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CN119698300A - 凝血因子x激活剂及其用于治疗出血性疾病的制剂 - Google Patents

凝血因子x激活剂及其用于治疗出血性疾病的制剂 Download PDF

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CN119698300A
CN119698300A CN202280097197.8A CN202280097197A CN119698300A CN 119698300 A CN119698300 A CN 119698300A CN 202280097197 A CN202280097197 A CN 202280097197A CN 119698300 A CN119698300 A CN 119698300A
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Jiangsu Beijeitai Biotechnology Co ltd
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Abstract

本申请涉及凝血因子X激活剂(FX激活剂，例如，RVV‑X)组合物(例如药物组合物)，所述组合物包含蔗糖、组氨酸、聚山梨醇酯20和甘露醇，以及FX激活剂(例如，RVV‑X)或其组合物(例如，药物组合物)用于治疗个体(例如，人类)出血性疾病(例如，血友病)的用途。

Description

凝血因子X激活剂及其用于治疗出血性疾病的制剂
以ASCII TEXT文本文件提交序列表
以下提交的ASCII TEXT文本文件的内容以其整体通过引用并入本文中：计算机可读形式(CRF)的序列表(文本名称：EN_202206200179_SEQLIST，记录日期：2022.06.20，大小：9KB)。
技术领域
本申请涉及凝血因子X激活剂(FX激活剂)的组合物(例如，药物组合物)，以及FX激活剂或其组合物(例如，药物组合物)用于治疗个体(例如，人类)的出血性疾病(例如，血友病)的用途。
背景技术
止血是使出血停止的复杂生理过程。在正常情况下，组织损伤后，血小板、血浆蛋白、血管和内皮细胞立即协同参与到止血过程中，迅速形成血凝块。在凝血级联反应中，某些血浆蛋白(或凝血因子)被另一种已被事先激活的凝血因子依次“级联”激活，导致凝血酶的快速生成。
凝血因子X(coagulation factor X，FX)是一种维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，其活性形式(FXa)为体内凝血酶原(prothrombin)唯一的生理性激活物，在常见的凝血途径中起关键作用。凝血因子X激活剂(coagulation factor X activator，FX activator)可特异性激活FX，使活性部位充分暴露，生成FXa。FXa在损伤部位与激活的血小板、FVa以及钙离子形成凝血酶原复合物，从而增加凝血酶生成。凝血酶激活损伤部位的血小板及因子V和Ⅷ，并通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白以形成止血栓，从而达到为出血患者止血的目的。FX激活剂在外科创面出血、内科出血性疾病、凝血系统疾病，如血友病等方面都有潜在的巨大应用价值。
最早发现也是迄今为止活性最高的FX激活剂是从圆斑蝰蛇(Vipera russelli，Daboia russellii siamensis)的毒液中提取发现的，简称RVV-X。RVV-X为一种金属蛋白酶，相对分子量(MW)为92880D，由分子量为57600D的重链和分子量分别为16400D和19400D的两条轻链通过二硫键组成。
自从McFarlane在圆斑蝰蛇蛇毒中首次发现了FX激活剂RVV-X之后(R.G.MacFarlane,“The coagulant action of Russell’s viper venom；the use ofantivenomin defining its reaction with a serum factor,”Br J Haematol.1961；7:496-511)，在许多其他蛇毒中也发现了FX激活剂。FX激活剂普遍存在于蝰蛇与响尾蛇蛇毒中。在少数眼镜蛇毒液中也发现了可激活FX的物质。此外，FX激活剂也可以通过生物工程技术获得，通过在细胞中表达重组人FX激活剂以及从细胞培养液中分离并纯化重组人FX激活剂。
FX激活剂的生物活性依赖于其二级和三级结构，因此，在制备、纯化、储存和给药过程中，保持其生物活性尤为重要。
通常将凝血酶和FX激活剂共同制备成组合物，用作止血药物，参见CN1520880A、CN1727002A、CN108785665A和CN1810258A。作为大分子蛋白，如果以FX激活剂为单一活性成分来制备FX激活剂药物组合物，其容易发生变性，不利于长期储存。人血白蛋白(HSA)是一种常用的保护剂，广泛应用于生物制品中，作为蛋白质的稳定剂。但由于HSA易引起过敏反应以及潜在的病毒污染风险，已逐渐被淘汰。
出血性疾病包括先天性出血性疾病和获得性出血性疾病，例如由于缺乏凝血因子(例如，FX)或由于存在凝血因子的获得性抑制物(例如，自身抗体)等导致的出血性疾病。
血友病通常是一种遗传性疾病，它会损害身体制造血凝块以用于止血的能力。血友病A(HA)和血友病B(HB)是血友病的两种主要类型。血友病A是由于凝血因子VIII(FVIII)含量较低导致，血友病B则是由于凝血因子IX(FIX)含量较低导致。血友病C(HC)是由于低水平的因子XI(FXI)而导致的另一种血友病。副血友病则是由于因子V(FV)水平较低导致。获得性血友病可能与癌症、自身免疫性疾病或妊娠有关。
通常采用因子替代疗法治疗HA和HB患者的出血事件(bleeding episodes，BEs)；然而，20％-30％的HA患者和5％的HB患者会产生外源性FVIII或FIX抑制物。伴抑制物(例如，自身抗体)HA和HB难以控制。在这些患者中，替代缺陷因子可能无法实现止血(取决于抑制物的效价)，因此可能需要施用旁路药剂。尽管旁路治疗药剂，如活化的凝血酶复合物浓缩物(aPCC，例如，)、艾美赛珠单抗-kxwh(例如，)和活化的重组人凝血因子VII(rFVIIa，例如，RT)已被广泛用作止血治疗剂，但它们仍有缺点和局限性。例如，aPCC在中国不可用，aPCC中的微量FVIII可能诱导对FVIII的回忆应答；并且由于价格高，rFVIIa和艾美赛珠单抗未被广泛应用。
本文提及的所有出版物、专利、专利申请和已公开的专利申请中披露的内容，以其整体通过引用并入本文。
发明概述
一方面，本申请提供一种药物组合物，其包含：i)凝血因子X激活剂(FX激活剂，例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL；ii)稳定剂，其含量为2mg/ml至100mg/ml；iii)缓冲剂，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml；iv)表面活性剂，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)和v)赋形剂，其含量为1mg/ml至100mg/ml；其中，所述药物组合物的pH为6.0至8.0。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述FX激活剂为RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X包含：a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；或c)a)和b)的混合物。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇(Daboia russellii siamensis)的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述药物组合物中RVV-X的纯度至少为95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述FX激活剂(例如，RVV-X)的含量为1U/mL至100U/mL，如5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL，或10U/mL。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述稳定剂包含蔗糖和海藻糖中的一种或两种。在一些实施例中，所述稳定剂是蔗糖。在一些实施例中，所述稳定剂(例如，蔗糖)的含量为2mg/ml至60mg/ml，如15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/ml，或30mg/ml。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述缓冲剂包含组氨酸和精氨酸中的一种或两种。在一些实施例中，所述缓冲剂是组氨酸。在一些实施例中，所述缓冲剂(例如，组氨酸)的含量为2mg/ml至20mg/ml，如2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml，或3mg/ml。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述表面活性剂包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一种或两种。在一些实施例中，所述表面活性剂为选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一种或多种。在一些实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。在一些实施例中，所述表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)的含量为0.005％(w/v)至0.05％(w/v)，如0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)，或0.02％(w/v)。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述赋形剂是甘露醇。在一些实施例中，所述赋形剂的含量为10mg/ml至60mg/ml，如30mg/ml至60mg/ml，或40mg/ml。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述药物组合物的pH为6.3至7.3，如6.8至7.0，或6.85。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述药物组合物进一步包含抗氧化剂，如甲硫氨酸。在一些实施例中，所述抗氧化剂的含量为0.01mg/ml至1mg/ml，如0.05mg/ml至1mg/ml。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述药物组合物进一步包含钙盐，如氯化钙。在一些实施例中，所述钙盐的含量为0.1mg/ml至10mg/ml。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述药物组合物包含：i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；和v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85。
在一些实施例中，如上所述任一种药物组合物，所述药物组合物是冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施例中，所述药物组合物在如下条件下是稳定的：i)复溶后，置于25℃下至少4小时；ii)置于2-8℃下至少3小时；和/或iii)置于25℃加速稳定条件下至少3小时。在一些实施例中，在25℃加速稳定条件下储存约6个月后再进行复溶，其药物组合物包含小于约5％的直径大于10μm的不溶性颗粒。
另一方面，本申请提供治疗个体(例如，人类)中出血性疾病(例如，血友病，如血友病A或血友病B)的方法，包括向个体施用有效量的如上所述任一种药物组合物。
另一方面，本申请提供治疗个体(例如，人类)中出血性疾病(例如，血友病，如血友病A或血友病B)的方法，包括向个体施用有效量的FX激活剂(例如，RVV-X)，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg。在一些实施例中，所述FX激活剂的给药剂量为0.08U/kg至0.48U/kg，如0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg。在一些实施例中，所述FX激活剂的给药次数为1次。在一些实施例中，所述FX激活剂最多给药6次。在一些实施例中，所述FX激活剂给药4次。在一些实施例中，所述FX激活剂每4小时(q4h)至每8小时(q8h)给药1次，如q4h。在一些实施例中，所述FX激活剂给药1次，剂量为0.01U/kg至0.48U/kg。在一些实施例中，所述FX激活剂的给药剂量为0.16U/kg q4h，最多给药6次。在一些实施例中，所述FX激活剂的给药剂量为0.16U/kg q4h，给药4次。
在一些实施例中，如上所述任一种方法，所述FX激活剂为RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X包含：a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；或c)a)和b)的混合物。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述药物组合物中RVV-X的纯度至少为95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)。
在一些实施例中，如上所述任一种方法，其中所述FX激活剂包含在药物组合物中。在一些实施例中，所述FX激活剂在药物组合物中的浓度为1U/mL至200U/mL，如1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL。在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含一种或多种稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和赋形剂。在一些实施例中，所述稳定剂包含蔗糖和海藻糖中的一种或两种。在一些实施例中，所述稳定剂是蔗糖。在一些实施例中，所述稳定剂(例如，蔗糖)的含量为2mg/ml至100mg/ml，如2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/ml或30mg/ml。在一些实施例中，所述缓冲剂包含组氨酸和精氨酸中的一种或两种。在一些实施例中，所述缓冲剂是组氨酸。在一些实施例中，所述缓冲剂(例如，组氨酸)的含量为0.1mg/ml至50mg/ml，如2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml。在一些实施例中，所述表面活性剂包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一种或两种。在一些实施例中，所述表面活性剂为选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一种或多种。在一些实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。在一些实施例中，所述表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)的含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)，如0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v)。在一些实施例中，所述赋形剂是甘露醇。在一些实施例中，所述赋形剂的含量为1mg/ml至100mg/ml，如10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物的pH值为6.0至8.0，如6.3至7.3、6.8至7.0或6.85。在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含抗氧化剂，所述抗氧化剂为甲硫氨酸。在一些实施例中，所述抗氧化剂的含量为0.01mg/ml至1mg/ml，如0.05mg/ml至1mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含钙盐。在一些实施例中，所述钙盐为氯化钙。在一些实施例中，所述钙盐的含量为0.1mg/ml至10mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物包含：i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；和v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合的pH值为6.85。在一些实施例中，所述药物组合物是冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施例中，所述药物组合物在如下条件下是稳定的：i)复溶后，置于25℃下至少4小时；ii)置于2-8℃下至少3小时；和/或iii)置于25℃加速稳定条件下至少3小时。在一些实施例中，在25℃加速稳定条件下储存约6个月后再进行复溶，其药物组合物包含小于约5％的直径大于10μm的不溶性颗粒。
在一些实施例中，如上所述任一种方法，所述FX激活剂(例如，RVV-X)通过静脉注射给药。
在一些实施例中，如上所述任一种方法，所述出血性疾病为先天性出血性疾病或获得性出血性疾病。在一些实施例中，所述出血性疾病选自由因缺乏凝血因子引起的疾病、因存在获得性凝血因子抑制物引起的疾病、血液疾病、出血性疾病、血管性血友病(VonWillebrands’disease)、由施用维生素K拮抗剂进行抗凝治疗引起的疾病、遗传性血小板疾病、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症、γ羧化酶缺乏症、与创伤或损伤或外科相关的出血、血栓、血小板减少症、脑卒中、凝血功能障碍、弥散性血管内凝血(DIC)、Bernard-Soulier综合征、格兰兹曼血栓形成症和储存池缺乏症组成的组。在一些实施例中，所述出血性疾病是由于凝血因子缺乏所致。在一些实施例中，所述出血性疾病是血友病，如血友病A或血友病B。在一些实施例中，所述血友病是伴抑制物的血友病。
在一些实施例中，如上所述任一种方法，所述个体是人类。
同时还提供组合物(例如，药物组合物)、试剂盒以及包含如上所述任一种药物组合物的生产制品。同时还提供使用如本文所述任一种方法或其药物组合物治疗个体(人类)出血性疾病(例如，出血性疾病，如血友病A或血友病B)的方法。
附图说明
图1A-1D描述了单次注射和多次注射RVV-X的PK特征。患者接受单次静脉注射RVV-X，3个剂量组分别为0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。图1A所示为单次注射后血浆中RVV-X的浓度-时间曲线。图1B所示为单次注射后血浆中RVV-X的半对数药物浓度-时间曲线。图1C所示为单次注射后Cmax和剂量之间的血浆RVV-X浓度分析。图1D所示为多次注射后血浆中RVV-X的浓度-时间曲线。
图2A-2B描述了单次注射RVV-X药效学(PD)特征。患者接受单次静脉注射RVV-X，6个剂量组分别为0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。图2A所示为凝血酶生成(TG)的峰高变化。图2B所示为内源性凝血酶生成潜力(ETP)的变化。由RVV-X给药后每个测试时间点的测量值减去基准值得到变化值。
图3A-3B描述了单次注射RVV-X后的FX血浆浓度(FX:C)。患者接受RVV-X单次静脉注射，6个剂量组分别为0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。图3A所示为FX:C的变化。图3B所示为FX:C值。结果以平均数±标准差表示。
图4描述了血浆样品中RVV-X浓度与APTT的关系。
图5所示为在0月，各冻干处方中不溶性颗粒的数量。
图6所示为加速6个月后，各冻干处方中不溶性颗粒的数量。
发明详述
通常将凝血酶和FX激活剂共同制备成组合物，用作止血药物。作为大分子蛋白，如果以FX激活剂为单一活性成分来制备FX激活剂药物组合物，FX激活剂容易发生变性，不利于长期储存。此外，FX激活剂的生物活性依赖于其二级和三级结构，因此，在制备、纯化、储存和给药过程中，保持其生物活性尤为重要。
伴抑制物(例如，自身抗体)的血友病A(HA)和血友病B(HB)患者中的出血事件难以控制。目前的旁路治疗剂存在缺点和局限性。例如，活化的凝血酶复合物浓缩物(aPCC，例如，)未被广泛应用。此外，aPCC中的微量FVIII可能诱导对FVIII的回忆应答。PCC可能诱导对FIX的记忆性免疫应答。另外，PCC和aPCC来自血液产品，因此存在病毒感染和过敏的潜在风险。艾美赛珠单抗(Emicizumab)-kxwh是一个双特异性人源化的单克隆抗体，其通过桥连激活的FIX和FX来恢复失活FVIII的功能，从而促进有效止血。FDA已批准其用于治疗分别伴FVIII或FIX抑制物的HA和HB患者。然而，由于价格昂贵，其未被广泛应用。活化的重组因子VII(rFVIIa，例如，RT)也存在同样的价格问题。rFVIIa通过与组织因子形成复合物发挥作用，该复合物通过外源途径激活FX成为FXa，然后将凝血酶原转化为凝血酶以实现止血。
一方面，本发明提供FX激活剂(例如，RVV-X)的组合物(例如，药物组合物)，如RVV-X先导制剂，其在长期储存、加速或应力条件下，和/或在复溶后保持稳定且具有生物活性。另一方面，本发明提供FX激活剂或其组合物，如本文所述的任一FX激活剂药物组合物，用于治疗个体(例如，人类)的出血性疾病(例如，血友病，如伴抑制物HA或HB)，所述FX激活剂或其组合物在体内表现出优异的治疗效果(例如，高特异性、高活性、低剂量、起效快)、PK/PD曲线和安全性。此特性与FDA批准的rFVIIa相当或更优。
如本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X，如从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离和纯化的)及其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，以及其在治疗如本文所述的出血性疾病中的用途(例如，伴或不伴抑制物HA或HB)，具有一个或多个优异疗效：1)其在促进伴抑制物(分别为FVIII抑制物或FIX抑制物)血友病A和血友病B患者的止血方面表现出良好的生物活性，这些患者是已知的难以治疗的人群；2)其在各种出血事件，如在外科手术期间(见实施例1-4)中，能有效促进止血；3)其与FDA批准的价格昂贵或应用受限的止血剂相比，具有相当的或更优的治疗效果，例如，RVV-X在人II期临床试验中的治疗效果(100％有效止血)显著优于凝血酶复合物浓缩物(PCC；有效止血率50％)，并与可注射重组人凝血因子VIIa(例如，RT；有效止血率约90％)相当，在KOFVIII血友病小鼠中，低剂量单次注射RVV-X即能有效促进止血及降低死亡率，并显示出与RT等类似甚至更优的治疗效果；4)其具有卓越的安全性，在本文所证实的剂量范围内具有良好的耐受性，不会引起任何血栓栓塞事件、弥散性血管内凝血(DIC)、严重不良事件(SAE)、导致临床试验期间停药的不良事件(AE)或疑似意外严重不良反应(SUSAR)(见实施例1和4)；5)其在体内不会诱导抑制物(结合抗体)或抗RVV-X中和抗体(不期望的免疫反应)；6)从哺乳动物(例如，小鼠)到人类个体，其均具有广泛的止血应用；7)其表现出卓越的药代动力学(PK)曲线和药效学(PD)曲线，如起效快及体内半衰期长等，例如低剂量RVV-X的单次和多次给药后T1/2达7-9小时，在给药后5-10分钟开始出现Cmax和治疗指标(例如，凝血酶生成(TG)增加、内源性凝血酶生成潜力(ETP)增加、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)缩短)，并持续至少24小时，而FDA批准的RT的T1/2仅为1.7-3.11小时(美国FDA NovoSeven包装说明书)；8)如本文所述的FX激活剂及其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)半衰期长、生物活性高，因此可以以低频率、低剂量进行给药(例如，每4小时1次，共4次，每次剂量0.16U/kg；或单次给药，剂量为0.16U/kg-0.48U/kg)即能达到有效止血，并且可以通过静脉注射给药，为患者提供了方便，降低了成本；以及9)如本文所述的FX激活剂其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)及制剂方案(例如，粉状冻干注射剂)提供优异的稳定性和安全性(例如，与含有人血清白蛋白作为蛋白质稳定剂的处方相比)，如在长期储存条件(2-8℃)、加速条件(例如，25℃、RH 65±5％)、应力条件(例如，高温(40±2℃)、高湿或光照)或复溶后，具有稳定的外观、水分、pH值和生物活性稳定性，聚集体和/或不溶性颗粒显著减少，从而有效地保持药性，同时也避免了HSA作为蛋白质稳定剂时常见的过敏反应和/或病毒污染的风险。
同时还提供制备(例如，制剂方案)如本文所述任一种FX激活剂药物组合物的方法，以及包含FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物的生产制品。
I.定义
除非上下文另有明确说明，实施本发明将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，许多所述方法将在下文详述以供说明。所述技术在文献中有充分解释。参见Current Protocols in Molecular Biology orCurrent Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubelet al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,John Wiley&Sons,1995；Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning:APractical Approach,vol.I&II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984)；Animal CellCulture(R.Freshney,ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)和其他相似参考资料。
如本文所述，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是一种获得有益的或期望的结果的方法，包括临床结果。鉴于本发明的目的，所述有益的或期望的临床结果，包括但不限于以下一种或多种：缓解由疾病引起的一种或多种症状，减轻疾病程度，稳定疾病(例如，预防或延迟疾病恶化)，预防或延迟疾病的扩散(例如，转移)，预防或延迟疾病复发，延迟或减缓疾病进展，改善疾病状态，缓解疾病(部分或全部)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病进展，改善或提高生活质量，增加体重，和/或延长生存期。同时，“治疗”还包括减少疾病病理结果。本申请的方法考虑了这些治疗的任何一个或多个方面。例如，如果一个或多个与该疾病相关的症状得到缓解或消除，包括但不限于减少该疾病引起的症状，提高该疾病患者的生活质量，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，和/或延长个体的生存期，则认为该患者被成功“治疗”。
术语“预防(prevent)”和类似的词语，如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等表示预防、抑制或降低疾病或病症复发可能性的方法。它还指延缓疾病或病症的复发或延缓疾病或病症的复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
如本文所用，“延缓”疾病的发展表示推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或推迟疾病的发展。根据疾病史和/或接受治疗的个体不同，延缓的时间可能不同。“延缓”疾病发展的方法是指与不使用该方法相比，在一个给定时间范围内降低疾病发展的可能性和/或降低疾病程度的方法。这种比较通常基于临床研究，使用统计学显著的个体数量。
如本文所用，术语“有效量”是指足以治疗特定紊乱、病症或疾病的药物剂量或药物组合物剂量，如改善、减轻、减弱和/或延缓一个或多个症状。在一些实施例中，有效量是足以延缓疾病发展的量。在一些实施例中，有效量是足以预防或延缓疾病复发的量。在一些实施例中，有效量是足以在一定程度上缓解与疾病相关的一种或多种症状的量。有效量可在一次或多次给药中施用。在一些实施例中，药物或组合物的有效量可以：(i)减少出血量和/或时间；(ii)增加凝血剂活性；(iii)激活FX；(iv)增加凝血酶生成(TG)和/或内源性凝血酶生成潜力(ETP)；(v)缩短活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和/或凝血酶时间(TT)；(vi)促进止血，如减少出血时间和/或出血量；(vii)减少死亡率和/或(viii)促进伤口愈合等。
如本文所用，“凝血途径”或“凝血级联反应”是指导致不溶性纤维蛋白凝块形成的一系列激活事件。在凝血级联或途径中，通过对丝氨酸蛋白酶(又称酶原)的非活性蛋白中的一个或多个肽键进行切割，将其转化为活性蛋白酶，然后作为级联反应中下一个酶原分子的激活蛋白酶。在级联反应的最后一个蛋白水解步骤中，凝血酶将纤维蛋白原水解为纤维蛋白，然后纤维蛋白在损伤部位交联形成凝块。
如本文所用，“止血”是指停止出血或使血液在一个器官或身体部位停止流动。术语“止血”可以包含防止血管损伤后失血的整个血液凝固过程，直至组织修复后的血凝块溶解。
如本文所用，“凝血(clotting)”或“凝血(coagulation)”是指不溶性纤维蛋白凝块的形成，或血液中的凝血因子在凝血级联中相互作用，最终导致不溶性纤维蛋白凝块形成的过程。
如本文所用，“促凝剂”是指任何促进血液凝固的物质。
如本文所用，“抗凝剂”是指任何抑制血液凝固的物质。
如本文所用，术语“渗透压”是指溶质浓度的量度，定义为每千克溶液中溶质(非离子形式和离子形式)的毫摩尔数。通过填加一种或多种稳定剂，如糖或糖醇，包括但不限于甘露醇、葡萄糖、海藻糖和/或蔗糖，可以达到所需的渗透压水平。参考文献详述了适于提供渗透压的其他稳定剂，如《药物赋形剂手册》(第四版，英国皇家药学会，科学与实践出版社)或《雷明顿：药学的科学与实践》(第十九版，麦克出版公司)。
如本文所用，术语“等渗的(isosmotic)”和“等渗的(isotonic)”与术语“实质上等渗的”互换使用，“实质上等渗的”是指制剂具有如下特性，即其渗透压与另一溶液渗透压相同或至少实质等同，该制剂中溶质的总浓度(包括渗透性溶质和非渗透性溶质)与另一溶液中溶质总数相同或至少实质等同。因此，尽管本领域技术人员所理解的用于体内给药的“等渗(isosmotic)的”和“等渗(isotonic)的”制剂通常的渗透压范围约270mmol/kg至310mmol/kg，但在本文所述实施例中高浓度、低黏性制剂的背景下，术语“等渗(isosmotic)的”、“等渗(isotonic)的”、“实质上等渗的(substantially isosmotic)”和“实质上等渗的(substantially isotonic)”互换使用，是指渗透压范围约240mOsm/kg至400mOsm/kg或270mOsm/kg至370mOsm/kg或300mOsm/kg至330mOsm/kg的制剂。
如本文所用，“个体”或“主体”是指动如(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、牛、马、猫、狗、啮齿动物、禽类或灵长类动物。在一些实施例中，所述个体是指人类。在一些实施例中，所述个体是小鼠、大鼠或猴子。
如本文所用，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“对..来说是特异性的”是指可测量的和可再现的相互作用，例如配体与受体的结合，可以确定在异质分子群，包括生物分子中存在该配体。例如，配体能够特异性地识别某受体是指，与其它受体结合相比，该配体与该受体的结合具有更高的亲和力、亲合力、更容易和/或更持久。在一些实施例中，所述配体与不相关受体的结合亲和力小于其与所测量的靶受体的结合亲和力的10％，例如通过放射免疫检定法(RIA)。在一些实施例中，特异性结合靶受体的配体的平衡解离常数(Kd)≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M。在一些实施例中，配体能特异性结合在不同物种间保守的受体。在一些实施例中，特异性地结合包括但不要求专一结合。配体的结合特异性可以通过本领域已知的方法进行实验测定。这些方法包括，但不限于Western blots、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-、EIA-、BIAcore测试和肽扫描。
如本文所用，“共价键”是指两个原子之间通过共用一个或多个电子形成的稳定键。共价键的示例包括但不限于肽键和二硫键。如本文所用，“肽键”是指氨基酸的羧基与相邻氨基酸的胺基之间形成的共价键。如本文所用，“二硫键”是指两个硫原子之间形成的共价键，如两个Fc片段通过一个或多个二硫键结合。两个片段之间的一个或多个二硫键可能通过连接两个片段中的硫醇基形成。在一些实施例中，两个Fc片段的一个或多个半胱氨酸之间可能形成一个或多个二硫键。氧化两个硫醇基可形成二硫键。在一些实施例中，共价连接是通过共价键直接连接而成的。在一些实施例中，共价连接通过肽键或二硫键直接连接。
肽或多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”或“同源性”被定义为候选序列中与特定多肽或多肽序列中相同氨基酸残基所占的百分比，在序列比对并引入间隙(如果必要)后以实现序列同一性百分比的最大化，并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分。可以通过本领域技术范围内的多种比对方式来确定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)、或MUSCLE软件等可公开获得的计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
如本文所用，多肽的“C端”是指该多肽的最后一个氨基酸残基，该残基的胺基与其相邻氨基酸残基的羧基形成肽键。如本文所用，多肽的“N末端”是指该多肽的第一个氨基酸，该残基的羧基与其相邻氨基酸残基的胺基形成肽键。
“分离的”多肽是指已从其生产环境(例如，天然或重组)的组分中鉴定、分离和/或回收的多肽。优选地，所分离的多肽与其生产环境中的所有其它成分没有关联。生产环境的污染成分，如重组转染细胞产生的污染成分，通常会干扰多肽的研究、诊断或治疗，并且可能包括酶、激素和其它蛋白溶质或非蛋白溶质。在一些实施例中，多肽将被纯化至：(1)按重量计算，多肽含量大于95％，如通过Lowry法确定，在一些实施例中，按重量计算，多肽含量大于99％；(2)通过使用旋杯测序仪达到足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸的序列的程度；或(3)通过SDS-PAGE在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选为银染色达到同质性。分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽，因为多肽天然环境中的至少一个要素不存在。然而，通常情况下，至少要经过一个纯化步骤来制备分离的多肽。
编码构建体的“分离的”核酸分子是从至少含一种杂质的核酸分子中鉴定和分离出来的核酸分子，在产生该“分离的”核酸分子的天然环境中，其和杂质核酸分子通常是联系在一起的。优选地，所分离的核酸与其生产环境中的所有成分没有关联。如本文所述的编码多肽的分离的核酸分子所存在的形式，与它在自然界中天然存在的形式不同。因此，分离的核酸分子不同于细胞中天然存在的编码本文所述多肽的核酸。分离的核酸包括含有该核酸分子的细胞中通常所含的核酸分子，但该核酸分子存在于染色体外，或者其在染色体中所处的位置与天然情况下不同。
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适合原核生物的控制序列包括启动子、任选的操控子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、多聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一个核酸序列建立功能性关系时，所述核酸即为“可操作地连接”。例如，如果多肽的DNA以前体蛋白形式(该前体蛋白参与多肽分泌过程中)进行表达，则前序列或分泌性先导序列的DNA可操作连接到多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作连接到编码序列；或如果核糖体结合位点处在便于翻译的位置，则所述核糖体结合位点可操作连接到编码序列。一般来说，“可操作连接”意味着连接的DNA序列是连续的，并且，对于分泌性先导序列而言，其不仅是连续的并且处于读码框内(reading phase)。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在适宜的限制性位点进行连接来完成的。如果不存在此类位点，则按照常规手段使用合成的寡核苷酸适配体或接头。
如本文所用，术语“载体”是指一种核酸分子，其能够扩增与其连接的另一核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及可被整合进所导入的宿主细胞的基因组的载体。某些载体能够指导与之连接的核酸表达。在本文中称此类载体为“表达载体”。
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源核酸转移或导入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试细胞及其子代细胞。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其中包括原代转化细胞和由此产生的子代，而不考虑传代次数。子代细胞在核酸上可能与亲代细胞不完全相同，可能含有突变。本文包括在原始转化细胞中筛选或选择与其具有相同功能或生物活性的突变子代。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指一种制剂，所述制剂以使活性成分的生物活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受毒性的额外成分。这种制剂是无菌的。“无菌”制剂是无菌的或不含任何活的微生物及其孢子。
本文中所述的本发明的实施例应理解为包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”的实施例。
本文中提及“约”为一个数值或参数，包含(和描述)针对该数值或参数本身的变体。例如，涉及“约X”的描述包括对于“X”本身描述。
如本文所用，提及“不是”一个数值或参数，通常表示并描述“除了(other than)”某一数值或参数之外。例如，该方法不能用于治疗X型疾病，意味着该方法通常用于治疗除X型疾病之外的其它类型。
如本文所用，术语“约X-Y”与“约X到约Y”意思相同。
除非上下文另有明确说明，本文和所述权利要求中所采用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象。
II.凝血因子X激活剂的药物组合物
本申请的发明人发现，使用双糖(例如，蔗糖和/或海藻糖)作为稳定剂与氨基酸缓冲液(例如，精氨酸和/或组氨酸)共同配置以FX激活剂(例如，RVV-X)作为单一有效成分的组合物，不仅极大地提高了产品的稳定性，减少了蛋白质聚集和不溶性颗粒含量，而且避免了使用人血清白蛋白作为常用稳定剂而引起的过敏反应和潜在的病毒污染风险。在FX激活剂(例如，RVV-X)冻干期间，使用蔗糖和/或海藻糖作为稳定剂可使FX激活剂高级结构更加稳定，防止其因冻干而变形，在低温冷冻脱水条件下保持FX激活剂的完整结构和功能，显著提高FX激活剂的稳定性。
在FX激活剂(例如，RVV-X)溶液冻干期间，FX激活剂的浓度逐渐增加，在蛋白质浓度较高时，溶液的pH值可能发生变化，严重时可能导致FX激活剂变性，致使FX激活剂失活。为了确保活性成分FX激活剂具有最大的生物活性，必须控制适当的pH范围。本申请的发明人发现，用组氨酸和/或精氨酸作为缓冲剂，不仅具有良好的缓冲能力，而且还可以在一定范围内保持产品pH的相对稳定性。此外，与常用的稳定剂HSA相比，当氨基酸缓冲剂(例如，精氨酸和/或组氨酸)与作为稳定剂的双糖(例如，蔗糖和/或海藻糖)组合使用时，本申请的制剂方案不仅可以确保FX激活剂的生物活性，还可以进一步提高组合物的稳定性。
本发明的FX激活剂药物组合物(例如，注射粉剂)至少具有如下有益效果：1)本发明所述的FX激活剂药物组合物或制剂方案，采用FX激活剂作为单一活性成分，使用蔗糖和/或海藻糖代替白蛋白(例如，HSA)作为稳定剂，并与精氨酸和/或组氨酸的缓冲剂和表面活性剂组合，不仅显著提高了FX激活剂组合物产品的稳定性，而且避免由病毒或白蛋白携带的其它未知成分引起的潜在风险；2)本发明所述的FX激活剂药物组合物或制剂方案，采用FX激活剂作为单一活性成分，因此有效成分及其含量明确，此外，蔗糖和/或海藻糖纯度高且来源广、便于长期批量生产、也便于控制成本及提高产品质量；3)本发明所述的FX激活剂药物组合物或制剂方案可确保FX激活剂在制备、运输和储存过程中保持良好的稳定性，不溶性颗粒含量低，并且具有更好的临床用药安全性和质量可控性；以及4)本发明所述的FX激活剂药物组合物或制剂方案不包含白蛋白且稳定性更高，用0.9％氯化钠注射液复溶后，室温下至少能保持稳定约8小时。
一方面，本申请提供凝血因子X激活剂(FX激活剂)药物组合物，以下也称为“FX激活剂药物组合物”或“FX激活剂制剂”。在一些实施例中，所述FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，40mg/ml)；其中，所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X包含：a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQID NO:1具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至100U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为15mg/ml至60mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为2mg/ml至50mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.005％(w/v)至0.05％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为10mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.0至8.0。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL至100U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml至50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为2mg/ml至15mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)至0.05％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.3至7.3。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL至50U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml至50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为3mg/ml至5mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.8至7.0。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL、10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL或50U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml至50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为3mg/ml至5mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.8至7.0(例如，6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL至50U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml、40mg/ml或50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为3mg/ml至5mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.8至7.0(例如，6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL至50U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml至50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.8至7.0(例如，6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL至50U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml至50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为3mg/ml至5mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)、0.02％(w/v)或0.03％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml至60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.8至7.0(例如，6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为5U/mL至50U/mL；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为30mg/ml至50mg/ml；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为3mg/ml至5mg/ml；iv)表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)，其含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)；以及v)赋形剂(甘露醇)，其含量为30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或60mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.8至7.0(例如，6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。
在一些实施例中，提供FX激活剂药物组合物(例如，冻干的)，其包含(或基本上由如下成分组成、或由如下成分组成)：i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.85(以下也称“先导制剂”或“RVV-X先导制剂”)。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X包含：a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ IDNO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，所述药物组合物为冻干制剂(例如，注射粉剂)。在一些实施例中，所述药物组合物为水溶液。
可通过将冻干FX激活剂药物组合物溶解在稀释液中使蛋白质分散在整个溶液中以制备复溶制剂。适用于本申请的示例性药学上可接受的(对人施用安全且无毒)稀释液包括，但不限于，无菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液(例如，0.9％ NaCl注射液)、葡萄糖注射液(例如，5％葡萄糖注射液)、林格氏溶液或葡萄糖溶液，或盐和/或缓冲液的水溶液。
在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。为了使药物组合物用于体内给药，它们必须是无菌的。所述药物组合物可以通过无菌滤膜过滤使其无菌。通常将本文所述的药物组合物放置在带有无菌进入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶。
本文所述的药物组合物还可能包含治疗特定适应症所需的一种以上活性化合物，优选地，具有互补活性且互不产生不利影响的化合物。此类分子在组合中的含量为对预期目的有效的量。
在一些实施例中，所述药物组合物装在一次性小瓶中，如一次性密封小瓶。在一些实施例中，所述药物组合物装在可多次使用的小瓶中。在一些实施例中，所述药物组合物散装在容器中。在一些实施例中，所述药物组合物是冷冻保存的。
在一些实施例中，所述药物组合物装在一次性小瓶中。在一些实施例中，所述小瓶包含FX激活剂(例如，RVV-X)，含量为1U至30U，如1U至5U、1U至10U、2U至18U、3U至15U或5U至10U中的任一。在一些实施例中，所述小瓶包含FX激活剂(例如，RVV-X)，含量为5U。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)用2mL 0.9％氯化钠注射液复溶，用于给药。
在一些实施例中，所述药物组合物包含本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的同质群体。同质群体表示FX激活剂彼此完全相同。在一些实施例中，药物组合物中至少约70％(如至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)的FX激活剂是同质的。
在一些实施例中，所述药物组合物主要包含(或由如下成分组成)：如本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)，以及可选的药物可接受的载体。在一些实施例中，所述药物组合物不包含任何宿主细胞(例如CHO)或非FX激活剂的动物(例如，蛇)蛋白。
凝血因子X激活剂(FX激活剂)
任何能从FX重链N端去除激活肽从而获得激活的FXa形态的试剂都可以用作FX激活剂。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂是一种蛋白激活剂，如作用于FX的具有蛋白水解特性的酶。在一些实施例中，所述FX激活剂可以是非蛋白质激活剂。
在一些实施例中，所述FX激活剂是从蛇的蛇毒中分离得到的，如属于蝰蛇科和响尾科的蛇种，以及一些眼镜蛇种。同时，可用于本发明的任何毒液来源的FX激活剂见于G.Tans和J.Rosing,“Snake venom activators of factor X:an overview”Haemostasis.2001；31(3-6):225-33(其内容通过整体引用并入本文)。在一些实施例中，所述FX激活剂是金属蛋白酶。在一些实施例中，所述FX激活剂是丝氨酸蛋白酶。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X，如从圆斑蝰蛇(Daboia russellii siamensis)蛇毒中分离的RVV-X。在一些实施例中，所述FX激活剂可以通过重组制备得到。
在一些实施例中，所述FX激活剂是野生的蛇毒来源的FX激活剂。在一些实施例中，所述FX激活剂是蛇毒来源的FX激活剂的天然变体。在一些实施例中，所述FX激活剂是蛇毒来源的FX激活剂的衍生物。在一些实施例中，所述FX激活剂是蛇毒来源的FX激活剂的功能片段。在一些实施例中，所述FX激活剂是蛇毒来源的FX激活剂的突变体。在一些实施例中，蛇毒来源的FX激活剂的功能片段或突变体形式保留了野生蛇毒来源的FX激活剂活性的至少约30％(如至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)。
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含FX激活剂(例如，RVV-X)，含量为0.1U/mL至200U/mL，如0.1U/mL至1U/mL、1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至80U/mL、10U/mL至50U/mL、1U/mL至50U/mL、5U/mL至50U/mL、5U/mL至20U/mL、5U/mL至10U/mL、1U/mL至30U/mL或5U/mL至15U/mL。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含FX激活剂(例如，RVV-X)，含量为0.1U/mL、0.5U/mL、1U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、30U/mL、40U/mL、50U/mL、60U/mL、70U/mL、80U/mL、90U/mL或100U/mL，如10U/mL。同时，关于活性单位(U)的测定见于下文“生物活性”小结。
凝血因子X(FX)及激活的FX(FXa)
FX或FX多肽是一种丝氨酸蛋白酶多肽，在激活状态下对凝血酶原表现出催化活性(即促凝血活性)。FX是一种丝氨酸蛋白酶，是凝血途径的一部分，特别是共同凝血途径中的第一个丝氨酸蛋白酶。在细胞中，FX由前体多肽(precursor)加工产生含有前肽(propeptide)的多肽，该前肽最终被切割以产生缺少信号序列和前肽的成熟FX多肽。分泌的FX多肽是一种双链多肽。活化的FXa缺少激活肽。FXa是FX的一种形式，表现出催化活性，活化的FX(FXa)与其辅因子Va结合后，催化活性大大提高。还可通过加入Ca2+和磷脂而增强FXa的活性。可以引入突变使FXa形式发生酶原样形式(zymogen-like)的构象变化，当FVa辅因子存在时，FXa处于完全激活状态，对凝血酶原表现出催化活性。本文所提及的FX或FX多肽包括其所有形式，包括前体(precursor)、单链和双链形式，包括成熟形式、酶原形态。
FX可以来自任何有机体，如哺乳动物，包括但不限于家畜(例如，牛、绵羊、山羊、猫、狗、驴和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物，如猴子或黑猩猩)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、沙鼠和仓鼠)。FX也可通过重组或合成的方法制备。在一些实施例中，FX是重组FX(rFX)，如重组小鼠FX(rmFX)或重组人FX(rhFX)。
在一些实施例中，FX是人FX多肽(如野生型人FX)，包括前体多肽(488aa)及其单链和双链形式，包括成熟形式(448aa)和酶原形式。其人酶原形式是一种双链形式，包含139个氨基酸的轻链和306个氨基酸的重链。人FXa形式是一种双链形式，包含139个氨基酸的轻链和254个氨基酸的重链。
所述的FX还包括其变体，如等位基因变体和物种变体，由剪接变体编码的变体以及其他变体，包含与前体多肽(例如，人前体FX)或成熟形式或酶原形式具有至少约40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽。这种变体表现出一种或多种FX活性，包括但不限于FVa结合、催化活性、凝血酶原结合、凝血酶活性和/或凝血活性。与天然或野生型FX的活性相比，其活性可能减少或增加。例如，FX多肽变体表现出天然或野生型FX多肽活性的至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％或更多。
前体FX多肽是指一种非分泌型的FX多肽，其包含一个用于分泌该蛋白的N端信号肽(signal peptide)和一个前肽(propeptide)。信号肽在内质网中被切掉。
“前区(proregion)”、“前肽(propeptide)”或“前序列(pro-sequence)”是指可被切割从而产生成熟蛋白的区域或片段。前区是位于成熟生物活性多肽的氨基酸末端的氨基酸序列，可以只有几个氨基酸，也可以是多域结构。对于FX多肽，前肽区域通常约为9个氨基酸，但可能根据物种的不同而不同(例如，更长或更短)。对于FX，前肽序列在蛋白质的翻译后修饰中起作用，并在细胞分泌蛋白之前被切割。例如，前肽是内质网上维生素K依赖性羧化酶的γ-羧基化识别元件。该反应通过将FX的Gla结构域中的谷氨酸残基转化为γ-羧基谷氨酸(Gla)而发生。这种修饰是血液中最理想的Ca2+介导的酶原激活所必需的。例如，Gla残基允许因子X/Xa以钙依赖性方式结合磷脂(即细胞表面)，这是凝血酶原复合物组装的一个必要条件。
FX的前肽形式是一种缺少信号肽但保留前肽的蛋白质。
“成熟的FX多肽”是指缺少信号肽序列和前肽序列的FX多肽。在多肽分泌前，前肽在反式高尔基体中被蛋白水解切割去除。成熟的FX多肽通常是指在链内蛋白水解产生双链多肽之前的单链形式的FX。
激活肽是存在于FX重链N端的片段，其功能是通过掩蔽催化机制抑制蛋白水解活性，从而防止催化中间体的形成(即通过构象封闭底物结合位点)。FX激活肽的示例是成熟人FX多肽重链N端的52个氨基酸残基激活肽。
所述的“野生型”或“天然”FX是指由天然或自然产生的FX基因编码的FX多肽，包括存在于自然界有机体的等位基因变体，包括人类和其他动物。当提及野生型或天然FXa多肽时，应理解为FXa多肽的活化的或有催化活性的部分。提及野生型因子X而不提及物种是为了涵盖任何物种的野生型因子X。野生型FX多肽包括编码的前体多肽、其片段及其经加工的形式，如缺少信号肽和前肽的成熟形式，及其任何翻译前或翻译后加工或修饰过的形式。天然FX多肽也包括翻译后修饰的多肽，包括但不限于糖基化、羧基化和羟基化修饰。天然FX多肽还包括双链分泌型，包括酶原型和激活型，以及任何经加工的形式或其异构体。例如，人类表达天然FX。
物种变体是指存在于不同物种间的多肽变体，包括不同的哺乳动物物种，如小鼠和人类。等位基因变体是指存在于同一物种成员之间的蛋白质变体。剪接变体是指通过对基因组DNA初级转录本的差异化加工产生的一种变体，该差异化加工可产生一种以上的mRNA。
因子X以非活跃状态的前体在血液中循环，称为酶原，需要蛋白水解来激活。与激活后产生的丝氨酸蛋白酶相比，酶原具有约10,000倍或更少的蛋白水解活性。
活化的FX(FXa)或激活的FX是指双链形式的FX多肽，其重链不包含N端激活肽。FXa通过裂解重链以去除激活肽而被激活。因此，FXa是一种异质二聚体，它由通过二硫键连接的两条链组成。对于人FX，其轻链的分子量为16000道尔顿(139aa)，重链的分子量为38000道尔顿(254aa)，构成丝氨酸蛋白酶结构域。人FX的激活是通过Arg194-Ile195键断裂，释放激活肽而发生。激活是通过外源性因子Xase复合物(因子VIIa/TF复合物)或内源性因子Xase复合物(FIXa/FVIIIa复合物)实现。激活通常需要磷脂和钙离子存在。也可以通过圆斑蝰蛇毒液(RVV-X)激活。FXa具有催化活性、FVa结合、肝素结合、凝血酶原结合、凝血酶原活性和/或凝血活性。为了本文的目的，提及的FXa是指任何缺少激活肽且能够显示FXa活性(如催化活性、FVa结合、肝素结合、凝血酶原结合、凝固酶活性和/或凝血活性)的FX双链形式。提及的FXa包括酶原样FXa多肽，在FVa饱和浓度条件下，表现出FXa活性。
FXa多肽的“催化活性部分”是指包含重链氨基酸的连续部分的FXa多肽，其包括催化三联体残基，但不包括重链的全序列。催化活性部分还可能包含FXa轻链的全部或部分。与全长FXa相比，FXa多肽的催化活性部分表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的活性，如至少约120％、130％、140％、150％、200％、300％、400％、500％或更多的活性。本文所提及的修饰的FXa或其催化活性部分是指所述催化活性部分包含修饰(例如，氨基酸取代)。
FXa可绕过级联中其它有缺陷的凝血因子，具有作为治疗性促凝剂的潜力，但由于过度激活全身凝血，已证明直接使用全功能FX作为治疗手段是不切实际的。直接使用FXa作为治疗手段的另一个限制在于循环FXa的半衰期短，这是由于其被血浆蛋白酶抑制剂(如抗凝血酶(AT)III和蛋白C)快速灭活。
圆斑蝰蛇蛇毒(RVV-X)
圆斑蝰蛇蛇毒(RVV-X)是圆斑蝰蛇(Russell’s viper)或圆斑蝰蛇(Daboiarusselli)或圆斑蝰蛇(Vipera russelli)(例如Daboia russellii siamensis,Daboiarussellii russellii)的蛇毒金属蛋白酶，可特异性激活因子X(Takeya et al.(1992)J.Biol.Chem.,267:14109-14117)。RVV-X的分子量为79,000道尔顿，包含二硫键连接的重链和轻链。RVV-X激活因子X不需要磷脂，但需要外源的Ca2+和氨基末端Gla结构域存在来增强激活。EDTA存在时，RVV-X的活性被抑制。纯化的RVV-X制剂是已知且可用的(参见CatalogNo.RVVX-2010,Haematologic Technologies,Inc.；Catalog No.ab62233,Abcam,Cambridge,Mass.)，且其序列是已知的(参见Takeya et al.(1992)J.Biol.Chem.,267:14109-14117and Uniprot No.Q7LZ61,Q4PRD1 and Q4PRD2)。RVV-X与FX的Gla结构域结合并切除FX的重链。来自其他蛇毒的金属蛋白酶FX激活剂可能具有相似的催化机制，因为它们的结构类似于RVV-X。
RVV-X包含3条多肽链：一条包含催化结构域的重链，两条与C型凝集素同源的轻链，认为所述轻链在Ca2+依赖性的FX激活中发挥调节作用。在一些实施例中，RVV-X包含：a)i)重链(RVV-XH或α链)，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；ii)轻链1(RVV-XL1或γ链)，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；以及iii)轻链2(RVV-XL2或β链)，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)序列同一性的序列；或c)a)和b)的混合物。在一些实施例中，RVV-X包含：a)i)重链，其包含序列SEQ IDNO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。当RVV-X包含SEQ ID NO:2或5(或与SEQ ID NO:2或5具有至少80％序列同一性的序列)的混合物作为γ链时，SEQ ID NO:2(或与SEQ IDNO:2具有至少80％序列同一性的序列)的γ链和SEQ ID NO:5(或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列)的γ链可以是任何比例，如99.9:0.1、99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、25:75、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.1:99.9，或两者之间的任何比例。在一些实施例中，RVV-X包含(基本上由如下序列组成、或由如下序列组成)：i)重链，其包含序列SEQ IDNO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3。
在一些实施例中，所述RVV-X是野生型RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是RVV-X的天然变体。在一些实施例中，所述RVV-X是RVV-X的类似物，如包含不超过约5个氨基酸(如4、3、2或1aa)突变位点的RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是RVV-X衍生物。在一些实施例中，所述RVV-X是糖基化的。在一些实施例中，所述RVV-X没有糖基化。
如本文所用，术语“RVV-X的衍生物”是指具有RVV-X或RVV-X类似物的氨基酸序列的分子，但在一个或多个氨基酸基团、α碳原子、氨基末端或羧基末端上还具有额外的化学修饰。化学修饰包括但不限于，添加化学基团、生成新化学键和移除化学基团。氨基酸侧基团的修饰包括但不限于赖氨酸的ε氨基酰基化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸的羧基烷基化，谷氨酰胺或天冬酰胺的脱氨。氨基末端的修饰包括但不限于脱氨、N-低烷基，N-二低烷基和N-酰基修饰。羧基末端的修饰包括但不限于酰胺、低烷基酰基、二烷基酰胺和低烷基酯修饰。在一些实施例中，低烷基基团为C1-C4烷基基团。此外，一个或多个侧基或末端基团可以由化学领域的技术人员利用已知的保护基团来保护。氨基酸的α碳可以是单甲基化或二甲基化。
在一些实施例中，所述RVV-X是修饰的RVV-X，如聚乙二醇化的RVV-X，或共价修饰的RVV-X。
提及的RVV-X还包括野生型RVV-X的功能片段。在一些实施例中，所述RVV-X是突变的RVV-X，如在野生型RVV-X的一条或多条多肽链上包含一个或多个突变(例如，氨基酸插入、缺失、取代和截段)。当用作本文中FX激活剂时，野生型RVV-X的功能性片段或其突变形式保留野生型RVV-X激活剂FX至少30％(如至少40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多)的活性。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码该蛋白质的核酸序列或通过多肽合成来制备。所述修饰包括，例如，在FX激活剂(例如，RVV-X)的氨基酸序列中进行残基的缺失和/或插入和/或取代。可以通过缺失、插入和取代的任何组合来获得最终的构建体，只要最终构建体具有预期的特性，例如保持/提高(例如，增加至少1.2倍)FX激活，保持/延长半衰期，减少(例如，减少至少1.2倍)FX激活(如减少全身凝血过度激活)等。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)具有一个或多个保守的氨基酸取代。“保守取代”是指被另一氨基酸所取代，所述另一氨基酸与被取代氨基酸带有相同的净电荷和大致相同的大小和形状。当侧链上的碳原子和杂原子总数相差不超过4个时，带有脂肪族或取代脂肪族氨基酸侧链的氨基酸大小大致相同。当其侧链上的分支数相差不超过1个时，氨基酸的形状大致相同。在侧链上具有苯基或取代苯基的氨基酸，可以认为其大小和形状大致相同。除非另有说明，保守取代优选应用天然氨基酸。
表A所示为保守型取代。在表A“取代示例”标题下提供了更多实质性取代，如下文关于氨基酸侧链类别部分进一步详述。氨基酸可以根据常见的侧链性质分类：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。非保守型取代需要将这些类别中的一个成员替换为另一类别的成员。可以将氨基酸取代引入到蛋白质构建体中，并筛选符合上文所述所需活性的产品。
表A氨基酸取代
如本文所用，广义的“氨基酸”既包括天然存在的氨基酸，也包括非天然存在的氨基酸，包括氨基酸类似物和衍生物。后者包括含有氨基酸部分的分子。根据这一宽泛的定义，本领域的技术人员会发现，本文所述氨基酸包括，例如，形成蛋白质的天然L-氨基酸；D-氨基酸；化学修饰的氨基酸，如氨基酸类似物和衍生物；不形成蛋白质的天然氨基酸，如正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、GABA等；以及本领域已知的具有氨基酸特征的化学合成的化合物。如本文所用，术语“蛋白质形成”是指可以通过代谢途径合成细胞的肽、多肽或蛋白质的氨基酸。
将包括合成的非天然氨基酸、取代氨基酸或一种或多种D-氨基酸在内的非天然氨基酸插入到本发明的FX激活剂(例如，RVV-X)中可具有多种益处。与含有L-氨基酸的多肽相比，含有D-氨基酸的多肽等在体外和体内表现出更高的稳定性。因此，当需要更好的细胞内稳定性时，如通过加入D-氨基酸进行多肽的构建是特别有用的。特别是D-肽和其类似物对内源性肽酶和蛋白酶活性有抗性，从而在需要时提高分子的生物有效性并延长其在体内的寿命。此外，D-肽和其类似物不能被有效加工，这是由于II型主要组织相容性复合体(MHC)呈递给辅助T细胞的过程受限，因此不易在受试者中诱导体液免疫反应。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)是重组表达的，如在原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，CHO细胞)中。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离的和/或纯化的。在一些实施例中，所述RVV-X是如CN109943554B所述分离的和/或纯化的(其内容通过整体引用并入本文)。在一些实施例中，所述RVV-X是无菌的和/或经病毒灭活的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯化包括一个或多个病毒灭活、阴离子交换层析、超滤、羟基磷灰石(HA)层析(HAC)和尺寸排阻层析(SEC)的步骤。在一些实施例中，分离和/或纯化后的RVV-X的纯度至少95％(如至少96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％)。例如，在一些实施例中，使用高效液相层析(HPLC)测量的分离和/或纯化后的RVV-X的纯度至少约98％。在一些实施例中，使用SDS-PAGE测量的分离和/或纯化后的RVV-X的纯度至少98％(例如100％)。在一些实施例中，分离和/或纯化后的RVV-X的生物活性至少为2×104U/mg(如至少为2.5×104U/mg、2.7×104U/mg、2.9×104U/mg、3×104U/mg、4×104U/mg、5×104U/mg、1×105U/mg、1×106U/mg或更多)。
稳定剂
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含稳定剂(例如，蔗糖)，含量为0.1mg/ml至100mg/ml，如0.1mg/ml至1mg/ml、1mg/ml至100mg/ml、2mg/ml至100mg/ml、2mg/ml至60mg/ml、10mg/ml至100mg/ml、1mg/ml至80mg/ml、10mg/ml至80mg/ml、10mg/ml至70mg/ml、10mg/ml至60mg/ml、1mg/ml至60mg/ml、1mg/ml至50mg/ml、10mg/ml至50mg/ml、10mg/ml至40mg/ml、10mg/ml至30mg/ml、15mg/ml至50mg/ml、20mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/ml、25mg/ml至50mg/ml或20mg/ml至40mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含稳定剂(例如，蔗糖)，含量为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含稳定剂(例如，蔗糖)，含量为25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml或50mg/ml，如30mg/ml。
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含稳定剂(例如，蔗糖)，含量为0.1mM至300mM，如0.1mM至1mM、1mM至300mM、1mM至200mM、1mM至100mM、10mM至300mM、10mM至200mM、10mM至100mM、50mM至300mM、50mM至200mM、50mM至100mM、50mM至90mM或70mM至90mM。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含稳定剂(例如，蔗糖)，含量为87.64mM。
在一些实施例中，所述稳定剂包含或是二糖。在一些实施例中，所述稳定剂是蔗糖和海藻糖的混合物。在一些实施例中，所述稳定剂是海藻糖。在一些实施例中，所述稳定剂是蔗糖。在一些实施例中，所述稳定剂是无水形式。在一些实施例中，所述稳定剂是水合形式，如二水合形式。
在一些实施例中，稳定剂可以保护蛋白质免于因冻干而变性。在一些实施例中，稳定剂在冻干过程中使用，由此产生的冻干剂和组合物包含稳定剂。在一些实施例中，稳定剂使药物组合物在暴露于应力(如升温和/或辐射)条件下能够免于降解。在一些实施例中，当药物组合施用于损伤或出血部位时，稳定剂可增强药物组合物的溶解能力。在一些实施例中，稳定剂提高了药物组合物的可用的保质期。在一些实施例中，稳定剂给药物组合物提供至少3个月的保质期(例如，至少6个月、1年、2年、3年或更长时间)。如本文所用，术语可用保质期是指药物组合物在未放大或放大(如放大镜或显微镜)观察时未表现出可观测的降解。
如本文所述，任何可提高药物组合物的稳定性和/或延长保质期的试剂均可用作稳定剂。稳定剂的示例包括但不限于，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、精氨酸、苯甲酸、柠檬酸、乙醇酸、乳酸、苹果酸、马来酸、多元醇(如山梨醇、甘露醇和海藻糖)、人血清白蛋白(HSA)、糖(如葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、羟乙基二胺三乙酸(HEDTA)、乙二醇双-(2-氨基乙基)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、氮三乙酸(NTA)、金属离子稳定剂和柠檬酸盐。
缓冲剂
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含缓冲剂(例如，组氨酸)，含量为0.1mg/ml至50mg/ml，如0.1mg/ml至1mg/ml、0.1mg/ml至5mg/ml、1mg/ml至50mg/ml、1mg/ml至40mg/ml、1mg/ml至30mg/ml、2mg/ml至20mg/ml、1mg/ml至10mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、1mg/ml至8mg/ml、3mg/ml至5mg/ml、2.5mg/ml至5mg/ml或1mg/ml至5mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含缓冲剂(例如，组氨酸)，含量为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml或50mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含缓冲剂(例如，组氨酸)，含量为2.5mg/ml、3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml，如3mg/ml。
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含缓冲剂(例如，组氨酸)，含量为0.5mM至350mM，如0.5mM至1mM、1mM至300mM、1mM至200mM、1mM至100mM、1mM至50mM、10mM至50mM、50mM至300mM、100mM至300mM、5mM至40mM、5mM至30mM、10mM至30mM或10mM至20mM。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含缓冲剂(例如，组氨酸)，含量为19.33mM。
与本发明相关的缓冲剂或缓冲液在所期望的终端应用时与蛋白质(如RVV-X)相容，在符合可接受的渗透压的浓度下提供足够的缓冲能力。与本发明相关的缓冲剂或缓冲液是惰性的、稳定的且其在或接近所需的pH值时具有最大缓冲能力。
根据本发明的各个方面和实施例，可以在冻干溶液中使用多种缓冲剂。相同的缓冲液可用于复溶冻干粉。缓冲剂包括但不限于，柠檬酸盐、柠檬酸-磷酸盐、磷酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、HEPES、Tris、Bicine、甘氨酸、N-甘氨酸、碳酸盐、双甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸和/或它们的混合物。在一些实施例中，缓冲剂为乙酸钠。在一些实施例中，缓冲剂包括组氨酸和精氨酸的一种或两种。在一些实施例中，所述缓冲剂是组氨酸。
符合本发明的缓冲液可有效维持适宜的pH值。确切的最佳pH值将因蛋白质而异。因此，对于不同的蛋白质，不同的缓冲系统或多或少会优于其他另一个缓冲系统。然而，一般来说，首选的缓冲液在pH值为5至8或6至8范围内是有效的，特别是在5.5至7.5范围内。
表面活性剂
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)，如0.001％(w/v)至0.01％(w/v)、0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.005％(w/v)至0.01％(w/v)、0.01％(w/v)至0.1％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)或0.01％(w/v)至0.03％(w/v)。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，含量(w/v)为0.001％、0.005％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，含量为0.01％(w/v)、0.02％(w/v)或0.03％(w/v)，如0.02％(w/v)。
表面活性剂可通过减少界面相互作用和防止蛋白质吸附，在制备和储存期间使制剂稳定。表面活性剂可以帮助溶解蛋白质，并保护蛋白质免受振荡诱导的聚集，这使得制剂在暴露于剪切表面应力时，不会引起活性蛋白质变性。本文可以使用任何已知的表面活性剂。在一些实施例中，所述表面活性剂包括聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一种或两者。在一些实施例中，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一种或多种。在一些实施例中，所述表面活性剂是聚山梨醇酯20(PS20)。
在一些实施例中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂包括，但不限于聚山梨醇酯，聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60；多氧杂聚物，如泊洛沙姆184和188；多元醇；司盘类(例如，山梨聚糖)；乙氧基化物；脂肪醇乙氧基化物；烷基酚聚氧乙烯醚(例如，Triton X-100)；多元醇；脂肪酸乙氧基化物；聚桂醇400；聚氧基40硬脂酸酯；聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60；单硬脂酸甘油酯；蔗糖脂肪酸酯；甲基纤维素；羧甲基纤维素；以及其它乙烯/聚丙烯块聚合物。非离子表面活性剂的存在范围为约0.05mg/ml至1.0mg/ml，优选0.07mg/ml至0.2mg/ml。
在一些实施例中，所述表面活性剂为离子表面活性剂，如阴离子表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)，二丁酸二辛酯磺酸钠，二辛基磺酸钠)或阳离子表面活性剂(例如，苯扎氯铵，苄索氯铵)。
在FX激活剂组合物冻干过程中，表面活性剂不仅可以减少在冷冻和脱水过程中由于冰水界面张力引起的冷冻和脱水变形，还可以在复水过程中，对活性成分起到润湿剂和重折痕剂(heavy crease agent)的作用。本发明的发明者发现使用聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的至少一种作为表面活性剂，不仅具有较低的毒性，而且可以有效抑制FX激活剂在各种条件下的表面吸附和聚集，从而提高组合物的稳定性。
赋形剂
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含赋形剂(例如，甘露醇)，含量为1mg/ml至100mg/ml，如1mg/ml至50mg/ml、10mg/ml至80mg/ml、10mg/ml至60mg/ml、5mg/ml至50mg/ml、20mg/ml至50mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或30mg/ml至50mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含赋形剂(例如，甘露醇)，含量为1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含赋形剂(例如，甘露醇)，含量为30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或60mg/ml，如40mg/ml。在一些实施例中，所述赋形剂是甘露醇。
在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含赋形剂(例如，甘露醇)，含量为5mM至550mM，如5mM至50mM、10mM至500mM、50mM至400mM、50mM至300mM、100mM至500mM、100mM至400mM、100mM至300mM、150mM至400mM、150mM至300mM、180mM至250mM或200mM至220mM。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)包含赋形剂(例如，甘露醇)，含量为219.58mM。
如本文所述的药物组合物包含一种或多种赋形剂。赋形剂通过防止施用部位的渗透性休克，从而减少药物制剂/组合物引起的局部刺激。可以存在赋形剂以调节或维持组合物中液体的张力。当与带电的生物大分子(如蛋白质)一起使用时，赋形剂可以与氨基酸侧链的带电基团相互作用，以减少分子间和分子内相互作用的可能性。考虑到其他成分的相对含量，赋形剂可以以0.1％-25％的重量比存在，优选1％-5％。赋形剂的示例包括但不限于，糖醇或多元醇(如甘露醇或山梨糖醇)、非离子表面活性剂(如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80)，以及糖(如蔗糖)。优选的赋形剂包括多羟基糖醇，优选为三羟基或更高的糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇。
pH
在一些实施例中，所述药物组合物的pH值为6.0至8.0，如6.3至7.3、6.8至7.0、6.0至7.0、7.0至8.0、6.5至7.5或6.5至7.0。在一些实施例中，所述药物组合物的pH值为6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.85、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些实施例中，所述药物组合物的pH值为6.8±0.5。在一些实施例中，所述药物组合物的pH值为6.8或6.85。
其他组分
药物组合物中可采用在所用剂量和浓度下对接受者无毒的可接受的载体或赋形剂，包括抗氧化剂，包括抗坏血酸、蛋氨酸、维生素E、焦亚硫酸钠；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚；丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；等渗剂(例如，氯化钠)；金属复合物(例如，锌蛋白复合物)；低分子量(少于10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；有机糖或糖醇，如蔗糖、乳糖、乳糖醇、海藻糖、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌醇、肌醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环醇(例如，纤维醇)、聚乙二醇；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫甘油、α-单硫甘油和硫代硫酸钠；成盐反离子，如钠；和/或螯合剂，如EDTA。
添加防腐剂可以延缓微生物的生长，其通常以0.2％-1.0％(w/v)的范围存在。添加防腐剂可促进多次使用(多剂量)制剂的生产。适用于本申请的防腐剂包括十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵(例如，氯化物、溴化物、碘化物)、苄索氯铵；硫柳汞、苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚。
抗氧化剂
在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含抗氧化剂，如蛋氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶、铂、维生素E、焦亚硫酸钠等。在一些实施例中，所述抗氧化剂为蛋氨酸。在一些实施例中，所述抗氧化剂的含量为0.01mg/ml至1mg/ml，如0.01mg/ml至0.05mg/ml、0.01mg/ml至0.1mg/ml、0.1mg/ml至1mg/ml或0.05mg/ml至1mg/ml。在一些实施例中，所述抗氧化剂的含量为0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1mg/ml。
抗氧化剂可以赋予蛋白制剂稳定性和/或抵抗自由基诱导的氧化或降解。由于一种或多种不利条件，可发生自由基氧化或降解，如暴露于光，包括紫外线、可见光和/或荧光灯，暴露于其他来源产生的自由基，和/或暴露于金属离子。任何已知的抗氧化剂都可用于本文所述的药物组合物中。
抗氧化剂也可选自由香草酸、没食子酸、丁香酸、原儿茶酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、绿原酸、苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、间甲酚、苯氧乙醇、苯酚、胞嘧啶、硫胺素、吡啶醇、富马酸、莽草酸、乙醇酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、儿茶素、表儿茶素、呋喃醇、磺胺苯酮、药物上可接受的盐或酯及其混合物组成的组中。
钙盐
在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含钙盐。在一些实施例中，所述钙盐为氯化钙。在一些实施例中，所述钙盐的含量为0.1mg/ml至10mg/ml，如0.1mg/ml至1mg/ml、0.5mg/ml至3mg/ml、1mg/ml至10mg/ml、1mg/ml至5mg/ml、5mg/ml至10mg/ml。在一些实施例中，所述钙盐的含量为0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml或10mg/ml在一些实施例中，所述钙盐的含量为1mg/ml、3mg/ml或10mg/ml。
任何合适的钙盐均可用于本文，包括但不限于氯化钙、磷酸钙、醋酸钙、柠檬酸钙、碳酸钙等。
生物活性(bioactivity)
如本文所用，“生物活性”(biological activity)是指化合物的体内活性，或由于在体内给予一种化合物、组合物或其他混合物而产生的生理反应。因此，生物活性包括这些化合物、组合物和混合物的治疗效果和药物活性。通过设计用于测试或应用这些活性的体外系统，可以在上述体外系统中观察到所述生物活性。因此，对于本文中的目的，FX多肽的生物活性包括凝血活性。
生物测定侧重于测试蛋白的生物活性(例如，FX激活剂)，并将其用作读数。在生物测定中，样品的活性在敏感样品(例如，人血浆)或被测蛋白相关疾病(例如，出血性疾病)的动物模型/人上进行测试，并将该活性(例如，止血)的结果与对照(例如，其他止血剂)进行比较。FX激活剂其他方面的生物活性包括：(i)激活FX和/或促进FXa产生；(ii)增加凝血酶生成(TG)和/或内源性凝血酶生成潜力(ETP)；(iii)缩短活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和/或凝血酶时间(TT)；(iv)促进止血，如减少出血时间和/或出血量；(v)降低死亡率；(vi)促进伤口愈合等。
用于测定如本文所述的FX激活剂(例如，蛇毒来源的FX激活剂(例如，RVV-X))生物活性的各种体外或体内方法在是本领域已知的。FX激活剂活性的测量技术主要有两种。一种是血浆凝固时间法，通过测定血浆凝固时间，并与活性对照品的凝固时间进行比较，从而确定FX激活剂的活性。另一种是显色底物连续速率法，通过比较被测样品与活性对照品的反应速率来确定FX激活剂的活性。参见J.Li et al.(“The activity determination offactor X activator from Vipera russelli by an enzyme rate method usingchromogenic substrates,”Chinese Journal of New Drugs.2007；16(18)；1491-1495)和CN108089006B，其内容通过整体引用并入本文。其普遍机制是：FX激活剂将无活性的FX转化为具有水解活性的FXa，生成的FXa反过来水解合成的显色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA(SEQ ID NO:4)，水解底物可以释放405nm处具有特征吸收峰的对硝基苯胺。反应速率可以用单位时间内生成的产物(对硝基苯胺)的量来计算，酶活性与反应速率成正比。测试样品(FX激活剂)的活性单位(U)可以参考活性对照品的反应速率来计算。除非另有说明，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的活性单位(U)采用如CN108089006B所述的显色底物连续速率法来测量。
可对施用FX激活剂后得到的产物和/或中间体进行分析测试，如FX ELISA、TGA(凝血酶生成试验)和FXa特异性活性试验。尽管测定FXa的显色底物对蛋白酶的特异性很强，但不是100％，因此，其他潜在靶点也会发生少量的裂解，尤其是在蛋白酶浓度较高的情况下。在存在交叉反应蛋白时，FXa特异性活性试验仍可用于测定FXa。为了测定FXa特异性活性，可以使用FXa的高特异性抑制剂(即利伐沙班)测定抑制量，代表蛋白酶的特异性活性。可计算活化效率，并用加入到反应中的总FX产生的FXa的百分比表示。可根据制造商的操作说明书进行TGA，如使用TGA试剂盒(Technoclone)。读出参数为血凝酶峰值浓度(PTC)，nM。
FX激活剂(例如，RVV-X)的生物活性也可用凝血仪测量，例如测定凝血时间。凝血测验也可以用于评估受试者的凝血功能，反映FX激活剂的生物活性，如凝血酶原时间(PT；测量血液凝固的程度和时间)，活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT；测量血液凝固的时间)和凝血酶时间(TT；测量纤维蛋白原的工作情况)。见于实施例1-3、6和10。
稳定性
所述药物组合物优选是稳定的，其中所含的蛋白质(FX激活剂，例如，RVV-X)在存储时基本上保持其物理和化学稳定性和完整性。各种测量蛋白质稳定性的分析技术在本领域可用，并在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,Vincent Lee Ed.,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中进行了综述。可以在选定的温度、湿度、光照或其他条件下，在选定的时间段测量稳定性。为快速筛选，制剂可在40℃放置2周至1个月，此时测量稳定性。如果制剂要在2-8℃储存，一般来说，该制剂应在30℃或40℃保持稳定至少1个月和/或在2-8℃保持稳定至少2年。如果制剂要在30℃储存，一般来说，该制剂应在30℃保持稳定至少2年和/或在40℃保持稳定至少6个月。例如，储存期间的聚集程度可作为蛋白质稳定性的指标。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)具有卓越的稳定性，如物理稳定性、化学稳定性和/或生物稳定性。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂药物组合物具有卓越的热稳定性。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂药物组合物在加速稳定性条件下(例如，25℃、RH 65％±5％；或25℃±2℃、RH 60％±5％)、长期储存条件下(例如，2-8℃至少3个月)和/或应力条件下(例如，高温(如40±2℃)、高湿(如2-8℃、RH 92.5％±5％)、光照(如2-8℃、4500±500LX))，具有优异的稳定性，如与使用HSA作为稳定剂的FX激活剂药物组合物相比，较少或没有碎片化、聚集体形成、不溶性颗粒(尤其是大于10μm的不溶性颗粒)和/或聚集增量。
蛋白质的稳定性，特别是对聚集的敏感性，主要取决于蛋白质分子的构象和胶体稳定性。一般认为，非天然蛋白质聚集的第一步，即最普遍的聚集形式，是分子结构的轻微扰动，例如，蛋白质的部分去折叠，即构象变化。这是由蛋白质的构象稳定性决定的。在第二步中，部分未折叠的分子在扩散和随机布朗运动的驱动下靠近，形成聚集体。第二步主要由分子的胶体稳定性决定(见于Chi et al.,Roles of conformational stability andcolloidal stability in the aggregation of recombinant human granulocytecolony stimulating factor.Protein Science,2003May；12(5):903-913)。如本文所用，术语“稳定性”通常是指维持生物活性物质(如蛋白质)的完整性或尽量减少其降解、变性、聚集或去折叠。如本文所用，“改良的稳定性”通常意味着，在已知会导致降解、变性、聚集或去折叠的条件下，与对照组蛋白质(或对照药物组合物中的相同蛋白)相比，目标蛋白质(或目标药物组合物中的蛋白)保持更佳的稳定性。
差示扫描量热法(DSC)和差示扫描荧光法(DSF)是本领域公知的技术，用于预测蛋白质制剂的稳定性。具体而言，这些技术可用于确定给定制剂中蛋白质的去折叠温度(Tm)。将给定制剂中蛋白质的高Tm测量值与可用于长期、稳定储存的更可靠和稳定的蛋白质制剂相关联是本领域的标准做法。
一种“稳定的”蛋白质(或制剂)，例如，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物，基本上在制造过程中和/或储存时保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性。本领域有多种用于测量蛋白质稳定性的分析技术，并在Peptide and Protein DrugDelivery,247-301,Vincent Lee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90中进行了综述。例如，在一个实施例中，根据溶液中单体蛋白质的百分比确定蛋白质(或制剂)的稳定性，其中降解(例如，片段化)和/或聚集蛋白质的百分比较低。优选地，蛋白质(或制剂)在室温或40℃下稳定至少1个月和/或在2-8℃下稳定至少6个月，或至少1年或至少2年。此外，该蛋白质(或制剂)优选在冷冻(例如，-70℃至-80℃)和融解后是稳定的，以下称为“冻/融循环”。
一种蛋白质(或制剂)，例如，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物，如果在目视检查(例如，颜色、饱满度、平滑度、清晰度、贴壁性)或通过紫外光散射或多角度光散射尺寸排除色谱法(SEC-MALS)、SEC、SEC-HPLC、反相色谱(RP-HPLC)或成像毛细管等电聚焦(iCIEF)测量时间，基本上没有不稳定迹象，例如聚集、沉淀和/或变性，则这种蛋白质在制剂中“保持其物理稳定性”。聚集是单个蛋白质分子或复合物共价或非共价结合形成聚集体的过程。聚集可以进行到形成可见沉淀的程度。
一种蛋白质(或制剂)，例如，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物，如果在给定时间内的化学稳定性是该蛋白质仍然保持其生物活性(例如，如上文“生物活性”小节所述)，则该蛋白质在制剂中“保持其化学稳定性”。化学稳定性可以通过例如检测和量化蛋白质的化学变化形式来评估。化学变化可能涉及尺寸改变(例如，剪切)，可使用尺寸排阻色谱法(SEC)、SDS-PAGE(例如，还原或非还原)、毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS，还原或非还原)和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)进行评估。其他类型的化学变化包括电荷变化(例如，由于脱酰胺或氧化而发生的变化)，例如，可通过离子交换色谱法进行评估。
一种蛋白质(或制剂)，例如，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物，如果药物制剂中的蛋白质对于其预期目的具有生物活性，则该蛋白质在制剂中“保留其生物活性”。例如，如果制剂中蛋白质的生物活性的改变不超过在制备制剂时所显示生物活性的30％、20％或10％(在分析误差范围内)内，则该蛋白保留了其生物活性。
本领域技术人员将理解蛋白质(例如，FX激活剂，如RVV-X)的稳定性除制剂的组成外还取决于其他特性。例如，稳定性可能受到温度、应力、湿度、pH值、光照和外部辐射的影响。蛋白质制剂中蛋白质的稳定性可通过多种方法确定。在一些实施例中，通过SEC确定蛋白质稳定性。SEC根据分析物(例如，蛋白质等大分子)的流体力学尺寸、扩散系数和表面性质来分离分析物。因此，例如，SEC可将本文所述的天然三维构象的FX激活剂(例如，RVV-X)与处于各种变性状态的蛋白质和/或已降解的蛋白质分离。在SEC中，固定相通常由填充在玻璃或钢柱内致密的三维基质中的惰性颗粒组成。流动相可以是纯水、水性缓冲液、有机溶剂、它们的混合物或其它溶剂。固定相颗粒具有小孔和/或通道，仅允许小于一定尺寸的物质进入。因此，大颗粒被排除在这些孔隙和通道之外，但较小颗粒从流动相中移除。颗粒被固定在固定孔隙中的时间在一定程度上取决于它们能渗透到孔隙中的深度。它们从流动相液流中移除会导致其从色谱柱中洗脱所需的时间更长，因此颗粒之间基于其大小差异而进行分离。
在一些实施例中，SEC与鉴定技术相结合，以鉴定或表征蛋白质(例如，FX激活剂，如RVV-X)或其片段。蛋白质鉴定和表征可通过多种技术完成，包括但不限于色谱技术，例如高效液相色谱(HPLC)、十二烷基硫酸钠毛细管电泳(CE-SDS)、免疫分析、电泳、紫外/可见/红外光谱、拉曼光谱、表面增强拉曼光谱、质谱、气相色谱、静态光散射(SLS)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、尿素诱导蛋白质去折叠技术、固有色氨酸荧光、差示扫描量热法和/或ANS蛋白结合。
在一些实施例中，在处理阶段之前可选地对样品制剂(例如，本文所述的FX激活剂药物组合物，例如，蔗糖用作稳定剂)和对照制剂(例如，包含HSA作为稳定剂的FX激活剂药物组合物或标准品)进行测定，以确定单体的含量，聚集体和/或片段化蛋白(和/或片段增加百分比，聚集体增加百分比等)，如下文实施例6所述。随后，每种蛋白质制剂都要经历一个处理阶段。例如，每种蛋白质制剂可在特定温度(例如，40℃、25℃或5℃)下储存较长时间(例如，3个月、6个月、12个月或更长)。在一些实施例中，对蛋白质制剂进行物理应力测试，如搅拌应力试验。在一些实施例中，对所述蛋白质制剂进行复溶试验或溶剂相容性试验。在一些实施例中，对蛋白质制剂进行加速稳定性试验，例如在加速应力下进行处理，包括高温(例如，40℃或以上)、高湿、光照和/或低pH值等。在一些实施例中，对蛋白质制剂进行冷冻和融解循环。在一些实施例中，相同蛋白质制剂的样品接受不同处理，例如，在不同温度/湿度/光照下储存一段时间。在处理阶段之后，对蛋白质制剂进行测定，以确定蛋白质单体、聚集体和/或片段的含量(和/或片段增加百分比，聚集体增加百分比等)。也可以测定蛋白质制剂的物体外观或pH值变化。
稳定性，例如组合物或制剂的物理稳定性，可通过本领域公知的方法评估，包括测量样品的表观光衰减(吸光度或光密度)。这种光衰减的测量与制剂的浑浊度有关。制剂的浑浊度是溶解在溶液中的蛋白质的固有特性，通常通过比浊法测定，并以比浊法浊度单位(NTU)测量。
浊度，例如，作为溶液中一种或多种成分浓度的函数，例如，蛋白质和/或盐浓度，也指制剂的“乳白色”或“乳白色外观”。浊度可以通过使用已知浊度的悬浮液生成的标准曲线来计算。确定药物组合物浑浊度的参考标准可基于欧洲药典标准(欧洲药典，第四版，欧洲委员会药品质量理事会(EDQM)，斯特拉斯堡，法国)。根据欧洲药典标准，澄清溶液定义为浊度小于或等于对照悬浮液的溶液，所述对照悬浮液根据欧洲药典标准的浊度约为3。在没有关联或非理想效应的情况下，浊度测量可以检测瑞利散射，其通常随浓度线性变化。用于评估药物蛋白质的物理稳定性的其它方法在本领域是公知的，例如，尺寸排阻色谱法或分析性超速离心法。
在一些实施例中，稳定性是指包含本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的制剂具有低至检测不到的微粒形成水平，或低至检测不到的直径大于10μm的微粒的形成水平。本文所用的短语“低至检测不到的微粒形成水平”是指通过HIAC分析、目视分析或根据《中国药典》2015年版第四通则确定，含有小于2500个微粒/ml、2000个微粒/ml、1800个微粒/ml、1500个微粒/ml、1400个微粒/ml、1200粒/ml、1000个微粒/ml、950个微粒/ml、900个微粒/ml、700个微粒/ml、500个微粒/ml、400个微粒/ml、300个微粒/ml、200个微粒/ml、150个微粒/ml、120个微粒/ml、110个微粒/ml、100个微粒/ml、50个微粒/ml、30个微粒/ml、20个微粒/ml、15个微粒/ml、10个微粒/ml、5个微粒/ml或更少的样品。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂药物组合物(例如，复溶后)具有不多于约350个不溶性微粒/mL，如不多于约200个或不多于约150个不溶性微粒/mL。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂药物组合物(例如，复溶后)在加速储存条件下放置6个月后，具有不多于约2500个不溶性微粒/mL，如不多于约1500个或不多于约1000个不溶性微粒/mL。
“大量的蛋白质聚集”是指蛋白质制剂中的蛋白质聚集水平显著高于对照蛋白质制剂中的蛋白质聚集水平。对照蛋白质制剂可以是储存期之前或处理之前(例如，在经受不稳定条件之前，如升高的温度、湿度、pH和/或长期储存)的相同蛋白质制剂。对照蛋白质制剂可以是在相同条件下测试的不同蛋白质制剂(例如，使用HSA作为稳定剂的其他FX激活剂制剂)。
“基本无蛋白质聚集”是指本发明的蛋白质(或制剂)，其蛋白质聚集的水平或百分比不显著高于对照制剂。例如，该术语指蛋白质(或制剂)中的蛋白聚集水平低于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％。蛋白质聚集水平可使用本领域已知的标准技术来确定。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物基本上无蛋白质聚集(例如，在加速稳定性试验或长期储存条件下)。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)最多具有15％的蛋白质聚集，例如最多14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的蛋白质聚集(例如，加速稳定性试验，反复冻/融(例如，直到5次)或长期储存条件下)。在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)没有蛋白质聚集(例如，加速稳定性试验，反复冻/融(例如，直到5次)或长期储存条件下)。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物具有不超过15％的聚集体增加，例如不超过14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％的聚集体增加(例如，加速稳定性试验，反复冻/融(例如，直到5次)或长期储存条件下)。在一些实施例中，通过SEC或SEC-HPLS测量稳定性。在一些实施例中，通过CE-SDS测量稳定性。
在一些实施例中，稳定性是指蛋白质片段化减少。本文所用的术语“低至检测不到的片段水平”是指含有等于或大于80％、85％、90％、95％、98％或99％的总蛋白质的样品，例如，在HPSEC测定的单峰中，或在还原毛细管凝胶电泳(rCGE)测定的多峰中(例如，与亚基数量相同的峰)，代表未降解蛋白质或其未降解片段，且不含占总蛋白质的超过5％、超过4％、超过3％、超过2％、超过1％或超过0.5％的其它单峰。本文所用的术语“还原的毛细管凝胶电泳”是指在足以还原测试蛋白中二硫键的还原条件下进行的毛细管凝胶电泳。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)具有0％至15％的片段，例如0％至12％的片段(例如，在加速稳定性试验或长时间储存条件下)。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)具有不超过30％的片段，例如不超过29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的片段(例如，在加速稳定性试验或长时间储存条件下)。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)没有片段(例如，在加速稳定性试验或长时间储存条件下)。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)的片段增加不超过30％，如片段增加不超过29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％(例如，在加速稳定性试验或长时间储存条件下)。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)具有至少75％的主峰，例如至少76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的主峰(例如，在加速稳定性试验或长时间储存条件下)。在一些实施例中，通过SEC测量稳定性。在一些实施例中，通过CE-SDS测量稳定性。
在一些实施例中，药物组合物的“稳定性”或“稳定”特性包括外观、水分含量、复溶时间、pH值和生物活性中的一种或多种。
在一些实施例中，冻干后的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物的水分含量最多5％，如最多4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.9％、2.8％、2.7％、2.6％、2.5％、2.4％、2.3％、2.2％、2.1％、2.0％、1.9％、1.8％、1.7％、1.6％、1.5％、1.4％、1.3％、1.2％、1.1％、1.0％、0.8％、0.5％或更少。在一些实施例中，冻干后的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物的复溶时间最多30秒，如最多28、26、24、22、20、18、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3秒或更少。在一些实施例中，冻干后的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物的收缩率最多10％(例如，与细腻/饱满的粉末相比)，如最多9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。在一些实施例中，冻干的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物复溶后为无色澄明液体。在一些实施例中，冻干的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)pH改变(例如，如与冻干前或有影响的储存条件开始前相比，增加或较少)最多1，如最多0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或更少(如0)。在一些实施例中，冻干的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)生物活性改变(例如，如与冻干前或有影响的储存条件开始前相比，增加或较少)最多30％，如最多25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0)。在一些实施例中，上述特性适用于标准储存条件(例如，复溶后2-8℃至少放置2小时)、高温条件(例如至少35℃、36℃、38℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或更高)、高湿度条件(例如，2-8℃，相对湿度(RH)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、97.5％或更高)、光照条件(例如，2-8℃，至少4000lx、4200lx、4400lx、4500lx、4600lx、4800lx、5000lx、5500lx或更高)、长期储存条件(例如，2-8℃或低于-70℃放置至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30、36个月或更长)、冻融条件(例如，-70℃/2-8℃冻融1、2、3、4、5或更多次)或加速储存条件(例如，25℃±2℃，RH至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、87.5％、90％、92.5％、97.5％或更高)，如在相应储存条件下放置至少2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、16小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、14天、16天、20天、25天、30天、1个月、2个月、3个月、6个月、30个月或更长。在一些实施例中，FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)与有影响的储存条件开始前相比(例如，高温、高湿度、光照、长期储存或加速)，其生物活性增加最多20％(例如，最多15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％))，如在有影响的储存条件下放置最多30个月内(例如，最多18个月、12个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、28天、20天、14天、10天、7天、5天、3天或1天)。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物可能包含少于10％(优选少于5％)的在药物组合物(例如，冻干粉末复溶后)中以聚集体或不溶性颗粒形式存在的FX激活剂。在一些实施例中，所述药物组合物为冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)在25℃放置至少4个小时(如至少6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72个小时或更长)是稳定的。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)在2-8℃(例如，2、3、4、5、6、7或8℃)放置至少3个月(如至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60个月或更长)是稳定的。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，冻干的)在25℃加速稳定性条件下至少3个月(如至少4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60个月或更长)是稳定的。在一些实施例中，所述药物组合物在25℃加速稳定性条件下储存至少6个月(例如，至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48或更长)后，包含少于100个(例如，少于90、80、70、60、50、40、30、20或10)直径大于10μm(例如，至少10、15、20、25、30μm或更大)的不溶性微粒。在一些实施例中，冻干的药物组合物在2-8℃(例如，2、3、4、5、6、7或8℃)放置至少6个月(如至少9、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60个月或更长)，如至少30个月，是稳定的。在一些实施例中，冻干的药物组合物在25℃±2℃(例如，23、24、25、26或27℃)放置至少1个月(如至少2、3、4、5、6、10、12个月或更长)，如至少6个月，是稳定的。例如，FX激活剂(例如，RVV-X)的生物活性改变(例如，如与长期或加速储存条件开始前相比，增加或较少)最多10％(如最多9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％))；pH值改变(例如，如与长期或加速储存条件开始前相比，增加或较少)最多0.5(如最多0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.05、0.02、0.01或更少(如0))；或水分含量改变(例如，如与长期或加速储存条件开始前相比，增加或较少)最多5％(如最多4％、3％、2％1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％))。
在一些实施例中，所述FX激活剂药物组合物为非冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，非冻干的)在-70℃以下放置至少6个月(如至少8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60个月或更长)，如至少24个月，是稳定的。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，非冻干的)在2-8℃放置至少1个月(如至少2、3、4、5、6、8、10、12个月或更长)，如至少6个月，是稳定的。在一些实施例中，所述药物组合物(例如，非冻干的)在冻/融至少1次后(如至少2、3、4、5、6、10次或更多)，如高达5次后，是稳定的。例如，其蛋白含量改变(例如，如与长期、加速或冻/融储存条件开始前相比，增加或较少)最多10％(如最多9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％))；FX激活剂(例如，RVV-X)的生物活性改变(例如，如与长期、加速或冻/融储存条件开始前相比，增加或较少)最多10％(如最多9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％))；pH值改变(例如，如与长期、加速或冻/融储存条件开始前相比，增加或较少)最多0.5(如最多0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.05、0.02、0.01或更少(如0))；纯度(例如，通过SEC-HPLC测量)改变(例如，如与长期、加速或冻/融储存条件开始前相比，增加或较少)最多10％(如最多9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％))。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物可以用任何合适的溶剂复溶，如用于静脉给药的溶剂。在一些实施例中，所述溶剂为注射用无菌水、0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液。在一些实施例中，所述溶剂为0.9％氯化钠注射液。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物复溶后在室温储存至少2小时(例如，至少3、4、5、6、7、8或更长)后，如8小时后，与复溶后0小时相比，其生物活性改变(例如，增加或减少)最多30％，如最多25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％)。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物复溶后在室温储存至少2小时(例如，至少3、4、5、6、7、8或更长)后，如8小时后，与复溶后0小时相比，其pH值改变(例如，增加或减少)最多0.5，如最多0.45、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.05、0.02、0.01或更少(如0)。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物复溶后在室温储存至少2小时(例如，至少3、4、5、6、7、8或更长)后，如8小时后，与复溶后0小时相比，其渗透压改变(例如，增加或减少)最多5％，如最多4％、3％、2％1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(如0％)。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)的渗透压为80mOsm/kg至450mOsm/kg，如100mOsm/kg至400mOsm/kg、100mOsm/kg至150mOsm/kg、150mOsm/kg至400mOsm/kg、350mOsm/kg至400mOsm/kg、100mOsm/kg至150mOsm/kg、200mOsm/kg至400mOsm/kg、240mOsm/kg至400mOsm/kg、270mOsm/kg至370mOsm/kg、300mOsm/kg至400mOsm/kg、250mOsm/kg至350mOsm/kg、350mOsm/kg至400mOsm/kg、300mOsm/kg至330mOsm/kg或280mOsm/kg至320mOsm/kg。人血浆正常渗透压约为280mOsm/kg至320mOsm/kg。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，复溶后)是等渗或基本等渗的，或在280mOsm/kg至320mOsm/kg范围内变化50％(例如，40％、30％、20％、10％、5％或更低)以内。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物复溶后在室温储存至少2小时(例如，至少3、4、5、6、7、8或更长)后，如8小时后，保持无色透明液体。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，冻干的)的保质期至少15天，如至少20天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年或更长，例如，在2-25℃，如2-8℃。如本文所用，“保质期”是指当药物制剂在特定储存条件下储存时，例如2-8℃，药物制剂中的活性成分如治疗性蛋白质(例如，本文所述的FX激活剂)发生最小降解(例如，不超过5％降解，如不超过4％、3％，或2％降解)的储存期。用于评估蛋白质或制剂稳定性的示例性技术包括尺寸排阻色谱SEC-HPLC以检测，例如，聚集、反相液相色谱(RP)-HPLC以检测，例如，蛋白质片段、离子交换HPLC以检测，例如，蛋白质电荷变化、质谱、荧光光谱、圆二色(CD)光谱、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和拉曼光谱以检测蛋白质构象变化。所有这些技术均可单独或组合使用，以评估药物制剂中蛋白质的降解情况，并确定该制剂的保质期。在一些实施例中，当本发明的药物制剂储存在2-8℃时，至少15天(例如，至少20天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年、3年或更长的时间)表现出不超过5％(例如，不超过4％、3％、2％或1％)的降解(例如，片段化、聚集或去折叠)。
III.制备凝血因子X激活剂药物组合物的方法
本发明还提供制备本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的方法。在一些实施例中，提供制备FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物的方法，包含使用本文所述的任何药物组合物组分配制FX激活剂(例如，RVV-X)。在一些实施例中，所述方法进一步包含对所述药物组合物进行冻干。在一些实施例中，所述方法进一步包含复溶所述的冻干的药物组合物。在一些实施例中，制备所述药物组合物的原液，然后根据需要进行稀释。同时，见于实施例5、7和8。
在一些实施例中，提供制备FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的方法，包含配制FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，约10U/mL)，带有i)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至10mg/ml(例如，约30mg/ml)；ii)表面活性剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，约3mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，约0.02％(w/v))；iv)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，约40mg/ml)；其中，所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，约6.85)。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述方法进一步包含对所述药物组合物进行冻干。
在一些实施例中，提供制备FX激活剂药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的方法，包含配制FX激活剂RVV-X，其含量为10U/mL，带有i)蔗糖，其含量为30mg/ml；ii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iii)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；iv)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中，所述药物组合物的pH值为6.85。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述方法进一步包含对所述药物组合物进行冻干。
本发明还提供编码本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)的分离的核酸及包含所述核酸的载体。同时，提供包含编码本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)的核酸和载体的分离的宿主细胞(例如，E.coli、CHO细胞、HEK 293细胞、Hela细胞或COS细胞)。在一些实施例中，所述分离的核酸进一步编码在FX激活剂N末端的信号肽序列(例如，每条RVV-X多肽链的N末端)。
在一些实施例中，包含编码本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)的核酸的载体适于在真核细胞中复制和整合，如哺乳动物细胞(例如，CHO细胞、HEK 293细胞、Hela细胞、COS细胞)。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。在一些实施例中，载体是非病毒载体。
已经开发出许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体及其衍生物。病毒载体技术是本领域公知的，例如，在Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中，及其他病毒学和分子生物学手册中均对其进行了详述。逆转录病毒为基因传递系统提供了一个方便的平台。可使用本领域已知的技术将异源核酸插入载体并包装在逆转录病毒微粒中。然后，可分离重组病毒并在体外或离体条件下将其输送至工程哺乳动物细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的。在一些实施例中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体是本领域已知的。在一些实施例中，使用慢病毒载体。在一些实施例中，使用自失活慢病毒载体。例如，携带构建体蛋白编码序列的自失活慢病毒载体可以用本领域已知的实验方法进行包装。所得的慢病毒载体可用于使用本领域已知的方法转导哺乳动物细胞。来自逆转录病毒(如慢病毒)的载体是实现长期基因转导的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定地整合并在子代细胞中的繁殖。慢病毒载体也具有低免疫原性，并且可以转导非增殖细胞。
在一些实施例中，载体是非病毒载体。在一些实施例中，载体是转座子，例如睡美人(SB)转座子系统或PiggyBac转座子系统。在一些实施例中，载体是基于聚合物的非病毒载体，包括，例如，聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA)和聚乳酸(PLA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)和树枝状大分子。在一些实施例中，载体是基于阳离子脂质的非病毒载体，如阳离子脂质体、脂质纳米乳和固体脂质纳米粒(SLN)。在一些实施例中，载体是基于肽的非病毒基因载体，例如聚-L-赖氨酸。适用于基因组编辑的任何已知非病毒载体都可用于将编码的核酸引入宿主细胞。参见Yin H.et al.,Nature Rev.Genetics(2014)15:521-555；Aronovich EL etal.,“The Sleeping Beauty transposon system:a non-viral vector for genetherapy.”Hum.Mol.Genet.(2011)R1:R14-20和Zhao S.et al.,“PiggyBac transposonvectors:the tools of the human gene editing.”Transl.Lung Cancer Res.(2016)5(1):120-125，通过引用并入本文。在一些实施例中，通过物理方法将编码本文所述FX激活剂(例如，RVV-X)的任何一个或多个核酸或载体引入宿主细胞(例如，CHO、HEK 293、Hela或COS)，包括但不限于电穿孔、声穿孔、光穿孔、磁转染、水穿孔。
在一些实施例中，所述载体包含可选择的标记基因或报告基因，用于从载体(例如，慢病毒载体、pTT5载体)转染的宿主细胞群中选择出表达本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的细胞。可选择的标记和报告基因的侧翼可具有适当的调控序列，以使其能够在宿主细胞中表达。例如，载体可包含转录和翻译终止子、起始序列和用于调节核酸序列表达的启动子。
可使用本领域已知的任何分子克隆方法，包括，例如，使用限制性内切酶位点和一个或多个可选择的标记将核酸克隆到载体中。在一些实施例中，核酸可操作地连接到启动子上。已经开发出多种用于在原核细胞或真核细胞(例如，哺乳动物细胞)中进行基因表达的启动子，并且本领域已知的任何启动子都可用于本发明。启动子大致可分为组成型启动子或调控型启动子，如诱导型启动子。
在一些实施例中，编码本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的核酸可操作地连接到组成型启动子上。组成型启动子允许异源基因(也称为转基因)在宿主细胞中组成型表达。本文所考虑的启动子示例包括但不限于CMV启动子(CMV)、人类延伸因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿猴病毒40早期启动子(SV40)、鸡β-肌动蛋白启动子与CMV早期增强子(CAGG)偶联，罗氏肉瘤病毒(RSV)启动子、多瘤病毒增强子/单纯疱疹胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增生性肉瘤病毒增强子、阴性对照区缺失、d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子。大量研究中已广泛比较了这些组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率。
在一些实施例中，编码本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的核酸可操作地连接到诱导型启动子。诱导型启动子属于调控型启动子的范畴。诱导型启动子可被一个或多个条件诱导，如物理条件、宿主细胞的微环境或宿主细胞的生理状态、诱导剂(即诱导剂)或其组合物。在一些实施例中，诱导条件不诱导宿主细胞中内源性基因的表达。在一些实施例中，诱导条件选自：诱导剂、辐射(如电离辐射、光)、温度(如热)、氧化还原状态和宿主细胞的激活状态。在一些实施例中，诱导型启动子可以是NFAT启动子、启动子或NFκB启动子。
适于表达本申请的蛋白质的原核宿主细胞包括古细菌和真细菌，如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。可用的细菌的示例包括大肠杆菌(例如，大肠杆菌)、杆菌(例如，枯草芽孢杆菌)、肠杆菌、假单胞菌(例如，铜绿假单胞菌)、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯菌、变形杆菌、志贺菌、根瘤菌、透明颤菌或副球菌。在一些实施例中，使用革兰氏阴性细胞。在一些实施例中，大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的示例包括菌株W3110(Bachmann,Cellular and Molecular Biology,vol.2(Washington,D.C.:AmericanSociety for Microbiology,1987),pp.1190-1219；ATCC Deposit No.27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 AfhuA(AtonA)ptr3 lac Iq lacL8 AompT A(nmpc fepE)degP41kanR的菌株33D3(U.S.Pat.No.5,639,635)。其它菌株及其衍生物，如E.coli 294(ATCC31446)、E.coli B、E.coli 1776(ATCC 31537)和E.coli RV308(ATCC 31608)也同样适用。这些例子是说明性而非限制性。构建任何上述提及的已知基因型的细菌衍生物的方法在本领域已知，并在例如Bass et al.,Proteins,8:309-314(1990)中进行了详述。考虑到复制子在细菌细胞中的可复制性，通常需要选择合适的细菌。例如，当使用公知的质粒如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌或沙门氏菌适于用作宿主。
用于克隆或表达本文所述载体中的DNA的合适的真核宿主细胞包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞的培养繁殖(组织培养)已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系示例为SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；来源于猴肾组织的COS成纤维细胞样细胞系；人类胚胎肾系(293或293细胞亚克隆，用于悬浮培养生长，Graham et al.,J.GenVirol.36:59(1977))；乳仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠塞尔托力氏细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC-ccl2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC-ccl34)；水牛-大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人类肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人类肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TR1细胞(Matheret al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞和人类肝癌细胞系(Hep G2)。
用上述表达载体或克隆载体转化宿主细胞以产生蛋白质构建体，并在经改良以适合于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。
同时，提供制备本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)的方法。因此，在一些实施例中，提供一种制备FX激活剂(例如，RVV-X)的方法，包括：(a)在可有效表达编码的FX激活剂的条件下，培养包含任何编码本文所述的FX激活剂的核酸或载体的宿主细胞(例如，CHO细胞)；以及(b)从所述宿主细胞获得表达的FX激活剂。在一些实施例中，步骤(a)的方法进一步包含产生宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)的核酸或载体。本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)可使用本领域已知的任何重组制备方法进行制备，或分离和/或纯化(如从蛇毒中)。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)是从蛇(如属于蝰蛇科和响尾科的蛇种，以及一些眼镜蛇种)的蛇毒中分离的和/或纯化的。在一些实施例中，所述FX激活剂RVV-X是从圆斑蝰蛇蛇毒中分离的和/或纯化的。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)是根据CN109943554B中所述的方法分离的和/或纯化的。任何合适的蛋白质纯化方法都可用于FX激活剂的纯化，如离子交换柱分馏、乙醇沉淀、反相液相色谱HPLC、硅胶层析、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀，取决于要回收的蛋白质构建体。在一些实施例中，所述FX激活剂是无菌的和/或经病毒灭活的。在一些实施例中，FX激化剂的纯化包括一个或多个病毒灭活、阴离子交换层析、超滤、羟基磷灰石(HA)层析(HAC)和SEC的步骤。
IV.治疗出血性疾病的方法
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其组合物(例如，RVV-X先导制剂)可用于多种用途，例如诊断、分子检测和治疗(例如，按需治疗或预防性治疗)。在一些实施例中，待治疗或诊断的个体是家畜(例如，猪、绵羊、山羊、奶牛、公牛、马、驴、骡子、鸭、鹅)。在一些实施例中，待治疗或诊断的个体是伴侣动物(例如，宠物)或辅助动物，如狗、毛、兔子、仓鼠，豚鼠，栗鼠，雪貂，鸟等。在一些实施例中，待治疗或诊断的个体是人类。在一些实施例中，待治疗或诊断的个体是灵长类动物(例如，猴)。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中出血性疾病(例如，血友病，如血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中出血性疾病(例如，血友病，如血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述FX激活剂或其药物组合物的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg(例如，约0.08U/kg至0.48U/kg，如0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg)。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物通过静脉给药，如静脉注射。当提及“FX激活剂药物组合物以剂量X给药”时，意味着所述药物组合物以有效量给药，其中包含的FX激活剂的剂量为X。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物给药1次。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物最多给药6次，如6、5、4、3、2或1次。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物给药4次。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物每4小时(q4h)至每8小时(q8h)给药1次，如4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8小时。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物以q4h给药。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg至0.48U/kg(例如，0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg或0.48U/kg)。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q8h，最多给药6次(例如，6、5、4、3、2或1次)。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q8h，给药4次。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h，最多给药6次(例如，6、5、4、3、2或1次)。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h，给药4次。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。在一些实施例中，所述出血性疾病是血友病A，如伴或不伴FVIII抑制物的血友病A。在一些实施例中，所述出血性疾病是血友病B，如伴或不伴IX抑制物的血友病B。在一些实施例中，所述出血性疾病是外科伤口出血。在一些实施例中，对所述个人进一步给予巩固治疗，如额外给药1次相同剂量的FX激活剂或其药物组合物，例如在治疗方法最后1次给药的24小时内。在一些实施例中，在出血开始的24小时内(如20小时、18小时、16小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、2小时、1小时、30分钟、20分钟、10分钟或更短时间内)向个体施用所述FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)。在一些实施例中，在出血开始前(例如，外科手术之前)至少5分钟(如至少10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、1小时、2小时或更长)向个体施用所述FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)。在一些实施例中，在出血开始前10分钟至15分钟向个体施用所述FX激活剂或其药物组合物。在一些实施例中，所述个体是人类。在一些实施例中，所述个体是动物，如小鼠、兔、猫、狗、豚鼠、仓鼠、马、奶牛、绵羊、鸟(例如，鸡、鸭)等。
本发明的药物组合物的剂量和所需药物浓度可根据特定用途而变化。确定合适的给药剂量或给药途径完全属于普通技术人员的技术范围。动物实验为确定人类治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以依据Mordenti,J.和Chappell,W.“The Use of InterspeciesScaling in Toxicokinetics,”In Toxicokinetics and New Drug Development,Yacobiet al.,Eds,Pergamon Press,New York 1989,pp.42-46中的原则进行有效剂量的种间类推。
在本申请的范围内，不同的制剂将对不同的治疗方法和不同的疾病有效，并且旨在治疗特定器官或组织的给药方式可能与针对另一器官或组织的方式不同。此外，剂量可通过一次或多次单独给药或持续输注给药。对于几天或更长时间内的重复给药，根据病情，治疗持续到疾病症状达到预期的抑制程度为止(例如，止血)。然而，其他剂量方案可能是有用的。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)是一次性给药的(例如，团注法)。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物是多次(如2、3、4、5、6或更多次)给药。如果多次给药，则可通过相同或不同的途径进行，并可在相同部位或不同的部位进行。所述FX激活剂或其药物组合物可以每小时、每天、每月或按需给药。两次给药之间的间隔可以是1小时到1天中的任意时间。间隔也可能是不规则的(例如，伴随出血事件)。在一些实施例中，给药计划中无中断。特定患者的最佳剂量和治疗方案可以由医学领域的技术人员通过监测患者的疾病体征并相应地进行调整以确定。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物给药频次为q1h、q2h、q4h、q6h、q8h、q12h、q16h、q18h、每天给药一次(每日给药)、每2天一次、每3天一次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物给药频次为q4h到q8h。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)是分剂量给药的，例如2、3、4、5或6次。在一些实施例中，分剂量给药超过1天、2天、3天、1周、1个月或更长时间。在一些实施例中，剂量被等分。在一些实施例中，分剂量为总剂量的17％、20％、25％、30％或50％。在一些实施例中，连续的分剂量给药之间的间隔为2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、18小时、1天、2天、3天、1周、1个月或更长。对于几小时、几天或更长时间的重复给药，根据病情，治疗持续到疾病症状出现预期的抑制程度为止。然而，其他剂量方案可能是有用的。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg，如0.01U/kg至0.1U/kg、0.02U/kg至0.08U/kg、0.01U/kg至0.05U/kg、0.01U/kg至0.08U/kg、0.05U/kg至0.1U/kg、0.1U/kg至0.48U/kg、0.1U/kg至0.4U/kg、0.1U/kg至0.3U/kg、0.1U/kg至0.2U/kg、0.2U/kg至0.48U/kg、0.2U/kg至0.4U/kg、0.2U/kg至0.3U/kg、0.3U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.16U/kg至0.48U/kg、0.16U/kg至0.2U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.02U/kg至0.14U/kg、0.04U/kg至0.12U/kg、0.06U/kg至0.12U/kg、0.08U/kg至0.1U/kg、0.02U/kg至0.16U/kg、0.04U/kg至0.16U/kg、0.06U/kg至0.16U/kg、0.1U/kg至0.16U/kg、0.12U/kg至0.16U/kg、0.14U/kg至0.16U/kg或0.08U/kg至0.16U/kg。在一些实施例中，治疗个体为人类。在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物的给药剂量为0.01U/kg、0.02U/kg、0.03U/kg、0.04U/kg、0.05U/kg、0.06U/kg、0.07U/kg、0.08U/kg、0.09U/kg、0.1U/kg、0.11U/kg、0.12U/kg、0.13U/kg、0.14U/kg、0.15U/kg、0.16U/kg、0.18U/kg、0.2U/kg、0.22U/kg、0.24U/kg、0.26U/kg、0.28U/kg、0.3U/kg、0.32U/kg、0.36U/kg、0.4U/kg、0.44U/kg和0.48U/kg，如0.16U/kg。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物给药1次，剂量为0.01U/kg至0.48U/kg、0.16U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，如血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物给药1次，剂量为0.01U/kg至0.48U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，如血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物给药1次，剂量为0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，如血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物给药1次，剂量为0.16U/kg、0.32U/kg或0.48U/kg。在一些实施例中，所述RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)通过静脉给药，如静脉注射。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/ml或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值约6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg至0.48U/kg、0.16U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/m或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg至0.48U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/m或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/m或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。在一些实施例中，所述药物组合物是冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施例中，所述方法进一步包含在给药前复溶所述药物组合物(例如，用0.9％氯化钠注射液)。在一些实施例中，所述药物组合物通过静脉给药，如静脉注射。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg至0.48U/kg、0.16U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg至0.48U/kg或0.16U/kg至0.48U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.16U/kg、0.32U/kg或0.48U/kg。在一些实施例中，所述药物组合物是冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施例中，所述方法进一步包含在给药前复溶所述药物组合物(例如，用0.9％氯化钠注射液)。在一些实施例中，所述药物组合物通过静脉给药，如静脉注射。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg(如0.16U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg)，q4h至q8h(如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h)，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h至q8h(如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h)，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)，其中所述RVV-X或其药物组合物的给药剂量为0.16U/kg q4h，给药4次。在一些实施例中，所述RVV-X或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)通过静脉给药，如静脉注射。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ IDNO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/ml或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值约6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg(如0.16U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg)，q4h至q8h(如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h)，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/m或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h至q8h(如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h)，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/m或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)FX激活剂(例如，RVV-X)，其含量为0.1U/mL至200U/mL(例如，1U/mL至100U/mL、5U/mL至100U/mL、5U/mL至50U/mL或10U/mL)；ii)稳定剂(例如，蔗糖)，其含量为2mg/ml至100mg/ml(例如，2mg/ml至60mg/ml、15mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至50mg/m或30mg/ml)；iii)缓冲剂(例如，组氨酸)，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml(例如，2mg/ml至20mg/ml、2mg/ml至15mg/ml、3mg/ml至5mg/ml或3mg/ml)；iv)表面活性剂(例如，聚山梨醇酯20)，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)(例如，0.005％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.05％(w/v)、0.01％(w/v)至0.03％(w/v)或0.02％(w/v))；以及v)赋形剂(例如，甘露醇)，其含量为1mg/ml至100mg/ml(例如，10mg/ml至60mg/ml、30mg/ml至60mg/ml或40mg/ml)；其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0(例如，6.3至7.3、6.8至7.0或6.85)；并且其中所述药物组合物1次的给药剂量为0.16U/kg，q4h，给药4次。在一些实施例中，所述药物组合物是冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施例中，所述方法进一步包含在给药前复溶所述药物组合物(例如，用0.9％氯化钠注射液)。在一些实施例中，所述药物组合物通过静脉给药，如静脉注射。在一些实施例中，所述FX激活剂是RVV-X。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg(如0.16U/kg至0.48U/kg、0.08U/kg至0.48U/kg、0.01U/kg至0.16U/kg、0.08U/kg至0.16U/kg或0.16U/kg)，q4h至q8h(如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h)，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h至q8h(如q4h、q5h、q6h、q7h或q8h)，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物的给药剂量为0.16U/kg，q4h，最多给药6次(如1、2、3、4、5或6次)。在一些实施例中，提供治疗个体(例如，人类)中血友病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)的方法，包括向个体施用有效量的药物组合物，其中所述药物组合物包含i)RVV-X，其含量为10U/mL；ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及v)甘露醇，其含量为40mg/ml；其中所述药物组合物的pH值为6.85；并且其中所述药物组合物给药1次的剂量为0.16U/kg，q4h，给药4次。在一些实施例中，所述药物组合物是冻干的。在一些实施例中，所述药物组合物是无菌的。在一些实施例中，所述方法进一步包含在给药前复溶所述药物组合物(例如，用0.9％氯化钠注射液)。在一些实施例中，所述药物组合物通过静脉给药，如静脉注射。在一些实施例中，所述RVV-X是从圆斑蝰蛇的蛇毒中分离得到的。在一些实施例中，所述RVV-X的纯度至少约为95％。在一些实施例中，所述RVV-X包含a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3；或c)a)和b)的混合物。
在一些实施例中，所述治疗出血性疾病(例如，血友病，如血友病A或B，伴或不伴抑制物；或外科伤口出血)的方法与患出血性疾病但未接受所述治疗或接受对照药剂(例如，安慰剂或其他止血剂)的个体相比，具有一个或多个以下生物活性：(i)激活FX和/或促进FXa产生；(ii)增加凝血酶生成(TG)和/或内源性凝血酶生成潜力(ETP)；(iii)缩短活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和/或凝血酶时间(TT)；(iv)促进止血，改善出血症状，如减少出血时间和/或出血量；(v)减少死亡率；(vi)促进伤口愈合；(vii)延长患者生存期；和/或(viii)减轻或缓解疼痛等。在一些实施例中，激活FX和/或促进FXa产生的方法可增加FXa至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、5倍、10倍、30倍或更多。在一些实施例中，增加TG和/或ETP的方法可增加TG和/或ETP至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％、1.5倍、2倍、5倍、10倍、30倍或更多。在一些实施例中，缩短APTT、PT和/或TT的方法可缩短APTT、PT和/或TT至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施例中，促进止血的方法可减少出血时间和/或出血量至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施例中，减少死亡率的方法可减少死亡率至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。在一些实施例中，促进伤口愈合的方法可促进至少约1.1倍(包括例如，至少1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50倍或更多)的伤口愈合。在一些实施例中，延长个体(例如，人类)生存期的方法可延长个体生存期至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24个月或2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。在一些实施例中，减轻或缓解疼痛的方法减轻疼痛至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的给药方式可以以任何方便的方式进行，包括通过注射或输液。给药途径依照已知和公认的方法，如通过单次或多次推注或以适当方式长时间输液。FX激活剂或其药物组合物通过注射向患者给药(例如，皮下注射，静脉注射或腹腔注射)。在一些实施例中，全身施用FX激活剂或其药物组合物。在一些实施例中，通过输注(如静脉输注)向个体施用FX激活剂或其药物组合物。免疫治疗所用的输注技术在本领域已知(参见Rosenberg et al.,New Eng.J.ofMed.319:1676(1988))。在一些实施例中，通过皮内或皮下(即在皮肤下)注射向个体施用FX激活剂或其药物组合物。对于皮下注射，可使用注射器注射FX激活剂或其药物组合物。然而，还有其他用于FX激活剂或其药物组合物给药的装置，如注射装置；注射笔；自动注射器装置、无针装置；和皮下贴片给药系统。在一些实施例中，通过静脉注射施用FX激活剂或其药物组合物。在一些实施例中，将FX激活剂或其药物组合物局部适用于损伤或伤口处，如直接在伤口组织或出血部位。在一些实施例中，将FX激活剂或其药物组合物局部施用于损伤或伤害部位，如直接施用于伤口组织。在一些实施例中，通过缓释或延长释放技术施用FX激活剂或其药物组合物。
在本文所述的任何用于治疗出血性疾病的方法的实施例中，所述方法还包括施用一个或多个额外的凝血因子。例如，一个或多个额外的凝血因子可以是血浆纯化或重组凝血因子、促凝剂，如维生素K、维生素K衍生物和蛋白C抑制剂、血浆、血小板、红细胞或皮质类固醇。
出血性疾病
如本文所用，“疾病(disease)”或“紊乱(disorder)”是指生物体中由病因或病症引起的病理状况，包括但不限于感染、获得性病症、遗传性病症，并以可识别的症状为特征。本文关注的疾病和紊乱涉及凝血，包括由凝血蛋白介导的疾病和其中凝血蛋白在病因学或病理学中起作用的疾病和紊乱。疾病和紊乱还包括由缺乏蛋白质引起的疾病和紊乱，例如血友病，并且本文特别关注的是由于凝血蛋白缺陷而不发生凝血的那些疾病。示例性疾病和紊乱，例如但不限于血液凝固疾病、血液学疾病、出血性疾病、血友病、凝血因子缺乏和获得性血液疾病，包括与创伤和手术相关的出血。
如本文所用，“出血性疾病”是指由于血液凝固不足，患者控制出血能力降低的病症。出血性疾病可以是遗传性或获得性的，并且可以由例如凝血途径的缺陷或不足、血小板活性的缺陷或缺乏或血管缺陷引起。在一些实施例中，出血性疾病是先天性出血性疾病或获得性出血性疾病。
如本文所用，“获得性出血性疾病”是指由肝病、维生素K缺乏或香豆素(华法林)或其他抗凝剂治疗引起的凝血缺陷所导致的出血性疾病。
出血性疾病可以是因缺乏凝血因子引起的疾病、因存在获得性凝血因子抑制物引起的疾病、血液疾病、出血性疾病、血管性血友病、因施用维生素K拮抗剂进行抗凝治疗引起的疾病、遗传性血小板疾病、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症、γ羧化酶缺乏症、与创伤或损伤相关的出血、血栓形成、血小板减少症、脑卒中、凝血功能障碍、弥散性血管内凝血(DIC)、Bernard-Soulier综合征、Glanzman血栓形成症或储存池缺乏症。在实施例中，对于由于缺乏凝血因子或由于存在获得性凝血因子抑制物所致的出血性疾病，凝血因子可以是因子VII、因子IX、因子X、因子XI、因子V、因子XII、因子II或血管性血友病因子。在实施例中，对于由于缺乏凝血因子所致的出血性疾病，凝血因子可以是因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI。在一些实施例中，出血性疾病是由于缺乏凝血因子所致。在一些实施例中，出血性疾病是血友病。例如，出血性疾病可以是血友病A、血友病B或血友病C。在一些实施例中，血友病是伴抑制物(例如，抗体)血友病。在一些实施例中，出血性疾病是不伴抑制物的血友病A。在一些实施例中，出血性疾病是伴FVIII抑制物(抗FVIII抗体，例如，外源性FVIII)的血友病A。在一些实施例中，出血性疾病是不伴抑制物的血友病B。在一些实施例中，出血性疾病是伴FIX抑制物(抗FIX抗体，例如，外源性FIX)的血友病B。
在本文所述的方法的示例中，出血性疾病是由于凝血因子缺乏所致，该疾病是家族性多凝血因子缺乏症(FMFD)。在本文所述的示例中，出血性疾病是由于存在凝血因子的获得性抑制物，凝血因子是因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI和因子XII。在这类示例中，获得性抑制物是自身抗体。例如，出血性疾病是获得性血友病。在本文所述的方法的示例中，出血性疾病是遗传性血小板疾病，其可以是Chediak-Higashi综合征、Hermansky-Pudlak综合征、血栓素A2功能障碍、Glanzmann血栓形成症和Bernard-Soulier综合征。在本文所述的其他实施例中，当疾病由维生素K拮抗剂的抗凝治疗引起时，维生素K拮抗药可以是肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药物和FXa抑制物。
在本文所述的方法的其他示例中，所述疾病是血栓形成、血小板减少、中风和凝血障碍。在本文所述的方法的进一步示例中，出血性病症由创伤、手术或伤口引起。例如，在这类示例中，出血表现为急性血肿、慢性血友病性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血或脑出血。在本文所述的其他示例中，出血是由于拔牙。在本文所述的其他示例中，所述出血性疾病是由于手术引起的，手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术或器官移植手术。例如，手术是移植手术，通过骨髓、心脏、肺、胰腺或肝脏的移植。
先天性出血性疾病
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可用于绕过内源性或外源性凝血途径中的任何凝血因子，并治疗因其缺陷引起的凝血病。先天性凝血因子缺乏引起的出血性疾病，包括血友病A(因子VIII缺陷症)；血友病B(因子IX缺陷症)；血友病C(XI因子缺陷症)；因子VII缺陷症；因子X缺陷症；因子XII缺陷症；以及I型、II型、IV型、V型和VI型家族性多凝血因子缺乏症(FMFD)(见于Roberts,H R and M DBingham,“Other Coagulation Factor Deficiencies,”Thrombosis and Hemorrhage,2nded.Baltimore,Md.:Williams & Wilkins,1998:773-802)。FX激活剂或其药物组合物也可用于治疗其他先天性出血性疾病和病症，例如但不限于血管性血友病、遗传性血小板疾病(例如，储存池疾病，如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak综合征、血栓素A2功能障碍、Glanzmann’s血栓形成症和Bernard-Soulier综合征)，遗传性出血性毛细血管扩张症，也称为Rendu-Osler-Weber综合征。
其他先天性出血性疾病可以用本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)治疗，以促进凝血。可使用FX激活剂或其药物组合物治疗与血管性血友病(vWD)相关的自发性和手术相关的出血事件。血管性血友病是一种出血性疾病，由凝血蛋白血管性血友病因子(vWF)缺陷或缺乏所引起，估计在1％至2％的人群中发生。vWD患者容易擦伤，反复流鼻血，拔牙、扁桃体切除术或其他手术后出血，女性患者月经出血增多。FX激活剂或其药物组合物可用于改善vWD患者的自发出血和手术相关出血。
其他血小板相关出血疾病也与内源性凝血活性降低有关，例如Glanzmann’s血栓形成症和Hermansky-Pudlak综合征。血小板相关出血疾病患者的过度自发或手术相关出血也可以通过治疗剂量的本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)来控制。例如，在手术前、手术中和/或手术后，可使用FX激活剂或其药物组合物治疗患有格兰兹曼血栓形成症的患者，以防止大出血。
获得性出血性疾病
出血性疾病也可以是获得性的，而不是先天性的。本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RV-X先导制剂)也可用于治疗获得性出血性疾病。获得性出血性疾病包括外科手术引起的凝血障碍或药物诱导的凝血障碍，例如化疗方案引起的血小板减少症。在一些示例中，FX激活剂或其药物组合物可用作过量抗凝剂治疗剂的解毒剂。FX激活剂或其药物组合物也可用于治疗获得性凝血因子缺乏症，如由于肝病导致的获得性因子X缺乏症、维生素K缺乏症。可受益于FX激活剂或其药物组合物治疗的其他获得性出血性疾病包括溶血性尿毒症综合征、过敏性紫癜(过敏性紫斑，Henoch Schonlein purpura)和弥散性血管内凝血(DIC)。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可用于治疗受试者因创伤或手术或血小板计数或活性降低而引起的出血事件。例如，可使用FX激活剂或其药物组合物治疗例如由于输血引起的血液稀释性凝血障碍或创伤后的急性创伤性凝血障碍。用于手术患者的示例性方法包括在治疗和手术之前、期间或之后防止出血或治疗，例如但不限于心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙科手术或器官移植手术，包括骨髓、心脏、肺、胰腺或肝脏移植。在一些实施例中，获得性出血性疾病是化疗获得性血小板减少症、其他凝血障碍、移植获得性出血(例如，骨髓移植(BMT)或干细胞移植(SCT)后的严重出血)，抗凝治疗引起的出血(接受抗凝治疗以治疗血栓栓塞等疾病的患者在急性服用抗凝剂，如华法林、肝素、磺达肝素和利伐沙班后，可能出现出血事件，或由于长期使用此类治疗而出现出血性疾病)，或获得性血友病。
创伤与外科出血
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可用于治疗具有正常凝血系统的受试者中与围手术期失血和创伤性失血相关的出血。例如，FX激活剂或其药物组合物可施用于患者以促进凝血并减少与手术相关的失血，进一步减少输血需求。
在一些实例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可施用于经历各种类型手术的凝血功能正常的患者，以实现快速止血并防止失血。用FX激活剂或其药物组合物治疗可促进手术部位的止血并减少或防止失血，从而减少或消除输血的需要。在一些实施方案中，FX激活剂或其药物组合物可表现出增强的性质，例如半衰期延长、对循环蛋白酶抑制剂的抗性和/或催化活性提高，因此，可以以例如，较低剂量、较少频率给药，且具有更少的不良反应。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RV-X先导制剂)也可用于促进创伤受试者的凝血和防止失血。创伤被定义为外来因素对生物组织的损伤，是美国第四大死亡原因。创伤分为钝性创伤(导致内部压迫、器官损伤和内部出血)或穿透性创伤(药剂穿透身体并破坏组织、血管和器官，导致外部出血)。创伤可由多种事件引起，包括但不限于车祸(造成钝性和/或穿透性创伤)、枪伤(造成穿透性创伤)，刺伤(造成贯穿性创伤)、机械事故(造成穿透和/或钝性创伤)，以及从高空坠落(造成穿透伤和/或钝器创伤)。创伤导致的不受控制的出血是大多数相关死亡的原因。
弥漫性凝血障碍是与创伤患者相关的一种相对常见的并发症，在25-36％的患者中发生。凝血障碍可在损伤后早期发展，由多种因素引起，如凝血因子和血小板的稀释和消耗、纤维蛋白溶解、酸中毒和低温。常规治疗包括通过输注新鲜冷冻血浆(FFP)血小板、红细胞和/或冷冻沉淀物的替代性疗法、纠正酸中毒和治疗低温过低。这些步骤通常不足以止血和防止死亡。
血友病
如本文所用，“血友病”是指由凝血因子缺乏引起的出血性疾病。血友病可以是由于凝血因子缺乏、表达减少或功能降低导致的。最常见的血友病类型是血友病A，它是由缺乏因子VIII引起的。第二种最常见的血友病是血友病B，它是由缺乏因子IX引起的。血友病C，也称为FXI缺乏症，是一种较温和且较不常见的血友病。
如本文所用，“先天性血友病”是指遗传的血友病类型。先天性血友病是由于凝血因子基因的突变、缺失、插入或其他修饰导致的，在该疾病中，凝血因子的产生缺失、减少或无功能。例如，凝血因子基因的遗传突变，如因子VIII和因子IX，导致先天性血友病，分别为血友病A和血友病B。
如本文所用，“获得性血友病”指的是一种在成年期因自身抗体的产生而发生的血友病，该抗体使凝血因子如FVIII失活。因子VIII抑制物可在其他健康个体中自发产生，导致“获得性血友病”。获得性血友病是一种罕见的疾病，每年发病率为百万分之0.2-1.0。自身抗体主要是IgG4抗体，当与FVIII结合时，其通过干扰凝血酶切割、血管性血友病因子相互作用和/或磷脂结合来抑制FVIII活性。这导致约87％的受影响患者出现危及生命的出血。常见的出血部位是皮肤、粘膜、肌肉和腹膜后，而遗传性血友病患者主要在关节和肌肉出血。获得性血友病可用活化凝血酶原复合物浓缩物或重组活化因子VII(Novo Nordisk)治疗，以控制出血事件。本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可表现出增强的凝血活性，无需FVII替代治疗。
血友病是一种出血性疾病，由一种或多种凝血因子缺乏引起。其特征是在组织损伤部位形成血凝块的能力降低。先天性X连锁血友病包括血友病A和血友病B，它们分别由导致FVIII和FIX缺陷的突变引起。血友病A的发病率为每100000名男性中有1名，而血友病B的发病率则为每50000名男性中的1名。血友病A和B进一步分为轻度、中度或重度。功能正常的因子VIII或IX在血浆中的水平为5％-25％时为轻度，1％-5％为中度，低于1％为重度。血友病C，通常被称为FXI缺乏症，是一种相对温和和罕见的常染色体隐性疾病，发病率约1/10万人。
血友病患者反复出现关节和肌肉出血，这可能是自发的，也可能是对创伤的反应。出血可引起严重的急性疼痛，活动受限，并导致继发性并发症，包括滑膜肥大。此外，关节反复出血可导致慢性滑膜炎，会引起关节损伤，破坏滑膜、软骨和骨骼。出血通常通过输注新鲜冷冻血浆(FFP)、FXI替代疗法，或局部治疗，如对外部伤口或拔牙的治疗，纤维蛋白胶。血友病A或B最常见的治疗是替代性治疗，向患者施用FVIII或FIX。该制剂为血浆衍生产品或重组产品，可市售获得，现在，重组蛋白是先前未治疗患者的治疗选择。虽然这些疗法可能非常成功，但如果患者对新施用的因子VIII或因子IX产生抑制物，则会出现并发症。
抑制物是能与FVIII或FIX反应并干扰促凝血功能的IgG抗体，主要是IgG4亚类。抑制物影响大约五分之一的严重血友病A患者。尽管受试者后来会产生出抑制物，但大多数受试者在第一次注射因子VIII(通常在儿童早期)后很快产生这些抑制物。抑制物也影响约15分之一的轻度或中度血友病A患者。这些抑制物通常在成年期产生，不仅破坏施用的外源性FVIII，还破坏内源性FVIII。结果，轻度和中度血友病患者病情进一步恶化。临床上，根据其再次暴露于FVIII时所经历的记忆反应强度，伴有抑制物的血友病A患者分为高反应者和低反应者。抑制物约影响百分之一的血友病B患者。在大多数情况下，抑制物在第一次注射治疗因子IX后产生，并可能伴随过敏反应。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RV-X先导制剂)以及本文提供的编码FX激活物的核酸可普遍用于治疗血友病患者，包括伴抑制物血友病患者，并可用于治疗与血友病相关的出血性病症。本文所述的FX激活剂或其药物组合物可用于例如控制或预防自发出血事件，或通过增强凝血酶生成而控制或预防创伤或外科手术引起的出血，同时不再需要FVIIA和/或FIXa。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可通过使用例如动物模型检测其治疗有效性。例如，FVIII或FIX缺陷小鼠(例如，M-KOVIII小鼠)、抗体诱导的血友病小鼠或血友病的任何其他已知疾病模型可以用FX激活剂或其药物组合物治疗。监测疾病症状和表型的进展以评估FX激活剂或其药物组合物的效果。FX激活剂或其药物组合物也可施用于动物模型以及受试者，例如在临床试验中，与安慰剂对照和/或使用其他止血剂的对照相比以评估体内有效性。
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)也可用于治疗因FVIII和FIX以外的凝血因子缺乏而导致的凝血障碍的患者。例如，FX激活剂或其药物组合物可用于治疗因子VII缺乏症、因子X缺乏症、因子XIII缺乏症和II、IV、V和VI型家族性多凝血因子缺乏症(FMFD)的患者(见于Roberts,H R and M D Bingham,“OtherCoagulation Factor Deficiencies,”Thrombosis and Hemorrhage,2nd ed.Baltimore,Md.:Williams&Wilkins,1998:773-802)。
药代动力学(PK)
药代动力学(PK)是指药物(例如，FX激活剂，如RVV-X)在向受试者施用后的吸收、分布、代谢和排泄。可用于确定临床效用的药代动力学参数包括但不限于血清/血浆浓度、随时间变化的血清/血浆浓度、最大血清/血浆浓度(Cmax)、达到最大浓度的时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、给药间隔内浓度-时间曲线下面积(AUCτ)等。
用于获得药物的PK曲线的技术是本领域已知的。参见Heller et al.,Annu RevAnal Chem,11,2018；和Ghandforoush Sattari et al.,J Amino Acids,Article ID346237,Volume2010。在一些实施例中，在个体的血液、血浆或血清样本中测量FX激活剂(例如，RVV-X)的PK曲线。在一些实施例中，使用质谱技术(例如，LC-MS/MS或ELISA)测量个体中FX激活剂(例如，RVV-X)的PK曲线。可通过本领域已知的任何方法在PK曲线上进行PK分析，如非室间分析，例如，使用PKSolver V2软件(Zhang Y.et al.,“PKSolver:An add-inprogram for pharmacokinetic and pharmacodynamic data analysis in MicrosoftExcel,”Comput Methods Programs Biomed.2010；99(3):306-1)。也可参见实施例1。
“C”表示受试者血浆、血清或任何合适的体液或组织中的药物浓度，通常表示为每单位体积中的质量，例如纳克/毫升或皮克/毫升。为方便起见，血清或血浆中的药物浓度在本文中称为“血清浓度”或“血浆浓度”。给药后任何时间(例如，FX激活剂，例如静脉注射、腹腔注射或皮下注射)的血清/血浆浓度称为Ctime或Ct。给药期间的最大血清/血浆药物浓度被称为Cmax；Cmin是指给药间隔结束时的最小血清/血浆药物浓度；Cave指给药间隔期间的平均浓度。
术语“生物利用度”是指药物(例如，FX激活剂，如RVV-X))通过体循环，从而进入作用部位的程度或速率。
“AUC”是血清/血浆浓度-时间曲线下的面积，被认为是对生物利用度最可靠的测量方式，如给药间隔内浓度-时间曲线下的面积(AUCτ)，“总暴露”或“一段时间内的总药物暴露”(AUC0-last或AUC0-inf)，给药后t时间内的浓度-时间曲线下的面积(AUC0-t)等。
血清/血浆浓度峰值时间(Tmax)是给药后达到血清/血浆浓度(Cmax)峰值的时间。
半衰期(t1/2)是指在血浆或血清(或其它生物基质)中测得的药物浓度(例如，FX激活剂(例如，RVV-X))降至其在特定时间点的浓度或量的一半所需的时间。例如，静脉给药后，由于药物的分布和消除，血浆或血清中的药物浓度下降。在静脉给药后血浆或血清药物浓度随时间变化的曲线中，第一阶段或快速下降阶段被认为主要是由于分布导致，而后期的下降通常较慢，主要是由于消除导致，尽管这两个过程在这两个阶段都会发生。在足够的时间后，假定药物的分布已完成。一般来讲，消除半衰期由血浆/血清浓度-时间曲线的终末期或消除(主要)阶段决定。参见Michael Schrag和Kelly Regal，“临床前药物开发毒理学综合指南”的“第3章-药代动力学和毒代动力学”，2013。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)具有至少5小时的半衰期(例如，静脉注射，如给人类注射)，如至少为5.5、6、6.5、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.7、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48小时或更长。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物具有5小时至12小时的半衰期(例如，静脉注射，如给人类注射)，如5小时至10小时、5小时至8.5小时、6.5小时至9小时、6.7小时至8.8小时或7小时至8.5小时。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物以单次给药的方式给药，如单次静脉注射，如剂量为0.16U/kg至0.48U/kg。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物以多次给药的方式给药(例如，4-6次，如5次)，如静脉注射，每次剂量为0.16U/kg，q4h。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)以单次或多次给药的方式给药可提高AUC0-∞约600h*pg/mL至4000h*pg/mL，如650h*pg/mL至3500h*pg/mL、650h*pg/mL至1500h*pg/mL、900h*pg/mL至2000h*pg/mL、1500h*pg/mL至3500h*pg/mL,、3200h*pg/mL至3500h*pg/mL、1200h*pg/mL至1500h*pg/mL、800h*pg/mL至1000h*pg/mL、2200h*pg/mL至2600h*pg/mL、1000h*pg/mL至4000h*pg/mL、2000h*pg/mL至4000h*pg/mL、3000h*pg/mL至4000h*pg/mL或600h*pg/mL至1000h*pg/mL。在一些实施例中，所述FX激活剂或其药物组合物的给药剂量为每次0.16U/kg至0.48U/kg(或单次剂量)，如每次0.16U/kg。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)以单次给药的方式给药(例如，静脉注射，如向人类注射)，如剂量为0.16U/kg至0.48U/kg，提供的Cmax约为60pg/mL至500pg/mL，如70pg/mL至450pg/mL、70pg/mL至150pg/mL、100pg/mL至500pg/mL、200pg/mL至500pg/mL、300pg/mL至500pg/mL、400pg/mL至500pg/mL、100pg/mL至300pg/mL、90pg/mL至120pg/mL、100pg/mL至250pg/mL、140pg/mL至180pg/mL、150pg/mL至450pg/mL或270pg/mL至320pg/mL。在一些实施例中，在给药最多10分钟(例如，最多9、8、7、6、5、4、3、2、1分钟)内达到Cmax，如给药5分钟。
药效学(PD)
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)可以使用试验或体内参数评估其生物活性，如体外凝血试验或血友病模型或个体的药效学(PD)效应。
PD参数或检测凝血活性的试验是本领域已知的，包括单不限于，活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、因子X活性试验(FX:C)、凝血酶生成(TG)(包括峰高)、校准的自动凝血酶生成分析(CAT)、内源性凝血酶生成潜力(ETP)、活化凝血时间(ACT)、全凝血时间(WBCT)等。APTT测试是通过测量在血浆样本中加入药物后形成血栓所需的时间(以秒为单位)来测量和评估所有凝血级联反应的内源性和共同途径的凝血因子。APTT可使用APTT-ACTIN FSL试剂盒(Siemens，德国)、CS-5100(Sysmex，日本)自动血液凝血分析仪或STA-CKPrest(斯塔戈，法国)和STA-R Max(Stago)自动凝血分析仪进行评估。FX:C可以通过使用自动凝血分析仪(Sysmex)或FX显色活性测定试剂盒进行验证性凝固试验。TG可以通过使用TG(CAT)分析仪(Stago)校准的自动血栓谱分析来测量，如以组织因子(TF)和磷脂(Stago)为触发器。也可参见实施例1。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)以单次给药的方式给药(例如，静脉注射，如给人类注射)，如剂量为0.16U/kg至0.48U/kg，可以i)增加TG的峰高和ETP，呈剂量依赖性；ii)在5分钟达到TG和/或ETP的峰值；iii)保持TG和/或ETP在较高水平至给药后4小时；和/或iv)给药约24小时后，TG和/或ETP恢复至剂量前水平。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)以单次给药的方式给药(例如，静脉注射，如给人类注射)，如剂量为0.16U/kg至0.48U/kg，可以i)缩短APTT，呈剂量依赖性；ii)缩短APTT至少约5％(例如，至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或更多)；iii)给药后约5分钟APTT的缩短达到最大；和/或iv)给药约24小时后，APTT恢复至剂量前水平。
在一些实施例中，本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)以多次给药的方式给药(例如，静脉注射，如给人类注射)，如剂量为0.16U/kg，q4h，2-6次(例如，2、3、4、5或6次)，能够i)在首次给药10分钟内缩短APTT；ii)缩短APTT至少约20％(例如，至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％或更多)；iii)缩短APTT至少约20秒(例如，至少约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、70、80或更多)；iv)第三次给药4小时后APTT达到平台期；v)缩短APTT至末次给药后约8小时；和/或vi)末次给药约28小时至26小时后，APTT恢复至剂量前水平。
安全性
本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的安全性结果可以通过生命体征、身体检查、实验室检查结果、心电图(ECG)、超声(双下肢腹部和深静脉)和不良事件概述来评估。不良事件的严重程度可参考NCI的不良事件通用术语标准(CTCAE v5.0)来确定。参见实施例1、表4-1、表4-2、表S1、表S2的安全性测量方法和参数。例如，可以检测剂量限制性毒性(DLT)事件、严重不良事件(SAE)、导致停药的不良事件(AE)、剂量依赖性的AE、药物相关的AE、药物相关的SAE或疑似意外严重不良反应(SUSAR)。其他不良参数包括但不限于临床相关的凝血异常、下肢深静脉血栓形成(DVT)、血栓事件、D-二聚体(血凝块溶解时产生的蛋白片段)增加、纤维蛋白降解产物(FDP)增加等。不良参数还包括FX水平和/或纤维蛋白原(FIB)水平下降超过正常值范围，和/或一段时间后(例如，3小时)不能恢复正常范围。
在一些实施例中，本文所述的治疗出血性疾病的方法(例如，单次或多次给药)，以及本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)不诱导或诱导低水平不良反应，如通过本文所述的一个或多个参数和/或试验测定。没有或较低水平的不良反应包括但不限于，1-2级内的AE(例如，药物相关的AE)；3级AE少于总AE的5％(例如，少于5％、4％、3％、2％、1％或0％)；各剂量依赖性的AE、DLT事件、SAE、AE、导致停药的AE、药物相关的SAE、SUSAR、临床相关的凝血异常、DVT、DIC、D-二聚体增加、FDP增加和/或静脉血栓事件少于总AE的5％(例如，少于5％、4％、3％、2％、1％或0％)；FX水平和/或FIB水平在正常范围内的降低等。
免疫原性
在给患者施用蛋白质药物的上下文中，术语“免疫原性”被定义为该蛋白质药物在给药后或反复给药后对病人产生免疫反应的倾向。
血浆中的抗FX激活剂(例如，抗RVV-X)结合抗体可以通过有效的电化学发光分析法(Meso Scale Discovery)检测。可进一步评估抗体效价和中和抗体(针对FX激活剂)。
在一些实施例中，本文所述的治疗出血性疾病的方法(例如，单次或多次给药)，以及本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)不诱导中和抗体或诱导低效价(例如，少于30、20、10、5或2)的中和抗体。
在一些实施例中，本文所述的治疗出血性疾病的方法(例如，单次或多次给药)，以及本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)i)在血浆中不会诱导抗FX激活剂(例如，抗RVV-X)的结合抗体，或诱导低效价(例如，少于30)的结合抗体；和/或ii)不会使得抑制物效价增加或抑制物效价的增加少于10％。
V.制品及试剂盒
进一步提供包含本文所述的任何FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的试剂盒、单位剂量和制品。在一些实施例中，提供包含本文所述的任一种FX激活剂药物组合物的试剂盒，并且优选地提供其使用说明，如用于治疗本文所述的出血性疾病(例如，血友病A或B，伴或不伴抑制物)。
在一些实施例中，所述FX激活剂(例如，RVV-X)药物组合物(例如，冻干的，如RVV-X先导制剂)包装在小瓶中(例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子)。在一些实施例中，所述药物组合物为粉末状。在一些实施例中，每小瓶装有5U的FX激活剂(例如，RVV-X)。在一些实施例中，所述试剂盒进一步提供说明书，说明药物组合物用2ml 0.9％氯化钠注射液复溶。在一些实施例中，所述试剂盒进一步提供说明书，说明药物组合物用于静脉注射。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含注射针。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含装在单独容器中的0.9％氯化钠注射液。
本发明的试剂盒包括一个或多个包含本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物(例如，RVV-X先导制剂)的容器，例如，用于治疗出血性疾病。例如，包含描述施用FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物以治疗疾病出血性疾病(如血友病)的说明书。试剂盒可能进一步包含识别个体是否患有疾病和疾病阶段以选择适合治疗的个体(例如，人类)的描述。与FX激活剂(例如，RVV-X)或其药物组合物的使用相关的说明通常包括关于预期治疗的剂量、给药计划和给药途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明通常是写在标签或药品说明书上的书面说明(例如，试剂盒中包括的纸张)，但机器可读说明(例如，存储在磁盘或光盘上的说明)也是可以接受的。本申请的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。还考虑与特定装置结合使用的包装，如输液装置如微型泵。试剂盒可具有无菌接入端口(例如，容器可为静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。该组合物中的至少一种活性剂是如本文所述的FX激活剂(例如，RVV-X)。容器可进一步包含第二种医药活性剂。试剂盒可选择性地提供附加组分，如缓冲液和解释信息。一般来说，试剂盒包含一个容器和容器上或与容器相关的标签或药品说明书。
本申请还提供制品，包括小瓶(如密封小瓶)、瓶、罐、软包装等。该制品包含容器和容器上或与容器相关的标签或药品说明书。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料制成，如玻璃或塑料。一般来说，容器容纳的组合物可有效治疗本文所述疾病或紊乱，并且可具有无菌接入端口(例如，容器可为静脉注射溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。标签或药品说明书表明该组合物用于治疗个体的特定病症。标签或药品说明书进一步包含向个体施用组合物的说明。标签可能会注明复溶和/或使用的说明。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，允许复溶制剂重复给药(例如，2-6次给药)。药品说明书是指通常包含在治疗产品商业包装中的说明书，其中包含与此类治疗产品使用有关的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告信息。此外，制品可能进一步包含第二容器，包含药学可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户角度来看，可能进一步包括其它需要的材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
所述试剂盒或制品包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其包装量足以在药房中储存和使用，例如，医院药房和复方药房。
具体实施方式
以下实施例旨在仅仅作为本发明的示例，因此不应被视为以任何方式限制本发明。提供以下实施例和详述仅用于说明而非限制。
实施例1：FX激活剂RVV-X在伴抑制物血友病A或B患者中的首个人体I期研究
血友病A(HA)和血友病B(HB)是分别由于缺乏因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)引起的遗传性出血性疾病。这些患者的出血事件(BEs)通常采用因子替代治疗；然而，20％-30％的血友病A患者和5％的血友病B患者会产生外源性FVIII或FIX抑制物1。伴抑制物的患者出血事件难以控制。在这些患者中，通过替代缺陷因子(取决于抑制物滴度)可能无法实现止血，因此可能需要使用旁路药物。目前推荐的两种用于伴抑制物患者的一线旁路药物是活化的凝血酶复合物浓缩物(aPCC)和活化的重组因子VII(rFVIIa)2-4。然而，aPCC在中国不可用，且aPCC中微量的因子VIII可能会诱导对FVIII的回忆应答。由于医疗费用较高，rFVIIa并没有得到广泛应用，特别是在发展中国家。
RVV-X是一种分子量为93kDa的异源三聚体，从圆斑蝰蛇(Daboia russelliisiamensis)毒液中纯化而来。它由α链(重链)、β链(轻链1)和γ链(轻链2)8-10组成。RVV-X可以特异性激活凝血因子X(FX)。该激活过程包括在FX重链N端特定的“Arg-Ile”肽键上切割FX，使活性位点充分暴露，产生凝血因子Xa(FXa)。然后FXa与血小板、凝血因子Va(FVa)和损伤部位激活的钙离子形成凝血酶原复合物，从而增加凝血酶的产生，达到止血的目的10。临床前研究证实RVV-X可以将FX激活为FXa，并以剂量依赖的方式增加人血浆中凝血酶的含量和凝血酶产生的峰值。此外，RVV-X能缩短血友病小鼠的APTT，降低血友病小鼠断尾24小时死亡率。临床前毒理学研究表明，RVV-X具有较好的耐受性和安全性。
在本研究中，我们对RVV-X进行了I期临床、首次在人体内、多中心、开放、剂量递增的研究，评估了RVV-X在分别伴因子VIII/IX抑制物血友病A或B患者中的安全性、药代动力学(PK)和药效学(PD)。
伴抑制物HA或HB的中国人群患者在无出血状态下单次静脉注射RVV-X(0.01U/kg、0.04U/kg、0.08U/kg、0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg)或多次静脉注射RVV-X(0.16U/kg)，每4小时(q4h)，最多注射6次。本研究注册于www.clinicaltrials.gov，试验编号NCT-04747964和NCT-05027230。
单剂量组结果：RVV-X表现出线性的PK曲线。RVV-X给药后，凝血酶生成(TG)峰值高度的变化和内源性凝血酶生成潜力(ETP)均呈剂量依赖性增加。活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)呈剂量依赖性缩短。
多剂量组结果：RVV-X前三次给药后，TG峰高度的升高，APTT的缩短均达到平台期。
综上，单次注射和多次注射RVV-X都是安全的，且耐受性良好。从单次剂量0.16U/kg开始，RVV-X显著改善凝血相关的实验指标。在多剂量组中，RVV-X给药4次后，APTT和ETP的改善达到平台期。未报告严重不良事件(SAE)或剂量限制性毒性(DLT)事件。未观察到血栓栓塞事件和弥散性血管内凝血(DIC)。RVV-X给药后未检出抗药抗体。这些结果表明，无论是HA还是HB，RVV-X具有用作血友病患者出血事件按需治疗的潜力。
·方法
·研究设计及参与者
本研究为首次在人体内进行的多中心、开放、剂量递增的I期临床研究。本研究在中国医学科学院血液病医院(天津，中国)及河南省肿瘤医院(郑州，中国)开展，遵循《赫尔辛基宣言》和国际临床研究管理规范(ICH-GCP)。本研究获得了各参与中心伦理委员会的批准(XY2019039-EC-2和XY2021034-EC-2)并在www.clinicaltrials.gov上注册(NCT-04747964和NCT-05027230)。所有受试者在登记前均签署知情同意书。
患有中度或重度伴有抑制物(分别伴有因子VIII或IX抑制物)血友病A或B(因子活性水平<5％ IU/dL)的中国男性患者(年龄18-65周岁)符合入选标准。排除既往或目前对药物或蛋白血液制品的任何成分有临床显著过敏史、除血友病A或B以外的凝血障碍、血栓栓塞性疾病的受试者。
单剂量组，符合条件的患者分为1组(0.01U/kg，n＝2)、2组(0.04U/kg，n＝2)、3组(0.08U/kg，n＝3)、4组(0.16U/kg，n＝3)、5组(0.32U/kg，n＝3)和6组(0.48U/kg，n＝3)，分别接受单次静脉(IV)注射RVV-X。
多剂量组，符合条件的患者(n＝6)接受静脉注射RVV-X，注射剂量为0.16U/kg，每4小时一次(q4h)，最多注射6次。根据A期研究结果，0.16U/kg RVV-X可显著缩短APTT，因此选择0.16U/kg作为多次剂量递增的初始剂量。
剂量递增从最低剂量RVV-X开始，并遵循逐步递增剂量的程序。在单剂量组中，RVV-X每次给药时，首先只向1名受试者给药。在48小时确认安全性后，再向其余受试者施用RVV-X。在给药后的168小时内监测生命体征、实验室检查(见于实施例2“实验室检查”各项指标)、心电图(ECG)、超声(双下肢腹部和深静脉)、不良事件。在耐受性和安全性得到确认后，数据和安全监查委员会决定进行下一个剂量水平。在确认单剂量组的耐受性和安全性后进行多剂量组给药。
FVIII缺乏的人血浆、FIX缺乏的人血浆和正常人血浆中RVV-X对APTT影响的研究结果表明，0.001U/ml～10U/ml RVV-X可缩短FVIII缺陷和FIX缺陷人血浆中的APTT，并呈剂量依赖性(图4)，据此确定最低预期生物效应剂量(MABEL)为0.001U/ml。根据平均健康人类体重60kg、循环血量4000ml估算，最大推荐起始剂量(MRSD)为0.067U/kg。
·研究药物及给药
用于给药的制剂包含从圆斑蝰蛇(Daboia russellii siamensis)的蛇毒中分离和纯化的RVV-X(包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO：3)及赋形剂。赋形剂包括蔗糖、组氨酸、聚山梨酯酯20和甘露醇。
本品为白色或白色稀疏块状或粉末，无菌，用于注射。每个小瓶含有5U的冻干RVV-X。注射前，每个小瓶用2ml 0.9％氯化钠注射液复溶。将复溶制剂缓慢静脉注射给受试者，并根据各组剂量计算每个受试者的注射量。
·测量结果
观察以下各项指标：生命体征、12导联心电图、胸片、超声(腹部、下肢深静脉)、凝血因子Ⅷ浓度(FVIII:C)、凝血因子Ⅸ浓度(FⅨ:C)、FⅧ或FⅨ抑制物、血常规、血液生化、尿常规、凝血酶原时间(PT)、APTT、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)、凝血因子X浓度(FX:C)，凝血酶生成(TG)、D-二聚体、纤维蛋白降解产物(FDP)、RVV-X的PK试验和抗RVV-X抗体。
·药代动力学(PK)
血浆RVV-X浓度通过经验证的电化学发光分析法测定(Meso Scale Discovery，美国)。定量下限为5pg/mL。
·药效学(PD)
评估了APTT、因子X活性分析(FX:C)、凝血酶生成(TG)，包括峰值高度、内源性凝血酶生成潜力(ETP)。使用APTT-ACTIN FSL试剂盒(Siemens，德国)、CS-5100(Sysmex，日本)自动血液凝固分析仪或STA-CK Prest(Stago，法国)和STA-R Max(Stago)自动血液凝结分析仪测定APTT。使用自动血液凝固分析仪(Sysmex)通过验证的凝血分析对FX:C进行测定。使用TG(CAT)分析仪(Stago)通过校准的自动血栓图测定法，以1μM组织因子(TF)和4μM磷脂(Stago)作为触发因素，对TG进行测定。
·安全性
通过生命体征、体格检查、实验室检查、心电图(ECG)、超声(腹部和下肢深静脉)以及不良事件概况评估安全性结果。不良事件的严重程度参照NCI不良事件通用术语标准(CTCAE v5.0)确定。
·免疫原性
血浆中的抗RVV-X结合抗体通过经验证的电化学发光分析(Meso ScaleDiscovery)进行筛选和确认。对于阳性样品，进一步测定抗体滴度和中和抗体。
·统计分析
对人口统计学特征、PK、PD和安全性结果进行总结统计。在单剂量组，计划在每个组中至少招募两名患者，以评估安全性、PK和PD。PK参数包括达到峰值的最大血浆浓度(Cmax)、从零时到最后一个可测定血药浓度的采集时间t的血药浓度-时间曲线下面积(AUC0-t)、从零外推至无穷远时间的曲线下面积(AUC0-∞)、达到最大血浆浓度的时间(Tmax)、半衰期(t1/2)、表观分布容积(Vz)、血浆清除率(CLz)、消除速率常数(λz)，使用PhoenixWinNonlin软件8.1版，从每个受试者的RVV-X血浆浓度-时间曲线计算从最后一次可量化浓度到无穷远的时间外推得出的残留面积百分比(AUC％Extrap)。通过幂函数模型分析AUC与剂量、Cmax和剂量之间的关系。在多剂量组中，计算AUC0-t、AUC0-∞、t1/2。
·结果
·研究群体
单剂量组：本试验共纳入16名中国血友病患者。其中，15名患者为伴有抑制物的血友病A(HA)，1名患者为伴有抑制物的血友病B(HB)(表1)。
多剂量组：本试验共纳入7名中国血友病患者，其中，5名受试者接受5次，1名受试对象接受6次，1名患者接受2次。其中，5名患者为伴有抑制物的血友病A(HA)，2名患者为伴有抑制物的血友病B(HB)(表1)。
所有患者均为汉族，并按照方案要求完成RVV-X给药。
表1入组受试者人口学资料和临床特征
·PK
单剂量组：剂量为0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg时，RVV-X的血浆浓度以剂量依赖性的方式增加，Cmax以线性PK特征增加，(图1A-1C)。Cmax出现在5分钟，并在给药24小时后逐渐恢复到给药前水平。PK参数分析结果(表2)显示，单剂量0.16U/kg、0.32U/kg和0.48U/kg RVV-X的Cmax分别为110.04±32.03pg/mL、163.51±50.79pg/mL和296.48±122.65pg/mL。AUC0-∞分别为988.38±325.97小时*pg/mL、1419.10±497.46小时*pgs/mL和2478.88±944.98小时*pg/mL，AUC0-∞也随着剂量增加而增加。T1/2分别为7.33±0.55h、8.33±1.41h和7.57±0.68h。
表2单次注射RVV-X后的PK参数
多剂量组：随着5次连续给药，RVV-X的血浆浓度逐渐增加，但增加趋势逐渐平缓(图1D)。多次注射0.16U/kg的PK参数分析结果表明，AUC0-∞为3342.02h*pg/mL，T1/2为8.40小时。
单剂量和多剂量方案的PK数据一致且具有可比性。
·PD
单剂量组：在RVV-X给药后，TG的峰高和ETP的变化均以剂量依赖性方式增加，在5分钟达到峰值，在前4小时保持在高水平，并在24小时后逐渐恢复到给药前水平(图2A和2B)。APTT以剂量依赖性方式缩短，在5分钟时观察到APTT的最大缩短，持续到12小时，并在24小时后逐渐恢复到给药前水平(表3-1)。
在单剂量组中，随着研究药物剂量的增加，APTT和ETP的改善越来越明显，从0.16U/kg剂量开始，RVV-X显著改善了凝血相关实验指标(见实施例2中“实验室检测”中的指标)。
表3-1单剂量组的APTT
多剂量组：在RVV-X的前3次给药后，TG的峰高持续增加，第4次给药之后没有显著增加。RVV-X给药后，APTT迅速缩短(首次给药后缩短至10分钟内，与基线水平相比平均缩短约22秒)，第3次给药后4小时降至平台期。这表明RVV-X在给药4次时已达到最大功效。APTT的缩短持续至最后一次给药后的8小时，并在最后一次给药后28-36小时逐渐恢复至给药前水平(表3-2)。
多剂量的0.16U/kg也显著改善凝血相关实验指标。
表3-2多剂量组的APTT(0.16U/kg)
·安全性结果
单剂量组：研究期间，RVV-X在高达0.48U/kg的剂量下耐受性良好。16名患者中的14名(88％)共报告了36起不良事件(表4-1)，其中32起(89％)事件严重程度为1级，4起(11％)事件为2级。试验期间未报告剂量限制性毒性(DLT)事件、严重不良事件(SAE)或导致研究停止的不良事件(AE)。此外，不良事件的发生率并没有随剂量增加而增加。研究人员判断的所有与药物相关的不良事件均为1级，未报告与药物相关的SAE或疑似意外严重不良反应(SUSAR)。
基于不良事件的报告，未发现临床相关凝血异常的证据，未发现下肢深静脉血栓形成(DVT)，也未报告血栓栓塞事件(表4-1)。在施用RVV-X的24小时内，每组FX显示出一定程度的降低，但与基线相比其变化在10％以内(图3A)，实际测量值在正常值的90％以上(图3B)。该结果表明，RVV-X激活FX是非常安全的，并且对FX的消耗是最小的。
表4-1单剂量组的所有AEs
MedDRA V24.0用于编码。注：SOC：系统器官分类，PT：首选术语。
多剂量组：多次注射RVV-X是安全的且是可耐受的。7名患者中的7名(100％)共报告了26起不良事件(AE)(表4-2)，其中24起(92％)事件为1级，1起(4％)事件为2级，1例(4％)为3级。不良事件导致6名受试者停止连续给药，其中1例退出试验。具体原因为：4例中出现D-二聚体(血凝块溶解时产生的蛋白片段)和纤维蛋白降解产物(FDP)增加，1例出现纤维蛋白原减少，1例出现右背足寒冷。RVV-X给药3-4次后，D-二聚体显著增加，但大多数患者中的最大值均未超过5mg/L，且停止给药后自动下降。未报告血栓栓塞事件或弥散性血管内凝血(DIC)。在施用RVV-X的24小时内，FX显示出一定程度的降低，但与基线相比变化在20％以内。
6名受试者共报告了18例与研究药物RVV-X相关的不良事件，其中17例为1级，1例为3级。大多数不良事件在停止RVV-X后未经治疗而恢复。唯一的3级AE是纤维蛋白原(FIB)水平下降。该不良事件的过程：5次RVV-X给药后，FIB从1.91g/L降至0.92g/L；未经治疗，3小时后FIB水平恢复到1.84g/L。在其他受试者中，与基线相比，FIB下降不超过1g/L，且均在正常值范围内。未报告RVV-X相关的SAE和SUSAR。
在0.16U/kg的多剂量组中，多达6个剂量的RVV-X没有引起血栓事件，表明RVV-X在改善血友病患者凝血功能障碍时具有良好的安全性。然而，在施用3-4个剂量的RVV-X后，D-二聚体显著增加，因此不超过4次连续剂量是更安全的。
表4-2多剂量组的所有AEs
RVV-X的靶标是FX，因此RVV-X激活FX会导致一定数量的FX消耗。单剂量组和多剂量组的上述结果表明，RVV-X对FX的激活不会导致FX的过度消耗。
·免疫原性
结合抗体
单剂量组：在RVV-X给药前和给药后第8天，16名受试者中有1名具有较低滴度的结合抗体(<30)。然而，未观察到该受试者的抑制物滴度增加。因此，结合抗体阳性的结果被认为与RVV-X无关，但可能与以前使用其他促凝药物有关。该受试者的APTT和TG在给药后均有改善。
多剂量组：在RVV-X给药前和给药后第7天，7名受试者中有1名具有较低滴度的结合抗体(<30)。然而，未观察到该受试者的抑制物滴度明显增加。因此，结合抗体阳性的结果被认为与RVV-X无关，但可能与以前使用其他促凝药物有关。该受试者的APTT和TG在给药后均有改善。
中和抗体
在单次注射组和多次注射组中，所有受试者的中和抗体均为阴性。
这些发现得出一个初步结论，即RVV-X具有低免疫原性，并且施用RVV-X不会获得超敏反应。
综上，这项首次在人体内进行的RVV-X研究表明，静脉注射RVV-X单次剂量高达0.48U/kg和多次注射0.16U/kg是安全的且耐受性良好。从单剂量0.16U/kg开始，RVV-X显著改善凝血相关实验指标。在多次注射RVV-X时，四次给药后，APTT和ETP的改善达到平台阶段。总之，这些结果表明，RVV-X具有作为血友病患者出血事件按需治疗的潜力，无论是HA还是HB。这项研究发现将推动RVV-X进入后续临床试验，以探索其治疗伴有抑制物血友病患者中的出血事件的有效性和安全性。
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实施例2：FX激活剂RVV-X在伴有抑制物的血友病A或B患者中的II期疗效研究
经研究者审查后，在I期研究中确定0.16U/kg多剂量组是安全的，其中，在施用研究药物RVV-X后，APTT显著改善。因此，采用0.16U/kg多剂量方案进行II期试验(按需治疗出血事件的疗效观察试验)。
·研究说明
II期临床试验入选的受试者是伴有抑制物的血友病患者。受试者在出血事件后接受研究药物治疗，并评估疗效。按照方案要求，研究药物处理的出血事件达80例后，不再入组新的受试者。
完成I期试验的受试者，经过研究者评估并获得受试者知情同意后，可以继续参与II期试验。
如果受试者在入组时没有出血，则可以进行随访。在随访期间，出现出血事件(非致命性或致残性出血事件，不包括中枢神经系统出血和胃肠道出血)的受试者立即前往研究中心接受RVV-X治疗。入组时发生出血事件的受试者应在入组后立即接受RVV-X止血治疗。
给药方案：连续给药，两次给药之间至少间隔4小时，直到止血，最多给药6次。可在临床判断止血后进行研究药物的巩固治疗(最后一次给药后8小时，最多1次，并且对于已经给药6次的患者，不额外进行巩固治疗)。如果连续6次给药结束后的4小时，出血事件仍未得到有效控制，且需要进一步治疗，则不再继续给予研究药物，而应使用当前临床指南推荐的标准治疗方法进行抢救治疗(如重组人凝血因子VIIa或PCC)，并记录在案。如果RVV-X连续给药超过2次但少于6次，但受试者的出血在给药期间继续恶化，若研究人员判断继续给药RVV-X可能无法阻止出血且可能存在重大医疗风险，也可以进行抢救治疗。
受试者入组后，随访至第12周，经研究者评估并获得受试者知情同意后，可重新入组。对于随访期间发生的出血事件，根据首次止血的给药原则，对所有患者进行按需RVV-X治疗，并记录剂量和给药频率，以评估止血效果。如果受试者在研究中心外接受出血事件治疗，则应以日记卡的形式详细记录出血事件和医疗处理。
·参与者
II期研究的参与者是分别伴有因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的血友病A或血友病B患者。
入组标准：1)年龄18-65岁，男性；2)血友病A或B患者；3)具有高抑制物滴度或高记忆应答的血友病患者：在之前的至少1次测试中，抑制物滴度>5BU/ml，并且在入组时抑制物测试呈阳性；4)能够建立适当的静脉通路；5)受试者在试验期间和随访结束后3个月内没有生育计划，并同意采取适当的避孕措施，避免其伴侣怀孕；6)自愿参与并签署知情同意书。
排除标准：1)血友病A和B以外的其他凝血障碍；2)计划在试验期间接受免疫耐受诱导治疗或凝血因子预防，或停止免疫耐受诱导疗法或凝血因子治疗少于4周的血友病患者；3)在研究药物给药前7天内接受抗凝或抗纤溶治疗，或计划在试验期间使用这些药物；4)有动静脉血栓、弥散性血管内凝血、心肌梗死、脑梗死、血栓性微血管病、自身免疫性疾病、恶性肿瘤、肝硬化等疾病史，经研究者判断不适合入组者；5)血小板减少症(PLT<100×109/L)、中重度贫血(血红蛋白<90g/L)；6)符合以下指标之一的肝病患者：a)总胆红素≥正常值上限的2倍，以及b)丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶≥正常值上限的2倍；肾病患者(血清肌酐≥正常上限的1.5倍)；7)筛查前发生严重出血(致命或致残性出血、中枢神经系统出血或胃肠道出血)；8)在筛查前4周内接受了大手术并接受了血液或血液成分输注；9)抗人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体检测呈阳性，或已知HIV感染，且伴CD4计数<200细胞/μL；10)对组合物的任何成分或其他蛋白质血液制品严重过敏的；11)一个月内参加过其他新药临床试验的；12)研究药物给药前7天内使用促凝血药物(如凝血酶原复合物、重组人凝血因子VIIa)的；或13)研究者认为不适合参加本试验的。
·停止给药参考标准
在多次给药过程中，如果受试者的测试结果符合以下任何一项标准，经研究者判断后，可以停止给药：i)纤维蛋白原(FIB)下降超过正常值下限的50％，或与基线相比下降超过1g/L；ii)APTT恢复到正常值上限以下；iii)D-二聚体显著高于基线水平且大于5mg/L；和iv)发生血栓栓塞事件。
给药过程中应注意实验室测试结果的报告，获得测试结果后应及时做出安全判断。
·研究药物及给药
用于给药的制剂包括从圆斑蝰蛇(Daboia russellii siamensis)蛇毒中分离和纯化的RVV-X(包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO：3)和赋形剂。赋形剂包括蔗糖、组氨酸、聚山梨酯酯20和甘露醇。每个小瓶含有5U的冻干RVV-X。注射前，每个小瓶用2ml0.9％氯化钠注射液复溶。将复溶制剂缓慢静脉注射给受试者，并根据剂量方案计算每个受试者的注射量。
·研究设计
筛选期：受试者签署知情同意书后开始，并采集基线数据。
随访和治疗期：受试者在发生出血事件(非致死性或致残性出血事件)后立即进入研究中心接受RVV-X治疗。
随访期为12周。受试者完成入组后第12周的随访内容后，定义为受试者完成试验。
·试验完成
试验完成确定为：参加试验的受试者完成80例出血事件的治疗和随访，并完成入组后第12周的随访内容。
·监测指标
日常安全性监测指标
体格检查：全面体检。
生命体征：血压、脉搏、呼吸、体温。
实验室测试
血常规：测定白细胞(WBC)计数和分类(中性粒细胞绝对值(NEUT#)、淋巴细胞绝对值(LYMP#)、单核细胞绝对值(MONO#)，嗜酸性粒细胞绝对值(EOS#)、绝对嗜碱性粒细胞绝对值(BASO#))、血红蛋白(HGB)、红细胞(RBC)计数、红细胞压积(HCT)和血小板(PLT)计数。
血生化：测定谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌酐(Cr)、尿素(Urea)、尿酸(UA)、钾(K)、钠(Na)、钙(Ca)、磷(P)和氯(Cl)。
尿常规：晨尿测定尿比重(SG)、pH值、葡萄糖(GLU)、酮体(KET)、尿蛋白(PRO)、白细胞(LEU)、隐血(BLD)、亚硝酸盐(NIT)、尿胆原(URO)、尿胆红素(BIL)。
常规凝血功能：检测凝血酶原时间(PT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)。
凝血因子X(FX:C)和凝血酶生成(TG)测定。
纤溶指数检测：检测D-二聚体和纤维蛋白降解产物(FDP)。
FVIII和FIX活性以及抑制物测定。
12导联心电图。
胸部X光：在筛查期间检查一次。
感染筛查：筛查期间检查一次。
B超：包括腹部B超和下肢深静脉彩超。
免疫原性筛选：检测抗药物抗体。
血药浓度。
·疗效终点
主要疗效终点
有效止血率(所有出血事件)：根据疗效评估表(表5)进行判断，疗效等级为良好或以上的评为有效。
次要疗效终点
首剂给药后第4h/8h/24h的临床缓解率(所有出血事件)：临床缓解定义为每一次出血事件中，首次给药后患者疼痛明显缓解和/或出血体征改善。
·统计分析
计算有效止血率及其95％ CI。计算每次出血事件首次给药后4h、8h和24h的临床缓解率及其95％ CI。
·结果
入组的是患有中度或重度血友病A或B且伴有因子Ⅷ或Ⅸ抑制物的中国男性患者(18-65岁)(因子活性水平<5％ IU/dL)。受试者发生出血事件后，使用研究药物RVV-X进行治疗，然后评估治疗效果。RVV-X以0.16U/kg每4小时给药一次，共4-6次。
共有8名受试者出现了19次出血事件，所有出血事件在RVV-X给药4次以内均实现止血，其中16次出血事件达到了临床试验方案中规定的“有效止血”标准(“有效止血”在疗效等级为优秀或良好时实现，见于表5)。
表5血友病疗效评估表
研究结果发现RVV-X的治疗效果明显优于凝血酶复合物浓缩物(PCC；有效止血率为50％)[见于J.M.Lusher,“Controlled clinical trials with prothrombin complexconcentrates,”Prog Clin Biol Res.1984；150:277-290])。还发现RVV-X的治疗效果与可注射重组人凝血因子VIIa的治疗效果相当(有效止血率约为90％[见于C.Knight et al.,“Systematic review of efficacy of rFVIIa and aPCC treatment for hemophiliapatients with inhibitors,”Adv Ther.2009；26(1):68-88])。
实施例3：RVV-X对M-KOFVIII血友病小鼠的研究
FDA批准的活化重组因子VII(rFVIIa，例如，RT)通过与组织因子形成复合物发挥作用，通过外源途径激活FX为FXa，然后将凝血酶原转化为凝血酶以实现止血。RT常用于治疗伴抑制物的HA和HB患者。然而，它的价格极其昂贵，因此应用有限。此外，非临床研究表明，RT体内半衰期较短：在大鼠中t1/2为0.5小时，在狗和猴子中t1/2约为3小时。RT的急性给药小鼠出现肺血管凝固；并且反复注射RT的大鼠和食蟹猴均出现肺血栓和注射部位的局部刺激反应。见于NovoSeven:EPAR–SCIENTIFIC DISCUSSION(https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/novoseven)及RT处方资料(修正的7/2020；https:// www.novomedlink.com/rare-bleeding-disorders/products/treatments/novosevenrt/ about/why-novosevenrt.html)。
本实施例证明，与RT相比，RVV-X具有相当甚至更优的体内治疗效果。
注射用RVV-X对M-KOFVIII血友病小鼠的促凝血药效预试验
试验选用M-KOFVIII(FVIII基因敲除)血友病小鼠。RVV-X(包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:3和SEQ ID NO:5)通过尾静脉注射给药，分别在D1和D5给药两次，给药剂量为0.1U/kg、1U/kg、10U/kg和100U/kg。首次给药后30min检测出血量、出血时间，第二次给药后30min检测凝血酶原时间(PT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。诺其用作阳性对照。RVV-X稀释液作为安慰剂(PBO)。
如表6所示，M-KOFVIII小鼠的APTT明显高于正常小鼠。诺其处理的M-KOFVIII小鼠出血时间和出血量均发生降低(数据未显示)，APTT恢复至正常动物的水平(表6)。与未经处理的动物相比，RVV-X在单次静脉注射0.1U/kg时即有缩短M-KOFVIII血友病小鼠的APTT的趋势(41.7±14.9s vs 55.7±10.8s)。在0.1～100U/kg剂量下单次静脉注射RVV-X后剂量依赖性地缩短APTT(表6)。RVV-X也不同程度地降低了血友病小鼠的出血时间和出血量(数据未显示)。0.1U/kg即为RVV-X作为M-KOFVIII血友病小鼠的药物活性剂量(PAD)。
表6RVV-X对M-KOFVIII血友病小鼠APTT和PT的影响
△在单次注射RVV-X 30分钟后测定APTT，用平均数±标准差表示；与1组比较，*表示P≤0.05；与2组比较，▲表示P≤0.05；APTT，活化部分凝血活酶时间；诺其，活化的重组因子VII(rFVIIa)，已被FDA批准用于治疗伴抑制物的血友病A或B。
注射用RVV-X对M-KOFVIII血友病小鼠APTT的影响
试验选用C57BL/6小鼠和M-KOFⅧ血友病小鼠。测试药物或对照通过尾静脉单次给药30min后，腹主动脉采血，凝固法测定APTT。诺其用作阳性对照。RVV-X稀释液作为安慰剂(PBO)。
如表7所示，M-KOFⅧ血友病小鼠对照组APTT显著高于正常对照组。诺其处理后，M-KOFⅧ小鼠的APTT显著降低，接近但仍高于正常动物水平。单次静脉注射0.25U/kg-4U/kg的RVV-X可显著缩短M-KOFVIII小鼠的APTT，且呈剂量依赖性。此外，单次静脉注射4U/kg的RVV-X缩短APTT，其效果甚至优于诺其，且将APTT降至正常水平。1U/kg的单剂量RVV-X可显著缩短M-KOFVIII血友病小鼠的APTT，与3mg/kg诺其的效果相当。
表7注射用RVV-X对M-KOFⅧ血友病小鼠APTT的影响
△在单次注射RVV-X 30分钟后测定APTT；NA，不显著；与1组比较，*表示P≤0.05；与2组比较，▲表示P≤0.05；与3组比较，□表示P≤0.05。
注射用RVV-X对M-KOFVIII血友病小鼠出血量、出血时间和断尾24h死亡率的影响
出血量和出血事件受多种因素影响，如血小板的数量和质量、毛细血管的结构和功能、血小板与毛细血管的相互作用和凝血因子。而断尾后24h死亡率受这些因素影响较小，也更接近临床评价指标，因此作为本实验的主要评价指标。
试验选用C57BL/6小鼠和M-KOFⅧ血友病小鼠。单次尾静脉注射测试药物或安慰剂，给药30min后断尾测定出血量和出血时间。然后将动物放回原笼继续饲养，第二天记录测试动物死亡率。诺其用作阳性对照。RVV-X稀释液作为安慰剂(PBO)。
如表8所示，正常小鼠断尾24h后死亡率为0％，而M-KOFⅧ血友病小鼠死亡率为66.7％。诺其给药后显著降低M-KOFⅧ血友病小鼠断尾24h死亡率，降至8.3％。单次静脉注射0.25U/kg的RVV-X已经证明有能力降低M-KOFVIII血友病小鼠的断尾24h死亡率。单次静脉注射0.25U/kg-4U/kg的RVV-X明显抑制M-KOFⅧ血友病小鼠出血倾向(数据未显示)，且24h死亡率的降低呈剂量依赖关系。此外，单次静脉注射4U/kg的RVV-X的M-KOFVIII血友病小鼠的死亡率与正常小鼠相同，为0％，该效果明显优于诺其。
表8注射用RVV-X对M-KOFⅧ血友病小鼠断尾24h死亡率的影响
注射用RVV-X不同时间点对M-KOFⅧ血友病小鼠APTT的影响
本试验考察了注射用RVV-X对M-KOFⅧ血友病小鼠凝血功能的时效关系。试验选用C57BL/6小鼠(正常对照组)和M-KOFⅧ血友病小鼠。血友病小鼠单次尾静脉注射1U/kg的RVV-X，于给药后5min、10min、30min、1h、2h、4h、6h及8h采血，8只/时间点，检测APTT。
如表9所示，与正常小鼠相比，M-KOFⅧ血友病小鼠的APTT显著增加。单次静脉注射1U/kg剂量的RVV-X，在药后5min即可明显缩短M-KOFVIII血友病小鼠APTT，作用持续至给药后2h，给药后4h基本恢复至药前水平，具有明显的时效关系。
表9注射用RVV-X不同时间点对M-KOFⅧ血友病小鼠APTT的影响
注：*表示与C57BL/6药前组相比p<0.05；#表示与血友病小鼠药前组相比p<0.05。
基于以上体内药效试验，在M-KOFVIII血友病小鼠中单次静脉注射RVV-X可显著缩短APTT，在0.1U/kg剂量下即有缩短APTT的趋势，在0.25～4U/kg的剂量范围内以剂量依赖性的方式显著缩短血友病小鼠的APTT，且可抑制出血倾向，降低断尾后死亡率。时效研究表明，静脉注射1U/kg的RVV-X，给药后5min-2h可明显缩短血友病小鼠APTT，给药后4h基本恢复至给药前水平。
对M-KOFⅧ血友病小鼠反复静脉注射RVV-X，每天5U/kg剂量，连续4周的毒理学研究显示，除注射部位形成局部血栓外，无其他全身毒性反应。因此，小鼠的安全剂量确定为5U/kg。
实施例4：手术患者多剂量注射用FX激活剂的I期临床研究
在手术患者中进行FX激活剂RVV-X多次给药的安全性和耐受性研究。选择二、三类手术患者入组研究，并分为几个剂量组。共给药2次：一次在手术前10-15分钟，一次在手术中(第一次给药后1.5小时)，通过静脉注射给药。术后观察3天，然后完成研究。
试验共入组18名受试者，包括6名男性和12名女性，其中2名患者接受普通外科手术，5名患者接受泌尿外科手术，11名患者接受妇科手术。
试验期间共发生9例(13例次)不良事件，均为轻度，包括7例次白细胞增加、1例次红细胞减少、1例次血红蛋白降低、1例次凝血功能国际标准化比值(INR)增加、1例次凝血功能凝血酶原时间(PT)延长、1例次皮疹、1例次左上肺结节阴影。其中，PT延长和皮疹可能与研究药物有关，其他均与研究药物无关。除左上肺结节阴影外，所有其他不良事件在试验结束时均恢复正常。试验期间未发生严重不良事件(SAE)。未发生导致试验终止的不良事件。
因此，手术患者对注射用FX激活剂的所有剂量均具有良好的耐受性。
还对多次注射FX激活剂RVV-X的手术患者进行了疗效研究。数十名手术患者入组研究，并通过静脉注射施用RVV-X。术后进行观察。
RVV-X在手术患者中显示出治疗效果(数据未显示)。
实施例5：制备凝血因子X激活剂注射粉剂
凝血因子X(FX)激活剂原液取自圆斑蝰蛇的毒液，经CN109943554A(其内容通过整体引用并入本文)中实施例6的方法制备获得，其余辅料除非特别说明，均为注射级别。
按照表10中的处方称取处方量的稳定剂、缓冲剂、赋形剂、表面活性剂、抗氧剂、二价钙盐，加入适量注射用水搅拌至完全溶解(当表面活性剂为液体时，可先溶解其他组分，再加入液体表面活性剂搅拌均匀)，加入处方量FX激活剂原液，用HCl或NaOH调pH，最后加注射用水定容至刻度，混合均匀后，经0.22μM滤膜过滤至无菌容器中，制备成半成品溶液。
表10FX激活剂制剂处方1-10
根据表10制备FX激活剂制剂1-10(制剂1作为对照组)，按0.53±0.03ml/瓶分装至中硼硅玻璃注射剂瓶中，半压塞，经冷冻干燥，即得FX激活剂注射粉剂(以下简称“FX激活剂制剂1-10注射粉剂”)。
实施例6：凝血因子X激活剂制剂性能测试
I)外观、水分、复溶时间、pH、生物学活性检测
对FX激活剂制剂1-10注射粉剂的外观、水分含量、复溶时间、pH值和生物学活性进行检测，生物学活性采用凝血仪进行检测，结果如表11所示。
表11FX激活剂制剂1-10的检测结果
为更直观描述外观，将外观分为以下4个等级。1级：细腻、饱满、白色疏松体。2级：轻微萎缩，表面略显粗糙，有颗粒物，轻微离壁。3级：中度萎缩，离壁，块状物稍微缩小。4级：严重萎缩，块状物明显缩小，严重离壁。
如表11所示，检测的制剂的外观、水分含量、复溶时间、pH值、生物学活性均符合相应的产品标准。除制剂3外，其他注射粉剂制剂的外观均为细腻、饱满、白色疏松体，加2ml复溶剂后均迅速溶解为无色澄明液体。由于制剂3注射粉剂海藻糖用量较高，甘露醇用量较少，其外观发生轻微萎缩，水分接近3.0％，复溶时间略微长于其他制剂，但均在30s内，溶解后均为无色澄明液体。所有制剂冻干前后pH值及生物活性无明显差异。
II)高温、高湿、光照条件下稳定性试验
由于制剂在储藏过程中会遇到偏离预设条件的情况，因此，我们利用影响因素试验考察样品在短期内暴露于高温(40±2℃)、高湿(2-8℃，RH 92.5％±5％)及光照(2-8℃，4500±500LX)条件下，对样品关键指标的影响。试验结果如表12、表13所示。
表12影响因素条件下部分指标
如表12所示，在高温条件下，随着储存时间延长，所有制剂均符合相应的产品标准。制剂3和10的外观出现萎缩趋势，复溶时间略微延长。在其他测试条件下，制剂2、4-9与0天相比，外观、水分、pH无明显变化。特别是制剂2、4、6和8在外观上始终维持在1级状态。
表13影响因素条件下的生物活性(％；与标示量相比)
如表13所示，制剂3、4、10在高温或光照14天后，活性略有降低，降低率在3.41％-9.45％之间，但仍优于对照组(制剂1)。制剂2、5-9在影响因素条件下活性基本保持稳定，在高温或光照14天后活性降低率仅低于1.60％。对照组(制剂1)与本发明的技术方案(制剂2-10)相比，FX激活剂的生物活性明显降低。该结果表明，在高温和光照条件下，人血白蛋白(HSA)对活性成分(FX激活剂)的稳定和保护作用不足，而本发明的技术方案则能够提供更加有效的稳定和保护作用。
上述结果表明，本发明的技术方案在高温、高湿及光照的条件下，均能够显著且有效地稳定和保护凝血因子X激活剂的活性。
III)加速及长期稳定性试验
对所有制剂进行稳定性研究，以考察生物学活性及不溶性微粒变化情况。
1)生物活性检测
将制剂1-10置于加速(25±2℃、RH 65±5％)及长期储存(2-8℃)条件下进行稳定性考察，检测生物学活性变化情况。结果如表14所示。
表14加速及长期储存条件下的生物学活性(％；与标示量相比)
生物学活性检测结果表明，在加速或长期储存6个月后，根据本发明的技术方案配制的冻干的制剂(制剂2-10)，其稳定性均明显优于对照组(制剂1)，特别是制剂2、5-9在加速或长期储存6个月后活性降低率低于1.60％或0.80％。上述结果表明本发明的技术方案可以使FX激活剂在加速及长期储存条件下更加稳定。
2)不溶性微粒检测
由于人体毛细血管的直径为7-12μm，静脉给药过程中，不溶性微粒可能会造成血管栓塞、诱发静脉炎、肉芽肿、肺动脉高压及热原样反应，对于静脉给药的药物，应避免和减少不溶性微粒的含量。因此，在相关药物制备过程中需要对不溶性微粒进行检测。
不溶性微粒主要来源于药物的生产过程、配伍过程及给药过程。另外，蛋白质药物在搅拌、冻干及储存过程中也可能产生不溶性微粒。
本发明采用8000亚可见微粒成像分析系统，通过电子成像系统拍摄动态流经流通池的微粒，再通过软件对不溶性微粒的大小、形态、折光性等参数进行分析，进而对所有图像进行区分，如蛋白颗粒、硅油、气泡、纤维等。微粒粒径的可检测范围为2-100μm。
所有注射粉剂制剂于0月、加速6个月后用2ml生理盐水溶解后，根据《中国药典》2015版四部通则0903中不溶性微粒检查方法检测不溶性微粒情况，结果如表15和表16所示(表中数据已扣除背景微粒)。
表15 0月不溶性微粒结果
如表15所示，各冻干制剂样品中不溶性微粒的数量均符合药典要求，但对照样品(制剂1)中各粒径的不溶性微粒的数量均明显高于其他冻干的制剂。本发明的冻干的制剂中的不溶性微粒数量均处于较低水平，尤其是制剂2、5-10，其不溶性微粒总数甚至低于260个。这些结果表明本发明的制剂方案能够显著减少不溶性微粒。也可参见附图5。
表16加速6个月不溶性微粒结果
如表16所示，加速储存6个月后，对照样品(制剂1)中不溶性微粒明显增加，其中以粒径2-10μm范围的微粒数量最多，如附图6所示。可能是由于制剂中添加的人血白蛋白在自身储存过程中发生了部分聚集，从而造成不溶性微粒含量升高。虽然对照样品中不溶性微粒的数量仍在合格范围内，但是远高于本发明其他制剂样品中的数量。而本发明的制剂样品中的不溶性微粒总量均处于较低水平，尤其是制剂2、5-10，其不溶性微粒总量甚至低于2000个。上述结果再一次表明，相对于对照制剂，本发明的技术方案能够有效改善不溶性微粒含量，从而进一步降低不溶性微粒带来的风险，提高临床使用安全性。
综上所述，本发明采用二糖(即，蔗糖或/和海藻糖)作为稳定剂，并与氨基酸缓冲剂(即，精氨酸或/和组氨酸)组合使用，所得到的制剂不仅显著提高FX激活剂组合物产品的稳定性，还能够避免因使用白蛋白作为稳定剂引起的病毒或其他未知成分带来的潜在风险。尤其当FX激活剂的活性浓度为5U/ml-50U/ml、稳定剂的质量体积浓度为30mg/ml-50mg/ml、缓冲剂的质量体积浓度为3mg/ml-5mg/ml、表面活性剂的质量体积浓度为0.1mg/ml-0.3mg/ml、赋形剂的质量体积浓度为30mg/ml-60mg/ml、制剂的pH为6.8-7.0时，组合物的外观细腻饱满，水分含量、复溶时间、pH值、生物学活性均符合产品标准，且在高温、高湿、光照、加速及长期条件下，组合物的稳定性均保持良好。
实施例7：制剂优化试验
为进一步优化FX激活剂制剂，按照表17，参照实施例5所述的方法配制制剂，以制备浓度为10U/ml，0.5ml/瓶(即，5U/瓶)的凝血因子X激活剂半成品溶液。随后，将制备的制剂采用冻干工艺制备成注射用无菌粉剂。
表17优化FX激活剂的制剂处方
于0月、加速6个月后的样品用2ml生理盐水复溶后，根据《中国药典》2015版四部通则0903中不溶性微粒检查方法检测不溶性微粒情况，结果如表18-19所示。
表18 0月时各制剂处方中不溶性微粒的结果
表19加速6个月后各制剂处方中不溶性微粒的结果
如表18所示，各冻干制剂样品的不溶性微粒数量均符合药典要求。其中，制剂11的不溶性微粒数量最少，稳定性最优。表19说明，经6个月的加速实验，各冻干制剂中的不溶性微粒总量均处于较低水平，尤其是制剂11，其不溶性微粒总量甚至低于1000个。
实施例8：FX激活剂半成品溶液的性能测试
按照制剂11的处方，制备三批(批号20160306、20160307、20160308)FX激活剂溶液半成品(0.5ml/瓶；未冻干)，随后进行长期稳定性研究(-70℃以下，24个月)、加速稳定性研究(2～8℃，6个月)及冻融稳定性研究(冻融5次，-70℃/2～8℃)，检测指标包括蛋白质含量、生物学活性(相对于标示量)、pH值和纯度(SEC-HPLC法)。
I.长期稳定性研究
将三批FX激活剂溶液半成品在-70℃条件下储存24个月，分别在第3、6、9、12、18及24个月进行取样并检测。
表20半成品溶液的长期稳定性结果
检测结果如表20所示：三批半成品溶液在-70℃条件下储存24个月后，相比于0月时，蛋白质含量变化为0.01mg/ml～0.03mg/ml，生物学活性变化为-0.4％～-0.7％，pH值变化为0.08～0.19，SEC-HPLC法检测的纯度变化为-0.6％～0.2％。这些结果表明，半成品溶液的各检测指标变化小或基本无变化(制剂处方11)，均在可接受标准范围内。
综上，凝血因子X激活剂溶液半成品在-70℃保存24个月各检测指标无差异，且批间一致性较高，制剂稳定性良好
II.加速稳定性试验
将上述三批FX激活剂溶液半成品置于2～8℃条件下，分别在第1个月、2个月、3个月与6个月取样并检测。
表21半成品溶液的加速稳定性结果
检测结果见表21，三批半成品溶液在2～8℃储存6个月后，相对于0月时，蛋白质含量几乎无变化，生物学活性变化为-0.1％～-0.6％，pH变化为-0.1～0.09，SEC-HPLC法检测的纯度变化为0.7％～0.8％。这些结果表明，在半成品FX激活剂溶液(制剂处方11)中，各检测指标变化较小甚至无变化，均在可接受标准范围内。
综上，凝血因子X激活剂溶液半成品在2～8℃条件下储存6个月，各检测指标变化较小甚至几乎无变化，半成品制剂稳定性良好。
III.冻融稳定性试验
将上述三批凝血因子X激活剂溶液半成品反复冻融(在-70℃冷冻24h，在2～8℃条件下复融)1次、2次、3次、4次、5次，分别取样并检测。经5次冻融后，相对于未冻融时，三批溶液半成品的蛋白质含量几乎无变化，生物学活性变化为-0.5％～-0.7％，pH变化为0.02-0.11，SEC-HPLC法检测的纯度变化为0.5％～0.8％。这些结果表明，在半成品FX激活剂溶液(制剂处方11)中，各检测指标变化较小甚至无变化，均在可接受标准范围内。
综上所述，在反复冻融5次时(在-70℃冷冻24h，在2～8℃条件下复融)，凝血因子X激活剂溶液半成品(制剂处方11：未冻干)均能保持稳定。
实施例9：凝血因子X激活剂制剂成品的稳定性研究
按照制剂处方11制备三批(批号：201606008、201606009、201606010)注射用凝血因子X激活剂半成品(规格为0.5ml/瓶)，冷冻干燥后制得成品。对上述成品分别进行长期稳定性研究(2～8℃，48个月)、加速稳定性研究(25℃±2℃，6个月)。检测产品外观、不溶性微粒、pH值、渗透压、水分含量和生物学活性(相对于标示量，％)等指标。
I.FX激活剂制剂成品的长期稳定性试验
上述三批注射用冻干的FX激活剂制剂成品在2～8℃条件下储存30个月，分别在9、18、30个月取样并检测。
表22三批成品的长期稳定性试验结果
制剂成品在2～8℃条件下储存30个月后，其产品外观、不溶性微粒均符合标准。如表22中所示，放置30个月后，相对于0月时，pH值变化为0.10-0.20，水分含量变化为-0.4％～-0.8％，生物学活性变化为-0.5％～-2.3％。这些结果表明，FX激活剂制剂成品在2～8℃条件下储存30个月后，各检测指标变化较小，且均在可接受标准范围内。
综上，凝血因子X激活剂制剂成品(冻干)在2～8℃条件下储存30个月，稳定性良好。
II.FX激活剂制剂成品的加速稳定性研究
上述三批凝血因子X激活剂制剂成品在25℃±2℃条件下储存6个月，分别在0、1、2、3、6个月取样并检测。
表23三批成品的加速稳定性试验结果
三批制剂成品(冻干)在25℃±2℃条件下加速6个月后，产品外观及不溶性微粒均符合标准。如表23所示：制剂成品在加速条件下(25℃±2℃)储存6个月后，相对于0月时，水分含量变化为-0.3％～-0.6％、pH值变化为0～0.1，生物学活性变化为-0.3％～-1.0％。这些结果表明，FX激活剂制剂成品在25℃±2℃条件下加速6个月后，各检测指标变化较小甚至无变化，各指标均在可接受标准范围内。
综上，凝血因子X激活剂制剂成品(冻干)在室温25℃±2℃条件下保存6个月内，稳定性良好。
实施例10：FX激活剂冻干制剂的配伍稳定性试验
本发明的产品(FX激活剂制剂)冻干后为注射用无菌粉末。该剂型的产品在使用前需使用适量的溶媒溶解后静脉注射给药。为研究溶剂的配伍稳定性及其对蛋白质稳定性的影响，根据临床上常用的配伍用药方法，选择灭菌注射用水、0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液作为溶媒。在起始及终点时间点(保质期或报告时间)检测制剂的稳定性，以研究配伍稳定性，从而为临床用药提供依据。
制剂处方6和制剂处方11的冻干成品作为示例性制剂，分别用2ml灭菌注射用水、0.9％氯化钠注射液、5％葡萄糖注射液复溶，轻轻摇匀，得均匀溶液。将复溶的制剂6和制剂11溶液于室温条件下(25℃)放置0、2、4、6、8h，记录溶液的外观，记录pH、渗透压、活性、不溶性颗粒、内毒素、生物活性(相对于标示量)和无菌情况。
表24制剂处方6的配伍稳定性试验结果
表25制剂处方11的配伍稳定性试验结果
如表24和表25所示，使用3种不同的溶媒复溶并在室温放置8h后，复溶的制剂6和制剂11的外观均为无色澄明液体，pH未发生明显变化。用2ml 0.9％氯化钠注射液复溶的制剂11用于实施例1、2、4中的给药。
人体血浆正常渗透压为280～320mOsm/kg，用2ml注射用水复溶的制剂6的渗透压约为85mOsm/kg，用2ml注射用水复溶的制剂11的渗透压约为100mOsm/kg，均低于人血浆正常渗透压。用2ml 0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液复溶制剂6和制剂11后，制剂样品溶液渗透压均在360～400mOsm/kg之间，高于人血浆正常渗透压。虽然3种溶媒复溶后的溶液均非等渗，但因本品为静脉注射，给药体积小，且人体血浆有一定的缓冲能力，因此，本发明的FX激活剂制剂给药后不会对血浆渗透压带来不利影响。
关于FX激活剂活性的稳定性，用2ml 0.9％氯化钠注射液复溶制剂6和制剂11，室温下放置8小时后，FX激活剂的生物活性保持稳定。用2ml注射用无菌水或5％葡萄糖注射液复溶制剂6，室温放置4小时后，FX激活剂活性基本稳定。用2ml注射用无菌水或5％葡萄糖注射液复溶制剂11，室温放置6小时后，FX激活剂活性基本稳定。
对于FX激活剂制剂在冻干前后的稳定性及配伍稳定性研究表明制剂11稳定性良好。将该制剂按照1.0ml/瓶，生物学活性分别为5U/ml、50U/ml、10U/ml、100U/ml(即5U/瓶、50U/瓶、10U/瓶、100U/瓶4种规格)进行配制。研究上述规格的制剂在各种影响因素条件下的稳定性。结果表明，在各种条件下，上述规格的制剂(仅RVV-X含量不同，其余组分含量并未变化)在水分、pH、渗透压及生物学活性等关键指标上均能保持相对稳定，表明制剂11对制备不同规格的RVV-X均具有良好的稳定作用(结果未显示)。
虽然本发明已经通过上述的一般描述、具体实施方法和实施例进行了详细的描述，但本领域技术人员基于本发明可以在本发明的范围内，不偏离本发明的主要目的进行修改和改进，这些修改或改进也属于本发明的保护范围。

Claims (123)

1.一种药物组合物，包含：
i)凝血因子X激活剂(FX激活剂)，其含量为0.1U/mL至200U/mL；
ii)稳定剂，其含量为2mg/ml至100mg/ml；
iii)缓冲剂，其含量为0.1mg/ml至50mg/ml；
iv)表面活性剂，其含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)；以及
v)赋形剂，其含量为1mg/ml至100mg/ml；
其中，所述药物组合物的pH值为6.0至8.0。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述FX激活剂是RVV-X。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述RVV-X是从圆斑蝰蛇(Daboiarussellii siamensis)的蛇毒中分离得到的。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的药物组合物，其中药物组合物中所述RVV-X的纯度至少为95％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中所述FX激活剂的含量为1U/mL至100U/mL。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中所述FX激活剂的含量为5U/mL至100U/mL。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其中所述FX激活剂的含量为5U/mL至50U/mL。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的药物组合物，其中所述FX激活剂的含量为10U/mL。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂包含蔗糖和海藻糖中的一种或两种。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂是蔗糖。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的含量为2mg/ml至60mg/ml。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的含量为15mg/ml至60mg/ml。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的含量为30mg/ml至50mg/ml。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其中所述稳定剂的含量为30mg/ml。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂包含组氨酸和精氨酸中的一种或两种。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂是组氨酸。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的含量为2mg/ml至20mg/ml。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的含量为2mg/ml至15mg/ml。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的含量为3mg/ml至5mg/ml。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的含量为3mg/ml。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一种或两种。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一种或多种。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的含量为0.005％(w/v)至0.05％(w/v)。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的含量为0.01％(w/v)至0.05％(w/v)。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的含量为0.02％(w/v)。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的药物组合物，其中所述赋形剂是甘露醇。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的药物组合物，其中所述赋形剂的含量为10mg/ml至60mg/ml。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的药物组合物，其中所述赋形剂的含量为30mg/ml至60mg/ml。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的药物组合物，其中所述赋形剂的含量为40mg/ml。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH值为6.3至7.3。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH值为6.8至7.0。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH值为6.85。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含抗氧化剂。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。
37.根据权利要求35或36所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂的含量为0.01mg/ml至1mg/ml。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的药物组合物，其中所述抗氧化剂的含量为0.05mg/ml至1mg/ml。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含钙盐。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中所述钙盐是氯化钙。
41.根据权利要求39或40所述的药物组合物，其中所述钙盐的含量为0.01mg/ml至10mg/ml。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物包含：
i)RVV-X，其含量为10U/mL；
ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；
iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；
iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及
v)甘露醇，其含量为40mg/ml；
其中，所述药物组合物的pH值为6.85。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物是冻干的。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物是无菌的。
45.根据权利要求43或44所述的药物组合物，所述药物组合物在如下条件下是稳定的：
i)复溶后，置于25℃至少4小时；
ii)置于2-8℃至少3个月；和/或
iii)置于25℃加速稳定条件下至少3个月。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物在25℃加速稳定条件下储存6个月后再进行复溶，其包含少于5％的直径大于10μm的不溶性颗粒。
47.根据权利要求2-46中任一项所述的药物组合物，其中所述RVV-X包含：
a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；
b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；或
c)a)和b)的混合物。
48.权利要求1-47中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗个体出血性疾病的药物中的用途。
49.FX激活在制备用于治疗个体出血性疾病的药物中的用途，其中所述FX激活的给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg。
50.根据权利要求49所述的用途，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.08U/kg至0.48U/kg。
51.根据权利要求49所述的用途，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.01U/kg至0.16U/kg。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.08U/kg至0.16U/kg。
53.根据权利要求49-52中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.16U/kg。
54.根据权利要求49-53中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂的给药次数为1次。
55.根据权利要求49-53中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂最多给药6次。
56.根据权利要求49-53和55中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂的给药次数为4次。
57.根据权利要求49-53、55和56中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂的给药间隔为每4小时(q4h)至每8小时(q8h)给药1次。
58.根据权利要求49-53和55-57中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂的给药间隔为q4h。
59.根据权利要求49所述的用途，其中所述FX激活剂的单次给药剂量为0.01U/kg至0.48U/kg。
60.根据权利要求49所述的用途，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.16U/kg q4h，最多给药6次。
61.根据权利要求49或60所述的用途，其中所述FX激活剂的给药剂量为0.16U/kg q4h，给药4次。
62.根据权利要求49-61中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂是RVV-X。
63.根据权利要求61或62所述的用途，其中所述RVV-X是从圆斑蝰蛇(Daboiarussellii siamensis)的蛇毒中分离得到的。
64.根据权利要求63所述的用途，其中所述RVV-X的纯度至少为95％。
65.根据权利要求49-64中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂包含在药物组合物中。
66.根据权利要求65所述的用途，其中所述FX激活剂在药物组合物中的浓度为0.1U/mL至200U/mL。
67.根据权利要求65或66所述的用途，其中所述FX激活剂在药物组合物中的浓度为1U/mL至100U/mL。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂在药物组合物中的浓度为5U/mL至100U/mL。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂在药物组合物中的浓度为5U/mL至50U/mL。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂在药物组合物中的浓度为10U/mL。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的用途，其中所述药物组合物进一步包含稳定剂、缓冲剂、表面活性剂和赋形剂中的一种或多种。
72.根据权利要求71所述的用途，其中所述稳定剂包含蔗糖和海藻糖中的一种或两种。
73.根据权利要求71或72所述的用途，其中所述稳定剂是蔗糖。
74.根据权利要求71-73中任一项所述的用途，其中所述稳定剂的含量为2mg/ml至100mg/ml。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的用途，其中所述稳定剂的含量为2mg/ml至60mg/ml。
76.根据权利要求71-75中任一项所述的用途，其中所述稳定剂的含量为15mg/ml至60mg/ml。
77.根据权利要求71-76中任一项所述的用途，其中所述稳定剂的含量为30mg/ml至50mg/ml。
78.根据权利要求71-77中任一项所述的用途，其中所述稳定剂的含量为30mg/ml。
79.根据权利要求71-78中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂包含组氨酸和精氨酸中的一种或两种。
80.根据权利要求71-79中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂是组氨酸。
81.根据权利要求71-80中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂的含量为0.1mg/ml至50mg/ml。
82.根据权利要求71-81中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂的含量为2mg/ml至20mg/ml。
83.根据权利要求71-82中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂的含量为2mg/ml至15mg/ml。
84.根据权利要求71-83中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂的含量为3mg/ml至5mg/ml。
85.根据权利要求71-84中任一项所述的用途，其中所述缓冲剂的含量为3mg/ml。
86.根据权利要求71-85中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂包含聚山梨醇酯和泊洛沙姆中的一种或两种。
87.根据权利要求71-86中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆188中的一种或多种。
88.根据权利要求71-87中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯20。
89.根据权利要求71-88中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂的含量为0.001％(w/v)至0.1％(w/v)。
90.根据权利要求71-89中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂的含量为0.005％(w/v)至0.05％(w/v)。
91.根据权利要求71-90中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂的含量为0.01％(w/v)至0.05％(w/v)。
92.根据权利要求71-91中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂的含量为0.01％(w/v)至0.03％(w/v)。
93.根据权利要求71-92中任一项所述的用途，其中所述表面活性剂的含量为0.02％(w/v)。
94.根据权利要求71-93中任一项所述的用途，其中所述赋形剂是甘露醇。
95.根据权利要求71-94中任一项所述的用途，其中所述赋形剂的含量为1mg/ml至100mg/ml。
96.根据权利要求71-95中任一项所述的用途，其中所述赋形剂的含量为10mg/ml至60mg/ml。
97.根据权利要求71-96中任一项所述的用途，其中所述赋形剂的含量为30mg/ml至60mg/ml。
98.根据权利要求71-97中任一项所述的用途，其中所述赋形剂的含量为40mg/ml。
99.根据权利要求65-98中任一项所述的用途，其中所述药物组合物的pH值为6.0至8.0。
100.根据权利要求65-99中任一项所述的用途，其中所述药物组合物的pH值为6.3至7.3。
101.根据权利要求65-100中任一项所述的用途，其中所述药物组合物的pH值为6.8至7.0。
102.根据权利要求65-101中任一项所述的用途，其中所述药物组合物的pH值为6.85。
103.根据权利要求65-102中任一项所述的用途，其中所述药物组合物进一步包含抗氧化剂。
104.根据权利要求103所述的用途，其中所述抗氧化剂是甲硫氨酸。
105.根据权利要求103或104所述的用途，其中所述抗氧化剂的含量为0.01mg/ml至1mg/ml。
106.根据权利要求103-105中任一项所述的用途，其中所述抗氧化剂的含量为0.05mg/ml至1mg/ml。
107.根据权利要求65-106中任一项所述的用途，其中所述药物组合物进一步包含钙盐。
108.根据权利要求107所述的用途，其中所述钙盐是氯化钙。
109.根据权利要求107或108所述的用途，其中所述钙盐的含量为0.01mg/ml至10mg/ml。
110.根据权利要求65-109中任一项所述的用途，其中所述药物组合物包含：
i)RVV-X，其含量为10U/mL；
ii)蔗糖，其含量为30mg/ml；
iii)组氨酸，其含量为3mg/ml；
iv)聚山梨醇酯20，其含量为0.02％(w/v)；以及
v)甘露醇，其含量为40mg/ml；
其中，所述药物组合物的pH值为6.85。
111.根据权利要求65-110中任一项所述的用途，所述药物组合物是冻干的。
112.根据权利要求65-111中任一项所述的用途，所述药物组合物是无菌的。
113.根据权利要求111或112所述的用途，所述药物组合物在如下条件下是稳定的：
i)复溶后，置于25℃至少4小时；
ii)置于2-8℃至少3个月；和/或
iii)置于25℃加速稳定条件下至少3个月。
114.根据权利要求111-113中任一项所述的用途，其中所述药物组合物在25℃加速稳定条件下储存6个月后再进行复溶，其包含少于5％的直径大于10μm的不溶性颗粒。
115.根据权利要求49-114中任一项所述的用途，其中所述FX激活剂通过静脉给药。
116.根据权利要求48-115中任一项所述的用途，其中所述出血性疾病是先天性出血性疾病或获得性出血性疾病。
117.根据权利要求48-116中任一项所述的用途，其中所述出血性疾病选自由因缺乏凝血因子引起的疾病、因存在获得性凝血因子抑制物引起的疾病、血液疾病、出血性疾病、血管性血友病、因施用维生素K拮抗剂进行抗凝治疗引起的疾病、遗传性血小板疾病、维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症、γ-羧化酶缺乏症、与创伤或损伤或外科相关的出血、血栓、血小板减少症、脑卒中、凝血功能障碍、弥散性血管内凝血(DIC)、Bernard-Soulier综合征、格兰兹曼血栓形成症和储存池缺乏症组成的组中。
118.根据权利要求48-117中任一项所述的用途，其中所述出血性疾病是由于缺乏凝血因子。
119.根据权利要求48-118中任一项所述的用途，其中所述出血性疾病是血友病。
120.根据权利要求48-119中任一项所述的用途，其中所述血友病是血友病A或血友病B。
121.根据权利要求119或120所述的用途，其中所述血友病是伴抑制物血友病。
122.根据权利要求48-121中任一项所述的用途，其中所述个体是人类。
123.根据权利要求62-122中任一项所述的用途，其中所述RVV-X包含：
a)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:2，或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；
b)i)重链，其包含序列SEQ ID NO:1，或与SEQ ID NO:1具有至少80％序列同一性的序列；ii)轻链1，其包含序列SEQ ID NO:5，或与SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性的序列；以及iii)轻链2，其包含序列SEQ ID NO:3，或与SEQ ID NO:3具有至少80％序列同一性的序列；或
c)a)和b)的混合物。
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