CN119679037A - 一种改性的玉米蛋白添加剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种改性的玉米蛋白添加剂及其制备方法和应用，属于饲料添加剂领域。本发明提供了一种通过生物酶改性的玉米蛋白添加剂及其制备方法，并且其可应用于制备改善猪肠道的饲料。本发明将传统玉米蛋白粉中的蛋白质通过酶解技术进行结构性改造，这不仅改变其原有水溶性差、消化率低的缺点，还显著提高了酸溶蛋白和小肽的含量，全方位地提高了营养成分的可消化吸收利用率，使其成为高消化率、无抗营养因子的高品质蛋白原料，可替代包括进口鱼粉和豆粕等优质蛋白原料，广泛用于各种类型的饲料中。解决了动物蛋白源的饲料成本较高的问题，并且解决了目前植物蛋白源饲料肠道不易吸收和不能改善肠道健康水平等问题。

Description

一种改性的玉米蛋白添加剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，特别是涉及一种通过生物酶改性的玉米蛋白饲料添加剂，其适用于仔猪保育料可改善仔猪肠道健康水平。

背景技术

我国猪的养殖量为全球最高，随着产业规模化的完善，猪的养殖水平的提升至关重要，仔猪与成年猪相比，胃容量较小，胃液pH值较大，肠道较短，消化酶分泌不足，容易引起消化不良。而且仔猪处于生长迅速阶段，对饲料中营养物质的要求较高，增加养殖成本。因此在仔猪的养殖过程，可以通过使用优质饲料，采用酶解等手段来增加饲料中营养物质的消化率来提升仔猪的肠道健康水平。饲料中的蛋白源添加剂的使用起到至关重要的作用。鱼粉是常见的动物蛋白源，其营养价值、适口性、消化率较高，但由于其价格偏高，所以需要寻找合适的替代蛋白作为饲料原料。植物性蛋白饲料如玉米蛋白价格低廉、价格稳定，是合适的替代蛋白原料，但由于天然的玉米蛋白分子结构复杂且为大分子蛋白，不易被动物肠道吸收，消化率偏低；毒素含量高、抗营养因子等问题不能大量使用，且由于其适口性较差，在仔猪饲料中应用受限。因此，亟需一种可以替代动物蛋白饲料的小分子植物性蛋白饲料添加剂。

发明内容

本发明通过酶解的技术提供了一种改性的玉米蛋白添加剂，解决了动物蛋白源的饲料成本较高的问题，并且本发明的改性的玉米蛋白添加剂解决了目前植物蛋白源饲料肠道不易吸收和不能改善肠道健康水平等问题。

一种通过生物酶改性玉米蛋白的方法，所述方法为：

步骤一：将玉米气浮液调节pH值到5.5～6.5并加热到70～85℃，加入α-淀粉酶，酶解30min，然后加入纤维素酶和木聚糖酶的混合酶，酶解20min，再加入中性蛋白酶酶解20min；

步骤二：将温度调节至55～58℃，pH值调节到8.0～9.0，加入碱性蛋白酶和角蛋白酶的混合酶，酶解2h，期间维持pH值在8.0～9.0；

步骤三：脱色；

步骤四：喷粉干燥，获得酶解后的玉米蛋白。

所述α-淀粉酶的酶活为50000U/g，加入量为干物质质量的0.3～0.6％。

所述纤维素酶和木聚糖酶的混合酶为将酶活为200000U/g的纤维素酶，加入量为干物质质量的0.1～0.3％和酶活为100000U/g的木聚糖酶，加入量为干物质质量的0.05～0.15％，进行混合。

所述中性蛋白酶的酶活为200000U/g，加入量为干物质质量的0.3～0.5％。

所述碱性蛋白酶和角蛋白酶的混合酶为将酶活为200000U/g的碱性蛋白酶，加入量为干物质质量的1～1.5％和酶活为100000U/g的角蛋白酶，加入量为干物质质量的0.1～0.2％，进行混合。

所述脱色为酶解结束后加入95％乙醇，搅拌3h。

一种改性的玉米蛋白添加剂，采用上述方法制备获得。

一种改性的玉米蛋白添加剂在制备改善猪肠道饲料中的应用。

所述改性的玉米蛋白添加剂在饲料中的添加量为5％～15％。

有益效果

玉米气浮液为玉米蛋白粉的前端玉米副产品，将传统玉米蛋白粉中的蛋白质通过酶解技术进行结构性改造，这不仅改变其原有水溶性差、消化率低的缺点，还显著提高了酸溶蛋白和小肽的含量，全方位地提高了营养成分的可消化吸收利用率，使其成为高消化率、无抗营养因子的高品质蛋白原料，可替代包括进口鱼粉和豆粕等优质蛋白原料，广泛用于各种类型的饲料中。

本发明提供一种可以有效改善玉米蛋白粉蛋白结构的复合酶制剂酶解方法，其可以使玉米蛋白中的酸溶蛋白含量大幅增加，作为饲料添加剂时更易于被动物吸收，是优质的饲料添加剂，并且本方法中的脱色为在酶解结束后加入95％乙醇进行脱色，工艺简单、成本低廉且不易造成损耗。

本发明中提供的蛋白饲料添加剂在仔猪的饲喂实验中，在一定的添加量下增加了肠道消化酶活性，尤其是蛋白酶活性。另外，肠道形态分析表明本发明的蛋白饲料添加剂能有效促进肠道生长发育，从而促进黏膜发育成熟，提高其分泌能力，改善肠道健康水平；

本发明中提供的蛋白饲料添加剂与鱼粉所影响肠道微生物的类群不同，但均能增加益生菌丰度并稳定肠道菌群结构，从而发挥促进仔猪生长的作用；

附图说明

图1为十二指肠黏膜HE染色图，其中A为FM、B为CGM、C为MCGM(5％)、D为MCGM(10％)、E为MCGM(15％)；

图2为空肠黏膜HE染色图，其中A为FM、B为CGM、C为MCGM(5％)、D为MCGM(10％)、E为MCGM(15％)；

图3为回肠粘膜HE染色图，其中A为FM、B为CGM、C为MCGM(5％)、D为MCGM(10％)、E为MCGM(15％)；

图4为盲肠黏膜HE染色图，其中A为FM、B为CGM、C为MCGM(5％)、D为MCGM(10％)、E为MCGM(15％)；

图5为回肠微生物群落组成结果图，其中A为门水平，Phylum，B为属水平，Genus；

图6为盲肠微生物群落组成结果图，其中A为门水平，Phylum，B为属水平，Genus；

图7为回肠差异菌属(>2％)对比结果图；

图8为盲肠差异菌属(>2％)对比结果图。

具体实施方式

对比例1.

根据专利CN102911992，一种酶解玉米蛋白制备玉米低聚肽螯合物的方法中提供的酶制剂酶解方案：

1、将玉米气浮液(干物质在7～9％之间)用3mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到8.5～9.5之间，温度调节到62～68℃，加入玉米蛋白粉重量的0.3～0.5％质量的酶活200000U/g的碱性蛋白酶，酶解3～4h，过程中不断用3mol/L氢氧化钠溶液维持pH值；

2、然后将温度下降到40～50℃，用3mol/L HCl溶液调节pH值在5～7之间，加入干物质0.3～0.5％质量的酶活200000U/g的中性蛋白酶，酶解0.5～1h；

3、调节温度在50～70℃，加入干物质质量的0.2～0.8％的酶活200000U/g的风味蛋白酶，酶解3～5h；

4、脱色：使用双氧水进行脱色，控制食品级双氧水的使用量在干物质的10～30％之间，温度在60～80℃，pH值7～9，脱色时长为1～3h；

5、加入干物质质量0.04～0.06％的过氧化氢酶，温度控制在40～60℃，酶解1～2h，后续在85～95℃灭酶15～20min；

6、喷粉干燥，获得玉米蛋白。

对比例2.

根据专利CN102994598，丙氨酸和亮氨酸含量高的弱苦味玉米低聚肽及其制备方法中提供的酶制剂酶解方案：

1、将玉米气浮液(干物质在7～9％之间)用3mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到6.0，加热到82℃维持40min，加入干物质质量0.5％的酶活50000U/g的α-高温淀粉酶，酶解45min，将温度升至95℃保持15min，降温至60℃后离心，弃上清；

2、用55℃的去离子水重悬，干物质含量在10％。用3mol/L氢氧化钠溶液调节pH值到6.5，在55℃恒温下加入干物质质量1％的酶活200000U/g的中性蛋白酶，酶解1.5h后再加入干物质质量1％的酸性蛋白酶，酶解6h；

3、脱色：酶解结束后升温至85℃，加入干物质质量0.6％的200目活性炭搅拌45min；

4、喷粉干燥，获得玉米蛋白。

实施例1.

1、将玉米气浮液(干物质在7～9％之间)用液氨调节pH值到5.5～6.5，加热到70～85℃，加入干物质质量0.3～0.6％的酶活50000U/g的α-淀粉酶，酶解30min。将温度降低至58～65℃，加入干物质质量0.3～0.5％酶活200000U/g的中性蛋白酶，酶解20min；

2、将温度控制在55～58℃，用液氨调节pH值在8.0～9.0之间，加入预混蛋白酶，其包括：干物质质量1～1.5％的酶活200000U/g的碱性蛋白酶，0.1～0.2％酶活100000U/g的角蛋白酶。酶解2h，期间用液氨维持pH值；

3、脱色：酶解结束后加入95％乙醇进行脱色，搅拌3h；

4、喷粉干燥，获得酶解后改性的玉米蛋白。

实施例2.

1、将玉米气浮液(干物质在7～9％之间)用液氨调节pH值到5.5～6.5，加热到70～85℃，加入干物质质量0.3～0.5％酶活200000U/g中性蛋白酶，酶解20min；

2、将温度控制在55～58℃，用液氨调节pH值在8.0-9.0之间，加入预混的蛋白酶，预混的蛋白酶包括干物质质量1～1.5％的酶活200000U/g碱性蛋白酶，0.1～0.2％酶活100000U/g角蛋白酶。酶解2h，期间用液氨维持pH值；

3、脱色：酶解结束后加入95％乙醇进行脱色，搅拌3h；

4、喷粉干燥，获得酶解后改性的玉米蛋白。

实施例3.

1、将玉米气浮液(干物质在7～9％之间)用液氨调节pH值到5.5～6.5，加热到70～85℃，加入酶活为50000U/g的α-淀粉酶，加入量为干物质质量0.3～0.6％，酶解30min。然后将温度降低至58～65℃，加入预混的蛋白酶A，其包括：干物质质量0.1～0.3％，酶活200000U/g的纤维素酶，干物质质量0.05～0.15％，酶活100000U/g的木聚糖酶，进行酶解20min。再加入干物质质量0.3～0.5％，酶活200000U/g的中性蛋白酶，酶解20min；

2、将温度控制在55～58℃，用液氨调节pH值在8.0～9.0之间，加入预混的蛋白酶B，其包括：干物质质量1～1.5％，酶活200000U/g的碱性蛋白酶和干物质质量0.1～0.2％，酶活100000U/g的角蛋白酶，酶解2h，期间用液氨维持pH值；

3、脱色：酶解结束后加入95％乙醇进行脱色，搅拌3h；

4、喷粉干燥，获得酶解后改性的玉米蛋白。

实施例4.

检测上述实施例和对比例中玉米蛋白的营养指标。对照组为将原料玉米气浮液(干物质在7～9％之间)直接喷粉干燥获得的玉米蛋白，并以动物蛋白源的鱼粉作为比对，结果如表1。其中所有实验结果均为干基结果。

表1

营养指标	对照组	对比例1	对比例2	实施例1	实施例2	实施例3	鱼粉
								粗蛋白％	62.88	65.37	64.89	66.06	64.78	62.97	65.13
酸溶蛋白％	15.94	48.37	50.33	50.57	47.22	52.55	14.84
								灰分％	4.86	4.66	5.96	5.23	5.56	4.72	20.35
水分％	1.66	1.74	1.78	1.57	1.69	1.97	12.93
								物质消化率％	88.68	90.18	89.18	93.21	92.15	93.51	78.54
酸溶蛋白/粗蛋白％	25.35	73.99	77.56	76.55	72.89	83.45	22.79
								18种氨基酸/粗蛋白％	92.14	93.45	94.13	93.25	92.56	93.12	95.45

酸溶蛋白指标的检测意义：可作为明确小肽含量的指标，其数值取决于多肽片段的大小及氨基酸和多肽的疏水性，代表相对分子质量较小的蛋白质水解物的含量。在饲料配方中酸溶蛋白可以帮助评估饲料中的蛋白质质量和营养价值，了解蛋白质的消化吸收情况，是饲料质量评估的重要指标。本实验采用两组对照，一是玉米气浮液直接喷干粉为对照组，再选取鱼粉作为动物源蛋白作对比，明确酶解蛋白粉的营养指标。从实验数据中可看出对照组和鱼粉作为天然的蛋白源其酸溶蛋白占比普遍偏低，仅达到粗蛋白的25.35％和22.79％，在对比例1-2和实施例1-3的结果显示经过多种酶制剂酶解后多肽链水解成小肽，酸溶蛋白含量激增，其中实施例3中涉及到的酶解方案其酸溶蛋白占比最高，将酸溶蛋白的占粗蛋白比例提升到83.45％，从饲料质量评估角度来讲可评价为优质的饲料添加剂。

物质消化率结果分析：结合灰分结果分析，灰分为无法消化的成分，除去灰分含量消化率趋近于100％，通过于对照组相比较，对比例1-2和实施例1-3的物质消化率均有所提升，普遍从88.68％提升到90％以上，对比例1、2为已授权玉米蛋白粉酶解专利中提及的酶解方案，实施例1-3为本研究设计的酶解方案，从物质消化率结果可以看出本研究的酶解方案效果高于参考专利，其中实施例3酶解方案消化率结果最佳达到93.51％；

灰分结果分析：当灰分含量普遍低于5％，可判断问优质蛋白，即实施例3获得的玉米蛋白为优质蛋白；

18种氨基酸结果分析：本研究检测的18种氨基酸在在农业领域具有显著影响，18种氨基酸分别为甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、蛋氨酸及异亮氨酸。将18种常见氨基酸含量结果统计相加，其与粗蛋白含量占比均达到90％以上，可以评估通过酶解改性的玉米蛋白为优质蛋白源饲料添加剂，可从表1结果看出，改性的玉米蛋白源的18种氨基酸含量占比与鱼粉接近，因此，其可代替动物源蛋白添加在饲料中。

实施例7.仔猪饲喂试验

实验目的：本实验评估通过酶解改性的玉米蛋白在仔猪饲料中代替其他蛋白原料对仔猪生长性能和肠道健康的影响。玉米蛋白的酶解方式采取上述的实施例3中涉及到的酶解方式。

实验设计：选择体重、胎次接近的母猪20头，分娩后根据体重平均调配至每栏仔猪12头，共计仔猪240头(20窝)，随机分为5组，每组4个重复，分组情况见表2。不同试验组分别使用不同蛋白原料加入至基础饲料中配制饲粮，不同蛋白原料分别为：普通玉米蛋白粉(CGM)、鱼粉(FM)、和通过酶解改性的蛋白粉(MCGM)；基础饲料为玉米40～45％、豆粕25～27％、乳清粉13～15％、磷酸氢钙1.2～1.5％、石粉0.8～1％、食盐0.3～0.4％、预混料1.7-2％。

饲喂试验从仔猪7日龄开始，21日龄断奶，35日饲喂试验结束后，于每个重复中选取2头仔猪屠宰(合计40头)，分别采集肠道组织(十二指肠、空肠、回肠和盲肠黏膜和组织样本)和肠道内容物(指十二指肠和空肠内容物)，评估不同处理对肠道发育和健康的影响。

表2

序号	处理组	重复数	仔猪数量
				1	基础饲粮+5％CGM	4	48
2	基础饲粮+5％FM	4	48
				3	基础饲粮+5％MCGM	4	48
4	基础饲粮+10％MCGM	4	48
				5	基础饲粮+15％MCGM	4	48

一、仔猪肠道组织形态分析试验：

分别制作各肠段切片并HE染色，在显微镜下固定视野中分别测量绒毛高度、隐窝深度，并计算绒隐比值，见表3，通过不同肠段切片展示，各组无明显病理性损伤。其中十二指肠和空肠黏膜组织，单层柱状上皮细胞及杯状细胞排列致密整齐，绒毛结构较完整见图1-图4。

表3

注：同一行中小写字母(a、b、c或d)不同的值表示两两对比差异显著(P<0.05)

结果分析：

通过切片测量，十二指肠中，FM、MCGM(5％)和MCGM(15％)组隐窝深度分别为296.58μm、303.58μm和240.67μm，显著低于CGM组(426.50μm，P<0.05)，表明分泌功能前者更强。绒隐比则分别为MCGM(5％)为2.36和MCGM(15％)为2.42显著高于FM和CGM组(1.89和1.71，P<0.05)。

空肠与十二指肠高度相似，MCGM(5％)组的2.26和MCGM(15％)的2.24显著高于FM和CGM组(1.76和1.97，P<0.05)。回肠中随绒毛高度和隐窝深度各组均呈现不同差异，但绒隐比差异未达到显著水平(P>0.05)。盲肠中，MCGM(5％)组的隐窝深度显著低于MCGM(15％)组(P<0.05)。

二、仔猪食道消化酶活性分析实验：

仔猪食道消化酶活性分析实验结果如表4。

表4

结果分析：

在十二指肠中，各试验组淀粉酶活性差异不显著(P>0.05)；FM、CGM和MCGM(5％)组中脂肪酶活性显著高于MCGM(10％)和MCGM(15％)组(P<0.05)。FM和MCGM(5％)组的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性极显著高于CGM、MCGM(10％)和MCGM(15％)组(P<0.01)。

在空肠中FM和MCGM(5％)组淀粉酶活性显著高于CGM、MCGM(10％)和MCGM(15％)组(P<0.05)；MCGM(5％)组脂肪酶活性显著高于CGM、MCGM(10％)和MCGM(15％)组(P<0.05)，与FM组差异不显著(P>0.05)。FM组脂肪酶活性则显著高于MCGM(10％)和MCGM(15％)组(P<0.05)。FM和MCGM(5％)组的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性均显著高于CGM、MCGM(10％)和MCGM(15％)组(P<0.05)，其中MCGM(5％)的胰蛋白酶与CGM、MCGM(10％)和MCGM(15％)三组相比达到极显著水平(P<0.01)。

三、如不同添加剂的饲料对仔猪肠道微生物群落组成的影响：

结果分析：

1、在回肠中，厚壁菌门Firmicutes占据超过96％以上，FM和MCGM(5％)占比高于CGM、MCGM(10％)和MCGM(15％)组，如图5A。属水平上，丰度排在前三的分别是乳酸菌属Lactobacillus、梭菌属的Clostridium_sensu_stricto_1和链球菌属Streptococcus，如图5B；

2、在盲肠中，厚壁菌门Firmicutes占据超过72％以上，其次是拟杆菌门Bacteroidota和变形菌门Proteobacteria，如图6A。属水平上，丰度排在前三的分别是梭菌属的Clostridium_sensu_stricto_1、乳酸菌属Lactobacillus和土孢杆菌属Terrisporobacter，如图6B；

3、通过Kruskal-Wallis检验，将丰度大于2％的差异菌属进行两两对比，如图7所示。乳酸菌属Lactobacillus和土孢杆菌属Terrisporobacter(多为芽孢杆菌)分在在FM组和MCGM(5％)组中显著增多(P<0.05)，提示FM和MCGM可能通过增加益生菌丰度，从而提高肠道健康。而肠球菌Enterococcus则在MCGM(10％)组中显著增加(P<0.05)；

4、盲肠中差异菌属两两对比如图8所示。MCGM的添加有助于增加链球菌属Streptococcus的丰度。肠道重要基石菌属——普雷沃氏菌属Prevotella在MCGM(10％)和MCGM(15％)两组中丰度显著降低(P<0.05)，以及潜在的致病菌——大肠埃氏菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)丰度显著提高(P<0.05)，提示这两组存在较高的肠道炎症以及腹泻风险。

Claims (9)

1.一种通过生物酶改性玉米蛋白的方法，其特征在于，所述方法为：

步骤一：将玉米气浮液调节pH值到5.5～6.5并加热到70～85℃，加入α-淀粉酶，酶解30min，然后加入纤维素酶和木聚糖酶的混合酶，酶解20min，再加入中性蛋白酶酶解20min；

步骤二：将温度调节至55～58℃，pH值调节到8.0～9.0，加入碱性蛋白酶和角蛋白酶的混合酶，酶解2h，期间维持pH值在8.0～9.0；

步骤三：脱色；

步骤四：喷粉干燥，获得酶解后改性的玉米蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述α-淀粉酶的酶活为50000U/g，加入量为干物质质量的0.3～0.6％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤维素酶和木聚糖酶的混合酶为将酶活为200000U/g的纤维素酶，加入量为干物质质量的0.1～0.3％和酶活为100000U/g的木聚糖酶，加入量为干物质质量的0.05～0.15％，进行混合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的酶活为200000U/g，加入量为干物质质量的0.3～0.5％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶和角蛋白酶的混合酶为将酶活为200000U/g的碱性蛋白酶，加入量为干物质质量的1～1.5％和酶活为100000U/g的角蛋白酶，加入量为干物质质量的0.1～0.2％，进行混合。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱色为酶解结束后加入95％乙醇，搅拌3h。

7.一种改性的玉米蛋白添加剂，其特征在于，所述玉米蛋白添加剂采用权利要求1-6任一项制备获得。

8.一种改性的玉米蛋白添加剂在制备改善猪肠道饲料中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述改性的玉米蛋白添加剂在饲料中的添加量为5％～15％。