CN119677519A

CN119677519A - 治疗体液免疫抑制病理、癌症和感染性疾病的体液免疫活化剂以及治疗炎性疾病的体液免疫抑制剂

Info

Publication number: CN119677519A
Application number: CN202380058719.8A
Authority: CN
Inventors: N·C·尼古拉德斯; J·B·克莱恩; L·格拉索
Original assignee: Navrogan
Current assignee: Navrogan
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2023-06-15
Publication date: 2025-03-21
Also published as: WO2023245086A1

Abstract

小分子量剂的组合物、方法和套组能够结合和刺激Fc‑γ‑活化受体，以通过改善对病原微生物以及病毒感染细胞和失调细胞的基于免疫效应细胞和/或抗体的功效来增强体液免疫应答和免疫效应细胞应答。这些能够用于治疗感染性疾病、癌症和其它体液免疫抑制疾病。此外，能够阻断Fc‑γ活化受体的非刺激类似物还能够用于抑制免疫效应细胞活化和炎症下游介质。

Description

治疗体液免疫抑制病理、癌症和感染性疾病的体液免疫活化剂以及治疗炎性疾病的体液免疫抑制剂

技术领域

本发明属于体液免疫和免疫效应细胞调节领域。具体地，本发明涉及小分子量剂的组合物、方法和套组(kit)，其结合和刺激Fc-γ-活化受体，从而增强体液免疫应答。对Fc-γ-活化受体的刺激改善免疫效应细胞介导的和抗体介导的对病原微生物、病毒感染细胞和失调细胞的应答。小分子量剂能够用于治疗感染性疾病、癌症和其它体液免疫抑制疾病。此外，能够结合和阻断CD16a活化的非刺激类似物还能够用于治疗由表达CD16a的细胞介导的炎性疾病。

背景技术

体液免疫是脊椎动物宿主生物监视和防御感染性病原体和失调宿主细胞的主要机制。在癌症治疗中，能够靶向癌症特异性细胞表面抗原的单克隆抗体(mAb)已被成功开发并获得商业批准。有报道称这些mAb中的数种，除补体依赖性细胞毒性(CDC)外，还通过体液介导的抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，经由与免疫效应细胞(NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、树突细胞等)上的Fc-γ-活化受体如CD16a(FCGRIIIA)、CD32a(FCGRIIA)和CD64(FCGRIA)衔接(engagement)而发挥其肿瘤杀伤作用(DiLillo DJ,Ravetech JV,Cancer Immunol Res3:704-713,2015；Ruck T,etal.Int J Mol Sci.16:16414-16439,2015；Pelaia C,et al.Biomed Res Int 4839230:1-9,2018；VanDerMeid KR,et al.Cancer Immunol Res 6:1150-1160,2018)。最近，几位研究者报道称，肿瘤产生能够抑制体液免疫途径，进而通过ADCC、ADCP和/或CDC机制抑制mAb的肿瘤杀伤作用的因子(Vergote I,et al.J Clin Oncol 34:2271-2278；Kline JB,et al.JClin Oncol 5:15,2018；Wang W et al.Cytogenet Genome Res 152:169-179,2017；KlineJB et al.Eur J Immunol.48:1872-1882,2018)。ADCC、ADCP和CDC体液免疫应答受抗体同细胞表面抗原衔接的配位(coordination)的管控，它们共同将抗体定位在抗原表位上距细胞表面有一定的接近度。在这种定位是最佳的情况下，细胞表面结合抗体可与天然杀伤(NK)或树突/髓样/单核细胞(任何参与ADCC或ADCP的细胞在此都被称为“免疫效应细胞”)上的Fc-γ-活化受体衔接以启动ADCC或ADCP以及与C1q补体启动蛋白衔接，以通过经典补体途径致使抗体结合细胞死亡(Reuschenbach M,et al.Cancer Immunol Immunother 58:1535-1544,2009)。数种治疗抗体，诸如但不限于利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)和达雷木单抗(daratumumab)，观察到了这些效果(Zhou X,etal.Oncologist 13:954-966,2008；Hsu YF,et al.Mol Cancer 9:1-8,2010；Spiridon CI,et al.Clin Cancer Res 8:1720-1730,2002；Luo C,et al.Sci Rep 7:46347,2017；Sanchez L,et al.J Hematol Oncol 9:51-59,2016)。类似地，在患者自身对失调细胞的免疫应答中和对疫苗的反应中，也观察到体液效应。在无痛性疾病(indolent disease)患者中观察到了具有抗增殖活性以及免疫介导的杀伤活性的抗体(Staff C,et al.J ClinImmunol 32:855-865；Branden S,et al.Cancer Res 63:7995-8005,2003)。然而，尽管已发现许多患有癌症和病毒性疾病的患者产生针对肿瘤或病毒抗原的自身抗体，但其存在常常不足以根除患病细胞，这可能是由于病原体、病毒感染细胞或失调细胞的总体低自免疫诱导抗体水平、次优表位结合、免疫效应细胞耗尽和/或体液免疫抑制机制(Bi J and TianZ.Frontiers Immunol 8:1-10,2017)。

在癌症(本文也称为失调细胞)中，已发现肿瘤产生的蛋白MUC16/CA125对体液免疫应答的抑制是通过直接结合IgG1、IgG3和IgM型抗体的子集(subset)，进而又干扰Fc区，使其对于它们与免疫效应细胞上的Fc-γ-活化受体FCGR2A(也称为FCGRIIA和CD32a)和/或FCGR3A(也称为FCGRIIIA和CD16a)的结合或与CDC的C1q蛋白的衔接不太有效(PantankarMS,et.al.Gyncol Oncol 99:704-713,2005；Kline JB,et al.OncoTarget8:52045-52060,2017；Kline JB,et al.J.Clin.Oncol.5:15,2018；Wang W,et al.Cytogenet Genome Res152:169-179,2017；Kline JB,et al.Eur J Immunol.48:1872-1882,2018；Vergote I,etal.J Clin Oncol 34:2271-2278,2016；Nicolaides NC,et al.Cancer Biol Ther 13:1-22,2018；Prochazka V,et al.Int J Hematol 96:58-64,2012；Grasso L.OncologyLetters 23:2,2022)。高亲和力FCGR1(也称为CD64)Fc-γ-受体(K_D＝0.5nM)未观察到这种效应，表明这种效应部分是由于对CD16a同种异型158F(1059nM)和158V(415nM)以及CD32a同种异型131R(218nM)和131H(39nM)的低亲和力结合(Kline JB,et al.J.Clin.Oncol.5:15,2018；Nordstrom JL,et al.Breast Cancer Res 13:R123,2011)。

上述关于癌症中体液免疫抑制的发现大多指出NK和髓样细胞活化以及抗体结合对于有效杀伤的重要性。有几份报道显示，NK细胞的去除会降低抗体介导的抗癌细胞响应的治疗功效(Waldhauer I,Steinle A.Oncogene 27:5932-5943,2008)。基于这些观察结果，目前正在实验模型和临床试验环境中探求数种利用NK细胞进行癌症免疫治疗的方法(Vivier E,et al.Nat Rev Immunol 12:239-252,2012；Shimasaki N,et.al.Nat RevDrug Dis 19:200-218,2020)。这些方法旨在利用NK细胞对因病毒感染或失调而缺乏主要组织相容性复合体1类(MHC1)蛋白的宿主靶细胞的ADCC以及抗体非依赖性细胞毒性(AICC)杀伤机制(Bachanova V and Miller JS.Crit Rev Oncol 19:133-141,2014；Paul S andLal G.Front Immunol 8:1124,2017)。此外，也在探求NK细胞疗法对病毒感染患者的治疗以根除病毒感染的宿主细胞，这些病毒感染的宿主细胞是病毒再活化的下游来源(TraylenCM,et.al.Future Virol 6:451-463,2011,Larkin J,et.al.J Interferon Cytokine Res26:12,2006)。直接利用NK细胞或通过抗体介导的治疗响应利用NK细胞的主要缺点是，在对患者施用后，不能留存足够数量的能够攻击病毒感染细胞或失调细胞的活化细胞。通过用IL-15等细胞因子激动剂或NKG2A等阻断NK细胞负调节途径的刺激剂进行预处理或合并处理来改善NK细胞活化的数次尝试带来的结果不一(Knudsen KM et al.Exp Opinion BiolTher 20:7705-709,2020；Miller JS et al.Nature Med 28:392-400,2022；Creelan BCand Antonia SJ.Nature Rev Clin Oncol 16:277-278,2019)。这些次优活性可能是由于导致宿主毒性的脱靶效应或体内刺激有限(Guo,J et al.Cell Res 31:1190-1198,2021)。鉴于这些缺点，需要鉴定出可优先或特异性活化和维持NK及其它免疫效应细胞对病毒感染细胞或失调细胞的杀伤活性的剂。

还发现表达CD16a的细胞与炎性疾病相关联并直接参与炎性疾病(Cooper DL,etal.PLOS 7:e28918,2012)。几项测试类风湿性关节炎中细胞浸润的关联研究发现表达CD16a的细胞与疾病严重程度之间存在相关性(Robinson JI,et al.Ann Rheum Dis 69:1054-1057,2010)。此外，炎性疾病的实验动物模型还显示CD16a活性和炎性疾病进展的直接影响(Ji H,et al.Immunity 16:157-168,2002；Diaz DS,et al.Eur J Immunol 32:2915-2922,2002)。基于这些发现，能够阻断CD16a活化的剂的开发可用作CD16a相关炎性疾病的治疗手段。

发明内容

本发明提供天然存在的和合成的小分子量剂，其增强IgG抗体与CD16a-158F Fc受体(FcR)(SEQ ID NO:1)和与CD16a-158V Fc受体(SEQ ID NO:2)的结合，以及刺激免疫效应细胞上的CD16a FcR来实现细胞活化和下游靶细胞杀伤。本发明的小分子量剂涉及四环三萜类的羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇(化合物1a)和9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇(化合物2a)。它们能够增强CD16a-158F FcR及其高亲和力同种异型CD16a-158V FcR结合IgG1抗体以及能够活化NK和其它免疫效应细胞中的CD16a途径。这类治疗剂能够通过免疫效应细胞的CD16a活化而用于治疗感染性疾病、癌症和其它体液免疫抑制疾病(另见Nes WD andHeftmann E.Nat Prod 44:377-400,1981)。可选地，在某些碳上能够使这些支架结构(scaffold)的用途得以改变，为的是结合CD16a并阻断其在炎性疾病中不期望的活化。

基于胆甾烷的羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇(化合物1a和1b)；9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇(化合物2a和2b)；基于双降醇的化合物3、4a和4b；以及包含它们的三个环己基(A、B、C)和环戊基(D)环骨架结构作为支架结构的类似物，能够如所述用于改变CD16a以增强与IgG型抗体的亲和力结合和/或在存在或不存在IgG的情况下增强CD16a受体活化，而其它类似物可用于阻断CD16a与IgG的结合并阻断其活化。已对基于以下结构的小分子量剂进行了分析和测试：

其中R1是羟基(OH)或甲酰基(CH＝O)；

其中R2和R3是甲基(CH₃)；

其中R4是甲基或14α-二氟-甲基(CHF₂)；

其中R5和R6独立地是醛(CH₃CHO)；胺(NH₂)；二甲胺((CH₃)₂NH)；哌啶((CH₂)₅NH)；异丙胺((CH₃)₂CHNH₂)；吗啉(O(CH₂CH₂)₂NH)；羧酸(C(＝O)OH)；磺酰胺(CH₃SO₂NH₂)；乙酰胺(CH₃CONH₂)或(C₂H₅NO)；醇(OH)；酮(CH₃C(O)CH₃)、异丙基甲基酮(CH₃COCH(CH₃)₂)或甲基-异丁基-酮((CH₃)₂CHCH₂COCH₃)；甲基(CH₃)；2-甲基庚烷2,3-二醇(CH₃CH(CH₂)CH(OH)C(OH)(CH₃)₂)；2-甲基庚烷(CH₃CH(CH₂)₃CH(CH₃)₂)；包含2至12个PEG(聚乙二醇)单元的聚乙二醇化胺；PEG5胺；和生物素化胺，其中生物素部分通过PEG 2-12与胺部分连接。

能够用作R6的生物素化PEG2胺的示例是：

用作R6的PEG5胺的示例是：

本发明的另一方面使用上述化合物以及某些其它化合物作为CD16a FcR的有效结合剂和表达此类受体的免疫效应细胞的刺激剂，以增强对患者中的病原体以及病毒感染细胞和失调细胞(包括恶性细胞)的治疗效果。

本发明还包括用于在哺乳动物(包括人)中于体外和体内活化免疫效应细胞的治疗性药物组合物。药物组合物包含有效量的化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b。

上述化合物中的数种是优选的，原因在于比如合成的容易性增加和/功效更大。优选的化合物包括羊毛甾醇14α-二氟-甲基、羊毛甾醇24-醛、羊毛甾醇24-胺、羊毛甾醇24-二甲胺、羊毛甾醇24-哌啶、羊毛甾醇24-异丙胺、羊毛甾醇24-吗啉、羊毛甾醇24羧酸、羊毛甾醇24-磺酰胺、羊毛甾醇24-乙酰胺、羊毛甾醇24-醇、羊毛甾醇24-PEG(2-12)、羊毛甾醇24-生物素、羊毛甾醇24-PEG5-生物素、羊毛甾醇24-PEG5-羊毛甾醇、羊毛甾醇24-PEG5-环木菠萝烯醇、羊毛甾醇24-异丙基甲基酮、羊毛甾醇24-甲基-异丁基酮、羊毛甾醇24-甲基、二氢羊毛甾醇和24,25二羟基羊毛甾醇。

可使用的其它优选的小分子量剂是：环木菠萝烯醇24-醛、环木菠萝烯醇24-胺、环木菠萝烯醇24-二甲胺、环木菠萝烯醇24-哌啶、环木菠萝烯醇24-异丙胺、环木菠萝烯醇24-吗啉、环木菠萝烯醇24-羧酸、环木菠萝烯醇24-磺酰胺、环木菠萝烯醇24-乙酰胺、环木菠萝烯醇24-醇、环木菠萝烯醇24-PEG(2-12)、环木菠萝烯醇24-生物素、环木菠萝烯醇24-PEG5-生物素、环木菠萝烯醇24-PEG5-羊毛甾醇、环木菠萝烯醇24-PEG5-环木菠萝烯醇、环木菠萝烯醇24-异丙基甲基酮、环木菠萝烯醇24-甲基-异丁基酮、环木菠萝烯醇24-甲基。

其它实施方式包括采用胃肠外和非胃肠外药物制剂的上述小分子量剂和类似物的制剂。这样的药物制剂可包括但不限于α-生育酚、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇(cetearylalcohol)、玉米油单-二甘油酯、乳浮EL、肠溶丙烯酸树脂、乙醇、油酸乙酯、甘油、棕榈酸异丙酯、乳酸月桂酯、脂质体、辛酸/癸酸的单/二甘油酯、油酸、PEG、磷酸盐缓冲盐水、聚山梨醇酯80、丙二醇、脱水山梨糖醇单油酸酯、磺酰胺类和海藻糖。

本发明的另一个实施方式在分子结合测定中使用CD16a，在化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b的存在下，通过任何基于ELISA或基于亲和动力学的方法(如表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)、基于流控技术的结合(fluidics-based binding)如Octet^TM测定或其它动力学结合分析平台)测量CD16a对全长IgG抗体或IgG Fc片段的结合亲和力。

本发明的另一方面是生物素化化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b监测所述生物素化化合物与CD16a结构域的结合的应用。这可用于对关键结合结构域进行描绘、用于提高抗体结合亲和力、用于提高CD16a FcR活化和/或用于确定对表达CD16a的细胞中活化的FcR的生物加工。

本发明的另一方面是化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b在分子测定中增强CD16a与IgG结合的用途。这能够用于促进对CD16a与IgG Fc结合的抑制剂的筛选。此类化合物的用途增强结合信号，这可促进对此类抑制剂的筛选。

本发明的另一方面是用于增强CD16a与IgG Fc结构域结合以供体外筛选的套组。套组包括化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b，其能够用于CD16a与IgG Fc结合测定以增强结合信号。增强的结合信号可用于测试CD16a与IgG Fc结合的抑制剂。可使用本领域技术人员已知的用于筛选蛋白质-蛋白质拮抗剂的任意方法。

本发明的又一方面是化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b与抗体的缀合以增强抗体与CD16a的结合并改善抗体介导的治疗响应。

本发明的又一方面是在存在或不存在护理标准疗法(standard-of-caretherapy)的情况下将化合物1a、1b、2a、2b、3、4a或4b施用于患有感染性疾病或癌症的患者。化合物增强患者的体液免疫应答(即活化表达CD16a的免疫效应细胞)，从而改善临床结果。化合物可口服施用、皮肤施用和/或注射施用。

本发明的其它实施方式是使用化合物1a、1b、2a、2b、3、4a和/或4b的类似物，其结合CD16a并阻断其在免疫效应细胞中的活化以抑制炎症。

通过阅读说明书，对本领域技术人员将是显而易见的本发明的这些和其它方面为本领域提供用于增强表达CD16a的免疫效应细胞的方法、组合物和套组，表达CD16a的免疫效应细胞包括但不限于NK细胞和髓样细胞。这些能够用于改善患者对病原体或病毒感染以及对失调细胞(包括癌症)的响应。本发明的化合物能够用作单一剂或与其它疗法(包括基于抗体的疗法)组合使用。抗体可任选地与其中一种或多种化合物缀合。这些化合物可改善与免疫抑制相关的疾病中的抗体介导的体液免疫应答，免疫抑制相关的疾病包括癌症和非肿瘤疾病——其中使用抗体治疗剂刺激体液介导的免疫应答。本发明的第二方面是阻断CD16a活化以抑制免疫效应细胞活化——其进而支持不期望的炎症——来治疗炎性疾病的化合物的用途。

附图说明

图1A-图1B.化合物1和化合物2特异性增强人(图1A)和啮齿类动物(图1B)CD16aFc受体与IgG抗体Fc结构域的结合。这些数据确定啮齿类动物为相关物种以测试化合物1和2以及类似物对表达CD16a的免疫效应细胞活化的增强以实现体内治疗活性。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图2.化合物2增强低亲和力CD16a-158F Fc受体对人IgG1抗体的亲和力。分子测定显示化合物2能够显著改善CD16a-158F Fc受体与IgG1的结合，是对照化合物的4.7倍。实验代表最少两个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图3A-图3B.在存在和不存在IgG1的情况下，化合物1和2增强Jurkat-CD16a-158F(JKT-CD16a)荧光素酶报告基因细胞系中CD16a Fc受体的活化，证明了在抗体和非抗体介导的免疫效应物活性中的有用性(图3A)。实验代表最少三个重复孔。CD16a活化通过活化细胞因子标志物IFNγ和TNFα向Jurkat-CD16a细胞而非CD16a剔除型(null)亲代Jurkat(JKT)细胞的培养基中的分泌增强得到证明(图3B)。P值是利用学生T检验比较各组的化合物处理vs媒剂产生的。

图4A-图4C.化合物2活化原代人外周血单核细胞(PBMC)、人天然杀伤细胞(NK)和小鼠脾细胞(SPL)效应细胞并增强对抗肿瘤靶细胞的抗体依赖性(ADCC)(图4A)以及抗体非依赖性(AICC)细胞毒性(图4B)。用化合物2处理原代NK细胞导致下游CD16aFc受体活化标志物TNFα、IFNγ、GM-CSF和粒酶B蛋白的产生(图4C)，从而支持免疫效应物介导的细胞活化以及后续靶细胞杀伤的证据。在人PBMC和小鼠SPL刺激培养物中发现类似的细胞因子产生。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图5A-图5B.化合物2在体内被测试并且显示在超过从体外研究计算得出的有效剂量的十倍下耐受良好(图5A)。化合物2显著活化体内血清TNF-α稳态蛋白水平(图5B)。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图6.化合物2活化PBMC培养物内的免疫效应细胞，其进而能够杀伤SARS-CoV-2病毒感染的同胞(sib)PBMC细胞并降低病毒载量。实验代表最少三个重复孔。

图7A-图7B.结构活性关系(SAR)筛选揭示化合物1、2、3和4支架结构上的关键活性区域(图7A)。图7B显示所测试的具体化合物。这些数据证明了化合物1、2、3和4支架结构或其类似物用于开发另外的化合物——它们能够增强CD16a Fc受体-IgG抗体结合并活化或阻断免疫效应细胞中的CD16a途径以实现治疗应用——的用途。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图8.显示能够实现以改善CD16a Fc受体-IgG抗体结合以及活化或抑制的R5和R6处修饰的另外的示例。它们也能够作为生物素化探针使用(例如，化合物34)以分析化合物-CD16a的体外和体内相互作用。这些修饰可提高溶解度、分子活性和治疗活性。下文提供合成方法和最终化合物结构。

图9.R5/R6修饰的化合物2对CD16a Fc受体结合帕妥珠单抗的影响。这些数据表明存在于化合物26、27和33中的R5或R6修饰的使用能够被并入化合物1、2、3或4中以进一步增强CD16a Fc受体-IgG抗体结合并活化或阻断免疫效应细胞中的CD16a途径以实现治疗应用。可选地，存在于化合物29、31和32中的R5或R6修饰能够被并入以抑制IgG与CD16a Fc受体的结合并潜在地用于抑制炎症以实现治疗应用。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图10.对图9中显示CD16a-帕妥珠单抗结合增强的化合物2、26、27和33进行生物学和药理学分析以确定性质最优的化合物。使用人PBMC作为效应细胞，通过抗HER2帕妥珠单抗(PTZ)抗体测试化合物和乙醇(EtOH)媒剂对人SKBR3(表达HER2的乳腺癌细胞)的ADCC杀伤。如图所示，与亲本化合物2相比，化合物27和33显著增强ADCC杀伤(P<0.0000075)。使用含有细胞和PTZ而不含PBMC或化合物的孔(第一条)作为阴性对照。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图11.化合物27的示意性合成。

图12.通过口服施用化合物27，在体内活化NK细胞。向小鼠(每组N＝3)施用化合物27或媒剂。最后一次处理后24小时，采集血清并通过ELISA分析NK细胞活化生物标志物IFNγ和TNFα。如图所示，在化合物27处理过的小鼠中，两种生物标志物均显著升高(P<0.0056)。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

图13.用于治疗炎性疾病的CD16a-IgG结合拮抗剂的开发。使用ELISA测试可能会潜在地阻断CD16a FcR-IgG结合的化合物类似物。如图所示，衍生自化合物2支架结构的化合物29能够显著抑制CD16a FcR探针与涂覆在96孔微量培养板中的帕妥珠单抗(PTZ)抗体的结合。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

具体实施方式

本发明人已鉴定出这样的小分子量剂：其能够特异性结合跨物种CD16a Fc-γ-活化受体，导致NK细胞和其它携带CD16a的免疫效应细胞在体外和体内活化。小分子量剂增强IgG抗体与低(158F)和高(158V)亲和力CD16a Fc-γ-活化受体(FcR)的结合。小分子量剂发挥其作用的方式是通过改变FcR的动态结构，导致FcR-IgG结合增加、CD16a受体信号传导增强以及后续免疫效应细胞活化和靶细胞杀伤增强。在此，我们描述小分子量剂及其活性内核的用途，它们刺激FcR的活性，进而导致免疫效应细胞活化和/或增强的IgG1亲和结合以及后续靶细胞杀伤(另见Bruhns P et al.113:3716-3725,2009)。刺激FcR活化和增强IgG结合的小分子量剂能够用于治疗感染性疾病、癌症和其它体液免疫抑制疾病。我们还教导化合物(诸如但不限于化合物37)的用途：其使用含有供CD16a结合的关键骨架支架结构而不含刺激结构域的能够抑制参与炎性疾病的免疫效应细胞中CD16a活化的组合物来抑制CD16a活化。

所鉴定的小分子量剂能够通过与CD16a Fc-γ-活化受体(FcR)直接结合而结合并活化表达啮齿类动物和人CD16a Fc受体的免疫效应细胞。此外，这些化合物还能够增强IgG型抗体与高亲和力和低亲和力CD16a受体的结合，从而增加其对表达抗原的靶细胞的抗体介导的杀伤机制(Rugo HS,et al.J Clin Oncol 37:1000,2019)。可选地，非刺激化合物提供阻断CD16a活化的机会，从而抑制免疫效应细胞活化和不期望的炎性响应。尽管不想限于任何具体的理论或作用机制，但申请人相信活性小分子量化合物与免疫效应细胞(包括巨噬细胞、NK细胞和表达CD16a FcR的任意其它细胞亚型)上的CD16a FcR衔接。它们改变CD16a的动态结构，导致受体信号传导和免疫效应细胞活化发生改变以及与IgG Fc结构域的亲和力增强，这两种结果中的任一种或两种均导致针对靶细胞的体液免疫细胞杀伤应答增强。此外，这些化合物中的一种或多种能够施用于患者以增强其针对感染性疾病病原体和失调细胞(包括癌症)的体液免疫应答。可选地，这些化合物能够经修饰以结合和阻断CD16a活化，导致受抑制的免疫效应细胞活化及其相关联的下游炎性级联。本申请用于抑制与本领域技术人员公知的炎性疾病相关联的不期望的炎症。

上述化合物的另外的类似物——其通过增强的CD16a FcR结合和活化或阻断和失活以及它们的药物代谢动力学(pharmacokinetic,PK)和药物动力学(pharmacodynamic,PD)性质来进一步提高它们的体内治疗活性——可类似地得到鉴定。此类增强能够提高治疗功效和患者耐受性，所有这些均能够通过临床前和人体试验得到进一步确定。

其中一些方法、组合物和套组可分为三个类别。在一个类别中，将化合物开发作为治疗剂使用。本领域公知，与CD16a Fc受体，特别是对低亲和力人CD16a-158F FcR同种异型的更强的抗体结合亲和力，导致针对表达抗体的特异性抗原的靶细胞的改善的治疗响应(Stavenhagen,JB et al.Cancer Res 67:8882-8890,2007)。此外，本领域还已知活化的NK细胞在杀伤病毒感染细胞类型和失调细胞类型方面是有效的(Minetto,P,et al.FrontImmunol 10:1-10,2019；Market M,et al.Front Immunol 11:1-23,2020)。本文所述的化合物既能够活化NK细胞，又能够增强与CD16a Fc受体抗体结合。在又一类别中，本领域技术人员已知表达CD16a的失调炎性细胞可能会导致不期望的炎症，从而引起各种炎性疾病(Cooper DL,et al.PLOS 7:e28918,2012)。采用本文所述的组合物和方法的类似物的使用，使得能够开发出能够结合和阻断免疫效应细胞活化及其下游炎性级联的化合物。最后，另一类别是活性化合物作为分子生物学试剂在ELISA和其它结合测定形式中增强CD16a-IgG抗体结合以促进对CD16a FcR-IgG抗体结合抑制剂或活化剂的筛选以及后续途径抑制/活化的用途。这些化合物能够用于套组中或作为独立的测定增强试剂使用。

对于癌症和感染性疾病治疗用途，化合物能够被单独施用以实现AICC疗法，也能够与实验或监管部门批准的利用ADCC或ADCP作用机制的抗癌/抗病毒抗体组合施用。某些可能受益于增强的CD16a活化和/或活性化合物的结合的抗癌和抗病毒抗体包括但不限于抗癌剂：利妥昔单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗emtansine、西妥昔单抗、YP218、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、达雷木单抗(daratumumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、纳武单抗(nivolumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、奥伐单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、替西木单抗(tremelimumab)、莫妥珠单抗(mosunetuzumab)、派安普利单抗(penpulimab)、埃万妥单抗(amivantamab)、玛格妥昔单抗(margetuximab)、那昔妥单抗(naxitamab)、坦昔妥单抗(tafasitamab)、伊奈利珠单抗(inebilizumab)、伊沙妥昔单抗(isatuximab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)。此外，化合物还能够与抗感染性疾病抗体一起施用，抗感染性疾病抗体包括但不限于：尼塞韦单抗(nirsevimab)、替沙格韦单抗(tixagevimab)、索托维单抗(sotrovimab)、瑞丹维单抗(regdanvimab)和组合抗体疗法即卡西瑞单抗(casirivimab)+伊德单抗(imdevimab)。那些改善体液免疫功能(ADCC或ADCP)的抗体可采用最佳化合物量实现组合疗法。

对于治疗应用，化合物能够以口服、舌下、含服(buccally)、局部或肠胃外方式，经由肌内、静脉内或皮下方法施用。

化合物能够被配制以支持这些不同的施用途径。它们可经由脂质体制剂或其它制剂递送。常规脂质体由一个由阳离子、阴离子或中性(磷酸)脂质和胆固醇组成的脂质双层组成，该脂质双层包围着水体积。脂质体的合适的组合物包括但不限于与类脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)组合的胍-胆固醇阳离子脂质双(胍)-tren-胆固醇(BGTC)。合适的脂质体制剂的另一个示例是与基于咪唑的辅助脂质MM27缔合的氨基糖苷类脂质二油基琥珀酰巴龙霉素(DOSP)。脂质体能够在空间上稳定，例如使用聚乙二醇涂覆脂质体。如果需要，脂质体能够是配体靶向的。合适的配体包括抗体、肽、碳水化合物和蛋白质。

用于胃肠外和非胃肠外施用的又其它制剂包括但不限于α-生育酚、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、玉米油单-二甘油酯、乳浮EL、肠溶丙烯酸树脂、乙醇、油酸乙酯、甘油、棕榈酸异丙酯、乳酸月桂酯、脂质体、辛酸/癸酸的单/二甘油酯、油酸、PEG、磷酸盐缓冲盐水、聚山梨醇酯80、丙二醇、脱水山梨糖醇单油酸酯、磺酰胺类和海藻糖。

在本发明的其它实施方式中，我们提供开发能够结合和活化CD16a-FcR的任一种同种异型和/或增强IgG抗体-CD16a亲和力结合和下游活化的化合物的方法和组合物。

在一些实施方式中，测试化合物增强CD16a FcR结合和对表达CD16a FcR的细胞的活化的能力。CD16a FcR活化能够通过下游途径信号传导和下游标志物的测量来监测，下游标志物诸如但不限于IL-1β、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF和粒酶B。这些能够在体外或体内得到测试。

在又其它实施方式中，例如在体外或体内筛选时测试化合物1a和1b、2a和2b、3以及化合物4a和4b的类似物的改善的CD16a FcR-IgG抗体结合和/或CD16a FcR介导的途径表达细胞的细胞活化，同时使细胞毒性降至最低。这些是使用本领域技术人员已知的各种方法完成的。

在又一个实施方式中，使用本领域技术人员用于测量ADCC和/或ADCP的任意方法，化合物具有修饰的区域以改善CD16a FcR与IgG抗体的最佳结合和/或增强测试抗体的体液免疫应答。

在又一个实施方式中，化合物含有化合物1a和1b、2a和2b，或3以及化合物4a和4b的骨架，同时保留R1、R2、R3和R4处的化学基团，R5和R6处为修饰的化学基团——能够根据经验测试这些经修饰的化学基团对CD16a FcR-IgG抗体结合和/或免疫效应细胞活化或抑制的增强。

在一种用于测量化合物有效增强FcR抗体结合或表达CD16a的细胞活化的能力的方法中；通过ELISA、免疫组织化学或本领域技术人员已知的其它方法对化合物使IgG抗体与CD16a FcR的直接结合进行测试。具备25％或更高结合的化合物适于进一步的测试。

在一些实施方式中，使用功能性方法在存在或不存在抗体的情况下利用ADCC、ADCP、AICC或下游细胞因子如IL-1β、IFNγ或TNFα的产生来测量化合物1a和1b、2a和2b，或3以及化合物4a和4b或衍生的类似物的活性，其中细胞能够是细胞系或原代NK、髓样、PBMC或SPL细胞。术语“活性”通常是指当化合物在有或没有抗体的情况下与细胞一起温育时，与不存在化合物的细胞相比，在ADCC、ADCP或AICC靶细胞杀伤或细胞因子产生方面有10％或更大的变化。根据细胞类型、抗体和使用的化合物，这一术语还可指至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。

能够筛选出药物代谢动力学(PK)、药物动力学(PD)或药理学(PL)活性提高的化合物。在一些实施方式中，在体外将化合物添加到细胞中并在存在或不存在抗体的情况下测试效应细胞活化对靶细胞的杀伤。在有或没有抗体的情况下杀伤增强的化合物现在适于利用体内模型进行治疗上的测试。在另一个实施方式中，能够在来自各种物种的微粒体中温育化合物以确定可能会影响此类化合物(一种或多种)具有更高代谢稳定性的化合物修饰。根据所用的化合物，这种效果可以是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％或更大的变化。

其它实施方式采用化合物1a、1b、2a、2b、3、4a和/或4b结合和阻断CD16a活化和信号传导，其进而经由与炎性疾病相关联的持续细胞因子产生导致下游炎性信号传导减少。

与所附描述的各个方面相关的各种术语和用语(“术语”)在本文件的整个说明书和权利要求书中使用。除非另有具体指示，这些术语将被赋予其在本领域的普通含义。其它具体定义的术语应以与提供的定义一致的方式理解。

如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式的“一”、“一个/种”和“该/所述”也包括复数指代，除非内容另有明确规定。作为示例，对“一个细胞”的提及可包括两个或更多个细胞的组合，等等。对“一个探针”的提及可包括聚组氨酸标记的人或啮齿类动物CD16a-FcR、CD32a FcR或用于监测FcR-抗体结合的独立探针，借此2-10个组氨酸密码子在FcR的成熟的N端或胞外C端结构域处经工程改造。这些探针被称为CD16a-HIS或CD34a-HIS。对“细胞活化”的提及可包括通过本领域技术人员已知的任意分析方法，化合物对表达CD16a FcR的细胞的作用。

当提及诸如量、时间段和/或类似的量化值时使用的术语“约”意在涵盖自指定值起上至±9％的变化，因为这样的变化适于实施所公开的方法。除非另有指示，说明书和权利要求书中使用的所有表示试剂量的值(如分子量、摩尔浓度、反应条件、百分比等)都应理解为在所有情况下都由术语“约”量化。因此，除非有相反指示，以下说明书和所列权利要求中列出的数值是近似值，其可根据所需组合物剂性质和/或本发明寻求获得的方法而变化。最不济，且并非试图限制本申请的范围，每个数值应该至少由报告的有效数字和通过本领域技术人员已知的普通舍入方法来取值。

所用的术语“抗体”是广义的并且包括免疫球蛋白(也称为“Ig”)或抗体分子，包括多克隆抗体(也称为pAb)，单克隆抗体(也称为mAb)，包括小鼠、大鼠、灵长类动物、人、人源化和嵌合mAb以及全长的双特异性抗体或三特异性抗体。通常，抗体是与特定抗原结合的蛋白质或多肽链。抗原是受给定抗体特异性识别的结构。典型抗体包含异四聚体糖基化蛋白质，由通过二硫键和氢键的复合物排列而成的两条轻链和两条重链组成。术语“其二硫桥”是指被包含在重链铰链区内的二硫桥，这是本领域技术人员公知的。每条重链都有一个可变结构域(可变区)(VH)，之后是多个恒定结构域(称为Fc结构域)。每条轻链都有一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对准，轻链VL与重链的可变结构域对准。任意物种的抗体轻链都根据其恒定结构域内其氨基酸序列而被分配为两种不同类型中的一种，即kappa(κ)和lambda(λ)。

免疫球蛋白被归类成类别或同种型，取决于Fc结构域的类型，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这取决于其重链恒定(Fc)结构域中包含的序列。IgG同种型进一步由下列亚类组成，如同种型IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

“特异性结合”或“特异性地结合”是指抗体或抗原(包括抗体自身所含的序列)的结合比对其它抗原的亲和力更大。一般而言，特异性抗体或抗原结合片段以约5×10^-8M或更小的平衡解离常数K_D结合靶抗原。在其它情况下，它指的是抗体Fc结构域与CD16a、CD32a或CD64 Fc受体的结合。平衡解离常数K_D的范围能够取决于Fc受体及其同种异型。

术语“同种异型”是指CD16a或CD32a Fc受体的氨基酸序列，这些受体已被证明在人类群体中不同，每一种受体都对IgG Fc有不同的结合亲和力。对于CD16a，它一般涉及第158位的氨基酸，含缬氨酸(V)或苯丙氨酸(F)，如本领域技术人员公知的。

术语“亲和力”是指对抗体有关抗原与可变结构域结合的开启vs关闭率的测量以及对抗体有关抗体Fc结构域与Fc受体(包括CD16a、CD32a和CD64)结合的开启vs关闭率的测量。

“抗体衍生物”是指如上定义的抗体通过另一分子的共价连接——比如通过肽化学(即酰胺化等)、遗传融合和/或通过一般不与抗体缔合的翻译后部分(即糖基、乙酰基和/或磷酰基)等——而被修饰。这可包括本文教导的化合物为增强抗体FcR结合活性与抗体的化学融合体。

术语“CD16a动态结构”是指能够影响表达CD16a的免疫效应细胞体液功能、活化、抑制和/或CD16a-IgG抗体结合的任何结构上的变化。

“Fc结构域”是指在抗体铰链二硫键区的C端并且包括该抗体铰链二硫键区的任意抗体序列。这一区域包括CD16a、CD32a和CD64 Fc受体的结合结构域并且是本领域技术人员已知的。

“抗原”是抗体或抗体片段特异性结合的实体。这包括与感兴趣的抗体或蛋白质结合。

术语“成熟”是指其中N端分泌信号序列被切割的胞外膜或分泌蛋白，这是本领域技术人员公知的概念。

术语“癌症”、“恶性”和“肿瘤”在本领域是公知的并且是指具有不受调节的细胞生长和形态特征的细胞的存在，这些细胞与类似来源的正常细胞类型不同，也称为“失调细胞”。恶性是指那些能够导致发病和/或死亡的癌细胞。如所使用的，“癌症和肿瘤”包括恶变前(premalignant)类型和恶性类型。

术语“病毒的”、“致病的”和“感染的”在本领域是公知的并且是指已被引起疾病的微生物或病毒颗粒感染的细胞或对象的存在。

术语“炎症”或“炎性疾病”是指患者的疾病，借此炎性细胞失调导致身体的一个或多个器官有炎症。

如所使用的，术语“可溶的”是指不附着于细胞的细胞膜的蛋白质或非蛋白质剂。例如，可溶的剂可从正常或癌细胞脱落、分泌或输出到生物流体——包括血清、全血、血浆、尿液或细胞的微流体(包括肿瘤)中。天然的膜结合Fc受体如CD16a、CD32a或CD64或含有聚组氨酸标签的受体能够通过在受体的跨膜结构域前并入终止密码子而被工程改造成是可溶的和功能性的。

术语“检测剂”或“可检测剂”是指能够被连接至抗体或FcR并通过本领域常用的设备检测到的任何剂。这些包括但不限于荧光团、酶和酶底物、放射性核素、重金属和比色染料以及能够通过诸如但不限于光密度测定法、分光光度法、发光法、显微术、射线照相术和闪烁法等方法检测到的底物。可能需要另外的试剂来产生可检测的信号。

术语“生物标志物”是指因用化合物处理而被增强或抑制的免疫效应细胞产生的蛋白质。具体地，干扰素-γ(也称为IFN-gamma或IFNγ)、肿瘤坏死因子-α(也称为TNF-alpha或TNFα)和粒酶B是已知的由CD16a Fc受体刺激的免疫效应细胞(包括NK细胞)产生的生物标志物。

所使用的包括来自靶细胞的CD16a FcR诱导的蛋白质在内的特定蛋白质或化合物(诸如但不限于粒酶B、IFNγ或TNFα)的“水平”是指使用本领域已知的响应于用化合物处理而在体外或体内测量蛋白质和/或化合物水平的任意方法确定的蛋白质或化合物的水平或多个水平。此类方法包括凝胶电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、溶液相测定、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、荧光共振能量转移(FRET)、福斯特共振能量转移、电化学发光免疫测定等。在一个实施方式中，IFNγ和/或TNFα的水平是使用基于探针的技术确定的，如更详细描述的。在另一个实施方式中，使用基于色谱和ELISA的技术确定化合物的水平。

术语“体液免疫抑制(humoral immuno-suppression)、免疫抑制或体液免疫抑制(humoral immune suppression)”是指最大生物学响应沉默的任何抗体、抗体片段、双特异性或三特异性抗体或免疫效应细胞(即NK细胞、髓样细胞、单核细胞、树突细胞等)。据报道，FcR受体同种异型以及缺乏免疫效应细胞活化会影响这些体液免疫组分的生物学活性，包括ADCC、ADCP、AICC和/或PK、PD和PL谱(profile)。

术语“抗体药物缀合物(ADC)”是指任意这样的抗体：其与化合物缀合或融合，导致抗体的活性增强(包括与FcR的结合增强)，从而导致ADCC和ADCP增强。

术语“双特异性或三特异性抗体(BSP)”是指能够结合两种或更多种不同抗原的任何抗体。BSP能够包括至少但不限于两种全长抗体、一种全长抗体或一种单链抗体，其中每一种抗体结合不同抗原或同一抗原上的不同表位。

术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是指一种体外或体内过程，其中抗体能够与细胞表面上的抗原结合，然后通过抗体的Fc结构域内的序列与免疫效应细胞衔接，进而导致免疫效应细胞释放能够杀伤结合的细胞的毒素。

术语“抗体非依赖性细胞毒性(AICC)”是指一种体外或体内过程，其中表达CD16a的细胞通过非抗体CD16a FcR活化而被刺激，进而导致表达CD16a的细胞通过天然细胞表面受体结合失调或感染的细胞，导致释放能够杀伤结合的细胞的毒素。

术语“抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和调理作用”是指一种过程，其中抗体能够与失调细胞表面上的抗原结合，然后通过其Fc结构域内的序列与免疫细胞衔接，进而导致免疫细胞吞没、消耗并最终杀伤抗体结合的细胞。

术语“筛选”可指代测试化合物并通过监测ADCC、AICC、ADCP或其它免疫效应细胞活化来测量增强或减弱的生物学响应，目的是鉴定出具有此类活性的化合物。其它提及涉及寻找能够阻断或增强CD16a Fc受体与IgG抗体结合的化合物。该术语可用在其它环境中，在这些环境中，大量的测试元件受到测定以确定测试元件中的哪些元件具有某种性质。类似地，它能够用来指代对具有特定性质的患者样品进行测定。

术语“显著(地)”是指由包括学生T检验在内的多种程序确定的P值小于0.05的统计结果。

术语“药物代谢动力学(PK)”是指化合物在施用于对象时维持其稳态浓度的时间。

术语“药物动力学(PD)”是指对化合物的生化和生理效应及其作用机制(一种或多种)——包括当施用于对象时它们的作用和效应与其生化结构的相关性——的研究。

术语“药理学(PL)”是指化合物在体外或体内对管控或杀伤患病细胞的已知作用。

术语“最大耐受剂量(MTD)”是指化合物在患者或测试动物经历毒性信号之前能够向其施用的最大剂量。在测试动物中，MTD一般被定义为体重减轻超过10％。

术语“样品”是指从对象中分离的类似流体、细胞或组织以及存在于对象体内的流体、细胞或组织的总称。流体可包括生物学流体，其包括与对象或生物源接触的液体溶液，包括细胞和类器官培养基、尿液、唾液、灌洗液等。

如所使用的，术语“对照样品”是指任何临床或非临床相关的对照样品，包括例如来自未遭受具体癌症类型的健康对象或不同于其亲代细胞的细胞的样品。

术语“对照水平”是指蛋白质或非蛋白质剂的接受水平或预定水平，其用于与源自对象的样品中或用于体外测定的相同剂的水平进行比较。

如所使用的，可具有共同骨架的两种化合物的信号之间的“差异”通常是能够使用本领域技术人员常用的统计方法在统计学上确定的任何差异，并且与对照相比，最少有10％或更大的差异。根据所用的化合物和测定，也可指代至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。

术语“抑制”或“其抑制”意为减少统计学上可测量的量，或完全防止。

化合物语境下、在存在或不存在根据所述方法使用的抗体的情况下的术语“功能性”指示化合物能够分别增强或阻断抗体的结合和/或免疫效应细胞的活化，导致在体外或体内对靶细胞的增强的杀伤和/或下游蛋白的产生或对免疫效应细胞炎性途径信号传导的抑制。

术语“药学上可接受的”是指从药理学以及毒理学方面可接受而向患者施用并且使用本领域技术人员已知的方法制造的物质。这些包括由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物和人类的剂。术语“药学上相容的成分”是指与抗癌剂一起施用的药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或基质媒剂。“药学上可接受的载剂”是指不干扰活性成分(一种或多种)的生物学活性的有效性并且对宿主无毒的基质。

术语“制剂”是指化合物中所添加以支持其向患者施用的溶剂、赋形剂或基质媒剂。

术语“患者”和“对象”可互换使用以指代接受治疗剂治疗的人类和其它非人类动物，包括兽医对象。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物。在一个实施方式中，对象是人类。

术语“有效量”和“治疗有效的”可互换使用，并且在以足以在患者中产生增强的临床结局的量施用药剂的环境下使用。根据本文在“有效方案”中描述的方法施用有效量的剂。术语“有效方案”是指足以为患有特定癌症的患者实现增强的临床结果的剂的量与剂量频率的组合。当向患者施用能够比亲本化合物更好地克服发病率的剂或能够增强有效方案的临床结果的剂时，增强的功效是改善的临床结果。比如在本文的环境中，有效量是指与无化合物相比时，表明功效或差异所需的该化合物的量。

“治疗剂”一般基本上不含不期望的污染物。这意味着剂一般至少约50％w/w(重量/重量)纯并且基本上不含干扰性蛋白质和污染物。

术语“靶细胞”是指这样的真核或原核细胞或细胞群：其表达特定抗体或含抗体部分的抗原，并通过直接的抗体衔接以实现ADCC或ADCP活性或通过AICC的间接抗体相互作用被表达CD16a Fc受体的细胞结合。

术语“免疫效应细胞”是指任意细胞系或天然细胞，包括但不限于NK细胞、髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞，其可在与抗体结合的靶细胞结合时赋予抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或吞噬作用(ADCP或调理作用)以及在CD16a FcR刺激时赋予抗体非依赖性细胞毒性(AICC)。天然细胞可被纯化或以外周血单核细胞(PBMC)的形式混合存在。细胞系可天然表达CD16a或被工程改造以表达CD16a。

术语“失调细胞”是指被认为对亲代细胞异常的任何细胞。这些包括转化细胞、恶性细胞、病毒感染细胞、通过自动调节自主生长的细胞或原核病原体。

术语“体液应答”是指在存在测试抗体的情况下免疫效应细胞对靶细胞的ADCC或ADCP。术语“细胞应答”是指在不存在测试抗体的情况下免疫效应细胞对靶细胞的AICC。

术语“化合物”是指本文件中描述的能够结合并改变CD16a FcR活性的任意化合物或结构式构想化合物。具体地，其指代基于胆甾烷的羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇(化合物1a)；9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇(化合物2a)和双降醇衍生的化合物(化合物3)以及由它们的三个环己基(环A、环B、环C)和环戊基(环D)环骨架结构组成作为支架结构的类似物(化合物4a)的使用。术语“化合物”还指代本文件中描述的能够结合并增强或阻断CD16a FcR活性的任意化合物或结构式构想化合物，包括化合物1a、1b、2a、2b以及由它们的三个环己基(环A、B、C)和环戊基(环D)环骨架结构组成作为支架结构的类似物(化合物3、4a或4b)。

术语“类似物”是指衍生自化合物1a、2a、3、4a、1b、2b或4b的任意化合物，其中在R1、R2、R3、R4、R5和/或R6处作出单个或多个修饰。

术语“食品”是指主要由蛋白质、碳水化合物和/或脂肪组成的物质，其在生物体中用于维持生长、修复和生命过程并提供能量。食品中还可以含有矿物质、维生素和调味品等补充物质。见《韦氏大学英语词典》，第10版，1993年(Merriam-Webster's CollegiateDictionary,10th Edition,1993)。术语食品包括适于人类或动物消耗的饮料。如本文所用，“食品添加剂”是由FDA在21C.F.R.170.3(e)(1)中定义的，包括直接和间接添加剂。

术语“膳食补充剂”是指旨在补充膳食的携带或含有以下膳食成分中的一种或多种的产品(烟草除外)：维生素、矿物质、药草或其它植物、氨基酸、人类通过增加每日总摄入量来补充膳食的膳食物质，或这些成分的浓缩物、代谢物、组成部分、提取物或组合。

用于增强体液免疫介导的疗法的治疗化合物、套组和方法

本文提供用于鉴定能够有效增强或抑制CD16a Fc受体与IgG抗体结合和/或活化对病原体、病毒感染细胞或失调癌细胞的免疫效应细胞应答或抑制失调炎性细胞的小分子量化合物的组合物、套组和方法。图1-图11示意性显示出示例。套组由化学组成通过本发明中的结构式和实施例3中描述的合成适当组合物的示意性方法教导得到的化合物组成。活性化合物能够使用分子CD16a FcR-IgG抗体结合和/或效应细胞活化或抑制测定来鉴定，如以下实施例中所描述的。

在通过基于细胞的筛选鉴定活化化合物的方法中，在有或没有抗体的情况下将化合物添加到表达测试抗体的靶抗原的靶细胞培养物中。将免疫效应细胞添加到培养物中并比较有化合物和无化合物时的体液免疫应答，并利用标准ADCC、ADCP或AICC杀伤测定监测体液应答。一般认为至少10％的变化是对ADCC、ADCP或AICC功能的有意义的影响。根据所用的测定，有意义的影响也可被定义为至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。

在用于鉴定活化化合物的其它方法中，将测试抗体添加到靶细胞的培养物中，其中靶细胞天然表达测试抗体的抗原。添加经工程改造的表达与荧光素酶报告基因连接的人CD16a Fc受体(JKT-CD16a)的人Jurkat细胞，并在12-24小时后监测荧光素酶水平。一般认为至少10％的变化是对CD16a活化的有意义的影响。根据所用的抗体和测定，有意义的影响也可被定义为至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的变化。

本文还提供用活性化合物治疗癌症对象的方法。例如，患者可患有CD20、HER2、EGFR或表达间皮素的癌症如淋巴瘤、乳腺癌、间皮瘤、结直肠癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胆管癌或子宫内膜癌。据报道，靶向这些抗原的数个抗体在免疫效应细胞表达高亲和力CD16a-158V FcR同种异型的患者中更有效(Rugo HS,et al.J Clin Oncol 37:1000,2019)。遗憾的是，超过50％的世界人口表达低CD16a-158F FcR，因此使得能够增强测试抗体与CD16a-158F FcR的结合亲和力的化合物成为一种药学上期望的实体(Wang W,et al.CytogenetGenome Res 152:169-179,2017)。一种这样的抗体是抗CD20利妥昔单抗，临床研究发现，在CD16a-158F等位基因为杂合或纯合的患者中，该抗体的治疗效果显著降低(Treon SP,etal.J Clin Oncol 23:474-481,2016)。针对这一抗体使用有效的化合物也是药学上高度期望的。

在用活性化合物治疗对象的方法的一些实施方式中，患有感染性疾病或癌症的患者可单用化合物治疗或与护理标准疗法组合治疗。在本文所述治疗对象的方法的一些实施方式中，将化合物单独施用于对象。在又一个实施方式中，化合物与护理标准疗法组合施用，护理标准疗法包括在治疗对象时被认为是疾病适应症的护理标准的所有剂。

在鉴定阻断CD16a途径的化合物的方法中，将测试抗体添加到靶细胞的培养物中，其中靶细胞天然表达测试抗体的抗原。添加经工程改造的表达与荧光素酶报告基因连接的人CD16a Fc受体(JKT-CD16a)的人Jurkat细胞，并在12-24小时后监测荧光素酶水平。一般认为当与未用化合物处理的培养物相比时信号抑制至少10％是对CD16a抑制的有意义的影响。根据所用的抗体和测定，有意义的影响也可被定义为至少5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％或75％的抑制。

在用活性化合物治疗对象的方法的一些实施方式中，患有炎性疾病的患者可单用化合物治疗或与护理标准疗法组合治疗。在本文所述治疗对象的方法的一些实施方式中，将化合物单独施用于对象。在又一个实施方式中，化合物与护理标准疗法组合施用，护理标准疗法包括在治疗对象时被认为是疾病适应症的护理标准的所有剂。

在本文所述治疗方法的一些实施方式中，化合物由衍生自化合物1、2、3或4的化学骨架组成并保留R1、R2和R3处的化学基团，同时使用本文教导或举例说明的结构式来修饰R4、R5和/或R6区域。

本方法能够与替代治疗如手术、辐射、靶向疗法、化学疗法、免疫疗法、生长因子抑制剂或抗血管生成因子的使用相结合。化合物能够同时向正在接受替代治疗的患者施用。在护理标准疗法施用之前或之后，等化合物施用至少一小时到上至数月，例如至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月时，患者也能够接受替代治疗。本文提供的治疗方法的一些实施方式涉及向对象施用除化合物之外的对由所述病原体、病毒、癌症或炎性介质表达的抗原特异的治疗有效抗体。

在本文所述治疗方法的一些实施方式中，对象在施用化合物之前可能已经接受过替代疗法和基于抗体的护理标准治疗。

根据本文所述的治疗方法对治疗剂和化合物的施用可通过本领域已知的任意方式进行。

在癌症或非肿瘤(病毒、病原体或炎性细胞)介导的疾病的治疗或预防中有效的治疗剂或化合物的量能够通过标准临床技术确定。此外，可任选地采用体外测定，使用本文教导的标准或专有筛选方法帮助确定化合物所需的最佳剂量范围。有效剂量可由化合物的导出自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线外推得到。

例如，剂的毒性和治疗功效能够在细胞培养物或实验动物中通过确定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(对50％群体治疗有效的剂量)值的标准药学程序来确定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，并且其能够表示为LD₅₀/ED₅₀之比。表现出大于2倍的治疗指数的剂是合适的。当剂表现出毒副作用时，能够使用将剂靶向到受影响组织的部位的递送系统以使对健康组织中的细胞的潜在损伤降至最低，从而减少副作用。

给药和剂量方案可因活性药物浓度而异，而活性药物浓度可取决于对象的需求。

用于优化CD16a FcR与IgG型抗体结合活性以实现筛选的套组

本文还提供使用活性化合物增强人或鼠CD16a FcR结合IgG抗体以实现快速筛选能够影响途径的抑制剂或活化剂的套组。本文教导的是本发明中提供的活性组合物能够显著改善在ELISA和其它结合测定形式中CD16a FcR-IgG抗体结合。这种改善促进筛选能够在免疫效应细胞中正向或负向影响CD16a FcR生物途径的剂以开发出用于治疗疾病的治疗剂的能力，借此调节CD16a FcR途径可具有临床益处。一种教导包括待添加到高通量筛选测定——利用CD16a FcR和抗体发现小分子量或大分子量抑制剂——中的活性化合物(诸如但不限于化合物1、2、4、14、26、27、30、33或36)的添加(Mandelboim O,et al.Proc NatlAcad Sci USA 96:5640-5644,1999)。其它筛选可用于筛选Fc结构域修饰的抗体或Fc融合蛋白以实现增强的CD16a FcR结合，从而提高药理活性(Saunders KO.Front Immunol10:1-20,2019)。图1和图2中提供这一特征的示例。

套组可包括化合物与ELISA中常用的试剂，或者只是单独包括化合物与在分子或细胞结合测定中增强CD16a FcR-IgG抗体结合的使用说明。

以上公开内容概括性地描述了本发明。本文公开的所有参考文献均通过引用并入。通过参考以下具体实施例能够获得更完整的理解，这些实施例在本文只是出于说明目的提供，而不意图限制本发明的范围。

实施例1-对用于在体外和体内增强免疫球蛋白与啮齿类动物和人CD16a-Fc受体的结合和免疫效应细胞活化的化合物1和2的鉴定

为鉴定可能潜在地结合并增强低亲和力人CD16a-158F FcR与IgG型免疫球蛋白结合的化合物，开展半高通量筛选测定来筛选从商业来源获得的天然小分子化学库。这些库包含1,100多种来自各种天然来源的小分子量化学品并且由大量具有不同结构和生物学特性的化学品构成。初步测定(primary assay)采用基于96孔ELISA的形式，借此用2.5μg/mL的人IgG1或人血清白蛋白(HSA)——用作阴性对照——涂覆板，并使用每种探针2.5μg/mL检测CD16a-158F-HIS(SEQ ID NO:1)、CD16a-158V-HIS(SEQ ID NO:2)或CD32a-131H-HIS(SEQ ID NO:3)FcR结合。将缺少跨膜结构域的各探针的cDNA和纯化用C端聚组氨酸标签工程改造到含杀稻瘟素选择标记的哺乳动物表达载体中。将载体稳定转导至HEK293细胞中，并使用基于ELISA的筛选方法和作为检测探针的抗聚组氨酸(HIS)-辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体筛选高效价生产FcR蛋白的抗杀稻瘟素克隆。从在无血清BalanCD HEK293培养基(Irvine Scientific)中生长至1.5X 10⁶个细胞/mL的10天培养物中分离出分泌的成熟CD16a或CD32a蛋白(分泌期间切割的前导序列)并按销售商(Thermo Scientific)的建议通过HisPur^TM Ni-NTA树脂柱进行分离。对化合物库初步探查后，清洗孔并通过第二抗HIS-HRP检测抗体(Sino Biologicals)监测IgG结合。使用多孔读板器(Varioskan,ThermoFisher)在450nm下定量对应于单个克隆的孔信号。在对1,100多种化合物筛选后，仅发现一种化合物与对照组相比可重复增强huCD16a-158F FcR与IgG1抗体的结合。化合物分析将这一化合物鉴定为基于胆甾烷的羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇(化合物1)。结构分析发现了高度相关的9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇化合物(化合物2)，随后获得并测试了这一化合物以与化合物1比较对CD16a FcR和CD32a FcR的分子和细胞活性。如图1A所示，与huCD32a-131H FcR或HSA相比，化合物1和2均能够显著增强huCD16a-158F FcR和huCD16a-158V FcR与IgG1抗体的结合，证明两种化合物的靶特异性。进一步测试化合物2增强人IgG与其它CD16a种类(species)结合的能力。如图1B所示，化合物2增强鼠CD16a同系物1(FCGR3)(SEQ ID NO:4)(muFCGR3-HIS)与人IgG1的结合，但未增强鼠同系物2(FCGR4)(SEQ ID NO:5)(muFCGR4-HIS)与人IgG1的结合。这些分析是采用与上文相似的ELISA方法并用HIS标记的鼠FCGR3和FCGR4作为探针(Sino Biologics)，然后使用抗HIS-HRP进行检测来进行的。这些数据确定啮齿类动物为相关物种以测试化合物1、2、3和4以及衍生类似物对体内免疫效应活化的增强以实现治疗上的确认和概念验证。此外，图1所示数据支持化合物1或2及其在图7和图8中所示相关活性类似物的用途。作为潜在CD16a FcR-IgG结合增强剂的任何以及所有化合物，均能够在分子生物学研究中作为测定试剂使用，以促进对能够正向或负向影响CD16a FcR-IgG抗体生物学途径以用于涉及这一途径的治疗适应症的化合物进行筛选。将这些化合物作为分子生物学测定试剂来应用，会在3至5分钟内产生稳健的ELISA信号读出，而相比在基本的CD16a FcR-IgG抗体结合形式中，则需要15至30分钟，因此推动筛选平台的发展。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

为进一步评估CD16a FcR-IgG抗体结合增强的效果，生成滴定曲线以确定化合物2能够赋予低亲和力huCD16a-158F FcR增强的结合的量。简言之，在存在不同浓度的化合物2或无活性类似物(化合物5，见图7)的情况下，用2.5μg/mL的人IgG1涂覆ELISA板并用2.5μg/mL的huCD16a-158F-HIS FcR探查。探查后，清洗板并使用抗HIS-HRP进行二次探查以进行检测。使用多孔读板器(Varioskan)在450nm下对孔进行定量。如图2所示，化合物2能够使CD16a-158F-IgG抗体结合相比对照化合物5提高4.7倍，并且表明亲和力结合相比单用CD16a-158F有显著提高。这种提高经计算是将huCD16a-158F对IgG1结合的亲和力从大约1μM增加到200nM，使得其亲和力近似于高亲和力huCD16a-158VFcR同种异型的亲和力——其公布的亲和力大约为415nM(Nordstrom JL,et al.Breast Cancer Res 13:1-14,2011)，这是一个意外的发现，也是在开发基于CD16a的疗法时非常期望的特征(Bowles JA,etal.Blood 108:2648-2654,2006)。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

为确认增强的CD16a FcR-IgG抗体结合具有生物学相关性，使用Jurkat-CD16a-158F-荧光素酶(JKT-CD16a)报告基因细胞系(Promega)建立生物测定以测试化合物1和2在存在或不存在IgG1加：靶细胞；仅靶细胞；或仅JKT-CD16a细胞的情况下增强和活化低亲和力CD16a-158F FcR的能力。使用的靶细胞是OV-CD20，一种稳定转导以表达人CD20抗原的人卵巢癌细胞系(OVCAR3)。使用的测定抗体是嵌合(小鼠可变区与人IgG1Fc结构域融合)抗CD20利妥昔单抗。简言之，将0至5,000个靶细胞接种到黑色96孔微量培养板中的RPMI(含7.5％胎牛血清(FBS)和1％ L-谷氨酰胺生长培养基(R7.5))中，并在5％ CO₂中于37℃下生长过夜。次日，将孔清洗并在含或不含2.5μg/mL测试利妥昔单抗抗体的情况下用50μL含有不同浓度的化合物1或2的测定培养基(透明RPMI，1％低IgG FBS和L-谷氨酰胺(R1))将孔铺覆(plate)，测试利妥昔单抗抗体先前已被证明特异性地与OV-CD20细胞衔接(Grasso L,etal.Oncol Letters 23:1-10,2022)。最后，向每个孔中加入R1培养基中的9，400个JKT-CD16a细胞并将板在5％ CO₂中于37℃下温育12-18小时。按照制造商的建议，使用BIO-GLO(Promega)荧光素酶底物测试孔中CD16a FcR活化并使用多孔读板器(Varioskan)分析其相对荧光素酶产量(relative luciferase production,RLU)。如图3A所示，与媒剂对照孔或无化合物对照孔相比，化合物1和2在IgG的存在下均显示出JKT-CD16a活化的显著增强(中间一组条)。还使用与上文类似的方法测试JKT-CD16a细胞加靶细胞在不含抗体的情况下的CD16a-158F FcR活化。如A图中右侧一组条所示，化合物1和2在不存在IgG抗体的情况下均刺激JKT-CD16a-158F FcR活化，证明了这些化合物直接刺激CD16a FcR活化的能力，但刺激水平低于存在IgG抗体的情况。在任意处理条件下，未添加JKT-CD16a细胞的孔(左侧条)未显示CD16a活化增强。为确认化合物1和2的CD16a FcR特异性，通过ELISA测试不表达CD16aFcR的亲本Jurkat细胞以及JKT-CD16a细胞在培养基中对下游CD16a FcR活化标志物IL-1β和TNFα的产生。用R1培养基中50,000个细胞/孔接种不透明的96孔微量培养板并向每个孔中加入10μM化合物2或其非活性化合物5类似物，并在37℃下于5％ CO₂中温育18小时。将板离心以使细胞沉淀并收集上清液，并按照制造商的建议通过ELISA测试INFγ(SinoBiologicals)和TNFα(R&DSystems)的产生。如图3B所示，当在化合物2的存在下生长时，两种细胞因子均由JKT-CD16a-158F细胞产生，而亲本Jurkat或用化合物5处理的任意细胞几乎没有细胞因子产生，因此证明了需要CD16a FcR以供化合物2诱导产生细胞因子。这些数据证明化合物及近似的类似物的使用能够：1)增强CD16a-158F FcR与IgG1抗体的结合，和2)在不存在抗体结合的情况下刺激CD16a FcR活化，这两个特征对于基于CD16a FcR的疗法的药物开发是有用的。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验比较各组的化合物处理vs媒剂产生的。

为证明化合物2等活性化合物刺激原代免疫细胞的免疫效应物活性的能力，通过测量针对肿瘤靶细胞的抗体依赖性(ADCC)或抗体非依赖性(AICC)细胞毒性来测试化合物2对人外周血单核细胞(PBMC)、人NK和小鼠脾细胞(SPL)效应细胞的活化。简言之，将5000个人乳腺癌(SKBR3或OE19)或OV-CD20靶细胞铺覆在黑色96孔微量培养板中的R7.5培养基中48小时。清洗孔并将50,000个PBMC、NK或SPL效应细胞添加到R1测定培养基中，其中含或不含靶向测试抗体和25或50μM的化合物2。媒剂是化合物2在其中溶解的溶剂。对于使用SKBR3人乳腺癌或OE19食管腺癌细胞系的测定，使用2.5μg/mL的靶向HER2的曲妥珠单抗测试抗体用于ADCC测定。对于OV-CD20测定，使用2.5μg/mL的靶向CD20的利妥昔单抗测试抗体用于ADCC分析。培养物在5％ CO₂中于37℃下温育24小时，三次重复。温育后，收获培养上清液用于细胞因子分析，并用磷酸盐缓冲盐水清洗孔并使用Varioskan读板器通过Cell Titer-GLO(Promega)定量附贴的靶细胞的成活力。如图4A所示，用化合物2加靶向抗体处理的孔表明，与单用抗体处理(媒剂)相比，化合物2能够通过ADCC增强人(PBMC细胞和NK细胞)和小鼠(SPL细胞)效应细胞对靶细胞的杀伤。ADCC数据被绘图成用化合物2或媒剂处理的抗体vs.未用抗体处理的培养物的杀伤百分比。使用与上文类似的方法，图4B显示出化合物2在不存在抗体的情况下活化人原代NK细胞，进而使得NK细胞能够通过AICC机制杀伤OV-CD20肿瘤细胞的能力。AICC结果被绘图成化合物2vs单用媒剂处理的培养物的杀伤百分比。为证明NK细胞中CD16a FcR途径活化参与AICC效应，使用各制造商分别推荐的抗细胞因子抗体组合，通过ELISA分析来自图2B中实验的化合物2和媒剂处理孔的上清液中与CD16a FcR介导的效应细胞活化相关联的细胞因子和粒酶。如图所示，除产生细胞毒性粒酶B蛋白(SinoBiologics)之外，还发现在不存在抗体的情况下，TNFα、INFγ和GM-CSF(Abcam)均由化合物2处理孔中的NK细胞产生和分泌，从而支持化合物2造成CD16a FcR效应物介导的细胞活化并后续杀伤靶细胞的证据(Wang R,et al.J Leukoc Biol 91:299-309,2012；Louis C,etal.J Exp Med 217:e20191421；Caligiuri MA.Blood 112:461-469,2008)。时间进程分析发现，活化和细胞因子产生发生在暴露后30分钟内。在化合物2处理的人PBMC和小鼠SPL培养物中发现类似的细胞因子产生。这些数据证明了化合物2及活性类似物能够通过抗体增强基于抗体的靶细胞杀伤以及增强对人和鼠免疫效应细胞的基于非抗体的刺激的能力，及其作为目标为CD16a FcR的疾病的治疗的潜力。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

为证明化合物2等活性化合物在体内活化免疫效应细胞的能力，我们使用无胸腺裸鼠来确定耐受性和全身免疫效应细胞活化。先前的体内测定发现，在无胸腺裸鼠中，化合物2最高耐受每日i.v.给药至少7mg/kg。为确定化合物2在体内活化免疫效应细胞的能力，我们每日施用7mg/kg化合物2或近似体积的媒剂(乙醇)达5天(第1-5天)，并在第11天分离总血清以测量免疫效应细胞活化标志物。如图5A所示，通过体重未减轻来确定每个队列中的所有小鼠对5天处理耐受良好。使用与上文的描述类似的方法，通过ELISA在来自经处理小鼠的血清中监测TNFα(R&D Systems)免疫效应细胞活化标志物并发现其在化合物2处理的小鼠(298pg/mL)中显著上调——与媒剂对照队列(11pg/mL)相比P＝0.00000026。这些数据证明了化合物2及其活性类似物在体内活化免疫效应细胞的能力，用于评估在人类疾病小鼠模型中的潜在治疗应用以及作为潜在疗法在用或不用基于治疗抗体的疗法的情况下治疗涉及CD16a FcR的人类疾病，如癌症或感染性疾病。实验代表最少三个重复孔。P值是利用学生T检验产生的。

实施例2-对能够抑制病毒杀伤人外周血单核细胞的化合物的鉴定

先前有报道称NK细胞能够杀伤病毒感染的细胞(Bjorkstrom NK,et al.NatReviews Immunol 22:112-123,2022)。具体地，先前的研究表明，SARS-CoV-2病毒能够感染人PBMC，并且这种感染对总体PBMC存活率可能是致命的(Manunta MDI,et al.ScientificReports11:4904-4916,2021)。为测试本文所述的活化CD16a FcR的小分子量剂在PBMC内活化效应细胞，进而能够杀伤病毒感染的PBMC同胞细胞并降低病毒载量的能力，针对暴露于SARS-CoV-2病毒的人PBMC来测试化合物2。简言之，将生长在含10％热灭活FBS(R10)的RPMI培养基中的IL2活化PBMC以100,000个细胞/孔铺覆在96孔U形底微量培养板中。接下来，将(先前通过蚀斑形成单位PFU确定的)2.7X 10⁵个病毒滴度添加到含或不含25μM化合物2的适当的孔中。在5％ CO₂中于37℃下温育培养物72小时。将板离心并收集上清液以供未来细胞因子和病毒滴度分析。将细胞重悬于RPMI+10％ FBS中，转移到96孔黑色微量培养板中，并使用Cell Titer-Glo(Promega)测试成活力，并在96孔微量培养板读出器上读出成活力。如图6所示，与用25μM化合物2处理的PBMC培养物保留100％成活力相比，用病毒和媒剂处理的PBMC培养物具有77％成活力。这些数据支持化合物2及相关类似物用于治疗病毒感染细胞和患有感染性疾病的患者的作用。实验代表最少三个重复孔。

实施例3-活性类似物的筛选和确定维持增强的CD16a FC受体-抗体结合和免疫效应细胞活化的关键区域

基于分子的重组CD16a-HIS FcR和IgG1抗体ELISA测定的使用能够实现便利(facilitated)筛选，以确定除了可能进一步增强或抑制CD16a FcR特异性活化和下游免疫效应细胞活性的新型类似物之外，化合物1和2以及相关的3-环己基,1-环戊基相关双降醇(化合物3和4)内的最佳区域。然后可在体外生物测定中对由本文教导的分子筛选所鉴定的先导化合物(leads)进行测试来确认，然后在体内进行测试以鉴定出在药物代谢动力上、药物动力上和治疗上最佳以及耐受最佳的化合物(一种或多种)。在本文中，我们先测试了公共结构域中与化合物1或2具有共同结构的大量化合物。如图7A所示，这些研究证明了羟基或甲酰基作为R1的重要性，其中高度相似的化合物2类似物——环木菠萝烯醇阿魏酸酯(化合物12，图7B)，其在R1处缺少羟基——是完全无活性的，而在R1处含有甲酰基的3-甲酰基环木菠萝烯醇24-酮类似物(化合物20)保留增强的CD16aFcR-IgG抗体结合，3-β-羟基-4,4-二甲基-5-α-双降醇类似物(化合物4)也是如此，与3-α-羟基-4,4-二甲基-5-α-双降醇(化合物17)形成对比，再次显示出R1区域处立体专一性的重要性。

此外，R2和R3处的甲基对于CD16a FcR-IgG抗体增强的结合和活化的重要性表现为与化合物1相比5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇(化合物6)的活性丧失，而C13和C14处的立体专一性对活性具有一定的负面影响，如化合物13所示。化合物1中甲基与氟在R4处的交换似乎对活性几乎没有影响。

基于上述发现，使用胆甾烷或化合物3骨架合成类似物进一步表明了在R5和R6区域处制备各种类似物的灵活性，借此在R6区域处两个胆甾烷衍生的9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇(化合物14)的PEG二聚化或在胆甾烷衍生的化合物20上C24处酮的取代表明增强的CD16a结合活性几乎没有丧失，类似于化合物3衍生的化合物4的保留的结合活性，导致集中努力进一步扩展不同化学类别的结构活性关系以实现R5/R6区域的进一步优化。在化合物1至20、化合物30和化合物36至38中发现的这些以及另外的结构活性关系提供了对活性区域的另外的教导，从而产生用于治疗涉及CD16a FcR的疾病适应症(包括癌症和感染性疾病)的另外的活性类似物。可选地，非增强化合物如化合物37或38可用作CD16a活化的抑制剂以治疗CD16a介导的炎性疾病。

基于活性化合物1、2、3或4衍生的类似物在R5和R6区域处具有极端可变性的发现，能够实施另外的修饰示例以提高CD16a FcR-IgG抗体结合和/或活化以及被用作生物素化探针(化合物34，图8)以在体外和体内分析化合物-CD16a FcR相互作用(图8)。这些修饰用于提高溶解度、分子活性、PK/PD质量和治疗活性。提供合成其它类似类型化合物结构的方法。

实施总体方案以产生化合物2在R5/R6处发生变化的另外的类似物，并适应增强CD16a-FCR与IgG1抗体的结合以及表达CD16a的效应细胞的FcR活化以实现治疗应用的必要需求。为制备这些化合物，生成化合物12并将其用作生成化合物2及其类似物的来源。在方案1中，碱水解，保护3-羟基，切割异丙啶(isopropylidine)，之后去除3-羟基保护基，产生化合物21，然后将化合物21用作活性类似物和共同中间体，通过：在C24处还原胺化(方案2)；氧化生成羧酸类似物(方案3)；以及中间体的乙酰化和硫酸化(方案4)产生另外的基于化合物2的R5/R6类似物。

在以下方案1中，化合物2是在氢氧化钾(KOH)的乙醇(EtOH)水溶液的存在下通过水解化合物12生成的。通过使用乙酸酐进行乙酰化来保护得到的仲醇。然后使用O₃、Zn和AcOH或锇酸钾和高碘酸钠氧化双键生成醛1-2，之后在80％ NaOH/EtOH水溶液中水解产生化合物21。由于化合物12来自天然来源，先前的经验发现C24酮异构体持续存在，这使得能够使用相同方法生成化合物30(图8)，但要通过超临界流体色谱法(SFC)纯化并通过核磁共振(NMR)确认。

方案1

在以下方案2中，化合物25是由化合物21和商业二甲胺盐酸盐在MeOH和/或DCM中采用还原胺化制备的。

方案2

通过方案2生成的另一种类似物是化合物26，其是由化合物21和商业异丙胺在MeOH和DCM中采用还原胺化制备的。

化合物27是通过方案2由化合物21和商业哌啶在MeOH和DCM中采用还原胺化制备的。

通过方案2方法生成的化合物2类似物28是在MeOH和DCM以及商业吗啉中利用对化合物21的还原胺化制备的。

在另一种方案2合成中，化合物29是通过在t-BuOH和THF中、在NaClO₄、NaH₂PO₄和2-甲基-2-丁烯的存在下将化合物21氧化产生化合物29生成的。

作为方案2类似物合成的最后一个示例，具有2至12个聚乙二醇(PEG)单元不同长度的化合物2的聚乙二醇化R6类似物是由化合物21和商业NH₂-PEG2-OH(化合物32)、NH₂-PEG12-OH(33)以及介于其之间的PEG长度在MeOH和DCM中采用还原胺化合成的。

在以下方案3中，化合物22是由化合物21和商业BnNH₂在MeOH和DCM中采用还原胺化，之后在Pd(OH)₂/C、H₂气氛和MeOH的存在下进行氢化制备的。然后在碱性条件下用甲基磺酰氯将化合物22磺酰化得到化合物23，而化合物24是在EDCI和DMAP的DCM溶液的存在下由化合物22与乙酸缩合制备的。

方案3和4

在另一种方法中，在NaBH₄的EtOH溶液的存在下还原化合物21得到化合物31，然后在EDCI和DMAP的DCM溶液的存在下使化合物31与D-(+)-生物素缩合得到生物素化化合物34。

使用类似方法生成具有类似R5和R6修饰的化合物1类似物。

实施例4-对在体内使用的具有最佳药理学性质的化合物的鉴定

进行对实施例3中描述的化合物2衍生类似物的分析，通过ELISA测试增强的CD16aFcR与IgG的结合。简言之，如上所述用PTZ涂覆96孔板，并在存在10μM亲本化合物2和R5/R6化合物类似物22-34的情况下用CD16a-158F-HIS探查以测定介导增强的CD16a-IgG结合的那些化合物。如图9所示，化合物26、27、33显著增强CD16a-158F与IgG的结合(P<0.005)。为进一步评估增强的结合的影响，如上所述测试这些化合物对人PBMC ADCC的增强。以5,000个细胞/孔将人乳腺癌SKBR3细胞铺覆于黑色96孔微量培养板中的R7.5中并在5％ CO₂中于37℃培养过夜。次日，每个孔中——在1或5μM的各化合物或乙醇(EtOH)媒剂对照的存在下——加入50,000个在R1培养基中的PBMC，三次重复。使用经EtOH和PTZ处理而不含PBMC的孔作为阴性对照。培养物在5％ CO₂中于37℃下温育24小时，三次重复。温育后，使用Varioskan读板器通过Cell Titer-GLO(Promega)定量靶细胞成活力。单位以相对发光单位(RLU)来显示。如图10所示，化合物27、33增强ADCC最为显著(P<0.0000075)。

接下来，我们使用人和小鼠微粒体测试化合物2、26、27和33的代谢稳定性。对于各测试化合物，在25mM磷酸钾缓冲液中将样品稀释为2μg/mL的最终浓度，同时各物种的肝微粒体的最终浓度为0.5mg/mL。通过添加最终浓度为1mM的NADPH试剂引发酶反应。对于阴性对照样品，不添加NADPH试剂。将样品在50RPM回旋振荡器(orbital shaker)上于37℃下温育，并在0、5、10、15、30和60分钟的预定时间点取出整分试样。然后用三体积的含普萘洛尔(propranolol)作为内标的乙腈使样品沉淀，并以2000g离心10min，然后通过LC/MS/MS进行分析。注意，在NADPH辅因子存在的情况下，化合物在肝微粒体中仅经历I期代谢。对结果的数据解释基于的是：相对于0分钟温育样品，剩余亲本化合物百分比，由此根据剩余化合物％的自然对数vs.时间图计算消除半衰期。计算以下参数以评估化合物的体外代谢稳定性：Cmp＝微粒体蛋白的浓度(mg/mL)；t_1/2＝半衰期(min)，其中t_1/2等于0.693/斜率；CLint＝固有肝清除率(μL/min/mg)，其中CLint等于0.693/(t_1/2×Cmp)。基于这些分析，如表1所示，与化合物2和33相比，化合物26和27在小鼠和人微粒体中的代谢稳定性均显著提高。

基于PBMC中化合物27的卓越代谢稳定性(表1)和ADCC增强(图10)，我们进一步分析化合物的体内活性。我们首先——如下所述以及图11中所描绘——放大(scale up)化合物27的合成。在0.415M KOH的EtOH水溶液这一碱性条件下水解一批25克的γ-谷维素得到仲醇N。然后使用37.8mM的Ac₂O，用乙酰基保护仲醇N，之后臭氧分解，得到醛中间体2。随后使用27.1mM哌啶的AcOH溶液进行还原胺化，之后添加NaBH(OAc)₃，得到中间体3。化合物27的游离碱是通过在NaOH的MeOH和THF水溶液这一条件下水解中间体3获得的。使用4M HCl二烷溶液将化合物27的游离碱转化为其HCl盐并通过过滤收集沉淀产物。通过质谱和H-NMR分析最终产物。质谱分析显示出主要化合物，预期化合物27分子量为470.6(见下文)且具有准确的H-NMR光谱特征。

化合物27的质谱分析显示，与对化合物27预测的一样，主要物质(species)的分子量为470.6。

为进一步确定化合物27的药理学性质，我们测试其口服生物利用度和在小鼠中全身性活化NK细胞的能力——通过测量NK细胞活化标志物IFNγ和TNFα来确定。对于口服生物利用度，向小鼠喂食标准实验室啮齿类动物膳食，并将其圈养在22+30℃且相对湿度为50+20％、12小时光和12小时暗循环的单独笼舍中。给药前，使动物禁食过夜，6小时后恢复食品供给，这时采集血液样品。在整个研究过程中，随意提供水。通过将化合物27的沉淀粉末研磨成细颗粒并悬浮在0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)的水溶液中来制备化合物27。通过用于口服施用的灌胃针以100mg/kg(10mL/kg)向三只动物给药。施用后5、15、30分钟以及1、2、4、6、8、24小时，经由隐静脉采集血液样品(每份样品25-30μL)。在24小时时，另外采集血液样品(每份样品150-200μL)以供细胞因子分析。将血液样品采集在Greiner MiniCollectK₂EDTA管中，置于冰上，且不长于30分钟，以15,000g离心5min，获得血浆样品，同时在24小时时，每份血浆样品另外采集50-100μL。所有血浆样品在分析前均储存在-70℃下。

如下进行血浆样品的生物分析。使用三体积的含内标的乙腈与一体积的血浆制备血浆样品，使蛋白质沉淀。将样品以3000g离心10分钟并取出上清液以供LC-MS/MS分析。通过制备1mg/mL储备溶液以及后续一系列于甲醇:水(1:1,v/v)中的工作溶液制出校准标准品和质量控制品，将这些工作溶液掺入到空白血浆中，得到范围从1ng/mL至10μg/mL的一系列校准标准样品和三种浓度水平(低、中、高)的质量控制样品。所有产生的血浆样品的处理方法都与校准标准品和质量控制样品相同。使用多反应监测进行LC-MS/MS分析，以检测每种候选药物、另外的相关分析物和内标的特征离子。如上所述测量血浆浓度以确定浓度vs.时间图谱。使用本领域技术人员已知的线性梯形法计算血浆浓度vs时间曲线(AUC)下面积。采用非房室分析对数据进行拟合以获得药物代谢动力学(PK)参数。

静脉施用后报告的关键PK参数如下：终末半衰期t_1/2、初始血浆浓度C₀、血浆浓度vs.时间曲线下面积AUC、稳态Vss下分布体积、总血浆清除率CLp和平均停留时间MRT。

血管外施用后报告的关键PK参数如下：终末半衰期t_1/2、最大血浆浓度Cmax、达到最大血浆浓度tmax的时间、血浆浓度vs.时间曲线下面积AUC、平均停留时间MRT和生物利用度F。所有参数均针对单只动物以及平均值、标准偏差和变异系数表示且为本领域技术人员所公知。

以100mg/kg混悬液口服施用后，测试化合物在6小时内逐渐达到峰值血浆浓度(Cmax)511ng/mL(Tmax)，并且其血浆浓度以多相方式下降，在24小时时的最后一次可测量浓度为242ng/mL并且长终末半衰期(t_1/2)为18.3小时。全身暴露总量(AUClast)为7.75h*μg/mL，同时口服生物利用度(F)为11.7％。这些数据表明了化合物27的口服生物利用度。

为确定在小鼠体内的耐受性和全身活化NK细胞的能力，我们对向小鼠口服施用的化合物27进行测试。将6只小鼠随机分为处理组媒剂对照(水)和100mg/kg化合物27——其全都悬浮于0.5％羟丙基甲基纤维素中。在第1-5、7、9、11、13、15天向小鼠口服给药，并在第16天处死小鼠，这时采集血浆。耐受性基于的是每只小鼠第1天体重。最大耐受剂量被确定为一组中死亡的动物体重减轻超过20％或>10％。10个给药进程后，发现两组中所有小鼠都很健康，体重相近，证实化合物27的100mg/kg多次口服给药耐受良好。

为证实化合物27的口服施用活化NK细胞，使用实施例1中描述的方法通过ELISA从第16天收获的血浆中测量NK活化标志物IFNγ和TNFα。如图12所示，与媒剂对照处理的小鼠相比，化合物27处理的小鼠中两种NK细胞活化标志物均上调，证实化合物27的口服摄取和靶NK细胞的活化。这些支架结构体现出本申请所教导的基本创造性。

实施例5-使用化合物1、2、3和/或4支架结构开发类似物以开发出CD16a途径抑制剂来抑制炎症

尽管由化合物1、2、3和4支架结构合成的类似物的多个示例已显示出增强的CD16aFcR结合和免疫效应细胞活化的活性，但发现其它类似物抑制IgG-C16a FcR结合。这一类类似物可用于抑制炎性疾病。有几份报告发现，炎性疾病中活性CD16a信号传导可能是一亚组炎性疾病的潜在原因(Steel AW,et al.Aliment Pharmacol Ther 33:115-126,2011)。本文的教导表明，化合物1、2、3和4支架结构能够用于添加能够增强其对CD16a刺激的活性的化学基团。此处，我们提供如何能够利用这些支架结构开发CD16a拮抗剂以抑制CD16a-IgG相互作用和下游活性(包括产生促炎细胞因子，如IFNγ)的示例。图10和图13显示出实施例1中描述的ELISA结合测定。简言之，用2.5μg/mL帕妥珠单抗(PTZ)IgG或HAS——作为阴性对照(无PTZ)——涂覆96孔透明微量培养板。然后在有或没有化合物的情况下用人CD16a-158F-HIS探查孔，以监测CD16a-PTZ结合。如图10和图13所示，衍生自化合物2支架结构的多个类似物(化合物29、31、32)能够抑制CD16a-PTZ相互作用约49％(P≤0.005)，进而将会抑制CD16a途径信号传导。本文教导的支架结构的用途能够被扩展以开发出甚至更强力的CD16a抑制剂，方法类似于本文教导的开发CD16a活化剂的方法。这些支架结构体现出本申请所教导的基本创造性。

本文提供的实施例中描述的方法教导了用于治疗CD16a FcR介导的疾病的新型组合物和疗法技术。

表1.序列标识(N到C端的所有序列)

下划线表示聚组氨酸标签

加粗表示人CD16a 158F和158V的多态性变化

SEQ ID NO:1成熟人CD16a-158F-HIS(登记号P08637)

SEQ ID NO:2成熟人CD16a-158V-HIS(登记号P08637)

SEQ ID NO:3成熟人CD32a-131H-HIS(登记号P12318)

QAAAPPKAVLKLEPPWINVLQEDSVTLTCQGARSPESDSIQWFHNGNLIPTHTQPSYRFKANNNSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVLQTPHLEFQEGETIMLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKFSHLDPTFSIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLFSSKPVTITVQVPSMGSSSPMGIIVAVVIATAVAAVAAVVALIYCRKKRISANSTDPVKAAQFEPPGRQMIAIRKRQLEETNNDYETADGGYMTLNPRADDDKNIYLTLPPNDHVNSNNGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH

SEQ ID NO:4成熟小鼠CD16a-1(FCRG3)-HIS(登记号P08508)

ALPKAVVKLDPPWIQVLKEDMVTLMCEGTHNPGNSSTQWFHNGRSIRSQVQASYTFKATVNDSGEYRCQMEQTRLSDPVDLGVISDWLLLQTPQRVFLEGETITLRCHSWRNKLLNRISFFHNEKSVRYHHYKSNFSIPKANHSHSGDYYCKGSLGSTQHQSKPVTITVQDPATTGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH

SEQ ID NO:5成熟小鼠CD16a-2(FCRG4)-HIS(登记号653142)

GLQKAVVNLDPKWVRVLEEDSVTLRCQGTFSPEDNSIKWFHNESLIPHQDANYVIQSARVKDSGMYRCQTALSTISDPVQLEVHMGWLLLQTTKWLFQEGDPIHLRCHSWQNRPVRKVTYLQNGKGKKYFHENSELLIPKATHNDSGSYFCRGLIGHNNKSSASFRISLGDPGSPSMFPPWHQGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH

Claims

1.治疗患有病毒感染、癌症、寄生虫感染、细菌感染、酵母感染或炎性疾病的对象的方法，其包括：

向所述对象施用有效量的化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b，借此增加所述对象对所述病毒感染、所述癌症、所述寄生虫感染、所述细菌感染、所述酵母感染的免疫应答，或借此减少炎症，其中所述化合物如下表示：

其中R1是羟基(OH)或甲酰基(CH＝O)；

其中R2和R3是甲基(CH₃)；

其中R4是甲基或14a-二氟-甲基(CHF₂)；

其中R5和R6独立地是醛(CH₃CHO)；胺(NH₂)；二甲胺((CH₃)₂NH)；哌啶((CH₂)₅NH)；异丙胺((CH₃)₂CHNH₂)；吗啉(O(CH₂CH₂)₂NH)；羧酸(C(＝O)OH)；磺酰胺(CH₃SO₂NH₂)；乙酰胺(CH₃CONH₂)或(C₂H₅NO)；醇(OH)；酮(CH₃C(O)CH₃)、异丙基甲基酮(CH₃COCH(CH₃)₂)或甲基-异丁基-酮((CH₃)₂CHCH₂COCH₃)；甲基(CH₃)；2-甲基庚烷(CH₃CH(CH₂)₃CH(CH₃)₂)；2-甲基庚烷2,3-二醇(CH₃CH(CH₂)CH(OH)C(OH)(CH₃)₂)；包含2至12个PEG(聚乙二醇)单元的聚乙二醇化胺；与化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b连接形成二聚体的PEG5胺；和生物素化胺，其中生物素部分通过PEG 2-12与胺部分连接。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括向所述对象施用治疗抗体。

3.测定与Fc受体CD16a结合的抗体的方法，其包括：

使所述Fc受体CD16a与化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b接触；

使所述抗体与所述Fc受体CD16a接触；和

确定所述抗体与所述Fc受体CD16a的结合量。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Fc受体CD16a在细胞表面上。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述Fc受体CD16a在无细胞制品中。

6.筛选用于改变抗体与Fc受体CD16a结合的化合物的方法，其包括：

使所述Fc受体CD16a与化合物接触；

使所述抗体与接触过所述化合物的所述Fc受体CD16a接触；和

确定所述抗体与接触过所述化合物的所述Fc受体CD16a的第一结合量；和

将所述第一结合量与所述抗体与未接触过所述化合物的所述Fc受体CD16a的第二结合量进行比较，其中增加所述结合量的化合物是候选治疗免疫调节剂，而减少所述结合量的化合物是炎性疾病的候选治疗剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Fc受体CD16a在细胞表面上。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述Fc受体CD16a在无细胞制品中。

9.筛选用于活化或抑制表达CD16a的细胞的化合物的方法，其包括：

在存在化合物的情况下培养表达CD16a的细胞的样品；

在不存在所述化合物的情况下培养表达CD16a的细胞的样品；

确定对在存在所述化合物的情况下培养的样品和在不存在所述化合物的情况下培养的样品的细胞活化或抑制的量，其中增加细胞活化的化合物是候选治疗免疫调节剂，而减少细胞活化的化合物是炎性疾病的候选治疗剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述表达CD16a的细胞选自表达CD16a受体的重组细胞系、天然免疫细胞、天然杀伤(NK)细胞、髓样细胞、树突细胞和单核细胞。

11.治疗抗体，其与化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b化学连接。

12.套组，其包括：

化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b；和

治疗抗体。

13.用于调节人或啮齿类动物对象的免疫应答的组合物，其包括：

化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b，其中所述化合物不是羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇或9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇；和

药学上可接受的载剂。

14.营养补充剂，其包含化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b，其中所述化合物的浓度大于700mg/100g补充剂。

15.根据权利要求14所述的营养补充剂，其中所述化合物不是羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇或9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇。

16.根据权利要求14所述的营养补充剂，其中所述化合物的浓度大于1g/100g补充剂。

17.根据权利要求14所述的营养补充剂，其为液体饮料。

18.根据权利要求14所述的营养补充剂，其为固体零食棒。

19.制备用于增加免疫应答的强化食品的方法，其包括：

将包含化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b的营养补充剂与食品物质混合形成适于增加免疫应答的强化食品，其中所述化合物不是羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇或9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇，其中所述营养补充剂中所述化合物的浓度大于700mg/100g补充剂。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述食品物质是纤维补充剂。

21.治疗对象的炎症的方法，其包括：

向所述对象施用有效量的化合物，借此减少所述对象的炎性应答，其中所述化合物选自双降醇、5α-胆甾-8,24-二烯-3β-醇、胆甾-5,24-二烯-3β-醇、5α-胆甾-7-烯-3β-醇、3β-氯-胆甾-5-烯、环木菠萝烯醇阿魏酸酯、3-羟基-4,4-二甲基-5-烯-双降醇、3-α-羟基-4,4-二甲基-5-烯-双降醇、2-甲基-3-β-羟基-4,4-二甲基-5-烯-双降醇、3β-羊毛甾-8,24,25-二羟基-烯-3-醇、羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇-25-吗啉基和9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇-25-吗啉基。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述对象患有炎性疾病或炎性综合征。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述炎性疾病选自：强直性脊柱炎(AS)、抗磷脂抗体综合征(APS)、痛风、炎性关节炎、肌炎、多发性硬化、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮(SLE、狼疮)和血管炎。

24.测定用于抑制或增强细胞表面上的Fc受体CD16a的活化的化合物的方法，其包括：

使所述细胞表面上的所述Fc受体CD16a与化合物1a、1b、2a、2b、4a或4b接触；和

确定对所述Fc受体CD16a的活化或抑制。

25.根据权利要求24所述的方法，其中活化是通过抗体非依赖性细胞毒性(AICC)确定的。

26.根据权利要求24所述的方法，其中活化或抑制是通过在存在或不存在IgG抗体的情况下测量来自CD16a-荧光素酶报告基因细胞系的荧光素酶产生确定的。

27.根据权利要求24所述的方法，其中活化是通过测量细胞对TNFα、IFNγ、粒酶B、GM-CSF或IL1β的产生确定的。

28.组合物，其包含化合物27。

29.用于制备化合物27的方法，其包括：在甲醇、二氯甲烷和哌啶中还原胺化化合物21。

30.组合物，其包含化合物26。

31.用于制备化合物26的方法，其包括在甲醇和二氯甲烷中还原胺化化合物21和异丙胺。

32.组合物，其包含化合物29。

33.用于制备化合物29的方法，其包括：在高氯酸钠、磷酸二氢钠和2-甲基-2-丁烯的存在下于叔丁醇、四氢呋喃中氧化化合物21。

34.用于增强利用Fc受体CD16a与抗体结合的体外基于抗体的测定的试剂，其包含选自化合物1a、1b、2a、2b、4a和4b的化合物或其组合，其中所述化合物不是羊毛甾-8,24-二烯-3β-醇或9β-19-环-24-羊毛甾烯-3β-醇。

35.套组，其包含用于增强利用Fc受体CD16a与抗体结合的体外基于抗体的测定的试剂，所述套组包含：

选自化合物1a、1b、2a、2b、4a和4b的化合物或其组合；和

Fc受体CD16a的无细胞制品。

36.根据权利要求35所述的套组，其包含3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)。