CN119698297A - 改进的聚糖依赖性嵌合抗原受体细胞 - Google Patents

Abstract

提供了用于治疗与细胞表面分子的异常糖基化和肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)表达相关的疾病的组合物和方法。还提供了对肿瘤相关碳水化合物抗原具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)(TACA‑CAR)、编码所述TACA‑CAR的载体，以及包含所述TACA CAR的重组细胞。

Description

改进的聚糖依赖性嵌合抗原受体细胞

相关申请的交叉引用

本申请要求2022年6月13日提交的美国临时专利申请号63/351,746的优先权权益，所述申请出于任何和所有目的特此通过引用整体并入。

关于联邦资助的研究或开发的声明

本发明是在由美国国家卫生研究院/国家癌症研究院颁发的U01CA233078、R41CA233111和R41CA261408号拨款下借助政府资助进行的。政府对本发明具有一定权利。

技术领域

本公开总体上涉及药理学和免疫学领域，并且具体涉及靶向肿瘤相关碳水化合物抗原的双特异性融合蛋白和嵌合抗原受体(TACA-CAR)以及表达TACA-CAR的免疫细胞用于治疗与细胞表面分子的异常糖基化相关的疾病的用于，以及预防或逆转TACA CAR T耗竭的方法。

背景技术

抗原靶向癌症免疫疗法，诸如双特异性抗体(例如，双特异性T细胞衔接器)或嵌合抗原受体T细胞(表达例如嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞)，是已知的最有效的免疫疗法。两者都触发T细胞介导的癌细胞杀伤，在复发性/难治性B细胞恶性肿瘤中，CAR T细胞的完全反应率高达约90％。两者都利用来源于单克隆抗体的可变重链和轻链的单链可变片段(scFv)来靶向癌症中表达的抗原。在双特异性抗体中，抗原特异性scFv与对CD3具有特异性的第二scFv融合，而在CAR中，抗原特异性scFv与来源于免疫细胞受体的跨膜结构域和一个或多个细胞质信号传导结构域融合。两种类型的嵌合分子都在T细胞中遗传表达。两种疗法目前均已获批用于治疗CD19⁺B细胞恶性肿瘤。为了将双特异性蛋白和/或CAR T细胞应用于多种癌症类型，必须首先鉴定出可以安全靶向的细胞表面癌症抗原。这是一个重大挑战，特别是对于实体癌症。解决所有这些问题的一个潜在方法是靶向在许多不同癌症类型中过表达并且在转移性和侵袭性癌症中甚至更高的‘肿瘤相关碳水化合物抗原’(TACA)。碳水化合物(聚糖)以及糖蛋白和糖脂是主要的细胞表面组分。因此，已经生成了免疫治疗双特异性蛋白和/或嵌合抗原受体(CAR)T细胞，它们利用来源于凝集素的肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)结合结构域来靶向细胞，从而被T细胞而不是抗体杀死。这项新技术被称为“聚糖依赖性T细胞募集”或GlyTR(发音为‘glitter’)。

然而，与许多有用的治疗方法和需要表达嵌合抗原受体的工程化细胞(例如，系统免疫细胞或干细胞)的传统免疫疗法一样，存在与持续的(例如，不受调控的)嵌合抗原受体信号传导相关的显著风险。CAR T细胞的早期耗竭会限制CAR T细胞的功效。T细胞耗竭的根本原因是持续的抗原暴露导致连续的TCR信号传导。T细胞耗竭的特征在于代谢功能、转录编程发生显著变化、效应功能(例如，细胞因子分泌、杀伤能力)丧失以及多种表面抑制受体共同表达。因此，不受调控的信号传导可通过增强工程化免疫细胞对耗竭的敏感性来降低CAR T细胞的效力。

因此，需要高效且不易受耗竭影响(例如，CAR介导的T细胞耗竭)的CAR-T细胞来靶向多种常见癌症中存在的抗原。本公开满足了这个未满足的需求。

发明内容

本公开的一个方面提供了一种修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中：(a)CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；和/或细胞内信号传导结构域；以及(b)修饰的细胞不太容易受到TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD；碳水化合物结合结构域)中包含突变，所述突变选自取代、缺失或插入。在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含缺失。在一些实施方案中，缺失位于TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。

在一些实施方案中，缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。在一些实施方案中，缺失为至少约10个氨基酸、至少约18个氨基酸、或至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，缺失为至少约36个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且其中所述缺失：(a)位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸；(b)位于C末端并且为至少约10个氨基酸；(c)位于TBD的N末端并且为至少约36个氨基酸；或者(d)位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸并且位于C末端并且为至少约10个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含缺失，所述缺失去除TACA结合结构域(TBD)中的二硫键键合的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的表达与包含野生型TBD的CAR的表达相似。

在一些实施方案中，(a)与包含有包含野生型TACA结合结构域(TBD)的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TBD中的缺失的CAR的修饰的细胞表现出降低的强直性信号传导；(b)与包含有包含野生型TACA结合结构域(TBD)的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TBD中的缺失的CAR的修饰的细胞不太容易经历耗竭；或(c)与包含有包含野生型TACA结合结构域(TBD)的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TBD中的缺失的CAR的修饰的细胞不太容易经历由强直性信号传导TACA CAR诱导的耗竭。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，TACA结合结构域来源于凝集素。在一些实施方案中，凝集素选自：半乳糖凝集素、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglec)、选择素(selectin)；C型凝集素；CD301、多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)、L-PHA(菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素)；E-PHA(菜豆红细胞凝集素)；番茄凝集素(tomato lectin)(番茄凝集素(Lycopersicon esculentum lec tin)；LEA)；花生凝集素(peanut lectin)(花生凝集素(Arachis hypogae a Agglutinin)；PNA)；马铃薯凝集素(potato lectin)(马铃薯凝集素(Solanum tuberosum lectin))、美洲商陆丝裂原(pokeweed mitogen)(美洲商陆凝集素(Phytolacca American lectin))、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)(麦胚凝集素(Triticum Vulgaris lectin))；木菠萝凝集素(Artocarpus polyphemus lectin)(木菠萝凝集素((Jacalin letin)))；野豌豆(Viciavillosa)凝集素(VVA)；蜗牛(Helix pomatia)凝集素(HPA)；多花紫藤(Wisteriafloribunda)凝集素(WFA)；接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)、BC2L-CNt(来自革兰氏阴性细菌新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cenocepacia)的凝集素)、山槐(Maackiaamurensis)白细胞凝集素(MAL)、毡毛小脆柄菇(Psathyrella velutina)凝集素(PVL)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)凝集素(SRL)、锯齿麒麟菜(Eucheuma se rra)凝集素(ESA)、CLEC17A(保护素)、橙黄网胞盘菌(Aleuria auranti a)凝集素、无梗接骨木(Sambucus sieboldiana)凝集素(SSA)、金钱薄荷(Glechoma hederacea)凝集素(Gleheda)、黑桑(Morus nigra)凝集素(Mo rniga G)、南欧丹参(Salvia sclarea)凝集素、Salvia bogotensis凝集素、蝶花鼠尾草(Salvia horminum)凝集素、海州常山(Clerodendrum tricho tomum)凝集素、贝壳花(Moluccella laevis)凝集素、加纳籽(Griffonia simplicifolia)(GsLA4)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)(酸性WBAI)、相思子(Abrus precatorius)凝集素、尾穗苋(Amaranthus caudatus)凝集素、白果苋(Amaranthus leucocarpus)凝集素、秋蕾丽兰(Laelia autumnalis)凝集素、木菠萝(Artocarpus integrifolia)凝集素、桑橙(Mac lura pomifera)凝集素、野波罗蜜(Artocarpus lakoocha)凝集素、双花扁豆(Dolichos biflorus)凝集素、双花扁豆凝集素、大豆(Glycine max)凝集素和双孢蘑菇(Agaricus bisporus)凝集素。

在一些实施方案中，凝集素为：(i)选自由以下组成的组的半乳糖凝集素：半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-2、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-5、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-9、半乳糖凝集素-10、半乳糖凝集素-11、半乳糖凝集素-12、半乳糖凝集素-13、半乳糖凝集素-14和半乳糖凝集素-15；和/或(ii)选自由以下组成的组的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(唾液酸粘附素)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-2(CD22)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-3(CD33)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-4(髓鞘相关糖蛋白)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-6、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-8、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-10、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-11、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-12、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-13、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-14、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-16、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-17、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素E、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素G和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素H。

在一些实施方案中，多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)选自由以下组成的组：ppGalNAc-T1(GALNT1)、ppGalNAc-T2(GALNT2)、ppGalNAc-T3(GALNT3)、ppGalNAc-T4(GALNT4)、ppG alNAc-T5(GALNT5)、ppGalNAc-T6(GALNT6)、ppGalNAc-T7(GA LNT7)、ppGalNAc-T8(GALNT8)、ppGalNAc-T9(GALNT9)、ppGa lNAc-T10(GALNT10)、ppGalNAc-T12(GALNT12)、ppGalNAc-T13(GALNT13)、ppGalNAc-T14(GALNT14)、ppGalNAc-T15(GALNT 15)、ppGalNAc-T16(GALNT16)、ppGalNAc-T17(GALNT17)、ppG alNAc-T18(GALNT18)、ppGalNAc-T样5(GALNTL5)和ppGalNAc-T样6(GALNTL6)。

在一些实施方案中，抗原结合结构域选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Thomsen-nouveau(Tn)表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewis^x/a、二唾液酸基-Lewis^x/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。在一些实施方案中，抗原结合结构域选择性地靶向β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、Tn表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、GalNAcα-丝氨酸、GalNAcα-苏氨酸、GalNAc或GalNAcβ1。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个TACA结合结构域。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域的碳水化合物结合结构域(CBD)中的缺失，所述TACA结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合包含与SEQ ID NO:34-39具有至少90％同源性的氨基酸序列。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，跨膜结构域包含选自由以下组成的组的分子的跨膜区：T细胞受体(TCR)-α、TCR-β、TCR-γ、TCR-δ、NKT细胞的不变TCR、CD3-ζ、CD3-ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134(Ox40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:78或SEQ IDNO:87的氨基酸序列。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，共刺激结构域是选自由以下组成的组的分子的共刺激结构域：CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其组合。在一些实施方案中，共刺激结构域包含：(i)4-1BB共刺激结构域；(ii)SEQ ID NO:58的氨基酸序列；(iii)CD28共刺激结构域；(iv)SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或(v)4-1BB和CD28共刺激结构域。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，细胞内结构域包含选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导结构域：T细胞受体(TCR)ζ、FcR-γ、FcR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε、CD3-ζ、CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域；或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，CAR进一步包含铰链结构域。在一些实施方案中，铰链结构域是选自由以下组成的组的蛋白质：CD28铰链、CD8α、抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区和人工间隔序列。在一些实施方案中，铰链结构域是：(a)CD8α铰链结构域；(b)CD28铰链；(c)包含SEQ ID NO:77或86的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含选自由SEQ ID NO:68、71-77和86组成的组的氨基酸序列。

本公开的另一个方面提供了一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：(i)SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，CAR选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewisx/a、二唾液酸基-Lewisx/a、唾液酸基6-磺基Lexisx、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。在一些实施方案中，CAR选择性地靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖、GalNAc、Tn抗原、GalNAcα-ser、GalNAc或GalNAcβ1。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比，包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞显示出降低的强直性信号传导。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。在一些实施方案中，细胞为T细胞。在一些实施方案中，细胞为自体细胞。

在本文公开的修饰的细胞的一些实施方案中，分离的核酸包含表达载体；和/或体外转录的RNA。

本公开的一个方面提供了一种在本文所述的修饰的细胞中表达的嵌合抗原受体。

本公开的另一个方面提供了一种选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其中：(a)CAR包含(i)选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个来源于凝集素的TACA结合结构域；(ii)跨膜结构域；(iii)共刺激信号传导区；以及(iv)细胞内信号传导结构域；以及(b)当引入修饰的细胞中时，表达CAR的修饰的细胞不太容易受到TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

本公开的另一个方面提供了一种选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其包含：(a)抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；(b)CD8或CD28铰链结构域；(c)CD8或CD28跨膜结构域；(d)CD28共刺激和/或4-1BB共刺激结构域；以及(e)CD3ζ细胞内信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列。

在本文公开的CAR的一些实施方案中，(a)包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比显示出降低的强直性信号传导；或(b)表达CAR的修饰的细胞，所述CAR包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ IDNO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失，所述修饰的细胞与包含有包含野生型抗原结合结构域的CAR的修饰的细胞相比不太容易受到耗竭的影响；或(c)表达CAR的修饰的细胞，所述CAR包含SEQ IDNO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失，所述修饰的细胞与包含有包含野生型抗原结合结构域的CAR的修饰的细胞相比不太容易受到与强直性信号传导TACA CAR相关的耗竭的影响。

本公开的一个方面提供了一种分离的核酸，其编码由本文所述的修饰的细胞表达的CAR或本文所述的CAR。

本公开的一个方面提供了一种表达构建体，其包含编码本文所述的CAR的分离的核酸。在一些实施方案中，表达构建体进一步包含启动子。在该实施方案中，启动子选自EF-lα启动子、T细胞受体α(TRAC)启动子、白细胞介素2(IL-2)启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine LeukemiaVirus，MoMuLV)启动子、禽白血病病毒(avian leukemia virus)启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)立即早期启动子或劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子。

在一些实施方案中，表达构建体是选自由以下组成的组的病毒载体：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，表达构建体是慢病毒载体。在一些实施方案中，表达构建体是自我灭活慢病毒载体。

本公开的一个方面提供了一种用于生成本文所述的修饰的细胞的方法，所述方法包括将本文所述的分离的核酸；本文所述的嵌合抗原受体；或本文所述的表达构建体引入细胞中。

本公开的一个方面提供了一种组合物，其包含：(a)本文所述的修饰细胞；(b)本文所述的嵌合抗原受体；(c)表达本文所述的核酸的细胞或细胞群；或(d)表达本文所述的表达构建体的细胞或细胞群。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载剂。

本公开的另一个方面提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含：(a)本文所述的修饰的细胞；(b)本文所述的嵌合抗原受体(CAR)；或(c)本文所述的组合物。

在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：血液恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤、白血病、癌、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴系统恶性肿瘤、黑色素瘤和淋巴瘤。

本公开的另一个方面提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效组合物，所述治疗有效组合物包含修饰的细胞，所述修饰的细胞包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其中所述CAR包含：(i)抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；(ii)CD8或CD28铰链结构域；(iii)CD8或CD28跨膜结构域；(iv)CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域；以及(v)CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，在不存在与强直性信号传导TACA CAR缔合的靶癌细胞的情况下，所述修饰的细胞不太容易受到耗竭和/或细胞因子产生的影响。

本公开的一个方面提供了一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本文所述的修饰的细胞群或本文所述的组合物。

附图说明

图1A-图1C示出了靶向β1,6GlcNAc-分支N-聚糖的聚糖依赖性T细胞募集器(GlyTR1)双特异性蛋白的示意图和表征。图1A示出了GlyTR1蛋白是嵌合单一多肽，其包含抗CD3单克隆抗体(CD3 scFv，OKT3克隆)的可变重链和轻链结构域，所述可变重链和轻链结构域连接至一个或多个L-PHA碳水化合物结合结构域(CRD)。L-PHA意指植物血凝素-L；H(6)意指6x-组氨酸标签。

图1B示出了GlyTR1^L-PHAxCD3和蛋白质标准品Sigma(目录号MWGF1000-1KT)的尺寸排阻色谱(SEC)分析。使用GE Superdex 200Increase3.2/300柱进行SEC分析。分子量是根据保留时间生成的趋势线来计算的。

图1C示出了使用GE HiLoad 16/600Superdex 200pg柱对GlyTR1^LPHA(2)xCD3和蛋白质标准品GE(目录号GE28-4038-42)进行的SEC分析。分子量是根据体积生成的趋势线来计算的。图1C展示GlyTR1^LPHA(2)xCD3的约50％-70％为二聚体，其余为单体(约30％-40％)或更大的多聚体(约10％-20％)。

图2A示出了用于靶向Tn抗原的各种改进的GlyTR2双特异性蛋白的示意图，所述GlyTR2双特异性蛋白包含多个碳水化合物结合结构域。GlyTR2蛋白是嵌合单一多肽，其包含抗CD3单克隆抗体(CD3 scFv，OKT3克隆)的可变重链和轻链，所述可变重链和轻链与CD301(C型凝集素结构域家族10成员A(CLEC10A))的多于一个碳水化合物结合结构域(CRD)连接。H(6)：6x-组氨酸标签。

图2B示出了色谱图，其证明了GlyTR2^CD301(3)xCD3主要由大的多聚体组成，并且具有刚性接头的GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}主要为单体。使用GE HiLoad 16/600Superdex 200pg柱，将GlyTR2^CD301(3)xCD3和GlyTR2s^{lCD301(4)xCD3}的SEC分析与蛋白质标准品GE(目录号GE28-4038-42)进行比较。分子量是根据保留体积生成的趋势线来计算的。

图3A-图3G示出了GlyTR-CAR设计和GlyTR-CAR T细胞表达以及体外和体内细胞毒性活性的示意图。

图3A示出了三种GlyTR-CAR(GlyTR1^LPHA(2)、GlyTR2^slCD301(4)和mutGlyTR2^slCD301(4))的示意图，其包含具有两个LPHA或四个CD301结构域的抗原结合结构域、CD8跨膜结构域、41BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域。mutGlyTR2^{slCD301(4)xCD3} CAR具有五个对于抗原结合结构域中的糖和钙结合至关重要的点突变(SEQ ID NO:164(NCBI RefSeq NP_878910.1)中的Gln267Gly、Asp269Gly、Glu280Gly、Asn292Gly和Asp293Gly)。

图3B示出了说明GlyTR-CAR T细胞生成的示意图。为了生成CAR T细胞，使用慢病毒转导T细胞，用Human T-Activator CD3/CD28刺激3天，然后从第4-7天静息。

图3C-图3E示出了GlyTR1^LPHA(2)或GlyTR2^slCD301(4)CAR T细胞容易地杀伤卵巢癌细胞和乳腺癌细胞。图3C示出了第3天和第7天的流式细胞术分析，表征了GlyTR-CAR的细胞大小和表面表达。

图3D-图3E示出了如图所示在GlyTR-CAR T细胞治疗后第7天的GlyTR-CAR介导的细胞死亡的定量。GlyTR-CAR T细胞以增加的比率与指定的癌细胞一起孵育，并在72小时后通过发光评估活性癌细胞。死亡％通过[1-(癌症+CAR T/癌症)*100来计算。

图3F示出了指定的GlyTR2-CAR T细胞对移植到小鼠体内的乳腺癌细胞的体内杀伤。如图3G所示，通过荧光素酶活性(光子/秒(p/s))量化肿瘤负荷。这些数据表明，与乳腺癌模型中的mutGlyTR2-CAR T细胞相比，GlyTR2-CAR T细胞诱导了明显的肿瘤消退。

图4A-图4C示出了GlyTR-CAR T细胞展示出抗原非依赖性强直性CAR信号传导。

图4A-图4B示出了与未转导(NT)的T细胞相比，存在或不存在SKOV3癌细胞(图4A)或MDS-MB-231癌细胞(图4B)的情况下的GlyTR-CAR T细胞诱导的干扰素伽马(IFNγ)产生。通过夹心ELISA测定分别来自(图3D)和(图3E)中的培养物的上清液中的IFNγ浓度。

图4C示出了图表，其说明了GlyTR-CAR T细胞在GlyTR2^slCD301(4)的高表达而非低表达下诱导强直性信号传导，并证明了GlyTR2^slCD301(4)CAR触发细胞表面CAR聚集，如4-1BB激活标志物的诱导所示。底图示出了GlyTR2^{slCD301(4)xCD3} CAR和激活标志物4-1BB的细胞表面表达的图像流分析，其中按指示对低和高CAR表达进行设门。

图5A-图5G示出了GlyTR-CAR T变体降低了强直性GlyTR-CAR T细胞信号传导，同时保持了有效的肿瘤杀伤活性。图5A示出了序列比对，其比较了GlyTR2^CD301 CAR中的CD301序列的野生型抗原结合结构域与修剪了TACA结合结构域(TBD)的N末端或C末端序列的变体。其他CAR结构域序列(诸如跨膜结构域、细胞内信号传导结构域)未显示。

图5B-图5C示出了GlyTR2^CD301-4-1BB-CD3ζCAR的示意图；对GlyTR2^CD301 CAR表面表达和激活标志物4-1BB进行图像流和流式细胞术分析，对低和高CAR表达进行设门，如上图4C所示。对于图5C，T细胞是未转导的，或使用具有指定CAR设计(全部为单个CD301结构域)的慢病毒进行转导，并用Human T-Activator CD3/CD28刺激3天，然后从第4-7天静置。示出了第3天和第7天的流式细胞术以评估CAR和4-1BB表面表达。图5D-图5E示出了第三代GlyTR2^CD301 CAR的示意图，其包含变体TACA结合结构域(TBD)、CD28和4-1BB共刺激结构域以及CD3ζ细胞内信号传导结构域，并且进一步证明，与亲本第一代GlyTR2^CD301 CAR(无CD28结构域)相比，GlyTR2^CD301-4-1BB-CD3ζCAR显著降低了癌细胞杀伤，尽管没有显著降低CAR表面表达。图5E-图5F示出了GlyTR2^CD301CAR T细胞对癌细胞的细胞毒性作用。将指定的第7天GlyTR2-CAR T细胞以增加的比例与指定的癌细胞一起孵育，并在48小时(图5E)或72小时(图5G)后通过发光评估存活的癌细胞。死亡％通过[1-(癌症+CAR T/癌症)*100来计算。图5F示出了，删除TACA结合结构域(TBD)的前36个N末端氨基酸(包括前两个二硫键键合的半胱氨酸残基)并且添加CD28信号传导结构域(即，变体181-316(SEQ ID NO:26-29和38))显著降低了强直性信号传导，如IFNγ产生所示。通过夹心ELISA测定来自(图5E)的培养物中的上清液中的IFNγ。

具体实施方式

I.概述

在同时提交的国际申请号PCT/US2023/024898(标题为“Improved Glycan-Dependent Immunotherapeutic Bi-Specific Fusion Proteins and Chimeric AntigenReceptors”)中，开发了一类新型免疫治疗双特异性融合蛋白和CAR，以有效靶向TACA以进行免疫治疗。具体而言，使用来源于凝集素而非单克隆抗体或其片段的碳水化合物识别结构域的抗原结合结构域对双特异性融合蛋白和CAR进行工程化以靶向TACA，而不考虑载体蛋白。这项新技术被称为“聚糖依赖性T细胞募集”或GlyTR(发音为‘glitter’)。一组GlyTR治疗剂是TACA双特异性融合蛋白，其包含来自凝集素的碳水化合物识别结构域，其可操作地连接至、缀合至或融合至免疫细胞识别结构域，所述免疫细胞识别结构域特异性地结合免疫效应细胞上的受体。另一组GlyTR治疗剂是嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含来源于凝集素的TACA结合结构域(即，碳水化合物识别结构域)。在所有情况下，TACA结合结构域(即，碳水化合物识别结构域)特异性地结合肿瘤细胞上表达的TACA，并且所述TACA结合结构域包含一个或多个来源于凝集素的TACA结合结构域。

该申请中公开的GlyTR代表了免疫疗法的重大改进，因为GlyTR可以靶向多种常见癌症中存在的抗原。这是因为生成TACA的改变的糖基化是癌症的普遍特征。TACA提供了已知的最丰富、最广泛的细胞表面癌症抗原，靶密度比典型的蛋白质抗原高出至多约100-1000倍。此外，TACA靶密度比典型的蛋白质抗原高出约100-1000倍。GlyTR还具有高亲合力结合，这是通过肿瘤细胞上高密度靶向表达以及工程化GlyTR存在多个碳水化合物结合结构域的组合来实现的。这种高靶密度和多个结合位点的组合增强了GlyTR对高TACA表达细胞(例如癌细胞)相对于低表达细胞(例如正常细胞)的特异性。

然而，与许多有用的需要表达嵌合抗原受体的工程化细胞(例如，系统免疫细胞或干细胞)的免疫疗法一样，存在与持续的(例如，不受调控的)嵌合抗原受体信号传导相关的显著风险。

已知许多工程化CAR T细胞可触发CAR对T细胞的抗原非依赖性作用。Long等人,Nat.Med.21:581-590(2015).CAR可以通过几种可能的机制递送抗原非依赖信号。虽然强直性CAR仍然能够以抗原依赖性方式触发细胞毒性，但CAR的抗原非依赖性信号传导对于这些嵌合抗原受体的临床使用具有重要影响。这是因为抗原非依赖性信号传导可以在CAR T细胞中驱动早期耗竭，从而限制其在体内的抗肿瘤功效。肿瘤反应性T细胞的耗竭是癌症的免疫逃避的一个明确机制。T细胞耗竭的根本原因是持续的抗原暴露导致连续的TCR信号传导。T细胞耗竭的特征在于代谢功能、转录编程发生显著变化、效应功能(例如，细胞因子分泌、杀伤能力)丧失以及多种表面抑制受体共同表达。

因此，不受调控的信号传导可通过增强工程化免疫细胞对耗竭的敏感性来降低CAR T细胞的效力。虽然导致强直性T细胞信号传导环境中的耗竭的机制很复杂且不太清楚，但CAR的结构在导致CAR T细胞容易发生慢性激活和耗竭方面发挥核心作用。

在本公开中，设计并开发了一类新型免疫治疗性TACA CAR，其不能触发抗原非依赖性强直性信号传导或表现出降低的抗原非依赖性强直性信号传导。本公开的新型CAR被设计为通过包含来源于凝集素的TACA结合结构域(即，碳水化合物识别结构域)的CAR来控制、管理或抑制抗原非依赖性强直性信号传导。具体而言，新型CAR设计包括：(1)对抗原结合结构域(即，来源于凝集素的TACA结合结构域)的序列中的突变进行工程化；和/或(2)改变跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(例如，具有或不具有共刺激信号传导结构域(诸如CD28)的41BB信号传导结构域)；和/或(3)改变抗原结合结构域中来源于凝集素的TACA结合结构域的数量和/或连接。

A.实验结果总结

本公开提供了新型GlyTR CAR，其包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；一个或多个共刺激结构域；和/或细胞内信号传导结构域。当在免疫细胞(诸如T细胞)中表达时，本公开的新型CAR不会触发强直性信号传导，并且表达本公开的CAR的修饰的免疫细胞不太容易受到TACA的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下预防或减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

与已知的CAR一样，GlyTR CAR也展示出抗原非依赖性强直CAR信号传导。例如，如图4A-图4B所示，GlyTR1^LPHA(2)-CAR T细胞和GlyTR2^slCD301(4)-CAR T细胞展示出抗原非依赖性强直性CAR信号传导。在GlyTR CAR表达水平高时，强直性信号传导效应显著，但在GlyTRCAR表达水平低时则不显著，这表明强直性信号传导是由细胞表面CAR聚集触发的(图4C)。然而，本文所述的以及在同时提交的国际申请号PCT/US2023/024898(标题为“ImprovedGlycan-Dependent Immunotherapeutic Bi-Specific Fusion Proteins and ChimericAntigen Receptors”)中公开的所有新型CAR仍然能够以抗原依赖性方式触发强烈的细胞毒性(图3A-图3G)。由于抗原非依赖性信号传导可导致CAR T细胞的早期耗竭，从而限制其在体内的抗肿瘤功效；并且由于肿瘤反应性T细胞的耗竭是癌症的免疫逃避的一个明确机制，因此本公开提供了新型且改进的GlyTR CAR，其抗原非依赖性强直信号传导减少甚至消失。从而提供改进的、不易耗竭的强效GlyTR CAR和GlyTR CAR T细胞。

如下文的实施例所示，通过对不能在质膜上多聚化或聚集的GlyTR CAR进行工程化，消除并且减少了GlyTR强直性信号传导。如图5B所示，GlyTR强直性信号传导部分是由CAR聚集引起的。因此，预防或减少GlyTR CAR T细胞耗竭的一个方面涉及对TACA结合结构域的碳水化合物识别结构域(CRD)进行诱变。例如，通过对TACA结合结构域中的一个或多个缺失进行工程化来降低强直性信号传导，所述缺失选自由以下组成的组：前36个N末端氨基酸的缺失、前18个N末端氨基酸的缺失、前两个二硫键键合的半胱氨酸残基的缺失、最后10个C末端氨基酸的缺失、以及它们的缺失的组合。具体而言，在强直性信号传导的背景下预防GlyTR耗竭的方法涉及删除TACA结合结构域的CRD中的前两个二硫键键合的半胱氨酸残基。

此外，通过以下额外的方式消除和减少GlyTR强直性信号传导。第一，向第二代GlyTR CAR中添加一个或多个共刺激结构域降低了强直性CAR信号传导。在示例性实施方案中，将CD28共信号传导结构域添加到包含4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内结构域的GlyTRCAR的细胞内结构域中以生成GlyTR–CD28-4-1BB CAR足以减少强直性信号传导。

第二，改变了包含多个TACA结合结构域(图1A和图2A)的Gly TR-CAR中分隔TACA结合结构域(例如，L-PHA结构域)的接头的长度和刚度。第三，通过阻止TACA结合结构域的二聚化来降低GlyT R-CAR强直性信号传导。例如，删除GlyTR1-CAR中两个L-PHA结构域中的一个或两个中的前五个氨基酸降低了CAR二聚化/强直性信号传导。经由删除L-PHA的前5个氨基酸来预防GlyTR1-CAR二聚化也降低对β1,6GlcNAc-分支N-聚糖的结合亲合力，这表现为相当于亲本GlyTR1^LPHAxCD3双特异性蛋白，GlyTR1^{LPHAΔ1-5xCD3}双特异性蛋白的结合/杀伤降低。参见同时提交的国际申请号PCT/US2023/024898(标题为“Improved Glycan-DependentImmunotherapeutic Bi-Specific Fusion Proteins and Chimeric AntigenReceptors”)，其通过引用整体并入。

因此，本公开提供的GlyTR–CAR在体外和体内诱导了足够的T细胞激活以最大限度地增加癌症杀伤，但不能诱导T细胞耗竭或细胞因子释放综合征。本公开进一步提供了具有增强的GlyTR结合亲合力、杀伤活性和安全性的GlyTR治疗剂。

B.TACA CAR的示例性益处

人们长期以来一直寻求预防或逆转T细胞耗竭作为增强T细胞有效性的一种方式(例如，在患有癌症或慢性感染的患者中)。CAR-T的强直性信号传导是一个常见的设计问题，并且可能有助于癌细胞杀伤，但也可能增加因T细胞过度活化而产生毒性的风险。细胞内和细胞外结构域均可驱动强直性信号传导。现有的用于在强直性信号传导系统背景下预防T细胞耗竭的技术存在动态范围有限和基础(“泄漏”)活性的问题。此外，目前在现有技术中发现的解决方案集中于改变共刺激结构域或对可调控或可诱导的CAR进行工程化(例如，向CAR或诱导型结构域添加可调控的去稳定结构域(regulatable destabilizationdomain，RDD)或蛋白酶切割位点)，这将允许对转移的免疫细胞的反应特征进行微调和优化。在GlyTR CAR T细胞的情况下，强直性信号传导可能是由细胞外结构域和细胞内结构域驱动的。因此，通过对细胞外结构域进行工程化以防止多聚化和/或通过掺入额外的(例如，一个或多个)细胞内共刺激结构域，消除/减少GlyTR CAR T细胞中的强直性信号传导。

因此，本公开提供了嵌合抗原受体(CAR)、修饰的细胞、组合物、以及用于治疗与肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)相关的病状或疾病的方法。本公开的CAR是对现有技术的改进，因为本公开的CAR设计提供了一种新型的CAR设计，其组合了工程化抗原结合结构域(即，来源于凝集素的包含碳水化合物结合结构域(CRD)中的一个或多个突变的TACA结合结构域)与(1)接头柔性，(2)分子内和分子间结合/多聚化的调节；(3)和/或改变跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。这些元素的组合为GlyTR提供了意料之外的性质，诸如能够靶向多种常见癌症上存在的抗原，触发针对多种常见癌症的强烈的细胞毒作用，同时不太容易受到强直性信号传导的影响。

本公开的一个方面提供了一种修饰的细胞，所述修饰的细胞不太容易受到强直性信号传导的影响，并且包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子。CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；刺激结构域；和/或细胞内信号传导结构域。修饰的细胞不太容易受到TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子的产生。

在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的突变，所述突变选自取代、缺失或插入。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失。在该实施方案中，缺失位于TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。在一些实施方案中，缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。

本公开的另一个方面提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域的CBD中的缺失，所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

本公开的CAR(TACA-CAR)是对现有技术的改进，因为所述CAR包含控制TACA-CAR的非抗原依赖性强直性信号传导的结构修饰。第一种结构修饰包括通过改变来源于凝集素的TACA结合结构域的数量、连接和序列来改变抗原结合结构域的结构。例如，TACA-CAR的抗原结合结构域包含一个或多个来源于凝集素的TACA结合结构域。第二种结构修饰包括改变跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域的结构。例如，本公开的TACA-CAR包含一个或多个来源于共刺激分子的细胞内结构域(例如，41BB信号传导结构域和/或CD28)。疾病或病状是例如癌症或与蛋白质糖基化改变相关的任何病症。所述癌症可以是血液恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤。

本公开的另一个方面提供了一种修饰的细胞，所述修饰的细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列；或(ii)与SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

本公开的另一个方面提供了一种嵌合抗原受体、编码所述CAR的分离的核酸和/或包含所述分离的核酸的表达构建体，其中所述CAR选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)，并且其中：(a)CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个来源于凝集素的TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号传导区；以及细胞内信号传导结构域；以及(b)当引入修饰的细胞中时，表达CAR的修饰的细胞不太容易受到TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

本公开的另一个方面提供了一种嵌合抗原受体、编码所述CAR的分离的核酸和/或包含所述分离的核酸的表达构建体，其中所述CAR选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)，所述CAR包含：(a)抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；(b)CD8或CD28铰链结构域；(c)CD8或CD28跨膜结构域；(d)CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域；以及(e)CD3ζ细胞内信号传导结构域。

本公开的另一个方面提供了一组合物，其包含本文公开的TACA-CAR；用于生成本文公开的修饰的细胞的方法；以及治疗有需要的受试者的疾病(例如，癌症)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含本文所述的修饰的细胞的组合物。

II.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然可在本公开的实践或测试中使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但描述优选的方法和材料。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且并非旨在进行限制。

除非另有说明，否则本公开的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术是本领域的技术范围内的。参见例如，Green和Sambrook编辑(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版；Ausubel等人编辑(2015)Current Protocols in Molecular Biology系列；Methods inEnzymology系列(Academic Press,Inc.,N.Y.)；MacPherson等人(2015)PCR 1:APractical Approach(Oxford University Press的IRL Press)；MacPherson等人(1995)PCR 2:A Practical Approach；McPherson等人(2006)PCR:The Basics(GarlandScience)；Harlow和Lane编辑(1999)Antibodies,A Laboratory Manual；Greenfield编辑(2014)Antibodies,A Laboratory Manual；Freshney(2010)Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique,第6版；Gait编辑(1984)Oligonucleotide Synthesis；Hames和Higgins编辑(1984)Nucleic Acid Hybridization；Anderson(1999)Nucleic AcidHybridization；Herdewijn编辑(2005)Oligonucleotide Synthesis:Methods andApplications；Hames和Higgins编辑(1984)Transcription and Translation；Buzdin和Lukyanov编辑(2007)Nucleic Acids Hybridization:Modern Applications；ImmobilizedCells and Enzymes(IRL Press(1986))；Grandi编辑(2007)In Vitro Transcription andTranslation Protocols,第2版；Guisan编辑(2006)Immobilization of Enzymes andCells；Perbal(1988)A Practical Guide to Molecular Cloning,第2版；Miller和Calos编辑,(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring HarborLaboratory)；Makrides编辑(2003)Gene Transfer and Expression in MammalianCells；Mayer和Walker编辑(1987)Immunochemical Methods in Cell and MolecularBiology(Academic Press,London)；Lundblad和Macdonald编辑(2010)Handbook ofBiochemistry and Molecular Biology,第4版；以及Herzenberg等人编辑(1996)Weir'sHandbook of Experimental Immunology,第5版。

如本文所用，下列术语中的每一个在本节中均具有与其相关的含义。如本文所用的冠词“一个”是指一个或多于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。

如本文所用，下列术语中的每一个在本节中均具有与其相关的含义。如本文所用的冠词“一个”是指一个或多于一个(即至少一个)所述冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意指一个元素或多于一个元素。

如本文所用，术语“约”当指代可测量值(诸如量、持续时间等)时，意在涵盖与指定值±20％、±10％、±5％)、±1％)或±0.1％)的变化，因为此类变化适合于进行所公开的方法。

如本文所用，术语“激活”是指T细胞已受到充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能相关。如本文所用，除其他情况之外，术语“激活的T细胞”是指正在进行细胞分裂的T细胞。

如本文所用的术语“抗肿瘤作用”是指一种生物学作用，其可以表现为肿瘤体积减少、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加或与癌症状况相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”还可以表现为本公开的肽、多核苷酸、细胞和抗体首先预防肿瘤发生的能力。

如本文所用，术语“自体”意在指代任何来源于同一个体的材料，后续将被重新引入至所述个体中。

如本文所用，术语“抗原”或“Ag”被定义为触发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及其他抗体的产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可来源于重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引起免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA均编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见的是，本公开包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以触发期望的免疫反应。此外，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见的是，抗原可以生成、合成，或者可以来源于生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物液体。

如本文所用，术语“同种异体的”是指来源于同一物种的不同动物的移植物。

如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可能是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，也可能是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本公开中的抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体(scFv)和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是指对感兴趣的抗原(例如，肿瘤相关抗原)具有显著已知的特异性免疫反应活性的此类组装体(例如，完整的抗体分子、免疫粘附素或其变体)。抗体和免疫球蛋包含轻链和重链，在所述轻链和重链之间有或没有链间共价键。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对好理解的。

术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用，术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。

如本文所用，“抗体轻链，”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。

如本文所用，术语“抗体变体”包括抗体的合成和工程化形式，所述抗体被改变以使得其不是天然存在的，例如，包含至少两个重链部分而非两条完整重链(诸如结构域缺失抗体或微型抗体)的抗体；抗体的多特异性形式(例如，双特异性、三特异性等)，其被改变以结合至两个或更多个不同抗原或结合至单个抗原上的不同表位)；与scFv分子连接的重链分子等。此外，术语“抗体变体”包括抗体的多价形式(例如，三价、四价等，与相同抗原的三个、四个或更多个拷贝结合的抗体。

如本文所用的术语“癌症”被定义为以异常细胞快速且不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。

如本文所用，术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换使用，以指代在癌细胞表面完整表达或作为片段(例如，MHC/肽)表达的分子(通常是蛋白质、碳水化合物或脂质)，并且所述分子可用于将药剂优先靶向至癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞表达的标志物(例如，B细胞上的谱系标志物，诸如CD19)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的细胞表面分子，例如与正常细胞相比，1倍过表达、2倍过表达、3倍过表达或更多。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将仅在癌细胞的细胞表面上完整表达或作为片段(例如，MHC/肽)表达，并且不在正常细胞的表面上合成或表达。在一些实施方案中，本公开的CAR包括包含与MHC呈递肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常情况下，来源于内源性蛋白质的肽填充了主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。所有的有核细胞均组成性表达MHC I类复合物。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表了一类独特的用于免疫疗法的细胞表面靶标。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的上下文中靶向来源于病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体。例如，可通过筛选文库(诸如人scFv噬菌体展示文库)来鉴定TCR样抗体。

在一些实施方案中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)、甲胎蛋白(AFP)/HLA-A2、AXL、B7-H3、BCMA、CA-IX、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD70、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CDI 17、CD123、CD133、CD147、CDI 71、CD276、CEA、紧密连接蛋白18.2、c-Met、DLL3、DRS、EGFR、EGFRvIII、EpCAM、EphA2、FAP、叶酸受体α(FRa)/叶酸结合蛋白(FBP)、GD-2、糖脂F77、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、HER2、HLA-A2、ICAMI、IL3Ra、IL13Ra2、LAGE-I、Lewis Y、LMPI(EBV)、MAGE-Al、MAGE-A3、MAGE-A4、Melan A、间皮素、MG7(糖基化CEA)、MMP、MUCI、Nectin4/FAP、NKG2D-配体(MIC-A、MIC-B和ULBP I至6)、NY-ESO-1、Pl 6、PD-LI、PSCA、PSMA、RORI、ROR2、TIM-3、TM4SF1、TnMuc1、VEGFR2及其任何组合。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指经工程化以在免疫效应细胞或其前体细胞上表达并特异性结合抗原的人工T细胞受体。CAR可用于使用过继细胞转移的过继细胞疗法。在一些实施方案中，过继细胞转移(或疗法)包括从患者中去除T细胞，并修饰T细胞以表达对特定抗原具有特异性的受体。在一些实施方案中，CAR对选择的靶标(例如，肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA))具有特异性。CAR还可包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的细胞外结构域。

如本文所用，术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上的分子，所述分子特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子，从而除了由例如TCR/CD3复合物与装载有肽的MHC分子的结合所提供的初级信号之外，还提供的介导T细胞反应的信号，所述T细胞反应包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可包括但不限于：CD2、CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还尤其涵盖与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。

如本文所用，“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，诸如但不限于增殖。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其有助于有效的免疫反应。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、Toll配体受体、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、PD-1、CD7、LIGHT、CD83L、DAP10、DAP12、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40、ICOS(CD278)、NKG2C、B7-H3(CD276)和来源于杀伤免疫球蛋白样受体(KIR)的细胞内结构域。在一些实施方案中，共刺激分子包括OX40、CD27、CD2、CD28、ICOS(CD278)和4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的进一步实例包括：CD8、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及与CD83特异性结合的配体。

如本文所用，术语“共刺激信号”是指与主要信号(诸如TCR/CD3连接)组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可由以下蛋白质家族来表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)和激活NK细胞受体。此类分子的实例包括：CD27、CD28、4-lBB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD8、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3以及与CD83特异性结合的配体等。

如本文所用，术语“来源于”是指在第一个分子和第二个分子之间的关系。其定义了在第一个分子和第二个分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对来源于第二个分子的第一个分子的过程或来源限制。例如，在来源于CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留了足够的CD3ζ结构，使得其具有所需的功能，即在适当条件下生成信号的能力。它并不暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制。它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列或施加突变才能到达细胞内信号传导结构域。

如本文所用，“疾病”是指动物的一种健康状态，其中动物不能维持内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康状态继续恶化。相反，动物的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持内稳态，但其中动物的健康状态不如不存在病症时那么好。如果不加以治疗，病症不一定会导致动物健康状态进一步变差。

如本文所用，“与肿瘤抗原表达相关的疾病”包括但不限于与肿瘤抗原表达相关的疾病或与表达肿瘤抗原的细胞相关的疾患，包括但不限于增殖性疾病，诸如癌症或恶性肿瘤；或癌前疾患，诸如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达肿瘤抗原的细胞相关的非癌症相关适应症。在一些实施方案中，与肿瘤抗原的表达相关的癌症是血液癌症。在一些实施方案中，与肿瘤抗原的表达相关的癌症是固体癌。与肿瘤抗原表达相关的其他疾病包括但不限于与肿瘤抗原表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前疾患或增生性疾病。与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于自身免疫性疾病(例如，狼疮)、炎性病症(过敏和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时候表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变型)，并且肿瘤抗原蛋白可以正常水平或降低的水平存在。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。

在一些实施方案中，与异常糖基化相关的疾病是癌症或自身免疫性疾病。如本文所用，术语“自身免疫性疾病”被定义为由自身免疫反应引起的病症。自身免疫性疾病是对自身抗原的不适当和过度反应的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于：爱迪生氏病(Addison'sdisease)、斑秃(alopecia greata)、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)、自身免疫性腮腺炎(autoimmuneparotitis)、克罗恩病(Crohn's disease)、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophic epidermolysis bullosa)、附睾炎(epididymitis)、肾小球肾炎(glomerulonephritis)、格雷夫斯病(Graves'disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barrsyndrome)、桥本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血(hemolytic anemia)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、重症肌无力(myasthenia gravis)、寻常型天疱疮(pemphigus vulgaris)、银屑病(psoriasis)、风湿热(rheumatic fever)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、结节病(sarcoidosis)、硬皮病(scleroderma)、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、脊柱关节病(spondyloarthropathies)、甲状腺炎(thyroiditis)、血管炎(vasculitis)、白癜风(vitiligo)、粘液性水肿(myxedema)、恶性贫血(pernicious anemia)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)等。

如本文所用，术语“下调”是指一个或多个基因的基因表达的减少或消除。

如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”意指如本文所述的化合物、制剂、材料、药剂或组合物在有需要的受试者中有效实现期望的生理、治疗或预防结果的量。此类结果可包括但不限于当施用于哺乳动物时，与缺失本公开的组合物的情况下检测到的免疫反应相比导致可检测水平的免疫反应的量。可通过多种本领域公认的方法容易地评估免疫反应。技术人员将理解，本文所施用的组合物的量是变化的，并且可以基于多种因素容易地确定，所述因素诸如所治疗的疾病或疾患、所治疗的哺乳动物的年龄和健康和身体状况、疾病的严重程度、所施用的特定化合物等。有效量可根据待治疗的受试者的健康和身体状况、待治疗受试者的分类群、组合物的制剂、受试者的医疗状况的评估以及其他相关因素因受试者而异。。

如本文所用，术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中的核苷酸的特定序列充当在生物过程中合成具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列的其他聚合物和大分子的模板的固有特性以及由此产生的生物特性。因此，如果与某个基因相对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生了蛋白质，则所述基因编码蛋白质。用作基因或cDNA的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mRNA序列同一，并通常在序列表中提供)和非编码链可被称为编码所述基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

如本文所用，术语“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。

如本文所用，术语“表位”被定义为抗原上的小化学分子，其可以引起免疫反应，从而诱导B细胞和/或T细胞反应。抗原可以具有一个或多个表位。大多数抗原具有许多表位；即，它们是多价的。一般来说，表位的尺寸大约为约10个氨基酸和/或糖。在某些示例性实施方案中，表位为约4-18个氨基酸、约5-16个氨基酸、约6-14个氨基酸、约7-12个氨基酸或约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，一般来说，整体三维结构，而不是分子的特定线性序列，是抗原特异性的主要标准，并因此将一个表位与另一个表位区分开来。基于本公开，本公开中使用的肽可以是表位。如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

如本文所用，术语“扩增”是指数量增加，如免疫细胞(例如，T细胞)数量的增加。在一些实施方案中，离体扩增的免疫细胞(例如，T细胞)的数量相对于培养物中最初存在的数量有所增加。在另一个实施方案中，离体扩增的免疫细胞(例如，T细胞)的数量相对于培养物中的其他细胞类型有所增加。

如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。

如本文所用，术语“表达”被定义为由特定核苷酸序列的启动子驱动的所述特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些载体，诸如掺入了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或脂质体中含有的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用，术语“离体”是指已从生物体(例如，人)中去除并在生物体外部(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。

如本文所用，术语“Fc部分”或“Fc单体”在本公开中意指包含至少一个具有CH2结构域功能的结构域和至少一个具有免疫球蛋白分子的CH3结构域功能的结构域的多肽。从术语“Fc单体”明显可知，包含这些CH结构域的多肽是“多肽单体”。Fc单体可以是包含至少一个免疫球蛋白恒定区片段的多肽，所述片段不包括重链的第一恒定区免疫球蛋白结构域(CH1)，并且至少维持了CH2结构域的功能部分和CH3结构域的功能部分，其中CH2结构域位于CH3结构域的氨基端。在该定义的一个优选的方面，Fc单体可以是包含Ig-Fc铰链区、CH2区和CH3区的一部分的多肽恒定区，其中铰链区位于CH2结构域的氨基端。

设想本公开的铰链区促进二聚化。此类Fc多肽分子可通过例如但不限于免疫球蛋白区的木瓜蛋白酶消化(当然会产生两个Fc多肽的二聚体)来获得。在该定义的另一个方面，Fc单体可以是包含CH2区和CH3区的一部分的多肽区。此类Fc多肽分子可通过例如但不限于免疫球蛋白分子的胃蛋白酶消化来获得。在一个实施方案中，Fc单体的多肽序列与以下的Fc多肽序列基本上相似：IgG1 Fc区、IgG2 Fc区、IgG3 Fc区、IgG4 Fc区、IgM Fc区、IgAFc区、IgD Fc区和IgE Fc区。(参见，例如，Padlan,Molecular Immunology,31(3),169-217(1993))。由于在免疫球蛋白之间存在一些变化，并且仅为了清楚起见，Fc单体是指IgA、IgD和IgG的最后两个重链恒定区免疫球蛋白结构域以及IgE和IgM的最后三个重链恒定区免疫球蛋白结构域。

Fc单体还可包括位于这些结构域的N端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc单体可包括J链。对于IgG，Fc部分包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3以及在前两个结构域和CH2之间的铰链。尽管Fc部分的边界可能有所不同，但包含功能性铰链、CH2和CH3结构域的人IgG重链Fc部分的实例可被定义为包含SEQ ID NO:79-84的氨基酸序列。

IgG铰链区可通过使用Kabat进行类比来鉴定。在一个实施方案中，本公开的铰链结构域/区包含与根据Kabat编号的D234至P243的IgG1序列延伸段相对应的氨基酸残基。在一些实施方案中，本公开的铰链结构域/区包含IgG1铰链序列DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:79或80)或由其组成。在一个实施方案中，IgG1铰链结构域/区包含EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ IDNO:80)的氨基酸序列。在本公开的进一步的实施方案中，铰链结构域/区包含或由以下组成：IgG2亚型铰链序列ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:81)、IgG3亚型铰链序列ELKTPLDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:82)或ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO:83)和/或IgG4亚型铰链序列ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:84)。在本公开的进一步的实施方案中，IgG铰链结构域/区包含表2或表3中公开的铰链氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，融合蛋白进一步包含有包含两个多肽单体的第三结构域，其中每个单体包含铰链、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，第三结构域按氨基至羧基的顺序包含：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。在一个实施方案中，CH2结构域包含域内半胱氨酸二硫桥。

在另一个实施方案中，两个多肽单体经由肽接头彼此融合。然而，在另一个实施方案中，第一和第二结构域经由肽接头与第三结构域融合。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的肽接头包含GGGGS(即，Gly4Ser(SEQ ID NO:72))的氨基酸序列或其聚合物(即，(Gly4Ser)n，其中n为5或更大的整数(例如，5、6、7、8等或更大))。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白的肽接头包含SEQ ID NO:60-76的氨基酸序列。

如本文所用，术语“同源”是指在两个肽之间或在两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个所比较的序列中的某个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中每一者的某个位置都被腺嘌呤占据，则所述分子在该位置上是同源的。在两个序列之间的同源性百分比是两个序列所共有的匹配或同源位置的数量除以所比较的位置数量再乘以100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个位置是匹配或同源的，则所述两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC共有50％的同源性。一般来说，当比对两个序列以提供最大同源性时，就会进行比较。

如本文所用，术语“同一性”是指在两个聚合物分子之间，特别是在两个氨基酸分子之间，诸如在两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，如果两个多肽分子的每一个中的某个位置都被精氨酸占据，则这两个分子在该位置上是同一的。两个氨基酸序列在比对中在相同位置具有相同残基的同一性或程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一的位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半(例如，长度为十个氨基酸的聚合物中的五个位置)的位置是同一的，则这两个序列具有50％的同一性；如果90％的位置(例如，10个位置中的9个)是匹配或同一的，则这两个氨基酸序列具有90％的同一性。

如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为一类用作抗体的蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白质包括五个成员，IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于体分泌物(诸如唾液、泪液、乳汁、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物)中的主要抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者的原发免疫反应中产生的主要免疫球蛋白。其是凝集、补体结合和其他抗体反应中最高效的免疫球蛋白，并在防御细菌和病毒中发挥着重要作用。IgD是没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体的免疫球蛋白。IgE是通过在暴露于过敏原后引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导速发型超敏反应的免疫球蛋白。

如本文所用，术语“免疫反应”被定义为当淋巴细胞将抗原分子鉴定为外来物并诱导抗体形成和/或激活淋巴细胞以去除抗原时发生的针对抗原的细胞反应。本文所用的术语“免疫刺激”是指增加整体免疫反应。本文所用的术语“免疫抑制”是指降低整体免疫反应。

如本文所用，术语“免疫反应”被定义为当淋巴细胞将抗原分子鉴定为外来物并诱导抗体形成和/或激活淋巴细胞以去除抗原时发生的针对抗原的细胞反应。

如本文所用，术语“免疫效应细胞”是指参与免疫反应(例如，参与促进免疫效应反应)的细胞。免疫效应细胞的实例包括T细胞(例如，α/ηT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和髓源性吞噬细胞。

如本文所用，术语“免疫效应功能”或“免疫效应反应”是指增强或促进靶细胞的免疫攻击的功能或反应。在一些实施方案中，免疫效应功能或反应是指T细胞或NK细胞促进靶细胞的杀伤或抑制靶细胞的生长或增殖的性质。在T细胞的情况下，初级刺激和共刺激是免疫效应功能或反应的实例。

如本文所用，“指导材料”包括出版物、录音、图表或任何其他可用于传达本公开的组合物和方法的有用性的表达媒介。本公开的试剂盒的指导材料可以例如固定在含有本公开的核酸、肽和/或组合物的容器上，或者与含有核酸、肽和/或组合物的容器一起运输。或者，可以将指导材料与容器分开运输，以便接收者可以配合使用指导材料和化合物。

如本文所用，术语“分离的”意指从自然状态改变或脱离。例如，在活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但从其天然状态的共存物质中部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，诸如，例如，宿主细胞。

在本公开的上下文中，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有彼此为简并版本且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，只要编码蛋白质的核苷酸序列在一些版本中可能含有内含子即可。

如本文所用，术语“凝集素”或“血凝素”是指结合碳水化合物结构的蛋白质或肽。本领域技术人员将理解，凝集素是对与糖部分结合具有高度特异性的蛋白质或肽。凝集素是碳水化合物结合蛋白，其对蛋白质和/或脂质上发现的碳水化合物具有高度特异性，因此引起特定细胞的凝集或糖缀合物和多糖的沉淀。凝集素在细胞和分子水平的识别中发挥作用，并且在涉及细胞、碳水化合物和蛋白质的生物识别现象中发挥多种作用。凝集素还介导细菌、病毒和真菌与其预定靶标的连接和结合。在一个实施方案中，“凝集素”可被定义为非免疫球蛋白性质的蛋白质或糖蛋白，其能够进行特异性识别并与复杂糖缀合物(蛋白质和/或脂质)的碳水化合物部分可逆结合，而不会改变任何被识别的糖基配体的共价结构。凝集素是具有碳水化合物结合结构域的糖蛋白，具有与糖蛋白或糖脂中的特定糖部分以及游离单糖和聚糖结构的可逆结合能力。尽管许多生物体都表达凝集素或凝集素样生物分子，但最近鉴定的具有科学意义的凝集素大多是从植物来源中纯化的。

如本文所用的术语“肿瘤相关碳水化合物抗原”或“TACA”是指在与改变的糖基化相关的病症(例如癌症)中发现的碳水化合物结构。含碳水化合物的大分子(聚糖)在生物系统中普遍存在，并对许多生物功能至关重要。碳水化合物这些含碳水化合物的大分子的结构变化(糖基化)对癌症生物学和癌症进展有显著影响。事实上，改变的糖基化是肿瘤细胞的共同特征，并导致肿瘤相关碳水化合物(TACA)的形成。癌细胞通常可通过其表面展示的碳水化合物结构的异常水平和类型与正常细胞区分开来。

含碳水化合物的大分子的三种常见变化与癌症相关：截短的或不完整的聚糖的表达增加、N-聚糖的支化增加以及含唾液酸的聚糖的存在增加或改变。例如，癌症相关聚糖通常表现出唾液酸量的增加，并且这种高唾液酸化增强了唾液酸结合受体(诸如选择素和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs))的激活，从而导致癌症进展。另一种最常见的癌症相关糖基化变化是O-连接碳水化合物链的截短(O-糖蛋白的截短)，诸如粘蛋白。在正常情况下，N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)糖残基连接至糖蛋白(GalNAcα1-O-Ser/Thr，Tn抗原)的丝氨酸或苏氨酸，并通常被高尔基体中的T合酶(核心1β3-半乳糖基转移酶)延长，所述T合酶将半乳糖残基连接至Thomsen-Friedenreich(TF)抗原(Tn抗原)。在各种癌症中，此过程发生改变，并且Tn抗原或其唾液酸化形式(唾液酸基-Tn(STn)抗原)的糖基化发生改变，从而导致了截短的T抗原、Tn抗原和STn抗原。此外，还观察到N-糖蛋白支化(其刺激半乳糖凝集素-3)增加和糖脂(诸如例如，神经节苷脂(GM3、GM2、CD3和GD2))的改变。

在各种癌症中都观察到了以下TACA：(i)原发性非小细胞肺癌中的H/Le^y/ILe^a；(ii)各种类型的癌症中的唾液酸基-Le^x(SLe^x)和唾液酸基-Lea(SLea)；(iii)结直肠癌、肺癌、乳腺癌和许多其他癌症中的Tn和唾液酸基-Tn；(iv)神经外胚层肿瘤(黑色素瘤和神经母细胞瘤)中的GM2、GD2和GD3神经节苷脂；以及(v)乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中的globo-H；(vi)肾细胞癌中的二唾液酸基半乳糖红细胞糖苷(disialylgalactosylgloboside)。

因此，术语“肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)”涵盖蛋白质和/或脂质上的所有改变的碳水化合物结构，其在肿瘤肿瘤细胞上表达，促进癌症转移、癌症进展、癌症和非癌症免疫抑制且/或促进自身免疫性疾病。技术人员将理解碳水化合物结构由一个或多个连接的糖或单糖组成。参见例如，Mantuano等人,J.Immunotherapy Cancer 8(2):8:e001222(2020)；Hakomori,Si.(2001).Tumor-Associated Carbohydrate Antigens DefiningTumor Malignancy:Basis for Development of Anti-Cancer Vaccines,在TheMolecular Immunology of Complex Carbohydrates—2.Advances in ExperimentalMedicine and Biology,第491卷.Springer,Boston,MA(Wu等人(编辑))。技术人员将理解，碳水化合物结构可以是独立的和/或连接至蛋白质或脂质，称为糖蛋白和糖脂。技术人员将理解这些碳水化合物结构与凝集素结合。

如本文所用的“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在能够感染非分裂细胞方面是逆转录病毒中独一无二的；它们可以将大量的遗传信息递送至宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最高效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的方式。

如本文所用的术语“有限的毒性”是指本公开的肽、多核苷酸、细胞和/或抗体，其在体外或体内对健康细胞、非肿瘤细胞、非病变细胞、非靶细胞或此类细胞群表现出缺乏显著的负面生物学效应、抗肿瘤作用或显著的负面生理症状。

如本文所用，如在scFv的上下文中使用的术语“柔性多肽接头”或“接头”是指由单独或组合使用的氨基酸(诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基)组成以将可变重链区和可变轻链区连接在一起的肽接头。在一个实施方案中，柔性多肽接头是Gly/Ser接头，并包含氨基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中n为等于或大于1的正整数。例如，n＝l、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9以及n＝10(SEQ ID NO:6592)。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(Gly4 Ser)₄或(Gly4Ser)₃。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。

如本文所用，术语“修饰的”意指本公开的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可通过多种方式(包括化学上、结构上和功能上)进行修饰。可通过引入核酸来修饰细胞。

如本文所用，术语“调节”意指与不存在治疗或化合物的情况下受试者的反应水平相比和/或与其他相同但未经治疗的受试者的反应水平相比，介导受试者的反应水平的可检测到的增加或减少。术语涵盖扰乱和/或影响天然信号或反应，从而介导受试者(优选人)的有益治疗反应。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有彼此为简并版本且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包含内含子。

如本文所用，术语“可操作连接”是指在调控序列和异源核酸序列之间，从而导致后者的表达的功能性连接。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时在同一个阅读框中。

如本文所用，术语“过表达的肿瘤抗原”或“肿瘤抗原的过表达”旨在表示相对于患者的特定组织或器官内的正常细胞中的表达水平，所述组织或器官内的疾病区(如实体瘤)的细胞中的肿瘤抗原的表达水平异常。患有实体瘤或以肿瘤抗原的过表达为特征的血液系统恶性肿瘤的患者可以通过本领域已知的标准测定法来测定。

如本文所用，术语“肠胃外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射或输注技术。

如本文所用，术语“患者”、“受试者”和“个体”等在本文中可互换使用，并且是指适合本文所述方法的任何动物或其细胞(无论是体外或原位)。受试者可以是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴子和人)。在某些实施方案中，如本文所用的术语“受试者，”是指脊椎动物，诸如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、非人灵长类动物、野生动物、野化动物、农场动物、运动动物和宠物。任何可以引起免疫反应的生物体都可以是受试者或患者。在某些示例性实施方案中，受试者是人。

如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员一般知道，核酸是可以水解成单体“核苷酸”的多核苷酸。单体核苷酸可以水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域中可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式包括但不限于重组方式，即使用普通克隆技术和PCR^TM等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列，以及通过合成方式。

如本文所用，术语“肽”和“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语既指代短链，其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体，也指代长链，其在本领域中通常称为蛋白质，存在多种类型的蛋白质。“多肽”包括例如，生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用，术语“启动子”被定义为被细胞合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，其是启动多核苷酸序列的特定转录所需的。

如本文所用，术语“启动子”或“调控序列”意指表达与“启动子”或“调控序列”可操作地连接的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，此序列还可以包括增强子序列和表达基因产物所需的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。

如本文所用，“组成型启动子”是一种核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致在细胞的大多数或所有生理条件下在细胞中产生基因产物。

如本文所用，“诱导型启动子”是一种核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在与启动子相对应的诱导物时才会导致在细胞中产生基因产物。

如本文所用，“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列，当其与基因编码或指定的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞是与启动子相对应的组织类型的细胞时，才会导致在细胞中产生基因产物。

如本文所用的关于抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白的术语“特异性结合”或“选择性地结合”意指识别特定抗原(例如，TACA)，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白。例如，特异性结合来自一个物种的抗原(例如，TACA)的抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白也可以与来自一个或多个物种的抗原结合。但是，这种交叉物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，特异性结合抗原(例如，TACA)的抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白也可以与抗原(例如，TACA)的不同等位基因形式结合。然而，此种交叉反应本身不会改变抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指代抗体、蛋白质、肽、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白与第二种化学种类的相互作用，以意指所述相互作用依赖于所述化学种类上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白识别并结合特定蛋白质结构(TACA)而不是一般的蛋白质。如果抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和所述抗体、抗原结合结构域、CAR或双特异性融合蛋白的反应中，含有表位A(或游离、未标记的A)的分子的存在可能会减少与抗体结合的标记的A的量。

如本文所用，术语“单链抗体”是指通过重组DNA技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段经由一段工程化氨基酸与Fv区连接。已知多种生成单链抗体的方法，包括美国专利号4,694,778；Bird,Science 242:423-442(1988)；Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)；Ward等人,Nature 334:54454(1989)；Skerra等人,Science 242:1038-1041(1988)中描述的那些方法。

如本文所用，术语“特异性”是指与给定靶抗原(例如，人靶抗原)特异性结合(例如，免疫反应)的能力。嵌合抗原受体可以是单特异性的并含有一个或多个特异性结合靶标的结合位点，或者嵌合抗原受体可以是多特异性的并含有两个或更多个特异性结合相同或不同靶标的结合位点。在某些实施方案中，嵌合抗原受体对同一靶标的两个不同(例如，不重叠)部分具有特异性。在某些实施方案中，嵌合抗原受体对多于一个的靶标具有特异性。

如本文所用，关于抗体的术语“特异性结合”意指识别特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体或其结合片段(例如，scFv)。例如，与来自一个物种的抗原特异性结合的抗体也可与来自一个或多个物种的该抗原结合。但是，这种交叉物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一个实例中，与抗原特异性结合的抗体也可与所述抗原的不同等位基因形式结合。但是，这种交叉反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指代抗体、蛋白质、嵌合抗原受体或肽与第二种化学种类的相互作用，以意指所述相互作用依赖于所述化学种类上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，嵌合抗原受体识别并结合特定蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离、未标记的A)的分子的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。

如本文使用，术语“刺激”意指由刺激分子(例如，TCR/CD3复合物)与其同源配体的结合诱导，从而介导信号转导事件(诸如但不限于，经由TCR/CD3复合物的信号转导)的初级反应。刺激可以介导某些分子的表达改变，诸如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组、克隆扩增和分化为不同的亚群。

如本文使用，术语“刺激分子”意指与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性地结合的T细胞上的分子。

如本文使用，术语“刺激配体”意指一种配体，当其存在于抗原呈递细胞(例如，aAPC、树突状细胞、B细胞等)上时，可以与T细胞上的同源结合配偶体(本文中称为“刺激分子”)特异性地结合，从而介导T细胞的初级反应，包括但不限于激活、启动免疫反应、增殖等。刺激配体是本领域所熟知的，并且尤其涵盖装载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体和超激动剂抗CD2抗体。

如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指代已经与在其天然存在状态下通常与其缔合的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指代已经与所述细胞在自然状态下自然缔合的细胞分离的细胞。在一些实施方案中，在体外培养细胞。在其他实施方案中，不在体外培养细胞。

如本文所用，“靶位点”或“靶序列”是指基因组核酸序列，其定义了结合分子可以在足以发生结合的条件下特异性结合的核酸的一部分。

如本文所用，术语“T细胞受体”或“TCR”是指响应抗原呈递而参与激活T细胞的膜蛋白复合物。TCR负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。TCR由阿尔法(a)链和贝塔(β)链的异二聚体组成，并与三个二聚体模块CD3δ/CD3ε、CD3γ/CD3ε和CD3ζ/CD3ζ偶联。在一些细胞中，TCR由γ和δ(γ/δ)链(CD3γ/CD3ε)组成。TCR可能以α/β和γ/δ形式存在，所述形式结构相似但具有不同的结构位置和功能。每条链由两个细胞外结构域、一个可变结构域和一个恒定结构域组成。在一些实施方案中，TCR可以在包含TCR的任何细胞上进行修饰，包括例如，辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。

如本文所用，术语“T细胞耗竭”或“耗竭”是指T细胞功能下降，其可能由于感染(例如，慢性感染)或疾病而发生。T细胞耗竭与PD-1、TIM-3和LAG-3表达增加、细胞凋亡以及细胞因子分泌减少有关。因此，术语“改善T细胞耗竭”、“抑制T细胞耗竭”、“减少T细胞耗竭”等是指T细胞功能恢复的状态，其特征是以下中的一种或多种：PD-1、TIM-3和LAG-3中一种或多种的表达和/或水平降低；记忆细胞形成增加和/或记忆标志物(例如，CD62L)的维持；预防细胞凋亡；抗原诱导型细胞因子(例如，IL-2)的产生和/或分泌增加；细胞毒性/杀伤能力增强；对低表面抗原的肿瘤靶标的识别增加；响应抗原的增殖增强。

如本文所用，术语“治疗性”意指治疗和/或预防。治疗效果是通过抑制、缓解或根除疾病状态来获得的。

术语“治疗有效量”或“有效量”是指由研究员、兽医、医学博士或其他临床医师探寻的将引起组织、系统或受试者的生物或医学反应的主题化合物的量。术语“治疗有效量”包括当施用时足以防止所治疗的病症或疾病的发展或在一定程度上缓解所治疗的病症或疾病的一种或多种体征或症状的化合物的量。治疗有效量将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的年龄、体重等而变化。

如本文所用，术语“疗法”是指可用于预防、控制、治疗和/或改善疾病或其相关症状的任何方案、方法和/或剂(例如，CAR-T)。在一些实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”是指生物疗法(例如，过继细胞疗法)、支持疗法(例如，淋巴细胞清除疗法)和/或本领域技术人员(诸如医务人员)已知的用于预防、控制、治疗和/或改善疾病或其相关症状的其他疗法。

如本文所用，术语“治疗(Treat)”、“治疗(Treatment)”和“治疗(Treating)”是指由施用一种或多种疗法(包括但不限于针对实体瘤治疗的CAR-T疗法)导致的疾病或其相关症状的进展、严重程度、频率和/或持续时间的减缓或改善。如本文所用，术语“治疗”还可以指代改变所治疗的受试者的疾病过程。治疗的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生和复发、缓解症状、减少疾病的直接或间接病理后果、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，如本文所用的术语“治疗”疾病意指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

如本文所用的术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入至宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已被外源核酸转染的、转化的或转导的细胞。所述细胞包括原代受试者细胞及其后代。

如本文所用的短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

如本文所用，“载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

如本文所用，术语“异种”是指来源于不同物种的动物的移植物。

范围：在整篇本公开中，本公开的各个方面可以范围形式呈现。应当理解，呈范围形式的描述仅仅是出于方便和简洁，并且不应解释为对本公开的范围的不可改变的刚性限制。因此，对范围的描述应被认为已经具体地公开所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，诸如1至6的范围描述应当被认为具有具体公开的子范围，诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。

III.TACA抗原结合结构域

本公开的一个方面提供了一种选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多于一个来源于凝集素的TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；以及细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，当CAR被引入修饰的细胞时，表达CAR的修饰的细胞不太容易受到CAR诱导的强直的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子的产生。

本公开的另一个方面提供了一种选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其包含：抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；CD8或CD28铰链结构域；CD8或CD28跨膜结构域；CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域；以及CD3ζ细胞内信号传导结构域。

细胞的恶性转化几乎普遍伴随着细胞表面蛋白质或脂质的异常糖基化(Kim和Varki,1997,Glycoconj J,14:569-576)。事实上，在所有类型的实验和人癌症中都观察到了细胞表面糖基化的改变(Hakomori,2002,PNAS USA,99:10231-10233)，并且这些改变的糖结构被称为肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)(表1)。这种肿瘤特异性性质使细胞表面TACA成为生产靶向许多常见癌症的单克隆抗体的优良靶抗原。然而，尽管经过了数十年的努力，由于难以生成针对碳水化合物抗原的抗体，因此尚未获得针对TACA的具有高亲和力的特异性抗体。

因此，本公开的发明人依靠凝集素而不是抗体对选择性地靶向肿瘤细胞上的TACA的双特异性融合蛋白和CAR进行工程化。凝集素及其结合配偶体是本领域所熟知的。参见例如，functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp。本公开的凝集素结合蛋白为开发用于癌症免疫疗法的新型治疗药物类别提供了机会，所述凝集素结合蛋白与现有技术(例如，GlyTR嵌合蛋白)相比具有显著的优势。基于GlyTR概念和对许多不同TACA具有特异性的多种不同凝集素的可用性，可通过用其他凝集素替换L-PHA来生成多种GlyTR；或者可以产生由凝集素和scFv构成的嵌合蛋白，其可以募集其他免疫效应细胞。凝集素结构域的功能可通过突变来改善。例如，可通过将E-PHA的碳水化合物结合结构域与L-PHA的碳水化合物结合结构域交换来进一步改进GlyTR L-PHA x CD3，这使得结合增加了20-30倍(Kaneda等人,2002,J Biol Chem,277:16928-16935)。

本文公开的CAR的抗原结合结构域被设计用于特异性地靶向肿瘤细胞上的糖蛋白和/或糖脂(即含有碳水化合物的大分子)。在一些实施方案中，本公开的CAR包含对靶细胞(例如，癌细胞)上的靶抗原(例如，肿瘤相关碳水化合物抗原)的亲和力。靶抗原可包括与靶细胞缔合的任何类型的蛋白质或其表位。例如，CAR可包含对靶细胞上的指示靶细胞的特定状态的靶抗原的亲和力。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含多个(例如，多于一个)TACA结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含一个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含两个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含三个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含四个TACA结合结构域。

A.TACA

在一些实施方案中，TACA结合结构域来源于凝集素。TACA结合结构域可包含可以特异性地结合TACA的任何肽、蛋白质、凝集素、凝集素片段、抗体、抗体片段、小分子、核酸等。在一些实施方案中，抗原结合结构域选择性地靶向β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、Tn表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、GalNAcα-丝氨酸、GalNAcα-苏氨酸、GalNAc或GalNAcβ1。

表1中列出了示例性TACA及其结合配偶体。示例性TACA包括但不限于β1,6分支、T抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、a2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基-Lewis^、二唾液酸基-Lewis^、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Lewis-y(Le^y)、Lewis Y、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GMl。在一些实施方案中，CAR或双特异性融合蛋白选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewis^x/a、二唾液酸基-Lewis^x/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Lewis-y(Le^y)、Lewis Y、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。在一些实施方案中，CAR选择性地靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖、GalNAc、Tn抗原、GalNAcα-ser、GalNAc或GalNAcβ1。

在一个实施方案中，TACA结合结构域与N-聚糖结合。在某些实施方案中，TACA结合结构域与三触角和四触角寡糖结合。在一个实施方案中，TACA结合结构域与β1,6GlcNAc分支N-聚糖结合。在一个实施方案中，TACA结合结构域与Tn表位结合。

B.凝集素

在某些实施方案中，TACA结合结构域是来源于凝集素蛋白的肽序列。在某些实施方案中，凝集素选自由以下组成的组：哺乳动物凝集素、人凝集素、植物凝集素、细菌凝集素、病毒凝集素、真菌凝集素和原生动物凝集素。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含来源于凝集素的TACA结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含至少两个来自凝集素的TACA结合结构域。

在一些实施方案中，凝集素选自由以下组成的组：半乳糖凝集素、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(siglec)、选择素(selectin)；C型凝集素；CD301、多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)、L-PHA(菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素)；E-PHA(菜豆红细胞凝集素)；番茄凝集素(番茄(Lycopersicon esculentum)凝集素；LEA)；花生凝集素(花生(Arachis hypogaea)凝集素；PNA)；马铃薯凝集素(马铃薯(Solanum tuberosum)凝集素)、商陆丝裂原(美洲商陆(Phytolacca Ame rican)凝集素)、麦胚凝集素(麦胚(TriticumVulgaris)凝集素)；木菠萝(Artocarpus polyphemus)凝集素(木菠萝(Jacalin)凝集素)；野豌豆(Vici a villosa)凝集素(VVA)；蜗牛(Helix pomatia)凝集素(HPA)；多花紫藤(Wisteria floribunda)凝集素(WFA)；接骨木(Sambucus nigra)凝集素(SNA)、BC2L-CNt(来自革兰氏阴性细菌新洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkh olderia cenocepacia)的凝集素)、山槐(Maackia amurensis)白细胞凝集素(MAL)、毡毛小脆柄菇(Psathyrella velutina)凝集素(PVL)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)凝集素(SRL)、锯齿麒麟菜(Eucheumaserra)凝集素(ESA)、CLEC17A(保护素)、橙黄网胞盘菌(Aleuria aurantia)凝集素、无梗接骨木(Sambucus sieboldiana)凝集素(SSA)、金钱薄荷(Gl echoma hederacea)凝集素(Gleheda)、黑桑(Morus nigra)凝集素(Morni ga G)、南欧丹参(Salvia sclarea)凝集素、Salvia bogotensis凝集素、蝶花鼠尾草(Salvia horminum)凝集素、海州常山(Clerodendrum tricho tomum)凝集素、贝壳花(Moluccella laevis)凝集素、加纳籽(Griffonia simplicifolia)(GsLA4)、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)(酸性WBAI)、相思子(Abrus precatorius)凝集素、尾穗苋(Amaranthus caudatus)凝集素、白果苋(Amaranthus leucocarpus)凝集素、秋蕾丽兰(Laelia autumnalis)凝集素、木菠萝(Artocarpus integrifolia)凝集素、桑橙(Mac lura pomifera)凝集素、野波罗蜜(Artocarpus lakoocha)凝集素、双花扁豆(Dolichos biflorus)凝集素、双花扁豆凝集素、大豆(Glycine max)凝集素和双孢蘑菇(Agaricus bisporus)凝集素。

在一些实施方案中，凝集素是可以选自由以下组成的组的半乳糖凝集素：半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-2、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-5、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-9、半乳糖凝集素-10、半乳糖凝集素-11、半乳糖凝集素-12、半乳糖凝集素-13、半乳糖凝集素-14和半乳糖凝集素-15。在一些实施方案中，凝集素是可以选自由以下组成的组的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(唾液酸粘附素)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-2(CD22)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-3(CD33)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-4(髓鞘相关糖蛋白)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-6、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-8、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-10、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-11、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-12、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-13、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-14、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-16、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-17、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素E、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素G和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素H。在一些实施方案中，TACA结合结构域来源于选择素或C型凝集素。

在一些实施方案中，凝集素是可以选自由以下组成的组的多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)：ppGalNAc-T1(GALNT1)、ppGalNAc-T2(GALNT2)、ppGalNAc-T3(GALNT3)、ppGalNAc-T4(GALNT4)、ppGalNAc-T5(GALNT5)、ppGalNAc-T6(GALNT6)、ppGalNAc-T7(GALNT7)、ppGalNAc-T8(GALNT8)、ppGalNAc-T9(GALNT9)、ppGalNAc-T10(GALNT10)、ppGalNAc-T12(GALNT12)、ppGalNAc-T13(GALNT13)、ppGalNAc-T14(GALNT14)、ppGa lNAc-T15(GALNT15)、ppGalNAc-T16(GALNT16)、ppGalNAc-T17(GALNT17)、ppGalNAc-T18(GALNT18)、ppGalNAc-T样5(GAL NTL5)和ppGalNAc-T样6(GALNTL6)。

在一些实施方案中，本文所述的CAR或双特异性融合蛋白的抗原结合结构域选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Thomsen-nouveau(Tn)表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewisx/a、二唾液酸基-Lewisx/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Lewis-y(Le^y)、Lewis Y、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。

C.嵌合抗原受体

本公开的一个方面提供了对肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)具有亲和力的嵌合抗原受体(CAR)，包含所述CAR的修饰的细胞、使用所述修饰的免疫细胞或其前体细胞的组合物和方法。本公开的主题CAR包含抗原结合结构域(例如，肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA))、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和细胞内信号传导结构域。本公开的主题CAR可以任选地包含铰链结构域。因此，本公开的主题CAR包含抗原结合结构域(例如，TACA结合结构域)、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，主题CAR的每个结构域被接头分开。本发明的主题CAR被突变以预防由T细胞耗竭引起的CAR诱导的T细胞耗竭。在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域被突变以调节CAR信号传导。

在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比，包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞显示出降低的强直性信号传导。在一些实施方案中，与包含有包含野生型抗原结合结构域的CAR的修饰的细胞相比，表达CAR(包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失)的修饰的细胞不太容易受到耗竭的影响。在一些实施方案中，与包含有包含野生型抗原结合结构域的CAR的修饰的细胞相比，表达CAR(包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失)的修饰的细胞不太容易受到与强直性信号传导TACA CAR相关的耗竭的影响。本公开的另一个方面提供了一种在本文公开的修饰的细胞中表达的嵌合抗原受体。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)对以下具有亲和力：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewis^x/a、二唾液酸基-Lewis^x/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、GloboH、GD2、GD3、GM3或岩藻糖基GM1。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)对β1,6分支或β1,6GlcNAc分支N-聚糖具有亲和力。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)对Tn抗原或唾液酸基-Tn表位具有亲和力。

1.抗原结合结构域

CAR的抗原结合结构域是CAR的胞外区，用于结合特定靶抗原，包括蛋白质、碳水化合物和糖脂。在一些实施方案中，CAR包含对靶细胞(例如，癌细胞)上的靶抗原(例如，肿瘤相关抗原)的亲和力。靶抗原可包括与靶细胞缔合的任何类型的蛋白质或其表位。例如，CAR可包含对靶细胞上的指示靶细胞的特定状态的靶抗原的亲和力。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含多于一个的TACA结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含两个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含三个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含四个TACA结合结构域。TACA结合结构域可包含可以特异性地结合TACA的任何肽、蛋白质、凝集素、凝集素片段、抗体、抗体片段、小分子、核酸等。

在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含突变，所述突变选自取代、缺失或插入。

在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含缺失。在一个实施方案中，缺失位于TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。在一个实施方案中，缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。在一个实施方案中，缺失为至少约10个氨基酸、至少约18个氨基酸、或至少约36个氨基酸。在一个实施方案中，缺失为至少约36个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于N末端并且为至少约10个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸，并且位于C末端并且为至少约10个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含缺失，所述缺失去除TACA结合结构域(TBD)中的二硫键键合的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的表达与包含野生型TBD的CAR的表达相似。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域的碳水化合物结合结构域中的缺失，所述TACA结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ IDNO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合包含与SEQ ID NO:34-39具有至少90％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表2或表3中公开的氨基酸序列。

抗原结合结构域可以可操作地连接至CAR的另一个结构域，诸如跨膜结构域、共刺激信号传导结构域或细胞内信号传导结构域(每个结构域均在本文其他地方描述)，以在细胞中表达。本文所述的抗原结合结构域可以与以下组合：任何跨膜结构域、任何共刺激信号传导结构域、任何细胞内信号传导结构域或可包括在本公开的CAR中的本文所述的任何其他结构域。

2.接头

术语“接头”和“间隔”在本文中可互换使用。接头通常富含甘氨酸以提供柔性，并富含丝氨酸或苏氨酸以提供溶解性。可使用多个接头来连接多于一个的TACA结合结构域。在一些实施方案中，多于一个的TACA结合结构域可通过接头可操作地连接，诸如接头可以选自由以下组成的组：肽接头、非肽接头、化学单元、受阻交联剂、非受阻交联剂。在一个实施方案中，接头是肽接头。肽接头可以是甘氨酸-丝氨酸接头。肽接头的长度可以为至少约4个、至少约6个、至少约8个、至少约10个、至少约12个、至少约14个或至少约15个氨基酸。

各种接头序列是本领域已知的，并且接头的非限制性实例公开于Shen等人,Anal.Chem.80(6):1910-1917(2008)和WO 2014/087010中，其内容特此通过引用整体并入。本领域技术人员能够选择适当的接头序列用于本公开的双特异性融合蛋白和/或CAR。

在一些实施方案中，接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76。在一个实施方案中，接头包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或SEQ ID NO:75的氨基酸序列。

3.跨膜结构域

关于跨膜结构域，本公开的CAR(例如，TACA CAR)可被设计为包含将CAR的抗原结合结构域与细胞内结构域连接的跨膜结构域。主题CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如免疫细胞或其前体)的质膜的区。跨膜结构域用于插入到细胞膜中，例如真核细胞膜。在一些实施方案中，跨膜结构域位于CAR的抗原结合结构域和细胞内结构域之间

在一个实施方案中，跨膜结构域与CAR中的一个或多个结构域天然地缔合。在一些情况下，可通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大程度地减少与受体复合物的其他成员的相互作用。

跨膜结构域可来源于天然来源或合成来源。当来源是天然的时，结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。当来源是合成的时，跨膜结构域可以是促进CAR插入细胞膜的任何人工序列，例如，人工疏水序列。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)包含跨膜结构域，所述跨膜结构域可包含选自由以下组成的组的分子的跨膜区：T细胞受体(TCR)-α、TCR-β、CD3-ζ、CD3-ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134(Ox40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。

在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。

在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在某些示例性实施方案中，在合成跨膜结构域的每一末端都将发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

本文所述的跨膜结构域可以与以下组合：本文所述的任何抗原结合结构域、本文所述的任何共刺激信号传导结构域、本文所述的任何细胞内信号传导结构域或可包括在受试者CAR中的本文所述的任何其他结构域。

4.细胞内结构域

本公开的主题CAR还包括细胞内结构域。CAR的细胞结构域负责激活表达CAR的细胞(例如免疫细胞)的至少一种效应功能。细胞内结构域转导效应功能信号并指导细胞(例如免疫细胞)执行其专门的功能，例如伤害和/或破坏靶细胞。

CAR的细胞内结构域或胞质结构域负责激活表达CAR的细胞。用于本发明的细胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的胞质部分、共刺激分子和任何协同作用以启动T细胞中的信号转导的分子，以及这些元件的任何衍生物或变体和任何具有相同功能能力的合成序列。在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域和细胞内信号传导结构域。

细胞内信号传导结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的z链或其任何同源物、syk家族酪氨酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子，诸如CD2、CD3和CD28。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcγRin、FcεRI、Fc受体的胞质尾、携带免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的胞质受体及其组合。

细胞内结构域的其他实例包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常见FcRε、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγR1 la、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X9、0X40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3特异性结合CD83的配体、CD3、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKpSO(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD3α、CD3β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CDlib、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKpSO、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列及其任何组合。

细胞内结构域的额外的实例包括但不限于几种类型的各种其他免疫信号传导受体的细胞内信号传导结构域，所述免疫信号传导受体包括但不限于第一、第二和第三代T细胞信号传导蛋白，包括CD3、B7家族共刺激蛋白和肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族受体(参见例如，Park和Brentjens,J.Clin.Oncol.(2015)33(6):651-653)。此外，细胞内信号传导结构域可包括NK和NKT细胞使用的信号传导结构域(参见例如，Hermanson和Kaufman,Front.Immunol.(2015)6:195)，诸如NKpSO(B7-H6)的信号传导结构域(参见，例如，Zhang等人,J.Immunol.(2012)189(5):2290-2299)，以及DAP 12(参见，例如Topfer等人,J.Immunol.(2015)194(7):3201-3212)、NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z。

适用于本公开的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括任何期望的信号传导结构域，其响应于CAR的激活(即，被抗原和二聚化剂激活)提供不同且可检测的信号(例如，细胞产生的一种或多种细胞因子增加；靶基因转录的变化；蛋白质活性的变化；细胞行为的变化，例如，细胞死亡；细胞增殖；细胞分化；细胞存活；细胞信号传导反应的调节；等等)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个等)如下所述的GGAM基序。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域不与膜结合CAR共价连接，而是扩散在胞质中。

适用于本发明的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的细胞内信号传导多肽。在一些实施方案中，ITAM基序在细胞内信号传导结构域中重复两次，其中ITAM基序的第一个和第二个实例彼此相隔6至8个氨基酸。在一个实施方案中，主题CAR的细胞内信号传导结构域包含3个ITAM基序。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括含有免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)的人免疫球蛋白受体的信号传导结构域，诸如但不限于FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIC、FcγRIIIA、FcRL5(参见，例如，Gillis等人,Front(2014)Immunol.5:254)。

合适的细胞内信号传导结构域可以是含有ITAM基序的部分，其来源于含有GGAM基序的多肽。例如，合适的细胞内信号传导结构域可以是来自任何含有ITAM基序的蛋白质的含有ITAM基序的结构域。因此，合适的细胞内信号传导结构域不需要含有其来源的完整蛋白质的完整序列。合适的含有ITAM基序的多肽的实例包括但不限于：DAP12、FCER1G(Fcε受体Iγ链)、CD3δ(CD3δ)、CD3ε(CD3ε)、CD3γ(CD3γ)、CD3ζ(CD3ζ)和CD79A(抗原受体复合物相关蛋白α链)。

在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于DAP 12(也称为TYROBP；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；KARAP；PLOSL；DNAX-激活蛋白12；KAR-相关蛋白；TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；杀伤激活受体相关蛋白；等等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于FCεR1G(也称为FCRG；Fcε受体Iγ链；Fc受体γ链；fc-εRI-γ；fcRγ；fceRlγ；高亲和力免疫球蛋白ε受体亚基γ；免疫球蛋白E受体、高亲和力、γ链；等等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于T细胞表面糖蛋白CD3δ链(也称为CD3δ；CD3-DELTA；CD3抗原，δ亚基；CD3d抗原，δ多肽(TiT3复合物)；OKT3，δ链；T细胞受体T3δ链；T细胞表面糖蛋白CD3δ链；等等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ε链(也称为CD3ε、T细胞表面抗原T3/Leu-4ε链、T细胞表面糖蛋白CD3ε链、AI504783、CD3、CD3ε、T3e等)。

在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于T细胞表面糖蛋白CD3γ链(也称为CD3γ、T细胞受体T3γ链、CD3-GAMMA、T3G、γ多肽(TiT3复合物)等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于T细胞表面糖蛋白CD3ζ链(也称为CD3Z、T细胞受体T3ζ链、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域来源于CD79A(也称为B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链；CD79a抗原(免疫球蛋白相关α)；MB-1膜糖蛋白；Ig-α；膜结合免疫球蛋白相关蛋白；表面IgM相关蛋白；等等)。在一个实施方案中，适用于本公开的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括DAP10/CD28型信号传导链。在一个实施方案中，适用于本公开的主题CAR的细胞内信号传导结构域包括ZAP70多肽。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包括TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的胞质信号传导结构域。在一个实施方案中，CAR中的细胞内信号传导结构域包括人CD3ζ的胞质信号传导结构域。

a.共刺激结构域

在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)包含共刺激结构域，其是选自由以下组成的组的分子的共刺激结构域：CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其组合。

在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域包含CD28共刺激结构域或SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB和CD28共刺激结构域。

b.细胞内信号传导结构域

在某些实施方案中，细胞内结构域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，分离的核酸分子编码包含细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞内结构域可以来自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导结构域：T细胞受体(TCR)ζ、FcR-γ、FcR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε、CD3-ζ、CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域；或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

细胞内结构域的可容忍的变异将是本领域技术人员已知的，同时维持特定的活性。例如，在一些实施方案中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:59中示出的任何氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列。

5.铰链

CAR的铰链区是位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。在一些实施方案中，此结构域促进CAR的正确蛋白质折叠。铰链区是CAR的任选的组分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)可进一步包含铰链结构域。

在一些实施方案中，铰链结构域是选自由以下组成的组的蛋白质：CD8α、CD28铰链、抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区和人工间隔序列。在一个实施方案中，铰链结构域是CD8α铰链结构域。在一个实施方案中，铰链结构域是CD28铰链结构域。在一个实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:77或86的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含选自由SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:68、71-77和86组成的组的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本公开的CAR包括连接抗原结合结构域和跨膜结构域的铰链区，所述跨膜结构域进而连接至细胞内结构域。铰链区优选地能够支持抗原结合结构域识别并结合至靶细胞上的靶抗原(参见，例如，Hudecek等人,Cancer Immunol.Res.(2015)3(2):125-135)。在一些实施方案中，铰链区是柔性结构域，因此允许抗原结合结构域具有最佳地识别细胞(诸如肿瘤细胞)上的靶抗原的特定结构和密度的结构。铰链区的柔性允许铰链区采用许多不同的构象。在一些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方案中，铰链区是来源于受体的铰链区多肽(例如，CD8或CD28衍生的铰链区)。

铰链区的长度可以为约4个氨基酸至约50个氨基酸，例如，约4个氨基酸至约10个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约15个氨基酸至约20个氨基酸、约20个氨基酸至约25个氨基酸、约25个氨基酸至约30个氨基酸、约30个氨基酸至约40个氨基酸或约40个氨基酸至约50个氨基酸。

合适的铰链区可以容易地选择，并且可以具有许多合适长度中的任一种，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸，2个氨基酸至15个氨基酸，3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸，5个氨基酸至9个氨基酸，6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以为1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

E.生成CAR

本公开的CAR可使用化学方法来制备。例如，CAR可通过固相技术(Roberge J Y等人(1995)Science 269:202-204)来合成，从树脂上切割，并通过制备高效液相色谱法纯化。例如，可以根据制造商提供的说明使用ABI 431A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现自动合成

本公开的CAR可通过常规技术来合成。例如，可使用固相肽合成通过化学合成来合成CAR。这些方法采用固相或溶液相合成方法(参见例如，关于固相合成技术，J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,Rockford111.(1984)以及G.Barany和R.B.Merrifield,The Peptides:Analysis Synthesis,Biology editors E.Gross和J.Meienhofer第2卷Academic Press,New York,1980,第3-254页；并且关于经典溶液合成，MBodansky,Principles of Peptide Synthesis,Springer-Verlag,Berlin 1984，以及E.Gross和J.Meienhofer编辑,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,suprs,第1卷)。举例来说，本发明的CAR可使用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)固相化学通过直接掺入磷酸苏氨酸作为N-芴基甲氧基-羰基-O-苄基-L-磷酸苏氨酸衍生物来合成。

可通过重组技术通过将嵌合蛋白的N端或C端与具有期望生物学功能的选择的蛋白质或可选择的标志物的序列融合来制备包含与其他分子缀合的本公开的CAR的N端或C端融合蛋白。所得融合蛋白含有与如本文所述的选择的蛋白质或标志物蛋白质融合的本公开的CAR。可用于制备融合蛋白的蛋白质的实例包括免疫球蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血凝素(HA)和截短的myc。

本公开的CAR可使用生物表达系统来开发。这些系统的使用允许产生大量的随机肽序列文库，并从这些文库中筛选出与特定蛋白质结合的肽序列。可通过将编码随机肽序列的合成DNA克隆至适当的表达载体中来产生文库(参见Christian等人1992,J.Mol.Biol.227:711；Devlin等人,1990Science 249:404；Cwirla等人1990,Proc.Natl.Acad,Sci.USA,87:6378)。还可通过重叠肽的同时合成来构建文库(参见美国专利号4,708,871)。

在一个方面，本公开提供了与本文公开的CAR具有基本同源性的任何形式的CAR。优选地，“基本上同源的”CAR与本文公开的肽的氨基酸序列具有约50％的同源性，更优选具有约70％的同源性，甚至更优选具有约80％的同源性，更优选具有约90％的同源性，甚至更优选具有约95％的同源性，并且甚至更优选具有约99％的同源性。CAR可替代地通过重组方式或通过从较长的多肽上切割来制备。

根据本公开的CAR的变体可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)取代的变体，并且这种取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基，(ii)其中存在一个或多个修饰的氨基酸残基(例如通过取代基的连接而修饰的残基)的变体，(iii)其中肽是本公开的肽的替代剪接变体的变体，(iv)肽的片段，和/或(v)其中肽与另一种肽融合的变体，所述另一种肽诸如前导序列或分泌序列或者用于纯化(例如，His标签)或用于检测(例如，Sv5表位标签)的序列。片段包括经由原始序列的蛋白水解切割(包括多位点蛋白水解)生成的肽。变体可以是翻译后修饰的或化学修饰的。根据本文的教导，此类变体被认为属于本领域技术人员的知识范围之内。

如本领域所已知的，两个肽之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守的氨基酸取代与第二个多肽的序列进行比较来确定的。变体被定义为包括不同于原始序列的肽序列，优选地，每个感兴趣的片段与原始序列的残基差异小于40％，更优选地，每个感兴趣的片段与原始序列的残基差异小于25％，更优选地，每个感兴趣的片段的残基差异小于10％，最优选地，每个感兴趣的片段与原始蛋白质序列的残基差异仅为几个残基，并且同时与原始序列足够同源以保留原始序列的功能性和/或与TACA结合的能力。本公开包括与原始氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、90％或95％相似性或同一性的氨基酸序列。两个肽之间的同一性程度使用本领域技术人员熟知的计算机算法和方法来确定。两个氨基酸序列之间的同一性优选通过使用BLASTP算法[BLASTManual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894,Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]来确定。

本公开的CAR可以进行翻译后修饰。例如，落入本发明范围内的翻译后修饰包括信号肽切割、糖基化、乙酰化、异戊二烯化、蛋白水解、豆蔻酰化、蛋白质折叠和蛋白水解加工等。一些修饰或加工事件需要引入额外的生物机制。例如，通过将犬微粒体膜或非洲爪蟾卵提取物(美国专利号6,103,489)添加至标准翻译反应中来检查加工事件，诸如信号肽切割和核心糖基化。

在一些实施方案中，本公开的CAR可包括通过翻译后修饰或通过在翻译期间引入非天然氨基酸而形成的非天然氨基酸。多种方法可用于在蛋白质翻译期间引入非天然氨基酸。

本公开的CAR可以与其他分子(诸如蛋白质)缀合以制备融合蛋白。例如，这可通过合成N端或C端融合蛋白来实现，前提条件是所得融合蛋白保留了肽的功能。本公开的CAR可使用常规方法(诸如Reedijk等人The EMBO Journal 11(4):1365(1992)中描述的方法)来进行磷酸化。

还考虑了本公开的CAR的环状衍生物。环化可以允许肽呈现更有利的构象，以便与其他分子缔合。环化可使用本领域已知的技术来实现。例如，可在两个具有游离巯基的适当间隔的组分之间形成二硫键，或在一个组分的氨基和另一个组分的羧基之间形成酰胺键。环化也可使用含有偶氮苯的氨基酸来实现，如Ulysse,L.,等人,J.Am.Chem.Soc.1995,117,8466-8467中描述。形成键的组分可能是氨基酸的侧链、非氨基酸组分或两者的组合。在本公开的一个实施方案中，环肽可以在右位置包含β转角。可通过在右位置处添加氨基酸Pro-Gly将β-转角引入至本发明的肽中。可能期望生产一种比如上所述含有肽键连接的环肽更具有柔性的环肽。可通过在肽的右位置和左位置处引入半胱氨酸并在两个半胱氨酸之间形成二硫桥来制备更具有柔性的肽。两个半胱氨酸被排列为使得β片层不变形并且不转动。由于二硫键的长度以及β片层部分中较少数量的氢键，因此肽更具有柔性。环肽的相对柔性可通过分子动力学模拟来确定。

本公开的一个方面提供了与靶蛋白融合或整合至靶蛋白的CAR，和/或能够将CAR引导至期望的细胞组分或细胞类型或组织的靶向结构域。CAR还可含有额外的氨基酸序列或结构域。从各种组分来自不同的来源的意义上说，CAR是重组的，因此在自然界中不会一起发现(即，是异源的)。

在一个实施方案中，靶向结构域可以是膜跨越结构域(membrane spanningdomain)、膜结合结构域或指导蛋白质与例如囊泡或细胞核缔合的序列。在一个实施方案中，靶向结构域可以将肽靶向至特定的细胞类型或组织。例如，靶向结构域可以是细胞表面配体或针对靶组织(例如，骨、再生骨、退化骨、软骨)的细胞表面抗原的抗体。靶向结构域可以将本发明的肽靶向至细胞组分。

IV.核酸和表达载体

本公开的一个方面涉及一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和细胞内信号传导结构域。

本公开的一个方面提供了一种编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，其中抗原结合结构域包含来源于凝集素的TACA结合结构域；并且抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号传导区；以及细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，编码抗原结合结构域的第一核酸序列可操作地连接至编码跨膜结构域的第二核酸，并且进一步可操作地连接至编码共刺激信号传导结构域和/或细胞内信号传导结构域的第三核酸序列。

本公开的另一个方面提供了一种分离的核酸，其编码由本文公开的修饰的细胞表达的CAR或本文公开的CAR的多肽。在一些实施方案中，核酸编码的CAR不诱导强直性信号传导。在一些实施方案中，表达编码本文公开的CAR的核酸的修饰的细胞不太容易受到CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子的产生。

在一些实施方案中，核酸编码包含一个或多个TACA结合结构域的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含两个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含三个TACA结合结构域。在一个实施方案中，抗原结合结构域包含四个TACA结合结构域。TACA结合结构域可包含可以特异性地结合TACA的任何肽、蛋白质、凝集素、凝集素片段、抗体、抗体片段、小分子、核酸等。在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含突变，所述突变选自取代、缺失或插入。

在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含缺失。在一个实施方案中，缺失位于TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。在一个实施方案中，缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。在一个实施方案中，缺失为至少约10个氨基酸、至少约18个氨基酸、或至少约36个氨基酸。在一个实施方案中，缺失为至少约36个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于N末端并且为至少约10个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸，并且位于C末端并且为至少约10个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含缺失，所述缺失去除TACA结合结构域(TBD)中的二硫键键合的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的表达与包含野生型TBD的CAR的表达相似。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域的碳水化合物结合结构域中的缺失，所述TACA结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ IDNO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合包含与SEQ ID NO:34-39具有至少90％同源性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含表2或表3中公开的氨基酸序列。

抗原结合结构域可以可操作地连接至CAR的另一个结构域，诸如跨膜结构域、共刺激信号传导结构域或细胞内信号传导结构域(每个结构域均在本文其他地方描述)，以在细胞中表达。本文所述的抗原结合结构域可以与以下组合：任何跨膜结构域、任何共刺激信号传导结构域、任何细胞内信号传导结构域或可包括在本公开的CAR中的本文所述的任何其他结构域。

A.核酸

编码本公开的嵌合抗原受体的分离的核酸序列可使用本领域已知的许多重组方法中的任一种来获得，诸如，例如，通过筛选表达所述基因的细胞文库、通过从已知包括所述基因的载体递送所述基因、或通过使用标准技术直接从含有所述基因的细胞和组织中分离所述基因。或者，感兴趣的基因可以合成地产生，而不是克隆。

分离的核酸可包含任何类型的核酸，包括但不限于DNA和RNA。例如，在一个实施方案中，组合物包含分离的DNA分子，包括例如分离的cDNA分子，其编码本公开的肽或其功能片段。在一个实施方案中，组合物包含编码本公开的肽或其功能片段的分离的RNA分子。

可以修饰本公开的核酸分子以提高其在血清中或用于细胞培养的生长培养基中的稳定性。可以添加修饰来增强稳定性、功能性和/或特异性，并最大程度地减小本公开的核酸分子的免疫刺激性。如，为了增强稳定性，可以稳定3'-残基以防止降解，例如，可以选择它们使得它们由嘌呤核苷酸组成，特别是腺苷或鸟苷核苷酸。或者，用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸(例如用2'-脱氧胸苷取代尿苷)是可耐受的，并且不影响分子的功能。在本公开的一个实施方案中，核酸分子可以含有至少一种修饰的核苷酸类似物。例如，可通过掺入修饰的核苷酸类似物来稳定末端。

核苷酸类似物的非限制性实例包括糖和/或骨架修饰的核糖核苷酸(即包括对磷酸盐-糖骨架的修饰)。例如，天然RNA的磷酸二酯键可被修饰以包括至少一个氮或硫杂原子。在优选的骨架修饰的核糖核苷酸中，连接至相邻核糖核苷酸的磷酸酯基团被修饰的基团(例如硫代磷酸酯基团)替换。在优选的糖修饰的核糖核苷酸中，2'OH-基团被选自H、OR、R、卤基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或ON的基团替换，其中R是Ci-Ce烷基、烯基或炔基并且卤基是F、Cl、Br或I。

其他修饰的实例是核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有至少一个非天然存在的核碱基来代替天然存在的核碱基的核糖核苷酸。可以修饰碱基以阻断腺苷脱氨酶的活性。示例性修饰的核碱基包括但不限于在5位置处修饰的尿苷和/或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位置处修饰的腺苷和/或鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-烷基化和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷是合适的。应注意，上述修饰可以组合。

例如，核酸分子包含以下化学修饰中的至少一种：一个或多个核苷酸的2'-H、2'-0-甲基或2'-OH修饰。在某些实施方案中，本公开的核酸分子可具有增强的核酸酶抗性。为了增加核酸酶抗性，核酸分子可包括例如2'-修饰的核糖单元和/或硫代磷酸酯键。例如，2'羟基(OH)可被多种不同的“氧基”或“脱氧”取代基修饰或替换。为了增加核酸酶抗性，本公开的核酸分子可包括2'-0-甲基、2'-氟、2'-0-甲氧基乙基、2'-0-氨基丙基、2'-氨基和/或硫代磷酸酯键。包括锁核酸(LNA)、乙烯核酸(ENA)(例如2'-4'-乙烯-桥接核酸)和某些核碱基修饰(诸如2-氨基-A、2-硫代(例如，2-硫代-U)、G-夹修饰)也可以增加对靶标的结合亲和力。

在一个实施方案中，核酸分子包括2'-修饰的核苷酸，例如2'-脱氧、2'-脱氧-2'-氟、2'-0-甲基、2'-0-甲氧基乙基(2'-0-MOE)、2'-0-氨基丙基(2'-0-AP)、2'-0-二甲基氨基乙基(2'-0-DMAOE)、2'-0-二甲基氨基丙基(2'-0-DMAP)、2'-0-二甲基氨基乙基氧基乙基(2'-0-DMAEOE)或2'-0-N-甲基乙酰胺基(2'-0-MA)。在一个实施方案中，核酸分子包括至少一个2'-0-甲基修饰的核苷酸，并且在一些实施方案中，核酸分子的所有核苷酸都包括2'-0-甲基修饰。

在一些实施方案中，本公开的核酸分子优选具有以下性质中的一种或多种：本文讨论的核酸剂包括未修饰的RNA和DNA以及已被修饰(例如以提高功效)的RNA和DNA以及核苷替代物的聚合物。

未修饰的RNA是指其中核酸组分(即糖、碱基和磷酸部分)与天然存在的核酸组分(优选人体中天然存在的核酸组分)相同或基本相同的分子。本领域将稀有或不常见但天然存在的RNA称为修饰的RNA，参见，例如，Limbach等人,Nucleic Acids Res.,1994,22:2183-2196。此类稀有或不常见的RNA(通常被称为修饰的RNA)通常是转录后修饰的结果，并属于如本文所用的术语未修饰的RNA。如本文所用的修饰的RNA是指其中核酸的一种或多种组分(即糖、碱基和磷酸部分)与天然存在的核酸组分不同(优选与人体中天然存在的核酸组分不同)的分子。尽管它们被称为“修饰的RNA”，但由于修饰，它们当然会包括严格来说不是RNA的分子。核苷替代物是其中核糖磷酸酯骨架被非核糖磷酸酯构建体替换的分子，所述非核糖磷酸酯构建体允许碱基以正确的空间关系存在，使得杂交与在核糖磷酸酯骨架中看到的基本相似(例如，核糖磷酸酯骨架的不带电模拟物)。本公开的核酸的修饰可以存在于磷酸基团、糖基团、骨架、N端、C端或核碱基中的一个或多个处。

B.表达载体

在一个方面，本公开提供了一种表达构建体，其包含编码本文公开的CAR的分离的核酸。在本公开的一些实施方案中，本文所述的分离的核酸包含表达载体；和/或体外转录的RNA。在另一个实施方案中，表达构建体包含编码本文所述的CAR的分离的核酸。

编码本发明的CAR的天然或合成的核酸的表达通常通过将编码肽或其部分的核酸可操作地连接至启动，子并将构建体掺入至表达载体中来实现。待使用的载体适合于在真核细胞中复制并且任选地整合。典型的载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调控期望的核酸序列的表达的启动子。

本公开的载体还可以使用标准基因递送方案用于核酸免疫和基因疗法。用于基因递送方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，所述专利通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，本发明提供了一种基因疗法载体。

本公开的分离的核酸可以克隆至多种类型的载体中。例如，可将核酸克隆至包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体和测序载体。

此外，可以病毒载体的形式将载体提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且在例如Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，合适的载体含有在至少一种生物体中发挥作用的复制起始点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一个或多个可选择的标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利号6,326,193)。

1.基于病毒的系统

在一些实施方案中，表达构建体是选自由以下组成的组的病毒载体：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，表达构建体是慢病毒载体。在一些实施方案中，表达构建体是自我灭活慢病毒载体。在一些实施方案中，表达构建体包含编码本文所述的CAR的分离的核酸。

已经开发了许多用于将基因转移至哺乳动物细胞中的基于病毒的系统。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了方便的平台。可使用本领域已知的技术将选择的基因插入至载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组的病毒并将其体内或离体递送至的受试者细胞中。本领域已知多种逆转录病毒系统。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。本领域已知多种腺病毒载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。

例如，来源于逆转录病毒(诸如慢病毒)的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期、稳定的整合以及转基因在子细胞中的传播。慢病毒载体比来源于癌逆转录病毒(诸如鼠白血病病毒)的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。在一个实施方案中，组合物包括来源于腺相关病毒(AAV)的载体。腺相关病毒(AAV)载体已成为用于治疗各种病症的有力的基因递送工具。AAV载体具有多种使其理想地适合基因疗法的特征，包括缺乏致病性、最小的免疫原性和以稳定且高效的方式转导有丝分裂后细胞的能力。通过选择AAV血清型、启动子和递送方法的适当组合，可以将AAV载体中含有的特定基因的表达特异性地靶向一种或多种类型的细胞。

2.控制元件

在一些实施方案中，载体还包括常规控制元件，所述常规控制元件以允许其在用质粒载体转染的细胞或用本发明产生的病毒感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接至转基因。如本文所用，“可操作地连接”序列包括与感兴趣的基因相邻的表达控制序列和反式或远距离作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效的RNA加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化(poly A)信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即科扎克共识序列(Kozakconsensus sequence))；增强蛋白质稳定性的序列；以及当期望时，增强编码产物的分泌的序列。本领域已知并可以利用的大量的表达控制序列，包括启动子，其是天然的、组成型、诱导型的和/或组织特异性的。

额外的启动子元件(例如增强子)调控转录起始的频率。通常，它们位于起始位点上游30bp-110bp的区域，但最近已示出多种启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，因此当元件倒置或相对于彼此移动时仍保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。根据启动子，各个元件似乎可以协同或独立地发挥作用来激活转录。

3.启动子

在一些实施方案中，表达构建体进一步包含启动子。启动子可以选自：EF-lα启动子、T细胞受体α(TRAC)启动子、白细胞介素2(IL-2)启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子或劳氏肉瘤病毒启动子。

立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列是强组成型启动子序列的一个实例，其能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延长生长因子-1a(EF-la)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒启动子以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限制组成型启动子的使用。诱导型启动子也被视为本发明的一部分。使用诱导型启动子提供了一种分子开关，其能够在期望这种表达时开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望表达时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

载体上发现的增强子序列也调控载体中含有的基因的表达。通常，增强子与蛋白质因子结合以增强基因的转录。增强子可能位于其调控的基因的上游或下游。增强子也可以是组织特异性的以增强特定细胞或组织类型中的转录。在一个实施方案中，本发明的载体包含一个或多个增强子以增强载体内存在的基因的转录。

4.可选择的标志物

为了评估肽的表达，待引入至细胞的表达载体还可含有可选择的标志物基因或报告基因或两者，以促进从需要通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标志物可以在携带在单独的DNA片段上并用于共转染程序。可选择的标志物和报告基因两者均可与适当的调控序列侧接，以实现宿主细胞中的表达。有用的可选择的标志物包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。

报告基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评估调控序列的功能。一般来说，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或不由受体生物体或组织表达的基因，并且所述报告基因编码的多肽的表达表现为一些容易检测的性质，例如，酶活性。在DNA被引入至受体细胞后，在合适的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyl transferase)、分泌性碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是熟知的，并且可使用已知技术来制备或商购获得。一般来说，显示出最高水平的报告基因表达的具有最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以与报告基因连接并用于评估剂调控启动子驱动的能力。

V.修饰的细胞

A.CAR-T细胞耗竭

T细胞耗竭的根本原因是持续的抗原暴露导致连续的TCR信号传导。本公开提供了CAR T细胞，其在治疗疾病或病状的背景下经由选择性调节(例如，减少)CAR细胞表面表达(防止聚集)而不经历抗原诱导的强直性信号传导和耗竭。因此，本公开的CAR T细胞将维持、恢复或具有增强的功能。“T细胞耗竭”是指T细胞功能下降，其可能由于感染(例如，慢性感染)或疾病而发生。T细胞耗竭与PD-1、TIM-3和LAG-3表达增加、细胞凋亡以及细胞因子分泌减少有关。因此，术语“改善T细胞耗竭”、“抑制T细胞耗竭”、“减少T细胞耗竭”等是指T细胞功能恢复的状态，其特征是以下中的一种或多种：PD-1、TIM-3和LAG-3中一种或多种的表达和/或水平降低；记忆细胞形成增加和/或记忆标志物(例如，CD62L)的维持；预防细胞凋亡；抗原诱导型细胞因子(例如，IL-2)的产生和/或分泌增加；细胞毒性/杀伤能力增强；对低表面抗原的肿瘤靶标的识别增加；响应抗原的增殖增强。

表达CAR的修饰的细胞由于受体聚集而经历强直性、抗原非依赖性信号传导，并且复制T细胞耗竭的基本生物学，如高水平的PD-1、TIM-3和LAG-3表达、抗原诱导的细胞因子产生减少和过度的程序性细胞死亡所示。由于强直性信号传导高度依赖于CAR T细胞中的CAR受体水平，因此可以通过控制CAR表达水平来调控强直性信号传导的水平(例如，体外或体内)。由于强直性信号传导高度依赖于CAR受体水平，因此精确控制CAR表达水平也精确调控强直性信号传导水平。因此，本公开内容提供了具有突变的抗原结合结构域的CAR，其防止TACA CAR在质膜处聚集，从而预防强直性信号传导。因此，在本公开的CAR中工程化的结构修饰调节修饰的细胞中的嵌合受体表面表达，从而防止或逆转CAR T细胞耗竭并恢复修饰的CAR T细胞功能。

本公开内容不受维持、恢复或增强(例如延长)的CAR T细胞功能类型的限制。实际上，包含经修饰以表达包含经修饰的TACA结合结构域的CAR的CAR T细胞的组合物及其利用方法可用于维持、恢复或增强CAR T细胞功能，包括但不限于针对肿瘤细胞的细胞毒性活性；促进CAR T细胞存活和功能；诱导细胞因子表达，诸如表达白细胞介素-2(IL-2)以促进T细胞存活，表达Fas配体(FasL)和/或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)以诱导肿瘤细胞凋亡，和/或诱导干扰素(IFN)-γ以激活先天免疫反应(例如针对癌症)；和/或增强诱导细胞周期停滞和/或细胞凋亡。在一些实施方案中，本公开的CAR T细胞使癌细胞对细胞周期停滞和/或细胞凋亡的诱导敏感，包括通常对此类诱导刺激具有抗性的细胞。

本公开的一个方面提供了遗传修饰的(例如，工程化)细胞，其包括并稳定地表达本公开的主题CAR。在一个方面，修饰的细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，所述CAR包含：选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，修饰的细胞包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体。

本公开的一个方面提供了一种修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中：CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；和/或细胞内信号传导结构域；并且修饰的细胞不太容易受到TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含突变，所述突变选自取代、缺失或插入。在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含缺失。在一些实施方案中，缺失位于TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。

在一些实施方案中，缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。在一些实施方案中，缺失为至少约10个氨基酸、至少约18个氨基酸、或至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，缺失为至少约36个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于C末端并且为至少约10个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸，并且位于C末端并且为至少约10个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含缺失，所述缺失去除TACA结合结构域(TBD)中的二硫键键合的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的表达与包含野生型TBD的CAR的表达相似。在一些实施方案中，与包含有包含野生型TBD的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的修饰的细胞表现出降低的强直性信号传导。

在一些实施方案中，与包含有包含野生型TBD的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的修饰的细胞不太容易经历耗竭。在一些实施方案中，与包含有包含野生型TBD的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的修饰的细胞不太容易经历强直性TACACAR诱导的耗竭。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个TACA结合结构域。在一些实施方案中，TACA-结合结构域来源于凝集素。在该实施方案中，凝集素选自：半乳糖凝集素、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素、选择素；C型凝集素；CD301、多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)、L-PHA(菜豆白细胞凝集素)；E-PHA(菜豆红细胞凝集素)；番茄凝集素(tomato lectin)(番茄凝集素(Lycopersicon esculentum lectin)；LEA)；花生凝集素(peanut lectin)(花生凝集素(Arachis hypogaea Agglutinin)；PNA)；马铃薯凝集素(potato lectin)(马铃薯凝集素(Solanum tuberosum lectin))、美洲商陆丝裂原(pokeweed mitogen)(美洲商陆凝集素(Phytolacca American lectin))、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)(麦胚凝集素(Triticum Vulgaris lectin))；木菠萝凝集素(Artocarpus polyphemus lectin)(木菠萝凝集素(Jacalin letin))；野豌豆凝集素(VVA)；蜗牛凝集素(HPA)；多花紫藤凝集素(WFA)；接骨木凝集素(SNA)、BC2L-CNt(来自革兰氏阴性细菌新洋葱伯克霍尔德氏菌的凝集素)、山槐白细胞凝集素(MAL)、毡毛小脆柄菇凝集素(PVL)、齐整小核菌凝集素(SRL)、锯齿麒麟菜凝集素(ESA)、CLEC17A(保护素)、橙黄网胞盘菌凝集素、无梗接骨木凝集素(SSA)、金钱薄荷凝集素(Gleheda)、黑桑凝集素(Morniga G)、南欧丹参凝集素、Salvia bogotensis凝集素、蝶花鼠尾草凝集素、海州常山凝集素、贝壳花凝集素、加纳籽(GsLA4)、四棱豆(酸性WBAI)、相思子凝集素、尾穗苋凝集素、白果苋凝集素、秋蕾丽兰凝集素、木菠萝凝集素、桑橙凝集素、野波罗蜜凝集素、双花扁豆凝集素、双花扁豆凝集素、大豆凝集素和双孢蘑菇凝集素。

在一些实施方案中，凝集素是选自由以下组成的组的半乳糖凝集素：半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-2、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-5、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-9、半乳糖凝集素-10、半乳糖凝集素-11、半乳糖凝集素-12、半乳糖凝集素-13、半乳糖凝集素-14和半乳糖凝集素-15。在一些实施方案中，凝集素是选自由以下组成的组的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(唾液酸粘附素)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-2(CD22)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-3(CD33)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-4(髓鞘相关糖蛋白)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-6、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-8、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-10、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-11、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-12、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-13、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-14、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-16、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-17、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素E、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素G和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素H。

在一些实施方案中，凝集素是选自由以下组成的组的多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)：ppGalNAc-T1(GALNT1)、ppGalNAc-T2(GALNT2)、ppGalNAc-T3(GALNT3)、ppGalNAc-T4(GALNT4)、ppGalNAc-T5(GALNT5)、ppGalNAc-T6(GALNT6)、ppGalNAc-T7(GALNT7)、ppGalNAc-T8(GALNT8)、ppGalNAc-T9(GALNT9)、ppGalNAc-T10(GALNT10)、ppGalNAc-T12(GALNT12)、ppGalNAc-T13(GALNT13)、ppGalNAc-T14(GALNT14)、ppGalNAc-T15(GALNT15)、ppGalNAc-T16(GALNT16)、ppGalNAc-T17(GALNT17)、ppGalNAc-T18(GALNT18)、ppGalNAc-T样5(GALNTL5)和ppGalNAc-T样6(GALNTL6)。

在一些实施方案中，抗原结合结构域选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Thomsen-nouveau(Tn)表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewisx/a、二唾液酸基-Lewisx/a、唾液酸基6-磺基Lexisx、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。

在一些实施方案中，抗原结合结构域选择性地靶向β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、Tn表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、GalNAcα-丝氨酸、GalNAcα-苏氨酸、GalNAc或GalNAcβ1。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含抗原结合结构域的TACA结合结构域中的缺失，所述TACA结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合包含与SEQ ID NO:34-39具有至少90％同源性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)包含跨膜结构域，所述跨膜结构域可包含选自由以下组成的组的分子的跨膜区：T细胞受体(TCR)-α、TCR-β、CD3-ζ、CD3-ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134(Ox40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ IDNO:78或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在某些示例性实施方案中，在合成跨膜结构域的每一末端都将发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

在某些实施方案中，细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)包含共刺激结构域，其是选自由以下组成的组的分子的共刺激结构域：CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其组合。

在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域包含CD28共刺激结构域或SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB和CD28共刺激结构域。

在某些实施方案中，细胞内结构域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，分离的核酸分子编码包含细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞内结构域可以来自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导结构域：T细胞受体(TCR)ζ、FcR-γ、FcR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε、CD3-ζ、CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域；或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

细胞内结构域的可容忍的变异将是本领域技术人员已知的，同时维持特定的活性。例如，在一些实施方案中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:59中示出的任何氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列。

CAR的铰链区是位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。在一些实施方案中，此结构域促进CAR的正确蛋白质折叠。铰链区是CAR的任选的组分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)可进一步包含铰链结构域。

在一些实施方案中，铰链结构域是选自由以下组成的组的蛋白质：CD8α、CD28铰链、抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区和人工间隔序列。在一个实施方案中，铰链结构域是CD8α铰链结构域。在一个实施方案中，铰链结构域是CD28铰链结构域。在一个实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:77或86的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含选自由SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:68、71-77和86组成的组的氨基酸序列。

本公开的一个方面提供了一种修饰的细胞，所述细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的细胞中表达的分离的核酸包含表达载体；和/或体外转录的RNA。

在一些实施方案中，CAR选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewisx/a、二唾液酸基-Lewisx/a、唾液酸基6-磺基Lexisx、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。在一些实施方案中，CAR选择性地靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖、GalNAc、Tn抗原、GalNAcα-ser、GalNAc或GalNAcβ1。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比，包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞显示出降低的强直性信号传导。

在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是遗传工程化T淋巴细胞(T细胞)、调节性T细胞(Treg)、未致敏T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)和能够产生治疗相关后代的巨噬细胞。在一些实施方案中，细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。在一个实施方案中，细胞是T细胞。在一个实施方案中，修饰的细胞是自体细胞。

可通过用包括本公开的核酸的表达载体稳定地转染宿主细胞来产生修饰的细胞(例如，包含主题CAR的细胞)。生成本公开的修饰的细胞的额外的方法包括但不限于化学转化方法(例如，使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转化方法(例如，电穿孔、光学转化、基因电转移和/或流体动力学递送)和/或基于颗粒的方法(例如，刺穿转染、使用基因枪和/或磁转染)。表达本公开的主题CAR的转染细胞可以离体扩增。

在一些实施方案中，通过使细胞与编码如本文所述的TACA CAR的分离的核酸接触来对细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将核酸序列递送至细胞。例如，表达本发明的肽的逆转录病毒和慢病毒载体可使用转导细胞作为载剂或使用包封的、结合的或裸露的载体的无细胞的局部或全身递送而被递送至不同类型的真核细胞中以及递送至组织和整个生物体中。所使用的方法可出于需要稳定表达或稳定表达足够的任何目的。

在其他实施方案中，使用体外转录的mRNA将核酸序列递送至细胞。体外转录的mRNA可使用转染细胞作为载剂或使用包封的、结合的或裸露的mRNA的无细胞的局部或全身递送而被递送至不同类型的真核细胞中以及递送至组织和整个生物体中。所使用的方法可出于需要瞬时表达或瞬时表达足够的任何目的。

在某些实施方案中，细胞可以是可以表达期望的肽的任何合适的细胞类型。在某些实施方案中，修饰的细胞用于将细胞引入至受体的方法中。在某些实施方案中，关于受体，细胞是自体的、同种异体的、同基因或异种的。

所公开的组合物和方法可应用于癌症、干细胞、急性和慢性感染以及自身免疫性疾病领域中的基础研究和疗法中的T细胞活性的调节，包括评估遗传修饰的T细胞杀伤靶标癌细胞的能力。

B.生成修饰的细胞的方法

在一个方面，本公开提供了一种用于生成本文公开的修饰的细胞的方法，所述方法包括将编码CAR或双特异性融合蛋白的分离的核酸或本公开的表达构建体引入至细胞中。

可通过用包括本公开的核酸的表达载体稳定地转染宿主细胞来产生修饰的细胞(例如，包含主题CAR或双特异性融合蛋白的细胞)。生成本公开的修饰的细胞的额外的方法包括但不限于化学转化方法(例如，使用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转化方法(例如，电穿孔、光学转化、基因电转移和/或流体动力学递送)和/或基于颗粒的方法(例如，刺穿转染、使用基因枪和/或磁转染)。表达本公开的主题CAR或双特异性融合蛋白的转染细胞可以离体扩增。

在一些实施方案中，通过使细胞与编码如本文所述的CAR或双特异性融合蛋白的分离的核酸接触来对细胞进行遗传修饰。在一些实施方案中，使用逆转录病毒或慢病毒载体将核酸序列递送至细胞。例如，表达本发明的肽的逆转录病毒和慢病毒载体可使用转导细胞作为载剂或使用包封的、结合的或裸露的载体的无细胞的局部或全身递送而被递送至不同类型的真核细胞中以及递送至组织和整个生物体中。所使用的方法可出于需要稳定表达或稳定表达足够的任何目的。

在其他实施方案中，使用体外转录的mRNA将核酸序列递送至细胞。体外转录的mRNA可使用转染细胞作为载剂或使用包封的、结合的或裸露的mRNA的无细胞的局部或全身递送而被递送至不同类型的真核细胞中以及递送至组织和整个生物体中。所使用的方法可出于需要瞬时表达或瞬时表达足够的任何目的。

在某些实施方案中，细胞可以是可以表达期望的肽的任何合适的细胞类型。在某些实施方案中，修饰的细胞用于将细胞引入至受体的方法中。在某些实施方案中，关于受体，细胞是自体的、同种异体的、同基因或异种的。

所公开的组合物和方法可应用于癌症、干细胞、急性和慢性感染以及自身免疫性疾病领域中的基础研究和疗法中的T细胞活性的调节，包括评估遗传修饰的T细胞杀伤靶标癌细胞的能力。

将基因引入细胞并在细胞中表达的方法是本领域已知的。在表达载体的的上下文中，可通过本领域的任何方法将载体容易地引入至宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物方式将表达载体转移至宿主细胞中。

1.物理方法

用于将多核苷酸引入至宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人(2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York)。用于将多核苷酸引入至宿主细胞的优选方法是磷酸钙转染。

2.生物方法

用于将感兴趣的多核苷酸引入至宿主细胞的生物方法包括使用DNA载体和RNA载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入至哺乳动物(例如，人)细胞的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利号5,350,674和5,585,362。

在一些实施方案中，通过表达载体将编码本公开的主题CAR或双特异性融合蛋白的核酸引入至细胞中。本文提供了包含编码主题CAR(例如，TACA CAR)或双特异性融合蛋白的核酸的表达载体。合适的表达载体包括慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体、工程化杂交病毒、裸DNA，包括但不限于转座子介导的载体，诸如睡美人(Sleeping Beauty)、Piggyback和整合酶，诸如Phi31。一些其他合适的表达载体包括单纯疱疹病毒(HSV)和逆转录病毒表达载体。

腺病毒表达载体基于腺病毒，其整合至基因组DNA中的能力低，但转染宿主细胞的效率高。腺病毒表达载体含有的腺病毒序列足以：(a)支持表达载体的包装，以及(b)最终在宿主细胞中表达主题CAR。在一些实施方案中，腺病毒基因组是36kb、线性、双链DNA，其中可以插入外来DNA序列(例如，编码TACA-CAR或双特异性融合蛋白的核酸)来取代大片段的腺病毒DNA，以便制备本发明的表达载体。参见，例如，Danthinne和Imperiale,Gene Therapy7(20):1707-1714(2000)。

另一种表达载体基于腺相关病毒，其利用腺病毒偶联系统。这种AAV表达载体具有整合至宿主基因组中的高频率。所述AAV表达载体可以感染非分裂细胞，因此使所述AAV表达载体可用于例如在组织培养物中或在体内将基因递送至哺乳动物细胞中。AAV载体具有广泛的感染宿主范围。关于AAV载体的生成和使用的详细信息在美国专利号5,139,941和4,797,368中进行了描述。

逆转录病毒表达载体能够整合至宿主基因组中，递送大量的外来遗传物质，感染广泛的物种范围和细胞类型，并被包装在特殊的细胞系中。通过将核酸(例如，编码TACA-CAR或双特异性融合蛋白的核酸)插入至病毒基因组的某些位置以产生复制缺陷型病毒，从而构建逆转录病毒载体。尽管，逆转录病毒载体能够感染广泛多种细胞类型，但主题CAR或双特异性融合蛋白的整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂。

慢病毒载体来源于慢病毒，其是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env外，还含有其他具有调控或结构功能的基因。参见，例如，美国专利号6,013,516和5,994,136。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒(HTV-1、HTV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。通过多重减弱HIV毒力基因来生成慢病毒载体，例如，删除基因env、vif、vpr、vpu和nef，使载体在生物上是安全的。慢病毒载体能够感染非分裂细胞，并可以用于例如编码主题CAR或双特异性融合蛋白的核酸的体内和离体基因转移和表达(参见，例如，美国专利号5,994,136)。

可通过本领域技术人员已知的任何方式将包括本公开的核酸的表达载体引入至宿主细胞中。如果期望，表达载体可包括用于转染的病毒序列。或者，可通过融合、电穿孔、基因枪、转染、脂质转染等引入表达载体。在引入表达载体之前，宿主细胞可以在培养中生长和扩增，随后进行适当的处理以引入和整合载体。然后扩增宿主细胞，并且可以借助于载体中存在的标志物筛选宿主细胞。

可使用的各种标志物是本领域已知的，并且可包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素(hygromycin)抗性等。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用。在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞或其前体，例如，T细胞、NK细胞或NKT细胞。

3.化学方法

用于将多核苷酸引入至宿主细胞的化学方式包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球(microspheres)、珠子、以及基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。

在利用非病毒递送系统的情况下，示例性的递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂用于将核酸引入至宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以被包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸均缔合的连接分子连接至脂质体、包裹在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合、或者以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以双层结构、胶束或“折叠”结构存在。它们也可仅散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，其可以是天然存在的脂质或合成脂质。例如，脂质包括细胞质中天然存在的脂肪滴以及含有长链脂肪烃及其衍生物的化合物类别，诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质储备溶液可在约-20℃的温度下储存。由于氯仿比甲醇更容易蒸发，因此氯仿被用作唯一的溶剂。“脂质体”是一个通用术语，其涵盖了通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以是具有囊泡结构，所述囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有多个由水性介质分离的脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前会经历自我重排，并将水和溶解的溶质包裹在脂质双层之间。Ghosh等人,Glycobiology 5:505-10(1991)。然而，还涵盖了在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅以脂质分子的非均匀聚集体的形式存在。还考虑了脂质体转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。

无论使用何种方法将外源核酸引入至宿主细胞，为了确认重组DNA序列在宿主细胞中的存在，可以进行各种测定。此类测定包括例如本领域技术人员熟知的“分子生物学”测定，诸如南方印迹法和北方印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，诸如例如通过免疫学方式(ELISA和蛋白质印迹法)或通过本文所述的测定来检测特定肽是否存在以鉴定落入本发明范围内的剂。

此外，可通过任何方式引入核酸，诸如转导扩增的T细胞、转染扩增的T细胞和电穿孔扩增的T细胞。可通过一种方法引入一种核酸，并且可通过不同的方法将另一种核酸引入至T细胞。

4.RNA

与更传统的质粒或病毒方法相比，RNA有几个优势。来自RNA来源的基因表达不需要转录，并且转染后快速产生蛋白质产物。此外，由于RNA仅需进入细胞质而不是细胞核，因此典型的转染方法导致了极高的转染率。此外，基于质粒的方法要求驱动感兴趣的基因的表达的启动子在研究的细胞中具有活性。

本发明的RNA转染方法的一个优势是RNA转染基本上是瞬时的并且不需要载体。RNA转基因可在短暂的体外细胞激活后被递送至淋巴细胞，并在其中表达为最小表达盒而无需任何额外的病毒序列。在这些条件下，转基因不太可能整合至宿主细胞基因组中。由于RNA的转染效率及其均匀地修饰整个淋巴细胞群的能力，因此无需进行细胞克隆。

用体外转录的RNA(TVT-RNA)对宿主细胞进行遗传修饰利用了两种不同的策略，这两种策略都已在各种动物模型中陆续进行了测试。通过脂质转染或电穿孔的方式用体外转录的RNA转染细胞。期望使用各种修饰来稳定IVT-RNA，以便实现转移的IVT-RNA的延长表达。文献中已知一些IVT载体，其在标准化方式中用作体外转录的模板，并且所述IVT载体已经遗传修饰以产生稳定的RNA转录物。

目前本领域中使用的方案基于具有以下结构的质粒载体：能够进行RNA转录的5'RNA聚合酶启动子，随后是感兴趣的基因，其3'和/或5'侧接非翻译区(UTR)，以及含有50-70个A核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒(3'polyadenyl cassette)。在体外转录之前，环状质粒在聚腺嘌呤基盒下游被II型限制性酶线性化(识别序列对应于切割位点)。因此，聚腺嘌呤基盒对应于转录物中后续的poly(A)序列。作为该程序的结构，一些核苷酸在线性化后仍作为酶切位点的一部分保留，并延长或掩盖3'末端的poly(A)序列。还不清楚这种非生理性突出端是否会影响这种构建体在细胞内产生的蛋白质的量。

在一个实施方案中，编码本公开的CAR或双特异性融合蛋白并且引入至本公开的细胞中的分离的核酸包含RNA。在一个实施方案中，RNA是mRNA。在一个实施方案中，RNA是体外转录的(IVT)RNA。RNA是使用聚合酶链式反应(PCR)生成的模板通过体外转录产生的。任何来源的感兴趣的DNA都可通过PCR直接转化为模板，用于使用适当的引物和RNA聚合酶进行的体外mRNA合成。DNA的来源可以是，例如，基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他适当的DNA来源。

在一个实施方案中，用于PCR的DNA含有开放阅读框。DNA可以来自生物体基因组中天然存在的DNA序列。在一个实施方案中，DNA是基因的一部分的感兴趣的全长基因。基因可包括一些或所有的5'和/或3'非翻译区(UTR)。基因可包括外显子和内含子。在一个实施方案中，用于PCR的DNA是人基因。在另一个实施方案中，用于PCR的DNA是包括5'和3'UTR的人基因。或者，DNA可以是通常不在天然存在的生物体中表达的人工DNA序列。示例性的人工DNA序列是含有连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的基因部分的序列。连接在一起的DNA部分可以来自单个生物体或来自多于一个的生物体。

可以用作PCR的DNA来源的基因包括编码为生物体提供治疗或预防作用或可以用于诊断生物体的疾病或病症的多肽的基因。优选的基因是可用于短期治疗的基因，或者对剂量或表达的基因存在安全性问题的基因。例如，对于治疗癌症、自身免疫性病症、寄生虫、病毒、细菌、真菌或其他感染的治疗，待表达的转基因可以编码一种多肽，其作为免疫系统细胞的配体或受体，或可以起到刺激或抑制生物体免疫系统的作用。在一些实施方案中，不期望对免疫系统进行延长的持续刺激，也不需要在成功治疗后产生持续的变化，因为这可能会引起新的问题。对于自身免疫性病症的治疗，可能期望在发作期间抑制或阻遏免疫系统，但不能长期抑制，长期抑制可能会导致患者对感染过度敏感。

使用PCR生成用于转染的体外mRNA转录的模板。用于进行PCR的方法是本领域熟知的。用于PCR的引物被设计成具有与待用作PCR模板的DNA区基本上互补的区。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸序列，其中引物序列中的大多数或所有碱基是互补的，或者一个或多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够在用于PCR的退火条件下与预期的DNA靶标退火或杂交。引物可以被设计为与DNA模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以被设计用于扩增细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，包括5'和3'UTR。引物还可以被设计用于扩增编码特定感兴趣的结构域的基因部分。在一个实施方案中，引物被设计用于扩增人cDNA的编码区，包括所有或部分的5'和3'UTR。可用于PCR的引物是通过本领域熟知的合成方法来生成的。

“正向引物”是含有与待扩增的DNA序列上游的DNA模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区的引物。“上游”在本文中用于指代相对于编码链的待扩增的DNA序列的5'的位置。“反向引物”是含有与待扩增的DNA序列下游的双链DNA模板基本上互补的核苷酸区的引物。“下游”在本文中用于指代相对于编码链的待扩增的DNA序列的3'的位置。

任何可用于PCR的DNA聚合酶均可用于本文公开的方法。试剂和聚合酶从多个来源商购获得。还可使用具有促进稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。RNA优选具有5'和3'UTR。在一个实施方案中，5'UTR的长度在零至3000个核苷酸之间。可通过不同的方法改变待添加至编码区的5'和3'UTR序列的长度，包括但不限于设计退火至不同UTR区的PCR引物。使用这种方法，普通技术人员可以在转录的RNA的转染后修饰实现最佳翻译效率所需的5'和3'UTR长度。5'和3'UTR可以是感兴趣的基因的天然存在的内源性5'和3'UTR。或者，可通过将UTR序列掺入至正向和反向引物中或通过对模板进行任何其他修饰来添加与感兴趣的基因不具有内源性的UTR序列。使用对感兴趣的基因不具有内源性的UTR序列可用于修饰RNA的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3'UTR序列中的富含AU的元件可以降低mRNA的稳定性。因此，可以基于本领域熟知的UTR的性质来选择或设计3'UTR以增加转录的RNA的稳定性。

在一个实施方案中，5'UTR可含有内源基因的科扎克序列。或者，当通过如上所述的PCR添加对感兴趣的基因不具有内源性的5'UTR时，可通过添加5'UTR序列来重新设计共识科扎克序列。科扎克序列可以增加一些RNA转录物的翻译效率，但科扎克序列似乎并不是所有RNA实现高效翻译所需的。许多mRNA对科扎克序列的需要是本领域已知的。在其他实施方案中，5'UTR可来源于RNA基因组在细胞中保持稳定的RNA病毒。在其他实施方案中，可以在3'或5'UTR中使用各种核苷酸类似物来阻止外切酶降解mRNA。

为了能够从DNA模板合成RNA而无需基因克隆，应将转录启动子连接至待转录序列上游的DNA模板。当将作为RNA聚合酶的启动子的序列添加至正向引物的5'末端时，RNA聚合酶启动子就会被掺入至待转录的开放阅读框上游的PCR产物中。在一个优选的实施方案中，启动子是T7聚合酶启动子，如本文其他地方所述。其他有用的启动子包括但不限于T3和SP6RNA聚合酶启动子。T7、T3和SP6启动子的共识核苷酸序列是本领域已知的。

在优选的实施方案中，mRNA具有5'末端上的帽和3'poly(A)尾两者，其决定了核糖体结合、翻译起始和细胞中mRNA的稳定性。在环状DNA模板(例如，质粒DNA)上，RNA聚合酶产生不适合在真核细胞中表达的长多联体产物。3'UTR末端处线性化的质粒DNA的转录导致正常大小的mRNA，所述mRNA在真核转染中无效，即使是在转录后也是如此。在线性DNA模板上，噬菌体T7 RNA聚合酶可以将转录物的3'末端延长至超出模板的最后一个碱基。Schenborn和Mierendorf,Nuc Acids Res.,13:6223-36(1985)；Nacheva和Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270:1485-65(2003)。

将polyA/T延伸段整合至DNA模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合至质粒DNA中的polyA/T序列会导致质粒不稳定性，这就是为什么从细菌细胞中获得的质粒DNA模板经常受到缺失和其他畸变的高度污染。这使得克隆程序不仅费力、耗时，而且经常不可靠。这就是为什么高度期望找到一种允许构建具有polyA/T 3'延伸段的DNA模板而无需克隆的方法。

转录DNA模板的polyA/T片段可以在PCR期间通过使用含有polyT尾(诸如100T尾(大小可以是50T-5000T))的反向引物来产生，或者在PCR之后通过任何其他方法来产生，包括但不限于DNA连接或体外重组。Poly(A)尾还为RNA提供稳定性并减少RNA降解。一般来说，poly(A)尾的长度与转录的RNA的稳定性呈正相关。在一个实施方案中，poly(A)尾介于100和5000个腺苷之间。

RNA的Poly(A)尾可以在体外转录后使用Poly(A)聚合酶(诸如大肠杆菌Poly(A)聚合酶(E-PAP))进一步延长。在一个实施方案中，将Poly(A)尾的长度从100个核苷酸增加至在300个至400个之间的核苷酸，导致RNA的翻译效率增加了约两倍。此外，不同的化学基团连接至3'末端可以增加mRNA的稳定性。这种连接可含有修饰的/人工的核苷酸、适体和其他化合物。例如，可使用poly(A)聚合酶将ATP类似物掺入至poly(A)尾中。ATP类似物可以进一步增加RNA的稳定性。5'帽也为RNA分子提供稳定性。在优选的实施方案中，通过本文公开的方法产生的RNA包括5'帽。5'帽是使用本领域已知且本文所述的技术提供的(Cougot等人,Trends in Biochem.Sci.,29:436-444(2001)；Stepinski等人,RNA,7:1468-95(2001)；Elango等人,Biochim.Biophys.Res.Commun,330:958-966(2005))。

通过本文公开的方法产生的RNA还可含有内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列可以是任何病毒、染色体或人工设计的序列，其启动与mRNA的帽非依赖性核糖体结合并促进翻译的启动。可以包括任何适合细胞电穿孔的溶质，所述溶质可以含有促进细胞通透性和活力的因子，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。

可使用多种不同方法中的任一种将RNA引入至靶细胞，例如，可商购获得的方法，其包括但不限于电穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或Gene Pulser II(BioRad,Denver,Colo.)、多功能细胞电穿孔仪(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂质转染的阳离子脂质体介导的转染、聚合物包封、肽介导的转染或基因枪颗粒递送系统，诸如“基因枪”(参见，例如，Nishikawa等人Hum Gene Ther.,12(8):861-70(2001)。

在一些实施方案中，RNA被电穿孔至细胞中，诸如体外转录的RNA。将核酸构建体电穿孔至哺乳动物细胞中的制剂和方法学在例如US2004/0014645、US2005/0052630A1、US2005/0070841 Al、US2004/0059285A1、US2004/0092907A1中教导。任何已知细胞类型的电穿孔所需的各种参数(包括电场强度)通常是在相关研究文献以及所述领域的众多专利和应用中已知的。参见例如，美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗应用的装置是可商购获得的，例如MedPulser^TMDNA电穿孔疗法系统(Inovio/Genetronics,San Diego,Calif)，并在以下专利中描述，诸如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482；电穿孔还可以如例如US20070128708A1中所述用于体外细胞转染。电穿孔也可用于将核酸体外递送至细胞中。

因此，利用本领域技术人员已知的许多可用装置和电穿孔系统中的任一种，通过电穿孔介导的施用将包括表达构建体的核酸施用至细胞中，这提出了一种将感兴趣的RNA递送至靶细胞的令人兴奋的新方式。

所公开的方法可应用于调节癌症、干细胞、急性和慢性感染以及自身免疫性疾病领域的基础研究和疗法中的宿主细胞活性，包括评估遗传修饰的宿主细胞杀伤靶标癌细胞的能力。方法还提供了通过改变例如启动子或输入RNA的量在广泛范围内控制表达水平的能力，使得可以单独地调控表达水平。此外，基于PCR的mRNA生产技术极大地促进了具有不同结构的mRNA及其结构域组合的设计。

C.免疫细胞的来源

扩增之前，从受试者获得的免疫细胞来源用于离体操作。用于离体操作的靶细胞来源还可包括例如，自体或异源供体血液、脐带血或骨髓。例如，免疫细胞的来源可以来自待用本发明的修饰的免疫细胞治疗的受试者，例如受试者的血液、受试者的脐带血或受试者的骨髓。受试者的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。在某些示例性实施方案中，受试者是人。

免疫细胞可以从多种来源获得，包括血液、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带、淋巴或淋巴器官。免疫细胞是免疫系统的细胞，诸如先天性或适应性免疫的细胞，例如髓系细胞或淋巴样细胞，包括淋巴细胞，通常是T细胞和/或NK细胞和/或NKT细胞。其他示例性细胞包括干细胞，诸如多能(multipotent)干细胞和多能(pluripotent)干细胞，包括诱导性多能干细胞(iPSC)。在某些方面，细胞是人细胞。参考待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。细胞通常是原代细胞，诸如直接从受试者分离的和/或从受试者分离并冷冻的那些细胞。

在某些实施方案中，免疫细胞是T细胞，例如，CD8⁺T细胞(例如，CD8⁺未致敏T细胞、中央记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4⁺T细胞、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、调节性T细胞(Treg)、干细胞记忆T细胞、淋巴样祖细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(NK细胞)或树突状细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。在一个实施方案中，靶细胞是诱导性多能干(iPS)细胞或来源于iPS细胞的细胞，例如，由受试者生成的iPS细胞，被操作以改变(例如，诱导突变)或操作一个或多个靶基因的表达，并且分化成例如，T细胞，例如，CD8⁺T细胞(例如，CD8⁺未致敏T细胞、中央记忆T细胞或效应记忆T细胞)、CD4⁺T细胞、干细胞记忆T细胞、淋巴样祖细胞或造血干细胞。

在一些实施方案中，细胞包括一种或多种T细胞子集或其他细胞类型，诸如全T细胞群、CD4⁺细胞、CD8⁺细胞及其亚群，诸如通过功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌特征和/或分化程度定义的那些细胞。T细胞和/或CD4⁺和/或CD8⁺T细胞的亚型和亚群包括未致敏T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，诸如干细胞记忆T(TSCM)、中央记忆T(TCM)、效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞，诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。在某些实施方案中，可使用本领域中可用的任何数量的T细胞系。

在一些实施方案中，方法包括从受试者分离免疫细胞，并对其进行制备、处理、培养和/或工程化。在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。如所述用于工程化的细胞可从样品(诸如生物样品，例如从受试者获得或来源于受试者的样品)中分离。在一些实施方案中，从中分离细胞的受试者是患有疾病或疾患或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预(诸如分离、处理和/或工程化细胞的过继细胞疗法)的人。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。样品包括直接从受试者采集的组织、液体和其他样品，以及通过一个或多个处理步骤(诸如分离、离心、遗传工程化(例如，用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)得到的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液，诸如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液、组织和器官样品，包括由其衍生的处理的样品。

在某些方面，来源于细胞或从细胞中分离的样品是血液或血液来源的样品或者是或来源于单采术产物或白细胞单采术产物。示例性的样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的上下文中，样品包括来自自体来源和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，细胞来源于细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞是从异种来源获得的，例如来自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和的细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂存在下对细胞进行洗涤、离心和/或孵育，例如，以去除不想要的组分、富集期望的组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质分离细胞，所述性质诸如密度、粘附性质、大小、敏感度和/或对特定组分的抗性。

在一些实例中，例如，通过单采术或白细胞单采术从受试者的循环血液中获得细胞。样品在某些方面含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在某些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如，以去除血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些情况下，根据制造商的说明通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在某些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。在一些实施方案中，方法包括基于密度的细胞分离方法，诸如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心从外周血中制备白细胞。

在一个实施方案中，通过单采术或白细胞单采术从个体的循环血液中获得免疫细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤，所述缓冲液或培养基诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或缺乏钙并且可能缺乏镁或者可能缺乏许多(如果不是所有)二价阳离子的洗涤溶液。本领域普通技术人员将容易理解，可以通过本领域技术人员已知的方法完成洗涤步骤，诸如通过根据制造商的说明使用半自动“流通(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics Cell Saver 5)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，诸如，例如，无Ca²⁺、无Mg²⁺的PBS、PlasmaLyte A或含有或不含有缓冲液的另一种盐溶液。在一些实施方案中，可以去除单采术样品中不期望的组分，并将细胞直接重悬在培养基中。

在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(诸如表面标志物，例如，表面蛋白、细胞内标志物或核酸)的表达或存在来分离不同的细胞类型。在一些实施方案中，可使用任何已知的基于此类标志物的分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在某些方面，分离包括基于一种或多种标志物(通常是细胞表面标志物)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如，通过与特异性结合此类标志物的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常进行洗涤步骤，并将已与抗体或结合配偶体结合的细胞与未与抗体或结合配偶体结合的那些细胞分离。此类分离步骤可基于正向选择，其中保留已经与试剂结合的细胞用于进一步使用，和/或基于负向选择，其中保留未与抗体或结合配偶体结合的细胞。在一些实例中，两个部分都被保留用于进一步使用。

在某些方面，当没有特异性地鉴定异质群中的细胞类型的可用的抗体时，负向选择可能特别有用，使得分离最好是基于除期望的群之外的细胞所表达的标志物来进行。分离不需要导致特定细胞群或表达特定标志物的细胞的100％富集或去除。例如，对特定类型的细胞(诸如那些表达标志物的细胞)的正向选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标志物的细胞完全不存在。同样地，特定类型的细胞(诸如那些表达标志物的细胞)的负向选择、去除或耗竭是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。在某些示例性实施方案中，进行了多轮分离步骤，其中对来自一个步骤的正向选择或负向选择的部分进行另一个分离步骤，诸如后续的正向选择或负向选择。

在某些示例性实施方案中，单个分离步骤可以耗竭同时表达多种标志物的细胞，诸如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起孵育，每种抗体或结合配偶体对靶向负向选择的标志物具有特异性。同样地，通过将细胞与各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时对多种细胞类型进行正向选择。

在一些实施方案中，一个或多个疲劳T细胞群富集或耗竭了细胞，所述细胞对一种或多种特定标志物(诸如表面标志物)呈阳性(markeri-)或表达高水平的一种或多种特定标志物(markerhigh)，或者对一种或多种标志物呈阴性(marker-)或表达相对低水平的一种或多种标志物(markerlow)。例如，在某些方面，通过正向选择或负向选择技术来分离特定T细胞亚群，诸如对一种或多种表面标志物呈阳性的细胞或表达高水平的一种或多种表面标志物的细胞，例如，CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和/或CD45RO⁺T细胞。在一些情况下，此类标志物是在T细胞(诸如非记忆细胞)的某些群中不存在或以相对较低的水平表达，但在T细胞(诸如记忆细胞)的某些其他群中存在或以相对较高的水平表达的那些标志物。在一个实施方案中，细胞(诸如CD8⁺细胞或T细胞，例如CD3⁺细胞)富集了(即，正向选择)对CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L呈阳性或表达高表面水平的CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L的细胞，且/或耗竭了(例如，负向选择)对CD45RA呈阳性或表达高表面水平的CD45RA的细胞。在一些实施方案中，细胞富集了或耗竭了表达高表面水平的CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD 127)或对其呈阳性的细胞。在某些示例性实施方案中，CD8⁺T细胞富集CD45RO阳性(或CD45RA阴性)细胞和CD62L阳性的细胞。例如，可使用CD3/CD28缀合磁珠(例如M-450CD3/CD28 T细胞扩增器)对CD3⁺、CD28⁺T细胞进行正向选择。

在一些实施方案中，通过对非T细胞(诸如B细胞、单核细胞或其他白细胞，诸如CD14)上表达的标志物进行负向选择，将T细胞从PBMC样品中分离。在某些方面，使用CD4⁺或CD8⁺选择步骤来分离CD4⁺辅助和CD8⁺细胞毒性T细胞。可通过对在一个或多个未致敏、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标志物进行正向选择或负向选择来将此类CD4⁺和CD8⁺群进一步分选为亚群。在一些实施方案中，CD8+细胞进一步富集了或耗竭了未致敏细胞、中央记忆细胞、效应记忆细胞和/或中央记忆干细胞，诸如通过基于与相应亚群缔合的表面抗原的正向选择或负向选择。在一些实施方案中，进行中央记忆T(TCM)细胞的富集以提高功效，诸如以改善施用后的长期存活、扩增和/或移植，其在某些方面在此些亚群中特别稳健。

在一些实施方案中，将富集TCM的CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞组合进一步增强了功效。在一些实施方案中，记忆T细胞存在于CD8⁺外周血淋巴细胞的CD62L⁺和CD62L-子集中。PBMC可以富集或耗竭CD62L-CD8⁺和/或CD62L⁺CD8⁺部分，诸如使用抗CD8和抗CD62L抗体。在一些实施方案中，CD4⁺T细胞群和/或CD8⁺T细胞群富集了中央记忆(TCM)细胞。在一些实施方案中，中央记忆T(TCM)细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD8和/或CD127呈阳性或高表面表达。在某些方面，富集基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的负向选择。在某些方面，通过耗竭表达CD4、CD 14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞进行正向选择或富集，来分离富集TCM细胞的CD8⁺群。在一个方面，中央记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达选择的阴性细胞部分开始进行，所述阴性细胞部分将经历基于CD14和CD45RA的表达的负向选择，以及基于CD62L的正向选择。在某些方面，此类选择是同时进行的，而在其他方面，此类选择是按任何顺序依次进行的。在一些实施方案中，用于制备CD8⁺细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4⁺细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性部分均被保留并用于所述方法的后续步骤，任选地后跟一个或多个进一步的正向选择或负向选择步骤。

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群将CD4⁺T辅助细胞分选为未致敏细胞、中央记忆细胞和效应细胞。CD4⁺淋巴细胞可通过标准方法来获得。在一些实施方案中，未致敏CD4⁺T淋巴细胞是CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L⁺、CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4⁺细胞是CD62L⁺和CD45RO⁺。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO。在一个实例中，为了通过负向选择以富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(诸如磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离细胞用于正向选择和/或负向选择。

在一些实施方案中，在遗传工程化之前或与遗传工程结合地孵育和/或培养细胞。孵育步骤可包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括被设计为诱导群中的细胞增殖、扩增、激活和/或存活的那些条件、模拟抗原暴露的条件、和/或准备细胞用于遗传工程化的条件，诸如为了引入重组抗原受体。条件可包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧气含量、二氧化碳含量、时间、剂，例如，营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，诸如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计用于激活细胞的剂。在一些实施方案中，刺激条件或剂包括一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的剂，例如，配体。

在某些方面，剂开启或启动T细胞中的TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类剂可包括抗体，诸如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的那些抗体，例如与固体支持物(诸如珠子)结合的例如抗CD3、抗CD28，和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可进一步包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2和/或IL-15，例如IL-2浓度为至少约10单元/mL。

在另一个实施方案中，通过裂解红细胞并且耗竭单核细胞，例如通过PERCOLL^TM梯度离心，从外周血中分离T细胞。或者，可以从脐带中分离T细胞。无论如何，可通过正向选择或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群。如此分离的脐带血单核细胞可以耗竭表达某些抗原的细胞，所述抗原包括但不限于CD34、CD8、CD14、CD19和CD56。可使用分离的抗体、包含抗体的生物样品(诸如腹水)、与物理支持物结合的抗体和细胞结合抗体来实现这些细胞的耗竭。

在另一个实施方案中，通过裂解红细胞并耗竭单核细胞(例如，通过PERCOLL^TM梯度离心或逆流离心淘析)从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可通过正向选择或负向选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，诸如CD3⁺、CD28⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和CD45RO⁺T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3x28)缀合的珠子(诸如M-450CD3/CD28 T)孵育足以对期望的T细胞进行阳性选择的一段时间来分离T细胞。在一个实施方案中，时间段为约30分钟。在进一步的实施方案中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长时间以及其间的所有整数值。在进一步的实施方案中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在又另一个优选的实施方案中，时间段是10至24小时。在一个优选的实施方案中，孵育时间段是24小时。对于从白血病患者中分离T细胞，使用较长的孵育时间(诸如24小时)可以增加细胞产量。在与其他细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞，诸如从肿瘤组织或从免疫失能的个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，使用较长的孵育时间可以增加CD8⁺T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠子结合的时间和/或通过增加或减少珠子与T细胞的比率(如本文进一步所述)，可以在培养起始时或过程期间的其他时间点优先选择或反对T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠子或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养起始时或其他期望的时间点优先选择或反对T细胞亚群。技术人员将认识到，在本发明的上下文中也可使用多轮选择。

在某些实施方案中，可能期望进行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”的细胞也可以经历进一步的多轮选择。可以使用针对负向选择的细胞特有的表面标志物的抗体的组合，通过负向选择实现T细胞群的富集。示例性的方法是经由负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞术使用针对负向选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过负向选择以富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。

在某些实施方案中，可能期望富集或正向选择通常表达CD4⁺、CD25⁺、CD62L^M、GITR⁺和FoxP3⁺的调节性T细胞。

或者，在某些实施方案中，调节性T细胞被抗C25缀合珠子或其他相似的选择方法耗竭。为了通过正向选择或负向选择来分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，诸如珠子)的浓度。在某些实施方案中，可能期望显著减少珠子和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠子的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用了20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用了10亿个细胞/ml的浓度。在进一步的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用了1000万个细胞/ml、1500万个细胞/ml、2000万个细胞/ml、2500万个细胞/ml、3000万个细胞/ml、3500万个细胞/ml、4000万个细胞/ml、4500万个细胞/ml或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用了7500万个细胞/ml、8000万个细胞/ml、8500万个细胞/ml、9000万个细胞/ml、9500万个细胞/ml或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可使用1.25亿个细胞/ml或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞，或从存在许多肿瘤细胞的样品(即，白血病血液、肿瘤组织等)进行捕获。此类细胞群可能具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8⁺T细胞。

在相关的实施方案中，可能期望使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，诸如珠子)的混合物，最大程度地减少颗粒和细胞之间的相互作用。这将选择表达大量期望的抗原的细胞与颗粒结合。例如，CD4⁺T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8⁺T细胞更高效地被捕获。在一个实施方案中，使用的细胞浓度为5X 10⁶/ml。在其他实施方案中，所使用的浓度可以为约1X 10⁵/ml至1X 10⁶/ml，以及其间的任何整数值。

在其他实施方案中，可以在2℃-10℃或在室温下以不同的速度将细胞在旋转器上孵育不同的时间长度。用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和后续的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知并且可用于本上下文，但是一种方法涉及使用PBS，其含有20％DMSO和8％人血清白蛋白，或培养基，其含有10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO、或31.25％Plasmalyte-A、31.25％右旋糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO，或其他合适的细胞冷冻培养基，其含有例如Hespan和PlasmaLyte A，然后以每1°/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃并储存于液氮储罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃下或在液氮中非受控冷冻。在某些实施方案中，将冷冻保存的细胞如本文所述进行解冻和洗涤，并且允许其在使用本发明的方法进行激活之前在室温下静置一小时。

在本公开的上下文中还考虑了，在可能需要如本文所述的扩增的细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采血液成分产物。因此，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并且分离和冷冻期望的细胞(诸如T细胞)以在T细胞疗法中后续使用，所述T细胞疗法用于将从T细胞疗法中受益的任何数量的疾病或疾患，诸如本文所述的那些疾病或疾患。在一个实施方案中，从一般健康的受试者采集血液样品或单采血液成分。在某些实施方案中，从有患病风险但尚未患病的一般健康的受试者中采集血液样品或单采血液成分，并且将感兴趣的细胞分离并冷冻用于后续使用。在某些实施方案中，可以扩增、冷冻T细胞并在后续使用。在某些实施方案中，在诊断为患有如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在进一步的实施方案中，在进行任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分分离细胞，所述治疗方式包括但不限于用以下剂治疗：诸如那他珠单抗(natalizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、放射、免疫抑制剂，诸如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融剂，诸如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸、类固醇、FR901228和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)，或者抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方案中，为患者分离细胞并冷冻用于后续与(例如，之前、同时或之后)骨髓或干细胞移植、T细胞消融疗法(使用化疗剂诸如氟达拉滨、外放射疗法(XRT)、环磷酰胺，或使用抗体诸如OKT3或CAMPATH)一起使用。在另一个实施方案中，在B细胞消融疗法之前分离细胞并可将其冷冻用于B细胞消融疗法(诸如，与CD20反应的剂，例如，瑞图宣(Rituxan))后的治疗后续用途。

在本公开的进一步的实施方案中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这方面，观察到在某些癌症治疗(特别是使用损害免疫系统的药物治疗)之后，治疗后不久，在患者通常从治疗中恢复期间，所获得的T细胞的质量可能由于其离体扩增的能力而达到最佳或得到改善。同样地，使用本文所述的方法进行离体操作后，这些细胞可能处于增强的移植和体内扩增的优选状态。因此，在本发明的上下文内，考虑了在此恢复阶段期间收集血细胞，包括T细胞、树突状细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些实施方案中，动员(例如，用GM-CSF动员)和调理方案可用于在受试者中创建其中有利于特定细胞类型的再殖、再循环、再生和/或扩增的条件，尤其是在疗法后的限定时间窗口期间。例示性细胞类型包括T细胞、B细胞、树突状细胞和免疫系统的其他细胞。

T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻，不需要单核细胞去除步骤。虽然不希望受理论的束缚，冷冻和后续的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且可用于本发明的上下文，但在非限制性实例中，一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后以1℃每/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃并储存于液氮储罐的气相中。可以使用其他受控冷冻方法以及立即在-20℃下或在液氮中非受控冷冻。

在一个实施方案中，T细胞群包含在诸如外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的T细胞群和T细胞系的细胞内。在另一个实施方案中，外周血单核细胞包含T细胞群。在又另一个实施方案中，纯化的T细胞包含T细胞群。

D.免疫细胞扩增

无论是在修饰细胞以表达主题CAR或双特异性融合蛋白之前还是之后，都可使用如在例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；以及美国公开号20060121005中所述的方法激活细胞和扩增细胞的数量。

例如，本公开的免疫细胞可通过与其中连接有刺激CD3/TCR复合物相关信号的剂和刺激免疫细胞表面上的共刺激分子的配体的表面接触来扩增。具体而言，免疫细胞群可通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触来刺激，或者通过与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)接触来刺激。为了共刺激免疫细胞表面上的辅助分子，使用了与辅助分子结合的配体。例如，可以在适合于刺激免疫细胞增殖的条件下，使免疫细胞与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Bes ancon,France)，并且这些抗体都可以用于本发明，如本领域已知的其他方法和试剂也可以用于本发明。参见，例如，ten Berge等人,Transplant Proc.30(8):3975-3977(1998)；Haanen等人,J.Exp.Med.190(9):1319-1328(1999)；以及Garland等人,J.Immunol.Methods 227(1-2):53-63(1999)。

通过本文公开的方法扩增免疫细胞可以乘以约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多倍以及其间的任何和所有完整或部分整数。在一个实施方案中，免疫细胞扩增的范围为约20倍至约50倍。

培养后，可将免疫细胞在培养装置中的细胞培养基中孵育一段时间，或直到细胞达到最佳传代的汇合或高细胞密度，然后再将细胞传代至另一个培养装置中。培养装置可以是常用于体外培养细胞的任何培养装置。在某些示例性实施方案中，在将细胞传代至另一个培养装置之前，汇合水平为70％或更高。在特别示例性的实施方案中，汇合水平为90％或更高。时间段可以是适合体外培养细胞的任何时间。可在免疫细胞培养期间在任何时间替换免疫细胞培养基。在某些示例性实施方案中，免疫细胞培养基约每2至3天替换一次。然后从培养装置中收获免疫细胞，之后可以立即使用免疫细胞或冷冻保存为后续使用而储存。在一个实施方案中，本发明包括冷冻保存扩增的免疫细胞。在将核酸引入至免疫细胞之前，先将冷冻保存的免疫细胞解冻。

在另一个实施方案中，方法包括分离免疫细胞并扩增免疫细胞。在另一个实施方案中，本发明进一步包括在扩增之前冷冻保存免疫细胞。在又另一个实施方案中，将冷冻保存的免疫细胞解冻以用编码嵌合膜蛋白的RNA进行电穿孔。

美国专利号5,199,942(通过引用并入本文)中描述了另一种用于离体扩增细胞的程序。诸如美国专利号5,199,942中描述的扩增可以是本文所述的其他扩展方法的替代或补充。简而言之，免疫细胞的离体培养和扩增包括添加细胞生长因子，诸如美国专利号5,199,942中描述的那些生长因子或其他因子，诸如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体。在一个实施方案中，扩增免疫细胞包括用选自由flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体组成的组的因子培养免疫细胞。如本文所述的培养步骤(与如本文所述的剂接触或在电穿孔后)可以非常短，例如少于24小时，诸如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时或23小时。如本文进一步所述的培养步骤(与如本文所述的剂接触)可以更长，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或更多天。

使用各种术语来描述培养的细胞。细胞培养通常是指从生物体中采集并且在受控的条件下生长的细胞。原代细胞培养是直接从生物体中采集并进行第一次传代培养之前的细胞、组织或器官的培养。当将细胞置于促进细胞生长和/或分裂的条件下的生长培养基中时，细胞会在培养中扩增，从而导致更大的细胞群。当细胞在培养中扩增时，细胞增殖率通常通过细胞数量增加一倍所需的时间量来测量，也称为倍增时间。

每一轮传代培养称为一个传代。当细胞进行传代培养时，它们就被称为已经传代。特定的细胞群或细胞系有时会通过其传代次数来指代或表征。例如，已传代十次的培养的细胞群可称为P10培养物。原代培养，即从组织分离细胞后的第一次培养，被命名为为P0。第一次传代培养后，细胞被描述为次级培养物(PI或第1代)。第二次传代培养后，细胞成为第三级培养物(P2或第2代)，依此类推。本领域技术人员应理解，在传代时间段期间可能存在许多群倍增。因此，培养物的群倍增数量大于传代次数。传代之间的时间段期间的细胞扩增(即，群倍增的次数)取决于许多因素，包括但不限于接种密度、底物、培养基和传代之间的时间。

在某些实施方案中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可由不同的方案来提供。例如，提供每种信号的剂可能在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，剂可以偶联至同一表面(即，“顺式”形成)或单独的表面(即，“反式”形成)。或者，可以将一种剂偶联至表面，并将其他剂偶联至溶液。在一个实施方案中，提供共刺激信号的剂与细胞表面结合，并且提供初级激活信号的剂在溶液中或偶联至表面。在某些实施方案中，两种剂都可以在溶液中。在另一个实施方案中，剂可以是可溶形式，然后交联至表面，诸如表达Fc受体的细胞或抗体或将与剂结合的其他结合剂。在这方面，参见例如，美国专利申请公开号20040101519和20060034810的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其被考虑用于在本发明中激活和扩增T细胞。

在一个实施方案中，将两种剂固定在珠子上，要么在同一个珠子上，即“顺式”，要么在单独的珠子上，即“反式”。举例来说，提供初级激活信号的剂是抗CD3抗体或其抗原结合片段，而提供共刺激信号的剂是抗CD28抗体或其抗原结合片段；并且两种剂以等效分子量共固定至同一珠子。在一个实施方案中，使用1:1比率的每种抗体与珠子结合，用于CD4+T细胞扩增和T细胞生长。在本发明的某些方面，使用一定比率的抗CD3:CD28抗体与珠子结合，使得与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到T细胞扩增的增加。在一个特定实施方案中，与使用1:1的比率观察到的扩增相比，观察到约1倍至约3倍的增加。在一个实施方案中，与珠子结合的CD3:CD28抗体的比率范围为100:1至1:100及其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，与抗CD3抗体相比，更多的抗CD28抗体与颗粒结合，即CD3:CD28的比率小于一。在本发明的某些实施方案中，与珠子结合的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2:1。在一个特定实施方案中，使用1:100的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。在另一个实施方案中，使用1:75的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。在进一步的实施方案中，使用1:50的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。在另一个实施方案中，使用1:30的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。在一个优选的实施方案中，使用1:10的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。在另一个实施方案中，使用1:3的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。在另一个实施方案中，使用3:1的CD3:CD28比率的抗体与珠子结合。

颗粒与细胞的比率为1:500至500:1以及其间的任何整数值，所述比率可用于刺激T细胞或其他靶细胞。本领域的普通技术人员可以容易地理解，颗粒与细胞的比率可能取决于相对于靶细胞的颗粒尺寸。例如，小尺寸的珠子只能结合少量细胞，而大尺寸的珠子则可结合许多细胞。在某些实施方案中，细胞与颗粒的比率范围为1:100至100:1以及其间的任何整数值，并且在进一步的实施方案中，比率包括1:9至9:1以及其间的任何整数值，也可用于刺激T细胞。导致T细胞刺激的抗CD3和抗CD28偶联颗粒与T细胞的比率可如上所述变化，然而某些优选值包括1:100、1:50、1:40、1:30、1:20、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1和15:1，其中一个优选比率为至少1:1颗粒/T细胞。在一个实施方案中，使用的颗粒与细胞的比率为1:1或更低。在一个特定实施方案中，优选的颗粒:细胞比率为1:5。在进一步的实施方案中，颗粒与细胞的比率可以根据刺激的天数而变化。例如，在一个实施方案中，第一天的颗粒与细胞的比率为1:1至10:1，并且此后每天或每隔一天向细胞中添加额外的颗粒，持续至多10天，最终比率为1:1至1:10(基于添加当天的细胞计数)。在一个特定实施方案中，刺激第一天的颗粒与细胞的比率为1:1，并且在刺激第三天和第五天调整为1:5。在另一个实施方案中，每日或每隔一天添加颗粒，刺激第一天的最终比率为1:1，刺激第三天和第五天的最终比率为1:5。在另一个实施方案中，刺激第一天的颗粒与细胞的比率为2:1，并且在刺激第三天和第五天调整为1:10。在另一个实施方案中，每日或每隔一天添加颗粒，刺激第一天的最终比率为1:1，并且刺激第三天和第五天的最终比率为1:10。本领域技术人员将理解，多种其他比率也可适用于本发明。具体而言，比率将根据颗粒尺寸以及细胞尺寸和类型而变化。在本发明的进一步的实施方案中，将细胞(诸如T细胞)与剂包被的珠子组合，并且随后分离珠子和细胞，并且然后培养细胞。在替代的实施方案中，在培养之前，剂包被的珠子和细胞不是分离的，而是一起培养。在进一步的实施方案中，首先通过施加力(诸如磁力)来浓缩珠子和细胞，导致细胞表面标志物的连接增加，从而诱导了细胞刺激。

举例来说，可通过允许与抗CD3和抗CD28连接的顺磁珠(3x28珠子)与T细胞接触来连接细胞表面蛋白。在一个实施方案中，将细胞(例如，104至109个T细胞)与珠子(例如，1:1的比率的M-450CD3/CD28 T顺磁珠)组合在缓冲液中，优选PBS(不含二价阳离子，诸如，钙和镁)。再次，本领域的普通技术人员可以容易地理解可以使用任何细胞浓度。例如，样品中的靶细胞可能非常稀有，并且仅占样品的0.01％，或者整个样品(即100％)可包含感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量均在本发明的范围内。在某些实施方案中，可能期望显著减少颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用了约20亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方案中，使用了多于1亿个细胞/ml。在进一步的实施方案中，使用了1000万个细胞/ml、1500万个细胞/ml、2000万个细胞/ml、2500万个细胞/ml、3000万个细胞/ml、3500万个细胞/ml、4000万个细胞/ml、4500万个细胞/ml或5000万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用了7500万个细胞/ml、8000万个细胞/ml、8500万个细胞/ml、9000万个细胞/ml、9500万个细胞/ml或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方案中，可使用1.25亿个细胞/ml或1.5亿个细胞/ml的浓度。使用高浓度可以导致细胞产量、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度允许更高效地捕获可较弱地表达感兴趣的靶抗原的细胞，诸如CD28阴性T细胞。在某些实施方案中，此类细胞群可能具有治疗价值并且是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更高效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。

在一个实施方案中，可以培养细胞几个小时(约3小时)至约14天或其间的任何小时整数值。适合于免疫细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可含有增殖和活力所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF-β和TNF-α或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。其他用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、血浆蛋白制剂(plasmanate)和还原剂，诸如N-乙酰半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其中添加了氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或者补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以用于免疫细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在待输注至受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％ C02)。

用于培养免疫细胞的培养基可能包括可以共刺激免疫细胞的剂。例如，可以刺激CD3的剂是CD3抗体，而可以刺激CD28的剂是CD28抗体。这是因为，如本文公开的数据所证明的，通过本文公开的方法分离的细胞可以扩增大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多倍。在一个实施方案中，通过培养电穿孔群，免疫细胞扩增范围为约2倍至约50倍或更多倍。在一个实施方案中，人调节性T细胞经由抗CD8抗体包被的KT64.86人工抗原呈递细胞(aAPC)进行扩增。用于扩增和激活免疫细胞的方法可见于美国专利号7,754,482、8,722,400和9,555,105，所述专利的内容整体并入本文中。

在一个实施方案中，扩增免疫细胞的方法可进一步包括分离扩增的免疫细胞用于进一步应用。在另一个实施方案中，扩增方法可进一步包括对扩增的免疫细胞进行后续的电穿孔，随后进行培养。后续的电穿孔可包括将编码剂的核酸引入至扩增的免疫细胞群中，诸如转导扩增的免疫细胞、转染扩增的免疫细胞或用核酸电穿孔扩增的免疫细胞，其中剂进一步刺激免疫细胞。剂可以刺激免疫细胞，诸如通过刺激进一步扩增、效应功能或另一种免疫细胞功能。

已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特征。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产物具有辅助T细胞群(TH，CD4⁺)，其多于细胞毒性或抑制T细胞群(Tc，CD8⁺)。通过刺激CD3和CD28受体进行T细胞离体扩增产生了一个T细胞群，其在约第8-9天之前主要由TH细胞组成，而在约第8-9天后，所述T细胞群包含越来越多的Tc细胞群。因此，根据治疗目的，向受试者输注主要包含TH细胞的T细胞群可能是有益的。相似地，如果已经分离出抗原特异性的Tc细胞子集，那么将此子集扩增到更大程度可能是有益的。

此外，除了CD4和CD8标志物外，其他表型标志物在细胞扩增过程期间也有显著变化，但在很大程度上具有可重复性。因此，这种可重复性使得能够根据特定目的定制激活的T细胞产物。

E.支架

在另一个方面，本公开提供了一种支架或基质组合物，其包含有包含TACA结合结构域的肽、编码包含TACA结合结构域的肽的核酸分子、经修饰以表达包含TACA结合结构域的肽的细胞或其组合。例如，在一个实施方案中，包含TACA结合结构域的肽、编码包含TACA结合结构域的肽的核酸分子、经修饰以表达包含TACA结合结构域的肽的细胞或其组合均存在于支架内。在另一个实施方案中，将包含TACA结合结构域的肽、编码包含TACA结合结构域的肽的核酸分子、经修饰以表达包含TACA结合结构域的肽的细胞或其组合应用于支架的表面。本发明的支架可以是本领域已知的任何类型。这种支架的非限制性实例包括水凝胶、电纺支架、泡沫、网状物、片、贴片和海绵。

VI.组合物

A.TACA组合物

在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文公开的分离的核酸；本文公开的嵌合抗原受体；被我听过课修饰的细胞；或本文公开的表达构建体。在一些实施方案中，组合物进一步包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，本公开的组合物可包含如本文所述的修饰的未刺激的免疫细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞)或修饰的刺激的免疫细胞。

在一些实施方案中，组合物包含有包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子修饰的细胞，其中：CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；和/或细胞内信号传导结构域；并且修饰的细胞不太容易受到TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

在该实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含突变，所述突变选自取代、缺失或插入。在一些实施方案中，抗原结合结构域在TACA结合结构域(TBD)中包含缺失。在一些实施方案中，缺失位于TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。

在一些实施方案中，缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。在一些实施方案中，缺失为至少约10个氨基酸、至少约18个氨基酸、或至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，缺失为至少约36个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于C末端并且为至少约10个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约36个氨基酸。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含TACA结合结构域(TBD)中的缺失，所述缺失位于TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸，并且位于C末端并且为至少约10个氨基酸。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含缺失，所述缺失去除TACA结合结构域(TBD)中的二硫键键合的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，包含抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的表达与包含野生型TBD的CAR的表达相似。在一些实施方案中，与包含有包含野生型TBD的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的修饰的细胞表现出降低的强直性信号传导。

在一些实施方案中，组合物包含修饰的细胞，与包含有包含野生型TBD的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的修饰的细胞不太容易经历耗竭。在一些实施方案中，组合物包含修饰的细胞，与包含有包含野生型TBD的CAR的修饰的细胞相比，表达具有抗原结合结构域的TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的修饰的细胞不太容易经历强直性TACA CAR诱导的耗竭。

在一些实施方案中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个TACA结合结构域。在一些实施方案中，TACA-结合结构域来源于凝集素。在该实施方案中，凝集素选自：半乳糖凝集素、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素、选择素；C型凝集素；CD301、多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)、L-PHA(菜豆白细胞凝集素)；E-PHA(菜豆红细胞凝集素)；番茄凝集素(tomato lectin)(番茄凝集素(Lycopersicon esculentum lectin)；LEA)；花生凝集素(peanut lectin)(花生凝集素(Arachis hypogaea Agglutinin)；PNA)；马铃薯凝集素(potato lectin)(马铃薯凝集素(Solanum tuberosum lectin))、美洲商陆丝裂原(pokeweed mitogen)(美洲商陆凝集素(Phytolacca American lectin))、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)(麦胚凝集素(Triticum Vulgaris lectin))；木菠萝凝集素(Artocarpus polyphemus lectin)(木菠萝凝集素(Jacalin letin))；野豌豆凝集素(VVA)；蜗牛凝集素(HPA)；多花紫藤凝集素(WFA)；接骨木凝集素(SNA)、BC2L-CNt(来自革兰氏阴性细菌新洋葱伯克霍尔德氏菌的凝集素)、山槐白细胞凝集素(MAL)、毡毛小脆柄菇凝集素(PVL)、齐整小核菌凝集素(SRL)、锯齿麒麟菜凝集素(ESA)、CLEC17A(保护素)、橙黄网胞盘菌凝集素、无梗接骨木凝集素(SSA)、金钱薄荷凝集素(Gleheda)、黑桑凝集素(Morniga G)、南欧丹参凝集素、Salvia bogotensis凝集素、蝶花鼠尾草凝集素、海州常山凝集素、贝壳花凝集素、加纳籽(GsLA4)、四棱豆(酸性WBAI)、相思子凝集素、尾穗苋凝集素、白果苋凝集素、秋蕾丽兰凝集素、木菠萝凝集素、桑橙凝集素、野波罗蜜凝集素、双花扁豆凝集素、双花扁豆凝集素、大豆凝集素和双孢蘑菇凝集素。

在一些实施方案中，凝集素是选自由以下组成的组的半乳糖凝集素：半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-2、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-5、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-9、半乳糖凝集素-10、半乳糖凝集素-11、半乳糖凝集素-12、半乳糖凝集素-13、半乳糖凝集素-14和半乳糖凝集素-15。在一些实施方案中，凝集素是选自由以下组成的组的唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(唾液酸粘附素)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-2(CD22)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-3(CD33)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-4(髓鞘相关糖蛋白)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-6、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-8、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-10、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-11、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-12、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-13、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-14、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-16、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-17、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素E、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素G和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素H。

在一些实施方案中，凝集素是选自由以下组成的组的多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)：ppGalNAc-T1(GALNT1)、ppGalNAc-T2(GALNT2)、ppGalNAc-T3(GALNT3)、ppGalNAc-T4(GALNT4)、ppGalNAc-T5(GALNT5)、ppGalNAc-T6(GALNT6)、ppGalNAc-T7(GALNT7)、ppGalNAc-T8(GALNT8)、ppGalNAc-T9(GALNT9)、ppGalNAc-T10(GALNT10)、ppGalNAc-T12(GALNT12)、ppGalNAc-T13(GALNT13)、ppGalNAc-T14(GALNT14)、ppGalNAc-T15(GALNT15)、ppGalNAc-T16(GALNT16)、ppGalNAc-T17(GALNT17)、ppGalNAc-T18(GALNT18)、ppGalNAc-T样5(GALNTL5)和ppGalNAc-T样6(GALNTL6)。

在一些实施方案中，组合物包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Thomsen-nouveau(Tn)表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewisx/a、二唾液酸基-Lewisx/a、唾液酸基6-磺基Lexisx、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。

在一些实施方案中，组合物包含抗原结合结构域，其选择性地靶向β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、Tn表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、GalNAcα-丝氨酸、GalNAcα-苏氨酸、GalNAc或GalNAcβ1。

在一些实施方案中，组合物包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含抗原结合结构域的TACA结合结构域中的缺失，所述TACA结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，组合物包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含SEQID NO:34-39中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合包含与SEQ ID NO:34-39具有至少90％同源性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，组合物包含嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含跨膜结构域，所述跨膜结构域可包含选自由以下组成的组的分子的跨膜区：T细胞受体(TCR)-α、TCR-β、CD3-ζ、CD3-ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134(Ox40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一个实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD28跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在某些示例性实施方案中，在合成跨膜结构域的每一末端都将发现苯基丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

在某些实施方案中，组合物包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)包含共刺激结构域，其是选自由以下组成的组的分子的共刺激结构域：CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其组合。

在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域包含CD28共刺激结构域或SEQ ID NO:88的氨基酸序列。在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB和CD28共刺激结构域。

在某些实施方案中，组合物包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，分离的核酸分子编码包含细胞内结构域的嵌合抗原受体(CAR)，所述细胞内结构域可以来自选自由以下组成的组的分子的细胞内信号传导结构域：T细胞受体(TCR)ζ、FcR-γ、FcR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε、CD3-ζ、CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一个实施方案中，细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域；或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

细胞内结构域的可容忍的变异将是本领域技术人员已知的，同时维持特定的活性。例如，在一些实施方案中，细胞内结构域包含与SEQ ID NO:59中示出的任何氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性的氨基酸序列。

CAR的铰链区是位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区。在一些实施方案中，此结构域促进CAR的正确蛋白质折叠。铰链区是CAR的任选的组分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)可进一步包含铰链结构域。

在一些实施方案中，铰链结构域是选自由以下组成的组的蛋白质：CD8α、CD28铰链、抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区和人工间隔序列。在一个实施方案中，铰链结构域是CD8α铰链结构域。在一个实施方案中，铰链结构域是CD28铰链结构域。在一个实施方案中，铰链结构域包含SEQ ID NO:77或86的氨基酸序列。在一些实施方案中，铰链结构域包含选自由SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:68、71-77和86组成的组的氨基酸序列。

本公开的一个方面提供了一种包含修饰的细胞的组合物，所述修饰的细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的细胞中表达的分离的核酸包含表达载体；和/或体外转录的RNA。

在一些实施方案中，组合物包含CAR，所述CAR选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewisx/a、二唾液酸基-Lewisx/a、唾液酸基6-磺基Lexisx、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。在一些实施方案中，CAR选择性地靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖、GalNAc、Tn抗原、GalNAcα-ser、GalNAc或GalNAcβ1。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比，包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞显示出降低的强直性信号传导。

B.药物组合物

在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物可包括药物组合物并且进一步包含一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂、佐剂或赋形剂。此类组合物还可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸、抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。本公开的组合物优选配制用于肠胃外施用(例如，静脉内施用)。

如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指对受试者无毒的药物制剂中除活性成分以外的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于：缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。药学上可接受的载剂在采用的剂量和浓度下通常对接受者是无毒的，并且包括但不限于：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。在某些方面，载剂的选择部分地由特定细胞和/或施用方法决定。

C.制剂

因此，有多种合适的制剂。可以采用与常规赋形剂混合的制剂，即适合施用于伤口或治疗部位的药学上可接受的有机或无机载剂物质。药物组合物可以是灭菌的并在期望时与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质和/或芳香物质等。如果期望，它们还可以与其他活性剂(例如其他止痛剂)组合。本公开的组合物的施用可通过例如，肠胃外、静脉内、肿瘤内、皮下、肌肉内或腹膜内注射进行，或通过输注或通过任何其他可接受的全身方法来进行。

如本文所用，“额外的成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；造粒剂和崩解剂；粘合剂；润滑剂；着色剂；防腐剂；生理学上可降解的组合物，诸如明胶；水性媒介物和溶剂；油性媒介物和溶剂；悬浮剂；分散剂或润湿剂；乳化剂、缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；以及药学上可接受的聚合物或疏水性材料。本公开的药物组合物中可包括的其他“额外的成分”是本领域中已知的并且在例如Genaro编辑(1985,Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA)中进行了描述，所述文献通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本公开的组合物以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在某些方面可以被缓冲至选择的pH。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物稍微更便于施用，尤其是通过注射施用。在另一个方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载剂，所述载剂可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。

可通过将细胞掺入溶剂中，诸如与合适的载剂、稀释剂或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合来制备无菌注射溶液。根据施用途径和期望的制剂，组合物可含有辅助物质，诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或色素。在某些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。

在一些实施方案中，本公开的组合物可包含占组合物总重量约0.005％至2.0％的防腐剂。防腐剂用于预防食品在暴露于环境中的污染物的情况下发生腐败。根据本公开的有用的防腐剂的实例包括但不限于选自由以下组成的组的那些防腐剂：苯甲醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、咪唑烷基脲及其组合。特别优选的防腐剂是约0.5％至2.0％苯甲醇与0.05％至0.5％山梨酸的组合。

在一些实施方案中，组合物包括抗氧化剂和抑制组合物的一种或多种组分降解的螯合剂。对于一些化合物而言，优选的抗氧化剂是BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸，其优选在组合物总重量的约0.01重量％至0.3重量％的范围内，并且更优选组合物总重量的0.03重量％至0.1重量％范围内的BHT。优选地，螯合剂以组合物总重量的按重量计0.01％至0.5％的量存在。特别优选的螯合剂包括乙二胺四酸盐(例如，乙二胺四乙酸二钠)和柠檬酸，其在组合物总重量的约0.01重量％至0.20重量％的重量范围内，并且更优选在0.02重量％至0.10重量％的范围内。螯合剂可用于螯合组合物中可能对制剂的保质期有害的金属离子。虽然BHT和乙二胺四乙酸二钠分别是一些化合物特别优选的抗氧化剂和螯合剂，但是如本领域技术人员已知的，其他合适且等效的抗氧化剂和螯合剂也可以取代所述BHT和乙二胺四乙酸二钠。

可使用常规方法来制备液体悬浮剂，以实现本公开的肽或其他组合物在水性或油性媒介物中的悬浮。水性媒介物包括，例如，水和等渗盐水。油性媒介物包括，例如，杏仁油、油性酯、乙醇、植物油(诸如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)、分馏的植物油和矿物油(诸如液体石蜡)。液体悬浮剂可进一步包含一种或多种额外的成分，包括但不限于悬浮剂、分散剂或润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。油性悬浮剂可进一步包含增稠剂。

已知的悬浮剂包括但不限于山梨醇糖浆、氢化食用脂肪、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、阿拉伯胶、以及纤维素衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。已知的分散剂或润湿剂包括但不限于天然存在的磷脂(诸如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸、与长链脂肪醇、与来源于脂肪酸和己糖醇的偏酯或与来源于脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，分别为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯氧十六醇、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯和聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括但不限于甲基、乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯、抗坏血酸和山梨酸。

在一些实施方案中，可以向有需要的受试者施用治疗有效量的包含本公开的修饰的免疫细胞的药物组合物。

药物组合物或制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌肉内、鼻内、颊内、舌下或栓剂施用的那些药物组合物或制剂。在一些实施方案中，修饰的免疫细胞群是肠胃外施用的。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，本公开的免疫细胞通过静脉内、腹膜内或皮下注射使用外周全身递送施用于受试者。

本公开的细胞可通过气雾吸入、注射、摄取、输液、植入或移植施用于受试者。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在其他情况下，将本公开的死细胞直接注射至受试者的炎症部位、受试者的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等中。应理解，可用于本公开的方法和组合物不限于实施例中示出的特定制剂。提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本公开的细胞、扩增和培养方法、以及治疗方法的完整公开内容和描述，并且不旨在限制发明人视作其发明的内容的范围。

用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌。一般而言，可以10⁴个细胞/kg体重至10⁹个细胞/kg体重的剂量施用包含本文所述的修饰的免疫细胞的药物组合物，在一些情况下以10⁴个细胞/kg体重至10⁶个细胞/kg体重的剂量，包括这些范围内的所有整数值。免疫细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可通过使用免疫疗法中普遍已知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等人,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。

VII.治疗方法

A.TACA CAR

在一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：将本公开的核酸、本公开的TACA嵌合抗原受体、或包含本公开的TACA CAR核酸的表达载体引入细胞(免疫细胞)以产生修饰的细胞；以及向受试者使用修饰的细胞。在一些实施方案中，从受试者获得细胞(即，细胞是自体的)，进行离体工程化，并且施用于同一受试者。在一些实施方案中，从不同的受试者获得细胞，进行离体经工程化，并且施用于第二个合适的受试者(即，细胞是同种异体的)。

在一个方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用免疫治疗组合物，所述免疫治疗组合物包含：本文所述的修饰的细胞；本文所述的嵌合抗原受体(CAR)；或本文所述的组合物。

本公开的一个方面提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效组合物，所述治疗有效组合物包含修饰的细胞，所述修饰的细胞包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，CAR包含抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:30-54；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；CD8铰链结构域或CD28铰链结构域；CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域；CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域；以及CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，在不存在与强直性信号传导TACA CAR缔合的靶癌细胞的情况下，所述修饰的细胞不太容易受到耗竭和/或细胞因子产生的影响。

本公开的一个方面包含一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向哺乳动物施用有效量的本文所述的修饰的细胞群或包含本文所述的修饰的细胞的组合物。

在一些实施方案中，提供了一种方法，其包括从受试者获取免疫细胞、通过将编码本公开的TACA CAR基因的核酸引入至免疫细胞中来对免疫细胞进行遗传修饰、以及将修饰的免疫细胞施用于受试者。在一些实施方案中，免疫细胞选自T细胞、未致敏T细胞、记忆T细胞、效应T细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)或巨噬细胞。在一个实施方案中，免疫细胞是T细胞。

在一个实施方案中，免疫细胞是从受试者获得的。免疫细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的一些实施方案中，可使用本领域中可用的任何数量的免疫细胞系。在本公开的一些实施方案中，可使用技术人员已知的任何数量的技术(诸如Ficoll^TM分离)从收集自受试者的血液中获得免疫细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即3x28)缀合的珠子(诸如M-450CD3/CD28 T)孵育足以对期望的T细胞进行阳性选择的一段时间来分离免疫细胞。

在一个实施方案中，时间段为约30分钟。在一个实施方案中，时间段的范围为30分钟至36小时或更长时间以及其间的所有整数值。在一个实施方案中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在一个实施方案中，时间段为10小时至24小时。在一个实施方案中，孵育时间段为24小时。对于从白血病患者中分离T细胞，使用较长的孵育时间(诸如24小时)可以增加细胞产量。在与其他细胞类型相比T细胞较少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞，诸如从肿瘤组织或从免疫失能的个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。此外，使用较长的孵育时间可以增加CD8⁺T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长允许T细胞与CD3/CD28珠子结合的时间和/或通过增加或减少珠子与T细胞的比率(如本文进一步所述)，可以在培养起始时或过程期间的其他时间点优先选择或反对T细胞亚群。此外，通过增加或减少珠子或其他表面上的抗CD3和/或抗CD28抗体的比率，可以在培养起始时或其他期望的时间点优先选择或反对T细胞亚群。理解的人员将认识到，在本发明的上下文中也可使用多轮选择。

在一些实施方案中，可能期望进行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”的细胞也可以经历进一步的多轮选择。然后如本文所述对所获得的细胞进行修饰。将编码本公开的TACA CAR的核酸(通常位于表达载体中)引入至免疫细胞中，使得免疫细胞将表达(优选稳定地表达)CAR。

根据免疫细胞的性质和待治疗的疾病，可以多种方式将修饰的免疫细胞(例如，修饰的T细胞或NK细胞)引入受试者，例如哺乳动物。可以将遗传工程化免疫细胞引入肿瘤部位。在一个实施方案中，将遗传工程化免疫细胞导航至癌症或修饰遗传工程化免疫细胞以导航至癌症。所采用的修饰的免疫细胞的数量将取决于多种因素，诸如环境、引入的目的、细胞的寿命、待使用的方案。例如，所采用的修饰的免疫细胞的数量可取决于施用次数、细胞倍增的能力和重组构建体的稳定性。修饰的免疫细胞可以作为分散体注射至感兴趣的部位或附近来应用。在一个实施方案中，细胞可以处于生理学上可接受的培养基中。应理解，治疗方法受许多变量的影响，诸如对TACA CAR的细胞反应、免疫细胞表达TACA CAR的效率以及分泌水平(视情况而定)、表达的CAR的活性、受试者的特定需要(这可能随着时间和环境而变化)、由于修饰的免疫细胞的损失或单个细胞的表达活性而导致的细胞活性的丧失率等。因此，预计对于每个个体患者，即使存在可以施用于广大人群的通用细胞，也需要对每个患者进行监测以确定适合其个体的适当剂量，并且此类监测患者的实践是本领域的常规做法。

在一个实施方案中，本发明的修饰的T细胞可以在体内经历稳健的T细胞扩增并且可以持续较长时间。在另一个实施方案中，本发明的修饰的T细胞逐渐演变成特定的记忆T细胞，其可被重新激活以抑制任何额外的肿瘤形成或生长。例如，本发明的修饰的T细胞可以在体内经历稳健的T细胞扩增，并在血液和骨髓中在较长时间内保持高水平，并形成特定的记忆T细胞。

在本文公开的治疗癌症的方法的一些实施方案中，编码CAR的分离的核酸包含表达载体；和/或体外转录的RNA。在一些实施方案中，CAR选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewis^x/a、二唾液酸基-Lewis^x/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。在一个实施方案中，CAR选择性地靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖、GalNAc、Tn抗原、GalNAcα-ser、GalNAc或GalNAcβ1。

B.癌症

在一个方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法。所述方法可用于治疗任何癌症，包括血液恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤。

可以治疗的癌症包括未血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤、以及某些白血病或淋巴系统恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：血液恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤、白血病、癌、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴系统恶性肿瘤、黑色素瘤和淋巴瘤、良性和恶性肿瘤、以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。在一些实施方案中，癌症可以是未血管化或尚未实质上血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液肿瘤，例如，白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：血液恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤、白血病、癌、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴系统恶性肿瘤、黑色素瘤和淋巴瘤。

血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和粒细胞性白血病、早幼粒细胞白血病、粒单核细胞白血病、单核细胞白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良。

实体瘤是异常的组织肿块，通常不含有囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤根据形成它们的细胞类型来命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤，诸如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴系统恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、髓样甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆氏瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑色素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤(诸如脑干神经胶质瘤和混合型神经胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、髓母细胞瘤、许旺氏细胞瘤(Schwannoma)、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。

待使用本公开的修饰的免疫细胞(例如，包含TACA CAR的修饰的T细胞)或药物组合物治疗的示例性癌症类型包括非小细胞肺癌。肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，并且尽管疗法取得了进步，但仍然存在显著的未满足的需求。非小细胞肺癌(NSCLC)占美国所有肺癌病例的85％，剩余15％中的很大一部分是小细胞肺癌(SCLC)。Zappa等人TranslLung Cancer Res,5(3):288-300(2016)；Alvarado-Luna等人Transl Lung Cancer Res,5(l):26-38)(2016)。手术切除仍然是局部性NSCLC最一致和最成功的选择；然而，近70％的肺癌患者在诊断时已存在局部晚期或转移性疾病。Molina等人,Mayo Clin Proc,83(5):584-594(2008)。总体而言，肺癌患者的预后较差，5年相对生存率小于18％。患有IV期NSCLC的患者的中位OS时间是4个月，而1年生存率和5年生存率分别为小于16％和小于2％。Cetin等人Clin Epidemiol,3:139-148(2011)。

待使用本发明的修饰的免疫细胞(例如，包含TACA CAR的修饰的T细胞)或药物组合物治疗的示例性癌症类型包括胰腺腺癌。胰腺导管腺癌是一种高度致命的恶性肿瘤。其是美国癌症相关死亡的第四大主要原因，每年大约有45,000例新病例。手术切除是唯一可能治愈的治疗方法，然而由于大多数患者患有晚期疾病，仅有15％-20％的患者适合手术干预。Fogel等人,Am J Gastroenterology,112(4):537-555(2017)。总体而言，即使进行手术干预，预后仍然很差：手术治疗后淋巴结阴性患者的五年生存率为大约25％，并且淋巴结阳性患者的五年生存率为大约10％。由于大多数患者存在无法切除的疾病，因此化疗是主要治疗方法。

待使用本发明的修饰的免疫细胞(例如，包含TACA CAR的修饰的T细胞)或药物组合物治疗的示例性癌症类型包括上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌通常包括输卵管恶性肿瘤以及原发性腹膜癌。多于70％的患有上皮性卵巢癌的女性在首次诊断时已存在晚期疾病。虽然患有晚期疾病的患者经手术减瘤以及基于铂类和紫杉类的化疗后可实现完全缓解，但最终仍有高达80％的患者会出现复发。Herzog等人,Gynecol Oncol Res Pract,4:13(2017)。

在一些实施方案中，施用TACA结合凝集素和凝集素结合组合物(例如，经工程化以表达抗凝集素CAR的T细胞)可能是有益的。首先，由于凝集素的半衰期比工程化T细胞短得多，因此该方法能够限制T细胞反应的时间。工程化T细胞可保留数年，但如果没有凝集素，T细胞将会失去活性，从而允许通过限制反应的持久性更容易地靶向实体癌。

在一些实施方案中，向受试者施用修饰的免疫细胞群。在一个实施方案中，修饰的免疫细胞群包含选自由自然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和T细胞组成的组的免疫细胞。在一些示例性实施方案中，修饰的免疫细胞群包含修饰的T细胞。在一些实施方案中，修饰的免疫细胞是自体或异源免疫细胞。

本公开提供了一种细胞疗法，其中T细胞经遗传修饰以表达本发明的肽，并且将所述细胞输注至有需要的受体。在某些实施方案中，输注的细胞能够杀伤受体体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，修饰的细胞能够在体内复制，导致长期持久性，从而可导致持续的肿瘤控制。在一个实施方案中，本文公开的修饰的细胞可以在体内经历稳健的T细胞扩增并且可以持续较长时间。在另一个实施方案中，本发明的修饰的T细胞逐渐演变成特定的记忆T细胞，其可被重新激活以抑制任何额外的肿瘤形成或生长。例如，本发明的修饰的T细胞可以在体内经历稳健的T细胞扩增，并在血液和骨髓中在较长时间内保持高水平，并形成特定的记忆T细胞。

D.施用

本公开的修饰的免疫细胞的施用可通过选自以下的至少一种方式施用：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、经颊、舌下、鼻内或透皮。在一些实施方案中，本公开的修饰的免疫细胞的施用可以本领域技术人员已知的任何方便的方式来进行。

在一些实施方案中，施用可经由肿瘤内递送、经由静脉内递送或经由腹膜内递送来进行。待向有需要的受试者施用的修饰的免疫细胞(例如，修饰的T细胞)的量通常是治疗有效量。本公开的细胞的施用可以与本领域技术人员确定的可用于治疗期望的疾病或疾患的其他方法组合。

关于正在经历疗法的受试者，待施用的本公开的修饰的免疫细胞可以是自体的或异源的。本公开的免疫细胞的施用可以本领域技术人员已知的任何方便的方式进行。本公开的免疫细胞可通过气雾吸入、注射、摄取、输液、植入或移植而施用于受试者。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用于患者。在其他情况下，将本公开的免疫细胞直接注射至受试者的炎症部位、受试者的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等中。

本发明的组合物可以单独施用，或作为与稀释剂和/或其他组分(诸如IL-2或其他细胞因子或细胞群)组合的药物组合物施用。简而言之，本发明的药物组合物可包含如本文所述的组合物与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物还可包含缓冲液，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸、抗氧化剂；螯合剂，诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。

本发明的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管适当的剂量可通过临床试验来确定，但是施用的数量和频率将通过诸如患者疾患以及患者疾病的类型和严重程度的因素来确定。

当指明“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明的组合物的准确量可以由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异来确定。

主题组合物的施用可以任何方便的方式来进行，包括通过气雾吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文所述的组合物可以皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(iv.)注射或腹膜内施用于患者。在一个实施方案中，本发明的组合物通过真皮内或皮下注射施用于患者。在另一个实施方案中，本发明的组合物通过静脉内注射施用。在某些实施方案中，将组合物直接注射至肿瘤或淋巴结中。

在某些实施方案中，将组合物与任何数量的相关治疗方式结合(例如，之前、同时或之后)施用于患者，所述相关治疗方式包括但不限于用以下进行治疗：化疗、放射、免疫抑制剂(诸如环孢菌素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其他免疫消融剂，诸如CAM PATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)，或者抑制对生长因子诱导的信号传导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321(1991)；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773(1993)。在进一步的实施方案中，将本发明的组合物与骨髓移植、T细胞消融疗法(使用化疗剂诸如氟达拉滨、外放射疗法(XRT)、环磷酰胺，或使用抗体诸如OKT3或CAMPATH)一起施用于患者。在另一实施方案中，本发明的组合物在B细胞消融疗法(诸如与CD20反应的剂，例如，瑞图宣)之后施用。例如，在一个实施方案中，受试者可以经历高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受本发明的扩增的免疫细胞的输注。在额外的实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

在某些实施方案中，在肿瘤或患病组织的手术切除或减瘤期间施用本发明的组合物。例如，在正在经历患病组织或肿瘤的手术治疗的受试者中，可以将组合物施用于所述部位，以便进一步治疗肿瘤。在一个实施方案中，方法包括向受试者施用支架，所述支架包含：包含TACA结合结构域的肽、编码包含TACA结合结构域的肽的核酸分子、经修饰以表达包含TACA结合结构域的肽的细胞或其组合。

考虑施用本发明的组合物和药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类动物、哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛、猪、马、羊、猫和狗。

E.剂量

在一些实施方案中，以期望的剂量施用修饰的免疫细胞，所述期望的剂量在某些方面包括期望的细胞剂量或数量或细胞类型和/或期望的细胞类型比率。因此，在一些实施方案中，细胞的剂量基于细胞总数量(或每kg体重的数量)和各个群或亚型的期望比率，诸如CD4⁺与CD8⁺的比率。在一些实施方案中，细胞的剂量基于各个群或各个细胞类型中的期望的细胞总数量(或每kg体重的数量)。在一些实施方案中，剂量基于此类特征的组合，诸如各个群中的期望的总细胞数量、期望的比率和期望的细胞总数量。

在一些实施方案中，细胞群或细胞亚型，诸如CD8⁺和CD4⁺T细胞，以期望的总细胞剂量(诸如期望的T细胞剂量)的可耐受差异或在可耐受差异内施用。在某些方面，期望的剂量是期望的细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的期望细胞数量，例如，细胞/kg。在某些方面，期望的剂量等于或高于最少细胞数量或每单位体重的最少细胞数量。在某些方面，在以期望的剂量施用的总细胞之中，各个群或亚型以期望的输出比率(诸如CD4⁺与CD8⁺的比率)存在或以接近期望的输出比率存在，例如，在这种比率的某个可耐受差异或误差内。

在一些实施方案中，细胞以各个细胞群或细胞亚型中的一个或多个的期望的剂量的可耐受差异或在所述可耐受差异内施用，诸如期望的CD4⁺细胞剂量和/或期望的CD8⁺细胞剂量。在某些方面，期望的剂量是亚型或群的期望的细胞数量或被施用细胞的受试者的每单位体重的期望的此类细胞的数量，例如，细胞/kg。在某些方面，期望的剂量等于或高于群或亚型的最少细胞数量或每单位体重的群或亚型的最少细胞数量。因此，在一些实施方案中，剂量基于总细胞的期望的固定剂量和期望的比率，且/或基于各个亚型或亚群中的一个或多个(例如，每一个)的期望的固定剂量。因此，在一些实施方案中，剂量基于T细胞的期望的固定或最少剂量和期望的CD4⁺与CD8⁺细胞的比率，且/或基于CD4⁺和/或CD8⁺细胞的期望的固定或最小剂量。

在一些实施方案中，以约一百万至约1000亿个细胞的范围向受试者施用修饰的免疫细胞或免疫细胞亚型的各个群，诸如，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由上述值中的任何两个定义的范围)，诸如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由上述值中的任何两个定义的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围之间的任何值。

在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或细胞的各个亚群的剂量在等于或约l xl0⁵个细胞/kg至约l x 10¹¹个细胞/kg、10⁴和等于或约10¹¹个细胞/千克(kg)体重之间的范围内，诸如在10⁵和10⁶个细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x10⁵个细胞/kg、1.5x10⁵个细胞/kg、2x10⁵个细胞/kg或1x10⁶个细胞/kg体重。例如，在一些实施方案中，细胞以等于或约10⁴至等于或约10⁹个T细胞/千克(kg)体重之间的某个误差范围施用或在所述误差范围内施用，诸如10⁴至10⁶个T细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x10⁴个T细胞/kg、1.5x10⁴个T细胞/kg、2x10⁵个T细胞/kg或1x10⁶个T细胞/kg体重。在其他示例性实施方案中，用于本公开的方法的修饰的细胞的合适的剂量范围包括但不限于约1x 10⁴个细胞/kg至约l x 10⁶个细胞/kg、约l x 10⁶个细胞/kg至约l x 10⁷个细胞/kg、约l x 10⁷个细胞/kg至约l x 10⁸个细胞/kg、约l x 10⁸个细胞/kg至约l x 10⁹个细胞/kg、约l x 10⁹个细胞/kg至约l x 10¹⁰个细胞/kg、约l x 10¹⁰个细胞/kg至约l x 10¹¹个细胞/kg。在示例性实施方案中，用于本公开的方法的合适的剂量为约1x10s个细胞/kg。在示例性实施方案中，用于本公开的方法的合适的剂量为约l x 10⁷个细胞/kg。在其他实施方案中，合适的剂量为约l x 10⁷个总细胞至约5x10⁷个总细胞。在一些实施方案中，合适的剂量为约1x10⁴个总细胞至约5x10⁴个总细胞。在一些实施方案中，合适的剂量为约1.4x10⁷个总细胞至约1.1x10⁹个总细胞。在示例性实施方案中，用于本公开的方法的合适的剂量为约7x10⁹个总细胞。在示例性实施方案中，合适的剂量为约l x10⁷个总细胞至约3x10⁷个总细胞。

在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或各个细胞亚群的剂量为等于或约1x10⁴个细胞/m2至约1x10¹¹个细胞/m²之间的范围内。在示例性实施方案中，总细胞的剂量和/或各个细胞亚群的剂量为等于或约l x l0⁷/m²至等于或约3xl0⁷/m²之间的范围内。在示例性实施方案中，总细胞的剂量和/或各个细胞亚群的剂量为等于或约l xl0⁸/m²至等于或约3x10⁴/m²之间的范围内。在一些实施方案中，总细胞的剂量和/或各个细胞亚群的剂量是给定患者的最大可耐受剂量。

在一些实施方案中，细胞以等于或约10⁴至等于或约10⁹个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/千克(kg)体重之间的某个误差范围施用或在所述误差范围内施用，诸如10⁴至10⁶个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重之间，例如，等于或约1x10⁴个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg、1.5x10⁴个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg、2x10⁴个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg或1x10⁶个CD4⁺和/或CD8⁺细胞/kg体重。在一些实施方案中，细胞以大于和/或至少l x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶或约9x10⁶个CD4⁺细胞，和/或至少1x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶或约9x10⁶个CD8⁺细胞，和/或至少约1x10⁶、约2.5x10⁶、约5x10⁶、约7.5x10⁶或约9x10⁶个T细胞的某个误差范围施用或在所述误差范围内施用。在一些实施方案中，在一些实施方案中，细胞以约10⁸至10¹²之间或约10¹⁰至10¹¹个T细胞之间、约10⁸至10¹²之间或约10¹⁰至10¹¹个CD4⁺细胞之间，和/或约10⁸至10¹²之间或约10¹⁰至10¹¹个CD8⁺细胞之间的某个误差范围施用或在所述误差范围内施用。

在一些实施方案中，修饰的免疫细胞以多种细胞群或亚型(诸如CD4⁺和CD8⁺细胞或亚型)的期望输出比率的可耐受范围施用或在所述范围内施用。在一些方面，期望的比率可以是特定比率或者可以是比率范围，例如，在一些实施方案中，期望的比率(例如，CD4⁺细胞与CD8⁺细胞的比率)为等于或约5:1至等于或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或等于或约1:3至等于或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，诸如等于或约2:1至等于或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，诸如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，可耐受差异在期望的比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％内，包括在这些范围之间的任何值。

在一些实施方案中，以单剂量或多剂量的形式向有需要的受试者施用修饰的细胞的剂量。在一些实施方案中，以多剂量施用修饰的细胞的剂量，例如每周或每7天一次、每2周或每14天一次、每3周或每21天一次、每4周或每28天一次。在示例性实施方案中，向有需要的受试者施用单剂量的修饰的细胞。在示例性实施方案中，通过快速静脉内输注向有需要的受试者施用单剂量的修饰的细胞。在一些实施方案中，以分次剂量或分割剂量的形式向有需要的受试者施用修饰的细胞的剂量。在此类实施方案中，施用第一剂，并在第一剂后1天或多天、2天或更多天、3天或更多天、4天或更多天、5天或更多天、6天或更多天、7天或更多天、8天或更多天、9天或更多天、10天或更多天、11天或更多天、12天或更多天、13天或更多天、2周或更多周、3周或更多周、4周或更多周、5周或更多周或其间的任何时间段施用后续剂量。为预防或治疗疾病，适当的剂量可能取决于待治疗疾病的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、细胞是出于预防或治疗的目的施用、先前疗法、受试者的病史和对细胞的反应、以及主治医师的判断。在一些实施方案中，组合物和细胞适合于一次或在一系列治疗中施用于受试者。

在一些实施方案中，修饰的免疫细胞作为组合治疗的一部分进行施用，诸如与另一种治疗干预(诸如抗体或工程化细胞或受体或剂(诸如细胞毒性剂或治疗剂))同时或按任何顺序依次进行施用。在一些实施方案中，修饰的免疫细胞与一种或多种额外的治疗剂或与另一种治疗干预同时或按任何顺序依次地共同施用。在一些情况下，细胞与另一种疗法以足够接近的时间共同施用，使得细胞群增强了一种或多种额外的治疗剂的效果，反之亦然。在一些实施方案中，在一种或多种额外的治疗剂之前施用细胞。在一些实施方案中，在一种或多种额外的治疗剂之后施用细胞。在一些实施方案中，一种或多种额外的剂包括细胞因子，诸如IL-2，例如，以增强持久性。在一些实施方案中，方法包括施用化疗剂。

在一些实施方案中，在施用细胞后测量工程化细胞群的生物活性，例如通过多种已知方法中的任一种。评估参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原在体内(例如，通过成像)或在体外(例如，通过ELISA或流式细胞术)的特异性结合。在某些实施方案中，可使用本领域中已知的任何合适方法来测量工程化细胞破坏靶细胞的能力，所述方法诸如在例如，Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009)和Herman等人,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(诸如CD 107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物活性。在某些方面，通过评估临床结果(诸如肿瘤负担或负荷的减少)来测量生物活性。在某些实施方案中，除了CAR之外，还可以对受试者施用二次治疗。

在一些实施方案中，可以在CAR T细胞疗法之前对受试者施用调理疗法。因此，本公开提供了一种治疗方法，其包括在施用CAR T疗法(例如，包含本公开的TACA CAR的修饰的T细胞)之前施用调理疗法。在TACA CAR T细胞疗法之前施用调理疗法可提高TACA CAR T细胞疗法的功效。美国专利号9,855,298描述了调理患者以进行T细胞疗法的方法。

待施用于患者的上述治疗的剂量将因所治疗的疾患的具体性质和治疗的受体而异。可根据本领域接受的实践来调整用于人施用的剂量。已经讨论了用于T细胞给药和安排的策略(Ertl等人,2011,Cancer Res,71:3175-81；Junghans,2010,Journal ofTranslational Medicine,8:55)。

实施例

这些实施例仅仅出于说明性目的提供，并且不限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1：GlyTR1双特异性蛋白中的β1,6GlcNAc-分支N-聚糖的改进的靶向

由于几乎所有细胞表面蛋白都是糖基化的，癌细胞中的TACA靶密度可比典型的蛋白质抗原高出约100-1000倍。因此，增加GlyTR中的TACA结合结构域的数量可通过增强结合亲合力来驱动癌细胞特异性。与抗体不同，在抗体中使用高亲和力来实现特异性。高亲合力结合是通过高密度靶标表达和多个碳水化合物结合结构域的存在的组合来实现的。高靶标密度和多个结合位点的组合应导致相对于低表达细胞对高表达细胞具有高特异性。因此，多价GlyTR蛋白对TACA的特异性将不是由靶标的存在或不存在决定的，而是由具有多个TACA结合结构域的GlyTR特异性检测到的靶标表达的阈值密度决定的。以这种方式，生成多价GlyTR蛋白应进一步提高对高靶标表达癌细胞的特异性并且保留了较低表达的正常组织。本文使用靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖(GlyTR1)和Tn抗原(GlyTR2)的两种不同的GlyTR蛋白证明了这个概念。

改进原始GlyTR1^LPHAxCD3蛋白的设计

原始GlyTR1^LPHAxCD3蛋白和序列将单个L-PHA结构域(菜豆，白细胞凝集素)与对CD3蛋白具有特异性的单个scFv结构域(OKT3克隆)连接(图1A)。参见例如，PCT/US2016/030113。L-PHA是一种对β1,6GlcNAc分支N-聚糖具有高度特异性的植物凝集素。原始GlyTR1^LPHAxCD3具有适中的癌症杀伤活性(EC50约1nM)。尺寸排阻色谱法揭示了GlyTR1^LPHAxCD3主要是约100kDa的二聚体，而预测值为55kDa(图1B)，并因此含有两个L-PHA和两个抗CD3结合结构域。由于天然L-PHA是四聚体，因此二聚体的形成并不意外。L-PHA蛋白的远离碳水化合物结合位点的前5个N末端氨基酸形成β折叠片层，所述β折叠片层通过反平行结合诱导二聚体形成。相对于二聚体GlyTR1LPHAxCD3，删除GlyTR1^LPHAxCD3中的L-PHA结构域的前五个氨基酸(图1A)以阻断二聚化并生成具有单个L-PHA结构域的单体GlyTR显著降低了与β1,6GlcNAc分支N-聚糖的结合和杀伤癌细胞的能力。因此，与包含两个TACA结合结构域的GlyTR1蛋白相比，GlyTR1蛋白内的单个TACA结合结构域显示出显著降低的结合。

为了进一步改善原始GlyTR1^LPHAxCD3双特异性蛋白的活性，生成了具有通过三个柔性接头(即(GGGGS)3)串联连接的两个L-PHA结构域的GlyTR1^LPHA(2)xCD3(＝GlyTR^{1LPHAxLPHAxCD3})(图1A)。尺寸排阻色谱法(SEC)揭示了GlyTR1^LPHA(2)xCD3约50％-70％为二聚体，其余为单体(约30％-40％)或更大的多聚体(约10％-20％)(图1C)。二聚体形成是稳定的，如在SEC上重新运行二聚体部分揭示>99％仍然是二聚体(数据未示出)。直接比较GlyTR1^LPHA(2)xCD3的单体(两个L-PHA结构域)和二聚体(四个L-PHA结构域)部分揭示了后者与β1,6GlcNAc分支N-聚糖的结合显著更高，进一步证实增加GlyTR1蛋白中的TACA结合结构域数量导致了更高的效力。

事实上，与靶标癌细胞结合的二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3(四个L-PHA结构域)显著优于原始二聚体GlyTR1^LPHAxCD3(两个L-PHA结构域)，导致癌细胞杀伤活性增加了>3000倍。此外，二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3有效地触发了多种液体癌和固体癌类型的人T细胞依赖性杀伤，EC₅₀低至<100飞摩尔，所述液体癌和固体癌包括多发性骨髓瘤、T细胞白血病、急性髓系白血病(AML)、胰腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌。

二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3(＝二聚体GlyTR1^{LPHAxLPHAxCD3})的体内癌症杀伤

评估了两种带有荧光素酶以进行体内成像的癌细胞系：三阴性乳腺癌(MDA-MD-231-Fluc)和卵巢癌(SKOV3-Fluc)。为了限制非匹配的T细胞(在不存在GlyTR1的情况下)对人癌细胞的同种异体杀伤，在两种细胞系(即MDA-MB-231-Fluc-M1-和SKOV3-Fluc-M1-)中删除了MHC I类基因(即β2微球蛋白)。流式细胞术证实了细胞表面处的HLA ABC I类的损失(数据未示出)。为了评估体内癌细胞杀伤，向NSG小鼠腹膜内(i.p.)注射MDA-MB-231-Fluc-M1^-或SKOV3-Fluc-M1^-细胞，并在5天后一旦肿瘤形成，每3-4天向小鼠腹膜内注射纯化的CD8⁺T细胞，分别注射2次或3次，同时每日两次腹膜内注射GlyTR1^{LPHAxLPHAxCD3}。在两种模型中，每日两次10ug的GlyTR1^{LPHAxLPHAxCD3}诱导了明显的肿瘤消退，许多小鼠在治疗<1周后就展示出无法检测到的疾病。无法评估长期生存曲线，因为用PBMC人源化的NSG小鼠从约3周-4周开始出现GvHD，从而导致死亡。在较低剂量(5ug和1.5ug，每日两次)下，GlyTR1^{LPHAxLPHAxCD3}剂量依赖性地减少了肿瘤进展，但效果不如10ug给药。

重要的是，将荧光标记的GlyTR1^{LPHAxLPHAxCD3}注射至具有或不具有转移性MDA-MB-231-Fluc-M1^-/-细胞的NSG小鼠中(通过尾静脉注射)，证明了GlyTR1LPHAxLPHAxCD3在患有而非不患有癌症的肺中积累。在人的四个染色最高的正常器官中的三个(即肾、胃和小肠)中，小鼠和人之间的二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3靶标表达(β1,6GlcNAc-分支N-聚糖)相似。然而，在体内容易地触发稳健癌症杀伤的剂量下，人源化小鼠的二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3治疗不诱导1)主要器官的“中靶、脱癌症”毒性或2)非特异性T细胞激活。“中靶、脱癌症”器官毒性的缺乏与荧光标记的二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3具有最高靶标表达的小鼠组织(即肾、胃和小肠)中没有显著积累一致。肾毒性缺乏也与二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3(约182kDa)的分子量远高于约70kDa的肾小球过滤截止值一致。这应限制了二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3进入靶标表达最高的鲍氏囊(bowman’s space)腔/小管腔，从而进一步减轻肾毒性的潜在风险。最后，体内肾和肝毒性的缺乏与体外数据一致，即二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3不会诱导原代人肾上皮细胞或原代人肝细胞的T细胞杀伤。

实施例2：靶向Tn抗原的GlyTR2双特异性蛋白的生成和优化

Tn抗原。尽管在正常人组织的细胞表面未发现Tn抗原，但其在约90％的人癌症和许多造血系统癌症中表达。事实上，Tn抗原是已知的最特异的人癌症相关结构之一，并且促进了细胞运动、侵袭和转移。Tn抗原是连接至蛋白质(如粘蛋白)中的丝氨酸/苏氨酸的单个N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)α-O。Tn是O-聚糖的生物合成前体，其通常用α1,3连接的半乳糖延长。配偶体蛋白COSMC是T合酶将半乳糖添加至GalNAc所需的蛋白质，在癌症中经常发生改变。ER/高尔基体内酶的错误定位也可能导致人癌症中Tn抗原表达异常。Tn抗原可通过唾液酸异常延长形成sTn抗原；所述sTn抗原通常也不在正常组织中表达。

靶向Tn抗原。为了生成靶向Tn抗原的第一GlyTR蛋白，利用了人CD301(CLEC10 A，巨噬细胞半乳糖凝集素)。CD301(CLEC10)是一种在巨噬细胞和树突状细胞中表达的跨膜凝集素，其用作非自身抗原的模式识别受体并与Tn⁺癌症结合。参见例如，Nollau等人,J.histochemistry and cytochemistry,61:199-205(2013)；Lenos等人,Oncotarget 6:26278-26290(2015)。详细的结合分析证明，人CD301对含有具有暴露的3-羟基和4-羟基(这种结构是Tn癌症抗原的典型结构，而非其他常见聚糖的典型结构)的GalNAc的小聚糖具有高度特异性。CD301还与其他三种熟知的含有3-羟基和4-羟基暴露的GalNAc的癌症特异性聚糖抗原强烈结合，即sTn和神经节苷脂GD2和GM236。这三种聚糖抗原是唯一进入III期免疫疗法临床试验的TACA，其中抗GD2单克隆抗体已获得FDA批准用于神经母细胞瘤。

与模式识别受体一致，CD301也结合无脊椎动物聚糖LacdiNAc(GalNAcβ1,4GlcNAc)。哺乳动物细胞通常不表达LacdiNAc，但表达在许多人癌症中通常被诱导。A血型聚糖抗原具有末端GalNAc残基，然而CD301在A血型个体中表达而不诱导毒性。事实上，CD301无法结合组织微阵列上的A血型阳性RBC或血管(数据未示出)。最后，全人蛋白质CD301应具有较差的免疫原性。因此，人CD301对Tn抗原和其他三种熟知的TACA具有高度特异性。

为了使用CD301生成靶向Tn抗原的GlyTR2双特异性蛋白，将人CD301的细胞外结构域与对CD3具有特异性的scFv结构域组合。参见例如，国际申请号PCT/US2016/030113。然而，这种蛋白质无法在CHO细胞中表达，可能是因为蛋白质错误折叠。CD301细胞外结构域由颈部区和单个TACA结合结构结构域(TBD)组成。颈部区促进了CD301的三聚化。参见例如，Jegouzo等人,Glycobiology 23:853-864(2013)；Napoletano等人,Eur.J.Immunol.42:936-945(2012)。因此，删除颈部区应避免了多聚化，并可能促进GlyTR2蛋白的折叠。事实上，含有单个CD301 TACA结合结构域而没有大部分颈部区的GlyTR2^CD301xCD3容易地表达并结合Tn^高Jurkat-TCRβ-/-白血病T细胞(图2A)。Jurkat-TCRβ-/-白血病T细胞由于配偶体蛋白COSMC(T合酶用半乳糖延长GalNAc并产生成熟O-聚糖所需的蛋白质)的突变而表达最大水平的Tn抗原。CD301的CRD中对糖和钙结合至关重要的5个氨基酸的点突变，即Gln267Gly、Asp269Gly、Glu280Gly、Asn292Gly andAsp293Gly(NCBI Ref Seq NP_878910.1)，消除了mutGlyTR2^CD301xCD3与Tn^高Jurkat-TCR^β-/-白血病T细胞的结合(图2A)。Oo-Puthinan等人,Biochim.Biophys.Acta 1780:89-100(2008)。本文所述的GlyTR1的数据表示，添加额外的TACA结合结构域增强了对TACA的结合亲合力。与此一致，GlyTR2^CD301(3)xCD3(三个CD301结构域)在与Tn⁺Jurkat-TCRβ-/-白血病T细胞结合时优于GlyTR2^CD301xCD3(单个CD301结构域)(图2A)。可溶性Tn抗原(GalNAcα-Ser)和GalNAc(而非相关糖半乳糖和GlcNAc)阻断了GlyTR2^CD301xCD3与Tn^高Jurkat-TCRβ^-/-白血病T细胞的结合，证实了GlyTR2^CD301(3)xCD3对Tn抗原的特异性。添加第四个CD301结构域(即GlyTR2^CD301(4)xCD3)相对于具有三个结合结构域的GlyTR2^CD301(3)xCD3进一步改善了结合。

然而，尺寸排阻色谱法表示GlyTR2^CD301(3)xCD3主要由大的多聚体组成(图2B)，这将对制造一致性和潜在的体内活性和安全性产生负面影响。因此，为了降低多聚化的潜力，将各个CD301结构域分离的柔性接头(GGGGS(3)；SEQ ID NO:71)用刚性接头(AEAAAKA(2)；SEQID NO:75)(图2A中的GlyTR2^{slCD301(4)xCD3})替换。事实上，尺寸排阻色谱法(SEC)揭示了具有刚性接头(AEAAAKA(2)；)的GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}是单体(图2A)。GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}(刚性接头，四个CD301结构域)与Tn^高Jurkat-TCRβ^-/-白血病T细胞的结合与GlyTR2^CD301(3)xCD3(柔性接头，三个CD301结构域)相似，但与多种Tn表达较低的肿瘤细胞系的结合显著更好。GalNAc而非相关糖GlcNAc容易地阻断了GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}与Tn⁺MM1R多发性骨髓瘤细胞的结合，证实了与Tn抗原结合的特异性。考虑到这些数据，选择GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}用于进一步表征。

GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}的体外和体内癌症杀伤GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}剂量依赖性地触发T细胞介导的多种Tn⁺液体和实体癌症的杀伤，EC₅₀在高pM至低nM范围内，所述癌症包括多发性骨髓瘤、T细胞白血病、AML、胰腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌。没有PBMC/T细胞时几乎不会发生杀伤，证实了GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}的细胞杀伤需要T细胞。CD8⁺T细胞容易地诱导了删除β2-微球蛋白的乳腺癌细胞的杀伤，证明这种杀伤不依赖MHC I类。GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}在存在而非不存在Tn抗原阳性癌细胞的情况下诱导了稳健的T细胞激活。因此，GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}应具有降低的非特异性T细胞激活和细胞因子释放综合征的风险。参见，例如，同时提交的国际申请号PCT/US2023/024898(标题为“Improved Glycan-Dependent Immunotherapeutic Bi-Specific Fusion Proteins and Chimeric AntigenReceptors”)。

为了首先评估GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}的体内活性，通过删除基因COSMC，最大程度地增加MDA-MB-231-Fluc-M1-乳腺癌细胞(即，MDA-MB-231-luc⁺MI^-/-C^-/-细胞)中的Tn抗原表达。GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}在体外容易地诱导了纯化的CD8⁺T细胞杀伤这些细胞。在建立乳腺癌肿瘤的小鼠中，与对照小鼠相比，15天的GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}治疗剂量依赖性地诱导了用CD8⁺T细胞人源化的NSG小鼠中的肿瘤消退。为了确认在Tn抗原表达更适中的实体癌症中的体内活性，利用了敲除了MHC I类的SKOV3卵巢癌细胞。与乳腺癌一样，相对于对照小鼠，GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}治疗在用CD8⁺T细胞人源化的NSG小鼠中诱导了明显的卵巢肿瘤消退。将荧光标记的GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}注射至具有或不具有转移性MDA-MB-231-Fluc-MI^-/-C^-/-细胞的NSG小鼠中(通过尾静脉注射)，证明了GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}在患有而非不患有癌症的肺中积累，这表示其对体内癌细胞具有特异性。总之，这些数据证明了GlyTR^{slCD301(4)xCD3}在体内容易地诱导了Tn⁺癌症的杀伤。参见，例如，同时提交的国际申请号PCT/US2023/024898(标题为“Improved Glycan-Dependent Immunotherapeutic Bi-Specific Fusion Proteins andChimeric Antigen Receptors”)。

实施例3：GlyTR-CAR T细胞展示出抗原非依赖性强直性CAR信号传导

通过将上述实施例1和2中描述的GlyTR1^LPHA(2)xCD3和GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}双特异性蛋白的优化设计与CD8跨膜结构域以及41BB和CD3ζ细胞内信号传导结构域融合来生成GlyTR1-CAR和GlyTR2-CAR(图3A)。为了生成GlyTR-CAR T细胞，用Dynabead刺激纯化的T细胞，并在1天后用慢病毒转导以表达GlyTR-CAR。第3天，通过流式细胞术测试细胞的CAR表达，通过去除珠子让所述细胞静置4天，然后以各种比率与癌细胞共培养以评估杀伤活性(图3B)。GlyTR1^LPHA(2)和GlyTR2^slCD301(4)CAR T细胞两者分别容易地杀伤卵巢癌细胞和乳腺癌细胞(图3C-图3E)。未转导的对照T细胞在高T细胞与癌细胞比率下诱导了同种异体杀伤。然而，两种GlyTR-CAR T细胞均展示出抗原非依赖性强直性CAR信号传导。

对于GlyTR1^LPHA(2)CAR T细胞，强直性信号传导表现为：1)尽管静置了4天，但在第7天仍继续爆发(即，基于侧向散射与前向散射(SSC/FSC)，与未转导的细胞相比，细胞明显较大)(图3C)；2)与未转导的细胞相比，第7天细胞死亡增加(即，SSC/FSC上的活细胞为58.3％与87.4％)(图3C)；以及3)在不存在癌细胞的情况下产IFNγ(图4A)。

相对于未转导的细胞，GlyTR2^slCD301(4)CAR T细胞在不存在癌细胞的情况下也表达升高的IFNγ产生(图4B)。此外，高表达而非低表达的GlyTR2^slCD301(4)CAR触发细胞表面CAR聚集和4-1BB激活标志物的诱导(图4C)，进一步表明强直性信号传导。

CAR-T的强直性信号传导是一个常见的设计问题，并且可能有助于癌细胞杀伤，但也可能增加因T细胞过度活化而产生毒性的风险。细胞内和细胞外结构域均可驱动强直性信号传导。Long等人,Nat.Med.21:581-590(2015)。在GlyTR CAR T细胞的情况下，强直性信号传导可能是由细胞外结构域和细胞内结构域共同驱动的。例如，GlyTR1^LPHA(2)xCD3双特异性蛋白中的两个L-PHA结构域诱导二聚化；因此GlyTR1-CAR中的两个L-PHA结构域很可能在细胞表面发生类似二聚化以驱动强直性信号传导。类似地，GlyTR2^slCD301(4)的CD301结构域中存在的N末端或C末端序列也可能促进多聚化以驱动强直性信号传导。最后，两种GlyTR-CAR均利用41BB细胞内信号传导结构域，这可能在不存在CD28共信号传导的情况下驱动强直性CAR信号传导。因此，可以通过改变细胞外结构域以防止多聚化并添加细胞内CD28信号传导结构域来消除/减少GlyTR-CAR T细胞中的强直性信号传导。

然而，尽管有强直性信号传导，GlyTR仍然能够在体外和体内诱导对肿瘤细胞的有效细胞毒作用。在建立乳腺癌肿瘤的小鼠中，与对照小鼠相比，15天的GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}治疗剂量依赖性地诱导了用CD8⁺T细胞人源化的NSG小鼠中的肿瘤消退(图3F-图3G)。为了确认在Tn抗原表达更适中的实体癌症中的体内活性，利用了敲除了MHC I类的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞或SKOV3卵巢癌细胞。与乳腺癌一样，相对于对照小鼠，GlyTR2^{slCD301(4)xCD3}治疗在用CD8⁺T细胞人源化的NSG小鼠中诱导了明显的卵巢肿瘤消退(图3F-图3G)。

实施例4：消除/减少GlyTR1-CAR T细胞中的强直性信号传导改变接头长度和刚度以分离GlyTR1-CAR中的L-PHA结构域

融合蛋白中分隔结构域的连接肽的长度和柔性在融合蛋白的表达、稳定性和功能中发挥重要作用。Chen等人,Advanced drug delivery reviews 65:1357-1369(2013)。柔性(GGGGS)_n接头的三次重复将二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3双特异性蛋白和GlyTR1-CAR中的L-PHA结构域分隔开。形成α螺旋的接头A(EAAAK)nA是一种刚性接头，其已成功用于融合蛋白中以维持两个不同结构域之间的距离，包括GlyTR2双特异性蛋白中。参见实施例2，Chen等人,Advanced drug delivery reviews 65:1357-1369(2013)。改变接头的长度和/或刚度预计会降低CAR二聚化/强直性信号传导。参见，例如，同时提交的国际申请号PCT/US2023/024898(标题为“Improved Glycan-Dependent Immunotherapeutic Bi-Specific FusionProteins and Chimeric Antigen Receptors”)。

通过预防L-PHA驱动的二聚化来减少GlyTR1-CAR强直性信号传导。

天然L-PHA是四聚体，并且二聚体GlyTR1^LPHA(2)xCD3双特异性蛋白中的两个L-PHA结构域驱动二聚体的形成。L-PHA蛋白的远离碳水化合物结合位点的前5个N末端氨基酸形成β折叠片层，所述β折叠片层通过两个β折叠片的反平行结合诱导二聚体形成。Hamelryck等人J.Biol.Chem.271:20479-20485(1996)。事实上，删除GlyTR1双特异性蛋白中的L-PHA结构域的前五个氨基酸会阻断二聚化，尽管结合亲和力和癌症杀伤会降低。因此，删除GlyTR1-CAR中的两个L-PHA结构域中的一个或两个中的前五个氨基酸预计会降低CAR二聚化/强直性信号传导。

经由增加β1,6GlcNAc-分支的N-聚糖的价态来最大程度地增加GlyTR1-CAR的结合亲合力。

如上详述，凝集素通过由多个碳水化合物结合结构域(CRD)的存在和高靶标密度而产生的高结合亲合力来实现对其靶标的特异性。经由删除L-PHA的前5个氨基酸来预防GlyTR1-CAR二聚化可降低对β1,6GlcNAc-分支N-聚糖的结合亲合力，这表现为相对于亲本GlyTR1^{LPHAΔ1-5xCD3}双特异性蛋白，GlyTR1^LPHAxCD3双特异性蛋白的结合/杀伤降低。因此，为了进一步增强GlyTR1-CAR对高靶密度癌细胞的特异性，可以向CAR中添加一个或多个额外的L-PHAΔ1-5结构域。如上文关于GlyTR1双特异性蛋白的详细描述，这应当会增强与正常细胞相比对癌细胞的特异性，同时仍在不存在抗原的情况下预防二聚化和强直性信号传导。

将CD28共信号传导结构域添加至GlyTR1-CAR。

将CD28共信号传导结构域添加至CAR(即，第三代CAR)的细胞内结构域(已知会降低41BB信号传导结构域的强直性信号传导)预计会进一步降低GlyTR1-CAR中的强直性信号传导。Long等人,Nat.Med.21:581-590(2015)。

TACA结合结构域的碳水化合物结合结构域中的工程化突变

GlyTR2^slCD301(4)CAR含有四个CD301结构域，这可能促进多聚化和细胞表面处的相关强直性信号传导。然而，将GlyTR2 CAR减少为单个CD301结构域(即，GlyTR2^CD301 CAR)不会显著影响强直性信号传导，如CAR的持续聚集和高>低CAR表达细胞中4-1BB活化标志物的诱导所证明(图5B)。因此，为了尝试减少CAR聚集和强直性信号传导，我们检查了GlyTR2^CD301CAR的多种变体，其中1)修剪了CD301的TACA结合结构域(TBD)的N末端或C末端序列，这可能促进多聚化，并且2)添加了CD28细胞内信号传导结构域，这可能导致4-1BB细胞内结构域的强直性信号传导降低(图5A，图5C)。Long等人,Nat.Med.21:581-590(2015)。

相对于亲本GlyTR2^CD301 CAR(不含CD28结构域)，修剪前18个N末端氨基酸并添加CD28细胞内信号结构域，同时修剪或不修剪最后10个C末端氨基酸(即变体163-316和163-306)，尽管没有显著降低CAR表面表达，但明显降低了癌细胞杀伤(图5A、图5C-图5E)。相反，去除前36个N末端氨基酸(包括前两个二硫键键合的半胱氨酸)并且添加CD28信号传导结构域(即，变体181-316)显著降低了强直性信号传导，如在不存在癌细胞的情况下4-1BB诱导和IFNγ产生减少所证明的，但在杀伤癌细胞方面与亲本GlyTR2CD301 CAR一样有效(图5F-图5G)。额外删除10个C末端氨基酸(即，变体181-306)也展示出降低的强直性信号传导，但在三个不同供体中在杀伤癌细胞方面，其效力低于变体181-316(图5A，CG)。因此，修剪CD301结构域的N末端以去除CRD中的前两个二硫键键合的半胱氨酸并添加细胞内CD28信号传导结构域，这组合生成了更安全的GlyTR2-CAR设计，所述设计可减少强直性信号传导，但仍能有效杀死癌细胞。

本公开的额外的示例性实施方案公开于同时提交的国际申请号P CT/US2023/024898(标题为“Improved Glycan-Dependent Immunother apeutic Bi-Specific FusionProteins and Chimeric Antigen Receptor s”)。

等效方案

本技术不限于本申请中描述的特定实施方案，所述实施方案旨在作为本技术的个别方面的单一说明。可对本技术进行许多修改和变化而不背离其精神和范围，如对于本领域的技术人员来说显而易见的。除了本文列举的那些方法和设备之外，在本技术的范围内的功能等效的方法和设备对于本领域技术人员来说根据前面的描述将是显而易见的。此类修改和变化旨在落入本技术的范围内。应理解，本技术不限于特定方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，这些当然可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且并非旨在进行限制。

此外，当根据Markush组描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员将认识到本公开还因此根据Markush组的任何各个成员或成员亚组进行了描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分描述并允许相同范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围都可以容易分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等，都包括所列举的数字并且是指随后可以被分解为如以上所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员将理解，范围包括每个个别成员。因此，例如，具有1至3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，等等。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文，其程度如同每一篇单独的出版物、专利或专利申请被明确地和单独地指明通过引用并入。

参考文献

Nunez-Prado,N.et al.The coming of age of engineered multi valentantibodies.Drug discovery today 20,588-594,doi:10.1016/j.drudis.2015.02.013(2015).

Loffler,A.et al.A recombinant bispecific single-chain antibody,CD19 xCD3,induces rapid and high lymphoma-directed cytotoxicity by unstimulated Tlymphocytes.Blood 95,2098-2103(2000).

Scott,A.M.,Wolchok,J.D.&Old,L.J.Antibody therapy of cancer.Naturereviews.Cancer 12,278-287,doi:10.1038/nrc3236(2012).

Feizi,T.Demonstration by monoclonal antibodies that carbohydratestructures of glycoproteins and glycolipids are onco-developmentalantigens.Nature 314,53-57(1985).

Kim,Y.J.&Varki,A.Perspectives on the significance of alteredglycosylation of glycoproteins in cancer.Glycoconjugate journal 14,569-576(1997)

Fernandes,B.,Sagman,U.,Auger,M.,Demetrio,M.&Dennis,J.W.Beta 1-6branched oligosaccharides as a marker of tumor progression in human breastand colon neoplasia.Cancer research 51,718-723(1991).

Lau,K.S.&Dennis,J.W.N-Glycans in cancer progression.Glycobiology 18,750-760,doi:10.1093/glycob/cwn071(2008).

Litynska,A.et al.Comparison of the lectin-binding pattern indifferent human melanoma cell lines.Melanoma research 11,205-212(2001).

Guo,H.B.,Randolph,M.&Pierce,M.Inhibition of a specific N-glycosylation activity results in attenuation of breast carcinoma cellinvasiveness-related phenotypes:inhibition of epidermal growth factor-induceddephosphorylation of focal adhesion kinase.The Journal of biologicalchemistry 282,22150-22162,doi:10.1074/jbc.M611518200(2007).

Dennis,J.W.,Laferte,S.,Waghorne,C.,Breitman,M.L.&Kerbel,R.S.Beta 1-6branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated withmetastasis.Science 236,582-585(1987).

Demetriou,M.,Nabi,I.R.,Coppolino,M.,Dedhar,S.&Dennis,J.W.Reducedcontact-inhibition and substratum adhesion in epithelial cells expressingGlcNAc-transferase V.The Journal of cell biology 130,383-392(1995).

Granovsky,M.et al.Suppression of tumor growth and metastasis inMgat5-deficient mice.Nat Med 6,306-312,doi:10.1038/73163(2000).

Beheshti Zavareh,R.et al.Suppression of cancer progression by MGAT1shRNA knockdown.PloS one 7,e43721,doi:10.1371/journal.pone.0043721(2012).

Dingjan,T.et al.Structural biology of antibody recognition ofcarbohydrate epitopes and potential uses for targeted cancer immunotherapies.Molecular immunology 67,75-88,doi:10.1016/j.molimm.2015.02.028(2015).

Blixt,O.et al.Analysis of Tn antigenicity with a panel of new IgM andIgG1 monoclonal antibodies raised against leukemic cells.Glycobiology 22,529-542,doi:10.1093/glycob/cwr178(2012).

Reusch,U.et al.A tetravalent bispecific TandAb(CD19/CD3),AFM11,efficiently recruits T cells for the potent lysis of CD19(+)tumor cells.mAbs7,584-604,doi:10.1080/19420862.2015.1029216(2015).

Klinger,M.et al.Immunopharmacologic response of patients with B-lineage acute lymphoblastic leukemia to continuous infusion of T cell-engaging CD19/CD3-bispecific BiTE antibody blinatumomab.Blood 119,6226-6233,doi:10.1182/blood-2012-01-400515(2012).

Spitzer,M.H.et al.Systemic Immunity Is Required for Effect ive CancerImmunotherapy.Cell 168,487-502 e415,doi:10.1016/j.cell.2016.12.022(2017).

Eyquem,J.et al.Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9enhances tumour rejection.Nature 543,113-117,doi:10.1038/nature21405(2017).

Hamelryck,T.W.et al.The crystallographic structure of phytohemagglutinin-L.J.Biol.Chem.271,20479-20485(1996).

Truong,L.D.,Phung,V.T.,Yoshikawa,Y.&Mattioli,C.A.Glycoconjugates innormal human kidney.A histochemical study using 13 biotinylatedlectins.Histochemistry 90,51-60,doi:10.1007/BF00495707(1988).

Shultz,L.D.et al.Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoieticstem cells.J Immunol 174,6477-6489(2005).

Sonntag,K.et al.Chronic graft-versus-host-disease in CD34(+)-humanized NSG mice is associated with human susceptibility HLA haplotypes forautoimmune disease.J Autoimmun 62,55-66,doi:10.1016/j.jaut.2015.06.006(2015).

Ju,T.,Aryal,R.P.,Kudelka,M.R.,Wang,Y.&Cummings,R.D.The Cosmcconnection to the Tn antigen in cancer.Cancer biomarkers:section A of Diseasemarkers 14,63-81,doi:10.3233/CBM-130375(2014).

Springer,G.F.T and Tn,general carcinoma autoantigens.Science 224,1198-1206(1984).

Springer,G.F.Immunoreactive T and Tn epitopes in cancer diagnosis,prognosis,and immunotherapy.Journal of molecular medicine 75,594-602(1997).

Kawaguchi,T.Cancer metastasis:characterization and identification ofthe behavior of metastatic tumor cells and the cell adhesion molecules,including carbohydrates.Current drug targets.Cardiovascular&haematologicaldisorders 5,39-64(2005).

Terasawa,K.,Furumoto,H.,Kamada,M.&Aono,T.Expression of Tn and sialyl-Tn antigens in the neoplastic transformation of uterine cervical epithelialcells.Cancer research 56,2229-2232(1996).

Laack,E.et al.Lectin histochemistry of resected adenocarcino ma ofthe lung:helix pomatia agglutinin binding is an independent prognosticfactor.The American journal of pathology 160,1001-1008,doi:10.1016/S0002-9440(10)64921-8(2002).

Konno,A.,Hoshino,Y.,Terashima,S.,Motoki,R.&Kawaguchi,T.Carbohydrateexpression profile of colorectal cancer cells is relevant to metastaticpattern and prognosis.Clinical&experimental metastasis 19,61-70(2002).

Gill,D.J.et al.Initiation of GalNAc-type O-glycosylation in theendoplasmic reticulum promotes cancer cell invasiveness.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 110,E3152-3161,doi:10.1073/pnas.1305269110(2013).

Nguyen,A.T.et al.Organelle Specific O-Glycosylation Drives MMP14Activation,Tumor Growth,and Metastasis.Cancer cell 32,639-653 e636,doi:10.1016/j.ccell.2017.10.001(2017).

Gill,D.J.,Chia,J.,Senewiratne,J.&Bard,F.Regulation of O-glycosylationthrough Golgi-to-ER relocation of initiation enzymes.The Journal of cellbiology 189,843-858,doi:10.1083/jcb.201003055(2010).

Nollau,P.et al.Protein domain histochemistry(PDH):binding of thecarbohydrate recognition domain(CRD)of recombinant human glycoreceptorCLEC10A(CD301)to formalin-fixed,paraffin-embedded breast cancer tissues.Thejournal of histochemistry and cytoche mistry:official journal of theHistochemistry Society 61,199-205,doi:10.1369/0022155412474823(2013).

Lenos,K.et al.MGL ligand expression is correlated to BRAF mutationand associated with poor survival of stage III colon cancerpatients.Oncotarget 6,26278-26290,doi:10.18632/oncotarget.4495(2015).

van Vliet,S.J.et al.Carbohydrate profiling reveals a distinctive rolefor the C-type lectin MGL in the recognition of helminth parasites and tumorantigens by dendritic cells.International immunology 17,661-669,doi:10.1093/intimm/dxh246(2005).

Marcelo,F.et al.Delineating binding modes of Gal/GalNAc andstructural elements of the molecular recognition of tumor-associated mucinglycopeptides by the human macrophage galactose-type lectin.Chemistry 20,16147-16155,doi:10.1002/chem.201404566(2014).

Jegouzo,S.A.et al.Organization of the extracellular portion of themacrophage galactose receptor:a trimeric cluster of simple binding sites forN-acetylgalactosamine.Glycobiology 23,853-864,doi:10.1093/glycob/cwt022(2013).

Artigas,G.et al.Glycopeptides as Targets for Dendritic Cells:Exploring MUC1 Glycopeptides Binding Profile toward Macrophage Galactose-TypeLectin(MGL)Orthologs.Journal of medicinal chemistry 60,9012-9021,doi:10.1021/acs.jmedchem.7b01242(2017).

Mortezai,N.et al.Tumor-associated Neu5Ac-Tn and Neu5Gc-Tn antigensbind to C-type lectin CLEC10A(CD301,MGL).Glycobiology 23,844-852,doi:10.1093/glycob/cwt021(2013).

Hung,J.-T.a.Y.,A.L..in Glycosignals in Cancer:Mechanisms of MalignantPhenotypes(ed K Furukawa,Fukuda,M.)Ch.11,197-219(Springer,2016).

Hirano,K.,Matsuda,A.,Shirai,T.&Furukawa,K.Expression of LacdiNAcgroups on N-glycans among human tumors is complex.BioMed researchinternational 2014,981627,doi:10.1155/2014/981627(2014).

Higashi,N.et al.The macrophage C-type lectin specific for galactose/N-acetylgalactosamine is an endocytic receptor expressed on monocyte-derivedimmature dendritic cells.The Journal of biological chemistry 277,20686-20693,doi:10.1074/jbc.M202104200(2002).

Napoletano,C.et al.Targeting of macrophage galactose-type C-typelectin(MGL)induces DC signaling and activation.Eur J Immunol 42,936-945,doi:10.1002/eji.201142086(2012).

Oo-Puthinan,S.et al.The amino acids involved in the distinctcarbohydrate specificities between macrophage galactose-type C-type lectins 1and 2(CD301a and b)of mice.Biochim Biophys Acta 1780,89-100,doi:10.1016/j.bbagen.2007.10.017(2008).

Rendell,M.S.Albiglutide:a unique GLP-1 receptor agonist.Expert OpinBiol Ther 16,1557-1569,doi:10.1080/14712598.2016.1240780(2016).

Santagostino,E.Transforming the treatment for hemophilia B patients:update on the clinical development of recombinant fusion protein linkingrecombinant coagulation factor IX with recombinant albumin(rIX-FP).Thromb Res141 Suppl 3,S5-8,doi:10.1016/S0049-3848(16)30415-7(2016).

Roopenian,D.C.et al.Albumin-deficient mouse models for studyingmetabolism of human albumin and pharmacokinetics of albumin-based drugs.mAbs7,344-351,doi:10.1080/19420862.2015.1008345(2015).

Long,A.H.et al.4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustioninduced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.Nat Med 21,581-590,doi:10.1038/nm.3838(2015).

Chen,X.,Zaro,J.L.&Shen,W.C.Fusion protein linkers:property,design andfunctionality.Advanced drug delivery reviews 65,1357-1369,doi:10.1016/j.addr.2012.09.039(2013).

Claims (60)

1.一种修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，其中：

(a)所述CAR包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个TACA结合结构域；跨膜结构域；共刺激结构域；和/或细胞内信号传导结构域；以及

(b)所述修饰的细胞不太容易受到所述TACA CAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

2.如权利要求1所述的修饰的细胞，其中所述TACA结合结构域来源于凝集素。

3.如权利要求1至3中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个TACA结合结构域。

4.如权利要求1至4中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含所述TACA结合结构域(TBD)中的选自取代、缺失或插入的突变。

5.如权利要求1至5中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含所述TACA结合结构域(TBD)中的缺失。

6.如权利要求6所述的修饰的细胞，其中所述缺失位于所述TACA结合结构域(TBD)的N末端和/或C末端区域。

7.如权利要求5至7中任一项所述的修饰的细胞，其中所述缺失为至少约2个氨基酸、至少约5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约16个氨基酸、至少约17个氨基酸、至少约18个氨基酸、至少约19个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约36个氨基酸、至少约38个氨基酸、至少约40个氨基酸、至少约45个氨基酸或更多个氨基酸。

8.如权利要求5至8中任一项所述的修饰的细胞，其中所述缺失为至少约10个氨基酸、至少约18个氨基酸、或至少约36个氨基酸。

9.如权利要求5至9中任一项所述的修饰的细胞，其中所述缺失为至少约36个氨基酸。

10.如权利要求1至10中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含所述TACA结合结构域(TBD)中的缺失，并且其中所述缺失：

(a)位于所述TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸；

(b)位于C末端并且为至少约10个氨基酸；

(c)位于所述TBD的N末端并且为至少约36个氨基酸；或者

(d)位于所述TBD的N末端并且为至少约18个氨基酸，并且位于C末端并且为至少约10个氨基酸。

11.如权利要求1至11中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含缺失，所述缺失去除所述TACA结合结构域(TBD)中的二硫键键合的半胱氨酸残基。

12.如权利要求1至12中任一项所述的修饰的细胞，其中包含所述抗原结合结构域的所述TACA结合结构域(TBD)中的缺失的CAR的表达与包含野生型TBD的CAR的表达相似。

13.如权利要求1至13中任一项所述的修饰的细胞，其中：

(a)与包含有包含所述野生型TACA结合结构域(TBD)的CAR的修饰的细胞相比，表达具有所述抗原结合结构域的所述TBD中的缺失的CAR的所述修饰的细胞表现出降低的强直性信号传导；

(b)与包含有包含所述野生型TACA结合结构域(TBD)的CAR的修饰的细胞相比，表达具有所述抗原结合结构域的所述TBD中的缺失的CAR的所述修饰的细胞不太容易经历耗竭；或

(c)与包含有包含野生型TACA结合结构域(TBD)的CAR的修饰的细胞相比，表达具有所述抗原结合结构域的所述TBD中的缺失的CAR的所述修饰的细胞不太容易经历由强直性信号传导TACA CAR诱导的耗竭。

14.如权利要求1至14中任一项所述的修饰的细胞，其中所述凝集素选自由以下组成的组：半乳糖凝集素、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素、选择素；C型凝集素；CD301、多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)、L-PHA(菜豆白细胞凝集素)；E-PHA(菜豆红细胞凝集素)；番茄凝集素(tomato lectin)(番茄凝集素(Lycopersicon esculentum lectin)；LEA)；花生凝集素(peanut lectin)(花生凝集素(Arachis hypogaea Agglutinin)；PNA)；马铃薯凝集素(potato lectin)(马铃薯凝集素(Solanum tuberosum lectin))、美洲商陆丝裂原(pokeweed mitogen)(美洲商陆凝集素(Phytolacca American lectin))、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin)(麦胚凝集素(Triticum Vulgaris lectin))；木菠萝凝集素(Artocarpus polyphemus lectin)(木菠萝凝集素(Jacalin letin))；野豌豆凝集素(VVA)；蜗牛凝集素(HPA)；多花紫藤凝集素(WFA)；接骨木凝集素(SNA)、BC2L-CNt(来自革兰氏阴性细菌新洋葱伯克霍尔德氏菌的凝集素)、山槐白细胞凝集素(MAL)、毡毛小脆柄菇凝集素(PVL)、齐整小核菌凝集素(SRL)、锯齿麒麟菜凝集素(ESA)、CLEC17A(保护素)、橙黄网胞盘菌凝集素、无梗接骨木凝集素(SSA)、金钱薄荷凝集素(Gleheda)、黑桑凝集素(MornigaG)、南欧丹参凝集素、Salvia bogotensis凝集素、蝶花鼠尾草凝集素、海州常山凝集素、贝壳花凝集素、加纳籽(GsLA4)、四棱豆(酸性WBAI)、相思子凝集素、尾穗苋凝集素、白果苋凝集素、秋蕾丽兰凝集素、木菠萝凝集素、桑橙凝集素、野波罗蜜凝集素、双花扁豆凝集素、双花扁豆凝集素、大豆凝集素和双孢蘑菇凝集素。

15.如权利要求15所述的修饰的细胞，其中：

(i)所述半乳糖凝集素选自由以下组成的组：半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-2、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-4、半乳糖凝集素-5、半乳糖凝集素-6、半乳糖凝集素-7、半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-9、半乳糖凝集素-10、半乳糖凝集素-11、半乳糖凝集素-12、半乳糖凝集素-13、半乳糖凝集素-14和半乳糖凝集素-15；且/或

(ii)所述唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素选自由以下组成的组：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-1(唾液酸粘附素)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-2(CD22)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-3(CD33)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-4(髓鞘相关糖蛋白)、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-5、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-6、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-7、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-8、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-9、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-10、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-11、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-12、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-13、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-14、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-16、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-17、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素E、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素F、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素G和唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素H。

16.如权利要求16所述的修饰的细胞，其中所述多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(ppGalNAc-T)选自由以下组成的组：ppGalNAc-T1(GALNT1)、ppGalNAc-T2(GALNT2)、ppGalNAc-T3(GALNT3)、ppGalNAc-T4(GALNT4)、ppGalNAc-T5(GALNT5)、ppGalNAc-T6(GALNT6)、ppGalNAc-T7(GALNT7)、ppGalNAc-T8(GALNT8)、ppGalNAc-T9(GALNT9)、ppGalNAc-T10(GALNT10)、ppGalNAc-T12(GALNT12)、ppGalNAc-T13(GALNT13)、ppGalNAc-T14(GALNT14)、ppGalNAc-T15(GALNT15)、ppGalNAc-T16(GALNT16)、ppGalNAc-T17(GALNT17)、ppGalNAc-T18(GALNT18)、ppGalNAc-T样5(GALNTL5)和ppGalNAc-T样6(GALNTL6)。

17.如权利要求1至17中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Thomsen-nouveau(Tn)表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewis^x/a、二唾液酸基-Lewis^x/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。

18.如权利要求1至18中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域选择性地靶向β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、Tn表位(Tn抗原)、唾液酸基-Tn表位(唾液酸基-Tn抗原)、GalNAcα-丝氨酸、GalNAcα-苏氨酸、GalNAc或GalNAcβ1。

19.如权利要求1至19中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含所述TACA结合结构域的所述CBD中的缺失，所述TACA结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

20.如权利要求1至20中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域包含SEQID NO:34-39中示出的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:34-39中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

21.如权利要求1至21中任一项所述的修饰的细胞，其中所述抗原结合包含与SEQ IDNO:34-39具有至少90％同源性的氨基酸序列。

22.如权利要求1至22中任一项所述的修饰的细胞，其中所述跨膜结构域包含选自由以下组成的组的分子的跨膜区：T细胞受体(TCR)-α、TCR-β、TCR-γ、TCR-δ、NKT细胞的不变TCR、CD3-ζ、CD3-ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134(Ox40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、CD278(ICOS)、CD357(GITR)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。

23.如权利要求1至23中任一项所述的修饰的细胞，其中所述跨膜结构域包含CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。

24.如权利要求1至24中任一项所述的修饰的细胞，其中所述跨膜结构域包含SEQ IDNO:78或SEQ ID NO:87的氨基酸序列。

25.如权利要求1至23中任一项所述的修饰的细胞，其中所述共刺激结构域是选自由以下组成的组的分子的共刺激结构域：CD27、CD28、4-IBB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、CD8、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、DAP10、DAP12、Lck、Fas及其组合。

26.如权利要求1至26中任一项所述的修饰的细胞，其中所述共刺激结构域包含：

(i)4-1BB共刺激结构域；

(ii)SEQ ID NO:58的氨基酸序列；

(iii)CD28共刺激结构域；

(iv)SEQ ID NO:88的氨基酸序列；或

(v)4-1BB共刺激结构域和CD28共刺激结构域。

27.如权利要求1至27中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞内结构域包含选自由以下组成的组的分子的所述细胞内信号传导结构域：T细胞受体(TCR)ζ、FcR-γ、FcR-β、CD3-γ、CD3-δ、CD3-ε、CD3-ζ、CD3、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。

28.如权利要求1至28中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含CD3ζ信号传导结构域；或SEQ ID NO:59的氨基酸序列。

29.如权利要求1至29中任一项所述的修饰的细胞，其中所述CAR进一步包含铰链结构域。

30.如权利要求1至30中任一项所述的修饰的细胞，其中所述铰链结构域是选自由以下组成的组的蛋白质：CD28铰链、CD8α、抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区和人工间隔序列。

31.如权利要求1至31中任一项所述的修饰的细胞，其中所述铰链结构域是：

(a)CD8α铰链结构域；

(b)CD28铰链；

(c)包含SEQ ID NO:77或86的氨基酸序列。

32.如权利要求1至32中任一项所述的修饰的细胞，其中所述铰链结构域包含选自由SEQ ID NO:68、71-77和86组成的组的氨基酸序列。

33.一种修饰的细胞，其包含编码嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸分子，所述嵌合抗原受体包含：

(i)SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列；或

(ii)与SEQ ID NO:23-29中示出的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。

34.如权利要求1至34中任一项所述的修饰的细胞，其中所述分离的核酸包含表达载体；和/或体外转录的RNA。

35.如权利要求1至35中任一项所述的修饰的细胞，其中所述CAR选择性地靶向选自由以下组成的组的TACA：β1,6分支、β1,6GlcNAc-分支N-聚糖、T抗原、Tn抗原、唾液酸基-T表位、Tn表位、唾液酸基-Tn表位、α2,6唾液酸化、唾液酸化、唾液酸基–Lewis^x/a、二唾液酸基-Lewis^x/a、唾液酸基6-磺基Lexis^x、Globo H、GD2、GD3、GM3和岩藻糖基GM1。

36.如权利要求1至36中任一项所述的修饰的细胞，其中所述CAR选择性地靶向β1,6GlcNAc分支N-聚糖、GalNAc、Tn抗原、GalNAcα-ser、GalNAc或GalNAcβ1。

37.如权利要求1至37中任一项所述的修饰的细胞，其中与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比，所述包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞显示出降低的强直性信号传导。

38.如权利要求1至38中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和调节性T细胞。

39.如权利要求1至39中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞是T细胞。

40.如权利要求1至40中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞是自体细胞。

41.一种选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其中：

(a)所述CAR包含(i)选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含一个或多个来源于凝集素的TACA结合结构域；(ii)跨膜结构域；(iii)共刺激信号传导区；以及(iv)细胞内信号传导结构域；以及

(b)当引入修饰的细胞中时，表达所述CAR的所述修饰的细胞不太容易受到所述TACACAR的强直性信号传导的影响，从而在不存在靶癌细胞的情况下减少耗竭和/或促炎细胞因子产生。

42.一种选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其包含：

(a)抗原结合结构域，其包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列中的缺失；或与SEQID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；

(b)CD8铰链结构域或CD28铰链结构域；

(c)CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域；

(d)CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域；以及

(e)CD3ζ细胞内信号传导结构域。

43.如权利要求43所述的嵌合抗原受体，其中所述CAR包含SEQ ID NO:23-29的氨基酸序列。

44.如权利要求43所述的嵌合抗原受体，其中：

(a)包含SEQ ID NO:23-29的CAR的修饰的细胞与包含SEQ ID NO:21或22的CAR的修饰的细胞相比显示出降低的强直性信号传导；或

(b)表达CAR的修饰的细胞，所述CAR包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列中的缺失；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失，所述修饰的细胞与包含有包含野生型抗原结合结构域的CAR的修饰的细胞相比不太容易受到耗竭的影响；或

(c)表达CAR的所述修饰的细胞，所述CAR包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列中的缺失；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失，所述修饰的细胞与包含有包含野生型抗原结合结构域的CAR的修饰的细胞相比不太容易受到与强直性信号传导TACA CAR相关的耗竭的影响。

45.一种嵌合抗原受体，其在如权利要求1至41中任一项所述的修饰的细胞中表达。

46.一种分离的核酸，其编码由如权利要求1至41中任一项所述的修饰的细胞表达的CAR或如权利要求42至46中任一项所述的CAR。

47.一种表达构建体，其包含如权利要求47所述的分离的核酸。

48.如权利要求48所述的表达构建体，其中所述表达构建体进一步包含启动子。

49.如权利要求49所述的表达构建体，其中所述启动子选自EF-lα启动子、T细胞受体α(TRAC)启动子、白细胞介素2(IL-2)启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒立即早期启动子或劳氏肉瘤病毒启动子。

50.如权利要求48至50中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体是选自由以下组成的组的病毒载体：逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体。

51.如权利要求48至51中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体是慢病毒载体。

52.如权利要求48至52中任一项所述的表达构建体，其中所述表达构建体是自我灭活慢病毒载体。

53.一种用于生成如权利要求1至41中任一项所述的修饰的细胞的方法，所述方法包括将如权利要求47所述的分离的核酸、如权利要求41至46中任一项所述的嵌合抗原受体；或如权利要求48至53中任一项所述的表达载体引入至细胞中。

54.一种组合物，其包含：

(a)如权利要求1至41中任一项所述的修饰的细胞；

(b)如权利要求41至46中任一项所述的嵌合抗原受体；

(c)表达如权利要求47所述的核酸的细胞或细胞群；或

(d)表达如权利要求48至53中任一项所述的表达构建体的细胞或细胞群。

55.如权利要求55所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载剂。

56.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫治疗性组合物，所述免疫治疗性组合物包含：

(a)如权利要求1至40中任一项所述的修饰的细胞；

(b)如权利要求41至46中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)；或

(c)如权利要求55或56所述的组合物。

57.如权利要求57所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：血液恶性肿瘤、实体瘤、原发性或转移性肿瘤、白血病、癌、母细胞瘤、肉瘤、白血病、淋巴系统恶性肿瘤、黑色素瘤和淋巴瘤。

58.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效组合物，所述治疗有效组合物包含修饰的细胞，所述修饰的细胞包含选择性地结合肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的嵌合抗原受体，其中所述CAR包含：

(i)抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列中的缺失；或与SEQ ID NO:30-54中示出的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列中的缺失；

(ii)CD8或CD28铰链结构域；

(iii)CD8或CD28跨膜结构域；

(iv)CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域；以及

(v)CD3ζ细胞内信号传导结构域。

59.如权利要求59所述的方法，其中在不存在与强直性信号传导TACA CAR缔合的靶癌细胞的情况下，所述修饰的细胞不太容易受到耗竭和/或细胞因子产生的影响。

60.一种在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的如权利要求1至40中任一项所述的修饰的细胞群或如权利要求55或56所述的组合物。