋白、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)杀昆虫蛋白、蛋白酶抑制剂(丝氨酸和半胱氨酸类型两者)、凝集素、α-淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶或双链RNA(dsRNA)分子。
在其他实施例中，第二有害生物控制剂是一种或多种化学杀有害生物剂，其任选地是种子包衣。化学杀有害生物剂的非限制性实例包括拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、新烟碱、神经元钠通道阻断剂、杀昆虫大环内酯、γ-氨基丁酸(GABA)拮抗剂、杀昆虫脲以及保幼激素模拟物。在其他实施例中，化学杀有害生物剂是以下中的一种或多种：阿巴美丁、乙酰甲胺磷、啶虫脒、磺胺螨酯(amidoflumet)(S-1955)、除虫菌素(avermectin)、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、联苯肼酯(binfenazate)、噻嗪酮、克百威、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、噻虫胺、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、λ-三氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、杀螨隆、二嗪磷、除虫脲、乐果、苯虫醚、甲氨基阿维菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威(fenothicarb)、苯氧威、甲氰菊酯、唑螨酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、τ-氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、氯芬奴隆、马拉硫磷、聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多威、烯虫酯、甲氧氯、久效磷、甲氧虫酰肼、噻虫醛(nithiazin)、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、杀线威、对硫磷、甲基对硫磷、氯菊酯、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、吡蚜酮、啶虫丙醚、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌素、螺甲螨酯(spiromesifin)(BSN 2060)、硫丙磷、虫酰肼、伏虫隆、七氟菊酯、特丁硫磷、杀虫畏、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫双(thiosultap-sodium)、四溴菊酯、敌百虫和杀铃脲、涕灭威、杀线威、苯线磷、双甲脒、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、依杀螨、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨灵以及吡螨胺。在仍其他实施例中，化学杀有害生物剂选自以下中的一种或多种：氯氰菊酯、三氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯和β-氟氯氰菊酯、高氰戊菊酯、氰戊菊酯、四溴菊酯、苯硫威、灭多威、杀线威、硫双威、噻虫胺、吡虫啉、噻虫啉、茚虫威、多杀菌素、阿巴美丁、除虫菌素(avermectin)、甲氨基阿维菌素、硫丹、乙虫腈、氟虫腈、氟虫脲、杀铃脲、苯虫醚、蚊蝇醚、吡蚜酮以及双甲脒。
在另外的实施例中，第二有害生物控制剂可以是任何数目的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白中的一种或多种，包括但不限于Cry蛋白、营养期杀昆虫蛋白(VIP)以及任何前述杀昆虫蛋白的杀昆虫嵌合体。在其他实施例中，第二有害生物控制剂是选自以下的Cry蛋白：Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、Cry1Ai、Cry1Aj、Cry1Ba、Cry1Bb、Cry1Bc、Cry1Bd、Cry1Be、Cry1Bf、Cry1Bg、Cry1Bh、Cry1Bi、Cry1Ca、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Db、Cry1Dc、Cry1Dd、Cry1Ea、Cry1Eb、Cry1Fa、Cry1Fb、Cry1Ga、Cry1Gb、Cry1Gc、Cry1Ha、Cry1Hb、Cry1Hc、Cry1Ia、Cry1Ib、Cry1Ic、Cry1Id、Cry1Ie、Cry1If、Cry1Ig、Cry1Ja、Cry1Jb、Cry1Jc、Cry1Jd、Cry1Ka、Cry1La、Cry1Ma、Cry1Na、Cry1Nb、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2Ac、Cry2Ad、Cry2Ae、Cry2Af、Cry2Ag、Cry2Ah、Cry2Ai、Cry2Aj、Cry2Ak、Cry2Al、Cry2Ba、Cry3Aa、Cry3Ba、Cry3Bb、Cry3Ca、Cry4Aa、Cry4Ba、Cry4Ca、Cry4Cb、Cry4Cc、Cry5Aa、Cry5Ab、Cry5Ac、Cry5Ad、Cry5Ba、Cry5Ca、Cry5Da、Cry5Ea、Cry6Aa、Cry6Ba、Cry7Aa、Cry7Ab、Cry7Ac、Cry7Ba、Cry7Bb、Cry7Ca、Cry7Cb、Cry7Da、Cry7Ea、Cry7Fa、Cry7Fb、Cry7Ga、Cry7Gb、Cry7Gc、Cry7Gd、Cry7Ha、Cry7Ia、Cry7Ja、Cry7Ka、Cry7Kb、Cry7La、Cry8Aa、Cry8Ab、Cry8Ac、Cry8Ad、Cry8Ba、Cry8Bb、Cry8Bc、Cry8Ca、Cry8Da、Cry8Db、Cry8Ea、Cry8Fa、Cry8Ga、Cry8Ha、Cry8Ia、Cry8Ib、Cry8Ja、Cry8Ka、Cry8Kb、Cry8La、Cry8Ma、Cry8Na、Cry8Pa、Cry8Qa、Cry8Ra、Cry8Sa、Cry8Ta、Cry9Aa、Cry9Ba、Cry9Bb、Cry9Ca、Cry9Da、Cry9Db、Cry9Dc、Cry9Ea、Cry9Eb、Cry9Ec、Cry9Ed、Cry9Ee、Cry9Fa、Cry9Ga、Cry10Aa、Cry11Aa、Cry11Ba、Cry11Bb、Cry12Aa、Cry13Aa、Cry14Aa、Cry14Ab、Cry15Aa、Cry16Aa、Cry17Aa、Cry18Aa、Cry18Ba、Cry18Ca、Cry19Aa、Cry19Ba、Cry19Ca、Cry20Aa、Cry20Ba、Cry21Aa、Cry21Ba、Cry21Ca、Cry21Da、Cry21Ea、Cry21Fa、Cry21Ga、Cry21Ha、Cry22Aa、Cry22Ab、Cry22Ba、Cry22Bb、Cry23Aa、Cry24Aa、Cry24Ba、Cry24Ca、Cry25Aa、Cry26Aa、Cry27Aa、Cry28Aa、Cry29Aa、Cry29Ba、Cry30Aa、Cry30Ba、Cry30Ca、Cry30Da、Cry30Db、Cry30Ea、Cry30Fa、Cry30Ga、Cry31Aa、Cry31Ab、Cry31Ac、Cry31Ad、Cry32Aa、Cry32Ab、Cry32Ba、Cry32Ca、Cry32Cb、Cry32Da、Cry32Ea、Cry32Eb、Cry32Fa、Cry32Ga、Cry32Ha、Cry32Hb、Cry32Ia、Cry32Ja、Cry32Ka、Cry32La、Cry32Ma、Cry32Mb、Cry32Na、Cry32Oa、Cry32Pa、Cry32Qa、Cry32Ra、Cry32Sa、Cry32Ta、Cry32Ua、Cry33Aa、Cry34Aa、Cry34Ab、Cry34Ac、Cry34Ba、Cry35Aa、Cry35Ab、Cry35Ac、Cry35Ba、Cry36Aa、Cry37Aa、Cry38Aa、Cry39Aa、Cry40Aa、Cry40Ba、Cry40Ca、Cry40Da、Cry41Aa、Cry41Ab、Cry41Ba、Cry42Aa、Cry43Aa、Cry43Ba、Cry43Ca、Cry43Cb、Cry43Cc、Cry44Aa、Cry45Aa、Cry46Aa、Cry46Ab、Cry47Aa、Cry48Aa、Cry48Ab、Cry49Aa、Cry49Ab、Cry50Aa、Cry50Ba、Cry51Aa、Cry52Aa、Cry52Ba、Cry53Aa、Cry53Ab、Cry54Aa、Cry54Ab、Cry54Ba、Cry55Aa、Cry56Aa、Cry57Aa、Cry57Ab、Cry58Aa、Cry59Aa、Cry59Ba、Cry60Aa、Cry60Ba、Cry61Aa、Cry62Aa、Cry63Aa、Cry64Aa、Cry65Aa、Cry66Aa、Cry67Aa、Cry68Aa、Cry69Aa、Cry69Ab、Cry70Aa、Cry70Ba、Cry70Bb、Cry71Aa、Cry72Aa、Cry73Aa、或以上任何组合。在一些实施例中，第二有害生物控制剂包含Bt11事件中的Cry1Ab蛋白(参见美国专利号US 6,114,608)、MIR604事件中的Cry3A055蛋白(参见美国专利号US 8884102)、5307事件中的eCry3.1Ab蛋白(参见美国专利号US10428393)和/或MZI098事件中的mCry3A蛋白(参见美国专利申请号US20200190533)。在一些实施例中，第二有害生物控制剂包含Bt11事件(参见美国专利号US 6,114,608)、MIR604事件(参见美国专利号US 8884102)、5307事件(参见美国专利号US 10428393)和/或MZI098事件(参见美国专利申请号US20200190533)。
在进一步的实施例中，第二有害生物控制剂是一种或多种Vip3营养期杀昆虫蛋白。将蛋白质鉴定为Vip3类蛋白质的一些结构特征包括：1)尺寸为约80-88kDa，其通过昆虫或胰蛋白酶蛋白水解加工成约62-66kDa毒性核心(Lee等人2003.Appl.Environ.Microbiol.[应用环境微生物学]69:4648-4657)；和2)高度保守的N-末端分泌信号，其在苏云金芽孢杆菌中的分泌期间不会天然地被加工。Vip3类的成员和它们相应的GenBank登录号、美国专利或专利公开号的非限制性实例是Vip3Aa1(AAC37036)、Vip3Aa2(AAC37037)、Vip3Aa3(美国专利号6,137,033)、Vip3Aa4(AAR81079)、Vip3Aa5(AAR81080)、Vip3Aa6(AAR81081)、Vip3Aa7(AAK95326)、Vip3Aa8(AAK97481)、Vip3Aa9(CAA76665)、Vip3Aa10(AAN60738)、Vip3Aa11(AAR36859)、Vip3Aa12(AAM22456)、Vip3Aa13(AAL69542)、Vip3Aa14(AAQ12340)、Vip3Aa15(AAP51131)、Vip3Aa16(AAW65132)、Vip3Aa17(美国专利号6,603,063)、Vip3Aa18(AAX49395)、Vip3Aa19(DQ241674)、Vip3Aa19(DQ539887)、Vip3Aa20(DQ539888)、Vip3Aa21(ABD84410)、Vip3Aa22(AAY41427)、Vip3Aa23(AAY41428)、Vip3Aa24(BI 880913)、Vip3Aa25(EF608501)、Vip3Aa26(EU294496)、Vip3Aa27(EU332167)、Vip3Aa28(FJ494817)、Vip3Aa29(FJ626674)、Vip3Aa30(FJ626675)、Vip3Aa31(FJ626676)、Vip3Aa32(FJ626677)、Vip3Aa33(GU073128)、Vip3Aa34(GU073129)、Vip3Aa35(GU733921)、Vip3Aa36(GU951510)、Vip3Aa37(HM132041)、Vip3Aa38(HM117632)、Vip3Aa39(HM117631)、Vip3Aa40(HM132042)、Vip3Aa41(HM132043)、Vip3Aa42(HQ587048)、Vip3Aa43(HQ594534)、Vip3Aa44(HQ650163)、Vip3Ab1(AAR40284)、Vip3Ab2(AAY88247)、Vip3Ac1(美国专利申请公开20040128716)、Vip3Ad1(美国专利申请公开20040128716)、Vip3Ad2(CAI43276)、Vip3Ae1(CAI43277)、Vip3Af1(美国专利号7,378,493)、Vip3Af2(ADN08753)、Vip3Af3(HM117634)、Vip3Ag1(ADN08758)、Vip3Ag2(FJ556803)、Vip3Ag3(HM117633)、Vip3Ag4(HQ414237)、Vip3Ag5(HQ542193)、Vip3Ah1(DQ832323)、Vip3Ba1(AAV70653)、Vip3Ba2(HM117635)、Vip3Bb1(美国专利号7,378,493)、Vip3Bb2(AB030520)和Vip3Bb3(ADI48120)。在实施例中，Vip3蛋白是Vip3Aa(美国专利号6,137,033)，例如，如由玉米事件MIR162所代表的(美国专利号8,232,456；美国专利号8,455,720；和美国专利号8,618,272)。在一些实施例中，第二有害生物控制剂包括事件MIR162(美国专利号8,232,456；美国专利号8,455,720；和美国专利号8,618,272)。
在一些实施例中，第二种有害生物控制剂包含存在于任何下列事件中的任一种或多种杀昆虫蛋白或dsRNA：Bt11事件(参见美国专利号US 6114608)、MIR604事件(参见美国专利号US 8884102)、MIR162事件(参见美国专利号8232456)、5307事件(参见美国专利号US10428393)、MZIR098事件(参见美国专利申请号US 20200190533)、TC1507事件(参见美国专利号US 7288643)、DAS-59122-7事件(参见美国专利号US 7323556)、MON810事件(参见US6713259)、MON863事件(参见美国专利号US 7705216)、MON89034事件(参见美国专利号US8062840)、MON88017事件(参见美国专利号US 9556492)、DP-4114事件(参见美国专利号US9725772)、MON87411事件(参见美国专利号US 9441240)、DP-032218-9事件(参见美国专利申请号US2015361447)、DP-033121-3事件(参见美国专利申请号US2015361446)、DP-023211-2事件(参见PCT公开号WO 2019209700)、MON95379事件(参见美国专利申请号US2020032289)、DBN9936事件(参见PCT公开号WO 2016173361)、DBN9501事件(参见PCT公开号WO 20207125)、GH5112E-117C事件(参见PCT公开号WO 17/088480)、LP007-1事件(参见中国专利申请号CN 112852801)、LP007-2事件(参见中国专利申请号CN 112831584)、LP007-3事件(参见中国专利申请号CN 112877454)、LP007-4事件(参见中国专利申请号CN112831585)、LP007-5事件(参见中国专利申请号CN 113151534)、LP007-6事件(参见中国专利申请号CN 113151533)、LP007-7事件(参见中国专利申请号CN 112852991)、LP007-8事件(参见CN 113980958)、Ruifeng8，ND207或Ruifeng125事件(参见中国专利申请号CN105017391)、KJ1172事件(参见中国专利申请号CN 1164109774)、LD02事件(参见中国专利申请号CN 115820630 A)、LD05事件(参见中国专利申请号CN 116287384)、LG11事件(参见中国专利申请号CN 116200529 A和CN 115725571 A)、DBN9235事件(参见中国专利申请号CN 116219063)、DBN9508事件(参见中国专利号CN 109971880)、DBN9888事件(参见PCT公开号WO 16/173540)、DBN9978事件(参见PCT公开号WO 16/173362)、DBN9953事件(参见中国专利号CN 104878092)、DBN9927事件(参见PCT公开号WO 16/173360)、LP026-1事件(参见中国申请号CN 116144672A)、LP026-2事件(参见中国申请号CN 116144818 A)、LP026-3事件(参见中国申请号CN 116144671 A)、LP026-4事件(参见中国申请号CN 116144817 A)、LP026-5事件(参见中国申请号CN 116200519A)、2A-7事件(参见中国专利申请号CN 112280743 A)、CA09328事件(参见中国专利申请号CN 112126707 A)、ZM8-143事件(参见中国专利申请号CN 108018286)、ZM1-027事件(参见中国专利申请号CN 108018368 A)、DP-915635-4事件(参见PCT公开号WO 21/247204)、DP-910521-2事件(参见PCT公开号WO 23/091888)、DAS-01131-3事件(参见PCT公开号WO 23/091884)、MON95275事件(参见PCT公开号WO 21/216571)和EH913事件(参见PCT公开号WO 21/087586)。
在实施例中，第二有害生物控制剂可以衍生自除苏云金芽孢杆菌外的来源。例如，第二有害生物控制剂可以是α淀粉酶、过氧化物酶、胆固醇氧化酶、马铃薯糖蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、脲酶、α-淀粉酶抑制剂、成孔蛋白、几丁质酶、凝集素、工程化抗体或抗体片段、蜡样芽孢杆菌杀昆虫蛋白、致病杆菌属物种(如嗜线虫致病杆菌(X.nematophila)或伯氏致病杆菌(X.bovienii))杀昆虫蛋白、发光杆菌属物种(如发光杆菌(P.luminescens)或P.asymobiotica)杀昆虫蛋白、短芽孢杆菌属物种(如侧孢短芽孢杆菌(B.laterosporous))杀昆虫蛋白、赖氨酸芽孢杆菌属物种(Lysinibacillus spp.)(如球形赖氨酸芽孢杆菌(L.Sphearicus))杀昆虫蛋白、色杆菌属物种(如C.subtsugae或C.piscinae)杀昆虫蛋白、耶尔森菌属物种(如耶尔森噬虫霉(Y.entomophaga))杀昆虫蛋白、类芽孢杆菌属物种(如丙型类芽孢杆菌属(P.propylaea))杀昆虫蛋白、梭菌属物种(如双酶梭菌(C.bifermentans))杀昆虫蛋白、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(如荧光假单胞菌(P.fluorescens))杀昆虫蛋白和木质素。在其他实施例中，该第二药剂可以是至少一种衍生自来自发光杆菌、致病杆菌、沙雷氏菌或耶尔森氏菌的杀昆虫毒素复合物(Tc)的杀昆虫蛋白。在其他实施例中，杀昆虫蛋白可以是衍生自杀昆虫细菌如发光杆菌属物种的ADP-核糖基转移酶。在其他实施例中，杀昆虫蛋白可以是VIP蛋白，如来自蜡样芽孢杆菌的VIP1和/或VIP2。在仍其他实施例中，该杀昆虫蛋白可以是衍生自杀昆虫细菌(如来自侧孢短芽孢杆菌的ISP1A和ISP2A或来自球形芽孢杆菌的BinA和BinB)的二元毒素。在仍其他实施例中，杀昆虫蛋白可以被工程化或可以是前述杀昆虫蛋白中的任一个的杂交体或嵌合体。
第二有害生物控制剂的其他实例包括DIG-657(美国专利公开2015366211)；PtIP-96(美国专利公开2017233440)；PIP-72(美国专利公开US2016366891)；PIP-83(美国专利公开2016347799)；PIP-50(美国专利公开2017166921)；IPD73(美国专利公开2019119334)；IPD090(美国专利公开2019136258)；IPD80(美国专利公开2019256563)；IPD078、IPD084、IPD086、IPD087、IPD089(美国专利公开2020055906)；IPD093(国际申请公开WO2018111551)；IPD059(国际申请公开WO 2018232072)；IPD113(国际申请公开WO2019178042)；IPD121(国际申请公开WO 2018208882)；IPD110(国际申请公开WO2019178038)；IPD103(国际申请公开WO 2019125717)；IPD092；IPD095；IPD097；IPD099；IPD100、IPD105；IPD106；IPD107；IPD111；IPD112(国际申请公开WO 2020055885)；IPD102(国际申请公开WO 2020076958)Cry1B.868和Cry1Da_7(美国专利公开2020-032289)；TIC107(美国专利8049071)；Cry2Ab和Cry1A.105(美国专利10584391)；Cry1F、Cry34Ab1、Cry35Ab1(美国专利10407688)；TIC6757、TIC7472、TIC7473、TIC6757(美国专利公开2017058294)；TIC3668、TIC3669、TIC3670、TIC4076、TIC4078、TIC4260、TIC4346、TIC4826、TIC4861、TIC4862、TIC4863、TIC-3668(美国专利公开2016319302)；TIC7040、TIC7042、TIC7381、TIC7382、TIC7383、TIC7386、TIC7388、TIC7389(美国专利公开2018291395)；TIC7941(美国专利公开2020229445)TIC836、TIC860、TIC867、TIC868、TIC869、和TIC1100(国际申请公开WO 2016061391)、TIC2160(国际申请公开WO 2016061392)、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、AND AXMI-045(美国专利公开20130117884)、AXMI-52、AXMI-58、AXMI-88、AXMI-97、AXMI-102、AXMI-112、AXMI-117、AXMI-100(美国专利公开201-0310543)、AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005(美国专利公开20130104259)、AXMI-134(美国专利公开20130167264)、AXMI-150(美国专利公开20100160231)、AXMI-184(美国专利公开20100004176)、AXMI-196、AXMI-204、AXMI-207、AXMI-209(美国专利公开2011-0030096)、AXMI-218、AXMI-220(美国专利公开20140245491)、AXMI-221z、AXMI-222z、AXMI-223z、AXMI-224z、AXMI-225z(美国专利公开20140196175)、AXMI-238(美国专利公开20140033363)、AXMI-270(美国专利公开20140223598)、AXMI-345(美国专利公开20140373195)、AXMI-335(国际申请公开WO2013134523)、DIG-3(美国专利公开20130219570)、DIG-5(美国专利公开20100317569)、DIG-11(美国专利公开20100319093)、AfIP-1A(美国专利公开20140033361)、AfIP-1B(美国专利公开20140033361)、PIP-1APIP-1B(美国专利公开20140007292)、PSEEN3174(美国专利公开20140007292)、AECFG-592740(美国专利公开20140007292)、Pput_1063(美国专利公开20140007292)、DIG-657(国际申请公开WO 2015195594)、Pput_1064(美国专利公开20140007292)、GS-135(美国专利公开20120233726)、GS153(美国专利公开20120192310)、GS154(美国专利公开20120192310)、GS155(美国专利公开20120192310)、DIG-911和DIG-180(美国专利公开号20150264940)；等等。
在一些实施例中，该第二杀有害生物剂可以是非蛋白质的(例如干扰RNA分子，如dsRNA)，其可以被转基因表达或作为组合物的一部分应用(例如，使用局部方法)。干扰RNA分子典型地包含针对靶基因的至少一种RNA片段、间隔序列、和与第一RNA片段互补的第二RNA片段，从而可以形成双链RNA结构。当生物体识别双链RNA(dsRNA)分子并水解它们时，RNA干扰(RNAi)发生。所得的水解产物是约19-24个核苷酸长度的小RNA片段，这些小RNA片段被称为小干扰RNA(siRNA)。然后这些siRNA扩散或被携带至整个生物体，包括越过细胞膜，在那里它们与mRNA(或其他的RNA)杂交并且导致RNA的水解。干扰RNA由RNA干扰沉默复合体(RISC)识别，RNA的效应链(或“引导链”)位于该复合体中。此引导链充当双链体序列的识别和破坏模板。每次siRNA与其互补RNA靶标杂交，此过程都被重复，有效防止那些mRNA被翻译，并且因此“沉默”mRNA自其中转录的特异性基因的表达。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制(参见例如，公开WO 2013/192256，其通过引用并入本文)。设计用于昆虫控制的干扰RNA产生非天然存在的双链RNA，其利用昆虫中的天然RNAi途径来触发靶基因的下调，这可能导致停止摄食和/或生长并可能导致昆虫有害生物死亡。干扰RNA分子可赋予针对与所披露的蛋白相同的靶标有害生物的昆虫抗性或可靶向不同的有害生物。靶标昆虫植物有害生物可以通过咀嚼、吸吮或刺穿来摄食。本领域已知干扰RNA可用于昆虫控制。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利公开20190185526、2018020028或20190177736中。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利号9,238,8223、9,340,797或8,946,510中。在实施例中，可用于昆虫控制的dsRNA描述于美国专利公开20200172922、20110054007、20140275208、20160230185或20160230186中。在其他实施例中，干扰RNA可赋予针对非昆虫植物有害生物(如线虫有害生物或病毒有害生物)的抗性。
在仍进一步的实施例中，在转基因植物中共表达第一昆虫控制剂(其是所披露的杀昆虫蛋白)和第二有害生物控制剂。可以通过将植物遗传工程化以含有并表达编码昆虫控制剂的核酸序列来实现一种以上杀有害生物成分在相同转基因植物中的共表达。例如，一种以上杀有害生物剂在相同转基因植物中的共表达可以通过制备单一的重组载体(其在“分子叠加(molecular stack)”中包含一种以上杀有害生物剂的编码序列)并对植物进行遗传工程化以在该转基因植物中含有并表达所有的杀有害生物剂而实现。这样的分子堆积还可以通过使用微型染色体进行制造，如在例如美国专利7,235,716中所述的。可替代地，可以将植物(亲本1)遗传工程化，用于所披露的杀昆虫蛋白的表达。可以将第二植物(亲本2)遗传工程化，用于第二有害生物控制剂的表达。通过将亲本1与亲本2杂交，获得了表达来自亲本1和亲本2二者的昆虫控制剂的子代植物。
在其他实施例中，本披露提供了对植物有害生物侵染有抗性的叠加性转基因植物，该植物包含编码用于在靶标有害生物中抑制必需基因的dsRNA的核酸(例如DNA)序列和编码针对该靶标有害生物展示出杀昆虫活性的所披露的杀昆虫蛋白的核酸(例如DNA)序列。
包含和/或表达所披露的蛋白的转基因植物或种子还可以用杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣进行处理，如美国专利号5,849,320和5,876,739中所述的。在实施例中，在本披露的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣以及转基因植物或种子针对相同靶标昆虫例如鞘翅目有害生物(例如西方玉米根虫)具有活性的情况下，该组合(i)在用于进一步增强本披露的组合物针对该靶标昆虫的活性的方法中和/或(ii)在用于通过提供针对该靶标昆虫的又另一种作用机制而预防对本披露的组合物产生抗性的方法中是有用的。因此，在实施例中，提供了增强鞘翅目昆虫群体的控制的方法，该方法包括提供本披露的转基因植物或种子并且向该植物或该种子施用本披露的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣。
即使在杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣针对不同昆虫具有活性的情况下，该杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣对于扩展昆虫控制的范围是有用的，例如通过将针对鞘翅目昆虫具有活性的杀昆虫剂或杀昆虫种子包衣添加到本披露的转基因种子(在一些实施例中针对鳞翅目昆虫具有活性)中，所产生的包被的转基因种子控制鳞翅目和鞘翅目昆虫有害生物两者。
制备和使用杀昆虫蛋白、核酸和转基因植物的方法
除了提供组合物之外，本披露还提供了产生和使用本披露的杀昆虫蛋白的方法。在一些实施例中，产生方法包括在宿主细胞产生对鞘翅目有害生物有毒性的杀昆虫蛋白的条件下，培养包含表达所描述的杀昆虫蛋白的多核苷酸、表达盒或载体的转基因非人宿主细胞。在一些实施例中，转基因非人宿主细胞是植物细胞。在一些其他实施例中，植物细胞是玉蜀黍细胞。在其他实施例中，植物细胞生长的条件包括自然阳光。在其他实施例中，转基因非人宿主细胞是细菌细胞。在仍其他实施例中，转基因非人宿主细胞是酵母细胞。
在一些实施例中，本披露的方法提供对至少一种鞘翅目有害生物的控制，该鞘翅目有害生物包括但不限于以下中的一种或多种：巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)(北方玉米根虫)、玉米根萤叶甲(西方玉米根虫)、十一星根萤叶甲(南方玉米根虫)、黄瓜条根萤叶甲(D.balteata)(带状黄瓜甲虫(banded cucumber beetle))、黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata undecimpunctata)(西方斑点黄瓜甲虫(western spotted cucumberbeetle))、斯格尼根萤叶甲(D.significata)(3斑叶甲(3-spotted leaf beetle))、南美叶甲(D.speciosa)(菊花甲虫(chrysanthemum beetle))、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫)、班尼根萤叶甲(D.beniensis)、克里斯塔根萤叶甲(D.cristata)、科威根萤叶甲(D.curviplustalata)、双斑根萤叶甲(D.dissimilis)、华丽根萤叶甲(D.elegantula)、伊墨根萤叶甲(D.emorsitans)、禾本科根萤叶甲(D.graminea)、伊斯帕尼根萤叶甲(D.hispanolae)、莱米妮根萤叶甲(D.lemniscata)、赭腿根萤叶甲(D.linsleyi)、米勒根萤叶甲(D.milleri)、钱币形根萤叶甲(D.nummularis)、扇叶根萤叶甲(D.occlusal)、普拉根萤叶甲(D.porracea)、蜗牛根萤叶甲(D.scutellata)、胫骨根萤叶甲(D.tibialis)、三线根萤叶甲(D.trifasciata)和微绿根萤叶甲(D.viridula)；及其任何组合。鞘翅目昆虫有害生物的其他非限制性实例包括瘦跗叶甲属物种，如马铃薯叶甲(科罗拉多马铃薯甲虫)；叶甲虫属物种(Chrysomela spp.)，如黑杨叶甲(C.scripta)(黑杨叶甲虫(cottonwood leafbeetle))；咪小蠹属物种(Hypothenemus spp.)，如咖啡果小蠹(H.hampei)(咖啡豆钻孔虫(coffee berry borer))；米象属物种(Sitophilus spp.)，如玉米象(S.zeamais)(玉蜀黍象(maize weevil))；毛跳甲属物种(Epitrix spp.)，如烟草跳甲(E.hirtipennis)(烟草跳(tobacco flea beetle))和黄瓜跳甲(E.cucumeris)(马铃薯跳甲(potato fleabeetle))；条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)，如萝卜菜跳甲(P.cruciferae)(十字花科植物跳甲(crucifer flea beetle))和西方黑跳甲(P.pusilla)(西方黑色跳甲(westernblack flea beetle))；花象属物种(Anthonomus spp.)，如胡椒花象(A.Eugenii)(胡椒茎象甲(pepper weevil))；金针虫属物种(Hemicrepidus spp.)，如金针虫(H.memnonius)(铁线虫(wireworms))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)，如普通梳爪叩头甲(M.communis)(铁线虫)；荚象甲属物种(Ceutorhychus spp.)，如白菜籽龟象(C.assimilis)(甘蓝心皮象鼻虫(cabbage seedpod weevil))；条跳甲属物种，如十字花科跳甲(十字花科植物跳甲)；Aeolus属物种(Aeolus spp.)，如A.mellillus(铁线虫)；Aeolus属物种，如A.mancus(小麦铁线虫(wheat wireworm))；砂铁线属物种(Horistonotusspp.)，如砂铁线虫(H.uhlerii)(沙子铁线虫(sand wireworm))；尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)，如玉米谷象(S.maidis)(玉蜀黍谷象(maize billbug))、梯牧草谷象(S.zeae)(梯牧草谷象虫(timothy billbug))、牧草长喙象(S.parvulus)(早熟禾谷象(bluegrass billbug))和南方玉米长喙象(S.callosus)(南方玉米谷象(southern cornbillbug))；鳃角金龟属物种(Phyllophaga spp.)(蛴螬(white grub))；凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)，如玉米铜色跳甲(C.pulicaria)(玉米跳甲(corn flea beetle))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)，如日本弧丽金龟(P.japonica)(日本金龟子(Japanesebeetle))；食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)，如墨西哥豆瓢虫(E.varivestis)(墨西哥豆甲虫(Mexican bean beetle))；萤叶甲属物种(Cerotoma spp.)，如豆叶甲(C.trifurcate，Bean leaf beetle)；豆芫菁属物种(Epicauta spp.)，如边缘豆芫菁(E.pestifera)和芫菁(E.lemniscata)(斑蝥(Blister beetles))；以及前述的任何组合。在一些实施例中，该杀昆虫蛋白针对西方玉米根虫集落具有杀昆虫活性，该西方玉米根虫集落对商业产品中存在的一种或多种杀昆虫蛋白(如mCry3a、eCry3.1Ab、Cry3Bb1、Cry34/35、IPD072Aa或IPD079Ea)具有抗性。
还涵盖产生抗昆虫(例如，抗鞘翅目昆虫)的转基因植物的方法。在一些实施例中，该方法包括：向植物中引入包含编码所披露的杀昆虫蛋白的核苷酸序列的多核苷酸、表达盒或载体，其中该核苷酸序列在该植物中表达以产生所披露的杀昆虫蛋白，从而赋予该植物对昆虫有害生物的抗性，以及产生抗昆虫的转基因植物(例如，如与适合的对照植物相比，该对照植物如不包含所披露的多核苷酸、表达盒或载体和/或不表达所披露的杀昆虫多肽的植物)。
在一些实施例中，抗有害生物转基因植物对选自由以下组成的组的昆虫有害生物具有抗性：玉米根萤叶甲(西方玉米根虫；WCR)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫；NCR)和/或十一星根萤叶甲(南方玉米根虫；SCR)和/或其他根萤叶甲属物种(包括墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫))。
在实施例中，向植物中引入所披露的多核苷酸、表达盒或载体的方法包括首先用多核苷酸、表达盒或载体转化植物细胞并由此再生转基因植物，其中该转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体，并表达本披露的所披露嵌合杀昆虫蛋白。
可替代地或另外地，该引入步骤可以包括使包含多核苷酸、表达盒或载体的第一植物与第二植物(例如，与第一植物不同的植物，例如不包含多核苷酸、表达盒或载体的植物)杂交，并且任选地，产生包含多核苷酸、表达盒或载体并表达所披露的杀昆虫蛋白的子代植物，从而导致对至少一种昆虫有害生物的增加的抗性。因此，转基因植物涵盖是转化事件的直接结果的植物及其(任一代)子代，该植物及其子代包含多核苷酸、表达盒或载体并任选地表达杀昆虫蛋白，从而导致对至少一种昆虫有害生物的增加的抗性。一旦所期望的核酸分子已转化到特定的植物物种中，可以使用传统的育种技术将其在该物种中繁殖或转移到相同物种的其他品种中，特别地包括商业品种。
本披露进一步提供了鉴定本披露的转基因植物的方法，该方法包括检测植物(或由其衍生的植物细胞、植物部分等)中的本披露的多核苷酸、表达盒、载体或杀昆虫蛋白的存在，从而基于本披露的多核苷酸、表达盒、载体或杀昆虫蛋白的存在将该植物鉴定为本披露的转基因植物。
实施例进一步提供了产生对至少一种昆虫有害生物(例如，至少一种鳞翅目有害生物)具有增加的抗性的转基因植物的方法，该方法包括：种植包含本披露的多核苷酸、表达盒或载体的种子，并且使来自该种子的转基因植物生长，其中该转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白。
在实施例中，通过本披露的方法产生的转基因植物包含本披露的多核苷酸、表达盒或载体。在实施例中，通过本披露的方法产生的转基因植物包含本披露的杀昆虫蛋白，并且任选地对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
产生本文描述的转基因植物的方法任选地包括进一步从该转基因植物中收获种子的步骤，其中该种子包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白。任选地，该种子产生另外的转基因植物，该转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白，从而对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
本披露进一步提供了通过本披露的方法产生的转基因植物的植物部分、植物细胞、植物器官、植物培养物、种子、植物提取物、收获产物和加工产物。
作为另外的方面，本披露还提供了产生种子的方法，该方法包括：提供包含所披露的多核苷酸、表达盒或载体的转基因植物，并且收获来自该转基因植物的种子，其中该种子包含多核苷酸、表达盒、载体并产生杀昆虫蛋白。任选地，该种子产生另外的转基因植物，该转基因植物包含多核苷酸、表达盒或载体并产生杀昆虫蛋白，从而对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。在代表性实施例中，提供该转基因植物的步骤包括种植产生该转基因植物的种子。
进一步提供了产生杂交植物种子的方法，该方法包括：使第一近交植物(其是包含本披露的多核苷酸、表达盒或载体并任选地表达本披露的杀昆虫蛋白的转基因植物)与不同近交植物(例如，不包含本披露的多核苷酸、表达盒或载体的近交植物)杂交，并且允许形成杂交种子。任选地，该方法进一步包括收获杂交种子。在实施例中，该杂交种子包含本披露的多核苷酸、表达盒或载体，并且在实施例中可进一步包含本披露的杀昆虫蛋白并对昆虫有害生物具有增加的抗性。在实施例中，该杂交种子产生转基因植物，该转基因植物包含本披露的多核苷酸、表达盒或载体，表达本披露的杀昆虫蛋白，并且对至少一种昆虫有害生物具有增加的抗性。
在进一步的实施例中，提供了控制鞘翅目有害生物的方法，该方法包括向有害生物或含有此类有害生物的环境递送有效量的披露的杀昆虫蛋白。为了有效，该杀昆虫蛋白首先被昆虫经口摄取。然而，杀昆虫蛋白可以以许多方式递送至昆虫。将蛋白经口递送至昆虫的方式包括但不限于(1)在转基因植物中提供该蛋白，其中昆虫采食(摄取)转基因植物的一个或多个部分，从而摄取在转基因植物中表达的多肽；(2)在一种或多种可施用于或掺入例如昆虫生长培养基的配制的蛋白组合物中提供该蛋白；(3)在一种或多种可施用于植物部分的表面(例如喷雾到植物部分的表面上)的蛋白组合物中提供该蛋白，然后当昆虫采食一个或多个被喷雾的植物部分时被昆虫摄取；(4)饵基；或(5)任何其他本领域公认的蛋白质递送系统。因此，可以使用经口递送至昆虫的任何方法来递送本披露的所披露的杀昆虫蛋白。在一些特定实施例中，将所披露的杀昆虫蛋白经口递送至昆虫，其中该昆虫摄取转基因植物的一个或多个部分。
在其他实施例中，所披露的杀昆虫蛋白被经口递送至昆虫，其中昆虫摄取被包含杀昆虫蛋白的组合物覆盖或部分覆盖的植物的一个或多个部分。可以使用本领域技术人员已知的用于将化合物、组合物、配制品等施用于植物表面的任何方法将本披露的组合物递送至植物表面。递送至或接触植物或其部分的一些非限制性实例包括喷雾、撒粉、喷洒、分散、下雾、雾化、撒播、浸泡、土壤注入、土壤掺入、浸透(例如，根、土壤处理)、浸渍、灌注、涂覆、叶或茎浸润、侧施或种子处理等及其组合。用于使植物或其部分与一种或多种化合物、一种或多种组合物或一种或多种配制品接触的这些和其他程序是本领域技术人员熟知的。
在一些实施例中，所披露的核苷酸和多肽序列可用于生物信息学分析以鉴定另外的杀昆虫毒素(核苷酸序列和由核酸编码的蛋白质两者)。在实施例中，另外的毒素的这种鉴定可以基于同一性百分比(例如，使用BLAST或类似算法)。在其他实施例中，可以使用保守的蛋白结构域或表位(例如，Hmmer、psi-BLAST或hhsuite)来完成对另外毒素的鉴定。在一些实施例中，生物信息学测定包括进行序列同一性比较，并选择一种或多种候选杀昆虫毒素，该候选杀昆虫毒素相对于本披露的所披露核苷酸或多肽序列具有高于特定阈值的序列同一性(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高同一性)。在一些实施例中，生物信息学测定包括进行结构域或表位保守性分析，并选择一种或多种候选杀昆虫毒素，该候选杀昆虫毒素相对于本披露的所披露核苷酸或多肽序列具有至少一个保守结构域或表位。
在实施例中，所披露的杀昆虫蛋白的杀昆虫活性的确定可以通过昆虫生物测定来完成。昆虫生物测定方法是本领域熟知的，并且可以在“体外”或“植物体内”进行。在体外生物测定中，在基于细胞的系统(例如，重组细菌菌株，例如，大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌Cry-)中产生后，将所披露的蛋白质递送至所期望的昆虫物种。含有在这些重组细菌菌株中产生的所披露的蛋白质的澄清裂解物可以经口喂食给昆虫。可替代地，可以制备纯化的蛋白质并经口喂食给昆虫。在一些实施例中，在昆虫侵染之前，将澄清的裂解物或纯化的蛋白质覆盖在人工饲料上。在其他实施例中，在昆虫侵染之前，将澄清的裂解物或纯化的蛋白质混合到或掺入到人工饲料中。在植物体内生物测定中，表达所披露的蛋白质的转基因植物用于向所期望的昆虫物种递送毒素。在实施例中，将取样的组织经口喂食给昆虫。取样组织的非限制性实例包括叶、根、花粉、丝和茎。在一些实施例中，在昆虫侵染之前，将植物组织混合到或掺入到人工饲料中。在实施例中，所评价的昆虫是LI龄虫或幼虫。在其他实施例中，所评价的昆虫是后期幼虫阶段，即L2、L3、L4或L5龄虫。
实例
本发明的实施例可以通过参考以下详细实例而被更好地理解。前述的和以下的本发明的实施例以及各种实施例的描述不是旨在限制权利要求，而是对其具有说明性。因此，应理解的是权利要求不旨在受限于这些实例的具体细节。本领域技术人员应理解的是本发明的其他实施例可以在不偏离本披露内容的精神和范围的情况下进行实践，本披露内容的范围是由所附权利要求限定的。本领域公认的重组DNA和分子克隆技术可在以下文献中找到：例如，J.Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册],第4版,冷泉港,纽约州:Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)；T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions[基因融合实验],Cold Spring Harbor Laboratory[冷泉港实验室],冷泉港,纽约州(1984)和Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology[现代分子生物学实验指南],纽约,John Wiley and Sons Inc.[约翰威利父子公司],(1988),Reiter等人,Methods in Arabidopsis Research[拟南芥属研究方法],World Scientific Press[世界科学出版社](1992)，以及Schultz等人,Plant Molecular Biology Manual[植物分子生物学手册],Kluwer Academic Publishers[克鲁沃学术出版社](1998)。
实例1：针对西方玉米根虫具有杀昆虫活性的蛋白质的鉴定
从细菌Samsonia erythrinae(登录号WP_132452716)中鉴定杀昆虫蛋白SamsoniaCRW。从宏基因组测序数据库鉴定了其他相关杀昆虫蛋白MGYP000214679871、MGYP000317625865和MGYP000301824029。鉴定出的蛋白质是直系同源物，并且彼此之间具有同一性百分比，范围为约17％-70％同一性(表1，使用Blosum62计算的同一性百分比)。合成大肠杆菌优化版本的基因，并将这些基因克隆到pET29a载体中。将所得构建体转化到大肠杆菌BL21*(DE3)中，并在18℃下在卢里亚-贝尔塔尼肉汤(Luria-Bertani broth)中用IPTG诱导过夜进行蛋白质表达。通过使用弗氏细胞压碎器(French pressure cell)，随后以20,000x g将整个裂解物离心三十分钟，从这些培养物制备裂解物的可溶性部分。然后测试上清液(可溶性部分)对西方玉米根虫(WCR；玉米根萤叶甲)的生物活性。
表1：鉴定的细菌直系同源物(多肽)的同一性百分比
使用膳食掺入方法进行生物活性测定。简言之，将大肠杆菌BL21*(DE3)裂解物与等体积的加热的人造昆虫膳食(Bioserv公司，弗伦奇敦(Frenchtown)，新泽西州(NJ))在1.5mL离心管中混合，然后施用于小的皮氏培养皿中。在膳食-样品混合物冷却并固化后，向每个板中添加12只WCR幼虫。将板密封并且保持在就温度、光照以及相对湿度而言的环境实验室条件下。将来自携带空pET29a载体的大肠杆菌BL21*(DE3)培养物的裂解物用作阴性对照。在第3天或第4天和第6天评估死亡率。对于该表格以及所有后续表格，“-”意指无死亡，“+”意指1％-24％的死亡率，“++”意指25％-49％的死亡率，“+++”意指50％-74％的死亡率，以及“++++”意指75％-100％的死亡率。对于该表格以及所有后续显示出对CRW的杀昆虫活性的表格，“备注”栏的缩写如下：s＝小幼虫，sm＝小/中等幼虫，m＝中等幼虫，mb＝中等/大幼虫，b＝大幼虫，vb＝非常大的幼虫。对于该表格以及所有后续显示出鉴定的蛋白或其变体的杀昆虫活性的表格，“SEQ ID NO.”是指蛋白质的氨基酸序列。如表2所示，来自表达从SamsoniaCRW中鉴定的蛋白质的培养物的裂解物显示出针对WCR的强生物活性。SamsoniaCRW还针对秋黏虫(草地贪夜蛾)进行了测试，对该有害生物几乎没有杀昆虫作用，表明对CRW的杀昆虫作用具有特异性，是理想的效果。
如表3和4所示，来自表达所鉴定的直系同源蛋白质的培养物的裂解物同样显示出针对WCR的生物活性。进行了使用表达这些蛋白质的另外的裂解物的确认生物测定，并产生了类似的结果。
表2：SamsoniaCRW在各种裂解物稀释度下针对西方玉米根虫(WCR)的杀昆虫活性
表3：MgNify直系同源物的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表4：MgNify直系同源物的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
实例2：针对北方玉米根虫具有杀昆虫活性的SamsoniaCRW
还在基本上如实例1所述进行的膳食掺入测定中测试了SamsoniaCRW裂解物针对北方玉米根虫(NCR)幼虫的功效。将来自携带空pET29a载体的大肠杆菌BL21*(DE3)培养物的裂解物用作阴性对照。如表5所示，SamsoniaCRW展示出针对NCR的杀昆虫活性。
表5：SamsoniaCRW在各种裂解物稀释度下针对北方玉米根虫(NCR)的杀昆虫活性
实例3：纯化的SamsoniaCRW蛋白针对WCR具有杀昆虫性
纯化SamsoniaCRW蛋白以进一步表征其杀昆虫特性。为SamsoniaCRW产生N末端六组氨酸标记的构建体用于蛋白质产生。使携带pET29a-6His-SamsoniaCRW的一升大肠杆菌BL21*(DE3)细胞在LB培养基中于37℃下生长。当O.D.达到0.8-1.0时，将IPTG(1mM)添加到培养物中，然后将培养物移至18℃培养18小时。收获细胞沉淀并重悬于含10％甘油、0.5MNaCl和5mMβ-巯基乙醇的20mM Tris(pH 8.0)(缓冲液A)中。使用弗氏细胞压碎器裂解细胞；然后使裂解物在超速离心机中以100k x g旋转。
离心后，过滤pET29a-6His-SamsoniaCRW的上清液，然后施加到在缓冲液A中平衡的5mL HisTrap FPLC柱上。使用缓冲液B(缓冲液B是含有0.25M咪唑的缓冲液A)的线性梯度从柱上洗脱His标记的蛋白质。通过SDS-PAGE分析级分的纯度。合并最纯的级分，然后透析到1×PBS中。然后将蛋白质浓缩，然后储存在-80℃下。通过BCA蛋白质测定方法确定蛋白质浓度。然后以基本上如实例1中描述的膳食掺入方法，将一系列浓度的纯的蛋白质针对12只WCR幼虫进行测试。如表6所示，该蛋白质在测试的浓度范围内对WCR显示出浓度依赖性生物活性。
表6：纯化的SamsoniaCRW蛋白针对WCR的剂量应答
实例4：针对WCR具有杀昆虫活性的SamsoniaCRW变体
将突变引入SamsoniaCRW并测定变体的蛋白稳定性和杀昆虫活性。使用基本上如实例1所述的膳食掺入测定，每个实验测定使用12只WCR幼虫测定杀昆虫活性。结果如表7-9所示。SEQ ID NO对应于变体的氨基酸序列。测试的大多数变体显示出针对WCR的杀昆虫活性。
表7：SamsoniaCRW变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表8：SamsoniaCRW变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表9：纯化的SamsoniaCRW三突变体针对WCR的杀昆虫活性
实例5：对SamsoniaCRW变体大肠杆菌裂解物制剂进行的模拟胃液测试
将在50mM磷酸钾(pH 7.0)、50mM氯化钠中的细菌裂解物稀释至3mg/mL(总蛋白浓度)用于消化率分析。在37℃下，通过将15μL裂解物添加至285μL模拟胃液[10个单位的胃蛋白酶/μg蛋白，或大约1579个单位的胃蛋白酶/mL，在G-Con溶液(2mg/mL氯化钠，pH 1.2)]中来启动消化反应。在5或10分钟时，取出100μL的裂解物-SGF反应液，并通过将其添加到100μL的预热(95℃)的终止溶液中来终止该反应，该终止溶液由65％ Tricine加样缓冲液(Bio-rad 2x Tricine加样缓冲液w/10％β-巯基乙醇)和35％500mM碳酸氢钠(pH 11.0)组成。通过将5μL测试裂解物添加到预热(95℃)的100μL终止溶液和95μL模拟胃液中来产生零时间点(T0)。将所有样品在95℃下加热5分钟，并然后储存在冰上直至SDS-PAGE分析。在标准蛋白质凝胶电泳之前，将30微升的每种反应液加样到10％-20％ Tris-tricine肽凝胶上。在电泳后立即用40％甲醇:10％乙酸混合物将Tris-tricine凝胶固定20分钟。然后将凝胶用GelCode蓝蛋白染色剂在室温下染色1小时。1小时后，将聚丙烯酰胺凝胶用蒸馏水脱色至少12小时。结果定性地示于“SGF-T5胃蛋白酶消化率”栏中。“否”(N)表示在凝胶电泳后可通过GelCode Blue蛋白染色检测到完整的SamsoniaCRW蛋白变体，这表明该蛋白质在SGF测定中不能被完全消化。“是”(Y)表示不可检测到完整的SamsoniaCRW蛋白变体，这表明SamsoniaCRW蛋白变体在SGF测定中是可消化的。
表10：SamsoniaCRW变体的SGF消化率
实例6：实例3：纯化的SamsoniaCRWI52L/I80L蛋白针对WCR具有杀昆虫性
细菌裂解物双突变体SamsoniaCRW I52L/I80L(SEQ ID NO:20)在SGF测定中被鉴定为具有改善的消化率，并且在膳食掺入生物测定中保留其对WCR的杀昆虫活性。纯化SamsoniaCRW I52L/I80L以进一步表征其杀昆虫特性。基本上如实例3所述进行纯化，然后进行昆虫生物测定。然后以基本上如实例1中描述的膳食掺入方法，将一系列浓度的纯的蛋白质针对12只WCR幼虫进行测试。如表11所示，该蛋白质在测试的浓度范围内对WCR显示出浓度依赖性生物活性。
表11：纯化的SamsoniaCRW I52L/I80L蛋白针对WCR的剂量应答
实例7：玉蜀黍转化
未成熟的玉蜀黍胚的转化基本上如在以下文献中描述的来进行：Negrotto等人(Plant Cell Reports[植物细胞报道](2000)19:798-803)。简言之，使包含表达实例1中披露的杀昆虫蛋白的表达载体的农杆菌属菌株LBA4404(pSB1)在28℃下在YEP(酵母提取物(5g/L)、蛋白胨(10g/L)、NaCl(5g/L)、15g/l琼脂，pH 6.8)固体培养基上生长2-4天。将大约0.8×109个农杆菌属细胞悬浮在补充有100μM As的LS-inf培养基中。在此培养基中对细菌预诱导大约30-60分钟。
将来自近交玉蜀黍系的未成熟胚从8-12天龄的穗中切除到液体LS-inf+100μM As中。将胚用新鲜的感染培养基冲洗一次。然后添加农杆菌溶液，并且将这些胚涡旋30秒并且允许其与细菌一起沉降5分钟。然后将这些胚盾片向上地转移到LSA培养基中，并且在黑暗中培养两至三天。随后，将每皮氏板(petri plate)约20与25个之间的胚转移到补充有头孢噻肟(250mg/l)和硝酸银(1.6mg/l)的LSDc培养基中，并且在约28℃下在暗处培养10天。
将产生胚性愈伤组织的未成熟的胚转移到LSD1M0.5S培养基中。在这种培养基上对培养物进行持续大约6周的选择，在约3周时进行传代培养步骤。将存活着的愈伤组织转移到补充有甘露糖的Reg1培养基中。在光照中培养(16小时光照/8小时黑暗方案)之后，然后将绿色组织转移到不具有生长调节剂的Reg2培养基中，并且孵育约1-2周。将小植株转移到含有Rcg3培养基的Magenta GA-7盒(伊利诺斯州芝加哥的马真塔公司(Magenta Corp,Chicago Ill.))中，并且使它们在光照中生长。在约2-3周之后，通过PCR测试植物的选择性标记基因和所披露的杀昆虫基因的存在。将来自PCR测定的阳性植物转移到温室用于进一步评估。
实例8：SamsoniaCRW和直系同源蛋白质在玉蜀黍植物中的表达活性
在来自每个事件的叶和根组织样品中，通过ELISA(ng/mg总可溶性蛋白质(TSP))或质谱法检测实例1-6中所披露蛋白质的存在。表达所披露的蛋白质的事件在整个植物生物测定中提供针对西方玉米根虫的保护。
实例9:SamsoniaCRW的丙氨酸扫描定点诱变
使用丙氨酸扫描定点诱变沿着SamsoniaCRW的整个长度引入突变，以鉴定可能与受体结合和杀昆虫活性相关联的残基。使用实例1的方法产生并在细菌中表达大约50个变体。将细菌裂解，并使用基本上如实例1中所述的膳食掺入测定来测定包含突变变体或纯化的蛋白质的细菌裂解物的杀昆虫活性。丙氨酸扫描突变体的生物测定结果示于表12-17中。如表中所示，改变蛋白质序列中的某些残基对SamsoniaCRW的CRW生物活性产生负面影响。这些残基包括W16A、F36A、W105A、F122A、L127A、Y131A和S139A。
表12：SamsoniaCRW丙氨酸扫描变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表13：SamsoniaCRW丙氨酸扫描变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表14：SamsoniaCRW丙氨酸扫描变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表15：SamsoniaCRW丙氨酸扫描变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表16：SamsoniaCRW丙氨酸扫描变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性
表17：SamsoniaCRW丙氨酸扫描变体的裂解物针对WCR的杀昆虫活性

Claims (39)

1.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性。
3.如权利要求1所述的多肽，其中所述氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少99％同一性。
4.如权利要求1所述的方法，所述多肽包含在与SEQ ID NO:1的I52、S53、I67、I72、I80、V83、A85、I95、I123、S125、I153、I175、I207、I237、D7、T9、T11、E27、S28、S29、M30、K31、T32、H33、R34、L35、V37、L38、S39、V83、G89、S94、G97、S99、Q100、G104、N106、P107、D111、E113、S114、N115、G118、I123、V129、T135、T140、V142、H143、N148、E164、T199或V241对应的一个或多个位置处的一个或多个取代突变。
5.如权利要求4所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、5-23或71-117中的任一个。
6.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:24至26中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:24至26中的任一个。
8.一种核酸分子，其包含编码如权利要求1至7中任一项所述的多肽的编码序列。
9.如权利要求8所述的核酸分子，其中所述编码序列包含与SEQ ID NO:2-4、27-45、49-67或118-164中的任一个具有至少80％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO:2-4、27-45、49-67或118-164中的任一个。
10.如权利要求8所述的核酸分子，其中所述编码序列包含与SEQ ID NOs:4或49-67中的任一个具有至少80％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NOs:4或49-67中的任一个。
11.如权利要求8至10中任一项所述的核酸分子，其中所述编码序列被密码子优化用于在植物中表达。
12.如权利要求8至11中任一项所述的核酸分子，其中所述编码序列与异源启动子可操作地连接。
13.如权利要求12所述的核酸分子，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。
14.一种载体，其包含如权利要求8至13中任一项所述的核酸。
15.一种转基因宿主细胞，其包含如权利要求1至7中任一项所述的多肽，或如权利要求8至13中任一项所述的核酸。
16.如权利要求15所述的转基因宿主细胞，其中所述转基因宿主细胞是植物细胞。
17.如权利要求16所述的转基因宿主细胞，其中所述植物细胞是单子叶植物细胞。
18.如权利要求15所述的转基因宿主细胞，其中所述植物细胞是玉蜀黍细胞。
19.如权利要求18所述的转基因宿主细胞，其中所述转基因宿主细胞是细菌细胞。
20.如权利要求19所述的转基因宿主细胞，其中所述细菌细胞是农杆菌属、芽孢杆菌属或大肠杆菌细胞。
21.一种组合物，其包含如权利要求1至7中任一项所述的多肽。
22.如权利要求21所述的组合物，其进一步包含农业上可接受的运载体。
23.一种植物，其包含如权利要求1至7中任一项所述的多肽，或如权利要求8至13中任一项所述的核酸分子。
24.如权利要求23所述的植物，其中所述植物是单子叶植物。
25.如权利要求24所述的植物，其中所述植物是玉蜀黍植物。
26.一种如权利要求23至25中任一项所述的植物的种子。
27.一种如权利要求23至25中任一项所述的植物的细胞。
28.一种产生转基因植物的方法，所述方法包括：
a.将如权利要求8至13中任一项所述的核酸分子引入到植物细胞中；
b.选择包含所述核酸分子的植物细胞；以及
c.从所选择的植物细胞再生植物。
29.一种用于产生具有增强的杀昆虫特性的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.将第一亲本植物与第二亲本植物进行有性杂交，其中所述第一或第二亲本植物是如权利要求23至25中任一项所述的植物；以及
b.选择具有增强的杀昆虫特性的第一代子代植物，其中所选择的子代植物包含所述核酸分子。
30.如权利要求29所述的方法，其进一步包括以下步骤：
a.使所述第一代子代植物自交，从而产生多个第二代子代植物；以及
b.从所述第二代子代植物中选择具有增强的杀昆虫特性的植物，其中所选择的第二代子代植物包含所述核酸分子。
31.一种控制鞘翅目有害生物的方法，所述方法包括向所述有害生物或其环境递送如权利要求1至7中任一项所述的多肽。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述多肽通过摄食来递送。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述摄食包括所述有害生物对包含所述多肽的植物部分进行摄食。
34.SEQ ID NO:1至164中的任一个的序列在生物信息学分析中鉴定杀昆虫蛋白的用途。
35.包含SEQ ID NO:1、5-26或71-117中任一个的氨基酸序列的多肽在昆虫生物测定中鉴定杀昆虫蛋白的用途。
36.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且对西方玉米根虫有毒性。
37.一种多肽，其包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且对西方玉米根虫有毒性，其中所述多肽衍生自Samsonia细菌。
38.一种多肽，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或通过保守取代、缺失和/或添加1-5个氨基酸而与SEQ ID NO:1的氨基酸序列不同，其中所述多肽对西方玉米根虫有毒性。
39.一种多肽，其由SEQ ID NO:1、5-26、或71-117中的任一个的氨基酸序列组成。
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