CN119662581B

CN119662581B - 羰基还原酶BsCR突变体、工程菌及合成克唑替尼手性中间体的应用

Info

Publication number: CN119662581B
Application number: CN202510126752.0A
Authority: CN
Inventors: 王亚军; 叶远帆; 姚丽莉; 薛斌; 居述云
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2025-01-27
Filing date: 2025-01-27
Publication date: 2025-10-10
Anticipated expiration: 2045-01-27
Also published as: CN119662581A

Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶BsCR突变体、工程菌及合成克唑替尼手性中间体的应用，本发明羰基还原酶BsCR突变体的活性和稳定性明显提高。本发明所获得的突变体比酶活与野生型BsCR相比显著提高，其中BsCR_M2突变体在45℃半衰期为52.1h，相比于母本WT‑BsCR提升了2.9h，比活性与野生型BsCR相比提高了87.7倍，最高底物投料量可达到100g/L 2,6‑二氯‑3‑氟苯乙酮(CFA)，产物浓度随反应时间的延长而逐渐增加，6h内绝大部分底物可被转化(底物转化率为92.06％)，产物e.e.值始终保持在99.5％以上，时空产率为368.24g/L/d。

Description

羰基还原酶BsCR突变体、工程菌及合成克唑替尼手性中间体的应用

(一)技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种羰基还原酶BsCR突变体、工程菌及催化合成手性克唑替尼中间体的应用。

(二)背景技术

克唑替尼是第一代间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase，ALK)抑制剂，能有效提高ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存时间。(S)-2,6-二氯-3-氟苯乙醇((S)-CFL)是合成克唑替尼的关键手性中间体，其合成通常是采用化学法不对称还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮(CFA)。然而，化学不对称还原工艺通常反应条件苛刻，使用金属催化剂成本高且产物存在金属污染风险。生物催化具有其反应条件温和、催化效率高、立体选择性好等优势，越来越多被应用于制药工业。发展CFA生物不对称还原制备(S)-CFL技术符合绿色化学发展方向。

羰基还原酶(carbonyl reductase，CRs)属于NAD(P)H依赖型氧化还原酶超家族，能不对称还原酮、醛、酮酸(酯)生成醇化合物。自然界中的野生型(WT)羰基还原酶往往对人工合成的非天然化合物表现出低活性、低选择性和低稳定性，难以满足工业应用的技术要求，需要利用酶工程技术改造天然酶的结构、强化其工业属性才能应用于规模化生产。

本发明通过对羰基还原酶实施分子改造，获得具有工业属性的羰基还原酶突变体，构建高时空产率的(S)-CFL生物制造技术。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种来源于B.subtilis的羰基还原酶BsCR突变体、重组质粒、重组基因工程菌及在不对称还原CFA合成克唑替尼关键手性中间体(S)-CFL中的应用，通过酶工程改造，获得了活性显著提升的羰基还原酶有益突变体。进一步通过组合突变获得具有高活性、高稳定性的超级突变体，其中突变体BsCR-I178L/T179L(BsCR_M2)的活性较WT-BsCR显著提升。本发明有效解决了鲁棒性S-选择性还原CFA酶元件缺乏、天然BsCR活性不高、稳定性差等问题。此外，本发明进一步优化生物催化反应的工艺参数，构建了优选的BsCR_M2催化CFA对映选择性还原合成(S)-CFL工艺，有效提高了(S)-CFL生物制造的时空产率。

本发明采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种羰基还原酶BsCR突变体，所述羰基还原酶BsCR突变体是将SEQ ID No.2所示来源于B.subtilis的羰基还原酶BsCR氨基酸序列第130位点、第178位点、第179位点或第182位点进行单点突变或多位点组合突变获得的。本发明所述羰基还原酶BsCR编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，优选所述的羰基还原酶BsCR突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第130位点谷氨酰胺突变为亮氨酸，Q130L；(2)第178位异亮氨酸突变为亮氨酸，I178L；(3)第179位的苏氨酸突变为亮氨酸，T179L；(4)第182位赖氨酸突变为谷氨酸，K182E；(5)上述(1)到(4)中的单点突变任意两两组合获得的双突变；(6)上述(1)到(4)中的单点突变任意三三组合获得的三突变。

进一步，更优选所述的羰基还原酶BsCR突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第179位的苏氨酸突变为亮氨酸，T179L；(2)第178位异亮氨酸突变为亮氨酸、第179位的苏氨酸突变为亮氨酸(I178L/T179L)。

本发明还涉及所述羰基还原酶BsCR突变体编码基因、重组表达载体、以及重组基因工程菌。所述重组表达载体优选载体pET28a(+)，所述重组基因工程菌优选宿主菌E.coliBL21(DE3)。

第二方面，本发明还涉及所述羰基还原酶BsCR突变体在不对称还原CFA制备克唑替尼关键手性中间体(S)-CFL中的应用。所述应用的方法为：羰基还原酶BsCR突变体菌株经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以CFA为底物，以葡萄糖为辅底物，采用pH 4.0～9.0的缓冲液(优选pH 6.0、100mM的磷酸钠缓冲液(PB))为反应介质构成反应体系，30～80℃(优选60℃)、800～1000rpm条件下进行反应，反应结束，反应液经分离纯化，反应液使用乙酸乙酯萃取，获得(S)-CFL化合物。

进一步，所述前手性CFA结构如下所示：

进一步，所述的反应体系中，底物加入终浓度1～100g/L；葡萄糖添加量为43.5～217.4g/L，葡萄糖与底物摩尔比为1～5:1(优选3：1)；催化剂用量以湿菌体重量计为10～50g/L，以湿菌体干重计为2～10g DCW/L(优选10g DCW/L)。

进一步，所述的反应体系中添加二甲基亚砜为助溶剂，二甲基亚砜体积加入浓度为10-80％，优选50％。

进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将携带羰基还原酶BsCR突变体基因的基因工程菌接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％(V/V)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，20℃培养16h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体。

进一步，所述BsCR突变体纯化酶按如下方法制备：(1)细胞裂解液：将湿菌体按50gWCW(湿菌体)/L缓冲液重悬于含300mM氯化钠的pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液中，菌悬液在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率250W，破碎1s、暂停1s，取破碎混合液，获得细胞裂解液；(2)细胞裂解液在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀，上清液即为粗酶液；粗酶液经0.22μm滤膜微滤后使用亲和层析法进行蛋白纯化，具体方法为：将镍-琼脂糖凝胶亲和层析填料加入至层析柱中，待充分沉降后使用含300mM氯化钠的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液平衡层析柱；上样；使用含300mM氯化钠和50mM咪唑的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液淋洗5个柱体积，去除未结合杂蛋白；再使用含300mM氯化钠和100mM咪唑的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液洗脱5个柱体积，收集含目的酶蛋白的洗脱液；洗脱液转移至截留分子量为30kDa的超滤离心管中，4℃、3000rpm将超滤离心管中的洗脱液浓缩至原体积的3％，再加入5个柱体积的pH7.0、20mM磷酸钠缓冲液，继续浓缩至原体积的3％，如此重复三次以去除酶液中的咪唑，得到的浓缩液即为纯酶液。

本发明羰基还原酶BsCR及羰基还原酶BsCR突变体碱基序列全长均为858bp，从第一个碱基起至第858个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码285个氨基酸。

本发明所述羰基还原酶BsCR突变体的获取是采用蛋白质工程改造获得，最终获得了4个有益突变体Q130L、T179L、I178L、K182E。通过进一步的迭代组合突变，获得了最佳突变体BsCR_M2，将获得的突变体质粒以热击的方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组工程菌。对获得菌株进行接种、转接、诱导培养、菌体回收，利用重悬菌液催化CFA还原，制备(S)-CFL。本发明羰基还原酶BsCR突变体的接种、转接、诱导培养、菌体回收，培养基制备可为本领域任何可使本发明菌体生长的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，水溶解。培养方法和培养条件没有特殊限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同，按本领域基本知识进行适当的选择。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)羰基还原酶BsCR突变体的活性明显提高。

本发明所获得的突变体比酶活较WT-BsCR显著提高，其中BsCR_M2突变体比酶活比WT-BsCR提高了87.7倍，最大底物投料量100g/L CFA，产物浓度随着时间的延长而逐渐增加，6h内绝大部分底物可被转化(底物转化率为92.06％)，产物ee_p值始终保持在99.5％以上，时空产率为368.24g/L/d。

(2)羰基还原酶BsCR突变体的稳定性得到提高。

与野生型BsCR相比，本发明构建的突变体稳定性均有提高，其中BsCR_M2在45℃半衰期(t_1/2)为52.1h，相比于母本WT-BsCR提升了2.9h。因此，突变体BsCR_M2展示出良好的工业应用前景。

(四)附图说明

图1是以葡萄糖为辅底物，羰基还原酶BsCR及其突变体催化CFA不对称还原制备(S)-CFL的反应示意图。

图2为CFA、(S)-CFL和(R)-CFL的标准品分析气相色谱图。

图3为气相色谱法建立的(S)-CFL检测标准曲线。

图4为WT-BsCR及其突变体SDS-PAGE凝胶电泳图。M，蛋白质标准品；泳道1，E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)(阴性对照)；泳道2，WT-BsCR粗酶液；泳道3，BsCR_M1粗酶液；泳道4，BsCR_M2粗酶液；泳道5，WT-BsCR纯化酶；泳道6为BsCR_M1纯化酶；泳道7，BsCR_M2纯化酶。

图5为温度对BsCR_M2酶活的影响。

图6为pH值对BsCR_M2酶活的影响。

图7为葡萄糖添加量对BsCR_M2酶活的影响。

图8为助溶剂种类对BsCR_M2酶活的影响。

图9为助溶剂DMSO用量对BsCR_M2酶活的影响。

图10为突变体BsCR_M2以葡萄糖为辅底物不对称还原CFA合成(S)-CFL的反应时间进程曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所用LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，水溶解。LB固体培养基是LB液体培养基中添加18g/L琼脂。

实施例1：WT-BsCR纯化酶制备

(1)野生型BsCR基因工程菌构建

人工合成GenBank中来源于B.subtilis羰基还原酶的基因序列(GenBank No.NC_000964.3)，即WT-BsCR基因(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)，连接到载体pET28a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间，构建重组表达载体，并将此重组表达载体转入宿主菌E.coli BL21(DE3)，获得WT-BsCR基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr。

SEQ ID No.2

MANQKKKTLPPQHQNQQPGFEYLMDPRPVFDKPKKAKKLEGKTAIITGGDSGIGRAVSVLFAKEGANVVIVYLNEHQDAEETKQYVEKEGVKCLLIAGDVGDEAFCNDVVGQASQVFPSIDILVNNAAEQHVQPSIEKITSHQLIRTFQTNIFSMFYLTKAVLPHLKKGSSIINTASITAYKGNKTLIDYSATKGAIVTFTRSLSQSLVQQGIRVNAVAPGPIWTPLIPASFAAKDVEVFGSDVPMERPGQPVEVAPSYLYLASDDSTYVTGQTIHVNGGTIVNG。

(2)湿菌体制备

将步骤(1)构建的野生型羰基还原酶基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr接种到含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1％(V/V)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，再向培养液中加入终浓度为0.15mM IPTG，20℃培养16h后，4℃、8000rpm离心10min，获得湿菌体。

(3)酶纯化

将步骤(2)的湿菌体细胞按照50g WCW/L缓冲液的量分散于pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液中进行重悬，菌悬液在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率250W，破碎1s，暂停1s，获得细胞裂解液，用于后续酶纯化。

酶纯化操作如下：细胞裂解液在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀、收集上清液。上清液经微滤(滤膜：0.22μm)后得到透过液，透过液使用亲和层析法进行蛋白纯化，具体方法为：将镍-琼脂糖凝胶亲和层析填料(3mL)平铺加入层析柱中，待充分沉降后使用15mL含300mM氯化钠的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲溶液平衡层析柱；上样；使用含50mM咪唑、300mM氯化钠的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液淋洗5个柱体积，去除未结合杂蛋白；再使用15mL含100mM咪唑、300mM氯化钠的pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液洗脱5个柱体积，收集含目标酶蛋白的洗脱液；洗脱液转移至截留分子量为30kDa的超滤离心管中，4℃、3000rpm离心，浓缩洗脱液至500μL，再加入15mL pH 7.0、20mM磷酸钠缓冲液，继续浓缩至500μL，如此重复三次以去除酶液中的咪唑，得到的浓缩液即为纯酶液，凝胶电泳见图4。

(4)酶活测定

酶活单位(U)定义为：在最适条件下，每分钟每生成1微摩尔(S)-CFL所需的酶量定义为一个酶活单位，U。比酶活定义为每毫克酶蛋白所具有的活力单位数，U/mg。

酶活检测条件：1mM还原型烟酰胺单核苷酸(NMNH)，适量纯酶液(酶蛋白质量为100μg)，1mM底物CFA，体积浓度5％ DMSO，底物先用DMSO溶解后投料，pH 6.0、100mM磷酸钠缓冲液补至终体积为500μL，在60℃、1000rpm下反应30min，采用安捷伦8860高效气相色谱检测底物的消耗量和产物生成量。

底物转化率、产物得率及产物e.e.值以及得率通过安捷伦8860高效气相色谱仪检测：GC(CYCLOSIL-B，30m×0.25mm，0.25μm)。进样器和检测器都设置在250℃，将柱温箱温度设定在155℃并保持15min，分流比为15:1(V/V)，进样量为2μL，其他条件为默认检测条件。CFA、(S)-CFL及(R)-CFL的标准品气相检测图谱示于图2，(S)-CFL气相色谱法检测标准曲线示于图3。

实施例2：WT-BsCR突变体位点的选择及单位点突变体的构建

1、WT-BsCR突变体位点的选择

使用对接软件YASARA将底物CFA对接到WT-BsCR活性口袋内，选取与底物距离为范围内氨基酸残基，这些氨基酸最有可能影响酶促反应的选择性和活性，在排除保守的催化三联体氨基酸残基(S177、Y190、K194)后，选择Q130、I178、T179、K182作为考察突变位点。

2、Q130位饱和突变

(1)Q130位饱和突变流程：提取实施例1野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-bscr的质粒pET28a(+)-bscr，利用表1中的引物进行PCR扩增将130位点谷氨酰胺突变成其它19种氨基酸，将PCR产物经Dpn I内切酶消化后，转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，将转化子涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，在37℃培养12h。然后挑取单克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养10h，收集菌液、提取质粒，测序验证突变。

表1BsCR130位点定点饱和突变引物设计

注：NDT，代表简并密码子；AHN，代表与NDT配对的简并密码子。

PCR反应体系(25μL)：0.5μL正向引物(100μM)，0.5μL反向引物(100μM)，12.5μL 2×Phanta缓冲液，0.5μL dNTP混合物(各10mM)，0.5μL质粒模板，0.5μL DNA聚合酶和10μL超纯水。根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶操作手册设置PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55-65℃退火15s，72℃延伸10s)，72℃终延伸10min，16℃保温。

(2)突变体的筛选

突变体筛选反应体系：50g/L步骤(1)制备的各个湿菌体，10g/L CFA，80g/L葡萄糖，反应介质为pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液，并添加10％(V/V)的DMSO作为助溶剂，构成10mL反应体系，在60℃、1000rpm条件下反应4h后，移取1mL反应液，加入1mL乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯层经离心后使用0.22μm滤膜微滤处理，透过液采用实施例1气相色谱检测产物、底物浓度、计算底物转化率、酶比活力和立体选择性，结果示于表2。每个突变体表征设置3个重复。通过对12个突变体的活性检测，筛选确定最佳突变体为E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L，保存于-80℃冰箱。

表2Q130位点突变体催化性能

注：ND，表示检测不到酶活。

3、T179位饱和突变

(1)T179位饱和突变流程：提取实施例1野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-bscr的质粒pET28a(+)-bscr，利用表3中的引物进行PCR扩增将179位点苏氨酸突变成其它19种氨基酸，将PCR产物经Dpn I内切酶消化后，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化子涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，在37℃培养12h。然后挑取单克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养10h，收集菌液、提取质粒，并测序验证突变。

表3BsCR179位点定点饱和突变引物设计

PCR反应体系(25μL)：0.5μL正向引物(100μM)，0.5μL反向引物(100μM)，12.5μL 2×Phanta缓冲液，0.5μL dNTP混合物(各10mM)，0.5μL质粒模板，0.5μL DNA聚合酶和10μL超纯水。根据Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶操作手册设置PCR程序如下：95℃预变性5min，然后30个循环(95℃变性15s，55～65℃退火15s，72℃延伸10s)，72℃终延伸10min，16℃保温。

(2)突变体的筛选

突变体筛选反应体系：50g/L步骤(1)制备的各个湿菌体，10g/L CFA，80g/L葡萄糖，反应介质为pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液，并添加10％(V/V)的DMSO作为助溶剂，构成10mL反应体系，在60℃、1000rpm条件下反应4h后，移取1mL反应液，加入1mL乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯层经离心后使用0.22μm滤膜微滤处理，透过液采用实施例1气相色谱检测产物、底物浓度、计算底物转化率、酶比活力和立体选择性，结果示于表4。每个突变体表征设置3个重复。通过对12种突变体的活性检测，筛选确定最佳突变体为E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-T179L，保存于-80℃冰箱。

表4T179位点突变体催化性能

注：ND，表示检测不到酶活。

4、I178位饱和突变

(1)I178位饱和突变流程：提取实施例1野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-bscr的质粒pET28a(+)-bscr，利用表5中的引物进行PCR扩增将178位点异亮氨酸突变成其它19种氨基酸，将PCR产物经Dpn I内切酶消化后，转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞，将转化子涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，在37℃培养12h。然后挑取单克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养10h，收集菌液、提取质粒，并测序验证突变。

表5BsCR178位点定点饱和突变引物设计

(2)突变体的筛选

突变体筛选反应体系：50g/L步骤(1)制备的各个湿菌体，10g/L CFA，80g/L葡萄糖，反应介质为pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液，并添加10％(V/V)的DMSO作为助溶剂，构成10mL反应体系，在60℃、1000rpm条件下反应4h后，移取1mL反应液，加入1mL乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯层经离心后使用0.22μm滤膜微滤处理，透过液采用实施例1气相色谱检测产物、底物浓度、计算底物转化率、酶比活力和立体选择性，结果示于表6。每个突变体表征设置3个重复。通过对12种突变体的活性检测，筛选确定最佳突变体为E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-I178L，保存于-80℃冰箱。

表6I178位点突变体催化性能

注：ND，表示检测不到酶活。

5、K182位饱和突变

(1)K182位饱和突变流程：提取实施例1野生型羰基还原酶基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-bscr的质粒pET28a(+)-bscr，利用表7中的引物进行PCR扩增将182位点赖氨酸突变成其它19种氨基酸，将PCR产物经Dpn I内切酶消化后，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，将转化子涂布至含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基，在37℃培养12h。然后挑取单克隆并转接到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm培养10h，收集菌液、提取质粒，并测序验证突变。

表7BsCR182位点定点饱和突变引物设计

(2)突变体的筛选

突变体筛选反应体系：50g/L步骤(1)制备的各个湿菌体，10g/L CFA，80g/L葡萄糖，反应介质为pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液，并添加10％(V/V)的DMSO作为助溶剂，构成10mL反应体系，在60℃、1000rpm条件下反应4h后，移取1mL反应液，加入1mL乙酸乙酯进行萃取。乙酸乙酯层经离心后使用0.22μm滤膜微滤处理，透过液采用实施例1气相色谱检测产物、底物浓度、计算底物转化率、酶比活力和立体选择性，结果示于表8。每个突变体表征设置3个重复。通过对12种突变体的活性检测，筛选确定最佳突变体为E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-K182E，保存于-80℃冰箱。

表8K182位点突变体催化性能

注：ND，表示检测不到酶活。

实施例3：组合突变体的构建

提取实施例2工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-I178L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-T179L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-K182E的质粒为模板，利用表9中的引物，采用实施例2方法和条件进行PCR扩增，分别构建工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/I178L、E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/T179L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/K182E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-I178L/T179L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-I178L/K182E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-T179L/K182E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/I178L/T179L、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/I178L/K182E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/T179L/K182E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-I178L/T179L/K182E、E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-Q130L/I178L/T179L/K182E。保存于-80℃冰箱。采用实施例1方法制备各个突变体的湿菌体。

表9BsCR组合突变引物设计

采用实施例2方法和条件测试底物转化率和立体选择性，筛选确定最佳突变体为E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-I178L/T179L，记为突变体BsCR_M2；E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-bscr-/T179L则记为突变体BsCR_M1，保存于-80℃冰箱。

表10突变对BsCR立体选择性和相对活力的影响

注：ND，表示检测不到酶活。

实施例4：突变体的诱导表达

将实施例3获得的E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-BsCR_M1和E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-BsCR_M2分别接种到含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，以体积浓度1.5％(V/V)的接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h，再向培养液中加入终浓度为0.15mM IPTG，20℃培养15h后，4℃、8000rpm离心10min，沉淀用0.9％(w/V)生理盐水洗涤两次，获得BsCR_M1湿菌体细胞和BsCR_M2湿菌体细胞。以上获得的细胞含有相应的蛋白，可用于酶的纯化，也可用于催化合成(S)-CFL。

实施例5：突变体酶蛋白纯化及酶活测定

分别按照50g湿菌体/L缓冲液的用量加入含300mM氯化钠的pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液进行重悬，在冰水混合物上超声破碎15min，超声破碎条件：功率为250W，破碎1s、暂停1s，破碎混合液即为细胞裂解液。细胞裂解液分别在8000rpm、4℃下离心10min，弃沉淀，收集上清液即为粗酶液，上清液同实施例1方法进行蛋白纯化，分别获得突变体BsCR_M1纯酶液和突变体BsCR_M2纯酶液，凝胶电泳见图4。WT-BsCR、BsCR_M1及BsCR_M2的酶活检测方法同实施例1，酶活检测数据见表11。其中，BsCR_M2相较于WT-BsCR提升了约87.7倍。

表11BsCR及突变体的立体选择性和比活力

实施例6：BsCR及突变体的半衰期测定

(1)半衰期的测定

半衰期(t_1/2)测定反应体系：将实施例1和实施例5中得到的WT-BsCR、BsCR_M1及BsCR_M2纯化酶稀释至蛋白浓度1μg/μL，每管分装200μL，置于45℃水浴中保温，每隔4h取出一管，待温度恢复至室温，按照实施例1的酶活检测体系检测保温不同时长的残余酶活。

(2)半衰期的拟合

半衰期(t_1/2)根据热失活方程计算：A_t＝A₀e^{-kd t}。在热失活方程中，k_d为失活动力学常数，A₀和A_t分别代表初始酶活和t时刻的酶活。根据热失活方程，以ln(A_t/A₀)为纵坐标，取样时间t为横坐标，使用Origin进行绘图，纵坐标ln(A_t/A₀)＝-ln2时的t值即为半衰期t_1/2。WT-BsCR及突变体的半衰期见表12。

表12BsCR及突变体在45℃的半衰期

实施例7：BsCR_M2最适反应温度、pH、葡萄糖浓度、DMSO体积浓度

1、最适反应温度

在10mL的pH 7.0、100mM PB缓冲液中，加入50g/L的实施例4方法制备的BsCR_M2湿菌体细胞，20g/L的底物CFA，80g/L的葡萄糖，10％(V/V)的DMSO，在30～80℃(30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃)、800rpm反应30min，根据实施例1方法检测不同温度下的酶活，优化BsCR_M2的催化温度，以最高酶活为100％计算相对酶活，结果示于图5。结果表明，温度优化范围为30～80℃，通过优化确定BsCR_M2最适催化温度为60℃。

2、最适反应pH

分别采用pH4.0～6.0醋酸钠缓冲液、pH6.0～8.0磷酸钠缓冲液、pH7.0～9.0Tris-HCl缓冲液进行突变体最适反应pH的筛选。

反应体系：在10mL的不同pH(pH 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、100mM缓冲液中，加入50g/L的实施例4方法制备的BsCR_M2湿菌体细胞，20g/L的底物CFA，80g/L的葡萄糖，10％(V/V)的DMSO，在60℃、800rpm反应30min，根据实施例1方法检测不同pH下的酶活，优化BsCR_M2的催化反应pH值，以pH 4.0的酶活为100％计算相对酶活，结果示于图6。pH优化范围为4.0～9.0，通过优化确定BsCR_M2最适催化pH值为6.0。

3、最适葡萄糖浓度

在10mL的pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液中，加入50g/L的实施例4方法制备的BsCR_M2湿菌体细胞，50g/L的底物CFA，葡萄糖与底物的摩尔比(1:1，2:1，3:1，4:1，5:1)，10％(V/V)的DMSO，在60℃、800rpm反应30min，根据实施例1方法检测不同温度下的酶活，优化BsCR_M2的辅底物葡萄糖浓度，以1:1的酶活为100％计算相对酶活，结果示于图7。结果表明，辅底物葡萄糖的考察范围为1～5倍底物摩尔量，通过优化确定BsCR_M2最适反应葡萄糖浓度为3倍底物摩尔量。

4、反应助溶剂

在9mL的pH 6.0、100mM磷酸钠缓冲液中，加入50g/L的实施例4方法制备的BsCR_M2湿菌体细胞和80g/L的葡萄糖，体积终浓度10％不同有机溶剂(DMSO、DMF、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇)，底物先用有机溶剂溶解后加入反应体系，使底物终浓度为20g/L，在60℃、800rpm反应30min，根据实施例1方法检测不同助溶剂下的酶活，不添加有机溶剂的酶活定义为100％，计算相对酶活，结果示于图8，BsCR_M2的最佳反应助溶剂为DMSO。

5、最适DMSO浓度

在10mL的pH 7.0、100mM磷酸钠缓冲液中，加入50g/L的实施例4方法制备的BsCR_M2湿菌体细胞，80g/L的葡萄糖，不同体积浓度(V/V)的DMSO(10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％)，底物先用有机溶剂溶解后加入反应体系，使底物终浓度为20g/L，在60℃、800rpm反应30min，根据实施例1方法检测不同温度下的酶活，优化BsCR_M2的助溶剂DMSO浓度，以不添加有机溶剂的对照酶活为100％计算相对酶活，结果示于图9。结果表明，在助溶剂DMSO 10％-80％(v/v)浓度范围内，BsCR_M2最适反应DMSO浓度为50％(V/V)。

实施例8：BsCR_M2不对称还原CFA合成(S)-CFL

先将按实施例4方法制备的BsCR_M2湿菌体细胞用pH 6.0、100mM的磷酸钠缓冲液重悬，反应体系中BsCR_M2的湿菌体添加量以干重计为10g DCW/L，底物CFA通过流加补料使总投料量为50g/L，加入3倍底物摩尔量的葡萄糖，以pH 6.0、100mM的磷酸钠缓冲液为反应介质，添加50％(V/V)的DMSO，构成50mL反应体系，在60℃、pH 6.0、800rpm条件下反应5～8h，每隔1h取样，采用实施例1的方法检测(S)-CFL的浓度，计算时空产率。同样条件下，将底物加入浓度改为100g/L，结果见图10所示。

时空产率计算公式：m为生成的产物质量(g)；t为反应时间(d)；V为反应液体积(L)。BsCR_M2能催化生成47.26g/L的产物，同等条件下，当底物浓度为100g/L时，在6h内能达到反应终点，并生成92.06g/L的产物，时空产率为368.24g/L/d。

表13BsCR_M2催化不同底物浓度时的时空产率

a，S/C表示底物与湿菌体干重投料质量比。

Claims

1.一种羰基还原酶BsCR突变体，其特征在于，所述的羰基还原酶BsCR突变体是将SEQID No.2所示氨基酸序列突变为下列序列：第178位异亮氨酸突变为亮氨酸、第179位的苏氨酸突变为亮氨酸。

2.一种含权利要求1所述羰基还原酶BsCR突变体编码基因的重组基因工程菌。

3.一种权利要求1所述羰基还原酶BsCR突变体在不对称还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮制备克唑替尼关键手性中间体中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：以羰基还原酶BsCR突变体的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体为催化剂，以2,6-二氯-3-氟苯乙酮为底物，以葡萄糖为辅底物，采用pH 4.0-9.0的缓冲液为反应介质构成反应体系，30~80℃、800-1000 rpm条件下进行反应，反应结束，反应液经分离纯化，反应液使用乙酸乙酯萃取，获得(S)-2,6-二氯-3-氟苯乙醇。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的反应体系中，底物加入终浓度1~100g/L；葡萄糖添加量与底物摩尔比为1~5：1；催化剂用量以湿菌体重量计为10~50 g WCW/L，以湿菌体干重计为2~10 g DCW/L。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的反应体系中添加二甲基亚砜为助溶剂，二甲基亚砜体积加入浓度为10-80%。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH 6.0、100 mM的磷酸钠缓冲液。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含羰基还原酶BsCR突变体基因的工程菌接种到含有终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度1%的接种量接种到新鲜的含终浓度50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、180 rpm培养至OD₆₀₀=0.6~0.8，再向培养液中加入终浓度为0.15 mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷，20℃培养16 h后，4℃、8000 rpm离心10 min，获得湿菌体。